GENÉTICA DO DESENVOLVIMENTO Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Genética Humana.
Genética Molecular Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva.
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Genética Molecular HumanaProfa. Dra. Ana Elizabete Silva
SUMÁRIO
Histórico e ConceitoTipos de morte celular: Apoptose x NecroseCaracterísticas gerais da apoptoseFunções da apoptoseMecanismos bioquímicos e molecularesRegulação da apoptose:-família Bcl-2-caspases
Vias apoptóticas:-via extrínseca-via intrínsecaFunção da mitocôndriaMétodos de detecção da apoptoseDoenças associadas à apoptose Apoptose e câncerAlvos para terapia
•1858: achavam que a M.C.P. era um processo patológico
•1951: consideraram um fenômeno fisiológico necessário (tecidos e embriões)
•Anos 70 : relacionaram alta freqüência de M.C.P. nos tumores com mecanismos homeostáticos (perda e ganho celular)
•Kerr, Willie e Currie (1972) Constataram que o padrão de morte celular que ocorria durante o desenvolvimento embrionário também se repetia em organismos adultos. Cada célula é vítima dessa ativa forma de morte
Apo = de Ptosis = cair “queda de folhas das árvores no outono”
FUNÇÕES DA APOPTOSE1-Elimina células danificadas/prejudiciais2-Fisiologicamente ocorre:
na renovação de células epiteliais e hematopoéticasMantém número constante de células nos tecidos adultos:
Ex.: 5x10 células do sangue → eliminadas por morte celular programada (dia/adultos)
# colapso endometrial durante a menstruação# deleção de células nas criptas intestinais
# na regressão de tumores3-Papel importante no desenvolvimento embrionário:
-eliminação do tecido larval durante metamorfose (anfíbios e insetos)-regressão da cauda do girino-eliminação de tecidos entre os dedos (membrana interdigital)-eliminação de neurônios em excesso
4- Mecanismo de defesa:-células infectadas por vírus-células com danos no DNA -células cancerosas
Exemplos da importância da Apoptose no desenvolvimento
Exemplos da importância da Apoptose no desenvolvimento embrionário em mamíferos
manutenção do tamanho e forma dos órgãos e tecidos
Equilíbrio entre a taxa de geração celular (60 bi/dia) e taxa de morte celular (10 bi/dia)
Razão damorte
celular Desordem eacúmulo celular
Homeostase
Desordem eperda celular
CATEGORIAS DE MORTE CELULAR ORGANISMOS SUPERIORES
NECROSE:NECROSE: -processo patológico -processo patológico (autólise das células): (autólise das células): resultado de uma lesão resultado de uma lesão maciça no tecido maciça no tecido caracterizada por:caracterizada por:-inchaço citoplásmatico e inchaço citoplásmatico e mitocondrial, mitocondrial,
- ruptura da membrana ruptura da membrana celular e vazamento do celular e vazamento do plasma celular plasma celular
-resposta inflamatória e resposta inflamatória e reação de tecido patológico reação de tecido patológico grande número de células grande número de células afetadas simultaneamenteafetadas simultaneamente
APOPTOSE:APOPTOSE:
--evento fisiológico evento fisiológico (processo de eleminação (processo de eleminação celular controlado) celular controlado) sequência de eventos que sequência de eventos que levam a morte celular em levam a morte celular em uma variedade de uma variedade de diferentes sistemasdiferentes sistemas
AUTOFAGIA: “auto-canibalização” da célula: degradação de organelas e citoplasma pelos lisossomos e vacúolos
NECROSE X APOPTOSE
NECROSE X APOPTOSE
APOPTOSE
-vacúolos citoplasmáticos
-encolhimento e diminuição do contato célula-célula
Fragmentação da membrana nuclear
-condensação cromatínica
-Despolarização da membrana mitocondrial
-fragmentação internucleossomal do DNA
-desintegração nuclear e corpos apoptóticos
-fagocitose pelos macrófagos
Ocorrência unicelular
Estímulo fisiológico
Sem reversibilidade
PROCESSO HISTOLÓGICO DA APOPTOSE
Passos histológicos distintos: -duração de 2-3 horas-processo não sincrônico-mudanças bioquímicas e morfológicas
1.Condensação da cromatina no núcleo e rompimento da interação célula-célula célula apoptótica isolada das vizinhas
-Condensação da cromatina antes da clivagem do DNA
-Condensação citoplasmática: (preservação integridade de organelas) disrupção dos contatos desmossomais entre células e disrupção do citoesqueleto (enzimas transglutaminase, colagenase, TRPM2) formação de blebs sobre a superfície celular.
ACINUSACINUS
degradação DNA nuclear (espaços degradação DNA nuclear (espaços inter-nucleossomal ) inter-nucleossomal ) → → endonucleases endonucleases
(Dnase I) dependentes de (Dnase I) dependentes de Ca2+ e Mg2+Ca2+ e Mg2+
produz quebras de cadeia única produz quebras de cadeia única
no DNA no DNA extremidades extremidades com grupos 3’-OH com grupos 3’-OH
PROCESSO HISTOLÓGICO DA APOPTOSE
Fragmentação do DNA internucleossomal produz padrão de escada no gel de eletroforese.
2.Fragmentação da célula em corpos apoptóticos núcleos fragmentados e organelas intactas (mitocôndrias e lisossomos) enzimas envolvidas: catepsina D, ativador plasminogênio tipo-tecido e RNase.
3.Fagocitose dos corpos apoptóticos células vizinhas normais e macrófagos degradação pelos lisossomos das células recipientes
PROCESSO HISTOLÓGICO DA APOPTOSE
http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/intro.html
TROFOBLASTO – ETAPAS DAS MUDANÇAS MORFOLÓGICAS
A- Condensação do citoplasma → clivagem da lâmina e filamentos de actina
B- Condensação nuclear → quebra da cromatina e proteínas estruturais nucleares
C-D- Fragmentação da célula → corpos apoptóticos → translocação de fosfatidilserina superfície celular → degradação macrófagos
Fagocitose dos corpos apoptóticos por macrófagos
APOPTOSE E CICLO CELULAR Células em apoptose maioria dos casos na fase Go (sem
proliferação)
Estímulo apoptótico morte celular programada
Fase morfológica de pré-condensação:acúmulo de produtos gênicos necessários para a apoptose
passo irreversível ativação de endonucleases
(tempo de duração da apoptose: 2-3 horas)
CÉLULA Go
FASE A1 DE APOPTOSE
FASE A2 DE APOPTOSE
é mediada por muitos fatores e em vários níveis do metabolismo celular
Infecção viral Pertubação metabólica: mudanças repentinas
na concentração de glicose Temperatura Irradiação Toxinas e drogas Fatores hormonais, como citocinas e
hormônios (peptídeos e esteróides)
REGULAÇÃO DA APOPTOSE
mudanças bioquímicas e moleculares da cascata dependente de energia
Fatores que previnem a apoptose (fatores de sobrevivência tecido-específico ou gerais): hormônios, citocinas e fatores de crescimento
Fatores que induzem ou aumentam apoptose: hormônios, depleção de fatores de crescimento, etc.
Mecânismos Bioquímicos e Moleculares
1-Extrínsecos: ligantes de morte (1) granzima (4)→ linfócitos T citotóxicos
2- Intrínsecos após estresse celular: radiação (2) agente químico (3) infecção viral deprivação de fator de crescimento estresse oxidativo
www.sghms.ac.uk/.../ ~dash/apoptosis/mito.html
ESTÍMULOS PRÓ E ANTI-APOPTÓTICOS
INIBIDORES DA APOPTOSEtestosteronaestradiolProgesteronaProlactinafatores de crescimento (EGF, IGF-I, NGF, PDGF)interleucinashormônio de crescimentogonadotrofinas
INDUTORES DE APOPTOSEesteróidesglucocorticóidesprogesteronahormônio tireóideprivação de fator de crescimento (IGF-I, EGF, PDGF, NGF)fator de crescimento transformante Citocinas: TNF-, IL-1, IL-6Fas liganteradicais livresÓxido nítrico
REGULAÇÃO DA APOPTOSE
Família de proteínas Bcl-2: -controla alguns passos chaves da sinalização da apoptose: -liberação do citocromo c, -ativação da caspase-9 e homeostase de cálcio alterando o limiar celular de sensibilidade à apoptose.
Caspases: cisteíno proteases
REGULAÇÃO DA APOPTOSE
Genes responsáveis pela regulação da apoptose conservados desde Nematodos a Humanosconservados desde Nematodos a Humanos
Caenohabditis elegans
• 1090 células somáticas (diferenciadas)
•131 eliminadas por apoptose durante o desenvolvimento
Regulação da apoptose: 14 genes cedced (cell death abnormal)
ced-3 e ced-4 levam à apoptoselevam à apoptose
ced-9 ced-9 anti-apoptótico anti-apoptótico
FAMÍLIA DE PROTEÍNA Bcl-2 25 genes Primeira oncoproteína anti-apoptótica
Descoberta em Linfoma de Células B: t(14;18), gene Bcl-2 translocado para locos da cadeia pesada da Ig expressão elevada em células B.
Localização de Bcl-2: membranas intracelulares mitocôndria, retículo endoplasmático e membrana perinuclearOncogene Bcl-2: não tem capacidade para estimular crescimento celular aumenta a sobrevivência celular em condições de crescimento subótimas inibindo a apoptoseProteína bcl-2: capaz de proteger as células de uma ampla variedade de estímulos apoptóticos privação de fator de crescimento, irradiação, drogas citotóxicas, calor, monócitos, oncogenes desregulados (previne a liberação do citocromo c -mitocôndria)
citoplasma mitocôndria
Localizadas no citosol (Bax), membranas mitocôndria e RE (Bak)
Bcl-2: ligada à membr. mit. e RE
Localizadas no citosol e translocadas p/mitocôndria
CASPASESCytosolic Aspartate-Specific Proteases (família de 12 proteínas: 7 envolvidas na apoptose)Possuem um resíduo de cisteína no sítio ativo clivam proteínas em resíduos de ácido aspárticoPro-caspases (forma inativa): quando clivadas (ativas) geram uma cascata de caspases que clivam proteínas críticas para a sobrevivência da célula, como:-desmontagem do envoltório nuclear e arcabouço da lâmina-hipercondensação da cromatina-degradação proteolítica das estruturas nucleares e citoplasmáticas
-duas subunidades 1 grande
1 pequena
-pro-enzimas inativas durante a apoptose;
cascata sinais pró-apoptóticos
ativam as caspases iniciadoras
(-2, -8, -9 e -10)
caspases efetoras (-3, -6 e -7)
clivam proteínas celulares vitais
(fase de degradação)
Caspases inflamatórias:(-1,-4,-5)
CASPASES CASPASES INICIADORAS
caspases -2, -8, -9 e -10
processadas e ativadas com a ajuda de moléculas adaptadoras:
pro-caspase-9: Apaf-1pro-caspase-8:
FADD/MORT1
quando ativadas clivam e ativam as pro-caspases efetoras
CASPASES EFETORAScaspases -3, -6 e -7
quando clivadas: responsáveis pela clivagem de várias proteínas
mudanças morfológicas e bioquímicas características da morte celular apoptótica
CASCATA DE CASPASES
Caspases-2,-3,-9
Clivagem de proteínas nuclear
PARP,DNA-PK, ICAD, Gelsolina, Topoisomerase I e II
Caspase-6
Clivagem de Lâmina e NuMA
Condensação da cromatina
Caspase-3
Clivagem de Acinus
Condensação da cromatina
Fragmentação do DNA
SUBSTRATOS DAS CASPASES
CASPASE-6Lâmina NuMA (proteína do aparelho mitótico-nuclear)
manutenção da integridade estrutural nuclear (condensação do envelope nuclear)
CASPASE-3ICAD (inibidor de DNase ativada por caspase)PARP (polimerase poli ADP-ribose)DNA-PK (proteína quinase dependente de DNA)PAK2 (proteína quinase ativada pela p21)
Todas participam do reparo do DNA e integridade genômica
Fragmentação do DNACondensação da cromatinaGelsolina: envolvida na montagem e desmontagem de actina (parte do citoesqueleto – estrutura da célula)Acinus (fator nuclear): após clivagem essencial para a condensação da cromatina
SUBSTRATOS DAS CASPASES
VIAS APOPTÓTICAS
Via independente de caspase
Via extrínseca – ligaçãodos receptores de morte:Fas/CD95/Apo-1, TNFR e TRAIL:expressos em timócitos, células Bativas, células T, monócitos,macrófagos e neutrófilos
-estímulo externo ( radiação,drogas,inflamação) ligação com ligantesespecíficos aos receptores deMorte: FasL/Fas; TNF- /TNFR) DISC (complexo de sinal indutor de
morte) Fasl/Fas + FADD + procaspase 8 caspase 8 ativada cascata de caspases
VIAS APOPTÓTICAS
Via intrínseca-Mitocondrial: estímulo interno:ROS, NO, citocinas (IL-1, IL-6) ativação Bax, Bid translocação do citosol p/ membrana mitocondrial liberação do citocromo c formação do apoptossomo clivagem da procaspase-9 caspase-9 ativa cascata de caspases clivagem da caspase-3 ativa fator de fragmentação do DNA quebra do DNA a cada 200pb
DUAS PRINCIPAIS VIAS DA APOPTOSE
CD95
Degradação DNA
Degradação proteínas nuclear e citoesqueleto
Condensação da cromatina e citoplasma
Fragmentação nuclear
Mudanças na permeabilidade da membr. mitocôndria
Via extrínseca da apoptose
TNF, TRAIL, CD95 (FAS ou APO1)
1) Ligantes de morte ligam-se aos receptores de morte
2) Molécula adaptadora FADD é recrutada
3) Ligação de caspases-8 e 10
Bloqueia a ativação da caspase-8
Bloqueia a ativação da caspase-8
Ativa o domínio BID, membro apoptótico da família Bcl-2
Cliva e ativa a caspase-3 efetora
DISC: complexo sinalização indutor de morte
Apoptose --- Via extrínseca
Apoptose --- Via intrínseca
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APOPTOSE – EFEITO NUCLEARClivagem do DNA nas unidades nucleossomais:
-PARP (reparo DNA) → clivada pela caspase 3
-Laminas → degradaçãp pela caspase 6 → condensação da cromatina e fragmentação nuclear
-Fragmentação do DNA:
Realizada pela enzima CAD (DNase ativada por caspase)
Complexo inativo CAD+ICAD
ICAD clivado → Caspase 3
CAD → fragmentação DNA
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Membrana externa:
membros anti-apoptóticos: Bcl-2, Bcl-Xl sobrevivência celularsobrevivência celular
Membros pró-apoptóticosMembros pró-apoptóticos:: Bad e Bax Bad e Bax interagem com Bcl-2 e Bcl-Xlinteragem com Bcl-2 e Bcl-Xl
Mitocôndria:Mitocôndria: liberação do citocromo C (poros liberação do citocromo C (poros Bad e Bax) Bad e Bax)
[citocromoC + Apaf-1 + ATP + pro-caspase 9][citocromoC + Apaf-1 + ATP + pro-caspase 9]
caspase 9caspase 9
caspase 3caspase 3
Apoptossomo
FUNÇÃO DA MITOCÔNDRIA
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APOPTOSSOMO – Ativação das Caspases
Estrutura em roda:
7 moléculas Apaf-1 + citocromomo C + ATP
7 moléculas pró-caspase 9
MÉTODOS PARA DETECÇÃO DA APOPTOSE
Citomorfológico: hematoxilina-eosinaFragmentação do DNA: TUNEL (Terminal dUTP Nick End-Labeling) → inserção de nucleotídeos marcados- dUTP nas extremidades 3’-OH DNA fragmentadoAnticorpos:
- caspases clivadas: caspase-3 ativada ou CPP32 - Anexina 5: externalização da fosfatidilserina membrana
externa da célulaEnsaio mitocondrial e liberação do citocromo c: corantes fluorescentes e microscopia eletrônicaPCR microarray: perfil de expressão de ~112 genes → painel de genes relacionados a apoptose
Combinar uma ou mais técnicas bioquímicas com morfológica → eventos precoces e tardios
Toxicol Pathol 2007 35: 495
Coloração H&E: Pâncreas de camundongo: setas células apoptóticas: citoplasma condensado e núcleos picnóticos
Coloração H&E: miocárdio de rato: setas indicam células apoptóticas: núcleo fragmentado
TUNEL: células mamárias
TUNEL: testículo
B
C D
mucosa gástrica normal
gastrite crônica superficial
gastrite crônica moderada
gastrite atrófica
TUNEL: núcleo marrom
A B
C
mucosa gástrica normal
gastrite crônica superficial
gastrite crônica moderada gastrite atrófica
CASPASE-3: citoplasma marrom
1- AIDS destruição apoptótica dos linfócitos T/CD4 destruição apoptótica dos linfócitos T/CD4 indução da permeabilização da membrana mitocondrialindução da permeabilização da membrana mitocondrial
2- Doenças neurodegenerativas: Alzheimer e Parkinson apoptose precoce dos neurôniosapoptose precoce dos neurônios demência progressiva, demência progressiva, perda cognitiva e memóriaperda cognitiva e memória
3- Infarto do miocárdio por isquemia necrose das células necrose das células que dependem dos vasos afetados e apoptose das células que dependem dos vasos afetados e apoptose das células vizinhas pela geração de ROSvizinhas pela geração de ROS
4- Doenças hepáticas induzidas por toxinas e alcoolismo
5- Osteoporose perda da massa ósseaperda da massa óssea
Doenças Associadas com Aumento da apoptose
CâncerLinfoma folicular, Carcinoma mamário
Tumores hormônios dependentesCâncer de próstata e ovário
Doenças auto-imunes falhas (no timo) na apoptose de falhas (no timo) na apoptose de células T que reagem com substâncias do próprio organismocélulas T que reagem com substâncias do próprio organismo
Lupus eritrematoso sistêmicoGlomerulonefrite imuno-mediada
Infecções virais inibem apoptose dasinibem apoptose das células infectadascélulas infectadas Herpesvírus
PoxvírusAdenovírus
Doenças Associadas com Diminuição da apoptose
APOPTOSE E CÂNCER
DEFEITOS NAS VIAS DE SINALIZAÇÃO DA APOPTOSE
CÂNCER
APOPTOSE: elimina as células com DNA lesado ou ciclo celulardesregulado
ALTERAÇÃO DA APOPTOSE
INICIAÇÃO DO TUMOR
AUMENTA A PROGRESSÃO TUMORAL E PROMOVE METÁSTASES: permitem as células
tumorais sobreviverem durante o trânsito na circulação sanguínea e crescerem em sítios de tecidos ectópicos, sem
os fatores de crescimento necessários.
RasBCL-2
Oncogenes :
• Regulam ou controlam o crescimento e a proliferação celular
•Atuam no controle do mecanismo da morte celular
INIBEM A APOPTOSE
FUNÇÃO DA PROTEÍNA P53
~50% dos cânceres humanos apresentam mutação de p53 (fator de transcrição):
-parada do ciclo celular
-reparo do DNA
-apoptose
Mutação de p53
Resistência à quimio e radioterapia: células não entram em Apoptose
Limiar aumentado da apoptose: pode conferir às celulas cancerosas resistência a várias formas de terapia.
Apoptose: tem uma função importante na regulação do crescimento tumoral e resposta do tumor à terapia
Tratamento citotóxico: radiação
ou quimioterapia
Resposta apoptótica: Dependente da dose
Candidato da Terapia Antitumoral:Aumentando a resposta apoptótica de
tecidos cancerosos ou inibindo a resposta apoptótica de tecidos
normais
•tecnologia antisense: oligos antisense contra Bcl-2, XIAP e survinina•proteínas antagonistas como Bax: inibição da atividade anti-apoptótica;utilizando ou elaborando compostos farmacêuticos que liguem-se em seus sítios ativos• siRNA p/ c-FLIP, Bcl-2, XIAP: induz apoptose p/ tratamento do câncer•Inibidores de caspases•Terapia gênica: restauração da função de p53
ALVOS PARA A TERAPIA DO CÂNCER
Reguladores da apoptose : principais fatores que contribuem p/ resistência a quimioterapia
Estratégias de terapias indutoras de apoptose:
Exemplos:
•Inibidores de caspase:- z-VAD-fmk (sintético) reduz a gravidade da injúria de reperfusão do miocárdio (modelos de ratos)-inibidores de ICE (Interleukin-1 beta-converting enzyme) ou caspase-1:tratar artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias via redução de interleucina-1β-K-777: inibidor de caspase p/ tratar doença Chagas•Inibidores de PARP1: atenuar células inflamatórias e isquêmicas e injúria de órgãos•Inibidores de Bax: previnir liberação do cit c da mitocôndria
ALVOS PARA A TERAPIA DO CÂNCER