· G10 INF-0089 VERSIÓN/ 00 PÁGINAS/ 1/133 ANTERIOR/ N/P BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM...

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 1/133

ANTERIOR/ N/P

BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA

RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)

SECCIÓN DE APROBACIÓN

ELABORADO POR/ MsC. Alejandro Portillo Vaquer FIRMA/

Responsabilidad/ J´Dpto de Control de la Calidad EPOVAC FECHA/

REVISADO POR/ MSc. Jinnay Rodríguez FIRMA/

Responsabilidad/ Especialista Asuntos Regulatorios CIMAB S.A FECHA

REVISADO POR/ Dra. Giselle Suárez Martínez FIRMA/

Responsabilidad/ Asesor Médico CIMAB S.A FECHA

REVISADO POR/ MSc. Anamary Bencomo FIRMA/

Responsabilidad/ Comercial Regional CIMAB S.A FECHA/

REVISADO POR/ MSc. Aurora Tamara García Melo FIRMA/

Responsabilidad/ J´ Dpto. Aseg. Calidad EPOVAC FECHA/

REVISADO POR/ Dra.C. Yamile González González FIRMA/

Responsabilidad/ Gerente Producto. FECHA/

REVISADO POR/ Dra. Yusnely Román Rodríguez FIRMA/

Responsabilidad/ Responsable de Farmacovigilancia CIMAB S.A FECHA/

APROBADO POR/ MSc. Yanet Borrego Morales FIRMA/

Responsabilidad/ Directora de EPOVAC FECHA/

APROBADO POR/ MSc. Yamira Busutil Sosa FIRMA/

Responsabilidad/ Directora de Calidad y Asuntos Regulatorios FECHA/

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 2/133

ANTERIOR/ N/P



INDICE PAG

RESUMEN.............................................................................................................................3

INDICE DE ABREVIATURAS ..............................................................................................4

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................5

LISTA DE TABLAS ...............................................................................................................9

1. INTRODUCCION ......................................................................................................... 12

2. OBJETIVO ................................................................................................................... 12

3. ALCANCE .................................................................................................................... 12

4. DESCRIPCION DEL PROCESO DE ior®EPOCIM (eritropoyetina). .......................... 12

5. MATERIALES Y METODOS. ...................................................................................... 35

6. RESULTADOS Y DISCUSION. .................................................................................... 47

7. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 127

7. REFERENCIAS ............................................................................................................. 128

8. REVISIÓN HISTÓRICA ................................................................................................ 133

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 3/133

ANTERIOR/ N/P



RESUMEN

El producto terminado (PT) de eritropoyetina humana recombinante (EPOhr) producido por el

Centro de Inmunologia Molecular (CIM), se comercializa bajo el nombre de ior® EPOCIM en

Cuba, con número de registro sanitario: 0095 aprobado el 21/abril/1998 para EPO 2 000 UI/mL,

B-17-148-B03 aprobado el 25/octubre/2017 para EPOhr 3 000 UI/mL, 0096 aprobado el

21/abril/1998 para EPOhr 4 000 UI/mL, B-17-146-B03 aprobado el 25/octubre/2017 para EPOhr

5 000, B-04-020-B03 aprobado el 23/enero/2004 para EPO 10 000 UI/mL, B-17-145-B03

aprobado el 25/octubre/2017 para EPOhr 30 000 UI/mL y B-17-147-B03 aprobado el

25/Xoctubre/2017 para EPOhr 40 000 por el Centro para el Control Estatal de los Medicamentos,

Dispositivos y Equipos médicos de Cuba (CECMED).

La experiencia comercial de ior® EPOCIM en el mercado, incluye, el registro sanitario en 29

países demostrando su seguridad y eficacia.

La eritropoyetina (EPO) es un factor estimulante de la eritropoyesis en los mamíferos producido

por tecnología del ADN recombinante. Tiene una estructura y un mecanismo de acción bien

caracterizado y establecido.

Con el fin de establecer la biocomparabilidad, el CIM realizó este estudio de comparabilidad

para demostrar la similitud físico-química, biológica, preclínica y clínica del producto

ior®EPOCIM con el producto de referencia, EPREX®/ERYPO® (Estudios realizados en

laboratorios en México, Canada, Cuba y Tailandia).

La estructura y funcionabilidad de ior®EPOCIM se ha caracterizado a través de métodos

analíticos sensibles y robustos. Las diferencias obtenidas en la caracterización entre ior®

EPOCIM y EPREX®/ERYPO®, específicamente en los estudios de N-Glicosilación y el perfil

de isoformas por electroforesis capilar de zona (EC) no tuvieron un impacto en los estudios

preclínicos, al no obtenerse diferencias estadísticas significativas en los resultados de actividad

biológica in vitro (proliferación celular) e in vivo (ratones normocitemicos) y afinidad (Biacore)

de ior® EPOCIM y EPREX®/ERYPO®.

Los resultados de los estudios preclínicos y clínicos obtenidos, confirman la similitud del

ior®EPOCIM con el producto de referencia. La totalidad de evidencia documentada en este

reporte incluye los datos analíticos, funcionales, preclínicos y clínicos, y permite determinar la

biocomparabilidad del ior®EPOCIM con el producto de referencia EPREX®/ERYPO®

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 4/133

ANTERIOR/ N/P



INDICE DE ABREVIATURAS

ADN: Ácido Desoxirribonucleico.

ANOVA: Análisis de Varianza.

AUC: Área bajo la curva

BioCen Centro Nacional de Biopreparados.

BRP Preparación Biológica de Referencia

BSA Suero de Albumina Bovina

CECMED: Centro para el Control Estatal de los Medicamentos, Dispositivos y Equipos

CENPALAB: Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio.

CIGB Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

CIM: Centro de Imunologia Molecular.

CIMAB Representante exclusivo del Centro de Inmunología Molecular para la

comercialización de productos biofarmacéuticos.

Empresa comercializadora de produto biotecnológicos.

Cl Aclaramiento total

CME: Centro de Masa Espectral.

COFEPRIS: Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.

COP Parámetros Críticos de Operación

CRS Sustancia Química de Referencia

CV%: Coeficiente de variación en porciento.

CHCM: Concentración Hemoglobina Corpuscular Media.

CHO Célula de Ovario de Hámster Chino

DC Dicroísmo circular

DE: Desviación estándar.

DO: Densidad óptica.

EAG: Evento Adverso Grave

EC Electroforesis capilar de zona

EM Espectrometría de masas

Emax: Respuesta máxima

EPO Eritropoyetina

EPOhr Eritropoyetina humana recombinante

FB: Farmacopea Británica

FE: Farmacopea Europea.

FR Fase reversa

GF Gel filtración

Hb Hemoglobina

HCM: Hemoglobina Corpuscular Media.

HCP Proteína contaminante de la célula hospedera

HPLC Cromatografía liquida de alta resolución

Hto Hematocrito

IEF Isoelectroenfoque

IFA Ingrediente Farmaceutico Activo

IFA: Ingrediente Farmacéutico Activo.

IPC Control en proceso

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 5/133

ANTERIOR/ N/P



IPC Controles de proceso

IPT Ensayos de proceso

Ka: Constante de asociación.

KD Farmacodinamia

Kd: Constante de disociación.

KOP Parámetros de Operación Claves

LAL: Lisado de Amebocitos de Limulus

LAMMB: Laboratorio Nacional para la Producción y Análisis de Moléculas y

Medicamentos Biotecnológicos.

MRT Material de Referencia de Trabajo

MRT: Tiempo médio de residencia.

OP Parámetros de Operación

Phe Fenil alanina

PP Parámetro de desempeño

PRCA Aplasia de células rojas

PT Producto terminado

QFB Químico físico y biológico

RAP: Revisión Anual de Producto.

EPOhr Eritropoyetina humana recombinante

Rmax Respuesta máxima.

SEPB Subcomité de evaluación de productos biotecnológicos

T ½ α: Tiempo vida media de la fase de distribución

T ½ β: Tiempo vida media de la fase de eliminación

TA Tanque agitado

TC Toxicocinética

Trp Triptófano

Tyr Tirosina

UDIBI: Unidad de desarrollo e investigación en bioprocesos.

UE: Unidades de Endotoxinas.

UI Unidades internacionales

UNAM: Universidad Nacional Autónoma de México.

USP Farmacopea de los Estados Unidos de América

VCM Volumen corpuscular medio

VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana

Vss Volumen de distribución en el estado estacionario

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Comparación de los espectros de emisión de 10 lotes del IFA a una longitud de onda de

excitación de 280 y 295 nm utilizando el buffer de formulación en cada corrida.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 6/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 2. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-250 nm) de las muestras: CE-C01-M77

(3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505), CE-C01-M80

(3342/P1506), CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540), CE-C01-M83

(3342/P1541), CE-C01-M84 (3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y CE-C01-M86

(3342/P1544).

Figura 3. Espectro de dicroísmo circular en la región del UV cercano (260-330 nm) de las muestras:

CE-C01-M77 (3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505),

CE-C01-M80 (3342/P1506), CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540),

CE-C01-M83 (3342/P1541), CE-C01-M84 (3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y

CE-C01-M86 (3342/P1544).

Figura 4. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-260 nm) de las muestras del IFA de

ALVERITIN® y EPREX® analizadas en SBS/Tailandia.

Figura 5. Cromatograma del mapeo peptídico del blanco.

Figura 6. Cromatograma del mapeo peptídico de las muestras analizadas. De arriba hacia abajo:

MRT(QFB)rh-EPO/0113, 3342/P1511, 3342/P1512, 3342/P1513, el lote de EPREX® FDS

6Q01 y el blanco del ensayo.

Figura 7. Secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina (Referencia FE 1316, 2016):

Figura 8. Secuencia de aminoácidos del IFA de ALVERITIN®

Figura 9. Secuencia de aminoácidos del lote de EPREX®

Figura 10. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes reductoras teñido con azul de

Coomassie. Se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular Bench

Mark, carril 2 Lote: FDS6Q01, carril 3 Lote: FAS 4800, carril 4 Lote: FBS 4Z00, carril 5

vacío, carril 6 Lote: 3342/P1511, carril 7 Lote: 3342/P1512, y carril 8 Lote: 3342/P1513.

Figura 11. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes no reductoras teñido con azul de

Coomassie. Se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular Bench

Mark, carril 2 Lote: FDS6Q01, carril 3 Lote: FAS 4800, carril 4 Lote: FBS 4Z00, carril 5

vacío, carril 6 Lote: 3342/P1511, carril 7 Lote: 3342/P1512, y carril 8 Lote: 3342/P1513.


Coomassie. Se cargó 12 μl de cada muestra. Carril 1 Lote FBS 4Z00, carril 2 Lote: FAS

4800, carril 3 vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote: LP00515 y carril 6 Lote:

LP00615. MP corresponde al marcador de peso molecular Bench Mark.

Figura 13. Western Blot en membrana de PVDF revelada con solución de carbazol. Carril 1 Lote FBS

4Z00, carril 2 Lote: FAS 4800, carril 3 vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote:

LP00515 y carril 6 Lote: LP00615. MP corresponde al marcador de peso molecular Dual

color.

Figura 14. Western Blot. Carril 1: 10 ug MRT(QFB)EPOhr/0113. Carril 2: 0,2 ug

MRT(QFB)EPOhr/0113. Carril 3: 10 ug Lote FDS 6Q01. Carril 4: 0,2 ug Lote FDS 6Q01.

Carril 5: 10 ug Lote LP00615. Carril 6: 0.2 ug Lote LP00615. Carril 7: 10 ug Lote

3342/P1513. Carril 8: 0.2 ug Lote 3342/P1513

Figura 15. Western Blot .Carril 1: 10 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 2: 0,2 ug

MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 3: 10 ug Lote FAS 4800.Carril 4: 0,2 ug Lote FAS

4800.Carril 5: 10 ug Lote LP00415.Carril 6: 0.2 ug Lote LP00415.Carril 7: 10 ug Lote

3342/P1511.Carril 8: 0.2 ug Lote 3342/P1511

Figura 16. Western Blot.Carril 1: 10 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 2: 0,2 ug

MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 3: 10 ug Lote FAS 4Z00.Carril 4: 0,2 ug Lote FAS

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 7/133

ANTERIOR/ N/P



4Z00.Carril 5: 10 ug Lote LP00515.Carril 6: 0.2 ug Lote LP00515.Carril 7: 10 ug Lote

3342/P1512.Carril 8: 0.2 ug Lote 3342/P1512

Figura 17. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.996, el

cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).

Figura 18. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.993, el

cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).

Figura 19. Gel de IEF teñido con nitrato de plata..MRT: 4 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 1: 4 ug

FDS6Q01.Carril 2: 4 ug 3342/P1512

Carril 3: 4 ug 3342/P1513.

Figura 20. Gel de IEF tenido con nitrato de plata.MRT: 4 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 1: 4 ug

FAS4800.Carril 2: 4 ug FBS4Z00.Carril 3: 4 ug 3342/P1511

Figura 21. Perfil de IEF de varias eritropoyetinas biosimilares y original. IEF fue desarrollado en un

rango de pH de 2-6. Fuente: Reichel y cols, 2009.

Figura 22. Espectro originado de cálculos derivativos de segundo orden de Tiroglobulina. El eje X

corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda

derivada del espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos

correspondientes al análisis del 17dic2015.


corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda

derivada del espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos

correspondientes al análisis del 10may2016.

Figura 24. Comparación de los espectros (orden cero) obtenidos del barrido de adsorción UV de 250 a

350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA de ALVERITIN®.

Figura 25. Comparación de los espectros derivativos de segundo orden obtenidos del barrido de

adsorción UV de 250 a 350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA de

ALVERITIN®.

Figura 26. Espectro de emisión de BSA a excitando a 280 y 295nm. Datos correspondientes a la

verificación del 16dic2015.


verificación del 26abri2016.

Figura 28. Comparación de los espectros de emisión de EPREX®/ERYPO® y el IFA excitando a 280

y 295nm.

Figura 29. Curva de calibración del estándar de homopolímero de glucosa. Se muestra la correlación

después de un ajuste polinomial de tercer orden, la cual fue usada para el cálculo de las

unidades de glucosa (UG) en los cromatogramas. Verificación correspondiente al

03dic2015 (A) y al 17ago2016 (B).

Figura 30. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de

EPREX®/ERYPO®.

Figura 31. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras del IFA.

Figura 32. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de EPREX®/

ERYPO® y el IFA.

Figura 33. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Vera y cols, 2011.

Figura 34. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Liem y cols, 2016.

Figura 35. Cromatogramas obtenidos por el método de HPLC-GF.

1- MRT: MRT(QFB)EPOhr/0113

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 8/133

ANTERIOR/ N/P



2- IFA Lote: 3342/P1511

3- IFA Lote: 3342/P1512

4- IFA Lote: 3342/P1513

5- Innovador ERYPO® Lote: FAS 4800

6- Innovador ERYPO® Lote: FBS 4Z00

7- Innovador EPREX® Lote: FDS 6Q01

Figura 36. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor

de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).

Figura 37. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor

de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).

Figura 38. Comparación del efecto proliferativo in vitro del EPREX®/ERYPO® vs ALVERITIN®.

Figura 39. Frecuencia de reticulocitos en respuesta a 67.5, 90 y 120 UI/ratón del medicamento de

prueba, referencia y Material de Referencia Interno, 72 horas después de su administración

a ratones B6D2F1. A los ratones B6D2F1 se les administró vía subcutánea uno de los

tratamientos: medicamento de prueba, medicamento de referencia, Material de Referencia

Interno en concentración de 67.5, 90 y 120 UI/ratón o control negativo (SF). Después de 72

horas de la administración de los tratamientos se obtuvo una muestra sanguínea de cada

uno de los ratones y se tiño con azul de metileno) para evaluar la frecuencia de reticulocitos

por cámara de neubauer. La gráfica muestra la frecuencia media de reticulocitos inducidos

por las muestras en 6 ratones por grupo. Las barras corresponden a la desviación estándar

de cada media. Los valores medios de los ratones controles negativos estuvieron entre 10-

15 reticulocitos (Datos no incluidos en las gráficas).

Figura 40. Sensogramas obtenidos en los lotes de EPREX®/ERYPO®. Tiempo vs Respuesta (RU).

Figura 41. Sensogramas obtenidos en los lotes de ALVERITIN®. Tiempo vs Respuesta (RU).

Figura 42. Respuesta a Altas dosis (600 UI/kg) de ior®EPOCIM y EPREX® para reticulocitos, RBC,

hemoglobina y Hematocritos. A y C (machos) y B y D (hembras).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 9/133

ANTERIOR/ N/P



LISTA DE TABLAS

Tabla A: Resgistros sanitarios otorgados.

Tabla 1: Controles de proceso para medio de cultivo.

Tabla 2: Controles y criterios de aceptación de las soluciones para su uso en la etapa de

purificación.

Tabla 3. Controles de proceso de la etapa descongelación.

Tabla 4. Controles de proceso de la etapa de cultivo en frascos T.

Tabla 5. Controles de proceso de la etapa de cultivo en rollers (inóculo).

Tabla 6. Controles de proceso de la etapa de fermentación en 30 L.

Tabla 7. Parámetros de operación de la etapa de fermentación en 1000 L.


Tabla 9. Parámetros de desempeño de la etapa de fermentación en 1000 L.

Tabla 10. Parámetros de operación de la etapa de cosecha.

Tabla 11. Controles de proceso de la etapa de cosecha.

Tabla 12. Controles de proceso de la etapa de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.

Tabla 13. Controles de proceso de la etapa de Sephadex G-25.

Tabla 14. Controles de proceso de la etapa de Quelatos Metálicos.


Tabla 16. Controles de proceso de la etapa de Q.

Tabla 17. Controles de proceso de la etapa de Superdex.

Tabla 18. Comportamiento de los controles de proceso en la etapa de cromatografía filtración en gel

durante los años 2015 y 2016.

Tabla 19. Controles de proceso de la etapa de confección del IFA.

Tabla 20. Controles de proceso en la etapa de Microfiltración.

Tabla 21. Resultados de los atributos de calidad, especificaciones y métodos de análisis del IFA

obtenidos en el CIM durante los años 2014, 2015 y 2016. Valores medios anuales.

Tabla 22. Resultados del nivel de contaminantes y concentración de proteínas presentes en los lotes

de IFA utilizados en el estudio de biocomparabilidad.

Tabla 23. Comparación estadística entre los espectros del grupo 1 y el grupo 2 del IFA. El análisis

estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo ANOVA.

Tabla 24. Determinación del centro de masa espectral (CME) a 280 y 295nm de excitación para los

10 lotes de IFA evaluados.

Tabla 25. Conformación estructural delas muestras del bloque 1 y 2.

Tabla 26. Resultados del análisis de secuenciación N-terminal de 10 lotes de IFA.

Tabla 27: Listado de lotes utilizados en el estudio de biocomparabilidad.

Tabla 28. Listado de matriz para caracterización física/química/biológica y laboratorio participante.

Tabla 28A: Listado de ensayos preclínicos y laboratorio participante.

Tabla 28B: Listado de ensayos clinicos

Tabla 29. Resultados del análisis de secuenciación del lote de IFA y EPREX®.

Tabla 30. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante reductoras de las muestras

de EPREX®/ERYPO®.


del IFA.

Tabla 32. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 10/133

ANTERIOR/ N/P



muestras de EPREX®/ERYPO®.

Tabla 33. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las

muestras del IFA.

Tabla 34. Análisis estadístico tipo t-Student.

Tabla 35. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras del IFA.

Tabla 36. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras de EPREX®/ERYPO®.

Tabla 37. Resumen de biocomparabilidad entre los espectros derivativos de segundo orden de los

medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.

Tabla 37A. Resumen de biocomparabilidad entre las intersecciones obtenidas en el rango 285-295nm

de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.

Tabla 38. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 16dic2015

Tabla 39. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 26abri2016

Tabla 40. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras de

EPREX®/ERYPO®.

Tabla 41. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras del IFA.

Tabla 42. Resumen de la comparación de espectros de fluorescencia. Los resultados obtenidos se

presentan tal y como los arroja el ANOVA.

Tabla 43. Resumen de la comparación de CMEs por medio del análisis estadístico t de Student. Los

resultados obtenidos se presentan tal y como los arroja el software Prism 6.

Tabla 44. Resumen de biocomparabilidad entre los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.

Estructuras propuestas para los N-glicanos con base en su migración en unidades de

glucosa, asumiendo que la proteína se produjo en una línea celular murina El análisis

estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p

de dos colas y un intervalo de confianza del 95%. Estructuras propuestas murina. Las

abreviaturas utilizadas son: A: Núcleo quitobiosa con tres manosas y dos N-

acetilglucosaminas. F: Fucosa. G: Galactosa. M: Manosa. S: Ácido siálico. LAC:

Lactosamina (N-acetilglucosamina-G). Los números se refieren al número de cada residuo

en el glicano.

Tabla 45. Resumen de biocomparabilidad entre los grupos de N-glicanos encontradas en las

muestras de EPREX®/ERYPO® y el IFA (producción en línea celular murina). El análisis

estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p

de dos colas y un intervalo de confianza del 95%.

Tabla 46. Verificación del sistema.

Tabla 47. Resultados de electroforesis capilar.



Tabla 50. Resumen de la verificación por HPLC-GF.

Tabla 51. Resumen de la comparación por HPLC-GF.

Tabla 52. Resumen de la comparación de los resultados de HPLC-GF por medio de un ANOVA

Tabla 53. Resultados del contenido de ácido siálico en las muestras del IFA.

Tabla 54. Determinación de endotoxinas bacterianas por LAL.

Tabla 55. Resultado de endotoxinas para los lotes de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®.

Tabla 56. Resultados de conteo de partículas subvisibles para los lotes de ALVERITIN®.

Tabla 57. Resultado de partículas visibles en los lotes de EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN®.

Tabla 58. Resumen estadístico de la comparación entre el efecto del medicamento

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 11/133

ANTERIOR/ N/P



EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN® sobre la proliferación en células TF-1.

Tabla 59. Resultados de potencia y rango mínimo- máximo para los lotes de ALVERITIN® y

EPREX®/ERYPO® determinados por ANOVA de líneas paralelas.

Tabla 60. Potencia: Resultados del ANOVA entre los valores de % potencia de ALVERITIN® y

EPREX®/ERYPO®.

Tabla 61. Resultados de actividad específica de los tres lotes de IFA de ALVERITIN®

determinados mediante el método in vivo de ratones normocitemicos.

Tabla 62. Biacore: Análisis t Student de los parámetros cinéticos entre ALVERITIN® y

EPREX®/ERYPO®.

Tabla 63. Listado de estudios no clínicos realizados y laboratorio participante.

Tabla 64. Registros sanitarios otorgados de ior® EPOCIM hasta el 31 diciembre 2016.

Tabla 65. Pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización por año.

Tabla 66. Total de pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización y en ensayos

clínicos.

Tabla 67. Ensayos clínicos terminados con ior® EPOCIM hasta 31 diciembre 2016

Tabla 68. Reportes espontáneos de EAG.

Tabla 69. Relación de EAG relacionados con ior®EPOCIM reportados hasta 31 diciembre de 2016.

Tabla 70. Relación de eventos adversos graves con incidencia ≥ 5 % en pacientes tratados con ior®

EPOCIM en las indicaciones aprobadas independientemente de su causalidad (acumulado

PSUR 2005-2010, PSUR 2011, IPS-2017).

Tabla 71. Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes a los que se les ha

suministrado ior® EPOCIM. Ensayo realizado el día 10nov2004.


suministrado ior® EPOCIM. Ensayo realizado el día 27oct2004.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 12/133

ANTERIOR/ N/P



1. INTRODUCCION

La eritropoyetina humana recombinate es una hormona glucoproteína de 30.4 kDa compuesta por

165 aminoácidos, la cual es secretada en respuesta a la hipoxia celular (Jelkman, 2011). La

actividad principal es controlar la producción de células eritroides a través de la promoción de la

sobrevivencia, proliferación y diferenciación de progenitores eritroides en la medula ósea

(Miyajima y Kinoshita, 1999). Es utilizada para corregir la anemia asociada a insuficiencia renal

terminal, falla renal crónica, distintos tipos de cáncer, enfermedades autoinmunes, VIH, hepatitis

C, incrementar los niveles de eritrocitos, evitar el riesgo de contraer infecciones post-

transfusionales y mejorar la calidad de vida del paciente (Jelkman, 2003; García, 2011).

Actualmente los biosimilares en general, y más específicamente los de EPOhr, muestran ventajas

significativas para la salud pública aumentando su disponibilidad en el acceso de los pacientes a

medicamentos. Así como la seguridad en el suministro, permitiendo ahorros para los sistemas de

salud, como ya se ha visto en otras regiones como Europa (IMS, 2012).

La comercialización de medicamentos biosimilares permite la competencia con los

medicamentos innovadores de referencia y abre una oportunidad para la reducción de los costos,

especialmente en situaciones de crisis económica contribuyendo a la sostenibilidad del sistema

sanitario (Beatriz, 2015).

Con la introducción de los biosimilares en Cuba, la población cubana se beneficia con el acceso

adecuado a los tratamientos terapéuticos avanzados en la actualidad.

Los resultados obtenidos usando los métodos analíticos recomendados en la guía de

biocomparabilidad emitida por la FDA (FDA/Biosimilarity, 2015), en cuanto a la estructura y

función, demostraron que ior®EPOCIM, con un alto grado de confianza, es biosimilar al

producto de referencia (EPREX®/ERYPO®). Además, los estudios incluyen resultados sobre

efectos toxicológicos y farmacocinéticos en animales de laboratorio y resultados clínicos que

demuestran la no inferioridad del ior® EPOCIM.

2. OBJETIVO

Demostrar la biocomparabilidad del ior®EPOCIM utilizando EPREX®/ERYPO® como

producto de referencia.

3. ALCANCE

Es aplicable a la producción y la analítica del producto ior®EPOCIM.

4. DESCRIPCION DEL PROCESO DE ior®EPOCIM (eritropoyetina).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 13/133

ANTERIOR/ N/P



El biomedicamento ior®EPOCIM se fabrica utilizando el Ingrediente farmacéutico activo (IFA)

producido en el CIM.

4.1 Experiencia comercial de ior®EPOCIM.

La experiencia comercial de ior®EPOCIM en el mercado, incluye hasta el cierre del año 2016, el

registro sanitario en 29 países (Tabla A) demostrando su seguridad y eficacia. Para mas detalles

puede remitirse al acápite 5.4.2 de este informe.

Tabla A. Registros sanitarios otorgados.

No País

1 Cuba

2 Chile

3 República Dominicana

4 Jamaica

5 Colombia

6 Brasil

7 Ecuador

8 Perú

9 Honduras

10 México

11 Panamá

12 EL Salvador

13 Guatemala

14 Venezuela (SERTERE) (Espromed

BIO)

15 Costa Rica

16 India

17 Nicaragua

18 Bolivia

19 Vietnam

20 Argentina

21 Túnez

22 Filipinas

23 Bielorrusia

24 Ucrania

25 Tailandia

26 Turquía

27 Nigeria

28 Myanmar

29 Paraguay

4.2 Proceso de producción del Ingrediente Farmaceutico Activo.

El proceso de producción del IFA consta de las siguientes etapas:

- Preparación de medios y soluciones.

Procesos de expansión celular fermentación

- Descongelación.

- Proceso de cultivo de células en frascos “T”.

- Expansión en frascos rotatorios e inóculo.

- Fermentación en 30 L para la escala productiva.

- Fermentación a escala de producción de 1000 L.

- Cosechas.

Proceso de purificación.

- Cromatografía de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.

- Cromatografía de filtración en gel.

- Cromatografía de pseudo-afinidad por Quelatos metálicos.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 14/133

ANTERIOR/ N/P




- Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose Fast Flow .


- Confección del IFA.

- Microfiltración.

- Definición del lote en cada una de las etapas del proceso hasta la confección del IFA.

Preparación de medios y soluciones.

El medio de cultivo empleado se preparara con agua purificada; cumpliendo con los estándares

establecidos en la USP para la industria biotecnológica y farmacéutica. El medio preparado es filtrado,

esta consiste en un esquema de filtración en serie; primeramente por un tamaño de poro 3 +0,8 μm y

posteriormente una filtración esterilizante de 0,45 +0,2 μm. El medio es almacenado en bolsa estéril y

apirogénica realizándose un muestreo para su liberación. En la tabla 1, se exponen los controles de

proceso (IPC) a cumplir para que el medio de cultivo sea usado en la etapa productiva de fermentación.

Tabla 1: Controles de proceso para medio de cultivo.

Controles Clasificación Criterios de aceptación

pH IPC 6,85 < pH < 7,22

Conductividad IPC 11 mS/cm < Conductividad < 15

mS/cm

Inspección visual IPC Solución transparente después

de 48h a 37ºC

Viabilidad IPC Viabilidad > 85 %

Xv células IPC Xv > 0,6 x 106 células/mL

Las soluciones se prepararan con agua purificada y con agua para inyección según corresponda. Todas

las soluciones preparadas son filtradas a través de filtros de tamaño de poro 0,45 +0,2 μm y

almacenadas en bolsa estéril y apirogénica por no más de 30 días según procedimientos. En la tabla 2

se expone para cada solución sus IPC y criterios de aceptación para que las soluciones preparadas sean

usadas en la etapa productiva de purificación de la EPOhr.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 15/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 2: Controles y criterios de aceptación de las soluciones para su uso en la etapa de purificación.

Soluciones Controles y Criterios de aceptación

Agua para inyección

pH: 5,0-7,0

Conductividad : ≤ 1,2µS/cm

Biocarga:< 10 UFC/100mL

Endotoxinas: < 0,25 UE/mL

Agua Purificada

pH: 5,0-7,0

Conductividad : ≤ 1,2µS/cm

Biocarga:< 100 UFC/mL

Endotoxinas: < 0,25 UE/mL

Tris 20mM, Tween 20 al 1%, pH 7,5 (T1) pH: 7,39-7,58

Conductividad (mS/cm): 0,9 - 3

Tris 20mM, NaCl 1M,Tween 20 al 1%, pH 7,5 (T3) pH: 7,39-7,58

Conductividad (mS/cm): 70 - 90

Alcohol etílico al 20%, KH2PO4 0,1M, pH 8 pH: 7,7-8.3


Na2HPO4 17mM, NaH2PO4 3mM, NaCl 0,5M, pH 7,2 pH: 7,15 – 7,25


Na2HPO4 0,2 mmol/L, NaH2PO4

99, 8 mmol/L, NaCl 0, 5 mol/L pH 4,1

pH: 4,1 – 4,3


Na2HPO4 1,81 mmol/L, NaH2PO4 18,18 mmol/L, pH 6 pH: 5,9 – 6,1


Acetato de sodio 50 mmol/L, Tween 0,01%, pH 4,5 pH: 4,3 – 4,5

Conductividad (mS/cm): 2,0 – 3,5

Na2HPO4 3 mmol/L, NaH2PO4 17 mmol/L,

NaCl 164 mmol/L pH 6

pH: 5,9 – 6,1


NaCl 100mM, Citrato de sodio 20mM, Ácido cítrico

0,36mM, Tween 20 al 0,02%, pH 6,9

pH: 6,85 – 6,95

Conductividad (mS/cm): 10 – 15

Alcohol etílico al 70% pH: NA

Conductividad (mS/cm): NA

Hidróxido de sodio 0,01 M pH: NA





Conductividad (mS/cm): 90-105



Sulfato de Cobre 0,1M pH: NA

Conductividad (mS/ cm): 7 - 10

Cloruro de sodio 3M pH: NA


G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 16/133

ANTERIOR/ N/P



Soluciones Controles y Criterios de aceptación

Cloruro de sodio 0,09% pH: NA


Cloruro de sodio 0,5 M pH: NA


Cloruro de sodio 2M pH: NA


EDTA 50 mM, NaCl 1M pH: NA


Alcohol etílico al 20% pH: NA

Conductividad (mS/cm): NA

* A todas las soluciones se le realiza inspección visual, Criterio: solución transparente después de 24 h.

Procesos de expansión celular y fermentación.

- Proceso de expansión celular.

La línea se obtuvo por co-introducción de los plásmidos pKG-Xho-EPO-Hind y pSV2 DHFR en el

genoma de células CHO dhfr-. Las células CHO dhfr- son un clon de células de ovario de hámster

chino, deficientes del gen para la dihidrofolato reductasa (dhfr). La línea productora de la EPOhr se

obtuvo por la transfección efectiva de las células CHO dhfr- con el DNA exógeno que son dos

plásmidos que contienen entre otros los genes de la eritropoyetina humana y el de la DHFR.

El primer paso del proceso de producción es la descongelación de un ámpula del banco de trabajo. Las

ámpulas deben contener una cantidad de células ≥ 5x106 células, con una viabilidad ≥ 80%. El ámpula

extraída se lleva desde la temperatura de −196ºC hasta la temperatura ambiente (18-24ºC) por

inmersión en un baño de agua a 37,0 ± 1,0˚C. Una vez descongeladas, las células se resuspenden en

medio libre de proteínas, luego se siembran en frascos “T” para comenzar la expansión. La operación

se realiza en cabina de flujo laminar. Los controles de proceso en la descongelación de muestran en la

siguiente tabla.

Tabla 3. Controles de proceso de la etapa descongelación.

Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación

Cantidad de células totales IPC ≥ 5x106 células

Viabilidad celular IPC ≥ 80%

Concentración de EPO IPC ≥ 5 µg/mL

Las células resuspendidas en medio fresco se incuban en frascos “T” de cultivo a una concentración

inicial ≥ 0,25 x 106 células/mL. Las condiciones de cultivo son: temperatura 36,0 ± 1,0 ºC, pH de 6,85 -

7,22. El proceso debe durar entre 48 y 96 horas hasta alcanzar una masa celular confluente para

expandir a botellas rotatorias. La operación se realiza en condiciones asépticas bajo cabina de flujo

laminar. Los controles de proceso se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 4. Controles de proceso de la etapa de cultivo en frascos T.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 17/133

ANTERIOR/ N/P




Observación al microscopio IPC No se observa presencia de contaminación

microbiana

Una vez confluente la suspensión celular proveniente de los frascos “T” se une para ser sembrada en

botellas rotatorias ≥ 0,25 x 106 células/mL. Las condiciones de cultivo que se establecen en esta etapa

son: temperatura 36,0 ± 1,0 0C, velocidad de rotación de 2 a 5,3 r.p.m. Se le adiciona a cada botella

rotatoria medio de cultivo hasta completar el volumen de 500 mL, el objetivo es generar la suficiente

biomasa para inocular el fermentador semilla. Las operaciones se realizan en condiciones asépticas

bajo cabina de flujo laminar.

Se toma una muestra de cada botella rotatoria para cuantificar las células y determinar la viabilidad

celular. Se seleccionan las botellas rotatorias que se emplearán en la confección de inóculo, teniendo en

cuenta que el número de células totales debe ser ≥ 3 000x106 y la viabilidad celular ≥ 80%. Los

controles de proceso se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Controles de proceso de la etapa de cultivo en rollers (inóculo).



Contaminación microbiana (Observación

al microscopio) IPC

No se observa presencia de

contaminación microbiana al

microscopio

Tiempo de las células en cultivo entre la

descongelación y el inóculo en roller IPC ≤ 60 días

Cantidad de células totales en el inoculo

en rollers IPC ≥ 3 000x106 células

- Proceso de fermentación.

Previo a que dé inicio el proceso de fermentación, el bioreactor debe prepararse para tal

acontecimiento. Se somete a un procedimiento de limpieza, que se considera aceptado cuando la

conductividad del agua contenida en el vaso del fermentador sea ≤ 1,3 µS/cm; luego se realiza una

prueba de hermeticidad y posteriormente se procede a la esterilización del vaso y sus periféricos, donde

se tendrán en cuenta todas las medidas de seguridad necesarias de acuerdo con lo establecido en el

registro de lote. Posterior a la esterilización, al fermentador se le aplica medio de cultivo desde la bolsa

de medio hasta que el mismo cubra los electrodos y se activa el control de temperatura en 36 ± 1˚C, el

control de pH en 7,0 ± 0,3 y el control de la velocidad del impelente en 100 r.p.m. Pasadas 48 - 24

horas, se toma una muestra del fermentador para corroborar la esterilidad del medio de cultivo y

comprobar pH. Verificada la esterilización, se comienza el proceso de inóculo del fermentador a partir

de botellas rotatorias.

Una vez que el inóculo esté listo y ha sido aceptado se transfiere al fermentador semilla. Las

condiciones de cultivo son las siguientes: velocidad inicial de agitación del impelente de 100 ± 5 r.p.m.

La temperatura de trabajo 36,0 ± 1 0C; flujo de aireación por la cabeza es de 120 mL/min,

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 18/133

ANTERIOR/ N/P



concentración de oxígeno disuelto en el caldo de cultivo de 50,0 ± 30 % y el pH controlado entre 7,0 ±

0,3.

Una vez que las células alcanzan la densidad celular máxima ≥ 1,0x106 células/mL, se comienza a

adicionar el medio de cultivo hasta alcanzar el volumen de trabajo de 30 L y una población celular

mayor que 24 000 x106 células.

Una vez completado el volumen de trabajo se inicia el proceso de perfusión, con el objetivo de

incrementar la biomasa. Al agotarse la bolsa de medio de cultivo y al llenarse la bolsa de cosecha, éstas

se desconectan empleando vapor limpio para realizar una desconexión aséptica y las nuevas bolsas son

conectadas a las líneas de medio y de cosecha y se esterilizan con vapor limpio suministrado desde el

fermentador.

Cuando se alcance una cantidad de células totales mayor de 60 000 millones, se procederá a transferir

el volumen de sobrenadante que contiene la cantidad de células requeridas hacia el fermentador de

1000L. Durante la fermentación, alrededor de 4 días se dedican a crecer el cultivo en la fase a templa y

más de 15 días al proceso en perfusión. Los controles de proceso de la etapa de fermentación 30L se

muestran en la Tabla 6.




Contaminación microbiana (Observación

al microscopio) IPC



microscopio.

Concentración de Glucosa IPT 5–20 mM

Concentración de EPO IPT ≥ 5 µg/ml

pH IPT 7±0,3

El propósito del Fermentador de Tanque Agitado (TA) 1000L, es la obtención de sobrenadante rico en

EPOhr a partir del cultivo de las células CHO-TA encargadas de su secreción.

Para lograr lo anteriormente descrito se somete a un procedimiento de limpieza, que se considera

aceptado cuando la conductividad del agua contenida en el vaso del fermentador sea ≤ 1,3 µS/cm,

luego se realiza una prueba de hermeticidad y posteriormente se esteriliza a vaso vacío el Fermentador,

empleando vapor limpio, luego se esteriliza la línea de adición de medio conectada a su respectiva

bolsa de medio y la línea de cosecha conectada a su respectiva bolsa.

Una vez concluida la esterilización, se adiciona medio de cultivo desde la bolsa de medio y se activa el

control de temperatura en 36 ± 1º C, el control de pH en 6,8 ± 0,3 y el control de la velocidad del

impelente en 30 ± 5 r.p.m.

Pasadas 48 24 horas se toma una muestra del fermentador para corroborar la esterilidad del medio de

cultivo y comprobar pH, y se procede a realizar el inóculo del fermentador. Una vez concluida la

operación de inoculación, se cultiva a una temperatura de 36 ± 1˚C, concentración de oxígeno disuelto

de 20 -100 % de saturación con respecto al aire, velocidad de agitación del impelente de 30-100 r.p.m,

pH controlado en 6,8 ± 0,3 y velocidades de los filtros rotatorios entre 500 - 800 r.p.m .

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 19/133

ANTERIOR/ N/P



Al agotarse la bolsa de medio de cultivo y llenarse la bolsa de cosecha éstas se desconectan, empleando

vapor limpio para realizar una desconexión aséptica y las nuevas bolsas son conectadas a las líneas de

medio y de cosecha y se esterilizan con vapor limpio suministrado desde el fermentador.

Durante el proceso de fermentación se establecen varios criterios para detener las fermentaciones, entre

ellos:

- Contaminación microbiana.

- Viabilidad por debajo de 70%, por un período de 3 días consecutivos.

- Tiempo de cultivo, considerando desde la descongelación del ámpula, mayor de 140 días.

- Ocurre un fallo del equipamiento o de algún sensor crítico para el seguimiento de la corrida.

- Por decisión administrativa asociado a los planes de producción.

Los controles establecidos en esta etapa de fermentación de 1000L aparecen en las tablas 7, 8 y 9.

Tabla 7. Parámetros de operación de la etapa de fermentación en 1000 L.

Parámetro de operación Clasificación Intervalo de operación

Cantidad de células totales en el inóculo KOP ≥ 60 000 106 células

Viabilidad del inóculo KOP ≥ 80 %

Velocidad de agitación OP 30-100 rpm

Volumen de trabajo OP 270–1150 L

Temperatura KOP 36±1 ⁰C

Flujo de aireación en la cabeza OP 10-40 L/min

Flujo de aire al burbujeador OP 1-30 L/min

Concentración de oxígeno disuelto OP 20–100 % de saturación

pH OP 6,8±0,3

Concentración celular para inicio de

perfusión y/o cultivo continuo KOP ≥ 1,5x106 cel/mL

Velocidad de dilución OP 0,25–1,5 vvd

Velocidad del filtro rotatorio OP 500-800 rpm

Tiempo máximo de las células en cultivo

desde la descongelación COP 140 días

Frecuencia de muestreo del fermentador OP ≤ 4 días



Observación al microscopio IPC



microscopio

Viabilidad celular IPC ≥ 70 %

Concentración de Glucosa IPC 5–20 mmol/L

Concentración de EPOhr IPC ≥ 5 µg/mL

pH IPT 6,8±0,3

Concentración celular IPT ≥ 8x106 cel/mL

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 20/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 9. Parámetros de desempeño de la etapa de fermentación en 1000 L.

Parámetro de desempeño Clasificación Criterio de Aceptación Alcance

Volumen de sobrenadante generado PP ≥ 10 000 L Una fermentación

Concentración de EPOhr en

sobrenadante PP ≥ 5 µg/mL Por cosecha

- Cosechas.

La cosecha se comienza una vez que se inicia la perfusión y/o el cultivo continuo. Se colectará en

bolsas estériles y apirogénicas de 500 L, 1000 L ó 2500 L. Una vez llena la bolsa de cosecha, se retira

la misma y se filtra por una batería de filtros cuyo poro inferior es de 0,22 µm y posteriormente se

almacena a una temperatura entre 2,0 ºC–24 ºC. Se envía una muestra al Laboratorio de Control de

Proceso y se le mide la concentración de EPOhr por el método de Cromatografía Liquida de Alta

Resolución (HPLC), donde el valor obtenido debe ser ≥ 5μg/mL y además debe estar libre de

contaminantes. Las cosechas filtradas para usar en la purificación se codifican con el código de la

fermentación, luego el consecutivo de la cosecha para cada fermentación, ejemplo

3222/TA1201/FCS01.

Los parámetros de operación de la etapa de cosechas se muestran en la Tabla 10 y los controles de

proceso en la Tabla 11.

Tabla 10. Parámetros de operación de la etapa de cosecha.

Parámetro de operación Clasificación Intervalo de operación

Volumen OP ≤ 2500 L

Tiempo de almacenamiento COP ≤ 4 días (18-24 ˚C)

≤ 21 días (2-8˚C)

Tabla 11. Controles de proceso de la etapa de cosecha.


Observación al microscopio IPC No se observa presencia de contaminación

microbiana al microscopio

Concentración de EPOhr IPC ≥ 5 µg/mL

Proceso de purificación.

- Cromatografía de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.

El primer paso se realiza empleando la cromatografía de afinidad Blue Sepharose Fast Flow, en una

columna Novasep 600/500 empleando como sistema cromatográfico el BIOPROCESS. El objetivo de

este paso es la captura de EPOhr y la eliminación parcial de los principales contaminantes presentes en

el sobrenadante. En esta columna las proteínas se unen de forma reversible al ligando coloreado

Cibacron BLUE 3G, el cual está acoplado covalentemente a la matriz Sepharose Fast Flow.

La columna se equilibra con buffer tris 20 mM, Tween 20 al 1 % a pH 7,5; posteriormente se aplica el

sobrenadante. Seguidamente, la EPOhr es eluída de la columna por aumento de fuerza iónica con

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 21/133

ANTERIOR/ N/P



solución de Tris 20 mM, Tween 20 al 1 %, NaCl 1M a pH 7,5 a un flujo lineal de 56 cm/h. El

procedimiento de limpieza de la matriz se realiza con la solución de NaOH 0,1 M; el procedimiento de

higienización se realiza con solución de NaOH 0,01 M y se conserva de acuerdo a las recomendaciones

del fabricante en una solución de Alcohol etílico al 20 %, KH2PO4 0,1 M, pH 8,0. Dos veces a la

semana se limpia con Etanol al 70%. Los controles de proceso esta etapa se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Controles de proceso de la etapa de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.


Relación Ve/Vc IPC ≥0,3

- Cromatografía de filtración en gel

Esta operación se realiza empleando una cromatografía de exclusión molecular, utilizando como matriz

Sephadex G-25 medium en una columna BPG 450/1000, empleando el sistema de purificación

BIOPROCESS. El volumen máximo de muestra a aplicar en cada ciclo debe estar entre el 15 - 30 %

del volumen del gel y el flujo lineal empleado será de 95 cm/h.

Este paso tiene como objetivo realizar un cambio de tampón de la proteína al buffer Na2HPO4 17 mM,

NaH2PO4 3 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,2; preparándola así para el siguiente paso de cromatografía de

afinidad por Quelatos metálicos. En la cromatografía de filtración en gel las moléculas de bajo peso

molecular (sales) se introducen en los poros de la matriz, retrasándose en su salida, mientras que las de

alto peso molecular (proteínas) salen con más rapidez, de esta manera ocurre la sustitución de un buffer

por otro.

Si la elución del desalaje de Blue se aplica seguidamente a la columna de quelatos, se omite el paso de

microfiltración; si esto no ocurre, se filtra el producto por un sistema de 0,2 µm. Finalmente se realiza

la higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna. Para la higienización se aplica la

solución NaOH 0,5 M, para la limpieza se emplea la solución 1 M y la solución de mantenimiento es

NaOH 0,01 M. Los controles de proceso de esta etapa se muestran en la Tabla 13.



Valor de DO a 280 nm IPC ≥ 0,1

Prueba de integridad a la membrana de

microfiltración IPT

Filtro

Sartopore 2 3,2-4 bar (46 psig)

Sartobran 3,2-4 bar (46 psig)

Millipak 3,45-4 bar (50

psig)

- Cromatografía de pseudo-afinidad por Quelatos metálicos

Este paso se realiza empleando la cromatografía de afinidad Chelating Sepharose Fast Flow en una

columna BPG 300/500, usando el sistema de purificación BIOPROCESS y manteniendo un flujo lineal

de 85 cm/h durante el equilibrio de la columna y de 76 cm/h durante la aplicación y la elución del

producto. El objetivo de este paso es la captura de la eritropoyetina y la eliminación total de la fracción

de contaminantes que no fueron removidos en los pasos anteriores del proceso.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 22/133

ANTERIOR/ N/P



La preparación de la columna se realiza de la siguiente manera:

- Adición de agua purificada (5 volúmenes de columna) (VC)

- Aplicación de Sulfato de Cobre 0,1M hasta saturación de la columna.

- Adición de agua purificada (5 VC).

- Lavado de la columna con solución buffer de elución Na2HPO4 0,2 mM, NaH2PO4 99,8 mM NaCl

0,5 M, pH 4,1, para eliminar el cobre unido débilmente a la columna.(2 -3 VC).

- Equilibrio con el buffer Na2HPO4 17 mM, NaH2PO4 3 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,2.

Esta laboriosa operación de equilibrio se realiza con el fin de que se forme el complejo metálico entre

los iones Cu2+ y los grupos imidazol de la matriz.

Después de equilibrada la columna, se aplica la elución de la G-25 de la Blue y finalizada la aplicación,

se continúa pasando solución de equilibrio hasta que la DO alcance línea base, luego se hace circular a

través de la columna buffer de elución compuesto por Na2HPO4 0,2 mM, NaH2PO4 99,8 mM, NaCl 0,5

M, pH 4,1 permitiendo que por disminución de pH, eluya la eritropoyetina. La elución de la matriz se

filtra y almacena a 4˚C, para su posterior tratamiento. Seguidamente, se regenera la columna para

romper el complejo IDA-Cu2+ con solución EDTA 50 mM, NaCl 1 M.

Si se realiza una higienización, previo al procedimiento de higienización se elimina el EDTA pasando

2VC de NaCl 0,5 M, la solución de higienización es NaOH 0,5 M. Si se va a realizar una limpieza,

previo a la misma se hacen circular 2 VC de la solución NaCl 2M para eliminar el EDTA, la solución

de limpieza es NaOH 1 M. La solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M. Los controles de proceso

se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 14. Controles de proceso de la etapa de Quelatos Metálicos.


Valor de DO 280 nm IPC ≥ 0,12


Esta operación se realiza empleando una cromatografía de exclusión por tamaño, usando como matriz

Sephadex G-25 medium, empleando las columnas ISOPACK 630/500 y BPG 200/950, además es

posible emplear en el paso las columnas cromatográficas BPG 450/1000 y Novasep 450/500, utilizando

el sistema de purificación BIOPROCESS. El volumen máximo de muestra a aplicar en cada ciclo debe

estar entre el 15-30 % del volumen de gel y se mantendrá un flujo lineal de 148 cm/h.

Este paso tiene como objetivo realizar un cambio de buffer de la proteína al buffer NaH2PO4 1,81 mM,

Na2HPO4 18,18 mM, pH 6,0, preparándola así para el siguiente paso de cromatografía de intercambio

iónico.

Una vez terminado el paso cromatográfico, se realiza una microfiltración del producto si el mismo será

almacenado para unirlo con otro lote y realizar la cromatografía de intercambio aniónico en Q

Sepharose FF, sino se continúa con el próximo paso cromatográfico.

Finalmente, se realiza la higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna.

Para la higienización se aplica la solución NaOH 0,5 M, para la limpieza se emplea la solución NaOH 1

M y la solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M. Los controles de proceso se muestran en la Tabla

15.



G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 23/133

ANTERIOR/ N/P



Valor de D.O 280 nm IPC ≥ 0,1

Pureza por HPLC-RP IPC ≥ 90 %

Prueba de integridad a la

membrana de microfiltración IPT

Filtro Punto de Burbuja



Millipak 3,45-4 bar (50 psig)

- Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose Fast Flow.

Este paso se realiza empleando la cromatografía de intercambio iónico en columnas BPG 100/500 y

BPG 200/500, considerando como carga máxima a cada columna de 4 g/L de gel, el gel empleado es Q

Sepharose fast Flow. Esta cromatografía se realiza utilizando el sistema BIOPROCESS. El objetivo de

este paso es la separación de las isoformas ácidas (biológicamente activas) de las básicas, la retención

de ADN y realizar la concentración del producto. En este paso se eleva la pureza de la EPOhr por

encima del 98 %.

La columna se equilibra con solución NaH2PO4 18,18 mM, Na2HPO4 1,81 mM, pH 6,0. El flujo lineal

es de 128 cm/h. Posteriormente se aplica la elución de la G-25 de la cromatografía de afinidad

Chelating Sepharose Fast Flow a la columna de Q Sepharose Fast Flow. El flujo lineal de aplicación es

de 102 cm/h. El siguiente paso es realizar un lavado de la columna de Q con acetato 50 mM, Tween 20

0,01%, pH 4,5 a un flujo lineal de 153 cm/h, para garantizar la eliminación de las isoformas básicas

que se retengan en este gel, y seguidamente se procede a reequilibrar la columna empacada con Q

pasando 5 VC de la solución NaH2PO4 1,81 mM, Na2HPO4 18,18 mM, pH 6,0 a flujo lineal de 128

cm/h. Una vez equilibrada la columna, comienza la elución al circular por la columna el buffer de

elución Na2HPO4 3 mM, NaH2PO4 17 mM, NaCl 164 mM, pH 6,0. El flujo lineal para la elución es de

90 cm/h. Finalmente, se regenera la matriz, para restaurar su condición de adsorción con solución de

NaCl 3M, a un flujo lineal de 102 cm/h.

Finalmente se realiza la higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna.


M y la solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M. Los controles de proceso se muestran en la tabla

16.

Tabla 16. Controles de proceso de la etapa de Q.


Valor de D.O 280 nm de elución IPC ≥ 0,8

Valor de DO a 260 nm IPC ≥0,2








Esta operación se realiza empleando una cromatografía de exclusión molecular, utilizando una columna

BPG 200/950, usando una matriz Superdex 200, empleando el sistema cromatográfico BIOPROCESS.

Este último paso tiene como objetivo almacenar la proteína en la solución de formulación. El equilibrio

de esta columna se realiza aplicando solución final que está compuesta por NaCl 100 mM, Citrato de

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 24/133

ANTERIOR/ N/P



sodio 20 mM, Ácido cítrico 0,36 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 6,9. El volumen máximo de la muestra

a aplicar será del 5-15 % del volumen de la columna a flujo lineal de 30 cm/h. Finalmente, se realiza la

higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna.


M y la solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M.

Una vez terminado el proceso de filtración en gel, al producto se le realiza una microfiltración por 0,2

µm y se almacena a 4˚C. Los controles de proceso se muestran en la tabla 17.

Tabla 17. Controles de proceso de la etapa de Superdex.


Pureza IPC ≥ 98 %

Concentración (mg/mL) IPC ≥ 0,5

Valor de DO a 280nm IPC ≥ 0,22

Relación DO a 280nm / DO a 260nm IPT ≥ 1,5







En la tabla 18 se muestran los valores medios de los variables de los controles de proceso realizados en

la etapa de cromatografía filtración en gel durante los años 2015 y 2016 donde se observa que los

mismos cumplen con los criterios de aceptación establecidos para cada parámetro evaluado. Todos los

lotes analizados cumplieron con los criterios establecidos y fueron incluidos en el cálculo de la media

de cada variable (Datos obtenidos de la Revisión Anual de Producto (RAP): G11 RAP-0001/2015,

2015 y G11 RAP-0001/2016, 2016).

Tabla 18. Comportamiento de los controles de proceso en la etapa de cromatografía filtración en gel

durante los años 2015 y 2016.

Variables Criterio de aceptación 2015 2016

Pureza ≥ 98% 99,48 99,46

Concentración (mg/mL) ≥ 0,5 1,04 1,08

Valor de DO a 280nm ≥ 0,22 0,78 0,80

- Confección del IFA.

La confección del IFA se realiza a partir de la unión de dos a cuatro lotes de purificados de una misma

fermentación. Estos lotes se homogenizan para conformar un IFA hasta 1 500 000 bulbos equivalentes

de 2000 UI, para más de 2 500 millones de UI/ lote de IFA. Cuando existan remanentes de IFAs

liberados, se conformará un pool. Los controles de esta etapa se muestran en la Tabla 19.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 25/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 19. Controles de proceso de la etapa de confección del IFA.


Concentración (mg/mL) IPC ≥ 0,5

Valor de DO a 280nm IPC ≥ 0,37

Relación DO a 280nm / DO a 260nm IPT ≥ 1,5

Biocarga IPC ≤ 50 UFC/mL

- Microfiltración.

El objetivo de este paso es mantener el producto libre de contaminación microbiana hasta que se

someta al proceso de formulación. El paso de filtración se realiza con filtros cuya membrana tiene una

porosidad de 0,2 µm y su material de construcción es inerte con relación al producto. En este paso se

realiza la prueba de integridad de la membrana para comprobar el desempeño adecuado de la barrera

filtrante según lo establecido en los procedimientos vigentes. Los controles de esta etapa se muestran

en la Tabla 20.

Tabla 20. Controles de proceso en la etapa de Microfiltración.


Prueba de integridad a la membrana

de microfiltración IPT





Flujo (L/min) OP 0,9-1,6

Tiempo de filtración (min) PP 12-23

El producto obtenido se almacena, por un tiempo no mayor de 1 año, en bolsas plásticas flexibles

estériles y apirogénicas listas para el uso hasta que sea necesario para la fabricación del producto

terminado. Se realiza un muestreo del producto para evaluar las siguientes características de calidad:

pureza, identidad, concentración, pH, DNA contaminante, proteínas contaminantes de célula

hospedera, inspección visual, actividad específica, ácido siálico y endotoxinas bacterianas.

Las etapas de purificación fueron diseñadas para producir un producto de calidad adecuada y que

permitieran reducir la agregación y degradación del producto así como los niveles de las impurezas

residuales que pueden estar presentes.

4.2 Consistencia y caracterización del Ingrediente Farmaceutico Activo.

Se realizó un análisis con los resultados de los principales atributos de calidad del IFA. Los datos

analizados fueron obtenidos en el CIM de la Revision Anual de Producto (RAP) correspondientes a los

años 2014, 2015 y 2016: G11 RAP-0002/2014, G11 RAP-0002/2015 y G11 RAP-0002/2016. Todos

los lotes de IFA analizados (45 lotes producidos en el 2014, 41 en el 2015 y 49 en el 2016 para un total

de 135 lotes de IFA) durante estos tres años consecutivos cumplieron con los criterios de aceptación

establecidos tanto para los parámetros cuantitativos como cualitativos o semicualitativos. El análisis de

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 26/133

ANTERIOR/ N/P



los parámetros cuantitativos mostró bajos coeficientes de variación cuando se analizó la media para

cada parámetro entre los tres años lo que demuestra una adecuada consistencia del proceso de

fabricación del IFA en el CIM (Tabla 21).

Tabla 21. Resultados de los atributos de calidad, especificaciones y métodos de análisis del IFA

obtenidos en el CIM durante los años 2014, 2015 y 2016. Valores medios anuales.

Atributo de

calidad Especificación

Método de

análisis

Media±DE Media DE CV%

Año 2014

(45 lotes)

Año 2015

(41 lotes)

Año 2016

(49 lotes)

Total

(135 lotes)

Pureza

≥ 98,00% del

monómero

(< 2.00% de

dímeros y

sustancias

relacionadas de alto

peso molecular*)

HPLC-GF 99.93±0.06

(*0.07)

99,82±0.13

(*0.18)

99.86±0.06

(*0.14)

99.87

(*0.13) 0.10 0.10

≥ 98,00% de

proteína HPLC-FR 99,60±0.26 99,48±0,28 99,65±0,21 99.58 0.26 0.26

Actividad

especifica

Potencia estimada

entre 80 y 125%

de la potencia

asignada. Limites

confianza entre 64

y 156 %.

In vivo en

ratones

normocitemicos

100±7,34 105±12,53 101±6,45 102 9.11 8.94

Concentración 0,50-10,00 mg/mL Densidad

óptica 280nm 1,38±0,20 1,06±0,32 1,07±0,23 1,17 0.29 24,71

Ácido siálico ≥ 10,00 moles/mol

de proteína Colorimétrico 12,29±0,84 11,78±1.00 11,68±0,89 11.92 0.94 7.91

pH 6,5-7,5 pHmetro 6,85±0,05 6,81±0,07 6,80±0,05 6.82 0.06 0.89

Biocarga ≤ 10 UFC/mL Filtración por

membranas Conforme Conforme Conforme NA

DNA

contaminante ≤ 10 ng/ dosis Hibridación Conforme Conforme Conforme NA

HCP

contaminante ≤ 0.4% ELISA Conforme Conforme Conforme NA

Endotoxinas

bacterianas

<20 UE/ 100 000

UI de

eritropoyetina

LAL Conforme Conforme Conforme NA

Punto

isoeléctrico

Conforme al

estándar: 8 isoformas, al

menos 5

mayoritarias

IEF Conforme Conforme Conforme NA

Identidad Conforme al

estándar

SDS-

PAGE/WB Conforme Conforme Conforme NA

Identidad Conforme al

estándar

HPLC-FR

Mapeo

peptídico

Conforme Conforme Conforme NA

Apariencia Solución Inspección Conforme Conforme Conforme NA

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 27/133

ANTERIOR/ N/P



transparente,

incolora, libre de

partículas

sedimentadas

visual

NA: No aplicable. DE: Desviación estándar. CV%: Coeficiente de variación.

Los tres lotes de IFA que dieron origen a los tres lotes de ior®EPOCIM incluidos en el estudio de

biocomparabilidad mostraron un cumplimiento de las especificaciones de calidad y niveles bajos de

agregación, degradación y de contaminantes de CHO (Tabla 22) lo cual disminuye los riesgos de

inmunogenicidad del producto y garantizan la eficacia y seguridad del uso del producto en la clínica

(Carlos y cols, 2016).

Tabla 22. Resultados del nivel de contaminantes y concentración de proteínas presentes en los lotes de

IFA utilizados en el estudio de biocomparabilidad.

Atributo de

calidad Especificación Método de análisis 3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513

Pureza

≥ 98,00% del

monómero

(<2.00% de

dímeros y

sustancias

relacionadas de

alto peso

molecular*)

HPLC-GF 99.82

(*0,18)

99.72

(*0,28)

99.80

(*0,20)

≥ 98,00% de

proteína HPLC-FR 98,78 99,37 99,37

HCP ≤0,400% ELISA 0,035 0,028 0,039

ADN

contaminante 10,00 ng/dosis Hibridación <1,25 <1,25 <5,00

Endotoxinas

<20 UI/100 000

UI de

eritropoyetina

LAL cromogénico <0,83 <0,83 3,93

Trazabilidad

Lote de IFA Lote de ior®EPOCIM

3342/P1511 LP00415

3342/P1512 LP00515

3342/P1513 LP00615

Como parte de la caracterización y evaluación de la consistencia del IFA producido en el CIM se

evaluó la estructura secundaria y terciaria de 10 lotes del producto (Grupo 1: 5 lotes de inicio de la

producción y Grupo 2: 5 lotes al final de la producción del año 2015). Para demostrar la similitud con

respecto a la estructura secundaria y terciaria, se utilizó el método de dicroísmo circular (DC) UV

lejano y cercano y se analizó el plegamiento al nivel de la estructura secundaria, es decir, el

enrollamiento de la hebra de aminoácidos en hélices alfa o su organización en hojas beta y

espectroscopia de fluorescencia. Los estudios fueron realizados en los laboratorios LAMMB de la

UNAM.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 28/133

ANTERIOR/ N/P



En la Figura 1 se observa la semejanza de los espectros de emisión por fluorescencia de los 10 lotes de

IFA y no se obtuvieron diferencias significativas entre los mismos cuando fueron evaluados por un

ANOVA para un 95% de confianza (Tabla 23). En la Tabla 24 se muestran los coeficientes de

variación obtenidos (<0.1 %) para la media de los Centros de Masa Espectral (CME) a 280 y 295nm

de excitación lo que demuestra la consistencia del proceso productivo y la similitud, lote a lote, en la

estructura terciaria del IFA.

Figura 1. Comparación de los espectros de emisión de 10 lotes del IFA a una longitud de onda de

excitación de 280 y 295 nm utilizando el buffer de formulación en cada corrida.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 29/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 23. Comparación estadística entre los espectros del grupo 1 y el grupo 2 del IFA. El análisis

estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo ANOVA.

Tabla 24. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación para los 10 lotes de IFA evaluados.

Lote de IFA Excitación 280nm Excitación 295nm

CME (nm) CME (nm)

3342/P1503 342.87 342.40

3342/P1504 343.06 343.55

3342/P1505 343.02 343.61

3342/P1506 343.06 343.36

3342/P1507 342.97 343.47

3342/P1540 343,02 343.33

3342/P1541 342.99 343.41

3342/P1542 343.07 343.34

3342/P1543 342.93 343.18

3342/P1544 343.02 343.23

Media 343.00 343.29

DE 0.06 0,34

CV % 0.02 0.10

DE: Desviación estándar, CV%: Coeficiente de variación

Quedo demostrada la similitud con respecto a la estructura secundaria de las muestras analizadas al

superponerse los espectros de DC UV lejano obtenidos para los 10 lotes de IFA analizados. Al ajustar

los datos al modelo de Micsonai y cols (2015) se observa que se componen fundamentalmente de α-

hélices (Figura 2). No se obtuvieron diferencias significativas entre los grupos mayoritarios cuando

fueron evaluados por un ANOVA para un 95% de confianza (Tabla 25) lo que demuestra la

consistencia del proceso productivo y la similitud, lote a lote, en la estructura secundaria del IFA.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 30/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 2. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-250 nm) de las muestras: CE-C01-M77

(3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505), CE-C01-M80 (3342/P1506),

CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540), CE-C01-M83 (3342/P1541), CE-C01-M84

(3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y CE-C01-M86 (3342/P1544).

Tabla 25. Conformación estructural delas muestras del bloque 1 y 2.

La estructura terciaria de las muestras de los 10 lotes del IFA mostró similitud con base en los

espectros de DC cercano (Figura 3).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 31/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 3. Espectro de dicroísmo circular en la región del UV cercano (260-330 nm) de las muestras:

CE-C01-M77 (3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505), CE-C01-M80

(3342/P1506), CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540), CE-C01-M83 (3342/P1541),

CE-C01-M84 (3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y CE-C01-M86 (3342/P1544).

Como parte de la caracterización y consistencia del IFA se evaluaron 6 lotes consecutivos producidos

durante el año 2014 por DC UV lejano en comparación con cuatro lotes de EPREX® y el Material de

Referencia de Trabajo (MRT(QFB)EPOhr/0113) utilizado en la liberación de los lotes de EPOhr

producidos en el CIM (Figura 4). Se observa una superposición de los espectros obtenidos para todas

las muestras demostrando una similitud con respecto a la estructura secundaria entre las mismas y que

se componen mayoritariamente de α-hélices. Coincidiendo estos resultados con los obtenidos en los

laboratorios LAMMB en la caracterización del IFA (Figura 2).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 32/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 4. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-260 nm) de las muestras del IFA de

ior®EPOCIM y EPREX® analizadas en los laboratorios de ScianBioscence Co., Ltd., Tailandia.

Adicionalmente, la secuenciación N-terminal de 10 lotes del IFA, de ellos 3 lotes al final de un estudio

de estabilidad acelerada (6 meses) fue identificada por el método de degradación de Edman (Tabla 26).

La secuencia obtenida para cada muestra es consistente con la secuencia declarada en la monografía de

la EPOhr de la Farmacopea Europea (FE) (FE 1316, 2016). La correcta secuencia N-Terminal de la

EPOhr fue hallada para los primeros 15 residuos con excepción del residuo 7 debido a que la cisteína

no es identificada por este método. Aspecto que queda solventado ya que este aminoácido fue

secuenciado en el estudio de biocomparabilidad por el método de espectrometría de masas (EM).

190 200 210 220 230 240 250 260 270

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

CD

(md

eg

)

Wavelength(nm)

3342/P1401

3342/P1402

3342/P1403

3342/P1404

3342/P1405

3342/P1406

EDS5L00

EES4F00

EGS7R00

EHS3H00

MRT(QFB)rhEPO/0113

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 33/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 26. Resultados del análisis de secuenciación N-terminal de 10 lotes de IFA realizado en los

laboratorios SGS de Inglaterra (Reporte: 128-001-001). Se utilizó un Procise Automatic Protein

Sequencer 494.

4.3 Proceso de fabricación del Producto Terminado (ior® EPOCIM).

El proceso de fabricación de ior® EPOCIM consta de 5 etapas:

- Formulación.

- Llenado.

- Etiquetado.

- Envase.

- Almacenamiento.

4.4.1 Formulación, llenado, etiquetado, envase y almacenamiento.

Sobre la base de los resultados de potencia, concentración y volumen del IFA, se ajusta la

concentración del producto a granel a 2000 UI/mL, 3000 UI/mL, 4 000 UI/mL, 5 000 UI/mL, 10 000

UI/mL, 30 000 Ui/mL o 40 000 UI/mL según corresponda; adicionando la cantidad de solución final

(5,8 g/L de la solución de Citrato de Sodio; 0,069 g/L ácido cítrico; 5,8 g/L cloruro de sodio; Tween 20

al 0,02 %, pH 6,9) necesaria para cada concentración final. Durante el ajuste también se adiciona

albúmina humana de calidad inyectable, de forma tal que la concentración final de la misma se

encuentre entre 2 - 3 mg/mL. El producto final formulado se filtra por filtros de 0,2 m acoplados a

bolsas desechables estériles y apirogénicas de 3; 5; 10; 20 y 50 L. Todas estas bolsas se utilizan además

para el almacenamiento del producto de 2-8ºC, hasta realizar la operación de llenado de los viales.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 34/133

ANTERIOR/ N/P



El producto formulado es sometido a un segundo proceso de filtración esterilizante por membrana de

0,2 µm inmediatamente antes de ser sometido al proceso de llenado. Posterior a esto ocurre el proceso

de llenado en bulbos 2R calidad hidrolítica I, a 1,1 mL por cada bulbo, en la máquina llenadora-

cerradora de bulbos KSF-1020 de la firma Bausch+Ströbel (B+S), rodeada de un ambiente clase 100,

según lo establecido. A partir de técnicas estadísticas una muestra representativa del lote es enviada al

Departamento de Control de la Calidad para ser evaluada en cuanto al cumplimiento de las

especificaciones establecidas para este producto.

Una vez que se concluye el llenado del lote, se procede a la inspección visual del 100 % de los bulbos

de cada lote para comprobar las características organolépticas del producto.

Los lotes aprobados durante el proceso de inspección visual y liberados por control analítico son

suministrados al área de etiquetado automatico a través de una carretilla hacia la máquina etiquetadora

Bauch + Strobel. Se rotula en la etiqueta el No. lote, fecha de producción, fecha de vencimiento

mediante termo impresión.

El almacenaje de este producto se realiza en la cámara fría de producto final en espera de su liberación

por destino certificado que emite Aseguramiento de la Calidad después del envase final del mismo.

4.4 Estudios de Estabilidad.

Estudios de estabilidad anaquel (Largo plazo), acelerado y estrés (determinación del perfil de

degradación) han sido realizados con el IFA por el CIM. Los resultados de los estudios evidencian que

los atributos de calidad (físicos, químicos, fisicoquímicos, microbiológicos y biológicos) del IFA

soportan una vida útil de 12 meses cuando el producto es almacenado entre 2 y 8 ° C y, de 6 meses en

condiciones aceleradas cuando es almacenado a una temperatura 25 oC±2 oC/ 60%±5% Humedad

Relativa. En el estudio de estrés se observó que la principal afectación del producto fue la aparición de

bandas adicionales que corresponden al producto agregado cuando fue sometido a diferentes

condiciones de estrés. La agregación fue identificada, principalmente, utilizando la metodología por

HPLC-GF.

Estudios de estabilidad anaquel (largo plazo), en curso, acelerados y de excursión han sido conducidos

con el producto ior® EPOCIM por el CIM. Los resultados de los estudios evidencian que los atributos

de calidad (físicos, químicos, fisicoquímicos, microbiológicos y biológicos) del producto cumplen con

sus especificaciones. Los datos de estabilidad proporcionados soportan una vida útil de 36 meses (para

las presentaciones entre 2 000 y 10 000 UI/mL) y 12 meses para las presentaciones 30 000 y 40 000

UI/mL) cuando el producto es almacenado entre 2 y 8°C, de 4 meses cuando el producto es almacenado

entre 28 y 32oC/ 60%±5HR, 24 meses cuando es almacenado entre 2 y 8 oC luego de sufrir excursiones

de temperaturas por un periodo de cinco días entre 28-32 oC y de 36 meses cuando es almacenado entre

2 y 8 oC luego de sufrir excursiones de temperaturas por tres días entre 0 oC ≤ X < 2 0C.

4.5 Experiencia post comercialización.

Los resultados de la farmacovigilancia y post-comercialización se proporcionan en el capitulo 6.10 de

este documento.

4.6 Agentes adventicios.

No se utilizan en el proceso de producción del ior®EPOCIM ninguna materia prima o excipientes de

origen biológico animal, ni en la fabricación del IFA ni en la fabricación del PT. Debido a esta

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 35/133

ANTERIOR/ N/P



característica, se considera que estas materias primas presentan un riesgo muy bajo con respecto a la

seguridad viral. Adicionalmente, todo el proceso de fabricación está bien controlado para garantizar la

seguridad microbiológica. Los bancos maestros y de trabajo han sido sometidos a pruebas apropiadas

que garantizan su uso.

4.7 Indicaciones aprobadas.

Las indicaciones aprobadas por el CECMED para el ior®EPOCIM en Cuba se mencionan a

continuación:

- Tratamiento de la anemia renal crónica.

- Tratamiento de la anemia de pacientes con SIDA en régimen terapéutico con zidovudina.

- Tratamiento de la anemia inducida por quimioterapia en pacientes oncologicos.

- Profilaxis t tratamiento de la anemia de la prematuridad.

5. MATERIALES Y METODOS.

5.1 Descripción de las muestras.

Para los estudios de biocomparabilidad se utilizaron 3 lotes de IFA, 3 lotes de ior®EPOCIM

(originados de los 3 lotes de IFA) y 3 lotes de EPREX®/ERYPO como se muestra en la Tabla 27. Los

productos durante todo el estudio fueron almacenados de acuerdo a sus instrucciones.

Tabla 27: Listado de lotes utilizados en el estudio de biocomparabilidad.

Nombre del producto Lote Fabricante Presentación Concentración

IFA

3342/P1511 CIM Bolsas desechables 0,60 mg/mL



ALVERITIN®

LP00415 ALVARTIS P. Caja con 6 frascos 4000 UI/mL



Hema-Plus® 0221602 Siam Bioscience Jeringa pre llenada 4000 UI/mL

EPREX® FDS6Q01 Lilly Jeringa pre llenada 40 000 UI/mL

ERYPO® FAS4800 Janssen Jeringa pre llenada 4000 UI/ 0.4mL

FBS4Z00 Janssen Jeringa pre llenada 4000 UI/ 0.4mL

EPREX® GDS3700 Cilag Fracos 4000 UI/mL

ALVERITIN®: Nombre registrado en México (COFEPRIS) del ior®EPOCIM comercializado en este

país a través de la empresa mexicana ALVARTIS PHARMA. ALVERITIN®= ior®EPOCIM.

Hema-Plus®: Nombre registrado en Tailandia (FDA Thai) del ior®EPOCIM comercializado en este

país a través de la empresa tailandesa Siam Bioscience Co., Ltd Tailandia. Hema-Plus®=

ior®EPOCIM.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 36/133

ANTERIOR/ N/P



5.2 Materiales de Referencia utilizados.

Se utilizaron los Estándares Físico Químico de la FE (CRS lote 1) y la preparación Biológica de

Referencia (BRP) Lote.3 de EPOhr. Los Materiales de Referencia de Trabajo de EPOhr con código

MRT (QFB) EPOhr/0208 y MRT (QFB)EPOhr/0113 producidos en el CIM y trazables a los estándares

regionales de la FE.

5.3 Estudios de biocomparabilidad y laboratorios participantes.

Los estudios fueron llevados a cabo a través de una matriz de caracterización analítica realizada en

laboratorios acreditados y/o habilitados para ese fin. El objetivo principal fue identificar cualquier

diferencia en los atributos de calidad (estructurales, fisicoquímico, biológicos y/o funcionales) entre

ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO (FDA/Biosimilarity, 2015) (Tabla 28, 28A y 28B).

Tabla 28. Listado de matriz para caracterización física/química/biológica y laboratorio participante.

Característica Método analítico Informe/referencia del estudio Laboratorio

participante

Bioactividad/

Identidad/Estructura

terciaria

in vitro por proliferación celular FTU/BIO/15/002-PRO/REP-002 UDIBI, IPN/

UNAM/México.

Bioactividad/Estructura

terciaria in vivo en ratones normocitemicos Farmacopea Europea

Laboratorio de Control

de la Calidad.

CIM/Cuba

Unión a receptor Afinidad por Biacore FTU/BIO/15/002-PRO /REP-001 UDIBI, IPN/

UNAM/México

Estructura primaria Secuenciación del IFA/espectrometría de

masas REP-LB-C008 ed.1

LAMMB,

UNAM/México.

Peso y pureza SDS-PAGE desnaturalizante Red y no

Red para el IFA REP-LB-C016 ed.1

Peso y pureza SDS-PAGE e inmunodeteccion para el

PT REP-LB-C006 ed.1

Estructura terciaria

Sulfidrilos libres para el IFA REP-LB-C014 ed.1

Estructura terciaria Espectroscopia de adsorción UV para el

IFA REP-LB-C009 ed.1

Estructura terciaria Espectroscopia de fluorescencia para el

IFA REP-LB-C013 ed.1

Pureza/Estructura terciaria

Perfil de isoformas por EC para el IFA REP-LB-C020 ed.1

Estructura terciaria

Perfil de N-Glicosilación por HPLC Fase

normal (HILIC) para el IFA

REP-LB-C017 ed.1

Estructura primaria

Mapeo peptídico para el IFA Farmacopea Europea

Laboratorio de Control

de la Calidad.

CIM/Cuba

Identidad, carga y pureza

Isoelectroenfoque para el IFA Farmacopea Europea

Pureza/agregados de alta

masa molecular

SDS-PAGE e inmunodeteccion para el

IFA y el PT Metodología Interna*

Pureza/ Agregados de alta

masa molecular HPLC-GF para el IFA Farmacopea Europea

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 37/133

ANTERIOR/ N/P



Contenido de ácido siálico

Método colorimétrico para el IFA Farmacopea Europea

Seguridad y pureza

Endotoxinas bacterianas para el IFA y PT Farmacopea Europea

Heterogeneidad de tamaño

Partículas subvisibles para el PT Farmacopea Europea

Heterogeneidad de tamaño

Partículas visibles para el IFA y PT. Farmacopea Europea

*La validación del método está documentada en el G10 INF-0071.

Tabla 28A: Listado de ensayos preclínicos y laboratorio participante.

Tipo de estudio Informe del estudio Laboratorio

participante

Preclínico in vitro por proliferación celular FTU/BIO/15/002-

PRO/REP-002

UDIBI,

IPN/México

Preclínico in vivo en ratones

normocitemicos Farmacopea Europea CIM/Cuba

Preclínico Afinidad por Biacore

FTU/BIO/15/002-PRO

/REP-001

UDIBI,

IPN/México

Preclínico

Farmacocinética comparada del

ior®EPOCIM en monos con el

producto de referencia

EPREX®.

97/23 IFAL/Cuba

Preclínico

Farmacocinética comparada del

ior®EPOCIM en conejos con el

producto de referencia

EPREX®.

97/22 IFAL/Cuba

Preclínico Toxicidad aguda endovenosa

del ior®EPOCIM en primates ERITO497

CETEX/Cuba

Preclínico Toxicidad aguda endovenosa

del ior®EPOCIM en ratas ERITO799

Preclínico

Estudio comparativo de

Toxicidad del ior®EPOCIM a

dosis intravenosas repetidas por

28 días en ratas Sprague

Dawley con EPREX® como

producto de referencia seguido

de un periodo de recuperación

de 14 días.

No.270994

Pucaj et al., Journal of

Pharmaceutical Sciences

103:3432–3441, 2014

Nucro-

Technics,/Canadá

CIM/Cuba

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 38/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 28B: Listado de ensayos clínicos.

Ensayo clínico

Código/País/Año/Publicación

Fase No.

Pacientes

Exposición

máxima

(semanas/

meses)

Vía

admon

Grupo

edad

(años/

días)

Farmacocinética comparada

A bioquivalence study of two-treatmen and

two sequence of Epoetin alfa 4000 IU

injection pre-filled siringe 4000 IU relative to

EPREX in healthy Thai volunteers under

fasting condition.

Report No. EPO-037-15/ Thai/2017

I 22 72 horas SC >18

Anemia por Insuficiencia Renal Crónica

Evaluación de la farmacocinética y el efecto

terapéutico de la hr-EPO en el tratamiento de

la anemia.

NC/Cuba/ /1997

I/II

25 16 semanas IV >18

Efecto terapéutico del uso subcutáneo de la

hr- EPO en el tratamiento de la anemia.

NC/Cuba/ 1998

Pérez-Oliva Díaz Rev Habanera de

Ciencias Médicas, vol. 3, n.o 10, 2004

I/II 24 12 semanas SC >18

Estudio abierto prospectivo para la

evaluación de la eficacia y la seguridad de hr-

EPO (CIMAB, Cuba) en pacientes en diálisis

o pre diálisis en el manejo de la anemia en la

insuficiencia renal crónica.

CLG002/BIO002/CKD/EPO/2005/

India/2005.

III 42 12 semanas IV/SC >18

Equivalencia terapéutica entre la

eritropoyetina humana recombinante y la hr-

EPO sin albúmina (EPO/ SA) en pacientes

con insuficiencia renal crónica en métodos

dialíticos (hemodiálisis o diálisis peritoneal).

IIC RD EC068/Cuba/2004

Pérez-Oliva y cols, Rev. Habanera Cienc.

Médicas, vol. 7, n.o 3, pp. 0-0, sep. 2008.

III

60 (30

pacientes

en cada

grupo)

12 semanas SC >18

Efectividad y seguridad de la eritropoyetina

humana recombinante en pacientes con

insuficiencia renal crónica en métodos



IV 617 24 meses IV/SC >18

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 39/133

ANTERIOR/ N/P




evaluación de la eficacia y seguridad de

Erypro-SafeTM (hr-EPO inyección) en

pacientes en diálisis o pre diálisis en el

manejo de la anemia en la insuficiencia renal

crónica.

BN002/CKD/2007/India/2007

IV 151 12 semanas IV/SC >18

Comparación de eficacia de la eritropoyetina

producida por el Instituto de Tecnología de

Inmunobiológicos de la Fundación Oswaldo

Cruz y una eritropoyetina biosimilar en

pacientes con insuficiencia renal crónica.

NCT01184495C/Brasil/2008

Paulo y cols. Clinics, vol. 69, n.o 8, pp. 547-

553, ago. 2014.

IV 74 24 meses SC >18


humana recombinante en pacientes con

insuficiencia renal crónica en pre-diálisis.


Alicia y cols. Rev.Habanera de Cienc.

Médicas, vol 15, Núm.6 (2016).


Anemia por Quimioterapia/Radioterapia

Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina humana

recombinante) en pacientes oncológicos con

anemia post quimioterapia/radioterapia.


IV 338 8 semanas SC >18


recombinante) en pacientes pediátricos

oncológicos con anemia post

quimioterapia/radioterapia


Alicia V y cols. MEDICC Rev, vol 12, n.o

3, p. 28, 2010.

IV 157 8 semanas SC <18

Anemia del Recién Nacido Pretérmino


humana recombinante en anemia del recién

nacido.


Sijo Y y cols. Rev. Cuba. Pediatría, vol. 85,

n.o 2, pp. 202–212, 2013.

III 72 8 a 10

semanas SC

> 7 días

y

< 30

días

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 40/133

ANTERIOR/ N/P



Evaluación de la seguridad y efectividad de

ior®EPOCIM en el manejo de la anemia del

recién

Nacido prematuro.

M9/CIMAB/AEC-2/ Cuba/2013

RPC. Registro Público Cubano de Ensayos

Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:

//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC000

00149-Sp. [Accedido: 07-dic-2015].

IV 131 8 a 10

semanas SC

> 15

días de

nacido.

Prevención de transfusiones de sangre en cirugías electivas con alto potencial de pérdida de

sangre

Eficacia y seguridad de la eritropoyetina

humana recombinante en la disminución de

los requerimientos de transfusiones de sangre

en pacientes con cirugías electivas de

hiperplasia prostática benigna.

IIC RD EC 096/Cuba/2009

Lamelas T y cols. Rev. Cuba. Urol., vol. 2,

n.o 2, ene. 2014.

III 250 3 semanas SC >18

años

Cardio-protección en el esquema de tratamiento con antraciclinas

Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en

pacientes con linfoma No Hodgkin tratados

con antraciclinas.

(IIC RD EC126) Cuba (2010)

RPC0096. Registro Público Cubano de

Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible

en: http:

//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC000

00096-Sp. [Accedido: 07-dic-2015

II

44 (22

pacientes

en cada

grupo)

8 meses IV >18

años

RCP: Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos/ Registro primario de la OMS:

http://registroclinico.sld.cu.

Leyenda: IV: Intravenoso; SC: Subcutáneo

http://registroclinico.sld.cu/

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 41/133

ANTERIOR/ N/P



5.4 Resumen de los métodos estructurales.

5.4.1 Mapeo peptídico.

Para determinar el mapa de péptidos se realizó una hidrolisis parcial de los tres lotes del IFA y el lote

de EPREX® con tripsina siguiendo las recomendaciones que aparecen en la monografía para le EPOhr

en la FE (FE 1316, 2016). Los fragmentos peptídicos fueron separados por el método de HPLC-FR

midiéndose con un detector de diodos a una absorbancia de 214 nm realizando una comparación de los

cromatogramas obtenidos para cada producto (G10 PNO-0087).

5.4.2 Secuenciación por espectrometría de masas.

La muestra de un lote de IFA y de un lote de EPREX® fueron previamente reducida con ditiotreitol

(Sigma-Aldrich), alquiladas con iodoacetamida (Sigma-Aldrich) y digeridas “in solution” con tripsina

(Promega Sequencing Grade Modified Trypsin). También fue digerida con Glutámico C (Roche

Sequencing Grade - No. catalogo 11 047817001). Los péptidos producidos por corte enzimático fueron

desalados con Zip Tip C18 (Millipore) y aplicados en un sistema LC-MS (Liquid Chromatography-

Mass Spectrometry) compuesto de una bomba de nanoflujo EASY-nLC II (Thermo-Fisher Co. San

Jose, CA) acoplada a un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Velos (Thermo-Fisher Co., San Jose,

CA) con fuente de ionización tipo nano-electrospray (ESI). El análisis para la identificación automática

de proteínas se realizó a través el software Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific). La secuencia

de aminoácidos de las muestras fue comparada con la secuencia de la eritropoyetina según la referencia

FE 1316, 2016. Finalmente se compararon las coberturas obtenidas entre las muestras (PNO-IT-030).

5.4.3 SDS-PAGE reducido y no reducido.

Para determinar la migración por electroforesis en gel de poliacrilamida y determinar el peso molecular

aparente de la EPO se colocó 3.0 μg de proteína de cada muestra de los tres lotes del IFA y de los tres

lotes de innovador de referencia EPREX®/ERYPO® en un gel de poliacrilamida al 13% en

condiciones desnaturalizantes reductoras y no reductoras. Se utilizó como referencia una solución de

marcadores de peso molecular Bench Mark. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie y se realizó un

análisis densitométrico utilizando el equipo ChemiDoc™ XRS+ y el software ImageLab 4.1™ de Bio-

Rad. Se determinó la media y la desviación estándar del peso molecular relativo y se realizó un análisis

de t de Student con un 95% de confianza de los datos obtenidos del software ImageLab 4.1™ (PNO-

IT-004).

5.4.4 SDS-PAGE y Western Blot.

Se aplicaron 12 uL provenientes de los viales de los tres lotes de ALVERITIN® y de las jeringas

provenientes de los dos lotes de ERYPO® en un gel en condiciones reductoras y desnaturalizantes al

12% de poliacrilamida y se tiño con azul de Coomassie. Se transfirió el gel a una membrana PVDF y se

realizó una inmunodetección con el anticuerpo policlonal anti-EPO (GeneTex, No. Catalogo

GTX52386) a una dilución 1:1000 en PBS. El anticuerpo secundario utilizado fue un anti-conejo HRP

a una dilución 1:2000 en PBS y finalmente se revelo con una solución de carbazol (PNO-LB-008 y

035).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 42/133

ANTERIOR/ N/P



5.4.5 SDS-PAGE y Western Blot. Determinación de impurezas de alto peso ≥ 2%.

Se realizó una electroforesis SDS-PAGE en condiciones no reductoras y desnaturalizantes. Se

aplicaron en geles de 12% acrilamida-bisacrilamida 29:1 (BIORAD), tanto las muestras de los tres

lotes de AlVERITIN®, de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® a una

concentración de 0,02mg/mL (0,4µg), como a una dilución al 2% de su concentración inicial. Se

aplicaron 20 µL de una dilución de las muestras volumen/volumen preparadas en tampón de

preparación de las muestras 2X (BIORAD). Posteriormente se transfirió el gel de la corrida a una

membrana de nitrocelulosa de 0,2µm de diámetro (SIGMA) y se realizó la inmunodetección con un

anticuerpo primario anti-EPO (CBSS EPO.1) a una dilución 1:250 en solución de TBS-BSA 1%. Se

utilizó como anticuerpo secundario un anticuerpo anti IgG-HRP (SIGMA A-4416) a una dilución

1:1000 en solución de TBS-BSA 1%. Para la detección se empleó una solución de 1mL de

dimetilformamida (MERCK), 0.02g de N-N diaminobenzidina (SIGMA) y 20µL de peróxido de

hidrógeno al 30% (SIGMA) (G10-PNO-0054).

5.4.6 Sulfidrilos libres.

El método se basó en un ensayo colorimétrico ultrasensible para cuantificar tioles proteicos y no

proteicos reportado por Singh y cols (1993, 1995). Se determinó la concentración de tioles libres con el

reactivo de Ellman en cada muestra de los tres lotes de IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO®.

Los tioles o sulfidrilos inorgánicos que se encuentran en las proteínas reducen a los disulfuros presentes

en la papaína-SSCH3 (derivado de la papaína) de manera estequiométrica, activando a esta enzima. La

papaína activada cataliza la hidrólisis de un sustrato cromogénico (L-BAPNA) resultando en un

aumento de la señal espectrofotométrica proporcional a la cantidad de tioles iniciales. Adicionalmente,

se utiliza la cistamina para detectar tioles de difícil acceso en la proteína o tioles con un valor alto de

pKa. Los disulfuros de la cistamina sufren una reacción de intercambio con los sulfidrilos de las

proteínas para generar 2- mercaptoetilamina (cisteamina), la cual activa a la papaína-SSCH3. Cada

muestra fue analizada por triplicado y se analizaron las medias, desviación estándar y coeficiente de

variación (PNO-IT-0006).

5.4.7 Espectroscopia de adsorción UV.

El método se basó en la caracterización de la EPOhr mediante la obtención del espectro de adsorción

de la radiación UV para cada uno de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO®

mediante el escaneo espectrofotométrico en el rango de 250 a 350nm. Los experimentos se llevaron a

cabo en el equipo eppendorf-BioSpectrofotometer. Se calcularon la media aritmética, desviación

estándar y se realizó un análisis tipo ANOVA y t de Student con un intervalo de confianza del 95%

para determinar si hay diferencia significativa entre las muestras de ambos productos (PNO-LB-024).

5.4.8 Espectroscopia de fluorescencia.

El método se basó en la caracterización de la estructura terciaria de la EPOhr a través del análisis de su

espectro de fluorescencia intrínseca como indicador de la calidad y estabilidad de la proteína. Se

adquirió el espectro de fluorescencia para cada uno de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y los tres

lotes del IFA a las longitudes de onda de excitación de 280 y 295nm. Se realizaron los cálculos de la

media aritmética, desviación estándar, análisis tipo ANOVA y t de Student con un intervalo de

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 43/133

ANTERIOR/ N/P



confianza del 95% para determinar si hay diferencia significativa entre las muestras de ambos

productos (PNO-IT-019).

5.4.9 Perfil de isoformas por electroforesis capilar.

Muestras de los tres lotes del IFA y de un lotes ERYPO® fueron analizadas por el método de

electroforesis capilar de zona. Se utilizó un capilar de sílica fundida y una solución amortiguadora pH

5.55. La separación de las diferentes isoformas de EPOhr se da por su diferencia en su relación

carga/masa. La EPOhr tiene 8 diferentes isoformas (Estándar de Referencia Europeo BRP) y cada

medicamento biotecnológico puede presentar diferentes perfiles de isoformas los cuales dependerán de

la línea celular utilizada y el proceso de producción. La FE define un criterio de aceptación con base en

el porcentaje de isoformas contenido en el medicamento (FE 1316, 2016). Los análisis se realizaron en

el equipo de electroforesis capilar (Código de equipo: E.Capilar.01). El método descrito en este

procedimiento se encuentra en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (PNO-IT-035 ed.1).

5.4.10 Perfil de N-Glicosilación.

Muestras de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® fueron desnaturalizadas y

digeridas con PNGasa F para separar los oligosacáridos (glicanos) en tres días diferentes.

Posteriormente, los glicanos son derivatizados con 2AB y separados por HPLC para ser detectados por

un detector de fluorescencia. La cromatografía de fase normal en HPLC requiere una columna con

grupos funcionales polares, los cuales interaccionan con los grupos hidroxilo de los azúcares. La

muestra de glicanos-2AB se inyecta al cromatógrafo en una alta concentración de solvente orgánico,

donde se absorben a la superficie de la columna y son eluidos por un gradiente acuoso. De esta forma,

los glicanos son removidos de la columna y separados con base en su hidrofilicidad. Los glicanos más

pequeños, con menos grupos hidroxilo (menos hidrofílicos), eluirán a bajas concentraciones de

solvente acuoso y por lo tanto, antes que los glicanos más grandes (más hidrofílicos). En el análisis de

los datos de la corrida cromatográfica se determina el tiempo de retención, el área y porcentaje de área

de cada pico y el área total de glicanos del cromatograma. Con los resultados obtenidos se puede llevar

a cabo un análisis de la microheterogeneidad y macro heterogeneidad de la glicosilación. De esta

manera, se proponen estructuras para cada uno de los picos identificados utilizando una escalera de

glucosa y bases de datos de estructuras publicadas en la literatura bajo las mismas condiciones

cromatográficas. Se calculó la media aritmética, la desviación estándar y se realizó análisis de t de

Student con un intervalo de confianza del 95% para ver si existían diferencias entre las muestras de

ambos productos (PNO-IT-028).

5.4.11 Punto isoeléctrico por isoelectroenfoque.

Se determinó la distribución de cargas en el perfil de isoformas de la molécula de la EPOhr mediante

isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida en muestras de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de

EPREX®/ERYPO®. Se realizó la corrida electroforética en geles de poliacrilamida (gradiente de pH

2,5-5). Se realizó una tinción con nitrato plata para la visualización de las bandas. Se determinó el

porcentaje de cada una de las bandas del perfil de isoformas de las muestras (G10 PNO-0081).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 44/133

ANTERIOR/ N/P



5.4.12 Cromatografía en gel filtración.

El análisis y el contenido de dímeros y especies de alto peso molecular de la EPOhr se realizó mediante

la técnica de HPLC-FG empleando un equipo de HPLC modelo LC-2010C HT (Shimadzu) y siguiendo

lo recomendado en monografía para el producto de la FE (FE 1316, 2016). En los ensayos se empleó

como fase estacionaria una columna TSK gel G2000SWXL de 300 x 7,8 mm (TOSOH), con un tamaño

de partículas de 5µm y como fase móvil tampón fosfato 1x a pH 7,2-7,4. Se inyectó un volumen

correspondiente a 30µg de masa de cada muestra de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de

EPREX®/ERYPO®. Se compararon los resultados de cada muestra evaluada con el criterio que

recomienda la Farmacopea Europea (FE 1316, 2016) de ≤ 2,00% de dímeros y especies de alto peso

molecular. Se compararon los resultados obtenidos entre los productos mediante un ANOVA para un

95% de confianza para evaluar si existen diferencias estadísticas entre los mismo (G10 PNO-0056).

5.4.13 Contenido de ácido siálico.

El método se basó en realizar una hidrolisis acida de las estructuras sialidadas enlazadas a la proteína

de le EPO presente en las muestras de los tres lotes del IFA. Posteriormente estas muestras se ponen a

reaccionar con el reactivo Resorcinol para formar un complejo violáceo, cuya absorbancia es

proporcional a la concentración de ácido siálico presente en la muestra y es medida utilizando un

espectrofotómetro Shimadzu. Se parte de una curva estándar de ácido siálico acetilado de cuatro puntos

8, 16,3 2 y 64 nmol/ml. (del inglés NANA). Los resultados obtenidos se compararon con el límite

establecido de no menos de 10 moles de ácido siálico/ mol de proteína recomendado por la FE (FE

1316, 2016) para la EPOhr (G10-PNO-0032).

5.4.14 Endotoxinas bacterianas.

El método se basó en determinar la concentración de endotoxinas en los tres lotes de ALVERITIN® y

los tres lotes de EPREX®/ERYPO® por el método del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL),

empleando el ensayo cromogénico cinético según recomendaciones de la FE (FE 5.1.10, 2016). Se

detectó o cuantificó el nivel de endotoxinas procedentes de bacterias gram-negativas utilizando el

lisado de amebocitos del cangrejo de herradura Limulus polyphemus (LAL) basado en el desarrollo de

color después de la escisión de un complejo sintético de péptido-cromógeno teniendo como principio

que las endotoxinas que existen en la muestra, activan una enzima proteolítica presente en lisado de

amebocitos del cangrejo Limulus polyphemus, ocasionando una cascada de reacciones enzimáticas,

que convierten la enzima pro-coagulable en coagulable, esta enzima actúa sobre el sustrato sintético

que lleva unido p-nitroanilina (pNa), provocando la liberación de la misma y desarrollando un color

amarillo. La cantidad de pNa es medida espectrofotométricamente a 405 nm y es proporcional a la

cantidad de endotoxinas presentes en la muestra. Los resultados fueron comparados entre sí y con el

límite establecido de < 20UE/10 000 UI de EPO según recomendaciones de la FB (FB, 2016) (G10-

PNO-0021).

5.4.15 Partículas subvisibles.

Se determinó, con ayuda de un contador de partículas en solución del fabricante RION modelo KL-

04A, la contaminación por partículas subvisibles en los tres lotes de ALVERITIN® (partículas que

aparecen de forma no intencionada como contaminantes en las preparaciones inyectables y

preparaciones para perfusión y consisten en partículas extrañas, partículas móviles no disueltas, aparte

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 45/133

ANTERIOR/ N/P



de burbujas de gas) por el método de bloqueo de la luz. Las operaciones fueron realizadas según la

metodología recomendada por la FE (FE 2.9.19, 2016), en un área controlada bajo una cabina de flujo

laminar. Los resultados fueron comparados con el límite establecido de valores medios de partículas

presentes en las unidades ensayadas menores de 6000 por envase para las partículas iguales o mayores

que 10 µm y menores de 600 por envase para las partículas iguales o mayores que 25 µm según

recomendaciones de la FE (FE 2.9.19, 2016) y la FB (FB apéndice XIIIB, 2016) (G10-PNO-0026).

5.4.16 Partículas visibles.

Se determinó, con ayuda de un banco de inspección óptica, la contaminación por partículas visibles en

muestras de los tres lotes de ALVERITIN® y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® por el método de

inspección visual (G10-PNO-0002). Las operaciones fueron realizadas según recomendaciones de la

FE (FE 20920, 2016) en un área controlada bajo un banco óptico. Los resultados fueron comparados

con lo recomendado en la monografía de la EPO inyectable de la FB (FB, 2016) para este parámetro de

calidad.

5.5 Resumen de los métodos funcionales.

5.5.1 Actividad biológica in vitro.

Se determinó el efecto proliferativo de muestras de los tres lotes de ALVERITIN® y de los tres lotes

de EPREX®/ERYPO® sobre la línea celular TF-1 por un método colorimétrico útil para determinar el

número de células vivas. El método colorimétrico consistió emplear el colorante MTS el cual es

reducido por enzimas deshidrogenasas que se encuentran en las células metabólicamente activas

generando un derivado de formazán. La cantidad de este producto se midió en un espectrofotómetro a

490nm y la absorbancia se consideró proporcional al número de células vivas. Se compararon los

valores medios del logaritmo de la concentración efectiva 50 % de la respuesta (log EC50) y de la

pendiente de Hill utilizando el software Prism 6.0 (Graphpad). (FTU/BIO/15/002-PRO/REP-002).

5.5.2 Actividad biológica in vivo.

El modelo biológico consistió en la administración de diferentes dosis de EPOhr en ratones B6D2F1

de 6-8 semanas de edad provenientes de CENPALAB. Se administraron, por vía subcutánea tres dosis

de las muestras de ALVERITIN® y de EPREX®/ERYPO®. Al final del tratamiento (72hrs) se colectó

una muestra de sangre vía seno venoso orbital y se realizó el análisis por cámara de neubauer para la

cuantificación de los reticulocitos y se compararon las pendientes de las curvas obtenidas. Se calculó la

potencia en UI/mL para cada lote evaluado por comparación con un Material de Referencia Interno

trazable al BRP de la FE mediante un ANOVA de líneas paralelas según recomendaciones

bioestadísticas de la FE (FE 5.3, 2016) para con un intervalo de confianza entre 64-156% y se evaluó

que las potencias halladas se encontraban entre un 80 a 120% de la potencia asignada de acuerdo a

recomendaciones de la FE (FE 1316, 2016) y de la FB (FB, 2016) para la EPOhr Se calcularon las

medias de potencia, desviación estándar y se realizó un análisis tipo ANOVA con un intervalo de

confianza del 95% para determinar si hay diferencia significativa entre los resultados de potencia de

ambos productos. Los animales fueron mantenidos durante toda la etapa de experimentación en un

régimen de luz/oscuridad de 12 horas con suministro ad libitum de agua/ alimento, una temperatura

entre 18-25oC y una humedad entre 20-70%.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 46/133

ANTERIOR/ N/P



5.5.3 Afinidad por Biacore.

El análisis de interacción biomolecular se basó en la resonancia de plasmones superficiales mediante el

uso de biosensores determinándose la K de afinidad y disociación de los tres lotes de ALVERITIN® y

los tres lotes de EPREX®/ERYPO® utilizando al menos cinco concentraciones del analito. Se utilizó

el chip CM5 de una celda en la que se inmovilizo el receptor de EPO recombinante humana utilizando

unión química de aminos estándar. Los datos obtenidos en tiempo real de las cinéticas de asociación y

disociación en el equipo Biacore 3000 GE healthcare, fueron analizados mediante el software

BIAevaluation, mediante el cual se obtuvieron las constantes de afinidad y disociación de la unión

ligando-receptor de forma automática. Se calcularon las medias de las constantes para cada producto y

los resultados, en su conjunto, fueron analizados estadísticamente mediante un análisis tipo t de Student

con un intervalo de confianza del 95% para determinar si hay diferencia significativa entre las

constantes de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® (FTU/BIO/15/002-PRO/REP-001).

5.6 Marco regulatorio.

El estudio de biocomparabilidad se realizó tomando como referencia principal:

- FDA/Biosimilarity. 2015. FOOD & DRUG ADMINISTRATION. Quality Considerations in

Demonstrating Biosimilarity of a Therapeutic Protein Product to a Reference Product.

- Comité de medicamentos patentados (CPMP), Nota de orientación sobre la toxicidad repetida

de dosis. Documento de orientación. EMEA CPMP / SWP / 1042/99 / corr., 27 de julio de

2000.

- Directrices sobre medicamentos biológicos similares que contienen proteínas derivadas de la

biotecnología como sustancia activa: cuestiones no clínicas y clínicas. EMEA / CHMP / BMWP

/ 42832/2005, 22 de febrero de 2006.

- ICH Good Clinical Practice (ICH-GCP).

- OECD Good Laboratory Practice (OECD-GLP).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 47/133

ANTERIOR/ N/P



6. RESULTADOS Y DISCUSION.

La complejidad estructural de los medicamentos biológicos solo puede ser reproducida por sistemas

vivos. Por ello, su proceso de producción puede provocar cierto grado de variabilidad natural entre las

distintas moléculas del mismo principio activo y entre los diferentes lotes del medicamento. Sin

embargo, aunque se reconoce que puede haber pequeñas diferencias entre ellos, la autorización de un

biosimilar se basa en la demostración de que éstas no tienen ni relevancia clínica ni conducen a

diferencias de seguridad o eficacia (EMA, 2012).

6.1 Resultados de la caracterización fisicoquímica.

6.1.1 Mapeo de péptidos.

Verificación del sistema:

Se realizó una inyección de un blanco (Fase móvil) y se determinaron los picos utilizando un detector

de arreglo de diodos a una absorbancia de 214 nm (Figura 5). Este blanco sirve para evitar seleccionar

los picos que son propios de la fase móvil.

Además, se verificó que el cromatograma obtenido para el MRT utilizado coincidía con el descrito en

su certificado de caracterización.

Figura 5. Cromatograma del mapeo peptídico del blanco.

Resultados:

En este ensayo analítico, la proteína se digirió en fragmentos más pequeños usando una proteasa

específica los cuales fueron separados posteriormente mediante HPLC-FR. En la figura 6 se muestran

los cromatogramas obtenidos después de la digestión con tripsina utilizando un detector de arreglo de

diodos a una absorbancia de 214nm. En la figura se compara el lote de EPREX®, los tres lotes de IFA

y el MRT con código MRT (QFB)rh-EPO/0113 trazable al BRP lote 3 de la FE.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 min

-25000

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

275000uV

Data6:Blanco 170316.lcd Detector A:214nmData5:FDS6Q01 170316.lcd Detector A:214nmData4:3342P1513M 170316.lcd Detector A:214nmData3:3342P1512M 170316.lcd Detector A:214nmData2:3342P1511M 170316.lcd Detector A:214nmData1:MRT rhEPO0113 170316.lcd Detector A:214nm

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 48/133

ANTERIOR/ N/P



Fig

ura

6.

Cro

mat

ogr

am

a

del

ma

peo

pep

tídi

co

de

las

mu

estr

as

ana

liza

das.

De

arri

ba

hac

ia

aba

jo:

MRT (QFB)rh-EPO/0113, 3342/P1511, 3342/P1512, 3342/P1513, el lote de EPREX FDS 6Q01 y el

blanco del ensayo.

Conclusión:

El mapeo peptídico de las muestras analizadas del IFA y el lote de EPREX® es cualitativamente

similar. No se observaron diferencias notables entre los cromatogramas del análisis por mapeo

peptídico entre las muestras analizadas lo que demuestra una secuencia de aminoácidos idéntica y

formación de enlaces disulfuros.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 min

-25000

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

275000uV

Data6:Blanco 170316.lcd Detector A:214nmData5:FDS6Q01 170316.lcd Detector A:214nmData4:3342P1513M 170316.lcd Detector A:214nmData3:3342P1512M 170316.lcd Detector A:214nmData2:3342P1511M 170316.lcd Detector A:214nmData1:MRT rhEPO0113 170316.lcd Detector A:214nm

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 49/133

ANTERIOR/ N/P



6.1.2 Secuenciación por espectrometría de masas.


Antes de la inserción de las muestras se realizó una calibración del espectrómetro en modo positivo,

con una solución de estándares de pesos moleculares conocidos (Calmix®: N-butilamina, cafeína,

H2N-MRFA-CO2 y Ultramark 1621). Después se corrió una muestra de albúmina y se determinó su

masa molecular. La calibración fue conforme ya que se determinó la masa molecular con una exactitud

menor a 5 ppm (partes/millón).

Resultados:

A continuación (figura 7) se presenta la secuencia de epoetina alfa contra la cual se compararon las

secuencias de las muestras analizadas. Se marcan en color azul y rojo los pares de cisteínas que forman

puentes disulfuro, con verde los sitios potenciales de N-glicosilación y naranja el sitio de O-

glicosilación.

Figura 7. Secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina (Referencia (FE 1316, 2016).

La Epoetina alfa tiene un peso molecular de 37 kDa y su secuencia está compuesta de 165 aminoácidos.

Las secuencias obtenidas del lote IFA y de EPREX® se compararon con la secuencia de referencia. Se dejó

en blanco los aminoácidos que no fueron secuenciados. La secuencia del lote del IFA se muestra en la figura 8, en amarillo se señalan los aminoácidos que fueron

secuenciados y que coinciden con la secuencia de referencia. Se obtuvo un 68.48 % de cobertura.

Figura 8. Secuencia de aminoácidos del IFA.

En la Figura 9 se muestra la secuencia del lote de EPREX®. En amarillo se señalan los aminoácidos

que fueron secuenciados y que coinciden con la secuencia de referencia. Se obtuvo un 63.64 % de

cobertura.

Figura 9. Secuencia de aminoácidos del lote de EPREX®.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 50/133

ANTERIOR/ N/P



El análisis que se realizó a través el software Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific) de la

secuenciación del IFA y EPREX® se detalla en la tabla 29.

Tabla 29. Resultados del análisis de secuenciación del lote de IFA y EPREX®.

Muestra Score Cobertura (%) No de péptidos

Masa intacta

desglicosilada

(kDa)

IFA

3342/P1511 4518.44 68.48 23 18.4

EPREX®

FDS6Q01 1573.61 63.64 28 18.4

Tambien se realizaron otros estudios como parte de la verificación de la estructura primaria de la

EPOhr producida en el CIM por espectrometría de masas donde se obtuvo en su conjunto un 98% de

cobertura según la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7 (CIM D701OT-007 2007, CIGB

MISC2-3 2017).

Conclusión parcial:

Se obtuvo una cobertura del 68.48% para el IFA y una cobertura del 63.64% para EPREX®. Al

integrar todos los resultados se obtuvo una cobertura del 98% para el IFA al compararla con la

estrustura primaria declarada en las referencias internacionales. De los aminoácidos secuenciados, se

mostró que las muestras del IFA y EPREX® comparten la misma secuencia de aminoácidos, las que

coinciden con la reportada para EPO en la FE (FE 1316, 2016) y que el IFA posee una correcta

secuencia de los primeros 15 residuos N-terminal, C-terminal, tres sitios de N-Glicosilacion, 1 sitio de

O-Glicosilacion, las 4 cisteinas y una correcta formación de los puentes disulfuros.

6.1.3 SDS-PAGE reducido y no reducido en condiciones desnaturalizante.


Se comprobó que el perfil del marcador Bench Mark coincidía con el perfil descrito por el proveedor

en la información del producto. Que las bandas del marcador se encontraban definidas y resueltas y que

el frente de corrida se ubica como mínimo al 90% del gel.

Resultados:

Condiciones desnaturalizante reductoras.

El gel de poliacrilamida al 13% en condiciones desnaturalizantes reductoras que se obtuvo de las

muestras de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® analizadas se muestran en la

Figura 10.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 51/133

ANTERIOR/ N/P



FIGURA 10. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes reductoras teñido con azul de

coomassie se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular bench mark, carril 2

lote: FDS6Q01, CARRIL 3 lote: FAS 4800, carril 4 lote: FBS 4Z00, CARRIL 5 VACÍO, CARRIL 6

lote: 3342/P1511, CARRIL 7 lote: 3342/P1512, Y CARRIL 8 lote: 3342/P1513.

La Epoetina alfa es una proteína que tiene un peso molecular relativo en su forma glicosilada de ~37

kDa (EPO-alpha, 2016). La Epoetina alfa es una proteína que migra por electroforesis como única

banda ancha en condiciones desnaturalizantes no reductoras (FE 1316, 2016). Tanto

EPREX®/ERYPO® y el IFA cumplen lo establecido en la FE ya que se observa una sola banda ancha

principal.

Para determinar el peso molecular aparente en cada uno de los geles se realizó una curva estándar con

el marcador de peso molecular Bench Mark, la R2 del ajuste exponencial fue mayor a 0.95.

Se realizó un análisis por densitometría del gel mostrado en la Figura 10 utilizando el equipo

ChemiDoc™ XRS+ y el software ImageLab 4.1™ de Bio-Rad y en la tabla 30 y 31 se muestran los

pesos moleculares relativos determinados para la banda principal observada en cada muestra analizada.

Tabla 30. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante reductoras de las muestras de

EPREX®/ERYPO®.

Lote FDS6Q01 Lote FAS 4800 Lote FBS 4Z00 Media aritmética y

DE

31.7 KDa 31.7 KDa 31.5 KDa 31.6 ±0.1 KDa


del IFA.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 52/133

ANTERIOR/ N/P



Lote 3342/P1511M Lote 3342/P1512M Lote 3342/P1513M Media aritmética y

DE

30.3 KDa 30.4 KDa 31.2 KDa 30.6 ±0.5 KDa

Condiciones desnaturalizante no reductoras.

El gel de poliacrilamida al 13% en condiciones desnaturalizantes no reductoras que se obtuvo de las

muestras de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® analizadas se muestra en la

Figura 11.


Coomassie. Se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular Bench Mark, carril

2 Lote: FDS6Q01, carril 3 Lote: FAS 4800, carril 4 Lote: FBS 4Z00, carril 5 vacío, carril 6 Lote:

3342/P1511, carril 7 Lote: 3342/P1512, y carril 8 Lote: 3342/P1513.

En las Tabla 32 y 33 se muestran los pesos moleculares relativos determinados para la banda principal

observada en cada muestra analizada.

Tabla 32. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las muestras

de EPREX®/ERYPO®.

Lote FDS6Q01 Lote FAS 4800 Lote FBS 4Z00 Media aritmética y

DE

30.9 KDa 31.0 KDa 30.9 KDa 30.9 ±0.05 KDa

Tabla 33. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las muestras

del IFA.

Lote 3342/P1511 Lote 3342/P1512 Lote 3342/P1513 Media aritmética y

B

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 53/133

ANTERIOR/ N/P



DE

29.5 KDa 29.5 KDa 30.4 KDa 29.8 ±0.5 KDa

Para los datos obtenidos de los geles se realizó la prueba de t-Student con un intervalo de confianza del

95% (p 0.05) y se encontró que no existe diferencia estadística significativa en el peso molecular

aparente entre el IFA y los medicamentos EPREX®/ERYPO® en condiciones desnaturalizantes

reductoras, mientras que en condiciones no reductoras se observa diferencia estadística significativa

(Tabla 34).

Tabla 34. Análisis estadístico tipo t-Student.


Se determinó el peso molecular aparente bajo condiciones reductoras y no reductoras desnaturalizantes.

Se observó una única banda ancha característica de EPOhr tanto en EPREX®/ ERYPO® y el IFA,

como se describe en la FE (FE 1316, 2016) y la FB (FB, 2016). No se observaron, en ninguna de las

muestras analizadas, bandas de bajo o altos pesos moleculares adicionales a la banda principal

observada lo que demuestra la pureza del producto. Por medio de un análisis de t-Student se determinó

que no existe diferencia significativa en el peso molecular relativo calculado en la condición

desnaturalizante reductora, mientras que si existe diferencia estadística significativa en la condición

desnaturalizante no reductora, con un intervalo de confianza del 95%. Las diferencias en el peso

molecular relativo es debida a un diferente perfil de N-glicosilación entre las muestras de

EPREX®/ERYPO® y el IFA aunque para ambos productos los valores medios del peso molecular

estuvieron muy cerca del peso molecular relativo (30.6 KDa) recomendado por la FE (FE 1316, 2016)

para la EPOhr.

6.1.4 SDS-PAGE y Western Blot para el biomedicamento.


Se comprobó que el perfil del marcador Bench Mark coincidía con el perfil descrito por el proveedor

en la información del producto. Que las bandas del marcador se encontraban definidas y resueltas y que

el frente de corrida se ubica como mínimo al 90% del gel.

Resultados:

Gel SDS-PAGE en condiciones reductoras y desnaturalizantes.

El gel en condiciones reductoras y desnaturalizantes que se obtuvo de las muestras de los tres lotes de

ALVERITIN® y los dos lotes de ERYPO® analizadas se muestra en la figura 12.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 54/133

ANTERIOR/ N/P




Coomassie. Se cargó 12 μl de cada muestra. Carril 1 Lote FBS 4Z00, carril 2 Lote: FAS 4800, carril 3

vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote: LP00515 y carril 6 Lote: LP00615. MP corresponde al

marcador de peso molecular Bench Mark.

Mediante el análisis de imágenes en ImageLab 4.1 se detectó una sola banda difusa en las muestras de

los dos lotes de ERYPO®, aproximadamente a la altura de 40 KDa, que corresponde al peso molecular

esperado para la EPO. En ensayos SDS-PAGE se ha observado que la banda difusa correspondiente a

la EPO (ERYPO®) se atribuye principalmente a la presencia de glicoformas (Gianoncelli y cols, 2015;

Reichel y Thevis, 2013).

En relación a las muestras evaluadas correspondientes a los tres lotes de ALVERITIN® se detectaron

varias bandas, incluyendo una banda correspondiente a la albumina (~67 KDa) y una banda apenas

perceptible a la altura de los 40 KDa aproximadamente. El peso molecular de EPO glicosilada es de

aproximadamente 37

KDa (EPO- Alpha, 2016), por lo

cual se supone que esta última banda

corresponde a la EPO.

6.1.5 Inmunodetección

mediante Western Blot

La membrana PVDF transferida con

las 5 muestras mencionadas

anteriormente se muestra en la

Figura 13.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 55/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 13. Western Blot en membrana de PVDF revelada con solución de carbazol. Carril 1 Lote FBS

4Z00, carril 2 Lote: FAS 4800, carril 3 vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote: LP00515 y carril 6

Lote: LP00615. MP corresponde al marcador de peso molecular Dual color.

En la Figura 13 se observa una sola banda ancha difusa que fue detectada por al anticuerpo anti-EPO en

todas las muestras analizadas, lo que confirma que la banda observada en el SDS-PAGE para las

muestras de ALVERITIN® y alrededor de los 67 KDa no corresponde a EPO sino a la albumina

presente en la formulación del producto. El peso molecular aproximado de la banda correspondiente a

la EPO en todas las muestras fue de ~37 kDa que corresponde al esperado a la EPO glicosilada (EPO-

Alpha, 2016). Resultados similares fueron obtenidos por Schmidt y cols (2003) cuando caracterizaron

productos biofarmacéuticos que contenían eritropoyetina como principio activo y albumina en su

formulación.


La migración de la molécula de EPOhr en SDS-PAGE y Westem Blot (-40 kDa) fue la misma para

ERYPO® y ALVERITIN®. No se observaron bandas adicionales de alto o bajo peso molecular en

ninguno de los biomedicamentos.

6.1.6 Western blot para el IFA y el PT.


En todos los geles revelados se visualiza la banda ancha del MRT con código MRT (QFB)

EPOhr/0113.

Resultados:

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 56/133

ANTERIOR/ N/P



Las membranas transferida con las muestras de los tres lotes del IFA, los tres lotes de ALVERITIN® y

los tres lotes de EPREX®/ERYPO® se muestran en las figuras 14, 15 y 16. En cada membrana se

evaluó 1 lote del producto innovador de referencia, 1 lote del producto candidato a biocomparable

ALVERITIN® y el lote de IFA que le dio origen.

En las Figuras se observa una sola banda ancha difusa que fue detectada por al anticuerpo anti-EPO en

todas las muestras analizadas (IFA, medicamento candidato a biocomparable e innovador) al aplicar 10

µg de las mismas lo que confirma la identidad del IFA y ALVERITIN® en relación al MRT y al

producto innovador utilizado.

Adicionalmente en ninguna de las muestras analizadas se observó una banda de agregados o especies

de alto peso molecular en relación a la masa aplicada correspondiente al 2% (0.2 µg) lo que confirma

una pureza similar entre el IFA, ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® mayor al 98% y un bajo riesgo

de respuesta inmune inducida por agregados (Vera y cols, 2011).


Figura 14. Western Blot

Carril 1: 10 µg MRT (QFB)EPOhr/0113

Carril 2: 0,2 µg MRT(QFB)EPOhr/0113

Carril 3: 10 µg Lote FDS 6Q01

Carril 4: 0,2 µg Lote FDS 6Q01

Carril 5: 10 µg Lote LP00615

Carril 6: 0.2 µg Lote LP00615

Carril 7: 10 µg Lote 3342/P1513

Carril 8: 0.2 µg Lote 3342/P1513

Figura 15. Western Blot



Carril 3: 10 µg Lote FAS 4800

Carril 4: 0,2 µg Lote FAS 4800





Figura 16. Western Blot.



Carril 3: 10 µg Lote FAS 4Z00

Carril 4: 0,2 µg Lote FAS 4Z00





G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 57/133

ANTERIOR/ N/P



Se observó una única banda ancha característica de EPO tanto en EPREX®/ERYPO®, el IFA y

ALVERITIN®, como se describe en la FE (FE 1316, 2016) y la FB (FB, 2016). No se observaron, en

ninguna de las muestras analizadas, bandas de altos pesos moleculares adicionales a la banda principal

observada ni mayores a la masa del producto aplicada correspondiente al 2% (0,2 µg) lo que demuestra

una pureza del producto superior al 98%.

6.1.7 Sulfidrilos libres.


Se obtuvieron dos curvas estándar de L-cisteína debido a que el análisis se realizó en dos días

independientes. En la Figura 17 se muestra la curva obtenida en el análisis realizado el día 01dic2015 y

en la Figura 18 la curva obtenida en el análisis realizado el día 14 jun2016. Figura 17. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.996, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).

Figura 18. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.993, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 58/133

ANTERIOR/ N/P



Las curvas estándares obtenidas son adecuadas para realizar la cuantificación de las muestras.

Se determinó la concentración de tioles libres en la L-cisteína con el reactivo de Ellman. En 0.1 mM de

L-cisteína hay 0.072 ± 0.001 mM de tioles libres. En el ensayo realizado el día 01dic2015 se encontró

que en 0.1 mM de L-cisteína hay 0.072 ± 0.001 mM de tioles libres. En el ensayo realizado el día

14jun2016 se encontró que en 0.1 mM de L-cisteína hay 0.056 ± 0.000 mM de tioles libres. Resultados:

En la tablas 35 y 3 6 se muestran los contenidos de sulfidrilos libres por mol de proteína de las

muestras de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® evaluados.

Tabla 35. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras del IFA.

Lote mol de tiol libre/ mol de proteína ± DE

3342/P1511 1Menor a 0.043

3342/P1512 1Menor a 0.043

3342/P1513 1Menor a 0.043 1 determinado a partir del límite de detección del kit utilizado lote: 1652339

Tabla 36. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras de EPREX®/ERYPO®.

Lote mol de tiol libre/ mol de

proteína ± DE

FDS 6Q01 1Menor a 0.168

FAS 4800 1Menor a 0.168

FBS 4Z00 1Menor a 0.168 1 determinado a partir del límite de detección del kit utilizado lote: 1737934


Los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® muestran un contenido menor a 0.168 mol

de tiol libre por mol de proteína lo que indica que prácticamente todas las cisteínas se encuentran

formando puentes disulfuro. Este resultado permitió analizar la formación correcta de los enlaces

disulfuros.

6.1.8 Punto isoeléctrico por isoelectroenfoque.


El criterio para determinar la adecuabilidad del sistema de acuerdo al procedimiento establecido en el

laboratorio resultó conforme ya que se visualizan las 5 bandas mayoritarias del MRT según su

certificado.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 59/133

ANTERIOR/ N/P



Resultados:

Los geles obtenidos se muestran en las Figuras 19 y 20.

Se ha descrito que debido a diferencias en la composición de las cadenas de carbohidratos, la EPO

exhibe microheterogeneidad causada por modificaciones postraduccionales (Choi y cols, 1996). La

separación isoeléctrica muestra una variedad de diferentes isoformas (Sherwood y cols, 1988, Lasne y

de Ceaurriz, 2000; Lasne, 2001).

Fueron observadas entre 5–6 isoformas coincidentes entre los productos evaluados (Figuras 19 y 20).

Los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y del IFA mostraron 5 isoformas mientras que el lote 3342/P1513

Figura 19. Gel de IEF teñido con nitrato de plata.

MRT: 4 µg MRT (QFB) EPOhr/0113

Carril 1: 4 µg FDS6Q01

Carril 2: 4 µg 3342/P1512

Carril 3: 4 µg 3342/P1513

MRT 1 2 3

MRT 1 2 3

Figura 20. Gel de IEF teñido con nitrato de plata.

MRT: 4 µg MRT (QFB)EPOhr/0113

Carril 1: 4 µg FAS4800

Carril 2: 4 µg FBS4Z00

Carril 3: 4 µg 3342/P1511

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 60/133

ANTERIOR/ N/P



del IFA mostro una isoforma adicional (6 isoformas). Estos resultados son semejantes a los citados por

otros autores, que describen entre 5-7 isoformas para la EPOhr α e β (Gokana A y cols, 1997; Storring

PL y cols, 1998). Otros autores plantean, que por lo general en geles de IEF, ERYPO® (EPOhr α)

muestra un máximo de 6 isoformas, Neorecormon (EPOhr β) un máximo de hasta 8 isoformas y la EPO

urinaria entre 14 y 15 isoformas. Siendo algunas isoformas más abundantes que otras (Thieme y

Hemmersbach, 2010).

Las diferencias entre biosimilares y los productos originales pueden ser fácilmente reveladas por IEF

como demuestra en la figura 21 (Thieme y Hemmersbach, 2010). La ALFAEPOETINA® es el nombre

comercial de la EPOhr producida en el CIM y comercializada en Brasil. En la figura 21 se puede

observar que la ALFAEPOETINA® posee un perfil de isoformas similar al obtenido por el producto

de referencia ERYPO®, resultados que coinciden con los obtenidos al comparar los tres IFAs contra

tres lotes de EPREX®/ERYPO® como parte del estudio de biocomparabilidad de ALVERITIN® y

descritos en las figuras 19 y 20.

Figura 21. Perfil de IEF de varias eritropoyetinas biosimilares y original. IEF fue desarrollado en

un rango de pH de 2-6. Fuente: Reichel y cols, 2009.


El perfil de isoformas obtenidos en las muestras de EPOhr en el IFA y EPREX®/ERYPO® son

similares y se encuentran dentro del rango aceptado para la EPOhr en las diferentes monografías.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 61/133

ANTERIOR/ N/P



6.1.9 Espectroscopia de adsorción UV.


Se realizó el escaneo espectrofotométrico por triplicado de Tiroglobulina (Tg) a 0,5 mg/mL en el rango

de 250-350nm de adsorción para determinar el correcto funcionamiento del equipo. Posteriormente, se

realizó el cálculo derivativo de segundo orden de cada curva realizada en dos ensayos (17dic2015 y

10may2016). Los datos fueron graficados como se presenta en las Figuras 22 y 23.


corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda derivada del

espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos correspondientes al análisis

del 17dic2015


corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda derivada del

espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos correspondientes al análisis

del 10may2016.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 62/133

ANTERIOR/ N/P



Posteriormente se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA a los datos de la segunda derivada de

cada medición. Los criterios de aceptación fueron: Emparejamiento significativo (P<0.05) y R2 ≥0.98.

Los datos obtenidos de análisis estadístico tipo ANOVA indican la existencia de emparejamiento y se

obtuvo una R2 =0.99 para el ensayo realizado el día 17ene2015 y una R2 =0.99 en el ensayo realizado

el día 10may2016, por lo que la verificación de la adecuabilidad del sistema resulto conforme para

ambos ensayos realizados.

Resultados:

Se realizó el escaneo espectrofotométrico en el rango de 250-350nm de todas las muestras de los tres

lotes de IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® (Figura 24). Posteriormente, se realizó el cálculo

derivativo de segundo orden y los datos fueron graficados según se muestra en la Figura 25.

Figura 24. Comparación de los espectros (orden cero) obtenidos del barrido de adsorción UV de 250 a

350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 63/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 25. Comparación de los espectros derivativos de segundo orden obtenidos del barrido de

adsorción UV de 250 a 350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA de ALVERITIN®.

Se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA entre los espectros derivativos de segundo orden de los

medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA (Tabla 37) y se obtuvieron diferencias significativas.

Tabla 37. Resumen de biocomparabilidad entre los espectros derivativos de segundo orden de los

medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA.

ANOVA

F 4.6

Valor P 0.0004

Existe diferencias estadísticamente significativas entre las medias? (P<0.05) SI

R cuadrada 0.037

Se realizó un análisis estadístico tipo t de Student entre las intersecciones obtenidas en el rango 285-

295nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO y el IFA y se obtuvieron diferencias significativas para

la segunda intersección (Tabla 37A).

Tabla 37A. Resumen de biocomparabilidad entre las intersecciones obtenidas en el rango 285-295nm

de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA de ALVERITIN®.

T de Student

Intersección 1 2 3

Valor P 0.1139 0.0138 0.2067

Existe diferencias estadísticamente significativas? (P<0.05) NO SI No

Es importante señalar que las diferencias observadas podrían deberse al excipiente, el cual es diferente

entre el IFA y EPREX®/ERYPO®, ya que, aunque se realizó un diafiltración de las muestras, aun

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 64/133

ANTERIOR/ N/P



pudieron haber contenido trazas de los excipientes que hayan influenciado el resultado. El espectro

mostrado en la figura 25 de la segunda derivada de las muestras de EPREX®/ERYPO® y el IFA

presenta similitud, ya que las bandas corresponden y se puede observar como las intersecciones son

muy similares en el rango 385-295nm, aunque, los datos exactos muestren que para la segunda

intersección dicha diferencia es estadística significativa.

Conclusiones parciales:

- Las diferencias estadísticamente significativas encontradas entre las medias de los espectros y la

segunda intersección de los lotes de EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes del IFA

puede deberse a trazas de los excipientes presentes después de la diafiltración de cada muestra.

- No se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de la 1 y 3 intersección

correspondiente a EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes del IFA.

- Se obtuvieron, aunque los datos exactos muestren diferencia es estadística significativa, espectros

similares de la segunda derivada con correspondencia de la bandas de adsorción para

EPREX®/ERYPO® y el IFA.

6.1.10 Espectroscopia de fluorescencia.


Se realizó la adquisición del espectro de fluorescencia intrínseca de albumina sérica bovina (BSA) a 0.5

mg/mL para determinar el correcto funcionamiento del equipo. Posteriormente, se obtuvo el CME y

coeficiente de variación (CV). Los resultados obtenidos de los CME, presentaron coeficientes de

variaciones menor a 0.2% por lo que la verificación del sistema fue adecuado para los dos ensayos

realizados (16dic2015 y 26abri2016) (Figuras 26 y 27, Tabla 38 y 39).


verificación del 16dic2015.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 65/133

ANTERIOR/ N/P




verificación del 26abri2016.

Tabla 38. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 16dic2015

Longitud de onda 280nm 295nm

CME Promedio (nm) 344.93 ± 0.23 346.30 ± 0.07

Coeficiente de variación (%) 0.07 0.02

Tabla 39. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 26abri2016

Longitud de onda 280nm 295nm

CME Promedio (nm) 344.62 ± 0.11 345.48 ± 0.07

Coeficiente de variación (%) 0.03 0.02

Los coeficientes de variación fueron menores al 0.2%, indicando que el sistema era adecuado para

realizar las mediciones.

Resultados:

La muestra de EPREX® tuvo una concentración inicial 40 000UI/mL mientras que las muestras de

ERYPO® tuvieron una concentración inicial de 4 000 UI/0,4 mL.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 66/133

ANTERIOR/ N/P



Se adquirió el espectro de fluorescencia de todas las muestras a las longitudes de onda de excitación de

280 y 295nm (Figura 28).

Figura 28. Comparación de los espectros de emisión de EPREX®/ERYPO® y el IFA excitando a 280

y 295nm.

Posteriormente, se realizó el cálculo del CME (Tablas 40 y 41).

Tabla 40. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras de

EPREX®/ERYPO®.

excitación 280 nm excitación 295 nm

Lote CME (nm) CV (%) CME (nm) CV (%)

FAS 4800 343.52 0.04 344.87 0.04

FBS 4Z00 343.57 0.03 344.78 0.09

FDS 6Q01 343.52 0.03 343.99 0.03

Media aritmética y DE 343.54 ± 0.03 - 344.55 ± 0.48 -

DE, Desviación estándar

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 67/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 41. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras del IFA.

excitación 280 nm excitación 295 nm

Lote CME (nm) CV (%) CME (nm) CV (%)

3342/P1511 344.21 0.03 345.26 0.03

3342/P1512 343.97 0.06 344.55 0.09

3342/P1513 343.13 0.04 343.12 0.05

Media aritmética y DE 343.77 ± 0.57 - 344.31 ± 1.09 -

DE, Desviación estándar

Se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA entre los espectros de fluorescencia obtenidos de los

medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA (Tabla 42) y se obtuvieron diferencias significativas y

entre los CMEs por medio del análisis estadístico t de Student (Tabla 43) y no se obtuvieron diferencias

significativas.

Tabla 42. Resumen de la comparación de espectros de fluorescencia. Los resultados obtenidos se

presentan tal y como los arroja el ANOVA.

Tabla 43. Resumen de la comparación de CMEs por medio del análisis estadístico t de Student. Los

resultados obtenidos se presentan tal y como los arroja el software Prism 6.

Las diferencias significativas obtenidas entre la intensidad de la fluorescencia entre el producto

EPREX®/ERYPO® y el IFA pueden deberse a las diferencias en la composición de la formulación

entre ambos productos y a la utilización del buffer PBS en vez del buffer de formulación de cada

producto. Esto coincide con los resultados obtenidos por Deechongkit y cols en el 2006 donde

demuestran que existen diferencias entre las proteínas contenidas en EPREX® y EPOGEN®, con

diferente tampón de formulación, al evaluarlas por fluorescencia del Trp intrínseco.

Sin embargo, no existen diferencias significativas entre los CME de los tres lotes de IFA y los tres

lotes de EPREX®/ERYPO® comparados lo que confirma que tienen igual estructura terciaria de la

molécula.

Como parte de la caracterización del IFA producido en el CIM se evaluó la estructura terciaria de 10

lotes del producto por espectroscopia de fluorescencia en los laboratorios LAMMB de la UNAM

ANOVA

Excitación 280nm 295nm

F 9.4 8.1

Valor P < 0.0001 < 0.0001

¿Existen diferencias estadísticamente significativas

entre las medias? (P < 0.05) Si Si

R cuadrada 0.025 0.022

t de Student

Excitación 280nm 295nm

Valor P 0.5501 0.7484

¿Significativamente diferente? (P < 0.05) No No

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 68/133

ANTERIOR/ N/P



utilizando el buffer de formulación en las corridas. En la figura 1 se observa la semejanza el los

espectros de emisión de los 10 lotes de IFA y no se obtuvieron diferencias significativas entre los

mismos cuando fueron evaluados por un ANOVA para un 95% de confianza (Tabla 23). En la tabla 24

se muestran los bajos coeficientes de variación obtenidos (<0.1 %) para la media de los CME a 280 y

295nm de excitación lo que demuestra la consistencia del proceso productivo y la similitud en la

estructura terciaria entre lotes del IFA.


- Las diferencias estadísticamente significativas encontrada entre las medias de los espectros de

fluorescencia de los lotes de EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes del IFA se debe a la

utilización del PBS en vez de los buffer de formulación de cada producto.

- El análisis t de Student no mostró diferencias significativas entre los CEMs de los lotes de

EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes de IFA por lo que podemos concluir que los

productos tienen igual estructura terciaria.

6.1.11 Perfil de N-Glicosilación.


Se obtuvieron dos curvas de calibración con el estándar de homopolímero de glucosa debido a que el

análisis se realizó en dos días independientes. Estas curvas fueron usadas para la transformación de los

tiempos de retención en unidades de glucosa (UG). El ajuste polinomial deberá presentar una R2 mayor o

igual a 0.98. En la figura 29A se muestra la curva obtenida en el análisis realizado el día 03dic2015

cuando se analizaron los tres lotes del IFA y en la figura 29B la curva obtenida en el análisis realizado

el día 17ago2016 cuando se analizaron los tres lotes de EPREX®/ERYPO®.

Figura 29. Curva de calibración del estándar de homopolímero de glucosa. Se muestra la

correlación después de un ajuste polinomial de tercer orden, la cual fue usada para el cálculo de las

unidades de glucosa (UG) en los cromatogramas. Verificación correspondiente al 03dic2015 (A) y al

17ago2016 (B).

Las curvas de calibración obtenidas del estándar de homopolímero de glucosa presentaron una R2

mayor a 0.99, indicando que el sistema era adecuado para realizar las determinaciones.

A B

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 69/133

ANTERIOR/ N/P



Resultados:

Se realizó la determinación del perfil de N-glicosilación por medio de HPLC fase normal de las

muestras de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y de los tres lotes del IFA. En las figuras 30 y 31 se

muestran los perfiles de glicanos obtenidos del análisis.

Figura 30. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de EPREX®/ERYPO®.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 70/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 31. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras del IFA.

En las Figuras 30 y 31 se observa que los 3 lotes de cada producto poseen un perfil de glicosilación

similar. Adicionalmente se realizó el estudio de biocomparabilidad mediante análisis estadístico entre los resultados

de los tres lotes del medicamento EPREX®/ERYPO y tres lotes del IFA. El análisis de biocomparabilidad

fue realizado mediante la prueba “t de Student” con un valor de p de dos colas y un intervalo de confianza

del 95%. Esta prueba fue aplicada a todas y cada una de las estructuras propuestas, así como a los

porcentajes relativos de glicanos por grupos. En la Figura 32 se muestra el empalme de los perfiles de

glicosilación de los 6 lotes analizados. En la Tabla 44 se muestran los resultados obtenidos del análisis

estadístico para cada estructura propuesta. En la Tabla 45 se muestra el resumen de biocomparabilidad por

grupos de las estructuras identificadas.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 71/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 32. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de EPREX®/

ERYPO® y el IFA.

Tabla 44. Resumen de biocomparabilidad entre los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.

Estructuras propuestas para los N-glicanos con base en su migración en unidades de glucosa,

asumiendo que la proteína se produjo en una línea celular murina El análisis estadístico se realizó por

medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p de dos colas y un intervalo de

confianza del 95%. Estructuras propuestas murina. Las abreviaturas utilizadas son: A: Núcleo

quitobiosa con tres manosas y dos N-acetilglucosaminas. F: Fucosa. G: Galactosa. M: Manosa. S:

Ácido siálico. LAC: Lactosamina (N-acetilglucosamina-G). Los números se refieren al número de cada

residuo en el glicano.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 72/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 45. Resumen de biocomparabilidad entre los grupos de N-glicanos encontradas en las muestras

de EPREX®/ERYPO® y IFA (producción en línea celular murina). El análisis estadístico se realizó

por medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p de dos colas y un intervalo de

confianza del 95%.

Nota: Debido a la diferencia de intensidades en las unidades de florescencia de cada lote, todos los cromatogramas

fueron normalizados tomando como referencia el pico mayoritario correspondiente a la estructura A4G4S4

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 73/133

ANTERIOR/ N/P



Mediante el análisis del perfil de glicosilación de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA,

fueron encontradas 24 estructuras glicosídicas comunes. Las 24 estructuras encontradas fueron

evaluadas mediante el análisis estadístico t de Student. Cuatro de las 24 estructuras no presentaron

diferencias estadísticamente significativas, mientras que 20 estructuras si presentaron diferencias

estadísticamente significativas entre los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.

Independientemente las diferencias obtenidas entre el IFA y EPREX®/ERYPO® en este estudio se

puede observar que se obtuvo un mismo perfil de glicosilación entre ambas moléculas difiriendo en el

contenido relativo de algunas especies y no se observaron estructuras inusuales con posible potencial

inmunogénico. También se observó que no se obtuvieron diferencias estadísticas entre ALVERITIN®

y EPREX®/ERYPO® en los estudios preclínicos (afinidad, actividad biológica in vivo e in vitro,

farmacocinética) por lo que consideramos que las diferencias en el contenido relativo de algunas

especies de ALVERITIN® en relación al observado en EPREX®/ERYPO® no impacta sobre estos

atributos de la molécula lo que garantiza la seguridad y eficacia del uso del producto en la clínica

demostrado a través de los informes de más de 10 años en el proceso de farmacovigilancia

internacionales reportadas al CIM (29 países y 1 505 941 pacientes). Dado que la glicosilación no sólo

depende de la línea celular utilizada para la expresión de las epoetinas sino también de todo el proceso

biotecnológico, los patrones de glicosilación de los biosimilares no reflejan necesariamente los

patrones de los compuestos innovadores (Schellekens, 2004; Michail y Farouk, 2013). Resultados

similares fueron obtenidos en los estudios de biocomparabilidad de la epoetin zeta aprobado como

biosimilar de EPREX® (EMA SB309, 2007). La epoetina zeta es otra EPOhr biosimilar comercializada

en Europa (aprobada en diciembre de 2007) y distribuida como Retacrit®y y Silapo®. Tanto la HX575

como la epoetina zeta tienen patrones de glicosilación diferentes de los de la epoetina alfa; sin

embargo, ambos fueron aprobados como formulaciones biosimilares de epoetina alfa (Islah y cols,

2012).

De igual manera en este estudio de biocomparabilidad los grupos de glicanos fueron evaluados por

medio de análisis estadístico t de Student. Se encontró que los grupos biantenarios, sialidados y altos de

manosa no presentan diferencias estadísticamente significativas entre ambas moléculas. Por lo antes

expuesto y al no obtener diferencias significativas entre los grupos de glicanos sialidados entre ambas

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 74/133

ANTERIOR/ N/P



moléculas consideramos que las mismas poseen similar contenido de ácido siálico en su estructura, lo

cual fue verificado al no obtener diferencias estadísticas en los resultados de afinidad y ensayos in vivo

e in vitro realizados entre ambas moléculas. Se pudo comprobar que el contenido de ácido siálico de las

muestras evaluadas de los tres lotes del IFA (12.00; 12.00 y 13.60 moles/mol de proteína) es mayor de

10 y menor de 14 moles/mol de proteína, cumpliendo con lo remomendado por la FE (FE 1316, 2016)

para la EPOhr y por lo reportado por otros autores que plantean que por la presencia de hasta cuatro

ácidos siálicos cargados negativamente en cada una de las tres cadenas de carbohidratos unidos a N y

hasta dos ácidos siálicos en la única cadena de carbohidratos unidos a O da como resultado hasta 14

ácidos siálicos tanto en la EPO endógena como en la recombinante (Egrie y Browne, 2001). La EPO

humana es una hormona conformada por dos partes, la secuencia de aminoácido (165 aminoácidos)

responsable de la unión a su receptor (Jelkmann, 2005) y la parte glicosilada (35-40 % de la molécula)

responsable de la estabilidad y del tiempo de vida media de la molécula en la circulación sistémica

(Alegre, 2005). Se ha demostrado que la actividad hematopoyética aumenta con un número creciente

de sialiloligosacáridos (Murakami y cols, 2016). La sialilación de los residuos de galactosa

preterminales es necesaria para la actividad in vivo. Se ha demostrado que la asialo-EPO es eliminada

rápidamente por los hepatocitos (Jelkmann 2003).

De la evaluación estadística por grupos de glicanos realizada en este estudio se obtuvo que los grupos

tri- y tetraantenarios así como fucosilados si muestran diferencias estadísticas significativas entre los

medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA, siendo en el IFA los grupos tri- y tetraantenarios mayores

(50.39 y 55.73% respectivamente) y los fucosilados menores (44.93%). Valorando que el contenido de

glicanos tri y tetraantenas es mayor en el IFA que EPREX® y que en ambos productos hay mucho

mayor porciento de tetraantena que biantena y por la función que desempeñan los glicanos tetraantena

en la estabilidad de la molecular, solubilidad, actividad in vivo, semivida en suero, agregación y

protección de los sitios hidrófobos de la molécula antes señalados consideramos que las diferencias

obtenidas en estos glicanos no tiene un impacto biológico significativo lo cual quedó demostrado al no

obtener diferencias estadística entre ambas moléculas en relación a su actividad biológica in vivo e in

vitro, afinidad por el receptor, farmacocinética y bajo contenido de agregación determinado por

SDS.PAGE/WB y HPLC-GF. Además, se establece que la actividad específica de las muestras

evaluadas de los tres lotes del IFA (103 797; 113 789 y 100 074 UI/mg de proteína) cumplen con lo

remomendado por la FE (FE 1316, 2016) para la EPOhr quedando corroborado al no obtenerse

deferencias estadísticas en la actividad biológica entre ambos biomedicamentos. La estructura y

composición de los carbohidratos son importantes para el mantenimiento de la molécula en circulación.

La glicosilación también es necesaria para el transporte plasmático de la molécula, para el paso de la

misma desde la sangre a la médula ósea través de las células endoteliales de la barrera sangre-médula

ósea (J.Miguel, 2015), para la estabilidad molecular, la solubilidad, la actividad in vivo, la semivida y la

inmunogenicidad (Zoltan y cols, 2010). La EPO posee 4 sitios de glicosilación y tres de ellos ligados al

residuo asparagina 24, 38 y 83 (Takeuchi y Kobata, 1991). Estas glicosilaciones exhiben un diverso

rango que van desde formas bi hasta tetraantenas y juegan un rol critico en el incremento del tiempo de

vida media de la EPO en sangre y en la actividad biológica (Dordal, 1985). Algunos autores han

demostrado que los sialiloligosacáridos de la asparagina 24 de la EPO urinaria humana y la EPOhr

exhiben diversidad en un intervalo de un patrón bi a tetraantenario, mientras que los

sialiloligosacáridos en la asparagina 38 y 83 se demostró que existían principalmente en forma

tetraantenaria (Rahbek-Nielsen y cols, 1997). Otros autores sugieren que los sialiloligosacáridos en la

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 75/133

ANTERIOR/ N/P



asparagina 38 y 83 son necesarios para cubrir la superficie de la proteína hidrófoba con

sialiloligosacáridos tetraantenario, que es necesario para retener su solubilidad de la molécula en la

sangre y para prevenir la agregación proteína-proteína (Murakami y cols, 2016; Murakami y cols,

2012; Hirano y cols, 2011; Hirano y cols, 2009). Considerando estos efectos de las proteínas,

Murakami y cols (2016) tomaron como hipótesis que el cuerpo humano usa la glicosilación como una

modificación postraslacional para regular la hidrofibicidad de la proteína secretada y protegerla de la

agregación proteína-proteína, así como para regular la filtración renal en el caso de la EPO porque el

oligosacárido exhibe propiedades altamente hidrofílicas y de baja propiedades antigénicas en el cuerpo.

Esto significa que la posición de glicosilación y el patrón de glicosilación son críticos para la

bioactividad de las glicoproteínas (Murakami y cols, 2016). Mientras que las diferencias en el

contenido de carbohidratos de la EPO puede afectar la afinidad a su receptor, los carbohidratos también

desempeña un papel importante en el mantenimiento de la molécula en circulación (Elliot y cols,

2004). Además de su efecto sobre la eliminación los carbohidratos también pueden aumentar la

solubilidad y disminuir las propiedades adhesivas de la proteína. Por lo tanto, el carbohidrato puede

proteger los residuos hidrófobos, reduciendo la agregación mientras protege las posibles superficies

inmunogénicas de la molécula (Zoltan y cols, 2010). Las cadenas de N-oligosacáridos tetraantenarios

impiden la depuración renal de la EPO, por lo que la relación de cadenas tetra- a diantenaria es

importante para la actividad in vivo de EPO (Jelkmann, 2003). Las cadenas de carbohidratos de la EPO

son responsables principalmente de su integridad y estabilidad, siendo el punto de partida de nuevos

desarrollos de análogos hiperglicosilados como la Darbepoetina alfa con vidas media sérica más larga

(Narhi y cols, 1991). La Darbepoetina alfa se catalogó como una EPO de segunda generación, ya que

se caracterizó por triplicar el tiempo de vida media en circulación sistémica debido a la adición de

cinco aminoácidos a la secuencia original de la EPO endógena teniendo así dos sitios de N-

glicosilación adicionales en la molécula lo cual dio como resultado un incremento significativo en el

tiempo de vida media (Macdougall, 2008). La tercera generación de EPOs se encuentra representada

por el Activador Continuo del receptor de EPO, cuyo nombre comercial es Mircera. Debido a la

adición de una cadena de metoxi-polietilenglicol a la secuencia de aminoácidos de la epoetina-beta

incrementando el tamaño de la molécula de 30kDa a 60kDa y un incremento del tiempo de vida media

a 130 horas (Thieme y Hemmersbach, 2010). Cuando se compararon las actividades in vitro e in vivo

(Darbepoetin y EPOhr), las formas de la curva dosis-respuesta, la estimulación máxima y la respuesta

hematológica fueron todas similares, lo que sugiere que el contenido diferente de carbohidratos puede

afectar la actividad específica pero no afecta la función biológica per se (Egrie y Browne, 2001). La

causa del aumento de la inmunogenicidad de EPREX®, por cambios en su formulación, todavía está en

discusión (Schellekens, 2004), aunque la agregación en la nueva formulación se considera la

explicación más probable, junto con la vía subcutánea de administración (Schellekens y Jiskoot, 2006).

En Tailandia, múltiples casos se han reportado de PRCA. También aquí, los agregados inducidos por

un almacenamiento inadecuado podrían haber contribuido al desarrollo de PRCA. Praditpornsilpa y sus

colegas (2009) mostraron una correlación entre el desarrollo de PRCA y el gen HLA-DRB1*09-

DQB1*0309, que es más abundante en la población tailandesa en comparación con la caucásica. La

calidad y el nivel de agregados en los biosimilares es un tema importante (Vera y cols, 2011).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 76/133

ANTERIOR/ N/P




- Se obtuvo el mismo perfil de estructuras propuestas para N-glicosilación entre EPREX®/ERYPO®

y el IFA difiriendo en el contenido relativo de algunas especies y grupo de N.

- No se observaron estructuras inusuales en el perfil de N-Glicosilación.

- Las diferencias encontradas no tienen impacto en la actividad biológica, afinidad por el receptor,

farmacocinética y agregación de ALVERITIN® en comparación con EPREX®/ERYPO®.

- Se establece que el uso de ALVERITIN® es seguro al no observarse estructuras glicosídicas

inusuales y bajo contenido de agregación de la molécula.

6.1.12 Perfil de isoformas por electroforesis capilar.


Se inyectó al capilar el estándar fisicoquímico de Eritropoyetina CRS cumpliendo con los parámetros

de verificación del sistema que se muestra en la tabla 46.

Tabla 46. Verificación del sistema.

Resultados:

En la Tabla 47 se presentan los porcentajes de isoformas obtenidos para el estandar CRS de la FE y los

criterios recomendados para cada una de las 8 isoformas de la EPOhr. En la tabla 48 se muestras los

resultados obtenidos por electroforesis capilar en cinco lotes del IFA evaluados.


Isoforma CRS FE %

1 0 0 a 15

2 0.508 0 a 15

3 3.330 1 a 20

4 17.087 10 a 35

5 28.670 15 a 40

6 30.106 10 a 35

7 18.32 5 a 25

8 1.979 0 a 15

Tabla 48. Resultados adicionales de electroforesis capilar.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 77/133

ANTERIOR/ N/P



Isoform

a

Estánda

r

IFA de ALVERITIN® ERYPO

®

Especificació

n CRS 3342/P150

3

3342/P150

4

3342/P150

7

3342/P154

1

3342/P154

2

FBS4Z00 FE %

1 0 0.588 0.653 0 0 0.473 0 0 a 15

2 0.508 3.244 4.553 0.993 1.613 4.438 0.317 0 a 15

3 3.330 16.743 15.997 12.294 11.418 17.704 3.123 1 a 20

4 17.087 27.480 25.511 25.233 28.515 28.047 18.960 10 a 35

5 28.670 26.553 26.139 28.177 30.271 25.641 30.734 15 a 40

6 30.106 16.484 18.338 21.245 20.311 16.055 29.667 10 a 35

7 18.32 7.210 7.610 9.753 7.873 6.401 16.240 5 a 25

8 1.979 1,698 1.200 2.306 0 1.240 0.959 0 a 15

Como se observa en la tabla 48 todas las muestras analizadas de los cinco lotes del IFA, del lote de

ERYPO® y el estándar fisicoquímico CRS presentaron porcentajes de área de los picos

correspondientes a las 8 isoformas dentro del intervalo establecido en la monografía de la EPOhr en la

FE (FE 1316, 2016).

Se calcularon las medias de los porcientos para cada isoforma obtenidas para el IFA y se compararon

con los valores de porcientos obtenidos para el lote de ERYPO® y el estándar CRS (Tabla 49) donde

se observan claras diferencias entre los productos.


Isoforma Estándar IFA de ALVERITIN® ERYPO® Especificación

CRS Media±DE FBS4Z00 FE %

1 0 0.342 ±0.320 0 0 a 15

2 0.508 2,968 ±1.619 0.317 0 a 15

3 3.330 14.831 ±2.800 3.123 1 a 20

4 17.087 26.957 ±1.496 18.960 10 a 35

5 28.670 27.356 ±1.887 30.734 15 a 40

6 30.106 18.487 ±2.285 29.667 10 a 35

7 18.32 7.769 ±1.241 16.240 5 a 25

8 1.979 1.289 ±0.848 0.959 0 a 15

DE: Desviación estándar.

En ERYPO® fueron observadas 7 isoformas y en el IFA hasta 8 isoformas. Además, los productos

mostraron diferentes relaciones de isoformas. En ERYPO® fueron más abundantes las isoformas 5 y 6,

y en el IFA las isoformas 4 y 5. En nuestro estudio no se obtuvieron diferencias significativas entre los

resultados de actividad biológica in vivo e in vitro de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® por lo que

se sugiere que las diferencias obtenidas en la glicosilación y el perfil de isoformas de ALVERITIN®

no tiene un impacto significativo en la potencia del producto en relación a EPREX®/ERYPO®.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 78/133

ANTERIOR/ N/P



Diferente número y relación de isoformas fueron encontradas al comparar por electroforesis capilar los

productos EPREX®, BINOCRIT®, RETACRIT®, DYNEPO® y NEORECORMON® observándose

que en EPREX® fueron más abundantes las isoformas 5 y 6, en BINOCRIT®, siendo biosimilar de

EPREX®, fue más abundante la isoforma 6 y en RETACRIT® fue más abundante la isoforma 5

(Figura 33) (Vera y cols, 2011) mientras que en el estudio realizado por Liem y cols (2016) se observó

que en EPREX® y BINOCRIT® fue más abundante la isoforma 5 y en RETACRIT® las isoformas 4 y

5, observándose en el RETACRIT® 7 isoformas, una más que en el estudio realizado por Vera y cols

(Figura 34). También puede observarse que en el presente estudio se obtuvieron 7 isoformas para

ERYPO® mientras que en el estudio realizado por Vera y cols (2011) y Liem y cols (2016) se

obtuvieron 6 isoformas para EPREX®, como también en nuestro estudio para el IFA se observaron

lotes que contenían entre 6 y 8 isoformas lo que puede explicarse por las diferencias en la glicosilación

lote a lote encontradas en otros estudios para la EPO (Schellekens, 2004).

Figura 33. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Vera y cols, 2011.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 79/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 34. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Liem y cols, 2016.

Algunos autores plantean que la glicosilación puede afectar la potencia de la molécula de la EPO al

igual que los diferentes perfiles de isoformas (Vera y cols, 2011; Delorme y cols, 1992 y Takeuchi y

cols, 1989).

En estudios realizados se ha demostrado que la calidad de los biosimilares de EPO es alta,

independientemente que se han observado diferencias en el contenido, perfiles de isoformas, y potencia

entre el producto innovador y sus biosimilares. Las diferencias no solo han sido observadas entre los

productos de diferentes fabricantes sino también en diferentes lotes del mismo producto. Tales

variaciones en los atributos de calidad son inevitables porque la fabricación de la EPOhr requiere el uso

de células vivas, en línea con el paradigma “similar pero no idéntico”. Por lo tanto, el ser diferente del

innovador no implica necesariamente una calidad diferente del producto (Schiestl y cols, 2011;

Shellekens, 2004; Liem y cols, 2016 y Vera y cols, 2011).


- Todas las muestras analizadas presentaron porcentajes de área de los picos dentro del intervalo

establecido en la monografía de la EPOhr en la FE (FE 1316, 2016).

- La diferencias obtenidas en el perfil y relación de las isoformas entre EPREX®/ERYPO® y el IFA

son esperadas por tener ambos productos diferente proporción de N-Glicanos.

- Las diferencias encontradas en el perfil y relación de isoformas entre EPREX®/ERYPO® y el IFA

no muestran impacto en la actividad biológica al no obtenerse diferencias estadísticas entre los

resultados biológicos in vivo, in vitro y por afinidad entre ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®.

6.1.13 Cromatografía en Gel filtración.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 80/133

ANTERIOR/ N/P




Se aplicó el 2% de cada una de las muestras evaluadas, tomándose como criterio de adecuabilidad que

la relación entre el promedio de las áreas del pico del monómero de la EPOhr de la muestra al 2% y el

área del pico del monómero de la EPOhr pura resulte entre 1,5-2,5%. En la tabla 50 se pueden observar

que las relaciones obtenidas para cada muestra evaluada cumplen con este parámetro por la que la

verificación del sistema resultó conforme.

Tabla 50. Resumen de la verificación por HPLC-GF.

IFA EPREX®/ERYPO® Material de

Referencia

3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513 FAS

4800

FBS

4Z00

FDS

6Q01

MRT(QFB)rh-

EPO/0113

Relación 1.9 2.3 2.0 2.1 2.2 2.0 1.6

Resultados:

En la figura 35 se comparan los cromatogramas obtenidos por HPLC-FR para los tres lotes de

EPREX®/ERYPO®, los tres lotes de IFA y el MRT con código MRT (QFB)rh-EPO/0113 trazable al

BRP lote 3 de la FE.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 81/133

ANTERIOR/ N/P



2

Los valores de porcientos de monómero, dímero y oligómeros obtenidos para cada muestra evaluada de

los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y los tres lotes del IFA se muestran en la Tabla 51.

1

Monómero

Oligómeros

Dímero

2 3

4 5 6

7

Figura 35. Cromatogramas obtenidos por el método de HPLC-GF

1- MRT: MRT(QFB)EPOhr/0113

2- Biofármaco Lote: 3342/P1511



5- Innovador ERYPO® Lote: FAS 4800

6- Innovador ERYPO® Lote: FBS 4Z00

7- Innovador EPREX® Lote: FDS 6Q01

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 82/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 51. Resumen de la comparación por HPLC-GF.

Especie

(%)

IFA EPREX®/ERYPO®

3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513 FAS

4800

FBS 4Z00 FDS 6Q01

Oligómeros 0.103 0.068 0.031 0.000 0.059 0.022

Dímero 1.080 0.217 0.173 1.284 0.288 0.000

Total de

especies de

alto peso

molecular

1.183 0.285 0.204 1.284 0.347 0.022

Monómero 98.817 99.715 99.796 98.716 99.653 99.978

Como se puede observar en la tabla 51 para todos los lotes incluidos en el estudio se obtuvieron valores

de pureza en relación a la especie monomérica > 98,00% y valores de especies de alto peso molecular ≤

2,00% por lo que todos los lotes cumplen con lo recomendado en la FE (FE 1316, 2016). Estos

resultados, por tratarse de un método más sensible, confirman los obtenidos por los métodos de

electroforesis y western Blot, realizados a los lotes de EPREX®/ERYPO®, IFA y ALVERITIN®, y

sugieren que el riesgo de respuesta inmune inducida por agregados en estos productos evaluados es

bajo (Vera y cols, 2011; Boven y cols, 2005; Hermeling y cols, 2003 y Hermeling y cols, 2006).

No se obtuvieron diferencias significativas (P=0,990) entre los valores medios del total de especies de

alto peso molecular y el % del monómero entre los lotes de EPREX®/ERYPO® y el IFA (Tabla 52).

Tabla 52. Resumen de la comparación de los resultados de HPLC-GF por medio de un ANOVA.


Todas las muestras analizadas poseen ≤ 2,00% de especies de alto peso molecular. No se encontró

diferencia significativa entre los lotes de EPREX®/ERYPO® y los lotes del IFA con un intervalo de

confianza de 95%.

ANOVA

Especie % total de especies de alto peso molecular % monómero

Valor P 0.990 0.990

¿Significativamente diferente? (P <

0.05)

NO NO

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 83/133

ANTERIOR/ N/P



6.1.14 Determinación del contenido de ácido siálico.


Se obtuvieron dos curvas estándar de ácido siálico acetilado debido a que el análisis se realizó en dos

días independientes. En la figura 36 se muestra la curva obtenida en el análisis realizado el día

04abr2015 y en la figura 37 la curva obtenida en el análisis realizado el día 21abri2015.

Figura 36. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).

Figura 37. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).

Las curvas estándares obtenidas son adecuadas para realizar la cuantificación de las muestras al

obtenerse en ambas un coeficiente R2 ≥ 0.998, una pendiente (M) entre 0.0036-0,0040 y coeficientes

de variación (CV) ≤ 7,00%. Resultados:

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 84/133

ANTERIOR/ N/P



Los resultados de ácido siálico obtenidos para cada lote del IFA se observa en la tabla 53. No fue

posible hacer la determinación en lotes del producto innovador por falta de disponibilidad de muestra.

Tabla 53. Resultados del contenido de ácido siálico en las muestras del IFA.

IFA

3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513

Contenido de ácido siálico

(moles/mol de proteína) 12.00 12.00 13.60

El contenido de ácido siálico de las muestras evaluadas de los tres lotes del IFA es mayor de 10 moles/

mol de proteína por lo que los tres lotes cumplen con lo establecido por la FE (FE 1316, 2016) para la

EPOhr.

Conclusión parcial: Los tres lotes del IFA poseen un contenido de ácido siálico conforme a lo recomendado en las

diferentes farmacopeas para la EPOhr. Al no existir diferencias estadísticas significativas entre

ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® en los resultados de los métodos funcionales in vitro e in vivo

evaluados en este estudio y conociendo la función biológica que desempeña el ácido siálico, se

establece que no hay deferencias en el contenido de ácido siálico entre ALVERITIN® y

EPREX®/ERYPO®.

6.1.15 Endotoxinas bacterianas.


Los valores de correlación de la curva estándar en el ensayo realizado fue ≥ 0.98, los coeficientes de

variación entre las réplicas fueron < 10% y los valores de recuperación de endotoxinas en los controles

positivos estuvieron en el 50- 200% (Tabla 54 y 55) indicando que los ensayos fueron válidos y el

sistema era adecuado para realizar las mediciones.

Tabla 54. Determinación de endotoxinas bacterianas por LAL.

Concentración de la curva estándar

(EU/mL)

CV% Coeficiente de regresión (%)

0.005 2.82

0.996

0.050 2.15

0.500 1.11

5.000 0.08

50.000 1.04

CV: Coeficiente de variación

Resultados:

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 85/133

ANTERIOR/ N/P



Los valores de endotoxinas obtenidos en los tres lotes de EPREX®/ERYPO y en los tres lotes de

ALVERITIN® evaluados estuvieron por debajo de 1.000 UE. Los valores, en su conjunto, estuvieron

muy por debajo del límite establecido de < 20 UE/ 10 000 UI de EPO según recomendaciones de la FB

(FB, 2016) (Tabla 55).

Tabla 55. Resultado de endotoxinas para los lotes de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®. EPREX®/ERYPO® ALVERITIN®

Lote

Nivel de

endotoxin

as

(UE/mL)

Nivel de

endotoxina

(UE/UI de

EPO)

Recuperación

del control

positivo

(%)

Lote

Nivel de

endotoxinas

(UE/mL)

Nivel de

endotoxinas

(UE/UI de

EPO)

Recuperación

del control

positivo

(%)

FAS 4800 <0.250 < 0.625 123 LP00415 <0.250 < 0.625 108

FBS 4Z00 <0.250 < 0.625 130 LP00515 <0.250 < 0.625 88

FDS 6Q01 <0.250 < 1.000 147 LP00615 <0.250 < 0.625 91

Conclusión:

Los resultados de endotoxinas de los lotes correspondientes a EPREX®/ERYPO® ALVERITIN®

cumplen con lo recomendado por diferentes farmacopeas y se encuentran por debajo del límite

aceptado lo cual garantiza la seguridad del producto para su uso en humanos.

6.1.16 Conteo de partículas subvisibles.


El conteo de las partículas de 10 µm en el blanco del ensayo (agua libre de partículas) fue de 9

partículas en 25 mL por lo que el sistema era adecuado para realizar las mediciones de las muestras

según la FE (FE 2.9.19, 2016).

Resultados:

Los valores obtenidos en los tres lotes de ALVERITIN® evaluados estuvieron por debajo de 100 para

las partículas iguales o mayores que 10 µm y por debajo de 0.5 para las partículas iguales o mayores

que 25 µm. Todos los valores estuvieron muy por debajo del límite establecido (Tabla 56).

Tabla 56. Resultados de conteo de partículas subvisibles para los lotes de ALVERITIN®.

ALVERITIN®

Lote

Partículas iguales o mayores

que 10 µm

≤6000 partículas/envase

Partículas iguales o mayores

que 25 µm

≤600 partículas/envase

Dictamen

LP00415 68.0 0.5 Cumple

LP00515 96.7 0.5 Cumple

LP00615 82.3 0.2 Cumple

Conclusión:

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 86/133

ANTERIOR/ N/P



Los resultados de partículas subvisibles de los lotes correspondientes a ALVERITIN® se encuentran

por debajo del límite aceptado por la FE (FE 2.9.19, 2016) y la FB (FB apéndice XIIIB, 2016) para este

parámetro, por lo que se concluye que el producto es seguro.

6.1.17 Partículas visibles.


Se verificó, antes de realizar la operación, la intensidad de la luz en la cabina de Inspección visual

utilizada según recomienda la FE (FE 20920, 2016).

Resultados:

Los resultados obtenidos en los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y en los tres lotes de ALVERITIN®

evaluados se muestran en la Tabla 57.

Tabla 57. Resultado de partículas visibles en los lotes de EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN®.

Resultados de la inspección EPREX®/ERYPO® ALVERITIN® Dictamen

Transparente Si Si Cumple

Incolora Si Si Cumple

Turbio No No Cumple

Coloreado No No Cumple

Cierre defecuoso No No Cumple

Ralladuras No No Cumple

Daños en la tapa o ratapa No No Cumple

Partículas extrañas

Vidrios No No Cumple

Escamas No No Cumple

Puntos negros No No Cumple

Fibras metálicas No No Cumple

Fibras coloreadas No No Cumple

Fibras de tejido No No Cumple

Partículas de goma No No Cumple

Partículas brillantes No No Cumple

Partículas en

suspensión en forma de

bastoncillos

No No Cumple


No se obtuvieron diferencias en los resultados de partículas visibles en los lotes correspondientes a

ALVERITIN® en comparación con los lotes correspondientes a EPREX®/ERYPO®, siendo

soluciones claras, incoloras y libres de partículas extrañas, cumpliendo con el criterio establecido para

este parámetro (FE 20920, 2016).

6.2 Resultados de la caracterización funcional.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 87/133

ANTERIOR/ N/P



6.2.1 Actividad biológica in vitro.


El método para determinar la inducción de la proliferación de la EPOhr por medio del ensayo

colorimétrico fue validado, cumpliendo con los atributos establecidos en el plan de validación:

linealidad; precisión, exactitud y adecuabilidad para el medicamento de referencia empleado. En los

ensayos de biocomparabilidad realizados se obtuvo una curva dosis respuesta del medicamento de

referencia que corresponde con los resultados obtenidos en la validación del método.

Resultados:

Los ensayos in vitro realizados en células TF-1 estimuladas con muestras de los tres lotes de

ALVERITIN® y tres lotes de EPREX®/ERYPO® mostraron que la proliferación aumenta de forma

dependiente a la concentración de ambos medicamentos, como resultado de la unión de la EPOhr con

su receptor y la cascada de señalización que regula la proliferación. Mediante un análisis comparativo

entre las curvas de las regresiones no lineales obtenidas para los tres lotes de ALVERITIN® y los tres

lotes de EPREX®/ERYPO® no se observaron diferencias significativas (P=0.6950) (Figura 38).

Tampoco se observaron diferencias estadísticas significativas en los parámetros de la pendiente de Hill,

la respuesta máxima y log IC50 al realizar una t de “Student” no pareada (Tabla 58).

Figura 38. Comparación del efecto proliferativo in vitro del EPREX®/ERYPO® vs ALVERITIN®.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 88/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 58. Resumen estadístico de la comparación entre el efecto del medicamento

EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN® sobre la proliferación en células TF-1.

Ensayo

Log IC50 + EEM Pendiente de Hill + EEM Respuesta máxima

AL

VE

RIT

IN®

EP

RE

X®

/ER

YP

O®

P

AL

VE

RIT

IN®

EP

RE

X®

/ER

YP

O®

P

AL

VE

RIT

IN®

EP

RE

X®

/ER

YP

O®

P

Inducción de la

Proliferación

0.9890±

0.1989

0.7110±

0.1146

0.5228

0.7631±

0.2476

0.6859±

0.1118

0.1739

94.920±

6.024

101.000±

3.963

0.1036


El análisis estadístico no indica diferencias significativas entre las curvas de regresiones no lineales

generadas entre ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®, con respecto a los parámetros: pendiente de

Hill, la respuesta máxima y log IC50 de las curvas, sugiriendo que no deben encontrarse diferencias en

el potencial terapéutico entre ambos biomedicamentos.

6.2.2 Actividad biológica in vivo.


Se siguió la metodología establecida en la FE utilizando ratones normocitemicos de la línea B6D2F1.

Se observó que la administración de concentraciones de EPOhr incremento el conteo de reticulocitos

en sangre periférica después de aproximadamente 72 horas en comparación con el nivel basal. En los

ensayos realizados se cumplieron los parámetros de linealidad, paralelismo y regresión común.

Resultados:

Se determino la potencia en UI/mL de los tres lotes de ALVERITIN® y los tres lotes de

EPREX®/ERYPO® comparando su efecto proliferativo con el de un MRT con código: MRT (QFB)

EPOhr/0208 y trazable al BRP de la FE. La FE (FE 1316, 2016) y la FB (FB, 2016) recomiendan una

potencia hallada para la EPOhr entre 80 a 120% del valor supuesto con límites de confianza para un

95% de confianza entre 64 y 156%. En la figura 39 se observan las curvas dosis respuestas descritas en

dos ensayos realizados.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 89/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 39. Frecuencia de reticulocitos en respuesta a 67.5, 90 y 120 UI/ratón del medicamento de

prueba, referencia y Material de Referencia Interno, 72 horas después de su administración a ratones

B6D2F1. A los ratones B6D2F1 se les administró vía subcutánea uno de los tratamientos: medicamento

de prueba, medicamento de referencia, Material de Referencia Interno en concentración de 67.5, 90 y

120 UI/ratón o control negativo (SF). Después de 72 horas de la administración de los tratamientos se

obtuvo una muestra sanguínea de cada uno de los ratones y se tiño con azul de metileno) para evaluar

la frecuencia de reticulocitos por cámara de neubauer. La gráfica muestra la frecuencia media de

reticulocitos inducidos por las muestras en 6 ratones por grupo. Las barras corresponden a la desviación

estándar de cada media. Los valores medios de los ratones controles negativos estuvieron entre 10-15

reticulocitos (Datos no incluidos en las gráficas).

En la Figura 38, se observa que la frecuencia de reticulocitos aumenta significativamente en las

muestras de sangre que se obtuvieron de los ratones tratados con los medicamentos de prueba,

referencia o el MRT.

En la Tabla 59, se muestran los valores de potencia hallados y su porciento para los tres lotes de

ALVERITIN® y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y el rango de máximo-mínimo de la potencia

para cada producto. Todos los valores de potencia hallados en los tres lotes de ALVERITIN® y de

EPREX®/ERYPO® se encuentran entre 80 y 120% del valor supuesto y sus límites para un 95% de

confianza entre 64 y 156% por lo que cumplen con los criterios recomendados por la FE (FE 1316,

2016) y la FB (FB, 2016).

100

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

% d

e r

eti

cu

locit

os

Log Dosis

MRT(B)rh-EPO/0208

LP00415

LP00515

FAS 4800

FBS 4Z00

100

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

% d

e r

eti

cu

locit

os

Log Dosis

MRT(B)rh-EPO/0208

FDS 6Q01

LP00615

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 90/133

ANTERIOR/ N/P



Tabla 59. Resultados de potencia y rango mínimo- máximo para los lotes de ALVERITIN® y

EPREX®/ERYPO® determinados por ANOVA de líneas paralelas.

ALVERITIN® EPREX®/ERYPO®.

Lote

Potencia

hallada

(UI/mL)

Limites

confianza

(%)

(%) Dictamen Lote Potencia

(UI/mL)

Limites

confianza

(%)

(%) Dictamen

LP00415 3857 88-106 96 Cumple FAS4800 4391 101-120 110 Cumple

LP00515 4278 98-117 107 Cumple FBS4Z00 4046 94-108 101 Cumple

LP00615 4147 96-113 104 Cumple FDS6Q01 38506 90-103 96 Cumple

Rango 96-107 Rango 96-110

Se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA entre los valores medios del % potencia obtenidos para

los medicamentos ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® y no se obtuvieron diferencias significativas

para un 95% de confianza (Tabla 60).

Tabla 60. Potencia: Resultados del ANOVA entre los valores de % potencia de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®.

ANOVA

F 0.00

Valor P 1.000

Existe diferencias estadísticamente significativas entre las medias? (P<0.05) No

Los tres lotes de ALVERITIN® incluidos en el estudio de biocomparabilidad fueron producidos a

partir de tres lotes diferentes del IFA producidos en el CIM. La actividad específica en UI/mg de

proteína de los tres lotes de IFA se encuentra por encima de las 100 000 UI/mg, con una media de 105

887 UI/mg y un coeficiente de variación de 6,70% (Tabla 61). Estos datos reflejan, a pesar de que

provienen de ensayos biológicos en animales los cuales por su naturaleza son muy variables, una baja

variabilidad y alta consistencia del proceso y cumplen con lo establecido en la FE (FE 1316, 2016) y la

FB (FB, 2016).

Tabla 61. Resultados de actividad específica de los tres lotes de IFA de ALVERITIN® determinados

mediante el método in vivo de ratones normocitemicos.

IFA

Lote Actividad especifica

(UI/mg)

3342/P1511 103 797

3342/P1512 113 789

3342/P1513 100 074

Media 105 887

DE 7092

CV (%) 6.70

Rango 103 797-113 789

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 91/133

ANTERIOR/ N/P



En estudios realizados, algunos autores han demostrado diferencias inesperadas por la baja potencia

obtenida para DYNEPO (78%) en comparación con la alta potencia obtenida para EPREX® (129%)

según la declarada en el envase (Vera y cols, 2011) lo que pudiera tener implicaciones clínicas serias en

los pacientes (Cotter y cols, 2004; Bradbury y cols, 2009 y Brown y cols, 1993). En nuestro estudio no

se obtuvieron diferencias estadísticas entre la potencia de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® por lo

que el riesgo de los efectos de una sobredosis es bajo.


La evidencia experimental de la eficacia in vivo presentada y el análisis integral de toda la información

brindada en el estudio, muestra que ALVERITIN® tiene un comportamiento curva dosis respuesta

similar al Estándar Europeo al no obtenerse diferencias significativas entre sus pendientes y comparado

con EPREX®/ERYPO® tiene un efecto comparable sobre la inducción de reticulocitos y la potencia

determinada en el modelo de ratones B6D2F1 normocitémicos mediante un ANOVA de líneas

paralelas. Los valores de potencia de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® no mostraron diferencias

significativas mediante un ANOVA para un 95% de confianza. Los resultados del bioensayo de

inducción de la eritropoyesis en ratones demuestran que no hay diferencias estadísticas entre ambos

productos.

6.2.3 Afinidad por Biacore.

Verificación del sistema: El método para la evaluación de la afinidad y reconocimiento específico mediante la determinación de

la constante de afinidad y disociación por el método de resonancia de plasmones superficiales fue

validado, cumpliendo con los atributos establecidos en el plan de validación: Ajuste al modelo de

regresión no lineal hipérbola, con una R2 de 0.9966, precisión, con un porcentaje del coeficiente de

variación (%CV) de RU de 20% para cada punto de la curva de afinidad, y un % CV de 11.41 para las

réplicas de la constante de afinidad (KD), especificidad, con una respuesta negativa de -7.915964 que

corresponde a la matriz empleada (HBS-EP, 0 nM) y una respuesta positiva de 225.979 que

corresponde a la concentración 250nM de eritropoyetina y adecuabilidad, con un intervalo de respuesta

(RU) de la curva de afinidad de 197.4 a 226.0. En los ensayos de biocomparabilidad realizados se

obtuvo un nivel de inmovilización del receptor de EPO que se encontraba dentro del nivel óptimo de

aceptabilidad del ensayo.

Resultados:

Las afinidades de unión entre la EPO y su receptor reflejan la integridad estructural de la molécula así

como la conformación tridimensional correcta generada por los residuos de aminoácidos dentro de las

regiones de unión diana. En consecuencia, la unión está directamente relacionada con la eficacia de la

EPO.

La afinidad de la EPO a su receptor se determinó por triplicado, evaluando las concentraciones entre

15.62 nm-250 nM de muestras de los tres lotes de ALVERITIN® y tres lotes de EPREX®/ERYPO®.

En las Figuras 40 y 41 se muestran los sensogramas obtenidos para cada medicamento.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 92/133

ANTERIOR/ N/P



Se calcularon las medias (n=3 experimentos independientes para cada lote de medicamento) de los

parámetros cinéticos de la interacción molecular con el receptor para cada muestra evaluada. Después

de efectuar un análisis estadístico (t Student no pareada, α=0.05), los resultados indicaron que no hay

diferencias estadística significativa entre los medicamentos para los parámetros de ka, Kd, KD y Rmax

(Tabla 62).

Tabla 62. Biacore: Análisis t Student de los parámetros cinéticos entre ALVERITIN® y

EPREX®/ERYPO®.

Parámetros cinéticos

ALVERITIN®

n=3

EPREX®/ERYPO®

n=3 Valor estadístico (p)

MEDIA EEM MEDIA EEM

ka (1/Ms) 4929000 2317000 1702000 623897 0.2498

kd (1/s) 0.0008826 0.0002177 0.001047 0.0001852 0.5969

KD (M) 4.437e-010 3.227e-010 8.409e-010 3.083e-010 0.4238

Rmax (RU) 208.8 5.788 214.3 7.267 0.5857


Figura 41. Sensogramas obtenidos en los lotes de

ALVERITIN®. Tiempo vs Respuesta (RU).

Figura 40. Sensogramas obtenidos en los lotes de

EPREX®/ERYPO®. Tiempo vs Respuesta (RU).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 93/133

ANTERIOR/ N/P



No se obtuvieron diferencias estadísticas significativas en los parámetros de ka (velocidad de asociación),

kd (velocidad de disociación), KD (constante de afinidad) y Rmax (respuesta máxima) en los ensayos de unión

a receptor entre de los tres lotes evaluados del medicamento ALVERITIN® y del EPREX®/ERYPO®.

6.3 Resultados de los estudios no clínicos.

En la tabla 63 se muestra los estudios no clínicos realizados y el año de realización.

Tabla 63. Listado de estudios no clínicos realizados.

Estudio Año de realización

Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en monos con el

producto de referencia EPREX®. 1997

Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en conejos con el

producto de referencia EPREX®. 1997

Toxicidad aguda endovenosa del ior®EPOCIM en primates 1998

Toxicidad aguda endovenosa del ior®EPOCIM en ratas 1999

Estudio comparativo de Toxicidad del ior®EPOCIM a dosis

intravenosas repetidas por 28 días en ratas Sprague Dawley con

EPREX® como producto de referencia seguido de un periodo de

recuperación de 14 días.

Pucaj et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 103:3432–3441,

2014

2014

6.3.1 Farmacocinética comparada en monos verdes: ior®EPOCIM vs EPREX®.

Resumen:

Se caracterizó la farmacocinética de la molécula del ior®EPOCIM y EPREX® mediante sus

parámetros específicos en monos verdes machos (entre 4-6 kg) de la raza Macaca fascícularis,

provenientes de CENPALAB, y se demostró la equivalencia farmacocinética entre ambas moléculas.

Antes de la administración del producto a los animales se les extrajo una muestra sanguínea para

valorar su concentración basal de EPO. A cada grupo de ensayo (2 animales por grupo) se le administró

la dosis correspondiente por la vena femoral, extrayéndosele por la vena femoral opuesta a los tiempos

de 0, 0.25, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, Y 18 horas, cuantificándose la EPOhr mediante un método de

ELISA (Boenhringer Mannheim cat. Num. 1693417). Los animales tratados con EPREX® recibieron

una dosis de 150 UI/kg y los animales tratados con ior®EPOCIM recibieron una dosis de 295 Ul/mL.

Los perfiles farmacocinéticos de cada animal se ajustaron a una modelación exponencial obteniéndose

un comportamiento regular de un modelo mamilar bicompartimental. Se determinaron los parámetros

característicos de α, β, t 1/2 α, t 1/2 β, AUC, CL, MRT, Vss, CL/kg y Vss/kg. Los animales fueron

mantenidos en ayuna desde la noche anterior a la administración del producto. El consumo de agua y

alimento fue ad libitum posterior a la administración del producto. Los animales fueron mantenidos

durante toda la etapa experimental en un régimen adecuado de luz/oscuridad, temperatura y una

humedad. Para su manipulación fueron sedados mediante anestesia con uretano (97/23, 1997).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 94/133

ANTERIOR/ N/P



Resultados:

Los valores basales de EPO antes de la inoculación con las variantes de producto fueron despreciables

por lo que no se hizo necesario realizar un ajuste a los valores observados. En ambos casos, existió una

correspondencia lógica de un transcurso farmacocinético en relación a la vía de administración

empleada.

Los valores obtenidos en cada animal para los parámetros característicos estudiados (ajuste, AUC, CL,

Vss, MRT, t1/2α, t1/2β, CL/kg) fueron lógicos según el comportamiento reportado para la EPO en la

literatura, así como, en comparación a los resultados obtenidos en ensayo previo en conejos para ambos

productos (97/22, 1997).

Si analizamos los valores promedios, podemos observar que los t1/2α, t1/2β, alcanzan los valores

reportados previamente para estructuras similares, y por tanto ofrecen un criterio de confiabilidad en

cuanto a establecer un régimen de dosificación de ior®EPOCIM aceptado internacionalmente para el

tratamiento con EPOhr, de forma similar lo mismo es aplicable para el MRT. Los valores de CL y Vss

corregidos por el peso del individuo, también ofrecen valores correspondientes a una seguridad clínica

del producto ior®EPOCIM.


Se manifiesta similitud entre los productos ior®EPOCIM y EPREX® en relación a su comportamiento

farmacocinético, en particular a sus parámetros de velocidad, t1/2α, t1/2β y MRT, lo cual implica un efecto

terapéutico con semejante tiempo de duración.

6.3.2 Farmacocinética a dosis única intravenosa en conejos: ior®EPOCIM vs EPREX®.

Resumen:

Se caracterizó la farmacocinética de la molécula del ior®EPOCIM y EPREX® mediante sus

parámetros específicos en conejos machos F1 (entre 1,56-2,19 kg), provenientes de CENPALAB, y se

demostró la equivalencia farmacocinética entre ambas moléculas. Antes de la administración del

producto a los animales se les extrajo una muestra sanguínea para valorar su concentración basal de

EPO. A cada grupo de ensayo (4 animales por grupo) se le administró la dosis correspondiente por la

vena marginal de la oreja, extrayéndosele por las venas contralaterales al sitio de la administración a

los tiempos de 0, 0.25, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8 y 18 horas, cuantificándose la EPOhr mediante un

método de ELISA (Boenhringer Mannheim cat. Num. 1693417). Los animales tratados con EPREX® e

ior®EPOCIM recibieron una dosis de 150 UI/kg. Los perfiles farmacocinéticos de cada animal se

ajustaron a una modelación exponencial obteniéndose un comportamiento regular de un modelo

mamilar bicompartimental. Se determinaron los parámetros característicos de α, β, t 1/2 α, t 1/2 β, AUC,

CL, MRT, Vss, CL/kg y Vss/kg. Los animales fueron mantenidos en ayuna desde la noche anterior a la

administración del producto. El consumo de agua y alimento fue ad libitum posterior a la

administración del producto. Los animales fueron mantenidos durante toda la etapa experimental en un

régimen adecuado de luz/oscuridad, temperatura y una humedad. Para su manipulación fueron sedados

mediante anestesia con uretano (97/22, 1997).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 95/133

ANTERIOR/ N/P



Resultados:

Los valores basales de EPO antes de la inoculación con las variantes de producto fueron despreciables

por lo que no se hizo necesario realizar un ajuste a los valores observados. En ambos casos, existió una

correspondencia lógica de un transcurso farmacocinético en relación a la vía de administración

empleada.

Los datos de cuantificación sérica fueron detectados por técnica ELlSA y se observa una secuencia de

concentraciones que disminuyen con respecto al tiempo, lo cual se corresponde lógicamente con una

administración bolus i.v. Al promediar los valores de concentración de cada tiempo, se obtuvo un

transcurso promediado ajustado a una lógica farmacocinética.

Es importante resaltar la similitud entre los valores numéricos de la fase de eliminación descrita por el

tiempo de vida media β con valores promedios de 2.55 y 3.03 horas para ior®EPOCIM y EPREX®

respectivamente, lo cual inclina la balanza hacia una duración óptima del efecto terapéutico,

encontrándose en el rango de variabilidad reportado por otros autores en la literatura científica,

empleando métodos diferentes de cuantificación: radiomarcaje y radioinmunoanálisis.

El ior®EPOCIM manifiesta un mayor valor del AUC que permite preconizar que la intensidad del

efecto terapéutico de dicho producto, se alcanzará sin grandes limitantes en su aplicación terapéutica, a

los niveles de dosis actualmente administrados.

Los valores de Cl y el Vss, para ambos productos, reflejan una diferencia lógica en la caracterización de

moléculas biotecnológicas, donde no se obtienen estructuras idénticas, sino semejantes. Estas

diferencias no desvirtúan su efecto biológico esperado, más bien responden a los procesos de

interacción con las entidades corporales no asociadas al sitio efector. Estos dos parámetros francamente

descritos con bases fisiológicas, logran en ambos casos un reajuste equilibrado de sus valores

particulares, ya que para ambos productos la relación Vss/CI, alcanzan un valor cercano, lo cual es

índice de una tendencia a manifestar un efecto integral semejante.

La comparación estadística, realizada utilizando una t-student, resalta los valores alcanzados de

diferencia significativa o no significativa en aquellos parámetros de interés. En cuanto a los valores

obtenidos de α, t1/2α, β, t1/2β y AUC no presentan diferencias significativas entre ambos productos, lo

cual responde a parámetros que inciden en cómo se manifiesta la respuesta farmacológica de la EPOhr.

La estimación de CL, Vss y el MRT presenta diferencia significativa, estando los dos primeros

estrechamente relacionados a los posibles cambios estructurales entre las dos EPOhr empleadas por

cada uno de los productos. Los cambios correspondientes a CI y Vss, denotan que el menor

aclaramiento en ior®EPOCIM se corresponde a una protección de carácter siálico en la molécula frente

a la biotransformación hepática, pero ese aumento de moléculas biodisponibles, se compensan frente al

mayor metabolismo posible de EPREX®, en cuanto a que se manifiesta para ior®EPOCIM un menor

valor de volumen de distribución y de hecho debe esperarse un efecto terapéutico semejante.

Conclusiones:

Existe similitud entre los productos ior®EPOCIM y EPREX® en cuanto a su comportamiento

farmacocinético, en particular a sus parámetros de velocidad y magnitud del efecto, lo cual implica un

efecto terapéutico con semejante tiempo de duración.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 96/133

ANTERIOR/ N/P



6.3.3 Toxicidad aguda endovenosa en primate no humano.

Resumen:

Se evaluaron síntomas de toxicidad, modificaciones en el consumo de alimentos, agua y peso corporal,

evaluaciones del estado general, aspecto, comportamiento y los signos vitales como temperatura

corporal, frecuencia respiratoria y frecuencia cardiaca, y se monitorearon parámetros hematológicos en

los días 0, 7 y 14 y de química sanguínea a los días 0 y 14, luego de la administración del

ior®EPOCIM, vía endovenosa (vena safena), dosis única de 300 UI/kg en primates no humanos de la

especie Cercopithecus aethiops sabaeus hembras y machos entre 1.975-1,953 kg, entre 1-2 años de

edad, provenientes del CENPALAB. Se formaron 2 grupos de tratamientos (grupo control y 300

UI/kg), a razón de 6 animales por cada grupo distribuidos al azar (3 machos y 3 hembras). Se realizó un

estudio de cada órgano o tejido de los animales que mueran durante el ensayo, así como aquellos que se

le practique la eutanasia por manifestar signos severos de toxicidad que comprometan su salud. Los

animales fueron mantenidos 63 días en un periodo de cuarentena. Alojados individualmente en jaulas

de acero inoxidable con bandejas y dispositivos para la sujeción y protección en las manipulaciones.

Mantenidos durante toda la etapa experimental en un régimen monitoreado de luz/oscuridad de 12

horas, suministro ad libitum de agua y alimento excepto 12 horas antes de la extracción de sangre para

los exámenes de química sanguínea, una temperatura de 26.67±1.51oC y una humedad de 77.93±5,90%

(ERIT0497, 1998).

Resultados:

No se observó ninguna muerte animal durante el estudio. Se observaron diferencias significativas en el

peso para las hembras del grupo control en los días 0 y 7 y para los días 0 y 14.

Se observó en el animal 4(1) escasa secreción cristalina en el ojo izquierdo, se realizó un exudado

ocular aislándose Echerichia coli. El macho 4(3) presentó una secreción anal dando negativo por

análisis parasitológico. No se observó ningún otro signo clínico aparente en los animales durante el

estudio.

Todas las variables (signos clínicos) demostraron homogeneidad de varianza excepto la frecuencia

respiratoria para las hembras en el día 7 del ensayo. Se observaron diferencias significativas en la

temperatura corporal para las hembras del grupo tratado en los días 0 y 7.

Al analizar los valores de las variables hematológicas, teniendo en cuenta el rango establecido,

encontramos ligeros aumentos en las variables relacionadas con la serie roja (Hb, Hto, CHCM y

eritrocitos) para los animales de ambos sexos tratados con la EPOhr. Estos hallazgos son explicables

por el efecto biológico de la EPO. Se apreció además, reducciones del conteo de plaquetas, pero no son

imputables a la acción de la administración de la sustancia, pues también ocurrió en los animales no

tratados. Se produjo una disminución en el conteo de leucocitos de las hembras tratadas, pero de

manera transitoria que se recuperó en la segunda semana. No se encontró diferencias significativas

entre los grupos para el conteo total de leucocitos, monocitos y eosinófilos.

Entre los grupo tratados, las hembras del grupo tratado en el día 0 del ensayo para el parámetro

aspartato aminotransferasa se encontraron fuera del rango establecido como normal para el grupo

control. También se observaron diferencias significativas entre los grupos en la alanino aminotrasferasa

para los machos en el día 0 del ensayo así como también para los machos en el día 14 del ensayo. En el

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 97/133

ANTERIOR/ N/P



caso de las proteínas totales se observaron diferencias significativas en las hembras en el día 0, sin

embargo se comprueba que los valores del grupo tratado se encuentran dentro del rango establecido

como normal para el grupo control, lo cual carece de importancia desde el punto de vista biológico.

Se realizó el análisis entre los días 0 y 14 del ensayo, encontrándose diferencias significativas en el

parámetro fosfatasa alcalina en hembras y machos del grupo tratado.


Los resultados indican que bajo las condiciones experimentales utilizadas y con los resultados

obtenidos en cada uno de los parámetros evaluados, el ior®EPOCIM no provocó alteraciones ni

modificaciones en el sistema de prueba que pudieran ser interpretados como signos tóxicos.

6.3.4 Toxicidad aguda endovenosa en ratas.

Resumen:

Se evaluaron los síntomas de toxicidad, atendiendo además al comportamiento y hábitos a través de las

actividades de exploración, acicalamiento, reposo y termorregulación, modificaciones en el peso

corporal (en los días 0, 7 y 14), y se monitorearon algunos parámetros hematológicos en los días 7 y 14

luego de la administración del ior®EPOCIM, vía endovenosa (vena de la cola), dosis única de 300

UI/kg en ratas Sprague Dawley hembras y machos, adultos, provenientes del CENPALAB. Se

formaron 3 grupos de tratamientos (grupo control, tratado con EPOhr 4000UI/mL y EPOhr 2000

UI/mL), a razón de 10 animales por cada grupo distribuidos al azar (5 machos y 5 hembras nulíparas y

no grávidas). Se realizó un estudio de cada órgano o tejido de los animales que mueran durante el

ensayo, así como aquellos que se le practique la eutanasia por manifestar signos severos de toxicidad

que comprometan su salud. Se realizó la necropsia a todos los animales al final del estudio para hacer

observación macroscópica de todos los órganos, además del examen histopatológico de los órganos

afectados. Los animales fueron mantenidos 6 días en un periodo de adaptación. Alojados

individualmente en cajas T4 plásticas (Makrolon) ubicadas en estantes módulo Tecniplast. Mantenidos

durante toda la etapa experimental en un régimen monitoreado de luz/oscuridad de 12 horas, suministro

ad libitum de agua y alimento excepto los días 0 y 13 del ensayo que se retiró el alimento para la toma

de muestras de sangre para análisis hematológicos, una temperatura de 27.50±2.64oC y una humedad

de 50.77±12.63% (ERIT0799, 1999).

Resultados:

El estudio concluyó con un 100% de supervivencia. Los signos clínicos observados fueron ligera caída

de pelo, llegando en ocasiones a depilaciones en la región dorsal del tren posterior, ventral a nivel de

las axilas y pelviana, escasa secreción sanguinolenta en fosas nasales y escasas secreciones cristalinas y

sanguinolentas en uno u otro ojo de algunos animales. Estas dos últimas observaciones tienen como

causa, las manipulaciones realizadas con los animales durante la extracción de sangre. Todos los signos

anteriormente descritos se observaron tanto en animales del grupo control como en los tratados, por lo

que se consideran que nos son provocados por la sustancia de ensayo. En relación al peso no se

encontraron diferencias significativas entre grupos para ninguno de los sexos.

Para los machos no se observaron diferencias entre días ni entre grupos en los niveles de hemoglobina.

Las diferencias encontradas para las hembras, están dadas en el día 0 el grupo tratado, el cual difiere

con el grupo control, ya que los valores de hemoglobina de este último fueron inferiores a los del grupo

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 98/133

ANTERIOR/ N/P



tratado, estas diferencias no se relacionan con la administración de la sustancia de ensayo. El día 14 los

grupos tratados difieren con el grupo control lo que se corresponde con el efecto terapéutico esperado,

y en ambos casos los valores medios estuvieron dentro del rango normal referido en la literatura. En

relación al conteo de hematocrito no se observaron diferencias para los machos, entre días ni entre

grupos. En el día 14 los grupos tratados difieren significativamente del grupo control, presentando

valores superiores. El conteo diferencial de leucocitos arrojó diferencias significativas entre días para

los eosinófilos en los machos, y para los monocitos en las hembras. En el caso de los linfocitos y los

neutrófilos, las diferencias ocurrieron en ambos sexos entre días y grupos. En las constantes

corpusculares VCM, HCM y CHCM se encontraron diferencias significativas en ambos sexos entre

días. Las diferencias encontradas en las variables antes mencionadas, carecen de connotación

toxicológica. En el resto de las variables hematológicas como plaquetas, reticulocitos y conteo total de

leucocitos no se observaron diferencias significativas. No se observaron alteraciones anatomo-

patológicas en las superficies externas, cavidades y órganos parenquimatosos imputables al

ior®EPOCIM.


- No se observaron muertes ni signos atribuibles al ior®EPOCIM.

- No se observaron modificaciones en el peso corporal de los animales en ensayo.

- Las variables hematológicas no sufrieron cambios que respondan a efectos tóxicos `provocados por

el ior®EPOCIM.

- La descripción de la necropsia no reportó alteraciones anatomopatológicas.

6.3.5 Toxicidad dosis intravenosas repetidas del ior®EPOCIM y EPREX® en ratas.

Resumen:

Se evaluó el efecto tóxico sistémico y sobre los órganos diana del producto ior®EPOCIM en

comparación con EPREX®, después de una administración de dosis intravenosa repetida de 28 días en

ratas Sprague-Dawley. Este estudio también evaluó la inmunogenicidad, la farmacodinamia (PD) y

Toxicocinética (TC) de ior®EPOCIM y EPREX®, así como la progresión o regresión de los efectos

observados después de un período de recuperación de 14 días. Los animales fueron dosificados con

ior®EPOCIM por vía intravenosa a los siguientes niveles de dosis: 30, 300 ó 600 UI / kg, que es

equivalente a 1x, 10x y 20x la dosis humana propuesta, respectivamente. Un cuarto grupo de animales

recibió EPREX® a 600 UI / kg, y un quinto grupo control fue dosificado sólo con el vehículo

(excipiente) que se usó para preparar las diluciones utilizadas de los medicamentos. Cada grupo de

ensayo principal y control consistió en 10 ratas macho y 10 hembras de la cepa Crl: CD® (SD) BR-

Sprague-Dawley provenientes de Charles River Canadá Inc. 4 ratas adicionales por sexo se asignaron a

los subgrupos de FD y 5 ratas por sexo se incluyeron en un periodo de recuperación por 14 días en el

control y las altas dosis de 600 UI/ kg de los grupos de ior®EPOCIM y EPREX®. 3 ratas por sexo

adicionales se usaron para la evaluación de TC en el día 1 y el día 28 en el grupo control. Las

respuestas clínicas a los tratamientos fueron monitoreadas así como la evaluación de los pesos

corporales, consumo de alimentos y oftalmología en todos los grupos. La sangre para FD se colectó en

el día 1 y luego las pre-dosis en los días 3, 7, 14 y 28. La patología clínica completa se evaluó en todos

los animales del estudio principal (Día 29 ó 30) y en todos los animales en recuperación (Día 43).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 99/133

ANTERIOR/ N/P



También fue colectada la sangre para los ensayos de TC (Días 1 y 28) y la formación de los anticuerpos

antidroga ADA, tanto en pre estudio como al final de los períodos de recuperación y tratamiento. La

patología general completa se realizó en todas las ratas de todos los grupos (excluyendo los subgrupos

FD y TC), y la histopatología se realizó en un rango de órganos comprensivo de las ratas control y las

ratas dosificadas a 600UI/kg con ior®EPOCIM o EPREX®. Además el estómago, el bazo y el fémur

(médula ósea) fueron examinados de los grupos tratados con ior®EPOCIM a 30 y 300 UI/kg ya que los

mismos fueron identificados como potenciales órganos diana. Los animales fueron alojados

individualmente en cajas para ratas Nalgene® con aire filtrado y mantenidos por un período de 14 días

en etapa de aclimatación. Mantenidos durante toda la etapa experimental en un régimen monitoreado

de luz/oscuridad de 12 horas con más de 10 cambios de aire/ hora, suministro ad libitum de agua/

alimento, una temperatura entre 18-26oC y una humedad entre 30-70% (Study No. 270994, 2014).

Resultados:

Todos los animales sobrevivieron y llegaron a la fecha programada para la eutanasia y la necropsia.

Los hallazgos adversos de anatomía patológica y clínicos que se consideraron relativos al tratamiento y

de significancia toxicológica fueron:

- Lesiones de la piel ulcerativas medias y sin formación de postilla fueron observadas en 4,3%,

10,9%, 1,8% y 8,9% de las ratas de género combinado en grupos tratados con 30, 300 y 600

UI/kg de EPREX® respectivamente. Dichas lesiones no se observaron al final del período de

recuperación.

- Se observó también cojera de media a marcada en ratas de ambos grupos de altas dosis

(ior®EPOCIM y EPREX® dosificadas a 600 UI/kg). La cojera se presentó como un

enrojecimiento e inflamación de la articulación de la pata (articulación tarsal). Fueron afectadas

más ratas en el grupo del EPREX® (14,3 %) comparado con el grupo del ior®EPOCIM (5,4%).

Las ratas con esta afectación perdieron esta condición durante el período de 14 días de

recuperación.

- En la necropsia, al final del período de tratamiento, las úlceras/ micro úlceras estomacales se

hallaron en el 15%, 35% y 25 % de las ratas dosificadas con ior®EPOCIM a 300 y 600 UI/kg y

con EPREX® a 600 UI/kg respectivamente. Como solo fueron afectadas las hembras, esos

porcentajes fueron mayores para las hembras solamente: 30%, 70%, y 50 %. Al final del

período de recuperación, todavía había una de cada 5 ratas hembras (ior®EPOCIM) y 2 de cada

5 ratas machos (EPREX®) con úlceras/micro úlceras estomacales.

La reducción en la ganancia de peso corporal, enrojecimiento/edema en la articulación de la pata y las

úlceras estomacales son reacciones adversas conocidas para el mismo tipo de fármaco (EPOhr) y había

sido previamente descrita. El enrojecimiento/inflamación de las articulaciones de la pata y las úlceras

estomacales fueron consecuencias de efectos trombóticos. La patogénesis de las úlceras de la piel no

está clara pero una explicación plausible podría ser también la presencia de eventos trombóticos. Las

ratas tratadas con EPREX® parecieron ligeramente más afectadas que las tratadas con ior®EPOCIM lo

cual puede ser una consecuencia de una exposición sistémica ligeramente mayor a la EPOhr de las ratas

tratadas con EPREX® que de las tratadas con ior®EPOCIM. La AUC 0-∞ para ratas expuestas a

EPREX® fue ligeramente mayor que en las expuestas al ior®EPOCIM. Con la excepción de las

úlceras estomacales, el resto de los efectos adversos hallados fueron todos reversibles durante el

período de 14 días de recuperación.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 100/133

ANTERIOR/ N/P



La patología clínica y los hallazgos patológicos relacionados con el tratamiento, pero que se

consideraron efectos patológicos exagerados para esta clase de compuesto, fueron los siguientes:

- Conteo total de reticulocitos incrementado, de forma marcada a moderada en machos y hembras

dosificados con el ior®EPOCIM 30-600 UI/kg y EPREX® 600 UI/kg. El incremento total fue

de 1,8x, 3,3x y 4,6x para machos y 2,3x, 3,8x 4,4x y 6,3x para hembras de grupos que

recibieron ior®EPOCIM y EPREX® respectivamente. Subsecuente al incremento en

reticulocitos, la masa de eritrocitos, Hb y Hto se incrementó también de forma moderada en los

grupos de tratamiento. El incremento promedio de la masa de eritrocitos estuvo entre el 31 y el

61% para los machos y entre 42% y 72 % para hembras dosificadas con ior®EPOCIM y 66%

para machos y 75 % para hembras dosificadas con EPREX®.

- Los parámetros de hematología al final del período de recuperación indicaron que la masa de

eritrocitos se mantuvo elevada en ambos grupos ior®EPOCIM y EPREX® (ambos géneros

dosificados a 600 UI/kg). En las ratas macho de ambos grupos los glóbulos rojos se

incrementaron en un 50% por encima de los valores del grupo de control, y en las hembras los

incrementos fueron de 67 y 74% para los grupos de altas dosis de ior®EPOCIM y EPREX®

respectivamente. El conteo de reticulocitos fue marcadamente reducido en las ratas de ambos

géneros dosificadas tanto con ior®EPOCIM como con EPREX® al final del período de

recuperación. En los machos el conteo de reticulocitos fue 10-11x reducido en comparación con

las ratas machos del grupo control, y en las hembras, fueron reducidos 12-16x cuando se

compararon a las ratas hembras del grupo control.

- El agrandamiento del bazo se detectó en 60%, 90% y 100% de las ratas en los grupos tratados

con ior®EPOCIM a 300 y 600 UI/kg y en ratas tratadas con EPREX® a 600 UI/kg

respectivamente. Estos incrementos fueron significativos (p<0.01) cuando se compararon con

las ratas del grupo control. Al final del período de recuperación los bazos se hallaban aun

aumentados en el 60% de las ratas tratadas con ior®EPOCIM y en el 80% de las ratas tratadas

con EPREX®.

Incrementos en las masas de reticulocitos y un incremento en el peso del bazo fueron respuestas

esperadas a la estimulación de la eritropoyesis por parte de la EPOhr. Las respuestas a la EPOhr en las

ratas, fueron ligeramente mayores en las ratas tratadas con EPREX® que en las tratadas con

ior®EPOCIM, similarmente a las acciones adversas tóxicas que fueron ligeramente más pronunciadas

en el grupo tratado con EPREX® que en el tratado con ior®EPOCIM.

Además hubo otros parámetros de la química hematológica/sérica que fueron afectados por el

tratamiento, pero fueron cambios menores en magnitud, y fueron similares o iguales entre los grupos

tratados con ior®EPOCIM y EPREX®. Esos hallazgos menores incluyeron: disminución del conteo de

plaquetas, e incremento del volumen medio de plaquetas en todos los grupos de tratamiento; los

conteos medios de glóbulos blancos y de linfocitos en particular fueron incrementados en todos los

grupos de tratamiento; fueron hallados ligeros incrementos en PT y APTT, BUN, CK, algunos

electrolitos, la bilirrubina total y el AST se incrementaron ligeramente. Esos pequeños cambios,

además de estar presentes en las ratas tratadas tanto con ior®EPOCIM como con EPREX®, también

estuvieron presentes y se reportaron con otros medicamentos del mismo tipo.

El análisis del suero en los grupos de ratas tratadas con elevadas dosis, tanto de ior®EPOCIM como de

EPREX® fue negativo para anticuerpos anti-EPO al final del tratamiento y del período de

recuperación.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 101/133

ANTERIOR/ N/P



Ambos, el ior®EPOCIM y el EPREX®, produjeron un incremento dependiente del tiempo de los

parámetros finales (FD en ratas tanto hembras como machos). La respuesta máxima (Emax) para los

reticulocitos se presentó en el día 7 de la dosificación. Los valores de ED50 para el ior®EPOCIM en los

días 7, 14 y 28 fueron similares en los machos en un rango entre 71 y 80 UI/kg, mientras en las

hembras los valores estuvieron entre 52-106 UI/kg. Los valores de (Emax) disminuyeron en hembras y

machos desde el día 7 al día 28 en 26 y 53 % respectivamente. Para los glóbulos rojos, Hb y Hto, los

valores de ED50 y (Emax) (anotada en el día 28) y el E0 fueron similares en ratas hembras y machos. En

el día 28 los valores de ED50 en ratas machos y hembras para los glóbulos rojos, Hb y Hto oscilaron de

63-84 UI/kg, 19-27 UI/kg y 23 - 26 UI/kg respectivamente. La relación entre las respuestas a dosis de

600 UI/kg para ior®EPOCIM y EPREX® oscilaron de 0,84-1,09.

En el día 1 los niveles pre dosis de EPO estuvieron todos inferiores al límite de cuantificación. En el

día 28 de dosificación los niveles pre dosis de EPO fueron superiores al límite de cuantificación LOQ a

niveles de dosis altas y medias de ior®EPOCIM y EPREX® y oscilaron de 16- 96 mUI/kg, lo que

sugiere que no existió eliminación completa de la EPOhr dentro de las 24 horas. Para el ior®EPOCIM,

tanto en el día 1 como el 28 de dosificación el AUC0-∞ se incrementó en forma lineal y proporcional a

las dosis. Para el ior®EPOCIM y EPREX® el AUC0-∞ fue inferior en el día 28, oscilando entre 0,76-

0,94 veces el valor de AUC0-∞ en el día 1.

La vida media de eliminación (t1/2(e)), el aclaramiento total (CL), el volumen de distribución al punto

estabilizado (Vss) y el tiempo de residencia medio (MRT) de EPO (desde el ior®EPOCIM y EPREX®

en los días 1 y 28 de la dosificación) fueron generalmente similares oscilando entre 3.0 y 4.7 horas,

0.022-0.035 L/kg/hr. 0.09-0.15 L/kg y 3.2-5.6 horas respectivamente. La relación entre el AUC0-∞ de

ior®EPOCIM a EPREX® en altas dosis fue de 0.84 y 0.80 en el día 1 y día 28 de la dosificación

respectivamente dentro de los estándares de los límites requeridos para que exista bioequivalencia.

Valores similares para Vss, algo más bajo el CL (1.2-1.3 veces) y mayor t1/2(e) (1.0 a 1,6 veces se

observaron para el EPREX® comparado con el ior®EPOCIM en altas dosis.

Una comparación basada en la dosis de 600 UI/kg de ior®EPOCIM y EPREX® revelaron similares

parámetros de aclaramiento (t1/2(e), CL, Vss, y MRT) los cuales tienen tendencias similares para el

ior®EPOCIM y EPREX® en el análisis con géneros combinados. Los valores plasmáticos de AUC0-∞

y AUC0-T Last fueron similares entre ratas hembras y machos en el día 1 pero fueron 13.9-19.1 % más

pequeñas en las hembras comparadas a los machos en el día 28.

El ior®EPOCIM y el EPREX® produjeron incrementos dependientes del tiempo para los valores

finales de los parámetros (reticulocitos, glóbulos rojos, Hb y Hto) en ratas hembras y machos. La

relación de las respuestas para estos parámetros finales entre el ior®EPOCIM y el EPREX® osciló de

0.84-1.09 y la relación del AUC0-∞ del iorEPOCIM al EPREX fue de 0.84 y 0.80 en el día 1 y el día 28

de dosificación respectivamente. Los resultados de este estudio implican que las ratas hembras y

machos dosificadas a 600UI/kg con ior®EPOCIM y EPREX® tuvieron respuestas FD y perfiles de TC

que fueron similares (Figura 42).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 102/133

ANTERIOR/ N/P



Figura 42. Respuesta a Altas dosis (600 UI/kg) de ior®EPOCIM y EPREX® para reticulocitos, RBC,

hemoglobina y Hematocritos. A y C (machos) y B y D (hembras).

El análisis de todos los datos generados, incluidas las observaciones clínicas, los pesos corporales, las

ganancias de peso corporal, el consumo de alimentos, la oftalmología, la patología clínica, la patología

general y la histopatología, revelaron que no existió toxicidad relacionada con el tratamiento en las

ratas que fueron tratadas con ior®EPOCIM a 30 UI/kg en un período de 28 días, el cual es equivalente

a las dosis propuestas en humanos. Los cambios relacionados con el tratamiento en los parámetros

hematológicos en este grupo (incremento de reticulocitos y masa de eritrocitos incrementada) fueron

esencialmente consistentes con lo anticipado para esta clase de producto. En los grupos dosificados a

300 y 600 UI/kg con ior®EPOCIM y 600 UI/kg con EPREX® tanto las reacciones adversas (reducción

del consumo de alimentos, y la ganancia de peso corporal, eventos trombóticos), y las reacciones

farmacológicas exageradas (reticulocitosis, incremento de la masa de eritrocitos, eritropoyesis extra

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 103/133

ANTERIOR/ N/P



medular en el bazo, engrosamiento del bazo) fueron respuestas también esperadas así como bien

documentadas para esta clase de fármaco. Tanto las reacciones adversas como las reacciones

farmacológicas exageradas, fueron algo más pronunciadas en las ratas tratadas con EPREX®, causadas

posiblemente por una exposición sistémica ligeramente mayor, como fue determinado por un mayor

incremento en el AUC0-∞ de las ratas tratadas con EPREX® (16-20 % aproximadamente).

Bajo las condiciones de este estudio, se consideraron niveles de efectos adversos no observados

(NOAEL) para el ior®EPOCIM en ratas los de 30UI/kg/día por 28 días.


Con base en estos hallazgos, así como un perfil toxicológico similar, se puede concluir que

ior®EPOCIM y EPREX® mostraron biosimilaridad cuando se dosificaron subcutáneamente en ratas a

600 UI/ kg durante 28 días (Pucaj y cols, 2014).

6.4 Resultados clínicos. Informe periódico de seguridad.

Resumen

El presente informe contiene la información de seguridad para el ior®EPOCIM, producida en el CIM,

Cuba. El reporte comprende el período desde el 1 enero de 2012 al 31 diciembre de 2016.

El ior®EPOCIM está registrado en 29 países. Las aprobaciones para su comercialización corresponden

a las indicaciones: tratamiento de la anemia asociada a la insuficiencia renal crónica incluyendo

pacientes en diálisis (insuficiencia renal crónica terminal) y en pacientes pre dialíticos, tratamiento de

la anemia en pacientes de SIDA en tratamiento con zidovudina, en el tratamiento de la anemia pos

quimioterapia en pacientes oncológicos (adultos y pediátricos) y en la profilaxis y tratamiento de la

anemia de la prematuridad.

Hasta el 31 diciembre de 2016 han concluido 14 ensayos clínicos con esta EPOhr. El total de pacientes

expuestos a esta EPOhr desde su aprobación sanitaria en Cuba en el año 1998 hasta el 31 diciembre de

2016 es de 1 505 941 pacientes (incluye pacientes tratados en ensayos clínicos y pacientes estimados

por las ventas nacionales e internacionales).

Este informe integrado de seguridad contiene la información de los eventos adversos recibidos por

reportes espontáneos del mercado y de ensayos clínicos, reportados a CIMAB en el período del 1 de

enero de 2012 al 31 de diciembre de 2016, directamente o a través de sus socios para la EPOhr

producida por el CIM con marca comercial ior®EPOCIM.

Durante el período analizado se recibieron 57 reportes espontáneos de eventos adversos, de ellos 19

fueron eventos adversos graves (EAG) y solo seis se relacionaron con la EPOhr referida. (Retinopatía

de la prematuridad (3), Anemia refractaria (1), Aplasia Pura de Células Rojas (APCR) (1) e

Hipertensión arterial (1).

En la Base de Datos Nacional de Farmacovigilancia del CECMED (período desde 1 enero de 2012 al

31 diciembre de 2016) se registraron 2 reportes de reacciones adversas al ior® EPOCIM 2000 UI, lo

cual representó el 0,001% del total de reportes para el período evaluado. Las reacciones notificadas

fueron: temblores (probable) y fiebre (definitiva), evaluadas como moderadas, ambas reacciones

adversas están descritas en la literatura. Se registraron 9 reportes de reacciones adversas al

ior®EPOCIM 4000UI, los cuales representaron el 0,009%del total de reportes para el período evaluado.

Las reacciones notificadas fueron: piel (41,7%): habones, prurito y flebitis; cardiovascular (33,3%):

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 104/133

ANTERIOR/ N/P



hipotensión arterial, taquicardia y dolor precordial; otras reacciones fueron: fiebre, vómitos y temblor.

Predominaron las reacciones moderadas (75%). La mayoría de los eventos fueron considerados

probables (83.3%) y de baja frecuencia de aparición (58.3%). Respecto al ior®EPOCIM 10 000UI, se

reportaron 4 reacciones adversas: escalofríos, mareos, fatiga y cefalea, evaluadas como moderadas,

probables y frecuentes.

La EPOhr producida en el CIM integró la lista de medicamentos a seguir por vigilancia intensiva en el

país desde el 2011 hasta el 2014. Adicionalmente en el 2015 se realizó una vigilancia activa por los

puntos focales de la Autoridad Reguladora en dos hospitales clínicos quirúrgicos universitarios sin

notificar reportes en este período. No ha sido objeto de alerta ni de comunicación de riesgo en el

territorio nacional ni en los países donde se comercializa.

El perfil de seguridad de ior® EPOCIM en el período analizado es coincidente con el reportado en la

Información Básica del producto (información administrativa y resumen de las características del

producto). No se aprecian cambios clínicamente significativos en la severidad o frecuencia de los

eventos adversos referenciados.

Se detectaron nuevas señales en la subpoblación de enfermos renales crónicos donde se reportaron 2

eventos adversos graves no referenciados como sospecha de APCR, específicamente en Tailandia,

pero solo una de ellas se confirmó por biopsia de médula ósea.

En concordancia con los datos de calidad, de seguridad y de eficacia descritos en este reporte se infiere

que el beneficio terapéutico de ior®EPOCIM supera los riesgos potenciales para todas las indicaciones

de uso aprobadas en condiciones de la práctica médica.

6.5 Registros sanitarios otorgados.

Al cierre del año 2016, la EPOhr producida en el CIM está aprobada para su comercialización

(registros sanitarios) en 29 países (Tabla 64).

Tabla 64. Registros sanitarios otorgados de la EPOhr producida en el CIM hasta el 31 diciembre 2016.

No. País Año Marca comercial/presentación

1 Cuba 1998

ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI 2004 ior®EPOCIM 10 000 UI

2 Chile 2001 EPOETINA ALFA HUMANA RECOMBINANTE

2000 UI

EPOETINA ALFA HUMANARECOMBINANTE

4000 UI 3 República Dominicana 2002

ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI

4 Jamaica 2002 ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI

5 Colombia 2002 ior®EPOCIM 2000 UI

2006 ior®EPOCIM 4000 UI

6 Brasil 2002

Alfaepoetina 2000 UI

Alfaepoetina 4000 UI

2014 Alfaepoetina 10 000 UI

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 105/133

ANTERIOR/ N/P



7 Ecuador 2013

ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI

ior®EPOCIM 10 000 UI

8 Perú



ior®EPOCIM 10000 UI

9

Honduras 2008 ior®EPOCIM 4000 UI

10 México 2008 ALVERITIN 2000UI

ALVERITIN 4000UI

11 Panamá 2003 ior®EPOCIM 2000 UI

12 EL Salvador 2002 ior®EPOCIM 4000 UI


13 Guatemala 2005 ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI

14 Venezuela(SERTERE) 2005 ior®EPOCIM 2000 UI


14a Venezuela(Espromed BIO) 2015 ior®EPOCIM 4000 UI


15 Costa Rica 2006 ior®EPOCIM 2000 UI

16 India 2006

r-human-Erythropoietin Injection 2000 UI



17 Nicaragua 2007

ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI


18 Bolivia 2007 ior®EPOCIM 10000 UI


19 Vietnam 2006 ior®EPOCIM 2000 UI

No. País Año Marca comercial/presentación

20 Argentina 2009 ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI

21 Túnez 2010 ior®EPOCIM 2000 UI

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 106/133

ANTERIOR/ N/P



22 Filipinas 2010

Hemapo Epoetin alfa (Recombinant Human

Erythropoietin) 2000 IU/mL

HemapoEpoetin alfa (Recombinant Human


Hemapo Epoetin alfa (Recombinant Human


23 Bielorrusia 2012 ior®EPOCIM 2000 UI

24 Ucrania 2012

ior®EPOCIM 2000 UI

ior®EPOCIM 4000 UI


25 Tailandia 2012

Hemaplus® 2000 UI

Hemaplus® 4000 UI

Hemaplus® 10000 UI

26 Turquía 2013 EPOPLUS 2000 UI

2015 EPOPLUS 4000 UI

27 Nigeria 2012

Hemapo Epoetin alfa 2000 UI



28 Myanmar 2015 ior®EPOCIM 4000 UI


29 Paraguay

2015

ior®EPOCIM 4000 UI


6.6 Acciones tomadas por razones de seguridad.

El producto iorEPOCIM ha demostrado ser un medicamento de calidad, seguro y eficaz en todas las

indicaciones evaluadas tanto en los ensayos clínicos como en los mercados autorizados para su venta.

Actualmente su producción se realiza en 6 plantas productivas bajo las Buenas Prácticas de Manufactura

(GMP):

- Centro de Inmunología Molecular (CIM), Cuba: IFA, formulado y PT (iorEPOCIM).

- Centro Nacional de Biopreparados (BIOCEN), Cuba: PT (iorEPOCIM).

- Biocon Limited, India: formulado y PT (Erypo-safeTM).

- Biomanguinhos-Fio-Cruz, Brasil: PT (Epoetina alfa).

- ScianBioscence Co., Ltd., Tailandia: PT (jeringa pre llenada) (Hema-Plus).

- Alvartis Pharma, México: PT (Alveritin).

Este producto no ha sido objeto de acciones tomadas por las autoridades regulatorias o por los titulares de

los registros por razones de seguridad.

6.7 Cambios a la información de referencia del producto.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 107/133

ANTERIOR/ N/P



En el período que cubre este informe no se describen cambios en el perfil de seguridad del

iorEPOCIM, por lo que no se ha modificado la información de referencia del producto sobre

seguridad, en relación con lo descrito anteriormente en la Monografía del producto.

6.8 Pacientes expuestos.

El número estimado de pacientes expuestos a ior EPOCIM se basa en la sumatoria del volumen

acumulado de ventas hasta el 31 diciembre de 2016 realizadas en el mundo, según consta en la

información recibida por la Dirección de Comercialización del CIM de sus socios comerciales y en el

número de pacientes incluidos en estudios clínicos en Cuba, Brasil e India. En la tabla 65 se muestran

los datos del número de pacientes expuestos durante la comercialización de iorEPOCIM por año. En

la tabla 66 se muestra el total de pacientes expuestos en ensayos clínicos concluidos y de pacientes

expuestos durante la comercialización hasta el 31 diciembre del 2016.

Tabla 65. Pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización por año.

Año No. Pacientes expuestos a ior®EPOCIM

2006 9 662

2007 8 229

2008 55 239

2009 108 062

2010 64 923

2011 176 618

Subtotal 422 733

2012 321 976

2013 226 371

2014 119 130

2015 223 123

2016 190 381

Subtotal 1 080 981

Total 1 503 714

Leyenda: Filas sombreadas corresponde al período de análisis de este IPS.

Tabla 66. Total de pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización y en ensayos

clínicos.

No. pacientes en ensayos clínicos

(acumulado entre 1997 hasta 31diciembre

2016)

No. pacientes tratados por venta del producto

(acumulado hasta 31 diciembre 2016 )

2 227 1 503 714

Total= 1 505 941 pacientes

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 108/133

ANTERIOR/ N/P



Total de pacientes expuestos: Se estima que aproximadamente 1 505 941 pacientes han sido expuestos

a ior®EPOCIM, de ellos, 1 081 648 (1 080 981 comercialización y 667 ensayos clínicos) corresponden

al período que cubre este informe.

6.9 Actualización de Ensayos Clínicos.

El ior® EPOCIM posee amplio perfil de seguridad comprobado en estudios clínicos controlados y en

estudios pos comercialización que incluye poblaciones vulnerables como ancianos y niños, donde el

perfil de seguridad manifiesto es idéntico al demostrado en el resto de la población.

Hasta el ano 2017 han concluido 15 estudios clínicos, en los cuales se ha evaluado la farmacocinética

comparada con el producto de referencia, la seguridad de ior® EPOCIM en las indicaciones de anemia

en pacientes sometidos a métodos dialíticos o no, en el tratamiento de la anemia inducida por

quimioterapia y radioterapia (pacientes adultos y niños), así como en el tratamiento y prevención de la

anemia en el recién nacido de muy bajo peso al nacer.

Adicionalmente 3 estudios han evaluado el perfil de seguridad de ior® EPOCIM en la prevención de

transfusiones de sangre por cirugías electivas con hemorragia (1); como agente neuroprotector en el

infarto cerebrovascular agudo (1) y como agente cardioprotector en la injuria cardíaca inducida por

antraciclinas (1).

Actualmente se encuentra un ensayo clínico en curso con ior® EPOCIM: Evaluación del efecto y

seguridad de la eritropoyetina humana recombinante (ior®EPOCIM) como agente cardioprotector en la

cirugía de la enfermedad valvular reumática (M9/CIMAB/AEC-02).

En la tabla 67 se presentan los ensayos clínicos terminados con ior® EPOCIM.

Tabla 67. Ensayos clínicos terminados con ior® EPOCIM hasta el 2017.

Ensayo clínico

Código/País/Año/Publicación

Fase No.

Pacientes

Exposición máxima

(semanas/meses)

Vía

admon

Grupo edad

(años/días)

Farmacocinetica clinica

A bioquivalence study of two-treatmen and two sequence

of Epoetin alfa 4000 IU injection pre-filled siringe 4000

IU relative to EPREX in healthy Thai volunteers under

fasting condition.

Report No. EPO-037-15/ Thai/2017

I 22 72 horas SC >18

Anemia por Insuficiencia Renal Crónica

Evaluación de la farmacocinética y el efecto terapéutico

de la hr-EPO en el tratamiento de la anemia.

NC/Cuba/ /1997

I/II

25 16 semanas IV >18

Efecto terapéutico del uso subcutáneo de la hr- EPO en el

tratamiento de la anemia.

NC/Cuba/ 1998

Pérez-Oliva Díaz Rev Habanera de Ciencias Médicas,

vol. 3, n.o 10, 2004

I/II 24 12 semanas SC >18

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 109/133

ANTERIOR/ N/P



Estudio abierto prospectivo para la evaluación de la

eficacia y la seguridad de hr-EPO (CIMAB, Cuba) en

pacientes en diálisis o pre diálisis en el manejo de la

anemia en la insuficiencia renal crónica.

CLG002/BIO002/CKD/EPO/2005/ India/2005.

III 42 12 semanas IV/SC >18

Equivalencia terapéutica entre la eritropoyetina humana

recombinante y la hr- EPO sin albúmina (EPO/ SA) en

pacientes con insuficiencia renal crónica en métodos



Pérez-Oliva y cols, Rev. Habanera Cienc. Médicas,

vol. 7, n.o 3, pp. 0-0, sep. 2008.

III

60 (30

pacientes en

cada grupo)

12 semanas SC >18

Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana

recombinante en pacientes con insuficiencia renal crónica

en métodos dialíticos (hemodiálisis o diálisis peritoneal).



Estudio abierto prospectivo para la evaluación de la

eficacia y seguridad de Erypro-SafeTM (hr-EPO

inyección) en pacientes en diálisis o pre diálisis en el

manejo de la anemia en la insuficiencia renal crónica.

BN002/CKD/2007/India/2007

IV 151 12 semanas IV/SC >18

Comparación de eficacia de la eritropoyetina producida

por el Instituto de Tecnología de Inmunobiológicos de la

Fundación Oswaldo Cruz y una eritropoyetina biosimilar

en pacientes con insuficiencia renal crónica.

NCT01184495C/Brasil/2008

Paulo y cols. Clinics, vol. 69, n.o 8, pp. 547-553, ago.

2014.

IV 74 24 meses SC >18


recombinante en pacientes con insuficiencia renal crónica

en pre-diálisis.


Alicia y cols. Rev.Habanera de Cienc. Médicas, vol 15,

Núm.6 (2016).


Anemia por Quimioterapia/Radioterapia


recombinante) en pacientes oncológicos con anemia post

quimioterapia/radioterapia.


IV 338 8 semanas SC >18


recombinante) en pacientes pediátricos oncológicos con

anemia post quimioterapia/radioterapia


Alicia V y cols. MEDICC Rev, vol 12, n.o 3, p. 28,

2010.

IV 157 8 semanas SC <18

Anemia del Recién Nacido Pretérmino


recombinante en anemia del recién nacido.


Sijo Y y cols. Rev. Cuba. Pediatría, vol. 85, n.o 2, pp.

202–212, 2013.

III 72 8 a 10 semanas SC > 7 días y

< 30 días

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 110/133

ANTERIOR/ N/P



Evaluación de la seguridad y efectividad de

ior®EPOCIM en el manejo de la anemia del recién

Nacido prematuro.

M9/CIMAB/AEC-2/ Cuba/2013

RPC. Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos».

[En línea]. Disponible en: http:

//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000149-Sp.

[Accedido: 07-dic-2015].

IV 131 8 a 10 semanas SC

> 15 días de

nacido.

Prevención de transfusiones de sangre en cirugías electivas con alto potencial de pérdida de sangre

Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana

recombinante en la disminución de los requerimientos de

transfusiones de sangre en pacientes con cirugías

electivas de hiperplasia prostática benigna.

IIC RD EC 096/Cuba/2009

Lamelas T y cols. Rev. Cuba. Urol., vol. 2, n.o 2, ene.

2014.

III 250 3 semanas SC >18 años

Cardio-protección en el esquema de tratamiento con antraciclinas

Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en pacientes con

linfoma No Hodgkin tratados con antraciclinas.

(IIC RD EC126) Cuba (2010)

RPC0096. Registro Público Cubano de Ensayos

Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:

//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000096-Sp.

[Accedido: 07-dic-2015

II

44 (22

pacientes en

cada grupo)

8 meses IV >18 años

RCP: Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos/ Registro primario de la OMS: http://registroclinico.sld.cu.

Leyenda: IV: Intravenoso; SC: Subcutáneo

El estudio de farmacocinetica comparada con código Report No.EPO-037-015 fue abierto, balanceado,

dos tratamieto aleatorizados, dos secuencias, cruce de dos periodos diseñado bajo rapidas condiciones

en voluntarios tailandeses sanos para evaluar la bioequivalencia entre el producto de prueba de

eritropoyetiba alfa 4 000 UI Hema-Plus® jeringa prellenada producida por Siam Bioscience Co., Ltd

Tailandia y el producto de referencia EPREX® 4 000 UI producido por Cilag AG, Suiza e importado

por Janssen-Cilag Limites (Tailandia). El intervalo para un 90% de condianza (CI) del radio

geométrico de la media para el producto de prueba y de referencia de eritropoyetina para la Cmax y

AUC0-72 fueron 106.58-124.82% y 99.70- 109.45% con el estimador puntual 115.34% y 104.32%,

respectivamente los cuales muestran que ambos parámetros cumplen con el critrerio para

bioequivalencia del producto.

6.10 Presentación de casos individuales.

En este informe se describen los eventos adversos y eventos adversos graves independientemente de su

relación con ior® EPOCIM, recibidos en el período del 1 de enero de 2012 al 31 diciembre de 2016,

reportados de forma expedita o en los informes finales de los ensayos clínicos terminados.

Las fuentes documentales de información utilizadas para este reporte son:

a) Base de datos de Farmacovigilancia (Departamento comercialización, CIM).

b) Reporte final. Ensayo clínico: Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana

recombinante en pacientes con insuficiencia renal crónica en pre-diálisis. IIC RD EC112.

c) Reporte final. Ensayo clínico: Evaluación de la seguridad y efectividad de ior® EPOCIM en el

manejo de la anemia del recién nacido prematuro.M9/CIMAB/AEC-2.

http://registroclinico.sld.cu/

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 111/133

ANTERIOR/ N/P



d) Reporte final. Ensayo clínico: Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante

en la disminución de los requerimientos de transfusiones de sangre en pacientes con cirugías

electivas de hiperplasia prostática benigna. IIC RD EC 096.

Durante el período analizado se recibieron 57 reportes espontáneos de eventos adversos, de ellos 19 de

eventos adversos graves (EAG), solo 6 EAG fueron relacionados con ior® EPOCIM.

6.11 Reportes espontáneos de eventos adversos graves (EAG)

Tabla 68. Reportes espontáneos de EAG.

Evento adversos

graves

relacionados

(RAM)

Frecuencia

del RAM

Indicación de

uso

Relación con

hr-EPO

Fuente (País/mercado

o ensayos clínicos )

Retinopatía de la

Prematuridad

3 Prematuridad Posible Cuba /ensayo clínico

Fase IV

(M9/CIMAB/AEC-2/

Cuba/2013)

Anemia refractaria 1 ERC Posible Singapur/mercado

Aplasia Pura De

Células Rojas

1 ERC Posible Tailandia /mercado

Hipertensión

Arterial

1 ERC Definitiva Tailandia/mercado

6.11.1 Eventos adversos graves relacionados con eritropoyetina humana recombinante

En este punto se describen los eventos adversos graves relacionados con la EPOhr, con causalidad

posible, probable o definitiva, reportados en los ensayos clínicos y de forma expedita hasta el 31

diciembre de 2016.

En la tabla 69 se describen los eventos adversos graves por indicación, código del ensayo, código del

paciente, sistema anatómico, eventos adversos y relación de causalidad con la eritropoyetina humana

recombinante.

Tabla 69. Relación de EAG relacionados con ior®EPOCIM reportados hasta 31 diciembre de 2016.

Indicación/código ensayo clínico

Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM

Ensayos Clínicos

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 112/133

ANTERIOR/ N/P




Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM

Anemia IRC

Evaluación de la farmacocinética y el

efecto terapéutico de la hr-EPO en el

tratamiento de la anemia.NC/Cuba/

/1997

No se reportaron eventos adversos graves relacionados con

eritropoyetina humana recombinante.

Efecto terapéutico del uso subcutáneo

de la hr- EPO en el tratamiento de la

anemia. NC/Cuba/1998




evaluación de la eficacia y la seguridad

de hr-EPO (CIMAB, Cuba) en


manejo de la anemia en la insuficiencia

renal crónica.

CLG002/BIO002/CKD/EPO/2005.India

/2005

YSD

Nervioso/

Neurología

Sangramient

o intra-

cerebral

Probable

ABS Cardiovascular Paro cardio-

respiratorio Posible

Equivalencia terapéutica entre la

eritropoyetina humana recombinante y

la hr- EPO sin albúmina (EPO/ SA) en

pacientes con insuficiencia renal crónica

en métodos dialíticos (hemodiálisis o

diálisis peritoneal). IIC RD EC068.

Cuba/2004



Efectividad y seguridad de la

eritropoyetina humana recombinante en


en métodos dialíticos (hemodiálisis o

diálisis peritoneal). IIC RD EC091.

Cuba/2006

SA 8 Nervioso/Neurolo

gía

Enfermedad

cerebrovascu

lar

hemorrágica

Probable

SA 13 Infecciones Bacteriemia Posible

LDS 20 Nervioso/Neurolo

gía

Enfermedad

cerebrovascu

lar

hemorrágica

Probable

Enfermedad

cerebrovascu

lar

hemorrágica

Posible

INNEF 78 Infecciones Sepsis

generalizada

Posible

Nervioso/Neurolo

gía

Accidente

vascular

encefálico

(isquemia)

Posible


generalizada

Posible

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 113/133

ANTERIOR/ N/P




Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM

INNEF 71 Cardiovascular Edema

agudo

pulmón

Posible


generalizada

Posible

INNEF 31 Cardiovascular Angina

inestable

aguda

Posible

INNEF 10 Nervioso/Neurolo

gía

Hemorragia

cerebral

Posible

HHA 2 Infecciones Endocarditis

(infecciosa)

Posible

HHA 14 Infecciones Sepsis

hematógena

Posible

GAL 50 Nervioso/Neurolo

gía

Enfermedad

cerebrovascu

lar

hemorrágica

Posible

GAL 24 Infecciones Sepsis

hematógena

Posible

CJF 47 Cardiovascular Infarto

miocardio

Posible

CJF 40 Vascular Trombosis

arterial

mesentérica

Probable


miocardio

agudo

Posible

CJF 3 Cardiovascular Miocarditis Posible


miocardio

agudo

Posible

CC 49 Nervioso/Neurolo

gía

Enfermedad

cerebrovascu

lar

hemorrágica

Posible

CC 37 Cardiovascular Infarto

miocardio

agudo

Posible

AS 41 Hepático/páncreas Insuficiencia

hepática

Posible

AS 38 Cardiovascular Shock mixto

infarto

Definitiva

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 114/133

ANTERIOR/ N/P




Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM

miocardio

agudo

AS 37 Cardiovascular Infarto

miocardio

agudo

Posible

AS 21 Cardiovascular Shock mixto

pericarditis

hemorrágico

Definitiva


evaluación de la eficacia y seguridad de

Erypro-SafeTM (hr-EPO inyección) en


manejo de la anemia en la insuficiencia

renal crónica. BN002/CKD/2007.

India/2007

6004 Cardiovascular Hipertensión

acelerada/ede

ma pulmonar

Posible

1. Comparación de eficacia de la

eritropoyetina producida por el Instituto

de Tecnología de Inmunobiológicos de

la Fundación Oswaldo Cruz y una

eritropoyetina biosimilar en pacientes

con insuficiencia renal crónica.

NCT01184495C. Brasil/2008

El reporte del estudio no refiere la relación de los eventos

adversos graves con la eritropoyetina humana recombinante o

la biosimilar utilizada en este estudio comparativo.




en pre-diálisis. IIC RD

EC112.Cuba/2011

CC-11

Sistema inmune Síndrome

anafiláctico

Muy

Probable

2. Anemia por quimioterapia

3. Impacto de la hr-EPO

(eritropoyetina humana recombinante)

en pacientes oncológicos con anemia

post quimioterapia/radioterapia. IIC RD

EC092. Cuba/2004



Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina

humana recombinante) en pacientes

pediátricos oncológicos con anemia post

quimioterapia/radioterapia. IIC RD

EC099. Cuba/2004

JLM-10 Sangre/Sistema

Linfático

Equimosis y

hematomas

Posible

JLM-12 Sangre/Sistema

Linfático

Trombocitop

enia

Posible

JLM-29 Neutropenia Posible


JLM-32 Trombocitop

enia

Posible

JLM-37 Trombocitop

enia

Posible


G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 115/133

ANTERIOR/ N/P




Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM

Tratamiento y prevención de la

anemia del Recién Nacido Pretérmino



anemia del recién nacido. IIC RD

EC121. Cuba/2010

M10-2 Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

Evaluación de la seguridad y

efectividad de ior® EPOCIM en el

manejo de la anemia del recién nacido

prematuro. M9/CIMAB/AEC-2.

Cuba/2013

10M-

DLM-19*

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

10M-

EVH-18*

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

10M-

EVH-21*

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

AB-AAS-

20

Ocular

Retinopatía

del

prematuro

Posible

AB-

ACJB-19

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

AB-KVF-

18

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

AB-

NCCC-17

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Probable

EH-DHF-

31

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

RGC-

KCO-17

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

RGC-

LAHM-7

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 116/133

ANTERIOR/ N/P




Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM

RGC-

LAHM-8

Ocular

Retinopatía

del

prematuro

Posible

RGC-

MVMV-9

Ocular Retinopatía

del

prematuro

Posible

RGC-

SSL-12

Ocular

Retinopatía

del

prematuro

Posible

Cardio-protección en el esquema de

tratamiento con antraciclinas

Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en

pacientes con linfoma No Hodgkin

tratados con antraciclinas.IIC RD

EC126. Cuba/2010.



Prevención de transfusiones de

sangre en cirugías electivas con alto

potencial de pérdida de sangre

Eficacia y seguridad de la eritropoyetina

humana recombinante en la disminución

de los requerimientos de transfusiones

de sangre en pacientes con cirugías

electivas de hiperplasia prostática

benigna. IIC RD EC 096. Cuba/2009

CP-25 Renal/Trastornos

Urinarios

Hematuria Probable

AN-10 Cardiovascular Hipertensión

arterial

Posible

CG-03 Cardiovascular Hipertensión

arterial

Posible

Reportes expeditos

Fuente de procedencia del reporte

/País

Código

del

paciente

Sistema

anatómico

Evento

adverso

grave

(EAG)

Relación

con ior®

EPOCIM

Reporte espontáneo/Cuba EPO2011/

01

Dermatología/piel Eritema

multiforme

Posible


06*

Ocular Retinopatía

prematuridad

Posible


07*

Ocular Retinopatía

prematuridad

Posible

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 117/133

ANTERIOR/ N/P




Código

del

paciente

Sistema

anatómico EAG

Relación

con ior®

EPOCIM


08*

Ocular Retinopatía

prematuridad

Posible

Reporte espontáneo/Singapur EPO2015/

01

Sangre/Sistema

Linfático

Anemia

refractaria

Posible

Reporte espontáneo/Tailandia EPO2015/

02

Sangre/Sistema

Linfático

Aplasia Pura

Células

Rojas

Posible

Reporte espontáneo/Tailandia EPO2016/

28

Cardiovascular Hipertensión

arterial

Definitiva

Leyenda: * Corresponde a EAG reportados también como reporte espontáneos durante el Ensayo

clínico.

6.12 Información relacionada con la eficacia.

6.12.1 Anemia en pacientes con Enfermedad Renal Crónica (ERC) sometidos a diálisis o en pre -

diálisis

En el período analizado de este reporte se obtuvo información de efectividad en la indicación de la

anemia por ERC en pacientes predialíticos del ensayo clínico IIC RD EC112. Efectividad y seguridad

de la EPOhr en pacientes con insuficiencia renal crónica en pre-diálisis.

El 31.0% (IC 95%, 25; 37) de los pacientes en el análisis por intención de tratamiento (AIT) y el 41.7%

(IC 95%, 31; 52) en el análisis por protocolo (APP) mantuvieron la Hb y el Hto en el rango previsto. El

23 % (AIT) y 31.3 % (APP) mantuvieron valores de Hb y el Hto por encima del valor establecido. La

media de la hemoglobina al inicio fue 10.0 g/dL y final 11.7 g/dL (p < 0.001). La media del Hto inicial

fue 31.57% y al final 37.26% (p < 0.001). La mediana del tiempo a la recuperación de la anemia fue 2

meses (IC 95%, 1.7; 2.2).

Requirieron transfusiones 7 pacientes, 2.9% (IC 95%, 1%; 5%), solamente en 2 pacientes la causa fue

no respuesta al tratamiento con ior® EPOCIM. Sobre el efecto de la corrección de la anemia en la

progresión de la ERC, no hubo cambios significativos en los valores medios de Filtrado Glomerular

Teórico (FGT) ni en la creatinina sérica. Al final del estudio se observó una reducción promedio de la

masa ventricular izquierda (29.9g) y del IMVI (Índice de Masa Ventrículo Izquierdo) que se redujo un

promedio de 51.8 g/m2 (IC 95%, 45; 99). El 40% (IC95%, 27; 52) de los pacientes redujo el IMVI en

12% o más respecto al valor basal.

La evaluación de calidad de vida (SF-36) al año de seguimiento, mostró mejoría para todas las

dimensiones de la escala, el mayor beneficio fue para las de rol físico y salud general. Se analizó la

seguridad en los 242 pacientes incluidos. Se reportaron 147 eventos adversos (EA) en 78 pacientes

(32.2% IC 95%, 26; 38), la mayoría fueron de intensidad leve (78 EA, 53.1%) y causalidad no

relacionada (71 EA, 48.3%). El EA más frecuente fue hipertensión arterial (66 EA, 44.9%), 20 (13.6%)

reportados con causalidad relacionada. Otros EA cardiovasculares y cerebrovasculares fueron Infarto

Agudo de Miocardio en 2 pacientes (1.4%), 2 pacientes con edema agudo del pulmón (1.4%), 2

pacientes con accidentes cerebrovasculares (1.4%) y uno con arritmia ventricular (0.7%), ninguno de

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 118/133

ANTERIOR/ N/P



ellos con causalidad asociada al medicamento en estudio. ior® EPOCIM mostró resultados beneficiosos

en la corrección de la anemia y demostró ser seguro en la población estudiada.

6.12.2 Anemia inducida por quimioterapia en pacientes oncológicos

La anemia es frecuentemente un síntoma concomitante en pacientes con cáncer. El origen obedece a

una combinación de factores, donde los efectos tóxicos directos de los agentes quimioterapéuticos

utilizados y la radioterapia, juegan un rol importante en su aparición. Esta anemia afecta en ocasiones

gravemente a la calidad de vida, obliga con frecuencia a la práctica de transfusiones y empeora la

temida hipoxia tumoral asociada con la resistencia a la quimioterapia y radioterapia.

La utilización de EPOhr en pacientes con anemia inducida por quimioterapia, mejora los valores de

hemoglobina y hematocrito, la calidad de vida, la adherencia a los regímenes de quimioterapia

planificados, así también, disminuye los requerimientos transfusionales.

6.12.3 Anemia y prematuridad

En el período analizado de este reporte se obtuvo información de efectividad en la indicación de la

anemia de la prematuridad en el ensayo clínico M9/CIMAB/AEC-2. El promedio de peso de los

pacientes incluidos fue de 1275 g y la edad gestacional de 31 semanas. El 86.3 % (113 pacientes) no

requirió transfusión durante el estudio. Solo 13.7 % necesitaron transfusión (18 pacientes), de estos el

10.7 % requirió una sola transfusión (14 pacientes), 3 pacientes recibieron 2 transfusiones y 1 recibió 4

transfusiones. Durante el seguimiento, ningún paciente fue transfundido. La media de la hemoglobina

al inicio fue de 120.81 g/l (DS 24.5) y en la evaluación final de 107.8 g/l (DS 17.3) IC 95 % (7.3-17.5),

p=0.000; respecto al hematocrito las medias oscilaron entre 38.4 % (DS 8) y 35.5 % (DS 6.7) IC 95 %

(1.6-4.0), p=0.000, hasta las 40 semanas de EG, momento hasta el cual recibieron el tratamiento. Se

identificaron alteraciones ligeras del neurodesarrollo, sólo en 2 pacientes a los 18 meses de

seguimiento.

6.12.4 Anemia y VIH/SIDA

En el período del 1 de enero de 2012 al 31 de diciembre de 2016 no hay reportes relacionados con falta

de eficacia de la EPOhr.

6.12.5 Literatura

En el período que cubre este informe se publicaron 6 artículos científicos con la EPOhr producida en el

CIM. A continuación, se relacionan los trabajos publicados en este período.

A. Lámelas Testa, A. A. L. Testa, I. C. Cabezas, C. A. R. Orta, Y. Y. G. Portales, M. R. Ferro, y

D. R. R. Díaz, «Eficacia y seguridad del ior® EPOCIM en el tratamiento de pacientes con

hiperplasia prostática benigna», Rev. Cuba. Urol., vol. 2, n.o 2, ene. 2014.

ior®EPOCIM-Infarto cerebral agudo-Fase I | Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos». [En

línea]. Disponible en: http: //registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000136-Sp. [Accedido: 07-

dic-2015].

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 119/133

ANTERIOR/ N/P



Efecto y seguridad del ior® EPOCIM en pacientes con Linfoma No Hodgkin tratados con

antraciclinas. | Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:

//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000096-Sp. [Accedido: 07-dic-2015].

J. F. Pérez-Oliva Díaz, «15 años de Eritropoyetina Recombinante Humana cubana. Beneficios y

retos», Rev. Habanera Cienc. Médicas, vol. 12, n.o 3, pp. 464-471, sep. 2013.

Sijó Yero, G. Saurez Martínez, D. Velázquez Noda, L. Méndez Alarcón, A. Alfonso Dávila, A.

Vargas Batista, M. Robaina García, P. Piedra Sierra, A. Lorenzo Rodríguez, A. Campos

González, y others, «Eficacia y seguridad de la eritropoyetina en la anemia de la prematuridad»,

Rev. Cuba. Pediatría, vol. 85, n.o 2, pp. 202–212, 2013.

Alicia Vargas Batista, Jorge Pérez-Oliva Díaz, Maytée Robaina García, Patricia Piedra Sierra,

Ivis Mendoza Hernández, Yusnely Román Rodríguez, «Efectividad y seguridad del uso de ior®

EPOCIM en pacientes en prediálisis Ensayo clínico», Rev.Habanera de Cienc. Médicas, vol 15,

Núm.6 (2016).

6.13 Evaluación general de seguridad

6.13.1 Evaluación de los eventos adversos en pacientes tratados con ior®EPOCIM.

A continuación, se resumen y analizan los eventos adversos reportados para pacientes tratados con ior®

EPOCIM para cada ensayo clínico terminado independiente de su relación.

La información disponible está en término de número de eventos adversos, se reportan en esta

evaluación los eventos adversos con incidencia ≥ 5%.

Los eventos se presentan por indicación, sistema anatómico y tipo de información disponible (número

de eventos adversos).

Los eventos adversos se presentan de acuerdo a la clasificación “Common Terminology Criteria for

Adverse Events v4.0” (CTCAEv4).

6.13.2 Indicación: Cardio-protección en el esquema de tratamiento con antraciclinas

Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en pacientes con linfoma No Hodgkin tratados con antraciclinas.

(IIC RD EC126)

Durante el estudio se presentaron 141 eventos adversos, 81 (57.4%) en el grupo que recibió tratamiento

con ior®EPOCIM (22 pacientes) y 60 (42.6%) en el grupo control (22 pacientes).

Los eventos adversos en término de número de eventos adversos (ver epígrafe 7.2.1, tabla 5) con

incidencia ≥ 5 %, independiente de su relación con ior®EPOCIM, fueron:

- Sangre /Sistema Linfático: Anemia (14.8%)

- Cardíaco: Taquicardia sinusal (12.3%)

- Vascular: Hipertensión arterial (9.9%)

- Gastrointestinal: Vómitos (6.2%)

6.13.3 Indicación: Prevención de transfusiones de sangre en cirugías electivas con alto potencial

de pérdida de sangre

Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en la disminución de los

requerimientos de transfusiones de sangre en pacientes con cirugías electivas de hiperplasia prostática

benigna. (IIC RD EC 096)

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 120/133

ANTERIOR/ N/P



Durante el estudio se presentaron 456 eventos adversos en 191 pacientes de los 250 incluidos en el

estudio, 93 (74.4%) pacientes en el grupo que recibió tratamiento con ior®EPOCIM presentaron 236

eventos adversos y 98 (78.4%) pacientes en el grupo control presentaron 220 eventos adversos.



- Renal/Urinario: Hematuria (31.8%)

- General/Sitio de Administración: Dolor en la herida quirúrgica (27.1%), sangrado por la herida

quirúrgica (6.4%), fiebre (5.9%)

6.13.4 Indicación: Anemia en Insuficiencia Renal Crónica

Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en pacientes con insuficiencia renal

crónica en pre-diálisis. (IIC RD EC112)

Durante el estudio se presentaron 147 eventos adversos en 78 (32.2%) pacientes de los 242 incluidos en

el estudio.

El evento adverso en término de número de evento adverso (ver epígrafe 7.2.3, tabla 7) con incidencia

≥ 5 %, independiente de su relación con la eritropoyetina humana recombinante, fue:

- Vascular: Hipertensión arterial (44.9%)

6.13.5 Indicación: Anemia en recién nacidos pretérmino

Evaluación de la seguridad y efectividad de ior® EPOCIM en el manejo de la anemia del recién nacido

prematuro. (M9/CIMAB/AEC-2)

Durante el estudio se presentaron 62 eventos adversos en 35 (26.7%) pacientes de los 131 incluidos en

el estudio.



- Ocular: Retinopatía del prematuro (21.0%)

- Infecciones/Infestaciones: Infección respiratoria alta (17.7%), sepsis tardía (9.7%)

- Respiratorio /Tórax/Mediastino: Crisis de sibilancia (11.2%)

6.13.6 Evaluación de los EAG presentados en ensayos clínicos terminados con relación de

causalidad con ior®EPOCIM.

En los ensayos clínicos terminados en el período del informe se reportaron 17 eventos adversos graves

relacionados con ior®EPOCIM, con causalidad muy probable (1), probable (2), posible (14).

A continuación, se relacionan los ensayos clínicos donde fueron presentados estos EAG relacionados

con la EPOhr:

Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en la disminución de los

requerimientos de transfusiones de sangre en pacientes con cirugías electivas de hiperplasia prostática

benigna. (IIC RD EC 096)

Del total de eventos adversos (456) presentados, se reportaron 27 (5.9%) EAG, 15(6.4%) en el grupo

ior® EPOCIM y 12 (5.5%) en el grupo control.

De los EAG presentados en el grupo ior® EPOCIM, se reportó 1 Hematuria y 2 Hipertensión Arterial.

La hematuria (código Paciente CP-25) fue de intensidad moderada, que no provocó cambios en el

tratamiento y el paciente se recuperó. Este evento fue clasificado con relación de causalidad probable

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 121/133

ANTERIOR/ N/P



con ior® EPOCIM y representó (0.2%) del total de eventos adversos (456) presentados en el estudio.

Los 2 eventos de hipertensión arterial con relación posible con ior®EPOCIM se describen como sigue:

Un caso (código Paciente AN-10) de intensidad moderada, que interrumpió definitivamente el

tratamiento y persistió el evento, sin otro detalle. El segundo caso (código Paciente CG-03) presentó

una HTA de intensidad severa, sin cambios en el tratamiento, que mejoró. Estos eventos representaron

el (0.4%) del total de eventos adversos presentados en el estudio.

- Renal/Urinario: Hematuria (0.2%), probable (1)

- Vascular: Hipertensión arterial (0.4%), posible (2)

Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en pacientes con insuficiencia renal

crónica en pre-diálisis. (IIC RD EC112)

Del total de eventos adversos (147) presentados durante el estudio, se clasificaron EAG 19 (12.9%), se

presentó 1 evento adverso grave relacionado con la administración de ior®EPOCIM: síndrome

anafiláctico (código Paciente CC-11), de intensidad severa, que interrumpió definitivamente el

tratamiento y tuvo recuperación total. Este evento se clasificó con relación de causalidad muy probable

con la administración del tratamiento y representó (0.7%) del total de eventos adversos presentados en

el estudio.

- Sistema inmune: Síndrome anafiláctico (0.7%), muy probable (1)

Evaluación de la seguridad y efectividad de ior® EPOCIM en el manejo de la anemia del recién nacido

prematuro. (M9/CIMAB/AEC-2)

Del total de eventos adversos (62) presentados en 35(26.7 %) pacientes, se reportaron 27 (12.9%)

EAG, 13 (21.0%) retinopatía del prematuro (10M-DLM-19, 10M-EVH-18, 10M-EVH-21, AB-AAS-

20, AB-ACJB-19, AB-KVF-18, AB-NCCC-17, EH-DHF-31, RGC-KCO-17, RGC-LAHM-7, RGC-

LAHM-8, RGC-MVMV-9, RGC-SSL-12) con relación probable (1), posible (12). Según el resultado

del EA se clasificaron: recuperado (9), mejorado (2), con secuelas (2). Respecto a la actitud frente a los

EA no se modificó el tratamiento con ior® EPOCIM al surgir el EA.

- Ocular: Retinopatía del prematuro (21.0%), probable (1), posible (12)

En el transcurso del estudio ocurrieron 3 muertes, dos en la etapa de tratamiento y una en la etapa de

seguimiento. Todas estuvieron relacionadas con comorbilidades asociadas, no estuvieron relacionados

con ior® EPOCIM. A continuación un sumario de estos reportes.

Pretérmino CIUR (Código paciente MG-YPH-8), femenino de 33 semanas de EG y 900 g de peso, que

con 71 días de vida fallece a consecuencia de una sepsis con fallo multiórgano.

Pretérmino femenino (Código paciente 10M-DLM-22), de 1040 g de peso, primera trilliza de 28

semanas de EG, con antecedentes perinatales de Rotura prematura de membrana que desencadenó el

parto pretérmino. A los 30 días de vida fallece por un cuadro de enterocolitis necrotizante complicada

con hemorragia pulmonar.

Pretérmino masculino (Código paciente AB-AAS-20), de 26 semanas y 938 g de peso. A los 14.7

meses de egresado (446 días), en edad de lactante, y en etapa de seguimiento, presentó una infección

respiratoria baja (Neumonía) que provocó su fallecimiento.

6.13.7 Evaluación de los eventos adversos con incidencia ≥ 5 %

Los eventos adversos de mayor incidencia en las indicaciones aprobadas de anemia en la enfermedad

renal crónica, anemia post quimioterapia/radioterapia y anemia en recién nacidos pretérminos,

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 122/133

ANTERIOR/ N/P



independiente de su causalidad con ior® EPOCIM (acumulado PSUR 2005-2010, PSUR 2011, IPS-

2017) son los siguientes (Tabla 70):

Tabla 70. Relación de eventos adversos graves con incidencia ≥ 5 % en pacientes tratados con ior®

EPOCIM en las indicaciones aprobadas independientemente de su causalidad (acumulado PSUR 2005-

2010, PSUR 2011, IPS-2017).

INDICACIONES

APROBADAS

EVENTOS ADVERSOS INCIDENCIA ≥

5 % (ensayos clínicos con información en

término de número de eventos adversos)

EVENTOS ADVERSOS INCIDENCIA

≥ 10 % (ensayos clínicos con información

en término de número de pacientes por

eventos adversos)

Anemia en

pacientes con

Enfermedad Renal

Crónica

Hipotensión 9.76 % Hipertensión

arterial

22.45 %

Dolor de cabeza 7.84 %

Hipertensión 52.07 %

Anemia en

pacientes

oncológicos por

quimioterapia

Fiebre 13.81 % - -

Dolor sitio inyección 10.81 %

Dolor óseo 9.61 %

Síndrome pseudo-gripal 6.91 %

Pérdida de peso 6.91 %

Vómitos 5.10 %

Anemia del Recién

Nacido Pretérmino

Infección respiratoria alta 34.4% - -

Sepsis tardía 23.6%

Retinopatía del prematuro 21.0%

Intertrigo moniliásico 13.9%

Crisis de sibilancia 11.2%

Reflujo gastroesofágico 8.3%

El ior® EPOCIM posee amplio perfil de seguridad comprobado en estudios clínicos controlados y en

estudios post comercialización que incluye poblaciones vulnerables como ancianos y niños, donde el

perfil de seguridad manifiesto es idéntico al demostrado en el resto de la población.

6.14 Evaluación de la inmunogenicidad de ior® EPOCIM en pacientes con insuficiencia renal

crónica.

Para determinar la inmunogenicidad se evaluó la presencia de anticuerpos anti-EPO en el suero de 87

pacientes con insuficiencia renal crónica del Hospital Nefrológico de Ciudad de la Habana, Cuba,

sometidos a hemodiálisis y tratados con la EPOhr producida en el CIM durante al menos 1año. Estas

determinaciones se realizaron en el Laboratorio de Ensayos Clínicos del Centro de Ingeniería Genética

(CIGB) de Cuba, utilizando las Buenas Prácticas de Laboratorio.

6.14.1 Metodología utilizada para la determinación de la presencia de anticuerpos anti-EPO.

Se utilizó un ELISA para la determinación de la presencia de anticuerpos anti-EPO en el suero de los

pacientes tratados con EPOhr producida en el CIM. Esta metodología fue previamente validada por el

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 123/133

ANTERIOR/ N/P



Departamento de Aseguramiento de la Calidad del CIGB. Los resultados de la validación obtenidos en

el Laboratorio de Ensayos Clínicos del CIGB se muestran en el punto 5.4.11.2.

6.14.2 Resultados de la validación de la metodología utilizada.

La validación se realizó según las recomendaciones del Comité Europeo para Estándar de Laboratorio

Clínico y la Guía para evaluación de kits diagnósticos (CEELC, 1987).

Los parámetros evaluados fueron: Precisión (repetibilidad y reproducibilidad) del control positivo y del

control negativo, límite de detección, especificidad (analítica), interferencias, estabilidad y sensibilidad.

Se utilizaron como:

Control positivo: Suero de conejo inmunizado con EPOhr.

Control negativo: Suero de donantes sanos que cumplen con todos los requisitos de: edad,

antecedentes patológicos personales negativos, test de hepatitis B negativo, test de HIV negativo.

En la validación del sistema ELISA de detección de anticuerpos anti-EPO se obtuvieron los siguientes

resultados:

- Repetibilidad: Control positivo CV≤10% y control negativo CV≤20%.

- Reproducibilidad: Control positivo CV≤10% y control negativo CV≤20%.

- Valor de absorbancia mínima detectable por el sistema: 0.072.

- En todos los testajes del control positivo del sistema se cumplió que la disminución del valor de

absorbancia era mayor que 3 desviaciones estándar del control negativo demostrando que el

sistema es específico.

- Se demostró que ni la hemólisis, ni la presencia de suero normal o de conejo interferían en nuestro

sistema de detección del ELISA.

- Se demostró que tanto los controles positivos como los controles negativos usados eran estables

por un período de 5 meses en las condiciones de conservación habituales.

Con los resultados anteriormente obtenidos el Departamento de Ensayos Clínicos del CIGB concluyó

que el sistema ELISA para la detección cualitativa de anticuerpos anti-EPO recombinante es seguro,

confiable y específico para demostrar la presencia de dichos anticuerpos en suero.

6.14.3 Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes.


La verificación de los dos ensayos realizados fue conforme ya que se obtuvieron los siguientes

resultados:

- El valor de absorbancia del fondo fue menor que 0.1.

- El valor de absorbancia del control negativo fue menor que 0.12.

- El valor de absorbancia del control positivo fue mayor que 1.

Resultados:

Para la interpretación de los resultados fue considerado:

- Se consideró positivo al suero con valores de absorbancia superiores a 3 desviaciones estándar por

encima del promedio de la población de controles negativos estudiados (punto de corte). Además,

para ser positivos deben satisfacer la condición de que la diferencia entre los valores de extinción

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 124/133

ANTERIOR/ N/P



de la pre-incubación con EPOhr y los de sin pre-incubación con EPOhr debe ser mayor que el

valor del punto de corte, lo que confirmaría la especificidad de los anticuerpos.

- Se consideró negativo al suero con valores inferiores a dos desviaciones estándar del promedio de

los controles negativos.

Los resultados de las determinaciones de anticuerpos anti-EPO en dos ensayos realizados muestran que

ninguno de los pacientes tratados con la EPOhr producida en el CIM presenta niveles detectables de

anticuerpos en sangre (Tabla 71 y 72)

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 125/133

ANTERIOR/ N/P




suministrado la EPOhr producida en el CIM. Ensayo realizado el día 10nov2004.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 126/133

ANTERIOR/ N/P




suministrado la EPOhr producida en el CIM. Ensayo realizado el día 27oct2004.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 127/133

ANTERIOR/ N/P




Los resultados obtenidos indican que la EPOhr producida en el CIM no es inmunogénica al menos

después del primer año de tratamiento de los pacientes.

- El producto ior® EPOCIM no ha sido objeto de alerta ni de comunicación de riesgo en el

territorio nacional ni en los países donde se comercializa en el período analizado.

- El perfil de seguridad de ior® EPOCIM en el período analizado es coincidente con el reportado en

la Información Básica del producto (IPP). No se aprecian cambios clínicamente significativos en

la severidad o frecuencia de los eventos adversos referenciados.

- Se detectaron nuevas señales en la subpoblación de enfermos renales crónicos como sospecha de

Aplasia Pura de Células Rojas, específicamente en Tailandia, pero solo una de ellas se confirmó

con relación posible.

- En concordancia con los datos de calidad, de seguridad y de eficacia descritos en este reporte se

infiere que el beneficio terapéutico de ior® EPOCIM supera los riesgos potenciales para todas las

indicaciones de uso aprobadas en condiciones de la práctica médica.

- Por todos los resultados anteriores se concluye que el producto es eficaz y seguro.

La evaluación beneficio-riesgo es favorable, en las condiciones de uso para la población (M9/IPS-

2017, 2017).

7. CONCLUSIONES

Calidad.

- El ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO® son similares en la calidad fisicoquímica y biológica y

no demuestran diferencias significativas en relación a su estructura primaria, estructura

secundaria y terciaria, impurezas, masa molecular, tamaño molecular, unión al receptor,

bioactividad in vitro e in vivo.

- Las diferencias obtenidas en la caracterización entre ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO® en

los estudios de N-Glicosilación y el perfil de isoformas por electroforesis capilar de zona no

muestran un impacto en los estudios preclínicos, al no obtenerse diferencias estadísticas

significativas en los resultados de actividad biológica in vitro (proliferación celular) e in vivo

(ratones normocitemicos) y afinidad (Biacore) entre ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO®.

Farmacología no clínica y toxicología.

Los productos ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO® son similares desde el punto de vista

farmacocinetico y toxixologico.

Farmacología clínica. Eficacia y seguridad.

- Los resultados clínicos realizados con ior®EPOCIM mostraron una farmacocinética similar a la

del producto de referencia.

- Los resultados clínicos realizados con ior®EPOCIM mostraron una eficacia y un perfil de

seguridad acorde a los parámetros aceptados internacionalmente.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 128/133

ANTERIOR/ N/P



- En concordancia con los datos de calidad, de seguridad y de eficacia descritos en este reporte se

establece que el beneficio terapéutico de ior®EPOCIM supera los riesgos potenciales para todas

las indicaciones de uso aprobadas en condiciones de la práctica médica.

Evaluación riesgo-beneficio.

El ior®EPOCIM ha demostrado ser un medicamento seguro y eficaz en todas las indicaciones

aprobadas y en los ensayos clínicos controlados y post comercialización realizados, evidencia efecto

terapéutico en la anemia por Insuficiencia Renal Crónica, anemia por quimioterapia/radioterapia,

anemia del Recién Nacido Pretérmino así como la prevención de transfusiones de sangre en cirugías

electivas con alto potencial de pérdida de sangre y cardio-protección en el esquema de tratamiento con

antraciclinas, lo que posibilita la continuación del ciclo de tratamiento planificado para afecciones

malignas. El uso clínico incluye poblaciones vulnerables como niños, con un favorable perfil de

seguridad manifiesto idéntico al demostrado en el resto de la población. No ha sido necesario realizar

acciones por las autoridades regulatorias o por los titulares de los registros aprobados por razones de

seguridad. No se han descrito cambios en el perfil de seguridad, por lo que no ha cambiado la

información de referencia sobre seguridad del producto (M9/IPS-2017, 2017).

Concentramos el objetivo de este estudio en la evaluación cualitativa y cuantitativa de la similitud del

medicamento biotecnológico de prueba y el producto de referencia. Basado en la totalidad de los

resultados obtenidos de ior®EPOCIM queda demostrada la biocomparabilidad a EPREX®/ERYPO®.

7. REFERENCIAS

- «ior® EPOCIM en la anemia del recién nacido prematuro.Fase IV. | Registro Público Cubano de

Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible en: http: //registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000149-Sp.

[Accedido: 07-dic-2015].

- 050302-Informe de inmunogenicidad de la EPOhr producida en el CIM. 2004.

- 97/22. Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en conejos con el producto de referencia

EPREX®. 1997.

- 97/23. Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en monos con el producto de referencia EPREX®.

1997.

- A. Lámelas Testa, A. A. L. Testa, I. C. Cabezas, C. A. R. Orta, Y. Y. G. Portales, M. R. Ferro, y D. R. R.

Díaz, «Eficacia y seguridad del IOR® Epocim en el tratamiento de pacientes con hiperplasia prostática

benigna», Rev. Cuba. Urol., vol. 2, n.o 2, ene. 2014.

- A. Sijó Yero, G. Saurez Martínez, D. Velázquez Noda, L. Méndez Alarcón, A. Alfonso Dávila, A.

Vargas Batista, M. Robaina García, P. Piedra Sierra, A. Lorenzo Rodríguez, A. Campos González, y

others, «Eficacia y seguridad de la eritropoyetina en la anemia de la prematuridad», Rev. Cuba.

Pediatría, vol. 85, n.o 2, pp. 202–212, 2013.

- Acta de sesión SEPB No.009/2014. Pruebas de caracterización para la determinación de

biocomparabilidad de los medicamentos biotecnológicos, que contengan como IFA Eritropoyetina

humana. 20 de noviembre de 2014.

- Alegre. A. Eritropoyetina en Hematología. Editorial Médica Panamericana. 2005.

- Alicia Vargas Batista, Jorge Pérez-Oliva Díaz, Maytée Robaina García, Patricia Piedra Sierra, Ivis

Mendoza Hernández, Yusnely Román Rodríguez, «Efectividad y seguridad del uso de ior® EPOCIM en

pacientes en prediálisis Ensayo clínico», Rev.Habanera de Cienc. Médicas, vol 15, Núm.6 (2016).

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 129/133

ANTERIOR/ N/P



- Beatriz Larrayoz. 2015. Medicamentos biosimilares Concepto, regulación y controversias en su

utilización. Boletín de información fármaco terapéutica de Navarra. VOLUMEN 23, Nº 3.

- Boven K, Knight J, Bader F, et al. Epoetin-associated pure red cell aplasia in patients with chronic

kidney disease: solving the mystery.Nephrol Dial Transplant; 20(Suppl 3):iii33–iii40. 2005.

- Bradbury BD,Do TP, WinkelmayerWC, CritchlowCW, Brookhart MA. Greater Epoetin alfa (EPO)

doses and short-term mortality risk among hemodiálisis patients with hemoglobin levels less than 11

g/dL. Pharmacoepidemiol Drug Saf; 18:932–40. 2009.

- Brown KR, Carter Jr W, Lombardi GE. Recombinant Erythropoietin overdose. Am J Emerg Med;

11:619–21. 1993.

- Carlos Pineda, Gilberto Casteada Hernández, Ira A. Jacobs, Daniel F. Álvarez, Claudio Carini. 2016.

Assessing the Immunogenicity of Biopharmaceuticals. BioDrugs, 30:195–206. DOI 10.1007/s40259-

016-0174-5.

- CEELC. Guidelines for Evaluation of Diagnostic Kits. Part 2. General Principles and outline procedures

for the evaluation of kits for qualitative tests. ECCLS Central Office: Dr Kjell Jacobsson University

Hospital S-221 85 LUND SWEDEN, March 1987.

- CIGB MISC2-3 2017

- CIM D701OT-007 2007.

- Cotter DJ, Stefanik K, Zhang Y, Thamer M, Scharfstein D, Kaufman J. Hematocrit was not validated as

a surrogate end point for survival among epoetin-treated hemodialysis patients. J Clin Epidemiol;

57:1086–95. 2004.

- Choi D et al. Erythropoietin: physico- and biochemical analysis. J Chromatogr B Biomed Appl

687(1):189–199. 1996.

- Deechongkit S, Aoki KH, Park SS, Kerwin BA. Biophysical comparability of the same protein from

different manufacturers: a case study using Epoetin alfa from Epogen and Eprex. J Pharm Sci; 95: 1931–

1943. 2006.

- Delorme E, Lorenzini T, Giffin J et al. Role of glycosylation on the secretion and biological activity of

erythropoietin. Biochemistry 31:9871–9876. 1992.

- Dordal M. S., Wang F. F., Goldwasser E., The role of carbohydrate in erythropoietin action.

Endocrinology 116, 2293–2299 (1985).

- DOT-005/04. Informe sobre el estudio de estabilidad en estrés de la eritropoyetina humana recombinante

(Ingrediente Farmacéutico Activo).

- Efecto y seguridad del ior® EPOCIM en pacientes con Linfoma No Hodgkin tratados con antraciclinas. |

Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:

//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000096-Sp. [Accedido: 07-dic-2015].

- Egrie JC, Browne JK. Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein

(NESP). Nephrol Dial Transplant 16(Suppl 3):3–13. 2001.

- Egrie JC, Browne JK. Development and characterization ofn novel erythropoiesis stimulating protein

(NESP). Nephrol Dial Transplant 16(Suppl 3):3–13. 2001.

- Elliott S, Heatherington AC, Foote M. Cancer drug discovery and development hematopoietic growth

factors in oncology: basic science and clinical therapeutics, 6 chapter, Erythropoietic factors-Clinical

pharmacology and pharmacokinetics. Human Press Inc, Totowa, NJ, pp 97–123. 2004.

- EMA 2012. 27 de sep, EMA/837805/2011-Questions and answers on biosimilar medicines (similar

biological medicinal products).

- EMA SB309. SCIENTIFIC DISCUSSION (Epoetin Zeta).2007.

- EPO-alpha, human recombinant. Consulta: 22ene2016. Recuperado de http://www.biovision.com/epo-

alpha-human-recombinant-2066.html. 2016.

- ERITO497. Toxicidad aguda endovenosa del ior®EPOCIM en primates. 1998.

http://www.biovision.com/epo-alpha-human-recombinant-2066.html

http://www.biovision.com/epo-alpha-human-recombinant-2066.html

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 130/133

ANTERIOR/ N/P



- ERITO799. Toxicidad aguda endovenosa del ior®EPOCIM en ratas.1999.

- F. Pérez-Oliva, B. Morejón, A. Vargas, M. Lagarde, I. Mendoza, y C. E. Viada, «Equivalencia

terapéutica entre ior® EPOCIM y EPO sin albúmina en pacientes con Insuficiencia Renal Crónica en

Hemodiálisis», Rev. Habanera Cienc. Médicas, vol. 7, n.o 3, pp. 0-0, sep. 2008.

- FB. British Pharmacopoiea 2016. Erythropoietin for injection. 2016.

- FB. Farmacopea Británica 2016. Apéndice XIIIB. Contaminación por partículas: Partículas subvisibles.

- FDA. Guidance for industry. Biosimilarity. 2015.

- FE 1316. Farmacopea Europea 9.0, 2016. 1316. Solución concentrada de eritropoyetina.

- FE 5.1.10. Farmacopea Europea 9.0, 2016. 5.1.10. Guía para el uso del test para endotoxinas bacterianas.

- FE. Farmacopea Europea 9.0, 2016. 2.9.19. Contaminación por partículas: Partículas subvisibles.

- FE. Farmacopea Europea 9.0, 2016. 2.9.20. Contaminación por partículas: Partículas visibles.

- FE. Farmacopea Europea 9.0, 2016. 5.3. Análisis estadísticos de resultados de test y ensayos biológicos.

- FTU/BIO/15/002-PRO /REP-001. Unión específica a molécula blanco.

- FTU/BIO/15/002-PRO/REP-002. Evaluación de la actividad biológica in vitro. Potencia biológica

mediante ensayos de proliferación celular.

- FTU/BIO/15/002-PRO/REP-003. Evaluación de biocomparabilidad de ALVERITIN contra el

medicamento de referencia in vivo. Metodología Farmacopéica.

- G10 INF-0071-Evaluacion de desempeño del método de western blot para la determinación e pureza en

el producto final de eritropoyetina humana recombinante.

- G10 REST-0051 Estabilidad acelerada del ingrediente farmacéutico activo de la rHuEPO.

- G10 REST-0052 Estabilidad anaquel del ingrediente farmacéutico activo de la rHuEPO.

- G10-PNO-0002 Determinación de partículas visibles.

- G10-PNO-0002 Inspección visual de producto por control de la calidad.

- G10-PNO-0021Determinacion de endotoxinas bacterianas por el método de LAL.

- G10-PNO-0026 Ensayo de recuento de partículas por bloqueo de la luz.

- G10-PNO-0032 Determinación del contenido de ácido siálico en muestras de EPOCIM.

- G10-PNO-0054 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y western blot

de la eritropoyetina humana recombinante.

- G10-PNO-0056 Análisis del contenido de dímeros y componentes de alto peso molecular de la

eritropoyetina.

- G10-PNO-0081 Análisis de la distribución de isoformas de la eritropoyetina mediante isoelectroenfoque.

- G10-PNO-0087 Análisis de la estructura de la eritropoyetina mediante mapeo peptídico.

- G11 RAP-0001/2014 Reporte Anual de Producto: Eritropoyetina, 2014



- García López, FL. La eritropoyetina recombinante humana en la enfermedad renal crónica: lecciones

que aprender. Nefrología. Suplemento Extraordinario, 2(4): 7-15. 2011.

- Gianoncelli A y cols. An integrated approach for a structural and functional evaluation of biosimilar:

Implications for Erythropoietin. Bio Drugs DOI 10.1007/s40259-015-0136-3. 2015.

- Gokana A, Winchenne JJ, Bem-Ghanem A, Ahaded A, Cartron JP, Lambin P. Chromatographic

separation of recombinant human erythropoietin isoforms. J Chromatogr A; 791:109-18. 1997.

- Hermeling S, Schellekens H, Crommelin DJ, Jiskoot W. Micelleassociated protein in epoetin

formulations: a risk factor for immunogenicity? Pharm Res; 20:1903–7. 2003.

- Hermeling S, Schellekens H, Maas C, Gebbink MF, Crommelin DJ, Jiskoot W. Antibody response to

aggregated human interferón alpha2b in wild-type and transgenic immune tolerant mice depends on type

and level of aggregation. J Pharm Sci; 95:1084–96. 2006.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 131/133

ANTERIOR/ N/P



- Hirano K., Izumi M., MacMillan D., Tezuka K., Tsuji T., Kajihara Y., Semisynthesis of Erythropoietin

analog having three oligosaccharides. J. Carbohydr. Chem. 30, 306–319 (2011).

- Hirano K., MacMillan D., Tezuka K., Tsuji T., Kajihara Y., Design and synthesis of a homogeneous

erythropoietin analogue with two human complex-type sialyloligosaccharides: Combined use of

chemical and bacterial protein expression methods. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9557–9560 (2009).

- IMS Health. 2012. MIDAS Global Biologics Database.

- Islah Ahmed; Ben Kaspar; and Uma Sharma. Biosimilars: Impact of Biologic Product Life Cycle and

European Experience on the Regulatory Trajectory in the United States. Clinical Therapeutics/Volume

34, Number 2, 2012.

- J.Miguel PV. Análisis de criterios y requisitos internacionales para determinar la biocomparabilidad de

productos que contienen eritropoyetina. 2015.

- Jelkmann W. Regulation of Erythropoietin Production. Journal of Ohysiology. 1251-1258. 2011.

- Jelkmann. W. Molecular Biology and Clinical Use. Johnson City: F.P. Graham Publishing. 2003.

- Jelkmann. W. Recombinant erythropoietins- the role of glycosilations in receptor binding. Action and

degradation. Available: http://www.business-briefings.com. 2005.

- Lasne F, Ceaurriz J. Recombinant erythropoietin in urine. Nature; 405:635. 2000.

- Lasne F. Double-blotting: a solution to the problem of non-specific binding of secondary antibodies in

immunoblotting procedures. J Immunol Methods 253(1–2):125–131. 2001.

- Liem Andhyk Halim, Vera Brinks, Wim Jiskoot, Stefan Romeijn, Rob Haselberg, Chris Burns, Meenu

Wadhwa, Huub Schellekens. Quality and Batch-to-Batch Consistency of Original and BiosimilarEpoetin

Products. Journal of Pharmaceutical Sciences 105,542e550. 2016.

- M. S. Alicia Vargas, M. S. Ivis Mendoza, M. S. Rolando Uranga, M. D. Alejandro González, M. D.

Liliana Martínez, M. D. Iraida Caballero, M. D. Patricia Piedra, M. D. Giselle Saurez, M. D. Manuel

Verdecia, y M. D. Ricardo Cabanas, «Efficacy and safety of ior® EPOCIM for chemotherapy-or

radiotherapy-induced anemia in pediatric cancer patients», MEDICC Rev., vol. 12, n.o 3, p. 28, 2010.

- M9/IPS-2017, 2017. Informe Periodico de Seguridad iorEPOCIM. 2017.

- Macdougall. I. Novel erythropoiesis-stimulating agents: A new in anemia management. Clinical Journal

of American Society Nephrolofy, 3: 200-207. 2008.

- Micsonai A., Wien F., Kernya L., Lee Y., Goto Y., Réfrégiers M., Kardos J. Accurate secondary

structure prediction and fold recognition for circular dichroismspectroscopy. PNAS, vol. 112 (24). p.p.

E3095-E3103. 2015.

- Michail. A and Farouk.M. Epoetin Biosimilars in Europe: Five years on. Adv.Ther. 30(1): 28-40. 2013.

- Miyakima. A and Kinoshita. T. Cytokine signaling for proliferation. Survival nad death in hematopoietic

cells. International Journal of Hematology. 69: 137-146. 1999.

- Murakami et al. Chemical synthesis of erythropoietin glycoforms for insights into the relationship

between glycosylation pattern and bioactivity. Sci. Adv. 2016; 2: e1500678. 2016.

- Murakami M., Okamoto R., Izumi M., Kajihara Y., Chemical synthesis of an Erythropoietin glycoform

containing a complex-type disialyloligosaccharide. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 3567–3572 (2012).

- Narhi LO et al. The effect of carbohydrate on the structure and stability of erythropoietin. J Biol Chem

266(34):23022–23026. 1991.

- No.270994. Estudio comparativo de Toxicidad del ior®EPOCIM a dosis intravenosas repetidas por 28

días en ratas Sprague Dawley con EPREX® como producto de referencia seguido de un periodo de

recuperación de 14 días. 2014.

- NOM-177-SAA-2013. Pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable.

20 de Septiembre de 2013.

http://www.business-briefings.com/

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 132/133

ANTERIOR/ N/P



- Paulo D. Picon y cols. Randomized double-blind clinical trial of a new human epoetin versus a

commercially available formula for anemia control in patients on hemodialysis. CLINICS; 69(8):547-

553. 2014.

- Pérez- Oliva Díaz, «Eficacia del tratamiento con eritropoyetina recombinante humana cubana

(EPOCIM), en pacientes anémicos hemodializados», Rev Habanera de Ciencias Médicas, vol. 3, n.o 10,

2004.

- PNO-IT-004 ed 1-Separación de proteínas por SDS-PAGE. Método farmacopéico.

- PNO-IT-006 ed.1-Cuantificación de sulfidrilos libres.

- PNO-IT-028 ed.1-Determinación del perfil de N-glicosilación en proteínas por HPLC fase normal

(HILIC).

- PNO-IT-030 ed1-Secuenciación de proteínas por LC-MS.

- PNO-IT-035 ed.1-Isoelectroenfoque por electroforesis capilar de epoetina.

- PNO-LB-008 ed.2-Separación de proteínas por SDS-PAGE. Método farmacopéico.

- PNO-LB-024 ed.1-Caracterización de la estructura de proteínas por espectrofotometría de adsorción UV.

- PNO-LB-027 ed.1-Evaluación de la estructura terciaria de proteína por espectroscopia de fluorescencia.

- PNO-LB-035 ed.1-Inmunodetección por WB semiseco en condiciones desnaturalizante reductoras.

- Praditpornsilpa K, Kupatawintu P, Mongkonsritagoon W, SupasyndhO, Jootar S, Intarakumthornchai T,

et al. The association of anti-r-HuEpo-associated pure red cell aplasia with HLA-DRB1*09-

DQB1*0309. Nephrol Dial Transplant; 24:1545–9. 2009.

- Pucaj et al., Safety and Biosimilarity of iorEPOCIM Compared with Eprex Based on Toxicologic,

Pharmacodynamic, and Pharmacokinetic Studies in the Sprague–Dawley Rat. Journal of Pharmaceutical

Sciences 103:3432–3441, 2014.

- Rahbek-Nielsen H., Roepstorff P., Reischl H., Wozny M., Koll H., Haselbeck A., Glycopeptide profiling

of human urinary erythropoietin by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J.

Mass Spectrom. 32, 948–958.1997.

- Reichel C et al. SDS-PAGE of recombinant and endogenous erythropoietins: benefits and limitations of

the method for application in doping control. Drug Test Anal 1:43–50. 2009.

- Reichel C y Thevis M, Gel electrophoretic methods for the analysis of biosimilar pharmaceuticals using

the example of recombinant Erythropoietin. Bioanalysis 5(5), 587-602. 2013.

- Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T., Drug Test. Anal. 1, 43–50. 2009.

- REP-LB-C006 Ed.1. Análisis de eritropoyetina por SDS-PAGE desnaturalizante en condiciones

reductora.

- REP-LB-C008 Ed.1. Determinación de la secuencia de epoetina alfa por espectrometría de masas.

- REP-LB-C013 Ed.1. Caracterización de la estructura terciaria de epoetina alfa por espectroscopia de

fluorescencia.

- REP-LB-C014 Ed.1. Cuantificación de sulfidrilos libres en epoetina alfa.

- REP-LB-C016 Ed 1. Análisis de epoetina alfa por SDS.PAGE desnaturalizante en condiciones

reductoras y no reductoras.

- REP-LB-C017.Ed. 1. Determinación del perfil de N-Glicosilación de epoetina alfa por HPLC Fase

Normal (HILIC).

- REP-LB-C018 Ed.1. Caracterización de la estructura terciaria de IFA de eritropoyetina por

espectroscopia de fluorescencia.

- REP-LB-C019 Ed.1. Análisis por dicroísmo circular de IFA de eritropoyetina.

- REP-LB-C020.Ed. 1. Determinación del perfil de isoforma de epoetina alfa por electroforesis capilar de

zona.

- Schellekens H. Biosimilar epoetins: how similar are they? EHLP Journal 3:43–47.2004.

G10 INF-0089

VERSIÓN/ 00

PÁGINAS/ 133/133

ANTERIOR/ N/P



- Schellekens.H and Jiskool. W. Eprex-associated pure red cell aplasia and leachales. Nature

Biotechnology. 24:613-614. 2006.

- Schiestl M, Stangler T, Torella C, Cepeljnik T, Toll H, Grau R. Acceptable changes in quality attributes

of glycosylated biopharmaceuticals. Nat Biotechnol.; 29(4):310-312. 2011.

- Schmidt C.A., Codevilla C.F., Fronza M., Casali R.G., Dalmora S.L., Lat. Am. J. Pharm. 22, 343–350.

2003.

- Sherwood JB et al. The heterogeneity of circulating human serum erythropoietin. Endocrinology

122:1472–1477. 1988.

- Storring PL, Tiplady RJ, Gaines Das RE, Stenning BE, Lamikanra A, Rafferty B, et al. Epoetin alfa and

beta differin their erythropoietin isoform compositions and biologicalproperties. Br J Haematol; 100:79-

89. 1998.

- Takeuchi M, Inoue N, Strickland TW, Kubota M, Wada M, Shimizu R, et al. Relationship between sugar

chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese

hamster ovary cells. Proc Natl Acad Sci USA; 86:7819–22. 1989.

- Takeuchi M., Kobata A., Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins.

Glycobiology 1, 337–346 (1991).

- Thieme. D and Hemmersbach. P. Doping in Sports. Germany: Springer Science. 2010.

- Vera Brinks & Andrea Hawe & Abdul H. H. Basmeleh & Liliana Joachin-Rodriguez & Rob Haselberg

& Govert W. Somsen & Wim Jiskoot & Huub Schellekens. Quality of Original and Biosimilar Epoetin

Products. Pharm Res; 28:386–393. 2011.

- Zoltán Kiss & Steven Elliott & Kinga Jedynasty & Vladimír Tesar & János Szegedi. Discovery and

basic pharmacologyof erythropoiesis-stimulating agents (ESAs), including the hyperglycosylated ESA,

darbepoetin alfa: an update of the rationale and clinical impact. Eur J Clin Pharmacol 66:331–340. 2010.

8. REVISIÓN HISTÓRICA

Revisión Descripción de los cambios Elaborador Fecha

00 Se crea un nuevo documento. Alejandro Portillo 04/2018

· G10 INF-0089 VERSIÓN/ 00 PÁGINAS/ 1/133 ANTERIOR/ N/P BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM...

Documents

Transcript of · G10 INF-0089 VERSIÓN/ 00 PÁGINAS/ 1/133 ANTERIOR/ N/P BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM...