Fundação José Bonifácio Lafayette de Andrada

Faculdade de Medicina de Barbacena

Núcleo de Pesquisa e Extensão

Projeto de Pesquisa

Pesquisadora responsável Polyana Cury Marinho

Pesquisadora colaboradora Cristiane de Melo Cazal

Avaliação do processo cicatricial de lesão cutânea induzida em ratos

diabéticos tratados com o uso tópico do óleo essencial da folha de

Schinus molle

Barbacena

2017

RESUMO

A diabetes é uma desordem multissistêmica que induz alterações fisiológicas em

tecidos e células que prejudicam o processo de cicatrização. As feridas diabéticas

ficam estacionadas na fase inflamatória causando danos colaterais extensivos ao

tecido circundante e prolongando o processo cicatricial normal. Diversos estudos

nos últimos anos demonstram agentes naturais com potenciais efeitos antioxidantes

e anti-inflamatórios que podem interferir beneficamente no processo de cicatrização

da ferida diabética. O presente estudo será conduzido para investigar o potencial

benéfico do tratamento tópico com óleo extraído das folhas da planta Schinus molle,

conhecida popularmente como “pimenteira-bastarda”, em lesões cutâneas

experimentais. Para o protocolo experimental serão estudados 56 ratos Wistar,

divididos em 8 grupos (controle 7 dias, controle tratado 7 dias, controle 14 dias,

controle tratado 14 dias, diabético 7 dias, diabético tratado 7 dias, diabético 14 dias e

diabético tratado 14 dias). Uma lesão circular será realizada no dorso de todos os

animais para posterior tratamento tópico com óleo nos animais dos grupos tratados.

No 7º e 14º dias de pós-operatório os animais serão eutanasiados para retirada do

fragmento da lesão. Cada fragmento será fixado em solução de paraformaldeído a

4% e processados de acordo com a rotina histológica para microscopia de luz e

inclusão em parafina. As análises a serem realizadas serão: contração da ferida,

reepitelização, espessura da neoepiderme, deposição e distribuição das fibras de

colágeno, quantificação de leucócitos polimorfonucleares (PMN), mastócitos e

angiogênese. Espera-se encontrar ao final do experimento um efeito benéfico e

acelerador do óleo de S. molle no processo de cicatrização das lesões cutâneas

experimentais.

Palavras-chave: Diabetes. Cicatrização. Lesão cutânea. Plantas medicinais.

SUMÁRIO

1

2

3

4

4.1

5

5.1

5.1.1

5.1.2

5.1.3

5.2

5.3

5.4

5.4.1

5.4.2

5.4.3

5.4.4

5.4.5

5.4.6

5.5

6

7

8

9

INTRODUÇÃO.......................................................................................

JUSTIFICATIVA....................................................................................

HIPÓTESE.............................................................................................

OBJETIVO.............................................................................................

Objetivos específicos..........................................................................

METODOLOGIA....................................................................................

Obtenção do óleo a partir das folhas da planta................................

Coleta dos folhas de Schinus molle.......................................................

Obtenção do óleo essencial...................................................................

Análises químicas do óleo essencial.....................................................

Amostra e procedimentos...................................................................

Indução da diabetes............................................................................

Análises................................................................................................

Análise macroscópica............................................................................

Contração e reepitelização da lesão......................................................

Microscopia de luz.................................................................................

Estereologia...........................................................................................

Morfologia..............................................................................................

Avaliação das fibras de colágeno..........................................................

Análise estatística................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................

CRONOGRAMA DE ATIVIDADES.......................................................

ORÇAMENTO.......................................................................................

ANEXO – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais da

Faculdade de Medicina de Barbacena..................................................

03

05

05

06

06

07

07

07

07

07

08

09

09

09

09

10

10

11

12

12

13

15

17

19

3

1 INTRODUÇÃO

A diabetes mellitus é uma desordem metabólica endócrina, considerada

multissistêmica que induz alterações fisiológicas em tecidos e células que

prejudicam o processo de cicatrização (1). De acordo com a estimativa realizada

pela Federação Internacional de Diabetes, aproximadamente 415 milhões de

pessoas no mundo tinham diabetes em 2015 e esse número pode aumentar para

642 milhões em 2040 (2). O indivíduo diabético é fator de risco aumentado para

amputação do membro inferior, representando o principal desperdício de custos e

recursos na área da saúde. Todos os anos, mais de um milhão de membros

inferiores de pacientes diabéticos são amputados como conseqüência do avanço da

ferida (3).

O processo de cicatrização envolve três principais estágios: inflamação,

proliferação e remodelação. O primeiro estágio surge para dar início a homeostasia

do tecido (coagulação do sangue) e pode durar até 6 dias. Durante a proliferação,

novos vasos sanguíneos são formados por angiogênese e as novas fibras de

colágeno são sintetizadas e depositadas, conduzindo a formação do tecido de

granulação, reepitelização e contração da ferida para seu completo fechamento. O

remodelamento do tecido é uma fase que substitui o tecido de granulação por uma

cicatriz, perdurando por 3 a 6 semanas. Nas feridas diabéticas, a fase inflamatória

se prolonga e a fase proliferativa não se inicia resultando em feridas crônicas não

cicatrizadas. Portanto, a cicatrização de feridas diabéticas é um sério desafio na

prática clínica (4).

Ainda não está completamente claro a fisiopatologia por trás do processo

prejudicado da cicatrização da ferida diabética, mas presume-se que a persistência

da inflamação e a inadequada resposta angiogênica estão relacionadas a cura tardia

(4). As feridas diabéticas ficam estacionadas na fase inflamatória caracterizada pelo

influxo contínuo de neutrófilos que liberam enzimas citotóxicas, radicais livres e

mediadores inflamatórios que causam danos colaterais extensivos ao tecido

circundante. Estes processos destrutivos superam o processo de cicatrização em

feridas prolongando o processo normal (1). Migração de células endoteliais,

proliferação e formação de tubos são processos essenciais na angiogênese que

4

visam o fornecimento de oxigênio e sangue, sendo indispensável para a

regeneração de novos tecidos através da formação dos novos vasos, e caso não

ocorra satisfatoriamente, as feridas diabéticas são impossíveis de curar (5).

O tratamento das feridas diabéticas requer estratégias baseadas na prática de

cuidados convencionais (incluindo antibióticos tópicos, curativos contendo

antibióticos, agentes anti-sépticos e até mesmo debridamento) que são

comercialmente utilizados para controlar infecções e promover eficácia no processo

de cicatrização da ferida. No entanto, eles podem se mostrar insuficientes e algumas

feridas se tornam resistentes (3). Diversos estudos nos últimos anos demonstram

agentes naturais com potenciais efeitos antioxidantes e antiinflamatórios que podem

interferir no processo cicatricial da ferida diabética (1). Nesse contexto, as plantas

medicinais que são ricas em compostos fitoquímicos poderosos, são de interesse

para o tratamento de diversas doenças (3).

O uso de ervas medicinais na conduta de feridas remonta há séculos e

permanecem populares nos dias atuais devido suas atividades multifacetadas e

mínimos efeitos colaterais indesejáveis. Nos últimos anos, foram realizados grandes

progressos na demonstração do potencial da planta como medicamento para

cicatrização de feridas e esclarecendo seus mecanismos subjacentes (5). Esses

agentes geralmente influenciam uma ou mais fases do processo de cicatrização e

também estão envolvidas na desinfecção e no fornecimento de um ambiente

adequado para o processo de cicatrização (6).

De vários modelos animais que foram desenvolvidos para o estudo da

diabetes tipo 1 e tipo 2, o modelo diabético induzido por estreptozotocina (STZ) é

amplamente utilizado porque o procedimento experimental é simples de induzir

hiperglicemia gerando um animal com diabetes tipo 1 e o procedimento também

pode ser usado como modelo animal para diabetes tipo 2 desde que se inclua uma

oferta de dieta hiperlipídica aos animais (7).

Tendo em vista o alto nível de estresse oxidativo e inflamação persistente

associada ao atraso de cura em feridas diabéticas, o presente estudo será

conduzido para investigar o potencial benéfico de cura do tratamento tópico do óleo

extraído das folhas da planta Schinus molle, conhecida popularmente como

“pimenteria-bastarda”, em ratos controle e diabéticos.

5

2 JUSTIFICATIVA

Na medicina tradicional, os medicamentos à base de ervas estão descritas na

literatura científica com valor curativo para várias doenças. Durante muitos anos, as

plantas são utilizadas popularmente como remédio para vários distúrbios cutâneos e

dermatológicos, especialmente feridas e queimaduras. Embora existam opções

disponíveis comercialmente (analgésicos, antibióticos, anti-inflamatórios) para tratar

feridas cutâneas, a maioria dessas terapias é responsável por indesejáveis efeitos

colaterais. Os medicamentos à base de plantas tem características que os tornam

promissores no benefício da cicatrização de feridas, facilitando a desinfecção, o

debridamento e provisão de ambiente adequado para o processo de cura natural,

uma vez que são menos tóxicos e proporcionam menos efeitos colaterais em

comparação com os medicamentos convencionais. Portanto, é importante

estabelecer uma validação científica para o efeito medicinal de plantas como

medicina tradicional na cicatrização de feridas (8). O óleo extraído das folhas da

planta S. molle possui propriedades cicatrizantes dependentes de concentração,

sendo que nanocápsulas a 2% e o óleo essencial a 10% se mostraram mais

eficazes que o controle negativo em relação ao tratamento de feridas cutâneas em

ratos (9). Em ensaios por cromatografia já foi observado que algumas frações

extraídas da semente dessa espécie possuem efeitos anti-inflamatórios e

analgésicos (10). Além disso, os óleos essenciais extraídos da folha e fruto de S.

molle possuem propriedades antioxidantes e antimicrobianas, sugerindo seu

potencial uso em indústrias alimentares ou farmacêuticas (11).

3 HIPÓTESE

O estudo científico da utilização do óleo de S. molle que será empregado nas

lesões cutâneas experimentais terá efeitos benéficos frente ao processo de reparo

tecidual.

6

4 OBJETIVO

O trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos do tratamento tópico do óleo

extraído das folhas da planta S. molle frente ao processo de cicatrização de lesão

cutânea induzida experimentalmente em ratos Wistar controles e diabéticos, a partir

de análises macro e microscópicas do processo cicatricial dos animais tratados e

não tratados com o óleo.

4.1 Objetivos específicos

� Avaliar macroscopicamente os efeitos da aplicação tópica do óleo da planta

medicinal Schinus molle no aspecto geral da lesão cutânea, na sua contração

e reepitelização;

� Quantificar a espessura da neoepiderme após a lesão;

� Quantificar os leucócitos polimorfonucleares (PMN) e os mastócitos no tecido

de granulação na área da lesão;

� Quantificar a imunomarcação com anticorpo anti-CD31 para análise da

angiogênese no processo de cicatrização;

� Analisar qualitativamente e/ou quantitativamente a deposição e distribuição

das fibras de colágeno na matriz extracelular (MEC) da derme cicatricial.

7

5 METODOLOGIA

5.1 Obtenção do óleo a partir das folhas da planta

5.1.1 Coleta dos folhas de Schinus molle

As folhas de S. molle serão coletadas no município de Barbacena, Minas

Gerais, no período matutino, entre 6:30 e 7:30 horas.

5.1.2 Obtenção do óleo essencial

Para a extração do óleo essencial das folhas de S. molle será

empregado o método de hidrodestilação, em aparelho tipo Clevenger. O

hidrolato será extraído com diclorometano, em triplicata de 30 mL. Em seguida,

a solução será seca com sulfato de sódio anidro (Na2SO4) para retirar o

excesso de água e posteriormente filtrada. O solvente será removido por

pressão reduzida por meio de um evaporador rotativo e o óleo será conservado

em refrigerador até as análises e demais experimentos.

A concentração do óleo utilizada no presente estudo será de 5%, ou

seja, o óleo depois de obtido será diluído para posterior emprego nas lesões

cutâneas.

5.1.3 Análises químicas do óleo essencial

As análises dos constituintes químicos do óleo essencial serão

realizadas em cromatógrafo gasoso Shimadzu GC – 17A, equipado com uma

coluna capilar DB - 5 (30 m x 0,25 mm), filme = 0,25 µm e ionizado por impacto

eletrônico (IE) (70 e. V).

Os componentes do óleo serão identificados por meio da comparação

de seus espectros de massas e de seus índices de retenção com aqueles

existentes na literatura do equipamento. Os índices de retenção linear (índice

de Kovats) dos componentes serão calculados em relação aos tempos de

retenção de uma série de n-alcanos.

8

5.2 Amostra e procedimentos

Os procedimentos serão realizados em conformidade com a Resolução

Normativa nº 01, de 09 de julho de 2010, constante no Conselho Nacional de

Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O protocolo experimental foi

encaminhado para apreciação e autorizado pela Comissão de Ética no Uso de

Animais da Faculdade de Medicina de Barbacena (CEUA-FAME) (protocolo

número CEUA/02/1027, Anexo).

Serão estudados 56 ratos Wistar machos (7-8 semanas de idade),

pesando 200-250 g, obtidos de colônias do Centro de Biologia da Reprodução

da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) e mantidos no biotério do

Núcleo de Pesquisa e Extensão (NUPE) da FAME, sob condições controladas

(temperatura 21±2 ºC, umidade 60±10%, ciclo de luz invertido de 12 horas -

claro/escuro e ciclo de reposição de ar 15 min/h). Os animais serão

alimentados com ração balanceada padrão e água ad libitum.

Os animais serão divididos em dois grupos, o grupo Controle e o grupo

Diabético. Após a indução da diabetes tipo 1 no grupo Diabético, os animais

serão subdivididos em 8 grupos experimentais, conforme o dia estabelecido

para eutanásia para análise histológica da área da lesão:

a. grupo Controle 7 dias (n=7), grupo Controle tratado 7 dias (n=7), grupo

Controle 14 dias (n=7) e grupo Controle tratado 14 dias (n=7).

b. grupo Diabético 7 dias (n=7), grupo Diabético tratado 7 dias (n=7), grupo

Diabético 14 dias (n=7) e grupo Diabético tratado 14 dias (n=7).

No dia zero, a lesão será induzida em todos os animais dos 8 grupos,

ficando os animais alojados individualmente em gaiolas. A eutanásia dos

animais para análise microscópica da lesão será nos dias 7 e 14 de pós-

operatório (PO).

Para realização do procedimento cirúrgico experimental, os ratos serão

anestesiados com cetamina (100 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg), por via

intraperitoneal. Depois de anestesiados, os animais serão posicionados em

decúbito ventral e imobilizados em prancha, realizando-se a retirada manual

dos pelos na região dorsal do tórax de cada animal.

9

Em seguida, será criada uma lesão circular no dorso dos animais

experimentais pela retirada de fragmento cutâneo (epiderme e derme) de

10mm2 de diâmetro. Estabelecida a lesão e divisão dos grupos, a aplicação

diária do óleo da planta será realizada nos animais do grupo controle tratado e

diabético tratado, até o dia estabelecido para eutanásia.

Ao final do experimento, no 7º e 14° dias PO, os animais serão

anestesiados com Tiopental sódico para retirada do fragmento da ferida com

margem de pele íntegra no entorno, em profundidade até a fáscia muscular

para análises posteriores.

5.3 Indução da diabetes experimental

A diabetes será induzida nos ratos a partir de uma única dose de injeção

intravenosa de Estreptozotocina (Streptozotocin, STZ, Sigma-Aldrich, St. Louis,

MO, USA) na dose de 50 mg/kg de peso corporal diluído em 0.1 mol/L de

tampão citrato, pH 4,5. Nos animais controle será injetado tampão citrato

apenas. Após sete dias da injeção, o sangue da ponta da veia da cauda de

cada rato será utilizado para aferir a glicose através de glicosímetro. Os

animais serão considerados diabéticos se o nível de açúcar no sangue for igual

a 250 mg/dL ou superior (3).

5.4 Análises

5.4.1 Análise macroscópica

As feridas operatórias serão avaliadas macroscopicamente durante os

dias de PO, para observação do aspecto geral das lesões, verificando a

ausência ou presença de secreção e crosta.

5.4.2 Contração e reepitelização da área da lesão

Para avaliar a contração e a reepitelização da lesão, representada por

uma área de maior vermelhidão, a margem da ferida será traçada em

10

transparência colocada sobre ela. As lesões traçadas serão digitalizadas e a

área será avaliada usando o programa Image-Pro Plus. A mensuração será

realizada em todos os animais no dia zero, 7º e 14º dia PO.

A contração e reepitelização da lesão serão estimadas pela diferença

entre a área total da lesão no dia zero e a área que ainda estará descoberta

por um novo epitélio, caso esteja, sendo que os dados da contração e

reepitelização serão expressos em percentual.

5.4.3 Microscopia de luz

Cada fragmento (ferida e pele íntegra adjacente) será fixado em solução

de paraformaldeído a 4% diluído em tampão fosfato, pH 7,2, e processados de

acordo com a rotina histológica para microscopia de luz e inclusão em parafina.

Posteriormente, serão seccionados cortes da amostra com 5 µm de espessura

em micrótomo.

As secções serão coradas pelos métodos de Hematoxilina e Eosina (HE)

para análise de aspectos gerais, espessura da neoepiderme e quantificação de

leucócitos PMN; azul de toluidina para quantificação de mastócitos; picrosirius

red para análise das fibras de colágeno; e também serão imunomarcadas com

anticorpo anti-CD31 para análise da angiogênese.

Após processamento e coloração histológica, as lâminas serão

analisadas através de sistema de vídeo-microscopia. Os cortes histológicos

corados pela técnica do picrosirius red serão observados ao microscópio sob

luz polarizada. Fotomicrografias serão capturadas através da câmera acoplada

ao microscópio e o sistema de aquisição de imagens (Image Pro Plus versão

7.0).

5.4.4 Estereologia

Fotomicrografias das lesões serão analisadas a fim de estimar a

densidade numérica de leucócitos PMN por área (QA), bem como o número de

mastócitos. A QA pode ser definida como o número de perfis de células dentro

de uma área teste conhecida (expresso como células/µm2), sendo 3305 µm2 a

11

medida da área teste utilizada. Diversas fotomicrografias por grupo serão

avaliadas e todas as células dentro da área serão contadas, exceto as que

toquem a linha proibida (12). Para análise estereológica, a QA será realizada

através do sistema de vídeo-microscopia citado anteriormente.

O número de leucócitos PMN será quantificado na área da lesão em

cortes histológicos corados pela técnica de HE. Serão avaliados 10 campos

aleatórios (3305 µm2) de cada lâmina (por animal), em objetiva de 40x (13). Os

mastócitos serão quantificados no tecido de granulação em cortes histológicos

corados pela técnica de azul de toluidina. Serão avaliados 15 campos

aleatórios (3305 µm2) de cada lâmina (por animal), em objetiva de 40x (14).

A imunomarcação com o anticorpo utilizado será pelo emprego do

anticorpo monoclonal (Santa Cruz) pela técnica da imunoperoxidase, em cortes

histológicos da área lesão. A quantificação do anticorpo anti-CD-31, será feita a

partir dos vasos sanguíneos imaturos que serão identificados pelas células

positivas, no tecido de granulação e quantificados através da análise de 5

campos aleatórios em objetiva de 20x da área da lesão em sistema de vídeo-

microscopia. Os dados serão expressos como densidade de volume de vasos

sanguíneos (Vv [vasos sanguíneos]%) (15).

Serão incluídos controles negativos e positivos apropriados para o fluxo

de imunomarcação.

5.4.5 Morfometria

A espessura da neoepiderme será mensurada desenhando-se uma linha

fornecida pelo programa Image-Pro Plus, de um lado ao outro da neoepiderme,

a partir da junção dermoepidérmica até a extensão mais externa da camada

granulosa.

As mensurações serão realizadas em fotomicrografias obtidas pelo

sistema de vídeo-microscopia, em objetiva de 20x, de cortes histológicos da

lesão corados pela técnica de HE. Três campos aleatórios de cada lâmina (por

animal) serão analisados, com três mensurações cada campo. Os dados serão

expressos pela média das mensurações em cada lesão.

12

5.4.6 Avaliação das fibras de colágeno

Cortes histológicos da lesão corados com picrosirius red serão

observados ao microscópio sob luz polarizada, em objetiva de 10x e 20x, e

fotomicrografias serão obtidas para análise da deposição e organização das

fibras de colágeno na MEC da derme cicatricial. O método de picrosirius red

realça a birrefringência normal das fibras de colágeno, demonstrando que

quando espessas, elas aparecem fortemente birrefringentes e na cor amarelo-

avermelhada, característico de um tecido com alta densidade de fibras de

colágeno, enquanto as fibras delgadas são fracamente birrefringentes,

esverdeadas e indicam um tecido com baixa densidade de colágeno (15).

5.5 Análise estatística

Os dados serão apresentados como média e erro padrão da média. As

análises estatísticas serão realizadas pela comparação entre os grupos

controle e controle tratado e entre os grupos diabético e diabético tratado, nos

dias 7º e 14º PO. Valores de p<0,05 serão considerados estatisticamente

significantes. As análises serão calculadas com o programa GraphPad Prism

(GraphPad Software, São Diego, Califórnia, EUA) pelo Teste t ou análise de

variância, conforme permitirem a distribuição dos resultados.

13

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. KANT V.; GOPAL, A.; PATHAK, N. N.; et al. Antioxidant and anti-inflammatory potential of curcumin accelerated the cutaneous wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats, International Immunopharmacology, v.20, p.322–330, 2014. 2. International Diabetes Federation. 2015. IDF Diabetes Atlas. Available at http://www.diabetesatlas.org/ resources/ 2015-atlas.html 3. CHOKPAISARN, J.; CHUSRI, S.; AMNUAIKIT, T.; et al. Potential wound healing activity of Quercus infectoria formulation in diabetic rats, PeerJ, v.5, p.e3608, 2017. 4. THANGAVEL, P.; RAMACHANDRAN, B.; CHAKRABORTY, S.; et al. Accelerated healing of diabetic wounds treated with L-Glutamic acid loaded hydrogels through enhanced collagen deposition and angiogenesis: an in vivo study, Scientific Reports, v.7:10701, 2017. 5. ZHANG, X-N.; MA, Z-J.; WANG, Y.; et al. Angelica Dahurica ethanolic extract improves impaired wound healing by activating angiogenesis in diabetes, PLOS ONE, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177862, 2017. 6. NAJI, S.; ZAREI, L.; POURJABALI, M.; et al. The extract of Lycium depressum stocks enhances wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats, The International Journal of Lower Extremity Wounds, v.16(2), p.85–93, 2017. 7. KIM, K-J.; NAMGUNG, U.; CHO, C. S. Protective effects of Bogijetong decoction and its selected formula on neuropathic insults in Streptozotocin-induced diabetic animals, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, v.2017, 12p., 2017. 8. TUHIN, R. H.; BEGUM, M.; RAHMAN, S.; et al. Wound healing effect of Euphorbia hirta linn. (Euphorbiaceae) in alloxan induced diabetic rats, BMC Complementary and Alternative Medicine, 17:423, 2017. 9. HAKIM, A.; WAHED, W. A.; NAYAL, R. Evaluation of wound healing activity of Schinus molle fruits essential oil in rats, International Journal of Phamaceutical Sciences and Nanotechnology, v.9, 2016. 10. TAYLOR, A.; OYEDEJI, O. O.; AREMU, O.; et al. Assessment of the analgesic, anti-inflammatory and sedative effects of the dichloromethanol extract of Schinus molle, Eur Rev Med Pharmacol Sci, v. 20(2):372-80, 2016. 11. MARTINS, M. R.; ARANTES, S.; CANDEIAS, F. et al. Antioxidant, antimicrobial and toxicological properties of Schinus molle L. essential oils, J Ethonopharmacol, v. 151(1):485-92, 2014.

14

12. MANDARIM-DE-LACERDA, C. A. Stereological tools in biomedical research, Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 75, n.4, p. 469-486, 2003. 13. CARDOSO, J. F.; SOUZA, B. R.; AMADEU, T. P. et al. Effects of cigarette smoke in mice wound healing is strain dependent, Toxicologic Pathology, v.35, p.890–896, 2007. 14. AMADEU, T. P.; COSTA A. M. A. Nitric oxide synthesis inhibition alters rat cutaneous wound healing, J Cutan Pathol, v.33, p.465–473, 2006. 15. ROMANA-SOUZA, B.; NASCIMENTO, A. P.; MONTE-ALTO-COSTA, A. Propranolol improves cutaneous wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats, European Journal of Pharmacology, v.611, p.77–84, 2009.

15

7 CRONOGRAMA DAS ATIVIDADES

Mês Atividades semanais

Março � Lançamento do edital para o PIC

� Seleção dos alunos para o PIC

� Início do PIC

� Apresentação do projeto

� Discussão de artigos científicos

� Abordagem do manual de práticas em animais de

laboratório

� Conhecendo o biotério do NUPE / Capacitação do

aluno para o uso de animais no biotério

Abril � Projeto piloto para indução da diabetes

� Início do experimento no biotério (com duração de

aproximadamente 21 dias):

� Indução da diabetes nos ratos Wistar

� Protocolo cirúrgico (indução da lesão cutânea nos

ratos Wistar)

� Tratamento com óleo da planta medicinal

� Eutanásia dos animais

� Preparação do material a ser analisado

Maio � Processamento histológico do fragmento de lesão

� Realização de técnicas histológicas (colorações:

hematoxilina e eosina, azul de toluidina, picro sirius

red, resorcina fuccina de weigert)

Junho � Realização de técnicas histológicas

(imunohistoquímica)

Julho � Desenvolvimento da parte escrita do artigo científico

(Introdução / Materiais e Métodos...)

Agosto � Análise do material processado através dos

programas de computador (estereologia,

morfometria)

16

Setembro � Análise estatística

Outubro � Escrita dos resultados e discussão

Novembro � Escrita

� Submissão do artigo científico

Dezembro � Finalização do projeto

� À espera da publicação

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8 ORÇAMENTO

Itens de almoxarifado / biotério * Quantidade Cetamina 1 frasco Xilazina 2 frascos Material cirúrgico 1 Lâmina de bisturi 5 Prancha de plástico 2 Esparadrapo 1 Seringa e agulha (1ml e 5ml) 100 de cada Algodão 1 Gaze 1 Luvas (tamanho M e G) 5 Fitas para glicosímetro 1 cx com 50 * Itens que estarão disponíveis para uso do pesquisador no almoxarifado do biotério. Os itens já foram cotados e a verba destinada para tais compras. Itens para processamento histológico * Quantidade Álcool 100% 6 Xilol 3 Parafina 1 Forminhas para inclusão 28 Forminhas para os banhos 28 Corante Hematoxilina e Eosina 1 Corante Azul de Toluidina 1 Corante Picro-sirius-red 1 * O objetivo é realizar esses procedimentos de Histologia no Laboratório pertencente à Faculdade. Caso não seja possível, é de interesse a obtenção desses itens junto ao laboratório do Biotério, pois serão de uso rotineiro e imprescindível.

18

Itens para compra Quantidade Valor (R$) Total (R$) Animais (Ratos Wistar) 56 * * Streptozotocina 500mg (Sigma) 1 frasco 1.269,00 1.269,00 Tampão citrato 1 552,00 552,00 Punch metálico 10mm 1 82,80 82,80 Álcool 100% 6 9,75 58,50 Xilol 3 18,38 55,14 Paraformaldeído (500 g/diluir) 1 207,00 207,00 Pote estéril para armazenamento 56 56,00 56,00 Lâminas 10 cx / 50 3,80 38,00 Lamínulas 5 cx / 100 2,85 14,25

TOTAL 2.332,69

Kit para imunohistoquímica** 1 2.437,00 2.436,00 Anticorpo CD-31 (Sigma)** 1 1.516,00 1.516,00

TOTAL

3.952,00

* O valor de cada rato Wistar será cotado (o orçamento só pode ser realizado mediante certificado de aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA). ** O anticorpo e o kit para imunohistoquímica são de grande valia para uma melhor publicação científica. Além disso, outros projetos de PIC podem ser beneficiados com a utilização desses itens.

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9 ANEXO – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade

de Medicina de Barbacena (CEUA-FAME)

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