Gabriela da Silva Dias Análise proteômica da variação ... · nem pensava em começar o mestrado...

Gabriela da Silva Dias

Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto Butantan, para obtenção do título de Mestre em Toxinologia.

São Paulo

2013


Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto Butantan, para obtenção do título de Mestre em Toxinologia.

Orientadora: Solange Maria de Toledo Serrano

São Paulo

2013

FICHA CATALOGRÁFICA

Elaborada com instruções fornecidas pela Biblioteca do Instituto Butantan

Dias, Gabriela Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca/Gabriela da Silva Dias/ orientadora: Solange Maria de Toledo

Serrano. – São Paulo, 2013

143 fls. : il. color. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação

em Toxinologia. Instituto Butantan, 2013

1. Bothrops. 2. Veneno de Serpente. 3. Proteômica 4. Filhotes. 5. Variabilidade Individual. I. Orientadora: de Toledo Serrano, Solange Maria. II. Programa de Pós-

Graduação em Toxinologia. Instituto Butantan. III. Título.

CDC 615.9

Av. Vital Brasil, 1500

São Paulo,05503-‐900 Tel/Fax: (11) 3726-‐7222 r 2064

[email protected] http://posgrad.butantan.gov.br

POS-GRADUAÇÃO EM TOXINOLOGIA

INSTITUTO BUTANTAN

RESULTADO DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO

MESTRADO

NOME DO ALUNO(A): Gabriela da Silva Dias DATA DO EXAME:.............../................ /................. BANCA EXAMINADORA: Profs. Drs. NOME Assinatura Aprovado(a) Reprovado(a) ________________________ ______________________ ( ) ( ) (Presidente) ________________________ ______________________ ( ) ( ) ________________________ ______________________ ( ) ( ) DECISÃO FINAL: APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A) ( ) Comentários da Banca (opcional):

Dias G.S. 2013

AUTORIZAÇÃO PARA REPRODUÇÃO DO TRABALHO

Eu, Gabriela da Silva Dias, mestranda pelo Programa de Pós-

Graduação em Toxinologia, autorizo a reprodução deste trabalho no site da

Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo.

______________________________


Aluna

______________________________

Solange de Maria Toledo Serrano

Orientador

Dias G.S. 2013 Dedicatória

Aos meus pais que me ensinaram

a lição que nenhuma escola pode

ensinar, às minhas amadas irmãs,

Camila e Luciane, ao meu eterno

namorado Alexandre e minhas

pequenas Molly e Miney (em

memória)

Dias G.S. 2013 Dedicatória

À minha orientadora Dra. Solange

Maria de Toledo Serrano pela

oportunidade grandiosa e

aprendizado, e ao Dr. André

Zelanis pela impecável co-

orientação.

Dias G.S. 2013 Agradecimentos

Agradecimentos

Esse pequeno espaço jamais representará a imensa gratidão que existe no

meu coração para cada uma dessas pessoas citadas abaixo.

Primeiramente agradeço a Deus por sempre me abençoar e guiar meus

caminhos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

À diretora do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada do Instituto

Butantan, Dra. Solange Maria de Toledo Serrano, que me deu essa grandiosa

oportunidade de conhecer o mundo da pesquisa científica e me abrir os

horizontes para o que é a vida.

Ao Programa de Pós Graduação em Toxinologia do Instituto Butantan e seus

funcionários: Kimie e Rosana.

Ao Dr. Hugo Armelin, diretor do CAT/cepid por permitir desenvolver o trabalho.

Aos membros da banca de qualificação, Dra. Ana Maria Moura da Silva

(Laboratório de Imunopatologia), Dr. Marcelo Santoro (Laboratório de

Fisiopatologia) e a Dr. Ida Shigueko (Laboratório de Fisiopatologia) pelas

sugestões, pelas críticas valiosas e elogios.

Ao Dr. André Zelanis, pela paciência e dedicação que teve desde quando eu

nem pensava em começar o mestrado até finalizar o mesmo.

Aos colegas do Laboratório de Herpetologia que forneceram gentilmente os

filhotes para que pudéssemos fazer a extração do veneno e desenvolver esse

projeto. Em especial ao Dr. Sávio Stefanini e a Dra. Marisa Rocha que

dispenderam um tempo precioso comigo.


À todos meus amigos do Laboratório Especial de Toxinologa Aplicada, Dr.

Alexandre Tashima, Dra. Aline Lopes, Dra. Amanda Asega, Debora Andrade,

Edson Takeshi, Eduardo Kitano, que me acolheram tão bem desde o primeiro

momento que entrei, e sem excessão, me ajudaram, apoiaram em todos os

momentos que passei por aqui e se tornaram uma agradável extensão da

minha casa.

À Dra Ana Helena que teve uma contribuição valiosa para esse projeto.

À Dra Milene Menezes pela amizade, carinho e risadas. À Msc Ana Karina

pela amizade, conselhos e inúmeras conversas. À Dra. Eliana Blini Marengo

pela doçura e Dra. Fernanda Bruni pela calma que transmite. E que juntas

fazem uma quinta feira ótima.

À Luciana Bertholim pela companhia no Alemão.

Aos funcionários da Laboratório Especial de Toxinoliogia Aplicada, em especial

Isaías, Zezé, Cissa e Dona Cida que me acompanham desde o começo.

Aos meus amigos da pós graduação, Hugo Vigerelli, Karina Kodama e Tarcísio

Liberato que dividiram comigo as angústias e alegrias do dia-a-dia na vida de

um estudante de pós graduação.

Aos meus pais, Nilo Dias e Eliete da Silva Dias por serem exemplos de vida e

por sempre me proporcionar mais do que poderiam.

Às minhas irmãs, Camila e Luciane que sempre estiveram presentes em todos

os momentos da minha vida dividindo sorrisos e lágrimas.

Ao meu namorado, Alexandre, por sempre me apoiar nas decisões difíceis e

incentivar meus estudos.


Aos meus padrinhos Eliane e Saulo, que sempre foram como segundos pais

pra mim. E a toda minha família que é meu alicerce de vida.

À minha prima-amiga querida Simone Beu.

Às minha amigas queridas Karen e Patrícia, que me acompanham desde a

época que não sabíamos das responsabilidades da vida.

À família do Alexandre: Zê, Sui, Fábio e Dona Almira que se tornou minha

família também.

Às amigas Jussara Santana, Paula Gouvêa e Fernanda Sasaki.

Dias G.S. 2013 Epígrafe

“Ela acreditava em anjo e, porque acreditava, eles existiam”. A Hora da estrela - Clarice Lispetor

Dias G.S. 2013 Resumo

RESUMO

DIAS G.S. Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca. 2013. 144 fls. (Mestrado em Toxinologia) - Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto Butantan, São Paulo-SP.

Venenos do gênero Bothrops causam, além de efeitos locais, efeitos

sistêmicos sobre os sistemas hemostático e cardiovascular. Mudanças ontogenéticas, além de variações relacionadas ao sexo do animal, na composição individual e atividades dos venenos de adultos, são características frequentemente reportadas na literatura, entretanto, a variação na composição individual de venenos de filhotes de serpentes deste gênero não é conhecida.

Para este estudo, o veneno de 21 filhotes de B. jararaca foi extraído e estocado individualmente a -20°C até o uso. A quantificação de proteínas nos venenos variou entre os indivíduos, porém a maioria apresentou valores de 110-120 mg/ml. Os perfis eletroforéticos foram analisados com e sem redução das pontes de dissulfeto das proteínas e diversas diferenças foram visualizadas entre os venenos. O perfil eletroforético dos venenos com coloração para glicoproteínas mostrou sutis diferenças. A análise por Western blot utilizando um anticorpo anti-bothropasina mostrou reconhecimento significativo, porém variável, de bandas contendo metaloproteinases, na maioria dos venenos. Da mesma forma, a análise utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2, revelou variação com relação às massas moleculares e intensidades das bandas reconhecidas contendo serinoproteinases.

Considerando a importância da atividade proteolítica nos envenenamentos, foram utilizados dois substratos diferentes para a determinação dessa atividade: a proteína caseína, que pode ser degradada tanto por serinoproteinases como metaloproteinases e o substrato sintético L-Benzoil-Arginil-pNA (L-BAPNA) que é degradado somente por serinoproteinases. Valores de atividade caseinolítica específica não apresentaram variação expressiva entre os venenos, porém quanto à atividade amidolítica sobre o substrato L-BAPNA os venenos mostraram significantemente diferentes, e alguns deles não apresentaram atividade enzimática sobre este substrato. Da mesma forma, a atividade coagulante sobre o plasma humano, determinada pela Dose Mínima Coagulante, mostrou-se bastante variável entre os indivíduos.

A análise dos venenos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) apresentou diferenças significativas entre algumas amostras, contudo uma característica ubíqua foi a presença do tripeptídeo <EKW em todos os venenos, um importante tripeptídeo, que é inibidor de metaloproteinases.

O perfil eletroforético dos venenos, analisados com as proteínas submetidas à redução de pontes de dissulfeto, mostrou significativa variabilidade e a identificação de proteínas por digestão in gel com tripsina seguida de análise por LC-MS/MS foi realizada com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas nos venenos individuais de filhotes. Por outro lado, a análise eletroforética comparativa dos venenos em condições não

Dias G.S. 2013 Resumo

redutoras mostrou perfis individuais menos variáveis, quando comparados com a análise com redução, e a identificação de proteínas presentes em uma região do gel, que era semelhante entre os venenos, levou à identificação de metaloproteinases, L-aminoácido-oxidase, e aminopeptidase, que seriam toxinas comuns entre eles.

Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram a expressiva variabilidade individual nos venenos de filhotes de B. jararaca, fato que já havia sido demonstrado em venenos individuais de adultos desta espécie, e sugerem que a variação individual nos venenos está presente desde o nascimento, não sendo um reflexo da ontogenia do animal. Estes achados servem como subsídios para o entendimento das bases moleculares da variabilidade de venenos de serpentes, sobretudo da B. jararaca.

Palavras-chave: Bothrops, veneno de serpente, proteômica, filhotes,variabilidade individual.

Dias G.S. 2013 Abstract

ABSTRACT

DIAS G.S. Analysis of the individual variation of the venom proteome of Bothrops jararaca newborn specimens. 2013.144 p (Mestrado em Toxinologia) - Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto Butantan, São Paulo-SP.

Envenomation by Bothrops snakes cause local damage as well as systemic, hemostatic and cardiovascular effects. Ontogenetic changes and variations related to animal gender, composition and activities of individual adult venoms are features commonly reported in the literature, however, the variation in the composition of newborn snake venom is still unknown.

For this study, venom from 21 newborn specimens of B. jararaca was milked and stored at -20°C until use. Protein quantification in the fresh venoms varied among individuals however most of them showed values between 110 and 120 mg/ml. Venom electrophoretic profiles were analyzed under reducing and non-reducing conditions and showed various differential protein bands among the venoms. Glycoprotein staining showed some subtle variations in the individual venom glycoproteomes. Comparison of the venoms by Western blot analysis using an anti-metalloproteinase antibody (anti-bothropasin) showed intense recognition of various protein bands, however their molecular masses varied among the venoms. Likewise, recognition of serine proteinases in the venoms by an anti-serine proteinase antibody (anti-MSP1/MSP2) revealed bands of variable molecular masses in newborn venoms.

Considering the importance of the proteolytic activity in B. jararaca accidents, two different substrates were used for measuring this activity: i) casein, a protein that can be degraded by both metalloproteinases and serine proteinases; ii) benzoyl-L-arginyl-pNA (L-BAPNA), a synthetic substrate which is only degraded by trypsin-like serine proteinases. The caseinolytic activity did not vary among the venoms, however, individual values of amidolytic activity upon L-BAPNA were significantly different among the venoms and some of them did not hydrolyze this substrate. Similarly, the coagulant activity was assessed by the determination of the Minimum Coagulant Dose and showed remarkable variability among the venoms.

Analysis of the venoms by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) showed significant differences between some samples, however, an interesting finding was the ubiquitous presence in these venoms of the tripeptide <E-K-W, which is an important inhibitor of venom metalloproteinases. The electrophoretic profiles of proteins submitted to reduction of disulfide bonds showed significant variability among the venoms and identification of proteins by in gel trypsin digestion followed by LC-MS/MS was carried out to identify proteins differentially expressed in the individual newborn venoms. On the other hand, the electrophoretic profiles of venoms analyzed under non-reducing conditions showed less individual variability and the identification of proteins present in a region of the gel which contained a broad protein band present in all venoms revealed the presence of metalloproteinases, L-amino acid oxidase, and amino peptidase as common components of these venoms.

Dias G.S. 2013 Abstract

Taken together, the results of this study demonstrate the significant individual variability in the venom of newborn B. jararaca specimens, a feature that has also been shown in adult specimens of this snake. Moreover, the findings of this work suggest that individual venom variability in B. jararaca exist since very early animal age and is not a result of ontogenetic changes. These findings can contribute for the understanding of the molecular basis of the variability of snake venoms, especially in B. jararaca.

Keywords: Bothrops, snake venom, proteomics, newborn, individual variability.

Dias G.S. 2013 Lista de Figuras

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Serpente Bothrops jararaca filhote. ................................................... 11 Figura 2. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca (proteínas não submetidas à redução) ............................................................................... 25 Figura 3. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca (proteínas submetidas à redução) ..................................................................................... 27 Figura 4. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca com coloração fluorescente para glicoproteínas. ...................................................... 29 Figura 5. Análise por Western blot dos venenos de filhotes de B. jararaca utilizando o anticorpo anti- bothropasina.. ......................................................... 31 Figura 6. Análise por Western blot dos venenos de filhotes de B. jararaca utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2. ........................................................... 33 Figura 7. Atividade proteolítica de venenos de filhotes de B. jararaca utilizando como substrato a caseína. ................................................................................. 35 Figura 8. Atividade amidolítica de venenos de filhotes de B. jararaca utilizando como substrato Benzoil-Arginil-p-nitroanilida. ................................................... 36 Figura 9. Perfis de LC-MS dos venenos de filhotes de B. jararaca .................. 39 Figura 10. Espectro representativo (MS/MS) do sequenciamento do íon correspondente ao peptídeo <E-K-W. ............................................................... 40 Figura 11. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca em gel de SDS-poliacrilamida (proteínas submetidas à redução) com indicação das bandas de proteínas recortadas para identificação por LC-MS/MS. ................. 42 Figura 12. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca em gel de SDS-poliacrilamida (proteínas não submetidas à redução) com indicação das bandas de proteínas recortadas para identificação por LC-MS/MS.. ................ 49 Figura 13. Comparação de características dos venenos de filhotes de B. jararaca machos e fêmeas utilizando o Teste T não pareado. .......................... 57 Figura 14. Dendrograma do agrupamento hierárquico dos venenos de filhotes de B. jararaca, evidenciando a divisão em dois grupos principais .................... 59

Dias G.S. 2013 Lista de Tabelas

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, com atuação sobre a hemostasia. ......................................................................................................... 7 Tabela 2. Dados dos espécimes de serpentes B. jararaca filhotes utilizados neste estudo. ..................................................................................................... 22 Tabela 3. Quantificação de proteínas presentes nos venenos individuais de B. jararaca filhotes. ................................................................................................ 23 Tabela 4. Atividade coagulante dos venenos de 21 filhotes de B. jararaca sobre o plasma humano. ............................................................................................. 37 Tabela 5. Identificação de diferentes bandas de proteínas dos venenos de filhotes de B. jararaca, indicadas na Figura 11, por LC-MS/MS. ....................... 43 Tabela 6. Identificação de diferentes bandas de proteínas dos venenos de filhotes de B. jararaca, indicadas na Figura 12, por LC-MS/MS ........................ 50

Dias G.S. 2013 Lista de Abreviaturas e Siglas

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BPP: Bradykinin Potentiating Peptide (Peptídeo potenciador de bradicinina)

BSA: Bovine Serum Albumin (soroalbumina bovina)

CRISP: Cysteine- rich secretory protein ( Proteína secretada rica em cisteína)

CTL: C-Type Lectin (Lectina tipo-C)

DMC: Dose mínima coagulante

DTT: DL-ditiotreitol

FII: Fator II / Protrombina

FIIa: Fator II ativado / trombina

FLA2: Fosfolipase A2

FX: Fator X / Fator de Stuart

FXa: Fator X ativado

IAA: Iodoacetamina

IgG: Imunoglobulina G

kDa: Kilodalton

LAAO: L-aminoácido oxidase

L-BAPNA: L-Benzoil-Arginil-pNitroAnilida

LC: Liquid chromatography (cromatografia líquida).

LC-MS/MS: Liquid Chromatography coupled to tandem mass spectrometry

(Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas seqüencial)

m/z: razão massa/carga

MP: Metaloproteinase

nm: nanômetro

NPU: Número de peptídeos únicos

PBS: Phosphate Buffered Saline (tampão fosfato-salina)

pNa: para-nitroanilina

Q-ToF: Quadrupole-Time of Flight (Quadrupolo- tempo de vôo)

rpm: Rotações Por Minuto

SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (dodecil sulfato de sódio)

Dias G.S. 2013 Lista de Abreviaturas e Siglas

SDS-PAGE: Sodium Dodecil Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio)

SP: Serinoproteinase

TFA: Trifluoracetic acid (ácido trifluoroacético)

Tris: Tris (hidroximetil) aminometano

VEGF: Vascular Endothelium Growth Factor (Fator de crescimento vascular

endotelial)

Dias G.S. 2013 Sumário

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................... 1 1.1. Proteoma e variabilidade dos venenos de serpentes do gênero Bothrops ................................................................................................... 1 1.2. Bothrops jararaca e seu veneno ....................................................... 6 1.3. Variabilidade no proteoma do veneno de B. jararaca ....................... 8 2. OBJETIVOS ....................................................................................... 12 3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 13 3.1. Extração dos venenos de filhotes ................................................... 13 3.2. Quantificação de proteínas ............................................................. 13 3.3. Eletroforese de proteínas em gel de SDS-poliacrilamida ............... 14 3.4. Atividade caseinolítica .................................................................... 14 3.5. Atividade amidolítica ....................................................................... 14 3.6. Atividade coagulante sobre o plasma– Dose Mínima Coagulante (DMC) .................................................................................................... 15 3.7. Análise do glicoproteoma ................................................................ 15 3.8. Análise por Western blot ................................................................. 15 3.9. Digestão tripsínica in gel e identificação de proteínas por LC-MS/MS ............................................................................................................... 16 3.10. Análise do perfil proteico dos venenos por espectrometria de massas (LC-MS) .................................................................................... 19 3.11. Critério para identificação dos peptídeos e análise em banco de dados ..................................................................................................... 19 3.12. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos venenos ................................................................................................. 20 4. RESULTADOS ................................................................................... 21 4.1. Quantificação da concentração proteica nos venenos individuais de filhotes de B. jararaca ............................................................................ 21 4.2. Comparação do perfil eletroforético individual de venenos de filhotes de B. jararaca ......................................................................................... 24 4.3. Sub-proteoma de metaloproteinases. Análise por Western blot com o anticorpo anti-bothropasina ................................................................ 30 4.4. Sub-proteoma de serinoproteinases. Análise por Western blot com o anticorpo anti-MSP1/MSP2 .................................................................... 32 4.5. Atividade proteolítica dos venenos individuais de filhotes de B. jararaca .................................................................................................. 34 4.5.1. Atividade caseinolítica ................................................................. 34 4.5.2. Atividade amidolítica .................................................................... 35

Dias G.S. 2013 Sumário

4.6. Atividade coagulante dos venenos individuais de filhotes de B. jararaca .................................................................................................. 36 4.7. Análise dos venenos de B. jararaca filhotes por espectrometria de massas (LC-MS) .................................................................................... 38 _Toc3495774384.8. Identificação de proteínas por espectrometria de massas em bandas diferenciais dos venenos ..................................................... 41 4.9. Identificação de proteínas por espectrometria de massas em bandas comuns dos venenos ............................................................................. 48 4.10. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos venenos ................................................................................................. 56 4.10.1. Teste de comparação de médias entre machos e fêmeas ........ 56 4.10.2. Análise multivariada ................................................................... 57 5. DISCUSSÃO ...................................................................................... 60 6. CONCLUSÕES .................................................................................. 68 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 69

Dias G.S. 2013 Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Proteoma e variabilidade dos venenos de serpentes do gênero Bothrops

O gênero Bothrops pertence à família Viperidae, compreende mais de 30

espécies de serpentes, e tem esta denominação decorrente da língua grega:

“Bothros” significa fosseta ou cavidade e “ops”, que significa olho ou face, uma

alusão à fosseta loreal, localizada entre a narina e os olhos destas serpentes.

(Carrasco et al, 2012). São caracterizadas pela ‘cabeça em formato de lança’, e

estão amplamente distribuídas em regiões tropicais como América Latina, mais

específicamente do nordeste do México até a Argentina e parte das ilhas do Caribe

(Campbell e Lamar, 2004). Diversas espécies pertencentes a este gênero são

responsáveis pelos acidentes ofídicos no continente Sul americano (Salomão et al.

1997; Warrel 2004). No Brasil, esse gênero compreende diversas espécies, dentre

as quais estão: Bothrops jararaca (jararaca), B. jararacussu (jararacussu), B.

alternatus (urutu-cruzeiro ), B. neuwiedi (jararaca-pintada) e B. moojeni (caissaca)

(Melgarejo, 2003). O veneno dessas serpentes, que é produzido por glândulas

exócrinas especializadas, consiste em uma secreção que contêm uma mistura

complexa de proteínas e peptídeos bioativos que auxiliam a digestão de uma presa

“não triturada”; constitui um mecanismo de defesa contra predadores/agressores e é

o fator responsável pela subjugação das presas (Gans e Elliot, 1968; Thomas e

Pough, 1979; Mackessy, 1993; Fry et al., 2006; Vonk et al., 2008).

Algumas das proteínas presentes nos venenos do gênero Bothrops são

enzimas, como serinoproteinases (Markland, 1998; Serrano e Maroun, 2005),

metaloproteinases (Moura-da-Silva et al., 2007; Gutiérrez et al., 2005; Fox e

Serrano, 2008), fosfolipases A2 (Kini, 2003, 2005), L-aminoácido oxidases (Du e

Clemetson, 2002), e nucleotidases (Rael, 1998). Esses venenos contêm ainda

outras proteínas como lectinas (Ogawa et al, 2005; Morita, 2005; Lu, 2005) e

disintegrinas (Calvete et al, 2005). Os venenos produzidos por serpentes

pertencentes à família Viperidae são conhecidos por conterem proteínas que


2

interferem com o funcionamento normal do sistema hemostático (Markland, 1998;

Braud et al, 2000; Fox e Serrano, 2005).

As serinoproteinases de venenos de serpentes são classificadas no clan SA,

família S1 da quimiotripsina (Barrett et al., 1995; Rawlings et al., 2008). A tripsina de

mamíferos e as enzimas de venenos apresentam fold semelhante e, acredita-se,

evoluíram a partir de um ancestral comum (Itoh et al., 1988). Estas enzimas

possuem uma tríade catalítica bem conservada formada pelos resíduos His57,

Asp102 e Ser195 (Serrano e Maroun, 2005). As serinoproteinases de venenos

interferem especificamente nos mecanismos hemostáticos e apresentam resistência

à inibição por inibidores plasmáticos de serinoproteinases (Parry et al., 1998). Em

contraste com a tripsina, que apresenta uma vasta especificidade de substrato, as

enzimas de venenos são caracterizadas pela alta especificidade, assim como as

serinoproteinases de mamíferos que regulam a hemostasia (Serrano e Maroun,

2005).

As metaloproteinases de venenos de serpentes são classificadas na família

M12 das metaloproteinases, juntamente com outros dois grupos dessas enzimas: A

Disintegrin and Metalloproteinase (ADAM) e A Disintegrin and Metalloproteinase with

Thrombospondin Motifs (ADAMTS). As metaloproteinases são componentes

abundantes em venenos de viperídeos e possuem em seu domínio catalítico um íon

inorgânico (normalmente zinco) coordenado pelas cadeias laterais de três resíduos

de histidina presentes na seqüência HEXXHXXGXXH, que é altamente conservada

nessas proteínas (Hite et al. 1994; Bjarnason e Fox, 1995; Fox e Serrano, 2008).

Com base na estrutura de seus precursores e das proteínas em forma madura (pós-

processamento) as metaloproteinases são divididas em três classes: P-I a P-III. Os

precursores destas proteínas contém em comum um peptídeo sinal, e um pró-

domínio, que mantém a enzima em estado latente, sem atividade proteolítica (Grams

et al, 1993; Stocker e Bode, 1995). Enzimas da classe P-I apresentam apenas o

domínio catalítico, com massa molecular entre 20 kDa e 25 kDa (Bjarnason e Fox,

1995; Fox e Serrano, 2008). Enzimas da classe P-II possuem um domínio

disintegrina na porção carboxil do domínio catalítico. Os precursores de enzimas da

classe P-II podem gerar proteínas maduras formadas somente pelo domínio

catalítico ou somente o domínio disintegrina (P-IIa), como a atrolisina-E, e também

proteínas que conservam o domínio disintegrina na proteína madura como as


3

metaloproteinases jerdonitina (proteína monomérica da classe P-IIb) e bilitoxina-1

(proteína dimérica da classe P-IIc). Estes precursores ainda podem gerar proteínas

maduras compostas por disintegrinas homo-diméricas, como a contortrostatina, ou

hetero-diméricas, como a acostatina, das classes P-IId e P-IIe, respectivamente (Fox

e Serrano, 2005, 2008). Já as enzimas da classe P-III são proteínas com massa

molecular entre 50 kDa e 110 kDa que apresentam na sua forma madura, além do

domínio catalítico, o domínio tipo-disintegrina seguido de um domínio rico em

resíduos de cisteínas na região C-terminal (Bjarnason e Fox, 1995; Fox e Serrano,

2008). A esta classe pertencem proteinases formadas pelos domínios citados, na

forma monomérica (classe P-IIIa) como a atrolisina-A, HF3, e também na forma

dimérica (classe P-IIIc), como a VAP1. Ainda, foi encontrada em venenos de

viperídeos uma proteína composta somente pelos domínios tipo-disintegrina e rico

em cisteínas, formada pelo processamento proteolítico de proteinases da classe P-

IIIb, como jarharagina, bothropasina e catrocollastatina, porém, o domínio catalítico

destas enzimas ainda não foi isolado do veneno (Usami et al., 1994; Shimokawa et

al., 1997). A antiga classe P-IV, hoje denominada classe P-IIId, é composta por

enzimas que apresentam uma cadeia contendo os domínios encontrados nas

proteinases da classe P-III, e mais duas cadeias de lectinas ligadas ao domínio rico

em cisteínas por pontes dissulfeto. São representantes desta classe as proteinases

RVV-X (Russell’s viper venom factor X activator) da Vipera russelli e VLFXA (Vipera

lebetina venom factor X activator) da Vipera lebetina, ambas com atividade de

ativação do fator X da coagulação (Fox e Serrano, 2005, 2008).

As fosfolipases A2 (FLA2) são enzimas que hidrolisam glicerofosfolipídeos na

posição sn-2 da cadeia de glicerol liberando lisofosfolípides e ácidos graxos (Kini e

Iwanaga, 1986; Kini, 2003). São divididas em duas classes: citósólicas e secretadas,

sendo as de veneno des serpentes, secretadas. As FLA2 de veneno apresentam

similaridade de estrutura química e função catalítica com enzimas de mamíferos,

entretanto as FLA2 de venenos são tóxicas e responsáveis por diversos efeitos

farmacológicos, tais como interferência na agregação plaquetária, miotoxicidade,

neurotoxicidade, entre outros (Gutiérrez e Lomonte, 1995; Kini, 1997, 2005).

As lectinas tipo-C são proteínas que requerem íons de Ca+2 para sua

interação com carboidratos específicos. Estas proteínas apresentam uma

conformação típica em sua estrutura (um loop) cujos resíduos coordenam a ligação


4

com íons de cálcio (Drickamer, 1988). A maioria das lectinas encontradas em

venenos de serpentes não apresenta o loop de ligação com íons de Ca+2 e nem

todas se ligam a carboidratos (Clemetson et al. 2001). As lectinas tipo-C são

proteínas diméricas, e apresentam massa molecular de cerca de 30 kDa. Estas

proteínas estão envolvidas principalmente nas alterações de processos

hemostáticos decorrentes do envenenamento, interagindo principalmente com

receptors plaquetários (Zingali et al. 2001).

A variação em proteomas de venenos animais ocorre em diversos níveis,

includindo interfamília, intergênero, interespécie, intersubspécie e intraespécie. A

variação intraespécie pode acontecer ainda individualmente, devido à variação

sazonal, dieta, habitat, idade e dimorfismo sexual (Chippaux et al, 1991). A

complexidade dos venenos de serpentes tem sido analisada pela

complementaridade das abordagens de transcriptômica e proteômica, que permitem

a elucidação da composição e variabilidade das proteínas e peptídeos, identificação

de modificações pós-traducionais, avaliação do processamento de precursores e de

proteínas maduras, análises de filogenia molecular, entre outras (Tubbs et al., 2000;

Ho, 2002; Kashima et al., 2004; Francischetti et al., 2004; Serrano et al., 2005;

Menezes et al., 2006; Fox et al., 2006; Ching et al., 2006; Cidade et al., 2006).

Considerando que a diversidade e abundância de proteínas presentes nos

venenos é extremamente variável, a análise proteômica é uma ferramenta

importante para o entendimento da complexidade dos venenos. Análises

proteômicas de venenos de serpentes têm revelado aspectos importantes em

relação à variabilidade da composição do veneno, seja ela inter-específica ou intra-

específica (Fox e Serrano, 2008; Calvete et al, 2009; Gutiérrez et al., 2009).

Neste contexto, diversos grupos têm estudado a complexidade e variabilidade

dos proteomas de venenos de serpentes. Gutiérrez et al (2009) compararam o

proteoma de venenos de B. asper, provenientes do Caribe e Costa Rica e

verificaram variação geográfica com relação à presença de diversas classes de

proteínas , tais como disintegrinas, FLA2, serinoproteinases, lectinas tipo-C,

Cysteine-Rich Secretory Protein (CRISP), L-amino acido oxidase e

metaloproteinases. Além disso, esses autores observaram ainda uma variação

ontogenética importante, em que o veneno de espécimes neonatos apresentou uma

alta proporção de metaloproteinases da classe P-III em relação ao veneno dos


5

espécimes adultos, que por outro lado, apresentou maior expressão de

metaloproteinases da classe P-I e FLA2 do tipo Lys-49. Guércio et al. (2006)

analisaram o perfil proteômico de venenos de exemplares juvenis, sub-adultos e

adultos de B. atrox, evidenciando uma pronunciada expressão de metaloproteinases

no veneno dos adultos.

De acordo com Vellard (1937) a variação intraespecífica do veneno de B.

atrox, resultou na variabilidade do quadro clínico e isso evidencia-se em espécies

que tem uma distribuição geográfica mais ampla, como é o caso da espécie citada

acima. Sendo assim a diversidade intraespecífica interfere na variabilidade clínica do

envenenamento, logo, merece mais consideração uma vez que os acidentes podem

requerer diferentes tipos de tratamento. Estudos de Saldarriaga et al. (2003)

relataram maior atividade coagulante nos venenos de exemplares jovens de B.

asper e B. atrox da Colômbia.

A variabilidade geográfica e intra-específica de venenos de serpentes B.

asper provenientes da Costa Rica foi demonstrada principalmente no que diz

respeito à toxicidade (Jimenez-Porras, 1964; Gutierrez et al., 1980; Aragon e

Gubensek, 1981; Moreno et al., 1988). Gutiérrez et al (1980) mostraram que

venenos de serpentes provenientes de regiões do Caribe causavam nos pacientes

maiores efeitos hemorrágico e mionecrótico do que aqueles advindos de diferentes

partes do Pacífico, que por sua vez apresentavam alta atividade proteolítica sobre a

caseína.

O processo de desenvolvimento de um indivíduo até a sua fase adulta

(ontogenia) tem também importante reflexos na composição dos venenos. A

variação ontogenética foi observada também no veneno de B. atrox, em que a

atividade coagulante foi mais intensa para os espécimes jovens em relação ao

veneno dos adultos (Lopez-Lozano et al., 2002). Em conjunto, esses trabalhos e

outros demonstraram que de fato o conhecimento sobre os proteomas do venenos

bem como sua variabilidade, seja de que tipo for, podem impactar a pesquisa

básica, não só para aqueles que estudam evolução de espécies e a relação entre o

conteúdo dos venenos e os efeitos observados no envenenamento, como também

as ações relacionadas ao tratamento, incluindo a seleção dos antissoros e também a

seleção de espécimes para a produção dos antissoros.


6

1.2. Bothrops jararaca e seu veneno

A B. jararaca é uma das mais importantes espécies causadoras de acidentes

ofídicos no Brasil. Os acidentes botrópicos correspondem a mais de 75% dos

acidentes ofídicos no Brasil, segundo estatísticas do Sistema de Informação e

Notificação de Agravos (SINAN) (Ministério da Saúde, 2010). As serpentes B.

jararaca são solenóglifas e possuem hábitos predominantemente noturnos e

generalistas, no entanto, exibem uma notável mudança na dieta associada ao

desenvolvimento ontogenético, alimentando-se de presas ectotérmicas

(principalmente artrópodes, lagartos e pequenos anfíbios) durante a fase juvenil, e

de animais endotérmicos (principalmente pequenos mamíferos) durante a vida

adulta (Sazima, 1992; Martins e Sazima, 2002). Distribuem-se desde o Sudeste da

Bahia até a porção nordeste do Rio Grande do Sul, ocupando uma diversidade de

habitats, desde Mata Atlântica até regiões abertas e áridas, com domínio

predominantemente de cerrado (Campbell e Lamar, 1989).

A característica principal do veneno de B. jararaca é a intensa atividade

proteolítica. Cidade et al. (2006) analisaram um transcriptoma da glândula de

veneno de B. jararaca e identificaram que 53% dos transcritos de toxinas é

constituído de metaloproteinases, e 28% é constituído de serinoproteinases. Grande

parte das toxinas isoladas do veneno de B. jararaca tem ação sobre componentes

da cascata de coagulação sanguínea ou sobre componentes da matriz extracelular e

do epitélio vascular (Theakston e Kamiguti, 2002; Serrano e Maroun, 2005; Moura-

da-Silva et al. 2007). Do veneno da B. jararaca foram isolados e caracterizados

diversos componentes que mostraram interferir em eventos envolvidos na

hemostasia (Tabela 1), incluindo metaloproteinases, serinoproteinases, fosfolipases

A2, lectinas tipo-C e uma nucleotidase.


7

Tabela 1. Toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, com atuação sobre a hemostasia. Toxina Classe Atividade biológica Referência

Bothrombina SP Atividade coagulante (liberação do fibrinopeptídeo A) sem efeito direto sobre plaquetas a menos que haja presença de

fibrinogênio

Nishida et al.,

(1994)

PA-BJ SP Indução da agregação plaquetária pela interação com os receptores plaquetários

PAR1 e PAR4

Serrano et al., (1995); Santos et

al., (2000)

TL-BJ SP Atividade coagulante (liberação do fibrinopeptídeo A ) sobre plasma e

fibrinogênio

Serrano et al., (2000)

KN-BJ SP Liberação de bradicinina do cininogênio bovino de baixo peso molecular e atividade coagulante (liberação do fibrinopeptídeo A)

Serrano et al., (1998)

Bothrops protease A

SP Atividades amidolítica e fibrinogenolítica

Mandelbaum e Henriques (1964); Murayama et al.,

2003; Paes-Leme et al., (2008)

Bothropasina MP (P-IIIb) Hemorragia Mandelbaum et al., 1982; Assakura et

al., 2003

Jararhagina MP (P-IIIb) Hemorragia

Paine et al., 1992 e

HF1 MP (P-III) Hemorragia

Assakura et al., 1986

HF2 MP (P-III) Hemorragia

Assakura et al., 1986

HF3 MP (P-III) Hemorragia Assakura et al., 1986; Silva et al,

2004

Jararafibrase I MP (P-III) Hemorragia e fibrinólise

Maruyama et al., 1992

Jararafibrase II, III, IV

MP (P-II) Hemorragia e fibrinólise

Maruyama et al., 1992; Maruyama et

al., 1993

J proteinase MP (P-II) Atividade caseinolítica Tanizaki et al., 1989

BJ-PI

MP (P-I) Atividade fibrinogenolítica Oliveira et al., 2009


8

BJ-PI2 MP (P-I) Atividade fibrinogenolítica; pró-inflamatória Da Silva et al., 2012

Bothrojaracina

CTL

Bloqueio da atividade da trombina sobre o

fibrinogênio, bem como da ativação plaquetária mediada por fibrinogênio

Zingali et al., 1993

Bothrocetina CTL Indução da agregação plaquetária pela

interação com o fator de von Willebrand Brinkhous et al.,

1981

Jararaca GPIb-BP

CTL Inibição da agregação plaquetária pela interação com a glicoproteína plaquetária Ib

Fujimura et al., 1995

BJ-FLA2

Bothrojaractivase

FLA2

MP (P-II)

NT

Indução de agregação plaquetária

Ativação do fator II da cascata de coagulação sanguínea e fibrinólise

Inibição da agregação plaquetária induzida por ADP

Serrano et al., 1999

Berger et al., (2008)

Santoro et al., (2009)

NPP-BJ

CTL –Lectina tipo-C; MP – Metaloproteinase; FLA2- Fosfolipase A2; SP- Serinoproteinase; NT nucleotidase. Tabela adaptada de Zelanis (2011) e atualizada.

1.3. Variabilidade no proteoma do veneno de B. jararaca

A variabilidade individual do veneno de serpentes não é um assunto muito

pesquisado; isso se dá pela dificuldade de manter os animais de forma individual

nos biotérios. Embora o veneno de B. jararaca tenha sido alvo de diversos estudos,

a extensão da variação individual de seu proteoma ainda é pouco conhecida. Em um

estudo de Menezes et al. (2006) o proteoma do veneno de 18 espécimes de B.

jararaca, provenientes de uma única ninhada, foi avaliado de forma individual,

utilizando técnicas de eletroforese (unidimensional e bidimensional) e análise da

atividades proteolíticas do veneno. Foi mostrado que venenos de fêmeas

apresentavam um perfil eletroforético mais homogêneo quando comparado aos


9

machos, bem como uma maior atividade proteolítica sobre a caseína. Ainda, a

variabilidade do proteoma do veneno desses 18 espécimes de B. jararaca não pôde

ser atribuída a condições do meio ambiente, idade ou até mesmo a dieta, já que

todas nasceram e foram criadas sob as mesmas condições em biotério, fato que

aponta para a herança genética das serpentes exercendo um importante papel no

fenótipo do veneno. De acordo com Pimenta et al. (2007) o perfil de LC-MS desses

18 venenos individuais apresentou expressiva variabilidade. A análise da fração

peptídica dos venenos por espectrometria de massas mostrou a presença de 11

peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) (9a, 10b, 10c, 11a, 11d, 11e, 12b,

12c, 13a, 13b, 14a) distribuídos pelos venenos, porém o único peptídeo que foi

encontrado em todas as amostras analisadas foi o BPP13a.

Em outro estudo, Furtado et al. (1991) mostraram que o veneno de filhotes de

B. jararaca apresentava um valor 12 vezes mais alto para a atividade coagulante

sobre o plasma quando comparado com o veneno dos adultos desta mesma

espécie. No estudo de Zingali (1993) variações individuais também puderam ser

vistas nos perfis de expressão de isoformas de bothrojaracina, um inibidor de

trombina isolado do veneno de B. jararaca. Embora hajam estudos de variações

individuais em venenos de serpentes, nada se sabe sobre essas variações em

venenos de filhotes.

Em um estudo recente sobre a variabilidade do veneno de B. jararaca foi

demonstrado que os venenos de espécimes filhotes e adultos apresentam atividade

hemorrágica similar enquanto que o veneno de adultos tem uma atividade letal

discretamente mais alta sobre camundongos, embora o veneno de filhotes seja

extremamente mais potente sobre aves (Zelanis et al., 2010). Outro fato interessante

é que a atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de dez vezes mais alta

do que a do veneno de adultos. Essas diferenças nas atividades biológicas dos

venenos foram também evidenciadas pelos perfis de eletroforese bidimensional,

zimografia de gelatina, imunocoloração com anticorpos específicos, padrões de

glicosilação e afinidade de glicoproteínas à concanavalina A. A análise da fração

peptídica desses venenos revelou conteúdos diferentes de peptídeos em geral,

enquanto que perfis semelhantes foram obtidos com relação aos BPPs. Em

conjunto, esses resultados indicaram que a variação na dieta da B. jararaca,

passando de presas ectotérmicas na idade juvenil para presas endotérmicas na vida


10

adulta, está associada a mudanças no proteoma e peptidoma do veneno (Zelanis et

al., 2010). Ainda, foi demonstrado que metaloproteinases estão entre as principais

toxinas diferencialmente expressas nos venenos de indivíduos filhotes e adultos de

B. jararaca e que o quociente de metaloproteinases da classe P-III/P-I é maior no

veneno de filhotes do que no veneno de adultos (Zelanis et al, 2011).

Em outro estudo foi mostrado que o transcriptoma de glândulas de veneno de

espécimes adultos de B. jararaca apresenta principalmente transcritos de

metaloproteinases (30%), precursor de peptídeos potenciadores de bradicinina

(23%), lectinas tipo-C (22%), fosfolipases A2 (9%), e serinoproteinases (8%) (Zelanis

et al., 2012). Por outro lado, em filhotes de B. jararaca, os transcritos de

metaloproteinases são muito mais abundantes (53%), enquanto que outras classes

de toxinas (fosfolipases A2, lectinas tipo-C, serinoproteinases e precursores de

peptídeos potenciadores de bradicinina) aparecem em menor abundância. Esses

achados, mostrando uma mudança substancial na composição do veneno durante o

desenvolvimento do animal, correlacionam-se com análises de venenos de filhotes e

adultos desta serpente, realizadas por abordagens proteômicas (Zelanis et al., 2010,

2011). Utilizando abordagem proteômicas e peptidômicas, este trabalho visa analisar

a variabilidade individual do veneno da serpente B. jararaca obtido de filhotes

(Figura 1).


11

Figura 1. Serpente Bothrops jararaca filhote. (Foto:Sávio Stefanini)

Considerando a variabilidade do veneno de B. jararaca relatada em diversos

trabalhos e as implicações em aspectos clínicos e terapêuticos dos acidentes

causados por filhotes e adultos de B. jararaca, torna-se importante um estudo

detalhado, com um enfoque especial para a variabilidade individual dos venenos de

filhotes. Uma abordagem proteômica associada a técnicas tradicionais de química

de proteínas e ensaios biológicos pode evidenciar diferenças qualitativas ou

quantitativas nos venenos de filhotes, fornecendo subsídios para o entendimento da

variabilidade individual verificada nesta espécie e em venenos de outras espécies do

mesmo gênero, no caso de venenos de espécimes adultos. Como regra geral na

toxinologia, a exploração do conteúdo dos venenos de serpentes tem sido realizada

com pools de venenos obtidos de espécimes adultos das serpentes, fato que aponta

para o desconhecimento do conteúdo proteômico dos venenos de filhotes, e de sua

variabilidade individual.

Dias G.S. 2013 Objetivos

12

2. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi analisar as variações proteômicas

individuais em venenos de espécimes filhotes de B. jararaca, nascidos na

mesma época e mantidos nas mesmas condições de biotério.

Objetivos específicos:

- Analisar o perfil proteômico do veneno de cada espécime.

- Analisar as variações proteômicas relacionadas ao sexo.

Dias G.S. 2013 Material e Métodos

13

3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Extração dos venenos de filhotes

A extração dos venenos de filhotes de B. jararaca foi realizada

mensalmente, durante nove meses consecutivos no Laboratório de

Herpetologia do Instituto Butantan, sob a coordenação do Pesquisador MSc.

Savio Stefanini Sant'Anna. Foram selecionados espécimes filhotes (machos e

fêmeas) de diferentes regiões do Estado de São Paulo, Santa Catarina e Minas

Gerais e o estudo foi realizado com indivíduos cujo volume de veneno coletado

era suficiente para a realização das análises, totalizando 21 amostras. Esses

animais foram mantidos individualmente em cativeiro no Biotério de Serpentes

do Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan. Para a extração de

venenos, os animais foram inicialmente anestesiados com o auxílio de gás

carbônico segundo protocolo descrito por Biasi et al. (1976) e, em seguida, o

veneno foi extraído com o auxílio de capilares de vidro.

Após a coleta, as amostras de veneno foram centrifugadas a 2000 x g,

4°C, por 30 min, para remoção do muco salivar, bem como presas ou escamas

que eventualmente estavam presentes no veneno extraído. Após este processo

os venenos foram acondicionados a temperatura de -20°C até o momento do

uso. Os venenos não passaram pelo processo de liofilização devido ao pouco

volume obtido, e foram aliquotados para evitar repetitivos processos de

descongelamento.

3.2. Quantificação de proteínas

A quantificação de proteínas presentes nos venenos foi realizada com

diferentes quantidades de veneno, em triplicata, utilizando o reagente de

Bradford (Bradford, 1976), adquirido da Sigma. Para estimar o teor protéico das

amostras utilizamos uma curva padrão, construída com concentrações

crescentes de soroalbumina bovina (Sigma).


14

3.3. Eletroforese de proteínas em gel de SDS-poliacrilamida

As análises eletroforéticas foram realizadas como descrito por Laemmli

(1970). Foram utilizados géis de 10 x 8 cm x 1.5 mm e um sistema de

eletroforese Hoefer (GE Healthcare). As amostras foram aquecidas a 95 °C

durante 5 min e aplicadas em volume máximo de 30 µl. As corridas foram

realizadas a temperatura ambiente. Para a coloração do gel foi utilizado o

Coomassie Coloidal [(NH4)2SO4 8%, ácido fosfórico 0,68%, Coomassie Brilliant

Blue-G250 (Sigma) 0,08%, metanol 25%]. A análise das imagens foi feita

utilizando o software Image Master Platinum 6.0 (GE Healthcare).

3.4. Atividade caseinolítica

Para este ensaio foi utilizada a caseína N,N-Dimetilada (Sigma) como

substrato, numa solução que continha 0,5 ml de solução tampão (Tris–HCl 0,1

M, pH 8,8, CaCl2 0,01 M), contendo 0,01 mg ou 0,02 mg do veneno e 0,5 ml de

caseína 2% (solubilizada no mesmo tampão), por 30 min, a 37 °C. A reação foi

interrompida com 1 ml de ácido tricloroacético 5%, a mistura foi centrifugada a

14.000 rpm, por 15 min e a absorbância do sobrenadante foi medida a 280 nm.

Uma unidade de atividade foi definida como o aumento de 1 U da densidade

óptica (DO) por min a 280 nm. A atividade específica foi expressa em

unidades/mg de proteína.

3.5. Atividade amidolítica

A atividade amidolítica foi determinada utilizando como substrato

Benzoil-Arginil-p-nitroanilida (L-BAPNA) (Sigma), na concentração de 0,002 M

em solução tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. O veneno foi utilizado nas doses

de 0,01 mg e 0,02 mg de proteína em 450 µl de solução tampão. Após a adição

da amostra de veneno à solução do substrato (450 µl), esta permaneceu por 30

min a 37°C. A reação foi interrompida com 100 µl de ácido acético 30% e a p-


15

nitroanilina que é liberada pela atividade amidolítica de serinoproteinases foi

medida a 405 nm no espectrofotômetro (Gene Quant- Amersham Biosciences).

3.6. Atividade coagulante sobre o plasma– Dose Mínima Coagulante (DMC)

A Dose Mínima Coagulante (DMC) é definida como a menor quantidade

de veneno capaz de coagular uma solução padronizada de fibrinogênio ou

plasma citratado em 60 seg a 37°C (Theakston e Reid, 1983). Para este ensaio

foi utilizado plasma humano citratado (contendo citrato de sódio 3,8%) e o

ensaio foi realizado em triplicata. A 200 µL de plasma foram adicionados 100

µL de veneno em diferentes concentrações (obtidas através de diluições

seriadas). As soluções de plasma foram mantidas em banho de gelo durante o

uso, e a 37°C, quando nas cubetas do fibrômetro (BBL Fibrosystem, Becton

Dickinson).

3.7. Análise do glicoproteoma

Para a visualização das bandas de glicoproteínas presentes nas

amostras de veneno analisadas por eletroforese foi utilizada a coloração

fluorescente Pro-Q-Emerald (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante.

A coloração para glicoproteínas foi realizada após a separação das proteínas

por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12%. A visualização das bandas

foi obtida após a exposição dos géis em transiluminador de ultravioleta (UV) a

300 nm.

3.8. Análise por Western blot

A visualização do sub-proteoma de metaloproteinases e

serinoproteinases das amostras de veneno de B. jararaca foi realizada por

imunocoloração com um antissoro policlonal anti-bothropasina

(metaloproteinase da classe P-III do veneno de B. jararaca; (Mandelbaum et


16

al., 1982) e um antissoro policlonal anti-MSP1/MSP2 (serinoproteinases do

veneno de B. moojeni; Serrano et al., 1993), respectivamente. Após a

eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12 % as proteínas dos venenos

foram transferidas eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose

(GE Healthcare) em uma cuba miniVE (GE Healthcare) preenchida com

tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% e SDS

0,037%). A transferência ocorreu sob voltagem fixa de 20V por 18 horas. Após

este período, as membranas foram imersas em uma solução 0,5% de corante

Ponceau S em ácido acético 1%, para se verificar a correta transferência das

proteínas. Em seguida, as membranas foram lavadas com água destilada e

imersas em uma solução de leite desnatado 5% em PBS (fosfato de sódio

monobásico 0,05M, fosfato de sódio dibásico 0,05M, NaCl 0,15M) por 30 min,

sob agitação.

O anticorpo primário (policlonal, preparado em coelhos foi adicionado

seguindo a diluição de 1:500 em uma solução de PBS contendo Tween 0,1%.

As membranas foram incubadas por uma hora nesta solução, sob agitação. Em

seguida, foram lavadas por 30 min com uma solução de PBS contendo Tween

0,1%. Finalmente, foi adicionado o anticorpo secundário (anti-IgG de coelho

conjugado à peroxidase) na diluição de 1:1000 em solução de PBS contendo

Tween 0,1% e as membranas foram imersas nesta solução por uma hora. A

revelação se deu com a adição da solução de 4-cloro-1-naftol (Sigma) em Tris-

HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 e 0,5% de peróxido de hidrogênio.

3.9. Digestão tripsínica in gel e identificação de proteínas por LC-MS/MS

Bandas de proteínas de interesse, presentes no gel de SDS-

poliacrilamida, foram recortadas e submetidas ao processo de digestão in gel

segundo o protocolo descrito por Hanna et al., (2000), com algumas

modificações. Todos os reagentes que foram utilizados foram preparados no

momento do uso.


17

Inicialmente os fragmentos de gel recortados foram incubados em 500

µL de uma solução de metanol 50% /ácido acético 5% em água MilliQ® por

duas horas. Em seguida, essa solução foi removida por aspiração com pipeta e

500 µL foram adicionados aos fragmentos de gel, permanecendo por mais uma

hora nesta solução. Em seguida, os fragmentos de gel foram desidratados pela

incubação por 10 min (2 vezes de 5 min) em 200 µL de acetonitrila (100%). A

solução de acetonitrila foi aspirada com pipeta e o restante evaporado em um

sistema de concentração a vácuo (speed vac). Após esta etapa, os pedaços de

gel foram reidratados por 30 min em 30 µL (por fragmento de gel) da solução

redutora (ditiotreitol 10 mM em bicarbonato de amônio 100 mM). Decorrido o

tempo de reidratação com DTT, a solução foi aspirada com pipeta e os

fragmentos de gel foram incubados por 30 min em 30 µL (por fragmento de gel)

da solução alquilante (Iodoacetamida 50 mM em bicarbonato de amônio 100

mM). Em seguida, a solução alquilante foi removida por aspiração com pipeta

e, os fragmentos de gel submetidos à incubação, por 10 min, em 100 µL (por

fragmento de gel) de uma solução de bicarbonato de amônio 100 mM. Após

esta etapa, a solução de bicarbonato de amônio foi retirada e 200 µL (por

fragmento de gel) de acetonitrila 100% foram adicionados e os fragmentos de

gel incubados nesta solução por 5 min. A solução de acetonitrila foi retirada e,

novamente, os fragmentos de gel incubados, por 10 min, em 200 µL (por

fragmento de gel) da solução de bicarbonato de amônio 100 mM. Na última

etapa de desidratação, a solução de bicarbonato de amônio foi retirada e os

fragmentos de gel incubados por 10 min (duas vezes de 5 min) em 200 µL de

acetonitrila 100%. A solução de acetonitrila foi retirada por aspiração com

pipeta e o restante evaporado em sistema speed vac. Os fragmentos de gel

foram reidratados em 5 µL de uma solução de tripsina (50 ng/µL em

bicarbonato de amônio 50 mM), em banho de gelo, por 30 min. Em seguida, a

solução de tripsina foi retirada, uma solução de bicarbonato de amônio 50mM

foi adicionada (em um volume suficiente para cobrir os fragmentos de gel) e os

tubos contendo os fragmentos de gel foram incubados em banho

termostatizado (a 37°C) por 18 horas.

A extração dos peptídeos do gel foi feita com a adição de 30 µL (por

fragmento de gel) da solução 1 - acido fórmico 5% (em água MilliQ) - e


18

incubação dos pedaços de gel por 10 min nesta solução, a temperatura

ambiente. Em seguida, a solução contendo os peptídeos foi transferida para

um novo tubo e, ao pedaço de gel do tubo anterior foram adicionados 12 µL

(por fragmento de gel) da solução 2 - acido fórmico 5% em acetonitrila 50%. Os

fragmentos de gel foram incubados por 20 min (duas vezes de 10 min) nesta

solução, e a solução que foi transferida para o tubo contendo os peptídeos que

foram extraídos com a solução 1. A solução será concentrada em speed vac e

os peptídeos resultantes foram ressuspendidos em 20µL (por amostra) de

ácido fórmico 0,1% e analisados em um espectrômetro de massas do tipo

Quadrupolo – Tempo de Vôo com fonte de ionização nanospray (Q-ToF Ultima,

Waters).

Uma alíquota de 4,5 µl da solução de peptídeos foi aplicada numa

coluna de trapping (coluna C-18; 180 µm x 20 mm, diâmetro interno e

comprimento, respectivamente, Waters) com fluxo de 15 µl /min, ajustado

diretamente no programa do cromatógrafo nano Acquity (Waters). Em seguida

a mistura de peptídeos foi submetida à cromatografia líquida de fluxo

nanométrico, utilizando coluna C-18 capilar de 100 µm x 100 mm (Waters),

num fluxo de 600 nl/min, com um gradiente de 0 a 80 % de acetonitrila

(solvente B) em ácido fórmico 0,1 %, (Solvente A) durante um total de 20 min

(3 % de B em 1 min; 60 % de B em 14 min; 80 % de B em 2 min e 30

segundos; 80% de B em 1 min e de 80-3% de B em 1 min e 30 segundos).

Como calibrante foi utilizada a infusão constante de uma solução de ácido

fosfórico 0,1% / acetonitrila 25 % em água MilliQ®, num fluxo de 700 nl/min.

No espectrômetro, a voltagem e a temperatura da fonte de ionização

foram ajustadas para 3.4 kV e 100 °C, respectivamente. O espectrômetro foi

operado no modo DDA, utilizando uma varredura de massas na região de m/z

de 200 a 2000, seguida da dissociação induzida por colisão dos 3 íons mais

intensos. O espectrômetro foi ajustado para operar com um tempo de exclusão

dinâmica de 90 segundos (para se diminuir a aquisição repetitiva de um mesmo

valor de m/z).


19

3.10. Análise do perfil proteico dos venenos por espectrometria de massas (LC-MS)

Uma alíquota de 4,5 µl da solução de veneno (contendo 1 µg, em ácido

fórmico 0,1 %) foi aplicada numa coluna de trapping (conforme descrito no item

3.9.). A cromatografia ocorreu utilizando um gradiente de 0 a 80 % de

acetonitrila (solvente B) em ácido fórmico 0,1 %, (Solvente A) durante um total

de 60 min (3 % de B em 1 min; 45 % de B por 57,5 min; 80 % de B por 1 min e

voltando a condição inicial de 80-3% de B em 1 min). A análise de massas foi

realizada utilizando o espectrômetro Q-TOF Ultima (Waters), utilizando os

mesmos parâmetros descritos anteriormente (item 3.9).

3.11. Critério para identificação dos peptídeos e análise em banco de dados

Para identificação dos peptídeos gerados pela digestão das proteínas

com tripsina utilizamos o banco não redundante do National Center for

Biotechnology Information (nrNCBI Databank) e restringimos o universo de

busca à taxonomia Serpentes, que contava com 25211 proteínas depositadas

na data 20 de Junho de 2011. Como parâmetros de busca foram utilizados: i)

uma clivagem perdida pela tripsina; ii) resíduos de cisteína carbamidometilados

(que foram escolhidos como uma modificação fixa) e resíduos de metionina

oxidados (que foram escolhidos como uma modificação variável). Utilizando o

programa Mascot (Matrix Science), acessado através de um servidor instalado

no Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada (Mascot Server versão 2.2),

para identificação, foram considerados os peptídeos cujos íons individuais

excederam os valores de homology score associados e cujos scores para os

íons de carga +1,+2, +3 e +4 e apresentaram valores maiores ou iguais a 10,

20, 20 e 40, respectivamente.


20

3.12. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos venenos

As amostras foram divididas em dois grupos: machos (n= 9) e fêmeas

(n= 12). As variáveis analisadas foram: concentração proteica, atividade

caseinolítica, atividade amidolítica e atividade coagulante. Para cada variável,

foi realizado o teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov (Henderson, 2006),

que mostrou que todas apresentavam distribuição normal.

Para a comparação de médias entre os dois grupos, empregou-se o

Teste T com amostras independentes, considerando igualdade de variâncias

em todas as comparações, fator este definido através da análise de igualdade

de variâncias (estatística F). Para o Teste T, considerou-se um intervalo de

confiança de 95%.

Para a realização das análises estatísticas foi utilizado o pacote Action®

(Estatcamp), que é um software livre (URL: http://www.portalaction.com.br),

instalado como suplemento do MicrosoftTM Excel.

Para a análise de cluster, foi utilizado o método de agrupamento

hierárquico, considerando como parâmetros a distância euclidiana e

encadeamento completo. As variáveis utilizadas na análise foram: sexo,

atividade caseinolítica, atividade amidolítica e atividade coagulante. Foi omitida

da análise a informação acerca da procedência geográfica das amostras, de

modo que qualquer agrupamento que porventura separasse as amostras de

acordo com a região de procedência seria baseado um reflexo das

características do veneno e/ou sexo das serpentes.

Dias G.S. 2013 Resultados

21

4. RESULTADOS

4.1. Quantificação da concentração proteica nos venenos

individuais de filhotes de B. jararaca

Para este estudo foram coletadas amostras individuais de veneno de 21

filhotes de B. jararaca. A coleta foi realizada mensalmente, durante 9 meses

consecutivos, juntamente com o Pesquisador Msc. Sávio Sant´anna. Embora

nascidas no Instituto Butantan, no Laboratório de Herpetologia, sua

progenitoras (que chegaram em estado de prenhez) são provenientes de 9

regiões diferentes (Tabela 2). A quantificação de proteínas foi feita utilizando

duas concentrações do veneno em triplicata. A concentração de proteínas nos

venenos frescos variou entre os indivíduos, porém a maioria deles apresentou

valores entre 110 a 120 mg/ml, enquanto que dois espécimes apresentaram

valores extremos abaixo (87 mg/ml) e acima (135 mg/ml) de concentração

proteica (Tabela 3).


22

Tabela 2. Dados dos espécimes de serpentes B. jararaca filhotes utilizados neste estudo.

Amostras Procedência Sexo

1 São Bento do Sul-SC ♂

2 São Bento do Sul-SC ♀



5 São Bento do Sul-SC ♀




9 Pilar do Sul-SP ♂

10 Pilar do Sul-SP ♀

11 Ibiúna-SP ♀

12 Ibiúna-SP ♀

13 São Lourenço da Serra-SP ♂

14 São Lourenço da Serra-SP ♀

15 São Lourenço da Serra-SP ♀

16 Extrema-MG ♀

17 Pilar do Sul-SP ♂

18 Araçariguama-SP ♀

19 Santana do Parnaíba-SP ♀

20 Ribeirão Pires-SP ♀

21 Tapiraí-SP ♀


23

Tabela 3. Quantificação de proteínas presentes nos venenos individuais de B. jararaca filhotes.

Venenos Concentração proteica

(mg/ml)

1 86,64 ± 3,9

2 108,28 ± 4,4

3 113,15 ± 3,3

4 90,9 ± 10,7

5 110,86 ±14,2

6 128,16 ± 3,9

7 116,67 ± 16,2

8 131,24 ± 12,0

9 118,97 ± 10,0

10 122,38 ± 11,5

11 110,09 ±5,7

12 129,71 ± 8,7

13 123,35 ± 10,1

14 110,50 ± 11,4

15 118,91 ± 16,6

16 127,76 ± 17,4

17 127,24 ± 18,0

18 106,15 ± 10,3

19 134,66 ± 13,1

20 119,13 ± 15,9

21 108,92 ± 15,7

Os valores representam a média ± desvio padrão de 3 determinações.


24

4.2. Comparação do perfil eletroforético individual de venenos de filhotes de B. jararaca

Para a comparação dos proteomas dos venenos, a análise do perfil

eletroforético, seja ela realizada com ou sem redução das pontes de dissulfeto

das proteínas, é uma técnica útil para se entender a natureza da complexidade

dos componentes do veneno. Para visualização inicial do perfil protéico

individual dos venenos, 20 µg de cada amostra foram submetidos à

eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12% e os géis foram corados com

Azul de Coomassie Coloidal. Diversas diferenças foram visualizadas entre as 21 amostras de venenos

de filhotes, sendo elas pertencentes à mesma ninhada ou à ninhadas

diferentes. A variabilidade também pôde ser vista de acordo com o sexo e a

região. Na Figura 2, pode-se verificar bandas distintas no perfil eletroforético,

em condições não redutoras, desde a região de massa molecular abaixo de 10

kDa, até acima de 70 kDa. Foram visualizadas bandas similares, mas não

idênticas em intensidade, em todas as amostras, como aquelas presentes na

região de 45-50 kDa. Verificamos também que todas os venenos apresentaram

perfil de bandas bem distinto na região de 18 a 22 kDa. Na Figura 2, as massas

moleculares indicadas para as bandas de proteínas dos venenos não são

exatas já que as proteínas não foram submetidas à redução de suas pontes de

dissulfeto e assim não são comparáveis exatamente àquelas das proteínas

marcadoras de massa molecular que foram submetidas à redução.

Gabriela da Silva Dias Análise proteômica da variação ... · nem pensava em começar o mestrado...

Documents

Transcript of Gabriela da Silva Dias Análise proteômica da variação ... · nem pensava em começar o mestrado...