FIJACION DEL CO2

INTRODUCCION

Descubrimiento del ciclo. Ciclo de Calvin. Fases carboxilativa, reductiva y regeneradora. Regulación del ciclo de Calvin. Rutas metabólicas a partir del ciclo de Calvin. Intercambio de sustancias entre cloroplasto y citoplasma.

OBJETIVOS:

Conocer el funcionamiento del ciclo fotosintético de reducción y asimilación del CO2.

Entender las rutas metabólicas que siguen los productos foosínteticos.

Razonar los procesos de regulación que permiten el correcto funcionamiento del ciclo.

INTRODUCCIONLa asimilación del CO2 tiene lugar en la denominada fase oscura de

la fotosíntesis. Es afótica indirectamente, no necesita luz para su desarrollo pero si los intermediarios obtenidos en la fase luminosa, poder asimilatorio, que son el ATP y poder reductor en forma de NADPH. Los procesos implicados en la asimilación tienen lugar en el estroma de los cloroplastos, mientras que la fase luminosa ocurre en la membrana de los tilacoides.

El proceso global de conversión del CO2 en carbohidratos fue descubierto por Calvin y Benson en 1949 y se le conoce como ciclo de Calvin.

DESCUBRIMIENTO Y METODOLOGÍA DEL CICLO DE CALVIN

El mecanismo más frecuente para la fijación del CO2 fue identificado por una serie de experimentos de Calvin, Benson y Bassham en 1949, que llevaron al descubrimiento de los distintos pasos del proceso global de conversión de CO2 en carbohidratos. En 1949 se logró disponer de CO2 marcado radiactivamente con el isótopo de 14C. Aquellos intermediarios que llevaban este isótopo después de exponer la maquinaria fotosintética al 14CO2 se podían detectar sensiblemente por su radiactividad. Se desarrolló también la técnica de cromatografía en papel para separar los distintos intermediarios, identificándolos por su migración comparándolos con otros compuestos patrones en cromatografías paralelas. Al revelar estas

cromatografías en papel fotográfico sensible, se podía detectar la radiación beta emitida por el 14C.

Cuando la exposición del material era muy breve, sólo aparecen marcados radiactivamente los primeros intermediarios. A tiempos de exposición más prolongados se marcan (Fig.1. Fig. 11-2) los sucesivos intermediarios.Calvin y colaboradores, usaron cromatografía bidimensional en papel para separar los intermediarios. Realizaron los experimentos con el alga Chlorella y a distintos tiempos de exposición al 14CO2. Tomaban fracciones del cultivo líquido de Chlorella y las añadían a etanol al 80 por 100, hirviendo, con lo cual rápidamente mataban las células y paraban el proceso fotosintético. Extraían los metabolitos intermediarios y sometían el extracto a cromatografía. Al cabo de un minuto de exposición, un gran número de productos se marcaban y cuando la exposición era de sólo dos segundos, la mayor parte del marcaje radiactivo aparecía sólo en el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA). Este era el primer compuesto que resultaba de la incorporación del 14C del 14CO2 en la materia orgánica.

Para conocer el precursor del 3-PGA sometieron el experimento a ausencia de CO2 y se vio que en estas condiciones disminuía el marcaje de 3-PGA pero aumentaba el de ribulosa-1,5-difosfato (RuDP) lo cual era debido a que ésta no se podia transformar en 3-PGA al faltar CO2. Sin embargo, si en lugar de suprimir el CO2, se sometía a periodos de oscuridad (Fig.2. Fig.-10.4) ocurría lo contrario, desaparecía RuBP y aumentaba 3-PGA. Como conclusión sacaron que era un proceso cíclico, donde una molécula de CO2 se combinaba con una de 5 átomos de carbono par dar 2 moléculas de 3 átomos de carbono, el 3-PGA. Al prolongar el experimento en el tiempo, la mancha de radiactividad de 3-PGA se hacía cada vez mayor, esto también implicaba que el proceso era cíclico ya que cada vez había más carbonos marcados.

Fig. 1. Consecuencias de las cromatografías en tiempos de Calvin

Fig. 2. Variación en las concentraciones de 3-PGA y de la RuBP en una suspensión de algas unicelulares al apagar y encender la luz.

FUNCIONAMIENTO DEL CICLO DE CALVIN.

El ciclo de calvin básicamente se divide (Esquema 1) en tres etapas:

Fase de carboxilacion: unión del CO2 a la RuDP.

Fase de reducción. Fase de reorganización o regeneración de la RuDP.

Esquema 1. Resumen de las fases de fijación

Fase de carboxilacíon

Se produce la incorporación del CO2 a la RuDP. Este proceso esta regulado por un enzima, la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (rubisco). Este enzima (Fig. 3) tiene un centro activo por el que compiten el O2 y el CO2. Esta fase será carboxilasa preferentemente.

Fig. 3. Papel oxidativo y carboxilativo de RUBISCO

El CO2, catalizado por la rubisco, se incorpora a la RuDP de 5 átomos de carbono generando una molécula de 6 átomos de carbono. Esta molécula a través de un proceso específico da lugar a una molécula hidratada que se hidroliza dando un fosfoglicerato (de 3 átomos de carbono) y una molécula intermedia que por proteolización da lugar a otro fosfoglicerato.

Fase de reducción.

Es igual que la glucolisis pero en sentido inverso. Hay una adición de fosfato por una quinasa para pasar el 3-fosfoglicerato a 1,3-bifosfoglicerato. Este paso tiene un gasto de energía de 1 ATP. El 1,3-bifosfoglicerato se reduce a gliceraldehido-3-fosfato (GAP) catalizado por una deshidrogenasa y consumiendo poder reductor en forma de NADPH. De cada 6 moléculas de GAP, una es derivada a la síntesis de carbohidratos y 5 participan en regeneración de RuDP.

Fase de reorganización o regeneración.La finalidad de esta etapa (Fig.4) es volver a generar la RuDP. De

GAP se genera de nuevo el aceptor disponible para la próxima fijación de CO2.

Fig.4. Fases del ciclo de Calvin y gasto de poder asimilatorio.

Fig. 5. Balance del ciclo.

REGULACIÓN DEL CICLO.

Durante la noche, el ATP y NADPH disminuyen pero no hasta valores despreciables, ya que al llegar el día sería un gran gasto de energía volver a iniciar el proceso. Siempre hay un nivel mínimo de ATP Y NADPH en la oscuridad, que se producen por otros mecanismos. Así pues, debe haber procesos de regulación específicos.

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD RUBISCO.Está formada (Fig. 6) por 8 subunidades grandes y 8 pequeñas.

Éstas están reguladas por el genoma nuclear y cloroplástico.

Fig. 6. Organización de Rubisco

La cantidad de luz afecta vía fitocromo a la expresión de los genes del cloroplasto que codifican a las subunidades grandes, que son las que tienen los centros activos. El genoma nuclear regula a las pequeñas. El ensamblaje de las subunidades y la expresión de los mensajeros están regulados por luz incidente sobre el genoma nuclear o cloroplástico.

La actividad de la rubisco está controlada por luz debido, entre otros motivos, a que el enzima necesita un pH óptimo ligeramente alcalino y requiere Mg2+. El enzima se encuentra en el estroma y es allí donde se produce una subida del pH, que activa a la RuDP carboxilasa, producida por el transporte electrónico fotosintético activado por la luz. Este transporte determina la entrada de protones al interior de los tilacoides y va acompañado de una salida de Mg2+.

Para que la rubisco sea activa (Fig.7) debe sufrir una carbamilación, tiene que tener carbamilado un residuo de lisina del centro activo del enzima. La carbamilación está catalizada por una activasa que requiere ATP y CO2. La carbamilación, para que se dé, necesita elevadas concentraciones de CO2 y Mg2+ así como un pH elevado, condiciones que se producen, precisamente, en presencia de luz.

Fig.7. Regulación de Rubisco

REGULACIÓN DE OTROS ENZIMAS

La regulación de los enzimas que catalizan las reacciones unidireccionales está asociada a la existencia de grupos tiol en este tipo de enzimas. Esta activación se basa en la reducción a grupos –SH los puentes disulfuro de los enzimas a activar (Fig. 8). Los electrones necesarios proceden de una cadena de transporte, estos electrones son excitados por la luz y proceden en último caso del agua. La luz hace funcionar el transporte de electrones, la ferredoxina se reduce, ésta mediante ferredoxina-tiorredoxina reductasa reduce a la tiorredoxina y ésta a grupos –SH los puentes disulfuro del enzima. Así, el enzima reducido será activado. La forma oxidada será inactiva.

Fig. 8. Regulación de enzimas asociadas

RUTAS METABÓLICAS A PARTIR DEL CICLO DE CALVIN.

En la Fig.9. Fig.10.14 se observan todas las salidas del metabolismo fotosintético del carbono, asociadas todas al ciclo de calvin. El transporte de electrones en los tilacoides proporciona ATP y NADPH al ciclo de calvin o al mecanismo de fijación del CO2 en la fotosíntesis de las C4. También proporciona reducción, vía tiorredoxin, para la activación por luz de enzimas. Las triosas-P generadas en el ciclo de calvin pueden ser utilizadas para la síntesis de productos, como almidón en los cloroplastos o sacarosa en el citoplasma, esto genera fosfato inorgánico, el cual es devuelto al cloroplasto para ser usado en la fotofosforilación. El carbono es usado también para la respiración mitocondrial o biosíntesis de ácidos grasos, aminoácidos, lípidos… vía PEPcarboxilasa. La RuBP puede tener actividad oxigenasa, produciendose así la fotorrespiración.

Fig.9. Integración del metabolismo fotosintético del carbono en hojas

SÍNTESIS DE SACAROSA Y ALMIDÓN.

Las triosas fosfato que se forman en el ciclo siguen distintas vías, o bien la síntesis de sacarosa o bien la síntesis de almidón. Estas dos vías ocurren en lugares distintos, la síntesis de sacarosa tiene lugar en el citoplasma de la célula mientras que la síntesis de almidón ocurre en el estroma del cloroplasto. La síntesis de ambos (Fig.10) es similar, solo difieren en los dos últimos pasos.

Fig.10. Síntesis de sacarosa y almidón

SÍNTESIS DE SACAROSA.

La síntesis de sacarosa tiene lugar en el citoplasma de la célula, por lo que la triosa fosfato es transportada al citoplasma a través de un transportador de membrana interno denominado translocador de fosfato. Su funcionamiento viene descrito en el apartado “Intercambio de sustancias entre cloroplasto y citoplasma” que se expondrá a continuación.

La sacarosa sirve para mantener energéticamente los procesos metabólicos y además va a ser el vehículo de transporte de carbono para tejidos o células no fotosintetizantes.

El transporte de triosas fosfato va a ser simultáneo con un antitransporte de grupos fosfato. La presencia de grupos fosfato por encima de concentraciones óptimas, tanto en el estroma como en el citoplasma va a ser inhibidor de la biosíntesis de productos finales.

SÍNTESIS DE ALMIDÓN.

El exceso de triosas fosfato que no se utilizan en la síntesis de sacarosa se convierten en almidón, que actúa como sustancia de reserva. Esta síntesis y posterior almacenamiento tiene lugar en el estroma del cloroplasto, donde se acumula durante el día para ser movilizado y exportado por la noche. Así, el aporte de carbono reducido al resto de la planta, se produce tanto de día como de noche.

En muchas plantas los polisacáridos de reserva se acumulan en forma de fructanos y no de almidón. Estos fructanos resultan de adiciones de residuos de fructosa a una molécula de sacarosa. Parece ser que están asociadas a plantas que necesitan una resistencia al frío.

INTERCAMBIO DE SUSTANCIAS ENTRE CLOROPLASTO Y CITOPLASMA

En el cloroplasto se encuentra transportadores de triosas que permiten la intercomunicación entre el cloroplasto y el citoplasma. En el estroma cloroplástico, se liberan triosas fosfato durante la fotosíntesis, que son transportadas al citoplasma para la síntesis de sacarosa mediante el translocador fosfato (Fig. 11). La síntesis de sacarosa produce un fosfato inorgánico que es intercambiado con el cloroplasto por una triosa fosfato destinada a la síntesis de sacarosa. Ese fosfato puede ser usado en la fotofosforilación.

Fig. 11. Funcionamiento del traslocador de fosfato de los cloroplastos

Todo lo descrito hasta ahora corresponde a plantas C3, ya que por la fijación del CO2 en el ciclo de calvin se obtienen moléculas de tres átomos de carbono.

BALANCE GLOBAL DEL CICLO

El balance global del ciclo hasta hexosas-fosfato nos da la reacción global:

6CO2 + 6H2O + 18ATP + 12NADPH hexosa-P + 12 H+ + 18 ADP + 17 Pi + 12 NADP+

El coste de fijar 1 CO2 =3 ATP + 2NADPH. Se gastan 2 ATP y 2 NADPH en la fase de reducción por cada

molécula de CO2 fijado y 1ATP más en el último paso de la fase de regeneración para de RuDP.

Jorge de la Rosa de Saa (2005-06)