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EVALUACIÓN Y CONTROL DE COMUNIDADES MICROBIANAS EN CUEVAS TURÍSTICAS

Evaluación y control de comunidades microbianas en cuevas turísticas

© Irene Domínguez Moñino, 2014

Cubierta: Sala de la Cristalería de Dios, Gruta de las Maravillas (Aracena, Huelva)

Imprime: Copistería Delicias, S.L.

I.S.B.N.: 978‐84‐697‐2079‐0

Impreso en España – Printed in Spain

Evaluación y control de comunidades microbianas en cuevas turísticas

Memoria que presenta

la Licenciada en Biología Irene Domínguez Moñino

para optar al título de Doctora en Biología

por la Universidad de Sevilla.

Sevilla 2014

Evaluación y control de comunidades

microbianas en cuevas turísticas

Visado en Sevilla, Diciembre 2014

LOS DIRECTORES

Dra Dña. Valme Jurado Lobo Dr. D. Bernardo Hermosín Campos

Doctora Contratada en el Instituto de Científico Titular del Instituto de

Recursos Naturales y Agrobiología Recursos Naturales y Agrobiología

de Sevilla (IRNAS-CSIC) de Sevilla (IRNAS-CSIC)

LA TUTORA

Dra. Dña. Carolina Sousa Martín

Profesora Titular de la Universidad de Sevilla

Departamento de Microbiología y Parasitología

Facultad de Farmacia

DRA. DÑA. VALME JURADO LOBO, DOCTORA CONTRATADA EN EL INSTITUTO DE RECURSOS

NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES

CIENTÍFICAS Y DR. D. BERNARDO HERMOSÍN CAMPOS, CIENTÍFICO TITULAR DEL INSTITUTO DE

RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE

INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

CERTIFICAN: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Evaluación y control de

comunidades microbianas en cuevas turísticas”, presentada por la Licenciada en Biología IRENE

DOMÍNGUEZ MOÑINO para optar al grado de Doctora en Biología, ha sido realizada en el

departamento de Geoecología, Biogeoquímica y Microbiología Ambiental, bajo nuestra

dirección reuniendo todos los requisitos exigidos.

Y para que así conste, se expide y firma el presente certificado

En Sevilla, a 1 de Diciembre de 2014

Fdo: Dra Dña. Valme Jurado Lobo Fdo: Dr. D. Bernardo Hermosín Campos

DR. D. JOSÉ ENRIQUE FERNÁNDEZ LUQUE, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS

NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES

CIENTÍFICAS

CERTIFICA: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Evaluación y control de

comunidades microbianas en cuevas turísticas”, presentada por la Licenciada en Biología IRENE

DOMÍNGUEZ MOÑINO para optar al grado de Doctora en Biología, ha sido realizada en el

departamento de Geoecología, Biogeoquímica y Microbiología Ambiental, bajo la dirección de

la Dra. Dña. Valme Jurado Lobo y del Dr. D. Bernardo Hermosín Campos, reuniendo todas las

condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales.

Y para que así conste, se expide y firma el presente certificado

En Sevilla, a 1 de Diciembre de 2014

Fdo: Dr. D. José Enrique Fernández Luque

El trabajo de investigación que ha dado lugar a la presente memoria se ha realizado durante el período de disfrute de una Beca Predoctoral adscrita al Proyecto de Investigación de Excelencia de la Junta de Andalucía RMN 5137 (convocatoria 2009), cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), titulado “Observatorio Microbiológico de cuevas visitables: evaluación y control de comunidades fúngicas en cuevas sometidas al impacto de actividades turísticas”.

Agradecimientos

Me gustaría expresar mi agradecimiento a la Dra. Valme Jurado, al Dr. Bernardo Hermosín y al Dr. Cesáreo Sáiz Jiménez, por la confianza depositada en mí, que ha hecho posible la realización de este trabajo, así como por sus directrices y consejos, y por compartir conmigo sus enseñanzas fruto de tantos años de experiencia y esfuerzo personal y profesional. Les agradezco enormemente el apoyo que me han mostrado y la dedicación que han puesto en el desarrollo de mi tesis doctoral.

A la Dra. Carolina Sousa Martín, del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, por haber tutorizado el presente trabajo.

A Eva, ya que gracias a ella pude conocer y contactar con el grupo de investigación de Microbiología Ambiental y Patrimonio Cultural, dándome esta valiosa oportunidad.

A la Beca Predoctoral asociada al Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía RMN 5137 y al Consejo Superior de Investigaciones Científicas por haberme permitido desarrollar este proyecto en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla.

A los Ayuntamientos de Ardales, Aracena y Rincón de la Victoria, responsables de la Cueva de Ardales, Gruta de las Maravillas y Cueva del Tesoro, respectivamente, y al personal de las cuevas, por la ayuda prestada en la realización de los muestreos, la información proporcionada y el trato amable con el que siempre nos han recibido.

A Bernardo, Valme, Isabel y Miguel por acompañarme en los muestreos, de los que guardo tan buenos recuerdos. También quería agradecer a Miguel sus buenos consejos y la ayuda que me ha prestado, tanto en la resolución de dudas como en los trabajos de edición de la tesis, carteles, etc.

Me gustaría dar especialmente las gracias a mi compañera Isabel por su implicación en mi tesis, por todo lo que me ha ayudado desde el primer día que llegué, facilitándome mucho el trabajo, y por todos los buenos momentos que hemos pasado. Quería agradecerle su labor al enseñarnos el manejo del laboratorio y solucionarnos tantas dudas a todos los que hemos ido llegando al grupo.

Al resto de mis compañeros del grupo de Microbiología y Patrimonio, con los que he tenido la suerte de coincidir a lo largo de estos años, que han sido para mí una gran ayuda y apoyo, con los que he compartido y espero seguir compartiendo muy buenas vivencias, tanto dentro como fuera del trabajo. Muchas gracias a Leonila, Marta, Sara, Ángela, Pedro, Ana, Laura, Cynthia, Alfonso y Estefanía.

Gracias también a otros compañeros del IRNAS, Marina, Elena, José María, Paloma, Paula, Rocío, Fran, Pili, Marta, Ángeles, David,…, por hacer mi estancia en el centro aún más agradable.

A mis amigas, Loly, Raquel, Noelia, Marta, Sonia, Elena, Carmen y María, por todas las etapas y proyectos que hemos compartido, el apoyo que me han demostrado todos los años que llevamos juntas y por regalarme su amistad.

A mi familia. A mis padres, por los valores que nos han transmitido a mí y a mis hermanos, por animarnos siempre y apoyarnos en nuestras decisiones, y porque son el mejor modelo a seguir. A mis hermanos, Mari, Isa y Jose, y a mis sobrinos Rubén y Jorge, por la felicidad que me aportan. A Manoli y Alfonso, les agradezco toda la ayuda que me dan a diario y el cariño de tantos años. A Alfonso, por el gran apoyo que es para mí, y porque ésta sea una de las muchas experiencias que hemos vivido y que nos quedan por vivir juntos.

I

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 1

1.1. Cuevas 3

1.1.1. Cuevas turísticas 6

1.1.2. Impacto de las visitas 7

1.2. Diversidad microbiana en cuevas 9

1.2.1. Colonización microbiana en cuevas 14

1.2.2. Microorganismos patógenos en cuevas 17

1.3. Aerobiología 18

1.3.1. Concepto y breve historia de la aerobiología 20

1.3.2. Proceso aerobiológico 21

1.3.3. Métodos de muestreo aerobiológico 26

1.4. Objetivos de la tesis 30

CAPÍTULO 2. MATERIAL Y MÉTODOS 33

2.1. Aerobiología 35

2.1.1. Muestreador DUO SAS (Surface Air System) SUPER 360 36

2.1.2. Recogida de muestras 37

2.1.3. Incubación, recuento y aislamiento de colonias 37

2.1.4. Identificación de las colonias de bacterias y hongos 39

2.1.4.1. Extracción de ADN de bacterias 39

2.1.4.2. Extracción de ADN de hongos 39

2.1.4.3. Medida de la concentración de ADN 40

2.1.4.4. Amplificación de ADN mediante la reacción

en cadena de la polimerasa 40

II

2.1.4.5. Electroforesis en gel de agarosa 42

2.1.4.6. Purificación de productos de PCR 42

2.1.4.7. Secuenciación de productos de PCR 43

2.1.4.8. Identificación de las secuencias 43

2.1.5. Análisis de datos 43

2.2. Análisis de cuerpos fructíferos 45

2.2.1. Muestreo 45

2.2.2. Extracción de ADN 45

2.2.3. Clonación 46

2.3. Análisis de distintos tipos de muestras 47

2.3.1. Muestras de excrementos con colonizaciones fúngicas 48

2.3.2. Otras muestras colonizadas por hongos 48

2.3.3. Muestras de sedimentos 48

2.3.4. Muestras de chicles 49

2.4. Descripción de nuevas especies bacterianas 49

2.4.1. Muestras 49

2.4.2. Pruebas morfológicas y fisiológicas 50

2.4.2.1. Caracterización morfológica 50

2.4.2.2. Caracterización de cultivos 53

2.4.2.3. Caracterización bioquímica 56

2.4.3. Pruebas quimiotaxonómicas 61

2.4.3.1. Composición de ácidos grasos 61

2.4.3.2. Quinonas respiratorias 62

2.4.3.3. Lípidos polares 62

2.4.4. Pruebas moleculares 63

2.4.4.1. Extracción de ADN genómico 63

2.4.4.2. Identificación bacteriana 64

III

2.4.4.3. Análisis filogenético 65

2.4.4.4. Análisis del contenido G+C 65

2.4.4.5. Amplificación aleatoria de fragmentos de ADN polimórfico 65

2.4.4.6. Hibridación ADN‐ADN 66

2.5. Medios de cultivo 69

2.6. Reactivos 73

2.7. Soluciones y tampones 74

CAPÍTULO 3. AEROBIOLOGÍA DE LA CUEVA DE ARDALES 79

3.1. Localización y contexto geológico 81

3.2. Descubrimiento e historia 82

3.3. Descripción de la cavidad 83

3.4. Parámetros ambientales 86

3.4.1. Exterior 86

3.4.2. Interior 87

3.5. Estudios microbiológicos preliminares 87

3.6. Localización y recogida de muestras de aerobiología 89

3.7. Resultados y discusión 90

3.7.1. Diversidad de bacterias 92

3.7.2. Diversidad de hongos 104

CAPÍTULO 4. AEROBIOLOGÍA DE LA GRUTA DE LAS MARAVILLAS 109





4.4.1. Exterior 119

4.4.2. Interior 119

IV





CAPÍTULO 5. AEROBIOLOGÍA DE LA CUEVA DEL TESORO 147





5.4.1. Exterior 154

5.4.2. Interior 154





CAPÍTULO 6. OTROS RESERVORIOS DE MICROORGANISMOS 181

6.1. Comunidades fúngicas en distintos tipos de muestras 183

6.2. Comunidades microbianas de la superficie de los chicles 190

CAPÍTULO 7. ESTUDIO DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS 195

7.1. Especies bacterianas potencialmente patógenas 197

7.2. Especies de hongos potencialmente patógenos 202

7.3. Calidad del aire 205

V

CAPÍTULO 8. DESCRIPCIÓN DE NUEVAS ESPECIES 209

8.1. Descripción de especies del género Paracoccus 211

8.1.1. Descripción de la cepa 0511ARD5E5 212

8.1.2. Descripción de la cepa 0911TES13M5 217

8.2. Descripción de especies del género Bacillus 223

8.2.1. Descripción de la cepa 0911MAR22V3 224

8.2.2. Descripción de la cepa 0911TES21U5 231

CAPÍTULO 9. COMPARACIÓN DE LAS TRES CUEVAS 239

9.1. Comunidades bacterianas 241

9.2. Comunidades fúngicas 249

CAPÍTULO 10. CONCLUSIONES 255

BIBLIOGRAFÍA 259

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN

Capítulo 1. Introducción

3

1.1. CUEVAS

Existen muchas definiciones para el término karst. Según Jennings (1985), es un terreno con morfología e hidrología distintiva resultado de la combinación de una alta solubilidad de la roca y una porosidad secundaria bien desarrollada, que dan lugar a rasgos morfológicos y sedimentológicos superficiales (exokarst), y presenta una serie de rasgos subterráneos (endokarst) resultantes de la disolución, siendo las cavidades las unidades más características y esenciales de las morfologías endokársticas.

Para White (1988) karst es un tipo de terreno con una geomorfología particular caracterizada por depresiones cerradas (poljes, uvalas y dolinas), una red de drenaje subterránea y en muchos casos cavidades.

El término karst engloba una serie de morfologías externas y subterráneas que se generan como consecuencia de importantes procesos de disolución en áreas con rocas solubles carbonatadas (calizas y dolomías), en menor medida en evaporitas (yeso, anhidrita, halita), cuarcitas, y de modo excepcional en otros sustratos (basaltos, granitos, etc.) (Cuezva, 2008). Algunos ejemplos de cavidades kársticas son la Cueva del Mamut (Kentucky, EE. UU.) (Northup y Lavoie, 2001), la Cueva de Altamira (Cantabria, España), la Cueva de Nerja y la Cueva de la Pileta (Málaga, España). En otras cuevas, como la Cueva de Lechuguilla y las Cavernas de Carlsbad (Nuevo Méjico, EE. UU), su espeleogénesis se debe a la disolución de la caliza llevada a cabo por el ácido sulfúrico, el cual se forma por la oxidación del sulfuro de hidrógeno, cuando éste, en forma acuosa o gaseosa, alcanza la zona oxigenada al ascender por las fisuras de la roca (Northup y Lavoie, 2001; Cunningham y col., 1995).

La definición de una cueva se ha basado, asimismo, en una variedad de criterios. Por ejemplo, Ford (1988) y Ford y Williams (1989) definen como cueva a los conductos formados por disolución, de un tamaño mayor a 15 mm de diámetro o sección (tamaño mínimo correspondiente a la apertura mínima efectiva para el flujo turbulento), que se extienden, de forma continua, desde unos puntos de entrada de agua subterránea a unos puntos de salida. Para White (1984) es una oquedad en la roca que actúa como conducto para un flujo de agua, ocasional o continuo, entre puntos de entrada como las simas o diversos conductos preferenciales de infiltración y puntos de salida como manantiales o goteos.

El dióxido de carbono está implicado en los procesos de disolución de la roca y, como consecuencia, en los mecanismos de espeleogénesis. Sus niveles están controlados por las diferencias en las presiones parciales entre el agua de la superficie y el aire de la cavidad (Fernandez‐Cortes y col., 2006; Milanolo y Gabrovšek, 2009), y muestran variaciones estacionales y espaciales (Fernandez‐Cortes y col., 2006). Los cambios en la presión parcial de


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dióxido de carbono en la cueva pueden potenciar la precipitación de la roca, o generar aguas de condensación agresivas, aumentando los efectos de corrosión sobre rocas y espeleotemas (Milanolo y Gabrovšek, 2009).

Las cavidades kársticas someras se ven afectadas por cualquier actividad desarrollada tanto en su interior, como en la zona de influencia exterior. Las condiciones microambientales y su estabilidad pueden ser alteradas directamente por el hombre, bien por acciones en el interior de la cueva, e indirectamente, por actividades realizadas en el área exterior o área de influencia. Las actividades que se desarrollan en el exterior pueden producir cambios en la composición química del agua de infiltración por fenómenos de contaminación: actividades agrícolas, industriales, etc., cambios en la morfología del karst, disminución de la cobertera rocosa, modificación de la red de drenaje, e incluso problemas de estabilidad (tanto por actividad minera en superficie, como por la construcción de infraestructuras) que repercuten de forma indirecta sobre las condiciones ambientales del interior de la cavidad (Cuezva, 2008).

La influencia de las visitas sobre la temperatura del aire o de la roca del interior tiene un marcado efecto en las cavidades turísticas (Cuezva, 2008). El cálculo de la condensación de vapor de agua y estimación de la corrosión por efecto de los visitantes, por ejemplo, en la Cueva de Altamira (Sanchez‐Moral y col., 1999) resulta fundamental para evaluar el efecto nocivo sobre el arte rupestre.

Desde el punto de vista de la conservación del microambiente kárstico, el suelo externo tiene un papel importante, constituyendo una primera membrana o filtro de las oscilaciones externas. Su espesor, composición y textura (porosidad‐permeabilidad) condicionan las características del medio subterráneo, ya que actúa como zona de captación y transmisión del agua meteórica, y en él tienen lugar procesos micro y macrobiológicos con generación y consumo de dióxido de carbono. Por tanto, condiciona la calidad y cantidad de agua que llega al sistema interno (Sánchez‐Moral y col., 2008).

La concentración de dióxido de carbono y radón en la atmósfera de la cueva es un parámetro indicativo de la circulación del aire de la cavidad (Cigna, 2005). La distribución de los gases en las cuevas guarda relación con la morfología de las mismas y la circulación del aire, y su evolución está influenciada por los parámetros microclimáticos, tales como la temperatura, la presión barométrica, la lluvia, la actividad biogénica y la producción de dióxido de carbono (Fernandez‐Cortes y col., 2006).

El radón (222Rn) es un gas noble radiactivo, inodoro e incoloro, que emana de suelos, rocas, sedimentos y agua. Una exposición prolongada a este gas tiene efectos perjudiciales sobre la salud. Por tanto, supone un factor de riesgo para los trabajadores y los visitantes de


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las cuevas, ya que en éstas el radón puede alcanzar concentraciones elevadas. Los niveles de radón en las cuevas están influenciados por diversos factores, como el contenido de radio en las rocas y los sedimentos, la porosidad, el flujo de aire y agua, la presión atmosférica y los terremotos (Cigna, 2005; Lario y col., 2005).

Las cuevas están aisladas geológicamente de la superficie y desprovistas de luz natural, por lo que la cantidad de energía que entra es limitada (Barton y Jurado, 2007). Las condiciones ambientales varían a lo largo de la cavidad. En la entrada de la cueva, la presencia de luz favorece la aparición de organismos fotosintéticos (algas, líquenes, musgos y plantas), que actúan como una fuente de nutrientes para el desarrollo de otros organismos y que van disminuyendo conforme se avanza hacia el interior. En muchas cuevas turísticas se instalan sistemas de iluminación artificial, lo que da lugar a la colonización de la zona en la que incide la luz por cianobacterias, algas y musgos, a los que se asocian otros microorganismos heterótrofos, como bacterias y hongos. Este es el caso de la Cueva de Tito Bustillo (Asturias), en la que la superficie de la roca, los espeleotemas y el suelo aparecían cubiertos por una película microbiana de organismos fotosintéticos (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a), y de la Cueva de Lascaux (Montignac, Francia), en la que las manchas verdes debidas al crecimiento del alga Bracteococcus minor afectaron a las pinturas rupestres (Lefèvre, 1974). En el interior de las cavidades, generalmente en ausencia de luz, aparecen alternativas a la fijación de carbono, como la quimiolitoautotrofía (Pašić y col., 2010).

La biota en la cueva depende fundamentalmente de la entrada de materia orgánica de la superficie, pudiendo proceder de las plantas, cuyas raíces pueden penetrar en la cueva, o de animales, como el guano de los murciélagos. Sin embargo, la mayor parte de esta materia orgánica se introduce en la cueva, principalmente, disuelta en las aguas de percolación (Saiz‐Jimenez y Hermosin, 1999), transportada por los ríos subterráneos o por las corrientes de aire (Pašić y col., 2010).

La alteración de las variables ambientales y la entrada de materia orgánica en el interior de las cavidades, repercuten en el equilibrio de los procesos geoquímicos y de los organismos que habitan en ellas, comprometiendo su conservación.


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1.1.1. CUEVAS TURÍSTICAS

El territorio español cuenta con más de treinta mil cavidades conocidas, exploradas y topografiadas, muchas de las cuales están habilitadas para las visitas turísticas, ofreciendo algunas de ellas la posibilidad de realizar espeleoturismo (http://www.cuevasturisticas.es). El turismo subterráneo constituye la actividad económica principal en numerosas áreas kársticas (Fernández‐Cortés y col., 2008).

En 1997 se creó la Asociación de Cuevas Turísticas Españolas (ACTE), que reúne en la actualidad a 34 cavidades turísticas en España peninsular, Baleares y Canarias. Muchas de estas cuevas han sido declaradas Monumentos Naturales y otras Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO. El objetivo de esta asociación es promocionar el turismo subterráneo, promoviendo la conservación y la explotación sostenible de las cuevas, así como el estudio y los trabajos de investigación que contribuyan a su conocimiento.

En la actualidad, la Comunidad Autónoma de Andalucía, junto con Cantabria, es la región española con mayor número de cavidades turísticas, representando entre el 15 y el 20% del total (Fernández‐Cortés y col., 2008). La primera cavidad andaluza en recibir visitas turísticas fue la Cueva de Ardales o de Doña Trinidad (Ardales, Málaga) en 1852, cuya visita estaba incluida dentro de las actividades programadas para los clientes del balneario hidrotermal de la localidad vecina de Carratraca. Fue declarada Monumento Nacional en 1931 y Bien de Interés Cultural en 1992 (Cantalejo y col., 2006a). Otro de los acontecimientos más relevantes fue la apertura al público de la Gruta de las Maravillas (Aracena, Huelva) en 1914, reforzando la oferta turística de interior en la comarca onubense. Por otra parte, la apertura turística de la Cueva de Nerja (Nerja, Málaga) en 1960, un año después de su descubrimiento, supuso uno de los motores para el desarrollo turístico de esta zona costera malagueña. Esta cavidad fue declarada Monumento Histórico Artístico en 1961 y Bien de Interés Cultural en 1985 (Fernández‐Cortés y col., 2008). Contiene una secuencia ininterrumpida de restos arqueológicos y pinturas prehistóricas desde el Paleolítico Superior (20.000 A.C.) hasta la Edad de Bronce (1.800 A.C.). En la actualidad, recibe medio millón de visitantes anualmente (Docampo y col., 2010).

Muchas de las cuevas son interesantes desde el punto de vista cultural, ya que albergan vestigios de ocupaciones humanas prehistóricas y diversas manifestaciones de arte rupestre. La Cueva de Ardales, Cueva del Tesoro (Rincón de la Victoria, Málaga), Cueva de la Pileta (Benaoján, Málaga) y Cueva de los Murciélagos (Zuheros, Córdoba) son algunos ejemplos de este tipo de cavidades. En otras cuevas la oferta turística está enfocada a la importancia de sus formaciones geológicas, riqueza de espeleotemas y presencia de lagos naturales y cauces de agua. Este es el caso de la Cueva de Nerja, la Gruta de las Maravillas y la Cueva del Tesoro.


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Algunas cavidades también pueden recibir otros usos, como la organización de espectáculos a los que acude un gran número de visitantes (Cueva del Tesoro y Cueva de Nerja), o su utilización como restaurante (Cueva de los Majuelos, Pegalajar, Jaén). Otro atractivo turístico es la posibilidad de realizar una visita espeleológica a zonas más inaccesibles de la cavidad, no incluidas en el itinerario turístico habitual, como ocurre en la Cueva de las Ventanas (Piñar, Granada) y en la Cueva de Nerja (Fernández‐Cortés y col., 2008).

Los criterios de explotación de las cavidades turísticas son diversos, tales como la duración de la visita, el número de personas por grupo y el recorrido. Pero, de forma general, la adopción de estos criterios no está orientada a garantizar la conservación del entorno subterráneo, para lo cual se tendría que determinar la capacidad de carga de visitas de la cavidad controlando espacial y temporalmente una serie de parámetros físico‐químicos (Fernández‐Cortés y col., 2008). El término capacidad de carga de visitas hace referencia al número máximo de visitantes por unidad de tiempo en una cueva determinada, que no implique la modificación de un factor o parámetro medioambiental crítico por encima de sus límites de fluctuación naturales. Entre estos parámetros se encuentran la temperatura del aire, humedad, concentración de dióxido de carbono, composición del agua, sustancias biológicas (biomasa, detritos orgánicos, etc.), además de otros parámetros restringidos a algunas cuevas o a partes de ellas, como el sulfuro de hidrógeno atmosférico en zonas donde circulan aguas sulfurosas (Cigna, 1993) o la elevada concentración de radón, como en la Cueva de Castañar de Ibor (Cáceres, España).

1.1.2. IMPACTO DE LAS VISITAS

Las cavidades subterráneas se caracterizan por ser sistemas frágiles, con unas condiciones ambientales estables susceptibles de sufrir alteraciones como consecuencia de la presencia humana y de las actividades antropogénicas desarrolladas tanto en el interior como en el exterior. La alteración del delicado equilibrio entre las condiciones geoquímicas y ambientales origina procesos de corrosión mineral y colonización microbiana de la roca (Fernandez‐Cortes y col., 2011).

Las actuaciones municipales, agrícolas, ganaderas e industriales realizadas en la superficie afectan a: la disponibilidad de agua de los acuíferos, la red de drenaje, la cantidad y composición química del agua de infiltración (variaciones en la concentración de dióxido de carbono, aporte de materia orgánica y de contaminantes) que penetra en la cueva, el intercambio gaseoso entre el interior y el exterior, la morfología del karst, la cobertura vegetal,


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etc., lo cual tiene repercusión en las condiciones del sistema kárstico subterráneo (LaMoreaux y col., 1997).

Las primeras evidencias del impacto del hombre en las cuevas corresponden a la presencia de manifestaciones artísticas y de vestigios prehistóricos y arqueológicos derivados de su ocupación, lo que es considerado como parte del patrimonio cultural. Por otra parte, los efectos del vandalismo y del acondicionamiento de las cavidades para su explotación turística, suponen un gran impacto en las condiciones de las cuevas (Jiménez‐Sánchez y col., 2011).

Es muy común la instalación de sistemas de iluminación artificial para el acondicionamiento turístico de las cavidades. La luz incandescente da lugar a un incremento en la temperatura en las inmediaciones del foco de luz y, por tanto, a un decrecimiento en la humedad relativa, lo que afecta a la espeleogénesis. Además se producen colonizaciones de organismos fotótrofos en las zonas iluminadas, que causan un efecto antiestético y que pueden inducir corrosión bioquímica de la roca. Otra de las actuaciones que se suelen llevar a cabo, es la apertura de entradas artificiales para facilitar el acceso de las visitas, lo cual contribuye a la introducción de microorganismos procedentes del exterior y modifica la circulación natural del aire, causando cambios importantes en las condiciones microclimáticas (Cigna, 1993).

La entrada del hombre en una cueva modifica el equilibrio ecológico ya que, debido a su propio metabolismo, desprende vapor de agua por la transpiración corporal y la respiración, irradia calor a través de la piel, consume oxígeno y emite dióxido de carbono mediante la respiración. Esto origina un incremento de la temperatura y de las concentraciones de vapor de agua y dióxido de carbono en el interior de la cavidad (Hoyos y col., 1998; Fernandez‐Cortes y col., 2011), que va en función de las características físicas de los visitantes (peso, altura, edad, etc.), del tiempo de permanencia en el interior de la cueva y de las características morfométricas de la misma, principalmente de su volumen (Sánchez‐Moral y col., 2008).

Por tanto, como se indicó anteriormente, para una gestión sostenible de las cavidades turísticas es necesario definir un umbral de equilibrio que permita establecer un régimen de visitas que asegure su conservación, es decir, es importante determinar la capacidad de visita de cada cavidad (Hoyos y col., 1998).


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1.2. DIVERSIDAD MICROBIANA EN CUEVAS

Los microorganismos ocupan todos los nichos de la biosfera, incluyendo los ambientes subterráneos, como las cuevas. Éstas son consideradas ecosistemas oligotróficos y, debido a sus condiciones estables de temperatura y elevada humedad relativa, cercana a la saturación, constituyen un hábitat favorable para el crecimiento de los microorganismos. Estos son capaces de colonizar la superficie de la roca, utilizando una amplia variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos, por lo que pueden causar el biodeterioro de los materiales, poniendo en peligro la conservación de la cueva. La alteración de los parámetros ambientales en la cavidad, debido a las corrientes de aire o al impacto de las visitas, puede afectar al equilibrio de las comunidades microbianas, influyendo tanto en su concentración como en su composición (Fernandez‐Cortes y col., 2011). Por otra parte, un aspecto importante a tener en cuenta, es la presencia en cuevas de bacterias y hongos potencialmente patógenos para la salud humana (Jurado y col., 2010a), que pueden afectar principalmente a personas inmunodeprimidas. Por lo tanto, para garantizar la conservación de las cuevas turísticas y para minimizar los riesgos para la salud derivados de las visitas, es necesario el conocimiento de las comunidades microbianas presentes y de los procesos de dispersión de los microorganismos, así como la detección de posibles brotes microbianos.

Los microorganismos son capaces de colonizar y desarrollarse en este ambiente, a priori poco favorable, debido a su gran versatilidad metabólica. Las comunidades microbianas adquieren la energía mediante distintos mecanismos, incluyendo la fijación de gases atmosféricos (compuestos orgánicos volátiles, dióxido de carbono y nitrógeno), la oxidación y reducción de metales, como Fe(II) y Mn(II), presentes en las rocas de la cueva y la utilización de compuestos aromáticos procedentes de la superficie disueltos en el agua de percolación. Muchos de los microorganismos presentes en el medio subterráneo proceden del exterior y han sido introducidos en la cueva mediante las corrientes de aire, el agua de infiltración, los animales o la actividad humana. Se estima que la cantidad de microorganismos que se encuentran en una cueva puede alcanzar las 106 células/gramo de roca (Barton y Jurado, 2007).

Los microorganismos presentes en la cueva establecen entre sí asociaciones mutualistas en las que, las especies capaces de captar y catabolizar los nutrientes disponibles, liberan productos metabólicos secundarios que soportan a otras especies, las cuales a su vez fijan otros nutrientes del ambiente, que pueden ser utilizados por las primeras (Barton y Jurado, 2007).

Según algunos autores, las bacterias litotróficas actúan como productores primarios en ausencia de luz, y soportan el crecimiento de microorganismos heterótrofos, por lo que juegan


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un papel importante en el ecosistema de algunas cuevas al ser el primer nivel de la cadena trófica (Sarbu y col., 1996; Hose y col., 2000).

La diversidad microbiana en cuevas es elevada, y los estudios para su identificación y caracterización se llevan a cabo mediante técnicas tradicionales de cultivo y técnicas de biología molecular. Las técnicas dependientes de cultivo sólo permiten detectar una pequeña fracción de los microorganismos presentes en las comunidades naturales, ya que muchos de estos microorganismos son difíciles de cultivar debido a que pueden permanecer en estado de inactividad durante parte de su ciclo de vida (Gonzalez y Saiz‐Jimenez, 2005), y a que tienen requerimientos nutricionales específicos, como es el caso de los microorganismos que se encuentran en cuevas, la mayoría de ellos oligotrofos o quimiolitotrofos (Barton y Jurado, 2007). Estas limitaciones son superadas por las técnicas de biología molecular independientes de cultivo, las cuales se basan en la detección de los ácidos nucleicos de los microorganismos y, por tanto, permiten conocer una mayor diversidad de los mismos presentes en las comunidades naturales (Gonzalez y Saiz‐Jimenez, 2005). Sin embargo, las técnicas moleculares no ofrecen ninguna información sobre las características fisiológicas, por lo que es importante el empleo de métodos de cultivo, mediante los que se obtienen cultivos puros de los microorganismos, y proporcionan la posibilidad de estudiar sus actividades metabólicas y determinar su papel en la naturaleza e implicación en el biodeterioro (Piñar y col., 2002).

La combinación de métodos de cultivo y de técnicas de biología molecular basadas en la amplificación del ARNr 16S, en el caso de procariotas, y del ARNr 18S y la región contenida entre los espaciadores internos transcritos (ITS), en el caso de eucariotas, permite por tanto, la identificación de los miembros de las comunidades microbianas naturales.

En cuanto a la diversidad bacteriana descrita en cuevas, se han encontrado gran cantidad de miembros de los filos Proteobacteria, Nitrospira, Firmicutes, Actinobacteria, Acidobacteria y Bacteroidetes, entre otros (Barton y Jurado, 2007; Pašić y col., 2010; Zhou y col., 2007). El filo Proteobacteria es el más abundante en cuevas, seguido de Actinobacteria, Chlorobi/Bacteroidetes, Chloroflexi, Acidobacteria, Firmicutes y Verrucomicrobia (Lee y col., 2012). Aunque el filo Proteobacteria represente la mayor parte de las bacterias, detectadas mediante técnicas moleculares, la mayoría de las bacterias cultivadas corresponden al filo Actinobacteria (Groth y col., 1999; Barton y col., 2007).

El filo Proteobacteria podría tener un papel clave en los procesos de los ciclos biogeoquímicos en las cuevas (Zhou y col., 2007). Se trata de bacterias con un metabolismo muy versátil, capaces de crecer a partir de una gran diversidad de materia orgánica, muchos de sus miembros son saprófitos, y se encuentran comúnmente en suelos y aguas. Generalmente no crecen bajo condiciones estresantes de pH, temperatura, nutrientes o tensión de agua


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(Ikner y col., 2007). Aparece como un grupo mayoritario en las aguas de infiltración, en las comunidades bacterianas que crecen sobre las pinturas paleolíticas (Laiz y col., 1999; Schabereiter‐Gurtner y col., 2002b) y en las colonizaciones amarillas, grises y blancas de las paredes de la Cueva de Altamira (Portillo y col., 2008, 2009). Las bacterias de este grupo están presentes de forma predominante también en las comunidades bacterianas de las paredes de la Cueva de Tito Bustillo (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a) y en los sedimentos de la Cueva del Viento (Dakota del Sur, EE. UU.) (Chelius y Moore, 2004).

Los miembros del filo Nitrospira son quimiolitoautótrofos obligados que obtienen la energía para su crecimiento a partir de la oxidación de nitrito (Pašić y col., 2010). Este grupo constituye una proporción significativa de las comunidades bacterianas encontradas en la superficie de las rocas en la Cueva de Tito Bustillo (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002b). El nitrógeno es un nutriente limitante en cuevas y, a pesar de la alta energía necesaria para su fijación, se han identificado una gran proporción de especies microbianas fijadoras de nitrógeno y nitrificantes (Barton y Jurado, 2007).

El filo Acidobacteria es abundante en varias cuevas kársticas. Según estudios independientes de cultivo, es un componente significativo de las comunidades microbianas presentes en las pinturas paleolíticas de la Cueva de Tito Bustillo (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a) y de la Cueva de la Garma (Cantabria, España) (Schabereiter‐Gurtner y col., 2004), en catacumbas romanas (Zimmermann y col., 2006) y en sedimentos de la Cueva del Viento (Chelius y Moore, 2004).

La abundancia de representantes del filo Actinobacteria en las cuevas sugiere que se trata de un hábitat particularmente favorable para este grupo de microorganismos, los cuales son capaces de adaptarse a bajas temperaturas y a condiciones oligotróficas. Estas bacterias están implicadas en el biodeterioro de las pinturas rupestres en cuevas (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a, b, 2004) y en pinturas murales en otros ambientes hipogeos (Diaz‐Herraiz y col., 2013, 2014), e intervienen directa o indirectamente en procesos constructivos de biomineralización en cuevas (Laiz y col., 1999; Cuezva y col., 2012). Por otra parte, constituyen una fuente de sustancias bioactivas derivadas de su metabolismo secundario, como antibióticos y sustancias con actividad antitumoral, antiviral, inmunológica y agrobiológica (Jurado y col., 2010a).

Los miembros del filo Firmicutes están ampliamente distribuidos en la naturaleza y a menudo se encuentran en ambientes bajo condiciones extremas, siendo los procariotas que muestran mayor resistencia a la desecación y al estrés nutricional. Se ha descrito la presencia de representantes de este filo en varias cavidades subterráneas, como la Cueva de Altamira


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(Portillo y col., 2008), Cavernas de Kartchner (Arizona, EE. UU.) (Ikner y col., 2007), Cueva del Mamut y Cueva de Lechuguilla (Lavoie y Northup, 2006).

Las comunidades fúngicas son otro grupo de microorganismos de gran relevancia en cuevas. Los hongos se encuentran ampliamente distribuidos en todos los ambientes, incluido el subterráneo, ya que tienen una alta capacidad de adaptación gracias a su versatilidad metabólica. En las cuevas constituyen un grupo heterogéneo, siendo capaces de colonizar diferentes sustratos, como excrementos de animales que habiten en el interior de las cavidades o que ocasionalmente puedan entrar en ellas (Mulec, 2008), restos vegetales, madera, cadáveres de artrópodos, etc. (Jurado y col., 2008). Los hongos actúan como los principales degradadores de materia orgánica en las cuevas.

La gran abundancia de hongos entomófilos y/o entomopatógenos en cuevas pone de manifiesto la importancia de los artrópodos como vectores para la dispersión de hongos, que ha sido descrita previamente en el caso de la Cueva de Lascaux (Bastian y col., 2009c) y en otros ambientes hipogeos (Jurado y col., 2008). Este es el caso de especies de hongos como Beauveria bassiana y Engyodontium album (Bastian y col., 2009a).

Los hongos establecen consorcios microbianos complejos con otros microorganismos (Mulec, 2008), como bacterias y cianobacterias. En la Cueva de Lechuguilla se observaron asociaciones entre hongos y bacterias, en las que las bacterias quimiolitoautótrofas soportaban el crecimiento de bacterias quimioheterótrofas y de gran variedad de hongos (Cunningham y col., 1995). En otros casos, el micelio de los hongos constituye un sustrato para el crecimiento de bacterias (Docampo y col., 2010). Además, los hongos establecen interacciones en las que, tanto hongos como bacterias, son capaces de utilizar la materia orgánica producida por los organismos fotótrofos (algas y cianobacterias), y como consecuencia liberan compuestos orgánicos que solubilizan los minerales del sustrato (Albertano y Urzì, 1999).

La diversidad de los organismos que habitan en las cuevas se ve afectada por la entrada de visitantes. Según Sáiz‐Jiménez (2010), la apertura de la cavidad repercute en la composición original de los microorganismos autóctonos, los cuales se encontraban formando comunidades estables. Esto se debe a diversos motivos, entre los que cabe destacar:

‐ El establecimiento de corrientes de aire que contribuyen a la dispersión de microorganismos a distintas salas de la cueva y que pueden introducir microorganismos procedentes del exterior.


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‐ El aporte de materia orgánica, transportada en los zapatos, la ropa o la piel, que proporciona nuevos microhábitats y nutrientes (Lavoie y Northup, 2006), lo que favorece el crecimiento de determinados microorganismos frente a otros, desplazando el equilibrio ecológico.

El grado de impacto humano en las cuevas se ve reflejado en la filogenia de las comunidades bacterianas presentes. Generalmente la diversidad bacteriana disminuye con el aumento del impacto antrópico. En estudios llevados a cabo en las Cavernas de Kartchner, la mayoría de las bacterias aisladas pertenecían a tres filos diferentes, Actinobacteria, Firmicutes y Proteobacteria. En las zonas de la cueva en las que el impacto del hombre es mayor predominan los miembros del filo Proteobacteria, lo que puede deberse a que estas áreas reciben mayor aporte de materia orgánica, tanto de origen antropogénico (cabellos, células epiteliales, fibras de la ropa, etc.) como derivada de las colonizaciones verdes en las proximidades de los puntos de iluminación artificial. Así la presencia de los géneros Pseudomonas, Sphingomonas y Alcaligenes en estas zonas parece estar relacionada con su capacidad para degradar una amplia variedad de sustratos orgánicos, incluyendo compuestos aromáticos. En las zonas de la cavidad con un impacto antrópico bajo o intermedio, el grupo bacteriano mayoritario corresponde al filo Firmicutes, cuyos miembros tienen gran resistencia a la desecación y a condiciones de escasez de nutrientes (Ikner y col., 2007).

La presencia de algunas especies bacterianas en las cuevas se considera como indicadora del impacto humano. Este es el caso de Bacillus spp., Escherichia coli y Staphylococcus aureus, presentes en altas concentraciones en áreas con un gran impacto antrópico en la Cueva de Lechuguilla (Lavoie y Northup, 2006).

Las comunidades fúngicas también se ven afectadas como consecuencias de las visitas. Los hongos son capaces de degradar los residuos de origen antropogénico, encontrándose mayores concentraciones de estos en las zonas de la cueva con mayor contaminación debida a la actividad del hombre. En otras zonas de las cuevas se encuentran colonizando sustratos como excrementos y madera. Estos hechos se observaron en unas cavidades kársticas siberianas, siendo los géneros de hongos dominantes Mucor, Penicillium y Chrysosporium, además de levaduras (Khizhnyak y col., 2003).

En la Cueva de Castañar de Ibor el vómito de un visitante supuso un gran aporte de materia orgánica, que originó una rápida colonización por Mucor circinelloides y Fusarium solani a las pocas horas del accidente. Ambas especies son capaces de ocupar un hábitat rápidamente con unas elevadas tasas de reproducción. Dos meses después del incidente se hallaron micelios blancos sobre los sedimentos del suelo en los que se identificaron distintas especies de hongos que correspondían a colonizadores secundarios, entre los que destacaban


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Mucor racemosus, Fusarium oxysporum, Chaetomium globosum, Mortierella alpina, Hypocrea lixii, Aspergillus ustus, Paecilomyces lilacinus, Cosmospora consors y Penicillium sp. (Jurado y col., 2010b).

En cuevas como las de Altamira y Lascaux el turismo masivo ha ocasionado graves problemas de colonización por microorganismos, por lo que fueron cerradas al público y las visitas se desviaron a las réplicas de las cuevas.

La alteración del delicado equilibrio ecológico existente entre las comunidades microbianas presentes en las cuevas origina cambios inesperados en la biodiversidad, dando lugar a brotes de colonizaciones secundarias por parte de bacterias y hongos indeseados. Esto es debido a que las comunidades microbianas autóctonas producen compuestos antifúngicos, actuando como agentes de control biológico, protegiendo la superficie de la roca frente a colonizaciones de hongos. El hecho de que no se hayan encontrado hongos en las paredes colonizadas por bacterias, en la Cueva de Altamira, corrobora esta hipótesis (Jurado y col., 2009). Como medida preventiva para evitar posibles brotes de colonización se debe proceder a la eliminación de los hongos que crecen sobre depósitos de materia orgánica, como excrementos y restos vegetales y a la recogida de los sedimentos adyacentes (Jurado y col., 2010b).

1.2.1. COLONIZACIÓN MICROBIANA EN CUEVAS

Los microorganismos son capaces de colonizar la superficie de la roca en las cuevas, pudiendo intervenir en los procesos de precipitación y disolución de los minerales que la constituyen. Los microorganismos están implicados, por una parte, en procesos constructivos de formación de espeleotemas y de otras estructuras de origen biogénico (por ejemplo, moonmilk, U‐loops y pool fingers) (Barton y Jurado, 2007; Northup y Lavoie, 2001) y, por otra, en procesos destructivos que afectan a la roca y a los espeleotemas.

Los procesos de precipitación pueden ser pasivos o activos. En los primeros, los microorganismos actúan como centro de nucleación para el crecimiento de los cristales y, en los segundos, los microorganismos producen enzimas que intervienen en la mineralización. Los hongos, algas, cianobacterias y bacterias heterotróficas están implicados en la precipitación de carbonato cálcico. La corrosión y la disolución de la superficie mineral causada por microorganismos pueden ocurrir mediante ataque mecánico o por secreción de exoenzimas y de compuestos ácidos, como el ácido sulfúrico, dando lugar al deterioro de los materiales. Son de especial interés los procesos de disolución que afectan a paredes y espeleotemas como


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consecuencia de la acidificación causada por bacterias oxidantes de hierro, azufre y manganeso (Northup y Lavoie, 2001).

En la Cueva de Altamira se han encontrado colonizaciones microbianas de tres coloraciones diferentes (amarillas, blancas y grises), de las cuales las blancas y las grises están relacionadas con procesos de biomineralización. Las colonizaciones se encuentran cubriendo diversos sustratos (roca caliza y dolomías, espeleotemas de calcita, arcilla de los sedimentos y áreas pigmentadas) y su densidad disminuye progresivamente hacia el interior de la cueva. En las zonas donde las fluctuaciones de los parámetros microclimáticos son mayores, se encuentra una mayor diversidad de estas comunidades microbianas y una menor capacidad de biomineralización. Las bacterias pueden captar el dióxido de carbono directamente de la atmósfera de la cueva o, mediante reacciones químicas, a partir del sustrato sobre el que se encuentran. Como consecuencia se produce una disminución del pH que da lugar a la disolución de la caliza. La liberación de Ca2+ en la solución que rodea a las bacterias puede originar la precipitación mineral en periodos de bajos niveles de humedad y/o dióxido de carbono en el aire de la cueva. Las colonizaciones blancas y grises estaban compuestas principalmente por especies del filo Actinobacteria (Cuezva y col., 2009, 2012). Previamente se había señalado que las actinobacterias de la Cueva de Altamira eran capaces de inducir la precipitación del carbonato cálcico en la cueva (Cañaveras y col., 1999; Laiz y col., 1999) y de formar cristales en medios de cultivo (Laiz y col., 2003).

Las pinturas rupestres presentes en muchas cuevas pueden verse afectadas por la colonización microbiana, ya que los microorganismos pueden formar películas microbianas pigmentadas y llevar a cabo procesos de degradación y decoloración de los pigmentos de las pinturas. Los pigmentos empleados para realizar las pinturas rojas son óxidos de hierro, principalmente hematita, y para las pinturas negras son óxidos o hidróxidos de manganeso o carbón vegetal finamente molido (Menu y Walter, 1992). Estos pigmentos suelen mezclarse con arcillas o caolines como carga o pigmento extendedor, y con un aglutinante, que puede ser grasa animal o vegetal (Judson, 1959), aunque no está claro si los ácidos grasos que se han encontrado en las pinturas se deben a la utilización de sustancias aglutinantes o proceden de forma natural de los microorganismos presentes en la superficie de la roca (Spades y Russ, 2005). En cultivos de laboratorio se encontró que Bacillus spp. y Arthrobacter viscosus, bacterias aisladas de pinturas rupestres, eran capaces de reducir la hematita (Gonzalez y col., 1999). Por otra parte, los pigmentos pueden verse afectados por los metabolitos orgánicos e inorgánicos excretados por miembros del filo Actinobacteria, y por los ácidos inorgánicos producidos por las bacterias oxidantes de sulfuro y de amonio. Además, las bacterias oxidantes de sulfuro producen la disolución de la arcilla, en cuevas con aguas ricas en sulfuro de hidrógeno (Schabereiter‐Gurtner y col., 2004).


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En la Cueva de Tito Bustillo los paneles de pinturas paleolíticas muestran colonizaciones microbianas y signos de biodeterioro. El estudio de las comunidades bacterianas presentes, mediante técnicas de biología molecular, mostraron una gran diversidad de bacterias quimiotróficas y heterotróficas. Se identificaron miembros relacionados con bacterias verdes no sulfurosas, orden Planctomycetales, géneros Cytophaga‐Flexibacter‐Bacteroides, filos Acidobacteria, Proteobacteria y Actinobacteria (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a). En la Cueva de Altamira, en las colonizaciones de una de las pinturas de la Sala de Polícromos, también se encontraron bacterias pertenecientes a estos grupos, además de miembros de Acidobacteria (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002b).

En otras dos cuevas españolas, Llonín (Asturias) y La Garma, se encontraron colonizaciones microbianas y colonias macroscópicas sobre las pinturas paleolíticas y la superficie de la roca alrededor de ellas, en las que había una gran diversidad de bacterias litotróficas y heterotróficas. El grupo predominante estaba compuesto por miembros de los filos Proteobacteria, Acidobacteria y Firmicutes. Las comunidades bacterianas de estas dos cuevas eran similares a las encontradas en Tito Bustillo y Altamira (Schabereiter‐Gurtner y col., 2004).

En la Cueva de Lascaux la iluminación artificial originó el crecimiento de una película de organismos fotosintéticos que afectó a las paredes con pinturas rupestres, hacia comienzos de los años sesenta (Lefèvre, 1974). Esto llevó al cierre de la cavidad en 1963, y a la aplicación de estreptomicina y penicilina para tratar las bacterias, y de formaldehido para las algas. El tratamiento surtió efecto hasta 1969, cuando fue necesario adoptar un programa de limpieza y mantenimiento periódico (Sire, 2006). En 2001 tuvo lugar un brote fúngico debido a Fusarium solani, que cubría los suelos y paredes de la cavidad con un abundante micelio blanco. Durante tres años se aplicaron tratamientos con biocidas, como cloruro de benzalconio, lo que causó la selección de Pseudomonas sp., Ralstonia sp. y amebas de vida libre, resistentes al tratamiento (Bastian y col., 2009a,b), y la aparición de manchas negras sobre los techos y paredes de la cueva, afectando también a los paneles con pinturas. Estas manchas negras estaban relacionadas con colonizaciones del hongo Ochroconis lascauxensis y de varias especies de levaduras negras (Martin‐Sanchez y col., 2012), ya que estos contienen melanina en sus paredes celulares (Martin‐Sanchez y col., 2011). Se ha demostrado que los colémbolos contribuyen a la dispersión de los hongos (Bastian y col., 2009c).


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1.2.1. MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN CUEVAS

La presencia en cuevas de microorganismos potencialmente patógenos para la salud humana constituye un riesgo para los visitantes, especialmente en el caso de personas inmunodeprimidas. Estos microorganismos son capaces de causar infecciones respiratorias, cutáneas, pulmonares y cerebrales (Jurado y col., 2010a).

En la Cueva de Altamira se han identificado bacterias de géneros, de los cuales se han descrito especies potencialmente patógenas de humanos, entre ellos Amycolatopsis, Aureobacterium, Brevibacterium, Nocardia, Nocardioides, Rhodococcus, Streptomyces y la familia Micrococcaceae (Groth y col., 1999).

Otras bacterias patógenas aisladas frecuentemente en cuevas son Escherichia coli, Staphylococcus aureus y especies de los géneros Sphingomonas, Pseudomonas, Alcaligenes e Inquilinus. En la Cueva de Lascaux se han identificado especies patógenas de los géneros Ralstonia, Pseudomonas, Escherichia, Achromobacter, Legionella, Afipia, Inquilinus, Shigella, entre otras (Bastian y col., 2009b).

En la Cueva de Altamira se describió Aurantimonas altamirensis como una nueva especie bacteriana (Jurado y col., 2006), que fue reclasificada en un género nuevo: Aureimonas altamirensis (Rathsack y col., 2011). Posteriormente a su descripción ha sido aislada de enfermos clínicos. Los primeros casos se registraron en Canadá, en tres pacientes que padecían fibrosis quística, queratitis o úlceras oculares (Luong y col., 2008). El segundo caso se describió en un hospital de Indianápolis (Indiana, EE. UU.), donde se identificó a A. altamirensis como un agente responsable de bacteremia (Mendes y col., 2009). En España, se han notificado dos casos de pacientes con derrame pleural causados por esta bacteria (Tellez‐Castillo y col., 2010). Recientemente, esta especie ha sido responsable de un caso de peritonitis en Alemania (schröttner y col., 2014).

La fauna que habita en las cuevas puede constituir un reservorio de especies de microorganismos patógenos. La leptospirosis, causada por espiroquetas del género Leptospira, puede ser transmitida por los murciélagos y los roedores, los cuales abundan en las cuevas tropicales, donde el riesgo es mayor como consecuencia de las condiciones climáticas. En cuevas en las que habitan murciélagos también es muy común la presencia del hongo Histoplasma capsulatum, que es el agente causal de la histoplasmosis (Igreja, 2011). En la Cueva de Ardales se han identificado levaduras del género Trichosporon (Stomeo, 2008), aisladas comúnmente del guano de los murciélagos. Varias especies de este género han sido asociadas a diferentes casos clínicos, aunque ninguna de ellas se ha encontrado en esta cueva. En la Gruta del Viento (Italia) se han identificado dos especies del género Trichosporon,


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T. mucoides y T. ovoides. La primera de ellas también fue encontrada en otras dos cuevas italianas, Gruta del Río y Gruta del Santuario (Vaughan‐Martini y col., 2000). Estas dos especies de levaduras están asociadas con lesiones cutáneas, micosis y meningitis (Surmont y col., 1990; Guého y col., 1992).

Otras especies de levaduras potencialmente patógenas de humanos identificadas en algunas de estas tres cuevas italianas fueron Candida tropicalis, Rhodotorula mucilaginosa y Cryptococcus laurentii (Vaughan‐Martini y col., 2000). Candida tropicalis se ha aislado a partir de muestras clínicas como esputo, heces y orina (Ahearn, 1998). Esta levadura puede sobrevivir en la naturaleza en aguas y suelos ricos en materia orgánica (Vaughan‐Martini y col., 2000). Rhodotorula mucilaginosa se ha relacionado con casos de fungemia y otras infecciones como meningitis, peritonitis y dermatitis, generalmente en personas inmunodeprimidas, pacientes oncológicos, trasplantados, etc. (Ramos y col., 2012; Wirth y Goldani, 2012). Cryptococcus laurentii también se ha aislado a partir de muestras clínicas procedentes de pacientes inmunodeprimidos y asociado a casos de fungemia (Furman‐Kuklińska y col., 2009).

Muchas de las especies de hongos son agentes patogénicos y alergénicos potenciales. Por ejemplo, el género Aspergillus, cuyas esporas son unas de las más abundantes en el aire de la Cueva de Nerja, se ha relacionado con un amplio espectro de enfermedades respiratorias y otras patologías, incluyendo diferentes formas de aspergilosis (Docampo y col., 2010).

Por todo ello, es importante conocer la diversidad de las comunidades microbianas que se encuentran en las cuevas visitables, para poder evaluar el riesgo potencial que suponen para la salud de los visitantes y de los trabajadores de la cueva, y así poder adoptar las medidas de seguridad necesarias e informar a los visitantes sobre tales riesgos.

1.3. AEROBIOLOGÍA

La dispersión aérea de los microorganismos es uno de los principales mecanismos mediante los cuales estos penetran en las cuevas y se dispersan a través de las distintas salas. Se han realizado muy pocos estudios sobre la dispersión aérea de microorganismos en cuevas, y los resultados obtenidos son difícilmente comparables debido al empleo de diferentes metodologías. Los trabajos sobre la aerobiología en las Cuevas de Mogao (Dunghuang, China) mostraron la influencia de la temperatura, la humedad relativa y la actividad antropogénica sobre la concentración y la distribución de las bacterias y hongos (Wang y col., 2010a, b). Los estudios del aire de la Cueva de Nerja, pusieron de manifiesto la entrada de esporas fúngicas y granos de polen desde el exterior, y el drástico incremento de las esporas de los géneros Aspergillus/Penicillium como consecuencia del festival de música y danza que se celebra en


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verano (Docampo y col., 2010, 2011). En cuevas como las de Altamira y Lascaux, el turismo masivo ocasionó graves problemas de colonización por microorganismos, por lo que fueron cerradas al público y las visitas se desviaron a las réplicas. Para hacer el seguimiento de los brotes microbianos en estas dos cuevas y en la de Castañar de Ibor se llevó a cabo un estudio aerobiológico (Porca y col., 2011). Estos autores han propuesto una clasificación de las cuevas en cinco categorías en función de las concentraciones de esporas fúngicas presentes en el aire, según el riesgo que conllevan para la conservación de la cavidad y de las pinturas rupestres que albergan. Las esporas fúngicas están expresadas como unidades formadoras de colonias por metro cúbico de aire, UFC/m3. Esta clasificación abarca desde cuevas sin problemas de conservación hasta las que sufren daños ecológicos irreversibles y potencialmente perjudiciales para la conservación de las pinturas:

‐ Categoría 1: Cuevas sin problemas, caracterizada por tener una concentración de hongos inferior a 50 UFC/m3 de aire.

‐ Categoría 2: Representa una primera señal de alarma para las cuevas, con concentraciones de hongos entre 50 y 150 UFC/m3 de aire. Requiere de controles periódicos.

‐ Categoría 3: Incluye cuevas amenazadas por los hongos, con concentraciones entre 150 y 500 UFC/m3 de aire. Necesita de la adopción de medidas como el control de las visitas, el cierre de puertas, el estudio de las corrientes de aire, etc.

‐ Categoría 4: Corresponde con cuevas muy afectadas por los hongos, con concentraciones entre 500 y 1.000 UFC/m3 de aire.

‐ Categoría 5: Se trata de cuevas que sufren daños ecológicos irreversibles y potencialmente perjudiciales para la conservación de las pinturas, con unas concentraciones de hongos superiores a 1.000 UFC/m3 de aire.

Las categorías 4 y 5, parecen estar relacionadas con cavidades en las que ha tenido lugar algún episodio de brote fúngico o visitas masivas, y requieren de una intervención urgente y de la adopción de una serie de medidas de gestión. Estos índices son sólo aplicables a cuevas con salas y galerías de dimensiones relativamente reducidas, no siendo aplicable a cavidades con salas de grandes volúmenes como, por ejemplo, la Cueva del Mamut.

Por tanto, entre las medidas de gestión de las cavidades turísticas se deberían incluir vías de control de la entrada de materia orgánica y la monitorización periódica de los microorganismos presentes en todos los elementos de la cueva, además del estudio de sus mecanismos de dispersión y de sus estrategias de colonización (Saiz‐Jimenez, 2012).


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1.3.1. CONCEPTO Y BREVE HISTORIA DE LA AEROBIOLOGÍA

La dispersión aérea de partículas biológicas ha suscitado el interés de muchos científicos a lo largo de la historia. Charles Darwin (1809‐1882) realizó estudios de muestras de polvo que tomó a bordo del H.M.S. Beagle, durante la travesía por la costa noroeste africana (Griffin y col., 2003), observando partículas bióticas de origen continental. Louis Pasteur (1822‐1895) puso fin a la teoría de la generación espontánea con sus estudios sobre los gérmenes transportados por el aire. En 1860 llevó a cabo una serie de experimentos a partir de los cuales se asentaron la mayoría de los principios de la Aerobiología: la necesidad de un muestreo volumétrico, la heterogeneidad de las esporas del aire y las vías del proceso aerobiológico (liberación, dispersión y deposición). Concluyó que las partículas presentes en el aire variaban en función de las condiciones climáticas, la altitud, la localidad y el momento del día. Consideró importante comparar las diferentes estaciones del año en el mismo lugar y distintos sitios en el mismo período. Esto marcó el camino para las investigaciones del bacteriólogo Pierre Miquel (1850‐1922), el cual es considerado el primer aerobiólogo profesional (Ariatti y Comtois, 1993), quien encontró diferencias en el contenido de partículas biológicas en el aire según la estación, la altitud y la hora del día.

En los años 30 del siglo XX, Fred C. Meier propuso el término Aerobiología para hacer referencia a los estudios que se estaban llevando a cabo sobre los granos de polen, las esporas fúngicas y las bacterias presentes en la atmósfera. Meier particularmente estaba interesado en estudiar la dispersión aérea de las esporas de hongos. A partir de 1950 comienza a crecer el interés por la Aerobiología y se desarrollan la mayoría de métodos y aparatos de muestreo. Posteriormente, Pathirane (1975) consideró la Aerobiología como una ciencia multidisciplinar que comprende la liberación, retención, dispersión, deposición e incidencia atmosférica de esporas, pólenes y otros microorganismos aerovagantes.

La Aerobiología en España comenzó a principios del siglo XX con un primer trabajo sobre la atmósfera de Madrid en 1921 (Chaparro, 1991) y otro posterior sobre la ciudad de Santander en 1924 donde se relacionaban los conidios de los hongos presentes en la atmósfera con los procesos alérgicos (Jiménez Díaz, 1932). En la década de los años treinta comenzó a estudiarse la biocontaminación de la atmósfera de Barcelona (Darder y Duran, 1936), y en los años 40‐50 se pasó de hacer investigación estrictamente descriptiva a investigación analítico‐explicativa, con el objetivo de conocer el origen del contenido de polen atmosférico con respecto a los parámetros meteorológicos y la incidencia alérgica (Barrios, 1942; Montserrat, 1951; Surinyach y col., 1956; Pla‐Dalmau, 1958). Es a partir de la década de los ochenta cuando tiene lugar el verdadero auge de la Aerobiología como ciencia en España, cuando biólogos y médicos comenzaron a estudiar las partículas aerovagantes.


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En 1992 fue creada la Red Española de Aerobiología (REA), cuya línea de trabajo principal ha sido desde el principio la aplicación de los datos del contenido de polen atmosférico para la prevención de las alergias polínicas. Cuenta con un Centro Coordinador Nacional establecido en la unidad de monitorizaje aerobiológico de la Universidad de Córdoba, que se encarga de recibir, almacenar y coordinar los datos procedentes de los distintos centros de control territoriales, así como de la difusión de la información y su incorporación a un banco de datos europeo. La REA figura como una Red Técnica dentro de la Asociación Española de Aerobiología (AEA), desde la constitución de la misma en 1995, y está integrada a nivel europeo en la European Aeroallergen Network (EAN). La vinculación de muchos de los miembros de la REA a Centros de Investigación y Universidades ha permitido desarrollar nuevas líneas de investigación básica y aplicada, que amplían el carácter interdisciplinar de la Aerobiología (Galán y col., 2007).

En 1998, la International Association of Aerobiology (IAA) definió la Aerobiología como una disciplina científica enfocada al estudio del transporte pasivo de organismos y partículas de origen biológico a través de la atmósfera. Estas partículas aerovagantes comprenden diferentes organismos y sus productos, incluyendo virus, células y esporas de bacterias y hongos, metabolitos asociados (como endotoxinas y micotoxinas), esporas de briofitas y pteridofitas, polen de plantas superiores, ácaros, insectos, etc. (Mandrioli y Ariatti, 2001).

Entre los diversos campos de aplicación de la Aerobiología encontramos: medicina (Frankland, 1991), fitopatología (Hirst, 1991), polinosis (Ekebom y col., 1996; Fernández‐González y col., 1999; Ianovici, 2007), biodiversidad (Kauserud y col., 2005), conservación del patrimonio cultural (Petushkova y Kandyba, 1999; Nugari y Roccardi, 2001), contaminación ambiental (Lebowitz y O’Rourke, 1991; Górny y col., 2002; Etzel, 2007), etc. El área de las alergias es el de mayor aplicación (Geller‐Bernstein, 1991; Ekebom y col., 1996; Ianovici, 2007). Cabe destacar los estudios que se llevan a cabo sobre la influencia de las variables meteorológicas (temperatura, humedad relativa, precipitaciones, etc.) en la dispersión de las partículas aerobiológicas alergénicas, a partir de los cuales se desarrollan modelos predictivos con el objetivo de evitar la exposición a dichas partículas (Burge y Rogers, 2000; Burge, 2002).

1.3.2. PROCESO AEROBIOLÓGICO

El proceso aerobiológico implica la producción de las partículas biológicas aéreas, también conocidas como bioaerosoles, su liberación a la atmósfera, dispersión, deposición e impacto sobre animales, plantas y humanos (Mandrioli y Ariatti, 2001) (Figura 1.1).


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La diversidad y las concentraciones de las partículas biológicas presentes en la atmósfera varían espacial y temporalmente como consecuencia de diversos factores ambientales, tales como cambios en las condiciones meteorológicas locales o regionales (velocidad del viento, precipitaciones, radiación solar y humedad), fuente de procedencia (suelo, vegetación, sistemas acuáticos, etc.), contaminación ambiental y actividades antropogénicas (agricultura, ganadería, industria, etc.). Estos factores ambientales intervienen en las distintas fases del proceso aerobiológico (Figura 1.1)

Figura 1.1. Proceso aerobiológico. Fuente: modificado de Lacey, 1996.

Producción de partículas biológicas aerovagantes

La concentración de partículas biológicas aéreas es mayor en zonas donde hay vegetación que en zonas donde el suelo está desnudo (Jones y Harrison, 2004). El tipo de vegetación determina el tipo y la concentración del polen presente en la atmósfera, así como de las esporas fúngicas, ya que muchos hongos crecen asociados a plantas. Los patrones de floración y distribución de la vegetación y, por tanto, de las partículas biológicas procedentes de ésta, están influenciados por las condiciones climáticas y responden a una estacionalidad (Burge, 2002). La cosecha de los cultivos puede incrementar significativamente la entrada de partículas biológicas a la atmósfera (Fierer y col., 2008).


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Las partículas de origen fúngico, particularmente las esporas, representan una proporción significativa de los bioaerosoles presentes en el aire de ambientes interiores y del exterior (Calderon y col., 2002) y están implicadas en la propagación de enfermedades humanas, animales y de plantas (Abdel Hammed, 2005). Estas partículas fúngicas pueden proceder de diferentes fuentes ambientales, como suelos y agua, además de la vegetación. Por otra parte, la contaminación fúngica del aire puede tener su origen en plantas de tratamiento de aguas residuales, ganadería, procesos de fermentación y actividades agrícolas e industriales. El número de esporas fúngicas en el aire varía en función de la hora del día, la región geográfica, la contaminación ambiental, los parámetros meteorológicos, la presencia de la fuente de origen y el tipo de vegetación (Abdel Hammed, 2005; Kauserud y col., 2005). Las concentraciones de las mismas incrementan con la temperatura y disminuyen con la lluvia y la humedad relativa (Abdel Hammed, 2005). Las mayores concentraciones de esporas fúngicas se asocian con estaciones en las que las precipitaciones y las temperaturas son elevadas, y hay abundancia de materia vegetal muerta sobre la que crecen los hongos. Las menores concentraciones se han encontrado en la estación más seca (Jones y Harrison, 2004).

Las bacterias contenidas en los bioaerosoles, al igual que en el caso de los hongos, pueden proceder de fuentes de origen natural como son la cubierta vegetal, el suelo o los sistemas acuáticos (Brodie y col., 2006), o pueden derivar de act

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