Ficha Catalográ fica - Biblioteca Digital de Teses e ... o apoio de amigos de trabalho: José de...

Ficha Catalográ fica Elaborada pela Divisào de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Quimicas da USP.

Pinto. C laudinéia Aparecida Sales de Oliveira P65ge Estudo comparativo da estabilidade de formulações cosméticas

contendo papaina livre e modifi c ada. ;' Claudinéia Aparecida Sales de Oliveira Pinto . -- São Paulo, 2005.

128p .

Dissertação (mestrado)- Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Farmácia.

Orientador : Velasco, Maria Valéria Robles

I. Emulsào cosmética: Cosméticos: Tecnologia I. T . 11. Velasco. Maria Valéria Robles, orientador.

668.55 CDD

Claudinéia Aparecida Sales de Oliveira Pinto

Estudo comparativo da estabilidade de formulações cosméticas contendo papaína livre e modificada

Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Profa. Ora. Maria Valéria Robles Velasco Orientador / Presidente

1°. examinador

2°. examinador

() ~ )0 C/ São Paulo, _ de de __

11

Ao meu marido Cléber, pelo amor, carinho, amizade,

incentivo, apoio, e compreensão.

Aos meus filhos Arthur, pela colaboração e demonstração

de maturidade ao entender minha ausência, e Heitor pela

alegria e mesmo sem entender aceitar minha ausência.

À minha mãe, Maria das Graças, pelo exemplo de luta e pela atenção com os netos.

Aos meus sogros Sr. Osseon e Da. Isabel pelo cuidado com meus filhos.

Á minha orientadora Ora. Maria Valéria Robles Velasco,

pela orientação, dedicação e amizade.

111

AGRADECIMENTOS

É difícil agradecer a todos que colaboram para a realização deste

trabalho, mas vou tentar não cometer injustiças!!!

No início o incentivo de algumas pessoas foi muito importante,

fazendo despertar o interesse pela pesquisa. D entusiasmo da

Professora Ora. Maria Valéria Robles Velasco, da Professora Ora. Teima

Mary Kaneko, da Patrícia Santos Lopes e da Júlia Kayko Yamamoto com

as pesquisas sobre a aplicação da papaína me envolveram neste mundo

fantástico.

As dificuldades foram surgindo e para enfrentá-Ias pude contar

com o apoio de amigos de trabalho: José de Sousa Sobrinho, lutador que

vai além do impossível para abrir caminho para um companheiro, Carla

Aparecida Gonçalves dos Santos que se mostrou muito companheira

neste período difícil, Edgar Muniz Júnior que me trouxe descontração

nos momentos mais tensos. À Cristiane que fez das minhas re.feições no

bandejão momentos para me alimentar com palavras incentivadoras e

agradáveis. À minha companheira de caronas Sueli com quem muitas

vezes dividi o peso dos materiais, artigos e pastas a serem levadas para

o carro e à também mamãe Beth da secretaria pelo profissionalismo e

pelos conselhos.

Aos professores Cristina Helena dos Reis Serra, Humberto Gomes

Ferraz, Valentina Porta, Vladi Diga Co nsiglie ri, Terezinha de Jesus

Andreoli Pinto, Elizabeth Igne Ferreira, que acreditaram que o

desenvolvimento do trabalho seria possível. Muito obrigada pelo

estímulo.

Para a execução deste projeto foi necessário contar com a valiosa

colaboração dos Professores Or. Sandro Roberto Marana, Or. Walter

Ribeiro Terra, Ora. Célia Célia e também dos alunos Sidnei, Lucas

IV

Blanes, Fernando (Miguelito), Fábio (Pererê), Adriana e Paloma do

Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de

São Paulo, que mais do que colaborar com o desenvolvimento do método

de doseamento e empréstimo de equipamentos, cederam sua atenção e

sempre me receberam de braços abertos para qualquer tipo de

solicitação, isso foi muito importante.

A modificação da enzima envolveu o prof Dr. José Abrahão Neto

do Laboratório de Enzimologia Industrial do Departamento de

Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica, que sempre muito prestativo não

mediu esforços para que pudéssemos chegar ao final deste trabalho.

Ao pessoal do Biofar, Eunice Kazue, Éder, Ereminata e Valdirene,

por cederem vidrarias, a água e muita atenção.

À comissão julgadora da banca de qualificação prof Dr. Flavio

Finardi Filho e Profa. Ora. Érika Rosa Maria Kedor pelas orientações,

sugestões e discussões que tornaram este processo final do trabalho

conclusivo.

Meus amigos de curso e de laboratório, Janaína Cecília Villanova

que cedeu sua casa para a primeira comemoração quando fui aprovada

para realizar o curso de pós-graduação, aos companheiros de

Cosmetologia Tânia Cristina de Sá Dias, André Rolim Baby, Vivian

Zague, Gislaine Zulli, por compartilharmos desta maravilhosa ciência.

Evelyn Ojoe e Vanessa Alves Pinheiro que me transmitiram a calma,

paciência e perseverança para que eu não me desesperasse e que

percebesse a importância deste equilíbrio para a finalização do meu

trabalho.

Todos participaram cedendo o que há de melhor em cada um.

Alguns me fizeram acreditar em minha capacidade e outros dividiram

seu conhecimento. A participação de todos teve uma importância que

talvez vocês nem imaginem.

v

SUMÁRIO

1- INTRODUÇAO ...................................................................................... 1

2 - REVISÃO DA LITERATURA ............................................................... 5

2.1 - ENZIMAS .................................................................................................... 6

2.1.1 - Histórico ......................................................................................... 6

2.1.2 - Propriedades ................................................................................. 9

2.1.3 - Especificidade dos substratos ................................................... 10

2.1.4 - Efeitos do valor de pH ................................................................. 10

2.1.5 - Enzimas proteolíticas .................................................................. 11

2.1.6 - Enzimas em cosméticos ............................................................. 12

2.2 - PAPAíNA ................................................................................................... 15

2.2.1 - Características físicas ................................................................. 16

2.2.2 - Estrutura Molecular ..................................................................... 17

2.2.3 - Estabilidade da papaína .............................................................. 18

2.2.4 - Ativadores e Inativadores ........................................................... 20

2.2.5 - Especifícidade enzimática .......................................................... 21

2.2.6 - Estabilização da papaína ........................................................... 21

2.2.7 - Reações adversas ....................................................................... 25

2.2.8 - Determinação da atividade de enzimas proteolíticas ............... 27

2.3 - ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTiCOS .................................... 34

3- OBJETIVOS ......................................................................................... 36

4- MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 38

4.1 - MATERIAL ................................................................................................. 39

VII

4.1.1 - Reagentes ...................................................................................... 39

4.1.2 - Padrão de referência .................................................................... 39

4.1.3 - Equipamentos ............................................................................... 39

4.1.4 - Outros materiais ........................................................................... 40

4.1.5 - Matérias-primas ............................................................................ 40

4.2 - MÉTODOS ............................................................................................... 51

4.2.1 - Doseamento da atividade da papaína ......................................... 51

4.2.1.1 - Soluções empregadas .................................................... 51

4.2.1.2 - Validação da metodologia analítica ............................... 53

a) Condições instrumentais ............................................. 53

b) Curva de calibração .................................................... 54

c) Especificidade .............................................................. 55

d) Precisão ........................................................................ 55

e) Exatidão ......................................................................... 56

f) Limite de detecção ........................................................ 57

g) Limite de quantificação ................................................ 57

4.2.2 -Modificação da enzima .................................................................. 58

4.2.3 - Teste de Estabilidade Preliminar ........................... ~ ..................... 59

4.2.3.1 - Pré- formulações ............................................................ 59

4.2.3.2 - Condições do Teste Preliminar de Estabilidade e

variáveis analisadas ...................................................................... 62

4.2.4 - Teste de Estabilidade Acelerada ................................................. 64

4.2.4.1 - Avaliação inicial .............................................................. 64

4.2.4.2 - Condições do teste ......................................................... 64

4.2.4.3 - Variáveis analisadas ........................................................ 65

4.2.5 - Teste de Estabilidade Normal ...................................................... 66

4.2.5.1 - Amostras ......................................................................... 67

4.2.5.2 - Condições do teste de estabilidade normal .................. 69

4.2.5.3 - Variáveis analisadas ........................................................ 69

Vll1

5- RESULTADOS E DiSCUSSÃO ........................................................... 70

5.1 - Curva de calibração .................................................................................... 71

5.2 - Especificidade - estudo de interferentes dos excipientes, a partir

das emulsões-base e gel-base sem papaína .................................................... 73

5.3 - Precisão ...................................................................................................... 77

5.4 - Exatidão ...................................................................................................... 79

5.5 - Limite de detecção e quantificação ........................................................... 79

5.6 - Modificação da enzima .............................................................................. 81

5.7 - Teste de estabilidade preliminar ................................................................ 81

5.8 - Testes de estabilidade acelerada .............................................................. 84

5.9 - Teste de estabilidade normal .................................................................... 93

6- CONCLUSÕES .................................................................................. 107

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................ 109

ix

TABELAS

Tabela 1 - Famílias de enzimas proteolíticas ... .. ...... .... .. .. ....... ... ....... ... .... .... ..... ..... . 12

Tabela 2 - Propriedades físicas da papaína ..... .. .... .... .. .... ........... ... ... .. ................ .... 16

Tabela 3 - Volumes adicionados das soluções das amostras e da solução

padrão no teste de recuperação .. ..... ....... ......... .......... ..... ..... .. ... .......... .. .......... .. .. .. ... 56

Tabela 4 - Pré-formulações contendo 0,8% de papaína, preparadas para

avaliação macroscópica e aspecto sensorial (1 a 11) .. ... .. ....... .. ... ...................... ... .. 60

Tabela 5 - Pré-formulações contendo 0,8% de papaína, preparadas para

avaliação macroscópica e aspecto sensorial (12 a 23) .. ....... .. .. ........... ...... ... .. ......... 61

Tabela 6 - Formulações submetidas ao Teste de Estabilidade Normal. ... ... .. .... .... .. 68

Tabela 7 - Resultados experimentais obtidos na curva de calibração para a

papaína Merck 30000, USP/mg, padrão secundário .. .. ........ ... ........ ... .... ....... .... .. ... .. 71

Tabela 8 - Resultados experimentais do estudo de interferentes dos

excipientes obtidos no doseamento da formulação 2, sem adição de papaína. ... ... . 73


excipientes obtidos no doseamento da formulação 3, sem adição de papaína. .. ... .. 74


excipientes obtidos no doseamento da formulação Gel, sem adição de papaína . ... 75

Tabela 11 - Precisão intra-dia - Resultados experimentais obtidos da avaliação

da precisão intra-dia das amostras 2, 3 e Gel. As leituras foram obtidas no

mesmo dia .. ... ....... .. .... ............... ....... ...... ...... ....... ... ... ..... ....... .............. ..... ... .. .. ... .. ... . 77

x

Tabela 12 - Resultados obtidos no teste de recuperação da papaína aplicado

nas amostras das formulações 2, 3 e Gel ... .... ..... ................ ... ...... .... .. ...... .... .. .... .... . 79

Tabela 13 - Resultados para cálculo do limite de detecção e quantificação da

papaína pelo método espectrofluorimétrico de microplacas .... ... .......................... .. .. 79

Tabela 14 - Avaliação das características organolépticas e físicas das pré

formulações contendo 0,8% (p/p) de papaína no Teste de Estabilidade

Preliminar ... ... ...... ........ ... ... .. ... ... ... .. ... ..... ....... ... ...... ..... ... .... .. ... ...... ...... .. .... ..... .. .. .... . 82

Tabela 15 - Avaliação das características organolépticas, físicas e físico

química da formulação 2 acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de

Estabilidade Acelerada . ... ....... ..... ...... .... ... ...... .... ... ...... .... ... .... .. ... .............. ...... .... .. 85



Estabilidade Acelerada . .. ... .. ...... ... .... ....... ...... ....... .. ......... .... ... ... .... .. ....... ... .. ......... . 86



Estabilidade Acelerada .. ........ ..... .. .. ...... ..... .... ........ ... ... .. ..... ....... .. ... .. .... .... ...... .... ... 87



Estabilidade Acelerada ... .. .. .. ... .... ... .. .... .... ...... .... .... .. .. ... .. .............. ....... .. ...... ... ...... 88

Tabela 19 - Avaliação da atividade enzimática, características organolépticas,

físicas e físico-químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação 2, acrescida de papaína

0,8% p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal .......... ....... ... ............. ....... ...... . 94


físicas e físico-químicas a 22 ± 2,O°C da formulação 2, acrescida de papaína

0,8% p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal.. ... ....... .. .... ........ ...... .... ......... ... 94

XI



0,8% p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal .... .. .. .. ... ..... .. .. ... .... ..... .... ... ...... . 95


físicas e físico- químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação 3, acrescida de papaína

0,8% p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal .. .... .... ..... .... .... .. .. ... .. ......... .... ... 95



0,8% p/p , durante o Teste de Estabilidade NormaL .. ....... .. ........ .. ... ... .... ..... ... ... .. ...... 96



0,8% p/p , durante o Teste de Estabilidade NormaL ........ .. ..... .............. ... ... .. .... ... .. .. .. 96


físicas e físico -químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação 2M, acrescida de papaína

modificada p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal. Condição 5 ± 1,0 °C ...... 97


físicas e físico-químicas a 22 ± 2,0 °C da formulação 2M, acrescida de papaína

modificada p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal. ... .. .. .... .... ... .. ....... ..... ... ... .. 97


físicas e físico-químicas a 40 ± 2,0 °C da formulação 2M, acrescida de papaína

modificada p/p , durante o Teste de Estabilidade Normal ..... ....... .. ........... ............. ... 98

Tabela 28 - Avaliação da atividade enzimática, características organolépticas

e físico-químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação Gel acrescida de papaína 0,8%

p/p, durante o Teste de Estabilidade Normal. ......... ...... ..... ......... .... ..... .. ...... ..... .... .. .. 98

Xl i

tllt5LIU I t:CA

Faculdade de Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo

FIGURAS

Figura 1 - Representação da estrutura da papaína ... .............................................. 17

Figura 2 - Representação da distribuição da amostra na microplaca de 96

poços .... ... ... ...... ... ......... .. ...... ... ......... ..... ... ........ ...... ... .. .. ...... ...... .. ..... .. ... .. ......... ... ..... 53

Figura 3 - Curva de calibração da papaína Merck 30000USP/mg . .. .. ........ ... .. ..... .... 71

Figura 4 - Curva de 4 tempos (tempo x unidades de fluorescência) obtida pelo

doseamento da formulação 2, sem adição de papaína . .... ................ ... ...... ... ... ........ 73


doseamento da formulação 3, sem adição de papaína .. ...... .. .................................. 74

Figura 6 - Curva de 4 tempos (tempo x unidades de fluorescência) obtida no

doseamento da formulação Gel , sem adição de papaína .................. .... .. .. ........ ...... 75

Figura 7 - Variação de pH (%) para as formulações 2, 3, 14 e 16, nas

diferentes condições do Teste de Estabilidade Acelerada . ....... ....................... ..... 89

Figura 8 - Variação da condutividade (%) para as formulações 2, 3 14 e 16,

nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Acelerada . ...... .......... ...... .. .... 90

Figura 9 - Variação da viscosidade aparente (%) para as formulações 2, 3, 14,

16, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Acelerada ... ............... ... ... 91

Figura 10 - Variação da Atividade da papaína (%) para as formulações 2, 3, 2M

e Gel, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade NormaL ..... .......... ... ... .. 99

. Figura 11 - Variação do valor de pH (%) para as formulações 2, 3, 2M e Gel,

nas diferentes condições do Teste· de Estabilidade Normal ....... ... .... ... ...... .... ..... 103 XIII

Figura 12 - Variação do valor de viscosidade aparente (%) para as formulações

2, 3 e Gel, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Normal .............. 104

Figura13 - Variação do valor da condutividade (%) para as formulações 2, 3 e

Gel, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Normal ......................... 105

xiv

RESUMO

A papaína é uma enzima utilizada em formulações tópicas como agente

proteolítico debridante, no tratamento de lesões abertas de grande extensão e

queimaduras. Também empregada como agente promotor da permeação

cutânea, peeling químico e como agente depilatório progressivo.

A estabilidade de formulações contendo enzimas não é facilmente

alcançada. No presente trabalho realizou-se a modificação da papaína com

polietilenoglicol, visando maior estabilidade.

O Teste de Estabilidade Normal de formulações cosméticas

incorporadas de papaína não modificada e modificada apresentou um perfil

diferenciado para a atividade da enzima modificada, nas diferentes condições

de temperatura (5 ± 1°C; 22 ± 2 °C, 40 ± 2°C), sendo que a mais adequada

para a papaína não modificada foi de 5 ± 1 °C e para a modificada foi de 22 ±

2,O °C.

Estes resultados confirmam o aumento da estabilidade da papaína

modificada e o seu potencial de aplicação em formulações de uso tópico.

xv

ABSTRACT

Papain is an enzyme used in formulations for local application as

proteolitic debridant agent, treatment of wound exposed in large extension and

burns. It is also applied as promotor agent of cutaneous permeation, chemical

peeling and as progressive depilatory agent.

The stability of formulations with enzymes is not easily obtained. In this

work modification of papain with polyethylenglycol was made in order to obtain

more stability.

The Test of Normal Stability of cosmetic formulations incorporated with

papain not-modified and modified, showed a differentiated profile for modified

enzyme in different conditions of temperature (5 ± 1°C; 22 ± 2°C, 40 ± 2°C),

being that, the most adequated for papain not-modified was 5 ± 1°C and for

modified was 22 ± 2,0 cC.

These results confirm the increase of stability of papain modified and its

potential application in formulations for local application.

xvi

I

o,!~naO~J.NI -~

Os estudos de estabilidade de produtos cosméticos visam o

conhecimento do comportamento de componentes incorporados em

diferentes veículos/excipientes resultando em formulações diversas,

, submetidas a variadas condições de vibração, temperatura e umidade em

determinado período de tempo. Conhecer o prazo de validade em que uma

formulação cosmética mantém sua integridade física, qUlmlca,

microbiológica e toxicológica frente a essas variações, reflete as condições

de segurança e eficácia durante este período. Produtos expostos ao

consumo e que apresentem problemas de estabilidade além de

descumprirem os requisitos técnicos de qualidade, podem comprometer os

objetivos propostos ao produto e, colocar em risco a saúde do usuário. O

teste de estabilidade é considerado um procedimento preditivo no

desenvolvimento de produtos cosméticos para avaliar prazo de validade,

baseado em informações obtidas de produtos armazenados com condições

que visam acelerar alterações passíveis de ocorrer quando o produto está

disponível no mercado (RIBEIRO, KHURY & GOTTARDI, 1996; BRASIL -

GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004).

A papaína é uma enzima proveniente do látex das folhas e frutos do

mamão verde adulto, Carica papaya Linn. Seu uso em formulações tópicas é

muito difundido como agente proteolítico debridante, sendo usada no

tratamento de lesões abertas de grande extensão e de queimaduras. Na

Cosmetologia é empregada na pele íntegra como agente promotor da

penetração e permeação cutânea, peeling químico e como agente

depilatório progressivo (HWANG & IVY, 1951 ; GUZMAN & GUZMAN, 1953;

STARLEY et ai , 1999; LOPES, 1999; TRAVERSA et aI. , 2003).

A estabilidade de formulações elaboradas com enzimas, geralmente é

dificultada por sua característica reativa com os componentes da formulação

e material de acondicionamento. Uma alternativa para elevar a estabilidade

das preparações com papaína envolve a modificação de sua estrutura,

protegendo seu sítio ativo da hidrólise. Um estudo comparativo entre as

formas da enzima livre e conjugada visa verificar a possibilidade da

aplicação desta última como matéria-prima em formulações

2

medicamentosas ou cosméticas (VELASCO, 1993; HEBDA, FL YNN &

DOHAR, 1998; TRAVERSA , 2003; SIM et aL , 2003; PIEPER & CALlRI,

2003).

Para verificação da atividade da papaína em formulações de uso

tópico existe a necessidade de utilizar uma metodologia com determinadas

características, como: rapidez, sensibilidade, facilidade de execução e baixo

custo. A literatura cita inúmeros métodos de avaliação da atividade de

enzimas proteolíticas, que dependem da hidrólise quantitativa de

determinada proteína ou substrato peptídico pela enzima (ERLANGER,

KOKOWSKY & COHEN, 1961 ; TANG, ROWELL & CUMMING; 1997).

Existem inúmeras variáveis que dependem do tipo de substância a

ser detectada e do substrato empregado. Os métodos envolvidos empregam

a colorimetria, a espectrofotometria e a espectrofluorimetria, dentre outros. A

metodologia f1uorimétrica é bastante sensível e depende da própria

fluorescência da enzima ou das propriedades fluorescentes do produto

gerado.

A utilização de microplacas e do substrato sintético f1uorimétrico

cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanina- L arginina - 4-metilcumarina - 7-

amido apresenta-se como alternativa ao método espectrofotométrico

convencional de doseamento da papaína. O produto da reação da papaína

com este substrato resulta na metilcoumarina, de elevada fluorescência.

Este método apresenta potencial de emprego analítico para a papaína, pois

possui elevada sensibilidade e é de fácil execução.

O método das microplacas pode ser utilizado para doseamento da

papaína livre e conjugada incorporada nos diversos tipos de formulações

cosméticas e farmacêuticas sob a forma de solução, gel e emulsão. Esse

método também pode ser empregado para monitorar a atividade proteolítica

da papaína durante o estudo de estabilidade da formulação, visando estimar

seu prazo de validade e comparar a atividade da enzima nas formas livre e

conjugada (L1NDHAL et aL , 1988; KORITSAS & ATKINSON, 1995).

A validação do método analítico escolhido (espectrofluorimetria),

envolvendo microplacas e substrato f1uorimétrico foi realizada a fim de torná-

3

ap se~:>!ls]JapeJe::> sepOl WO::l OI

,,~n.l"~3.l11 "a O"SIJ\3~ -Z -

2.1 - ENZIMAS

2.1.1 - Histórico

Os sistemas vivos, do vírus ao homem, são formados por uma grande

variedade de reações bioquímicas e quase todas são mediadas por vários

catalisadores biológicos, conhecidos como enzimas. A Enzimologia, ou

estudo das enzimas, tem sua raiz nos primórdios da Bioquímica, pois ambas

se desenvolveram simultaneamente, a partir de pesquisas sobre a

fermentação e a digestão (COPELAND, 1996; VOET, 2000; LEHNINGER,

2002).

Os povos da antiguidade produziam queijos, pães e bebidas

alcoólicas utilizando enzimas. Atualmente, continuam sendo utilizadas na

produção de alimentos, bebidas e numerosos produtos ' como sabões para

lavar roupas, medicamentos e produtos cosméticos. Além das enzimas

serem de fundamental interesse para a saúde humana despertam grande

fascinação entre os cientistas (COPELAND, 1996).

O registro mais antigo que se refere ao uso comercial de enzimas é

uma descrição do preparo de vinho no The Code of Hammurabi (conjunto de

leis de uma antiga civilização da Babilônia) a cerca de 2100 a.C. O uso de

microrganismos como fonte de enzimas para fermentação foi difundido pelos

povos antigos. Descrições destes processos foram encontradas em

escrituras não somente dos povos da Babilônia, como também em

documentos das antigas civilizações de Roma, da Grécia, do Egito, da China

e da índia. Estes contêm descrições que relatam o processo de produção do

vinagre, baseado na conversão enzimática do álcool em ácido acético,

utilizado não somente na alimentação como na preparação de

medicamentos. A produção do queijo também foi muito importante para

estas sociedades e a enzima utilizada eram a ficina, obtida do extrato da

árvore de figo e a renina, extraída do estômago de animais como a vaca. A

primeira referência da atividade da ficina foi encontrada no clássico "lIíada"

de Homero. Outro alimento importante para a época, o pão, também

6

necessitava da ação das enzimas que resultava na produção do dióxido de

carbono. O amaciamento da carne, processo baseado na ação de enzimas,

foi utilizado desde a Antiguidade. Quando a marinha britânica começou a

explorar as ilhas do Pacífico em 1700, conheceu o uso da papaia para

amaciamento de carne e tratamento de micoses. Relatos do uso nativo da

papaia despertaram muito interesse na Europa no século XVIII (COPELAND,

1996).

Os povos antigos utilizaram as enzimas de forma prática e sua

aplicação foi baseada no conhecimento empírico e folclore, porém nos

séculos 18 e 19 os cientistas começaram a estudar a ação das enzimas de

forma sistemática. Os processo de digestão foram de interesse popular no

período do Iluminismo. Réaumur (1683-1757), realizou alguns estudos

prévios sobre digestão nos pássaros, utilizando um tubo de metal para

proteger a carne da ação física do estômago. Este foi inserido no estômago

do animal e a carne foi digerida por 24 horas. Ele concluiu que o processo

de digestão não era apenas físico, mas também químico e repetiu o

experimento com um pedaço de osso e um de planta, verificando que o

primeiro foi amaciado e a planta não foi atingida. Esta foi provavelmente a

primeira demonstração de atividade específica das enzimas (COPELAND,

1996).

Posteriormente Spallanzani (1729-1799), repetiu o experimento com

diferentes animais inclusive seres humanos. Também utilizou seu próprio

suco gástrico para observar a digestão de pedaços de carne in vitro. Estes

experimentos ilustraram alguns fatores críticos do "ingrediente ativo" (que

ainda não tinha sido definido) do suco gástrico. Ele demonstrou que o

volume de água, a temperatura e o tempo influenciavam na atividade do

"ingrediente ativo" do suco gástrico e que fora do corpo sua atividade

diminuiu com o tempo. Nesta mesma época descobriu-se atividade

enzimática de diferentes sistemas biológicos, como por exemplo a

peroxidase de origem vegetal , e a a-amilase em grãos (COPELAND, 1996).

7

Durante a segunda metade do século XIX os cientistas

começaram a voltar sua atenção para fracionar extratos diversos que

continham enzimas e obter o "ingrediente ativo" sob a forma pura.

Inicialmente, a impossibilidade de reproduzir a maioria das reações

bioquímicas no laboratório conduziu Louis Pasteur (1822-1895) e outros

pesquisadores a considerar que os sistemas vivos eram dotados de uma

"força vital" que lhes permitia evitar as leis da natureza que governavam a

matéria inanimada. Contudo, alguns investigadores, principalmente Justus

von Liebig (1803-1873), argumentaram que os processos biológicos eram

causados pela ação de substâncias químicas que, na época, eram

conhecidas como "fermentos". Durante este período, em 1878, Wilhelm

Kühne, ao estudar a catalise dos extratos de leveduras, definiu pela primeira

vez o termo enzima (do grego, em + zyme, levedura). Bertand purificou

parcialmente a enzima laccase de uma árvore. Buchner (1897), utilizou um

suco prensado e rehidratado de uma levedura, que foi estocado em baixa

temperatura (O °C). Ocorreu diminuição de sua atividade em 5 dias e quando

foi adicionado caldo de cana de açúcar esta foi mantida por 2 semanas, na

mesma condição de temperatura. Este pesquisador demonstrou que a

fermentação alcoólica poderia acontecer na ausência de células vivas. Este

fato foi um grande marco na história das enzimas o que encorajou os

pesquisadores a tentar isolar muitas enzimas diferentes, e posteriormente

estudar suas propriedades catalíticas. (COPELAND, 1996; VOET, 2000;

LEHNINGER, 2002).

Até 1926, a composlçao química das enzimas não havia sido

totalmente esclarecida e somente após esta data foi obtido seu isolamento

sob a forma cristalina pura. A primeira enzima a ser cristalizada por James

Sumner foi a urease, obtida de extratos do feijão de soja (VOET, 2000;

LEHNINGER 2002).

Atualmente, cerca de 2.000 tipos de enzimas foram identificadas e

cada uma delas catalisa uma reação química diferente, sendo centenas

obtidas sob a forma cristalina pura (LEHNINGER, 2002).

8

Para que as moléculas possam reagir devem ter energia suficiente

que lhes permita atingir um estado reativo denominado de transição e a

velocidade de reação é diretamente proporcional ao número de moléculas

que atingem este estado. A diminuição do valor da energia de ativação é

uma forma de acelerar a velocidade da reação que pode ser obtida na

presença de catalisadores, como enzimas, substâncias que aceleram a

velocidade de uma reação química, sem ocorrer seu consumo pelo processo

(CHAMPE & HARVEY, 1996, MURRA Y, 1998; MARZZOCCO, 1999; VOET,

2000).

2.1.2 - Propriedades

Desde a época de Pasteur, a pesquisa bioquímica tem demonstrado

que, embora estejam sujeitas às mesmas leis da natureza que governam o

comportamento de outras substâncias, as enzimas diferem dos catalisadores

químicos comuns em vários aspectos importantes (VOET, 2000).

a. Velocidade de reação mais rápida

A velocidade das reações catalisadas pelas enzimas é maior do que

as reações correspondentes não catalisadas, geralmente 106 a 1012. A

velocidade inicial de uma reação catalisada pela enzima é sempre

proporcional à sua concentração (VOET, 2000).

b. Condições de reação mais brandas

As reações catalisadas enzimaticamente ocorrem em condições mais

brandas que as correspondentes não catalisadas, como no caso de

temperaturas inferiores a 100 °C, pressão atmosférica e valor de pH entre 5

e 9. Em contraste, geralmente uma catálise química eficiente requer

temperatura e pressão elevadas, assim como valores de pH extremos

(VOET, 2000).

9

c. Maior especificidade da reação

As enzimas apresentam maior especificidade que os catalisadores

químicos em relação à identidade dos seus substratos (reagentes) e dos

seus produtos, isto é, as reações enzimáticas dificilmente produzem

subprodutos (MURRA Y, 1998; VOET, 2000).

2.1.3 - Especificidade dos substratos

As forças não-covalentes, por meio das quais substratos e outras

moléculas se ligam às enzimas, são similares aquelas que regem a

conformação das proteínas. Ambas envolvem interações do tipo: ponte de

hidrogênio, de Van der Waals, eletrostáticas e hidrofóbicas. Em geral , o sítio

de ligação do substrato consiste de uma depressão ou sulco na superfície da

enzima, complementar ao formato dos substratos (complementaridade

geométrica). A complementaridade entre as enzimas e seus substratos é a

base do modelo "chave-fechadura" da função enzimática, proposto por Emil

Fischer em 1894. O modelo de Koshland (1958) é um modelo mais refinado

e é denominado de modelo do encaixe induzido, sendo a característica

principal a flexibilidade da região do sítio ativo. Neste modelo, o substrato

induz uma mudança de conformação na enzima, na orientação espacial

correta para a ligação do substrato (MURRA Y, 1998; VOET 2000).

Quando existe quantidade suficiente de substrato para reagir com a

enzima livre, qualquer aumento ou decréscimo na concentração de enzima é

acompanhado pelo aumento ou decréscimo correspondente na velocidade

de reação (MURRAY, 1998).

2.1.4 - Efeitos do valor de pH

A maioria das proteínas é ativa apenas em um intervalo estreito de

valor de pH, freqüentemente de 5 a 9, influenciando a ligação do substrato à

enzima, o estado de ionização dos resíduos de aminoácidos envolvidos na

10

atividade catalítica da enzima, a ionização do substrato e a variação da

estrutura da proteína (em geral, significativa somente em valores extremos

de pH). As velocidades de muitas reações enzimáticas apresentam curvas

que obedecem à distribuição normal (curva em forma de sino) em função do

valor de pH, refletindo o estado de ionização de alguns resíduos de

aminoácidos que influenciará a atividade enzimática (VOET, 2000).

As enzimas apresentam valores de pH onde possuem atividade

máxima, denominado de pH ótimo. Valores extremos causam sua

denaturação, por meio da protonação ou desprotonação de resíduos de

aminoácidos ácidos ou básicos, impedindo a formação de ligações iônicas

responsáveis pela manutenção da estrutura das enzimas (MURRA Y 1998,

VOET, 2000).

2.1.5 - Enzimas proteolíticas

As enzimas proteolíticas participam de numerosos processos

celulares e extracelulares na saúde e na doença, clivando ligações

peptídicas e historicamente foram associadas com processos de digestão

em animais e homem. As proteinases são agrupadas em 6 famílias, de

acordo com o resíduo de aminoácido essencial em seu sítio ativo e sua

estrutura tridimensional, conforme indicado na Tabela 1. Os membros

destas famílias descendem de um antecessor comum que se diferenciou

durante a evolução. O intervalo de pH ótimo, de atividade, a seqüência de

aminoácidos e os inibidores são similares entre elas (NEURATH, 1989;

STERCHI & STOKER, 1999).

11

Tabela 1 - Famílias de enzimas proteolíticas (NEURATH, 1989)

Família

Serina protease I

Serina protease "

Cisteína protease

Aspartico protease

Metallo-protease I

Metallo-protease II

Proetase representante

Chymotrypsina

Sutilisina

Papaína

Penicillopepsin

Carboxipeptidase A Bovina

Termolisina

2.1.6 - Enzimas em cosméticos

Característica do

resíduo do sítio ativo

Asp l02 Ser195 His5/ , ,

ASp32, Se~21 , His64

Cis25, His 159, Asp 158

Asp33, ASp213

Zn, Glu27o, Tlf48

Zn Glu 143 His231 , ,

o uso de enzimas em cosméticos tem sido muito disseminado nos

últimos anos. Enzimas proteolíticas, como a papaína e bromelina, entre

outras, têm sido empregadas na Cosmetologia para o peeling químico, em

formulações depilatórias e como promotores de penetração (BROOKS,

1999; LOPES, 1999; PROTOPA et aI., 1999; ROHR, BENARD &

SCHRADER, 2000; TRAVERSA et aI. , 2003).

O emprego de proteases na superfície da pele exige alguns cuidados,

pois é difícil controlar sua ação e muitas vezes a enzima continua agindo

para o interior da pele causando irritação (BROOKS, 1999).

É interessante notar que o processo natural de renovação de

camadas da pele é controlado por meio de enzimas específicas que liberam

as células mortas da superfície da pele. Quando esta for normal, a produção

de queratinócitos na camada basal da epiderme é balanceada pela perda

destas células da superfície do estrato córneo durante o processo de

descamação. Caso este balanço esteja alterado, existe falha na

descamação e também pode ocorrer a hiperproliferação dos queratinócitos,

resultando no aumento da coesão destes na superfície da pele. Um dos

principais componentes do estrato córneo responsável pela coesão das

12

células são os desmossomos, compostos, em parte, de proteínas

transmembranárias como a desmocollin-1 (dsc1), a desmogleín-1 (dsg1), a

desmoplakin e a comeodesmosin que por meio de interações com proteínas

idênticas nas células adjacentes realizam a coesão celular. Esses

componentes são progressivamente degradados durante o processo de

maturação requerido para a descamação normal (EI-KADI et aI., 2001 ;

RAWLlNGS, 2003).

O aumento do número de desmossomos intatos na pele eleva a

coesão dos queratinócitos, diminuindo a velocidade da descamação e

confere à pele aspecto seco. O processo de esfoliação na superfície da pele

ocorre pela ação específica de enzimas hidrolíticas que degradam os

desmossomos e diminuem as forças de coesão dos queratinócitos

(BROOKS, 1999; EL-KADI et aI., 2001 ; BERNAD et aI., 2003; RAWLlNGS,

2003).

O efeito da papaína no tratamento da pele seca foi investigado por EI

Kadi, et aI., 2001, que verificou seu potencial de utilização para diminuição

do problema, utilizando uma escala visual para avaliação. Os efeitos foram

analisados após 3 e 24 horas da aplicação da enzima e foram considerados

melhores que o veículo.

A eficácia de um produto cosmético é determinada por sua

capacidade de liberar seus componentes ativos no sítio de ação. O conceito

de liberação de substâncias funcionais distingue-se entre liberação dérmica

e transdérmica. No primeiro caso, o local de ação da substância ativa é no

estrato córneo e denomina-se penetração; e quando ocorre na epiderme

viável elou derme é denominado de permeação. Para ocorrer a liberação

transdérmica, ou absorção da substância ativa, conhecida como de

absorção percutânea, o local de ação envolve a derme e a circulação

sistêmica (ANSEL, POPOVICH & ALLEN, 2000; OSTROSKY, 2001).

As enzimas podem interferir na permeação cutânea, favorecendo ou

impedindo a absorção de substâncias ativas, portanto podem ser utilizadas

como promotores ou retardadores deste processo (LOPES, 1999).

13

Enzimas proteolíticas, como a papaína, são empregadas como

promotores de penetração cutânea de substâncias ativas incorporadas nos

produtos tópicos, pois o estrato córneo é uma membrana relativamente

impermeável que limita o processo de absorção. A via mais importante de

penetração através do estrato cómeo é a matriz lipídica, e a velocidade

como este fenômeno ocorre depende das características da substância

envolvida. As maiores variáveis que influenciam neste processo envolvem

concentração da substância ativa, o coeficiente de partição do permeante

entre o estrato córneo e o veículo e a difusibilidade do princípio ativo com o

estrato córneo (MORGANTI et aI., 2001).

Pesquisas demonstraram que a papaína promoveu absorção de

substâncias ativas pela pele, sendo o efeito da penetração de fármacos

investigado por Sim et aI., 2003. A papaína foi conjugada com SC-glucam™

para garantir sua estabilidade durante o processo de absorção. Os fármacos

utilizados foram a antipirina e a indometacina como modelo hidrofílico e

hidrofóbico, respectivamente. Os resultados indicaram que a papaína

facilitou a absorção cutânea da antipirina. A espessura do estrato cómeo e

da epiderme viável aumentou após o tratamento com a papaína conjugada

com SC-glucam, além disso, ocorreu indução da fase de separação,

formação de lacuna e destruição lamelar dentro dos interstícios do estrato

cómeo. Contudo, a papaína conjugada com SC-glucam™ não foi irritante

para a pele (SIM et aI., 2003).

A ação promotora de penetração foi investigada por Lopes, 1999, que

estudou a papaína (0,2% p/p) incorporada em formulação contendo

diclofenaco sódico, comparando-a com o óleo de pequi como auxiliar de

penetração. A enzima apresentou resultados satisfatórios em relação ao

segundo promotor investigado.

Lopes, 2003, verificou a segurança do uso da papaína como promotor

de absorção cutânea, utilizando técnicas biofísicas e cultura celular de

queratinócitos humanos. O estudo demonstrou que a papaína foi inócua e

segura, pois permitiu a recuperação dos queratinócitos humanos,

conduzindo a formação do epitélio celular após 21 dias. A eficácia foi

14

comprovada por meio de métodos biofísicos, observando-se a

desestruturação dos componentes do estrato cómeo, que permitiu a

passagem de substâncias ativas através da pele.

Enzimas proteolíticas, como a papaína, são consideradas como

retardadoras do crescimento do pêlo. De acordo com Prista e colaboradores,

1995, a papaína penetrou pelos canais foliculares, moderando esta ação.

Hemandez & Mercier-Fresnel (1999) e Breuer (1990) também citaram o

emprego de enzimas proteolíticas para retardar o crescimento do pêlo. Em

1972, Barry et aI., consideraram a papaína como um depilatório enzimático

(TRAVERSA et aI. , 2003).

Traversa et aI., 2003, estudaram os efeitos da papaína sobre o pêlo e

o folículo piloso decorrentes da utilização de formulações gel hidrofílico e

emulsão tipo óleo em água contendo papaína (0,8%) em dois grupos de dez

camundongos machos Swiss. A aplicação foi realizada diariamente durante

um período de 30 dias e a papaína veiculada na emulsão, conduziu ao efeito

depilatório visível nos camundongos, sendo pouco expressivo quando a

enzima foi incorporada na forma cosmética gel hidrofílico (TRAVERSA et aI. ,

2003).

2.2 - PAPAíNA

As enzimas proteol íticas têm sido investigadas extensivamente por

muitos anos por vários pesquisadores. A papaína é uma enzima proveniente

do látex das folhas e frutos do mamão verde adulto, Carica papaya Linn e

consiste de um mistura de proteínas, envolvendo essencialmente uma

combinação de papaína e quimopapaína, enzimas proteolíticas que

hidrolisam polipeptídios, amidos e ésteres, especialmente nas ligações

envolvendo aminoácidos básicos, leucina ou glicina, produzindo peptídeos

de baixo peso molecular. O termo refere-se tanto ao látex bruto seco quanto

à enzima cristalina. A árvore de papaia é cultivada na maioria dos países

tropicais. Os maiores produtores são a índia, Siri Lanka, Malásia, Indonésia,

15

América do Sul e Central , África do Sul e Havaí (HWANG & IVY, 1951 ;

MERCK INDEX, 1996; MARTINDALE, 2002).

2.2.1 - Características físicas

Várias características físicas da papaína são listadas na Tabela 2.

Tabela 2 - Propriedades físicas da papaína (SASMITO, DEMEESTER &

BRACKE, 1982; KAMPHUIS et aI. , 1984; MERCK INDEX, 1996;

DARDENNE et aI. , 2003).

Propriedades físicas

Apresentação

Ponto Isoelétrico

Constante de sedimentação S20,w

Constante de difusão D2o,w

Massa molecular

Coeficiente de extinção, ET%'1cm

Km (BAEE)

Rotação óptica (pH 5,7; 25 °C) [a]D

Conteúdo de a-hélice

Solubilidade

F aixa de temperatura favorável

para a reação proteolítica

Faixa de pH ótimo para a reação

enzimática

Faixa de pH da solução a 2% em

água

CaracterísticaNalor

PÓ branco ou branco acinzentado,

altamente higroscópico

PH 8,75

2,42 +/-O,04S

10,27 +/- O, 13x1 0-7 cmZsec-1

23.350 Dalton

25,0

O,023M

-66,7°

17%

Água e glicerol incompleto

Álcool , clorofórmio e éter - Insolúvel

60 a 90°C sendo 65°C o ponto ótimo

5,0 a 7,0

4,8 a 6,2

16

2.2.2 - Estrutura Molecular

A molécula da papaína consiste de uma cadeia polipeptídica simples.

Sua seqüência de aminoácidos foi reportada primeiramente por Light et aI. ,

1964, que descreveram a indicação da posição das pontes de dissulfitos na

molécula, bem como do grupo sulfidrila ativo. Uma das principais

características estruturais da papaína é a presença de dois domínios, ou

regiões topográficas, do mesmo tamanho, o domínio R e o domínio L

(Figura 1), mas de conformação diferente, delimitando o sítio ativo em uma

fenda profunda (ARNON, 1970; SASMITO, DEMEESTER & BRACKE, 1982;

KAMPHUIS, 1984; DARDENNE et aI. , 2003).

Figura 1 - Representação da estrutura da papaína (IMAGE GALLERY,

2004)

Na primeira parte, domínio L, começando pelo grupamento amino

terminal , a cadeia é dobrada ao redor de um núcleo hidrofóbico contendo

três regiões de a-hélices, sendo que seu conteúdo na molécula é de

aproximadamente 20%. A segunda parte, domínio R, contém além da região

17

a-hélice uma J3-estrutura (ARNON, 1970; SASMITO, DEMEESTER &

BRACKE, 1982; KAMPHUIS, 1984).

Existem sete resíduos de cisteína, seis envolvidos na formação da

ligação dissulfito, dois constituindo a primeira parte da cadeia (Cys22-Cys63

e Cys56-Cys95) e um na segunda parte (Cys153-Cys200). O sétimo resíduo

de cisteína (Cys25) participa do sítio catalítico. As duas partes da molécula

são unidas por pontes de hidrogênio, ligação eletrostática e efeitos

hidrofóbicos (ARNON, 1970; SASMITO, DEMEESTER & BRACKE, 1982).

A seqüência primária exata da molécula da papaína e sua estrutura

foi estabelecida por estudos químicos e parcialmente por estudos de raio X.

A molécula tem 212 resíduos de aminoácidos, seu formato é elipsoidal e

possui dimensões aproximadas de 5,0 x 3,7 x 3,7nm (ARNON, 1970;

SASMITO, DEMEESTER & BRACKE, 1982).

A conformação da papaína é estabilizada por três ligações dissulfito e

sua ruptura completa resulta na destruição da proteína, com redução da

atividade biológica, catalítica e imunológica. Porém, nem todas as ligações

dissulfito são essenciais para a performance da função biológica (SASMITO,

DEMEESTER & BRACKE, 1982).

2.2.3 - Estabilidade da papaína

A estabilidade da papaína pode ser influenciada por condições

ambientais, tais como temperatura, luz, presença de oxigênio, umidade e

material de acondicionamento. A enzima apresenta-se mais estável e ativa

no intervalo de pH de 5,0 a 7,0 (SASMITO, DEMEESTER & BRACKE, 1982;

SIM et aI. , 2000).

Arnon, 1970, relata alguns experimentos onde a enzima foi submetida

a diferentes condições para verificação de sua estabilidade. Em solução de

derivados de mercúrio, sua atividade enzimática diminui de 1 a 2% por dia,

provavelmente resultado de autólises e/ou oxidação. A papaína sob a forma

de pó resistiu ao calor seco a 100 °C por 3 horas. Em solução de

dimetilsulfoxido contendo 20% de solvente orgânico não ocorreu diminuição

18

da atividade da papaína. A exposição a agentes denaturantes potentes

como solução de ácido tricloroacético a 10% ou de hidrocloroguanidina 6M

causou mudanças irreversíveis na estrutura molecular da papaína,

expressas pela mudança drástica na rotação óptica específica e na baixa

atividade enzimática.

Kang & Warner, 1974, pesquisaram o efeito do valor de pH sobre a

atividade da papaína. As ações combinadas de pH e temperatura sobre a

estabilidade da enzima indicaram que ocorreu pequena redução de atividade

em pH 5,0; alguma perda a pH 7,0 e diminuição significativa em valor de pH

9,0; especialmente à temperatura de 70°C (ASAKURA, 1982).

Velasco, 1993, avaliou a atividade de 4 formulações de Gel de

papaína 0,4% (p/p) . As temperaturas utilizadas para o armazenamento das

formulações foram 5, 22 e 37 °C e o tempo de análise foi cerca de 2 meses.

Observou-se perda de aproximadamente 30% da atividade proteolítica à

temperatura de 5 °C, houve diminuição de aproximadamente 50%, para a

temperatura de 22 °C, mas para a condição 37 °C ocorreu variação de 30%

a 60% da redução da atividade proteolítica em cerca de 2 meses.

Velasco et aI. , 1999, verificaram a estabilidade da papaína em

solução a 2% (p/v) em água. As soluções foram armazenadas em 2

condições diferentes: 5 e 22 °C. No primeira caso, após 52 horas de

armazenamento a atividade enzimática foi reduzida a 64%, em relação ao

inicial , enquanto no segundo, o mesma comportamento ocorreu em apenas

6 horas.

Traversa, 2003, avaliou a estabilidade fisico-química de formulações

cosméticas contendo papaína em diferentes temperaturas. As formulações

avaliadas foram: gel de Carbopol® 940 e um creme à base de cera

emulsificante não iônica POlawax®, ambas contendo 0,8% (p/p) de papaína.

As condições do teste foram 4, 25 e 40 °C. Os parâmetros avaliados

envolveram, características organolépticas, cor, odor, e uniformidade,

valores de pH e viscosidade. As maiores variações de resposta foram

observadas quando as formulações foram armazenadas na temperatura de

40 °C, onde ocorreu alteração no odor, para as duas formulações na

19

primeira semana, na cor ao 32° dia para a formulação a base de Polawax®.

No caso da emulsão ocorreram alterações de viscosidade em todas as

condições, sendo que à temperatura de 40°C houve variação de 48%.

2.2.4 - Ativadores e Inativadores

Ativação - A papaína é uma enzima que requer um grupo sulfidrila

livre para sua ação catalítica. A enzima nativa tem o grupo tiol bloqueado e

neste estado, exibe baixa atividade. A ativação é acionada por um agente

redutor moderado como a cisteína, sulfito, cianida, cianeto de hidrogênio,

glutationa reduzida e tioglicolato. Como padrão de condições de ativação da

papaína tem sido usado um meio contendo 0,005M de cisteína e 0,001-

0,002M de EDTA (GRASSMANN, SCHOENEBECK & EIBELER, 1930;

ARNON, 1970; MERCK INDEX, 1996; USP 25, 2002).

Inativação - A papaína é inativada, reversivelmente na presença de ar

e baixa concentração de cisteína e também por peróxido de hidrogênio,

acetato de iodo, sais de guanidina, ácidos concentrados e solução de uréia

6M, sendo acelerado por metais pesados, como o cádmio, zinco, mercúrio,

ferro, chumbo e cobre. O aumento da temperatura também conduz à

inativação da enzima (BALLS, LlNEWEAVER, 1939; KIMMEL, & SMITH,

1957; ARNON, 1970; KILARA, SHAHANI & VWAGNER, 1977; MONETTA,

1988; RAJALAKSHMI & SUNDARAM, 1995; MERCK INDEX, 1996; USP 25,

2002).

Todas as substâncias que reagem com o grupo sulfidrila atuam como

inibidores da papaína. Por este motivo, o p-cloromercuriobenzoato, que

forma um complexo estável com a enzima, pode ser utilizado para titulação

do grupo -SH livre. O ácido iodoacético ou iodoacetamida pode também

reagir com o grupo sulfidrila livre da papaína, causando assim uma

inativação irreversível (ARNON, 1970).

A reação da papaína com o clorometil cetona da fenilalanina e lisina

provocou perda total de sua atividade. Reagentes aldeídos, como a

20

fenilidrazina e hidroxilamina entre outros, têm sido reportados como agentes

inativadores da papaína (ARNON, 1970).

Além dos inibidores descritos, existem aqueles específicos da

estrutura da papaína. O ácido carbobenzoxi-L-glutâmico é descrito como um

inibidor quando o meio apresenta valor de pH entre 3,9 a 4,5. Outros

contendo fenilalanina como um resíduo secundário do C-terminal, têm sido

relatados pela literatura (ARNON, 1970).

2.2.5 - Especificidade enzimática

A papaína se destaca por sua especificidade relativa a proteínas e

substratos de baixo peso molecular. Estudos com peptídeos sintéticos e

derivados de destes contribuíram significativamente para o conhecimento da

especificidade hidrolítica da enzima. Estas pesquisas demonstraram que a

maioria das ligações peptídicas é hidrolisada com intensidade variada pela

papaína, sendo as mais suscetíveis aquelas formadas por grupos a-amino

substituído. Além disso, na hidrólise de ligações peptídicas, a papaína é tão

efetiva quanto na atividade esterase ou tiol esterase e na transferase, sendo

capaz de catalisar não somente a transamidação e a transpeptidação, mas

também reações de transesterificação (KIMMEL & SMITH, 1954).

2.2.6 - Estabilização da papaína

Existem vários métodos para se realizar a imobilização de enzimas,

considerando-se sua ação específica. Diversas tentativas têm sido

realizadas para estabilizar a estrutura da papaína, visando sua utilização

mais eficiente como: ligações covalentes, interação com íon metal

imobilizado, insolubilização em glutaraldeído, imobilização em agarose,

biopolímero, ligações covalentes com poliéter sulfona, acoplamento a uma

sacarose polimérica, modificação com anidrido succínico, absorção simples

em Celite®, absorção iônica em CM-cellulose (resina de troca iônica

catiônica) e QAE-Sephadex® · (resina de troca iônica-aniônica) e ligação

21

cruzada covalente (ZHUANG & BUTTERFIEL, 1991 ; SIM et aI., 2000;

KHAPARDE & SINGHAL, 2001 ; AFAQ & IQBAL, 2001).

As propriedades e a atividade enzimática da papaína insolubilizada

com glutaraldeído foram pesquisadas por Janse & Olson, 1969, mantendo

se inalterada na temperatura de 4 °C, por 5 semanas, sendo que esta

resposta considerada satisfatória (JANSE & OLSON, 1969).

Kilara, Shahani & Wagner, 1977, imobilizaram papaína e lípase em

agarose e obtiveram dados favoráveis de cinética enzimática. A enzima

imobilizada apresentou estabilidade aumentada quando estocada em valor

de pH 7,5 e na temperatura de 5°C. A papaína imobilizada não foi afetada

depois de repetidos tratamentos com solução de uréia (KILARA, SHAHANI &

WAGNER, 1977).

A estabilidade da atividade proteolítica da papaína foi estudada em

um sistema de fase micelar reversa e em meio aquoso. Nas micelas

reversas, a atividade máxima foi de 80%, comparada com a da enzima em

meio aquoso, porém foi verificado aumento no tempo de meia vida para a

enzima modificada. Os resultados obtidos foram: tempo de meia vida para

enzima em solução aquosa, 10 dias; e em meio da fase micelar reversa, o

tempo foi de 24 dias (VICENT, BARROS & EMPIS, 1994).

Rajalakshmi & Sundaram, 1995, estudaram a estabilidade da papaína

nativa e covalentemente modificada, acoplada a uma sacarose polimérica. A

papaína nativa e a modificada foram submetidas a diferentes valores de

temperaturas, por 30 minutos. Foi observado aumento na termo

estabilidade e maior resistência à inativação pela uréia na concentração de

8M. A papaína modificada apresentou valor de temperatura ótima 10 °C

acima que a forma nativa, que foi de 65 °C (RAJALAKSHMI & SUNDARAM,

1995).

Um estudo sobre papaína imobilizada por ligação não cova lente numa

estrutura modificada de membranas de poliéter sulfona unida a um complexo

biotina-avidina, foi realizado por Bhardwaj et aI. , 1996. A atividade da enzima

modificada apresentou aumento na estabilidade quando comparada à forma

22

livre. O estudo de estabilidade foi realizado por um período de 19 dias, à

temperatura de O °C (BHARDWAJ et aI. , 1996).

Zhang et aI. , 1996, utilizaram quatro tipos de suportes para a

imobilização da papaína por diferentes métodos: absorção simples em

Celite®, absorção iônica em CM-cellulose (uma resina de troca iônica

catiônica) e QAE-Sephadex® (resina de troca iônica-aniônica) e uma ligação

cruzada covalente com albumina. Os efeitos diretos dos suportes nas

propriedades catalíticas da enzima foram examinados verificando a

influência da quantidade de água, valor de pH, resistência iônica e

temperatura de reação, utilizando-se como substrato o dipeptídeo Boc-Phe

ValOMe em _acetato etila sob condições termodinamicamente controladas.

Os suportes com baixa hidrofobicidade demonstraram reter maior atividade

catalítica da papaína que aqueles com elevada característica. A albumina foi

considerada o melhor suporte para a papaína com rendimento de 94,5% do

dipeptídeo (ZHANG et aI. , 1996).

SIM et aI., .estabilizaram a papaína e a lisozima para aplicação em

produtos cosméticos. As enzimas foram conjugadas com uma solução de de

SC-glucam™, um biopolímero produzido pelo fungo Schizophy/lum

commune. A estabilidade das enzimas conjugadas elevou significativamente,

acima de 90% de sua atividade foi mantida, quando estocada à 45 °C, por

30 dias (SIM et aI., 2000).

A estabilização da papaína em formulações cosméticas foi estuda por

Kang et aI. , 2000. A enzima foi conjugada numa solução aquosa de SC

glucam™, incorporada a uma emulsão múltipla (água/óleo/água) e

armazenada à temperatura de 45 °C. Após 3 meses, a enzima manteve 85%

da atividade inicial (KANG et aI. , 2000)_

Khaparde & Singhal , 2001 , realizou um estudo sobre a papaína

modificada para ser incorporada a uma formulação detergente. A papaína foi

modificada com anidrido succínico, o que alterou seu valor de pH ótimo de

6,0 para 8,0 e a temperatura ótima ficou inalterada (KHAPARDE &

SINGHAL, 2001).

23

Afaq & Iqbal, 2001 selecionaram um método para imobilização da

papaína baseado na interação dos resíduos de histidina, cisteína e triptofano

com um condutor íon metal imobilizado. A enzima imobilizada reteve 87% da

atividade, quando submetida à temperatura de 65°C por uma hora ( AFAQ &

IQSAL, 2001).

Edwin, Sharma & Jaganndham, 2002, observaram que em meio de

pH ácido as moléculas de papaína foram suscetíveis à agregação e

permaneceram em estado de glóbulo fundido. Na presença de

concentrações reduzidas de hidrocloro guanidina, à temperatura ambiente

os glóbulos tendem à agregação que pode ser evitada com a adição de

solução de uréia O,5M em meio de tampão, induzindo a estabilização da

proteína. A agregação foi máxima em valor de pH 2,0; com de hidrocloro

guanidina 1 M. Este trabalho sugeriu que o efeito de estabilização da papaína

pela uréia em concentrações reduzidas ocorreu por sua ação na estrutura da

água, criando condições desfavoráveis para os grupos hidrofóbicos expostos

que se direcionaram para o interior da molécula. A eliminação da água do

interior da molécula da proteína induziu ao aumento no volume interior bem

como elevou a estabilidade da proteína neste estado (EDWIN, SHARMA,

JAGANNDHAM, 2002).

A estabilidade da papaína conjugada com polímeros de fosfolipídeos,

solúveis em água, foi estudada por Miyamoto, Watanabe, Ishihara, 2004. A

enzima foi conjugada com polioxietileno com um grupo carboxila (PEO

COOH) e foi utilizada como controle. Os polímeros poli (2-metacriloiloxietil

fosforilcolina) (PMPC-COOH) reagiram com os grupos aminas terminais da

. enzima, resultando em moléculas com diferentes pesos, com aumento de 5

a 40K de PMPC-COOHs. A enzima modificada e a não modificada foram

estocadas a 40°C e a atividade monitorada durante um período de 28 dias,

sendo que na forma não modificada esta foi reduzida em 7 dias, chegando a

níveis próximos de 0% e a enzima conjugada com PEO-COOH apresentou

diminuição de 50% após 7 dias e manteve-se estável por 28 dias. O peso

molar das enzimas modificas com de PMPC-COOHs determinou diferentes

comportamentos da estabilidade da atividade enzimática, sendo que esta foi

24

mantida durante 4 semanas para as amostras modificadas com P-PMPC 5 e

40K (MIYAMOTO, WATANABE & ISHIHARA, 2004a).

Posteriormente, Miyamoto, Watanabe & Ishihara, 2004, realizaram um

estudo de estabilidade com a papaína modificada com PMPC-COOH, em

diferentes temperaturas. Foram analisadas duas amostras que

apresentaram diminuição de 41,5% e 34,1 % da atividade após a

modificação. À temperatura de 40 °C a atividade de ambas foi mantida entre

75% e 85% durante o período de 28 dias, embora para a temperatura de

25°C ocorreu sua diminuição, chegando próximo de 50% nos primeiros 7

dias, seguidos de uma elevação gradual, até 150% do valor inicial aos 28

dias. Este fenômeno foi explicado pela formação de agregados da papaína

conjugada, à 25 °C, que se dissociam com o passar do tempo (MIYAMOTO,

ISHIHARA & WATANABE 2004b).

2.2.7 - Reações adversas

Enzimas proteolíticas, como a papaína, são conhecidas por oferecem

riscos de doenças respiratórias, principalmente nos processos produtivos

onde estão envolvidas, pois estas substâncias podem ser liberadas para o

ambiente e inaladas pelos trabalhadores (TANG, ROWELL & CUMMING,

1997).

Gross et aI. , 1965 observaram os efeitos da papaína em ratos

tratados com 3% desta enzima, em pó, por inalação. Os animais

apresentaram dispnéia e tosse durante as primeiras 48 horas após o

tratamento, ocorrendo também perda de peso entre 10 a 15%. Este quadro

foi recuperado após 2 semanas e nenhum animal morreu (GROSS et aI.

1965).

Chambers et aI. , 1998, verificaram que a papaína ativa induziu

resposta IgG1 , em ratos, típica de reação alérgica. O experimento foi

realizado para verificação da desensibilização da papaína ativa, utilizando

papaína inativa. Foram utilizados 48 ratos divididos em 4 grupos de 12

animais. Os grupos A e B foram imunizados com 1,0 J.lQ de papaína ativa e

25

os grupos C e D com papaína inativa. Aos 14 dias, foram injetados na

cavidade peritonial de 6 dos animais de cada grupo, 1,0 /1g de papaína ativa

(grupo A e C) e, 1,0 /1g de papaína inativa (grupo B e D). Os outros animais

passaram pelo mesmo processo aos 28 dias. Houve uma resposta

diferenciada para os animais imunizados com papaína ativa comparada aos

imunizados com papaína inativa, para o primeiro caso a resposta de IgG1 foi

3 vezes superior que o segundo (CHAMBERS et aI., 1998).

Existem relatos de reação alérgica por contato da enzima com a pele.

Estes casos estão relacionados com exposição ocupacional.

Soto-Mera et aI. , 2000, relataram o caso de duas mulheres que

trabalharam em salão de beleza e usavam comprimidos de papaína

dissolvidos em água para a retirada de adesivos. No primeiro caso, a

profissional , trabalhou por 5 anos e desenvolveu progressivamente urticária

de contato, rinoconjuntivite e asma, após interromper o uso da papaína, não

ocorreram mais os sintomas descritos. No segundo caso a profissional

trabalhou por 10 anos apresentou rinite, asma e urticária de contato.

Similarmente ao primeiro caso, quando o uso foi interrompido não ocorreram

mais os sintomas. Ambas nunca ingeriram mamão papaia e nunca tiveram

problemas com abacaxi, carne, látex e creme dental. A primeira nunca usou

lentes de contato e não apresentava os sintomas com o consumo de kiwi e

cerveja. A segunda usava lentes de contato, nunca consumiu cerveja e

apresentava inchaço na boca quando ingeria kiwi. Foram realizados testes

para verificar a reação com papaia, papaína, bromelina, abacaxi, kiwi e látex.

Os resultados dos testes com a pele e de IgE foram positivos para papaia e

papaína para as duas e positivo para kiwi para a segunda (SOTO-MERA et

al. , 2000).

Focke et aI., 2003, estudaram a relação imunológica com a pele para

o látex e as frutas figo e outras como: kiwi , banana, abacaxi , abacate, amora

e papaia. O número de pacientes testados para o mamão papaia foi 5,

sendo que todos apresentavam algum tipo de reação ao figo o resultado foi

positivo para 3 deles O resultado do teste com o kiwi foi positivo para 4

pacientes; para a banana e o abacaxi o resultado foi positivo para 2; para o

26

abacate 3 e para a amora 1, em um total de 6 pacientes testados (FOCKE et

aI., 2003).

2.2.8 - Determinação da atividade de enzimas proteolíticas

A necessidade de metodologias específicas, sensíveis e rápidas para

monitorar os níveis de enzimas proteolíticas tem estimulado o

desenvolvimento de inúmeros métodos analíticos com diferentes vantagens

sobre os clássicos descritos por Anson e Kunitz. Estes métodos envolviam o

substrato hemoglobina denaturada pela uréia na presença do quelante de

metais, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,001 M; o ativador

enzimático, cisteína 0,005 M; cloreto de sódio (NaCI) 0,1 M, para evitar

modificações na atividade enzimática por conferir força iônica adequada ao

meio, valor de pH da solução de 7,0 e a temperatura de reação de 39°C

(LAUWERS & RUYSSEN, 1963; EDWARDS, TOWNSHEND & STODDART,

1995).

Os métodos analíticos empregados na determinação da atividade das

enzimas proteolíticas podem ser geralmente divididos, em duas categorias:

métodos enzimáticos e imunológicos, de acordo com o mecanismo envolvido

na reação, com variáveis dependentes da metodologia analítica empregada.

O primeiro depende da hidrólise quantitativa de determinada proteína ou

substrato peptídico por uma enzima a ser doseada, baseando-se na

formação do produto da reação, de baixo peso molecular, formado durante o

processo. No segundo caso, temos a interação entre a enzima com um

antígeno ou anticorpo que possui natureza protéica variável. Em ambas

categorias, existem muitas variáveis, dependendo dos métodos de detecção

empregados (ARNON, 1970; KIRSCHKE & WIEDERANDERS, 1999).

A atividade enzimática da papaína pode ser medida pela

determinação da velocidade de digestão de proteínas ou da hidrólise de

substratos sintéticos, como ésteres ou amidas derivadas de aminoácidos de

baixa massa molecular. Nesta metodologia substratos sintéticos são

indispensáveis para medir a cinética da reação, testar inibidores enzimáticos

27

e analisar os peptídeos. As reações de hidrólise enzimática liberam resíduos

cromóforos ou cromogênicos, que podem ser determinados por métodos

simples como o espectrofotométrico (KIRSCHKE & WIEDERANDERS,

1999).

Muitos substratos sintéticos contendo grupos cromogênicos e

fluorogênicos foram pesquisados, incluindo o f3-naphtilamido, 7 -amino-4-

metilcoumarina, 4-nitroanilida, tioesterpeptídeos e 4-aminoftalhidrazida

(isoluminol). Vários métodos para marcar a proteína nativa (sem modificação

química) com grupos fluorescentes como a fluoresceína e o 2-metoxi-

2,4difenilfuran-3-one foram descritos (ROWELL; CUMMING & NITESCU,

1995).

Kanaoka & Takahashi, 1977, estudaram o método fluorimétrico de

elevada sensibilidade, utilizando o substrato Benzoil-L-arginina-4-

metilcoumarina-7amida, tendo como seu produto hidrolítico o 7-amino-4-

metilcoumarina que é altamente fluorescente, podendo ser utilizado nas

determinações da tripsina e da papaína. A metodologia envolveu excitação

da solução reagente a 380nm e a emissão a 440nm. A concentração do

substrato foi de 0,02 a 0,2mM em meio de tampão Tris-HCI, pH 7,5 contendo

5mM de I-cisteína, 2mM de E.D.T.A e 1 % (v/v) de DMSO. A linearidade da

fluorescência versus tempo de incubação foi satisfatória e a razão da

hidrólise foi proporcional à concentração da enzima, sendo entre 30-

600ng/mL. A sensibilidade do método foi 100 vezes superior comparada com

a do substrato cromogênico benzoil-L-arginina-p -nitroanilida (KANAOKA &

TAKAHASHI, 1977).

o L-piroglutamil-L-fenilalanina-L-Ieucina-p-nitroanilida, substrato

cromogênico para tiol proteases, foi sintetizado por Filippova et aI. , em 1984.

A papaína, a ficina e a bromelina hidrolisaram esse substrato e liberaram a

p-nitroanilina, quantificada espectrofotometricamente, em comprimento de

onda de 410 nm (FIUPPOVA, et aI. , 1984).

Twining, 1984, desenvolveu um método sensível , reprodutível e de

baixo custo, utilizando a caseína ligada ao isotiocianato de fluoresceína. A

proteína foi incubada com o substrato na temperatura de 37 °C, por 24 horas

28

e a fluorescência foi medida a cada 5 minutos. A reação foi interrompida com

uma solução de ácido tricloroacético e a proteína insolúvel foi sedimentada

por centrifugação, a solução sobrenadante foi diluída em tampão tris pH 8,5

e a fluorescência foi determinada usando um comprimento de onda de

excitação de 365nm ou 460nm e de emissão de 525nm. De acordo com o

autor, a caseína funcionou como substrato adequado para muitas proteases,

porque é uma proteína solúvel similar aos substratos fisiológicos, facilmente

preparada, estável no armazenamento e de baixo custo. As proteínas

testadas foram a quimotripsina, elastase, subtilisina e a termolisina. A

atividade dessas enzimas pôde ser quantificada na ordem de nanogramas

(TWINING, 1984).

Um método sensível para detecção de enzimas proteolíticas foi

descrito por Robertson, Kwan-Lim & Maizels, 1988. Foram utilizados

microplacas e gelatina marcada com radio-iodina (substrato), o tempo de

incubação foi de 16 horas na temperatura de 37 °C. Ao final da reação, a

solução sobrenadante foi aspirada, individualmente de cada poço, e foi

realizada a leitura em um aparelho contador de radiação gama. Foi possível

a detecção de 1 ng de papaína por mL (ROBERTSON, KWAN-LlM &

MAIZELS, 1988).

Lindhal et aI. , 1988, utilizaram o substrato Cabobenzoxi-L-fenilalanina

L-arginina-4-metilcumarina-7amida e para inibir a hidrólise o

monocloroacetato de sódio 0,1 M. A reação ocorreu em meio de pH 4,3. O

produto formado foi quantificado em fluorímetro com excitação a 370nm e

emissão 440 nm (LlNDHAL et aI. , 1988).

Um sensor holográfico foi testado por Millington e colaboradores, em

1995. O uso de elementos holográficos como sensores biológicos foi

sugerido como artifício para monitorar a atividade de proteases. Uma

resposta óptica quantitativa de um elemento holográfico preparado em

gelatina foi utilizado para um intervalo de concentração de tripsina abaixo de

25nM (aproximadamente 0 ,6!lg/ mL), com resposta em 20 minutos, podendo

ser considerado um período de tempo reduzido. A resposta holográfica foi

fornecida pela mudança no comprimento de onda na luminosidade. Para a

29

construção do holograma foi usado: filme, Agfa® 8E75HD, incubado em

solução tampão de borato por 12 horas e a reflexão do holograma foi

construído sob o tampão. O espectro das amostras, com diferentes

concentrações foram analisados de 1 em 1 minuto, por 30 minutos,

avaliando-se as mudanças na reflectividade (MILLlNGTON et aI., 1995).

Tang, Rowell & Cumming, 1997, confirmaram a importância dos

métodos enzimáticos com detecção colori métrica de um produto formado

para a indústria, também sendo importantes para a pesquisa científica.

Quando se utiliza um substrato como o N,N-dimetilcaseína (DMC) existe a

necessidade de uma reação secundária após a digestão enzimática. Outros

substratos de peptídeos sintéticos que incluem a p-nitroanilida éster e a p

nitrofenil acopladas a peptídeos podem também ser empregados. Como

desvantagem, os autores afirmaram que estes métodos não foram sensíveis

com limites de detecção na ordem de J.lg e foram lentos, requerendo tempo

prolongado de incubação da enzima com o substrato (TANG, ROWELL &

CUMMING, 1997).

Outro método relatado, o f1uorimétrico tradicional que utilizou o

isotiocianato de f1uoresceína ligado à caseína foi citado como sendo

relativamente sensível , porém, exigiu duas etapas: incubação da enzima

com o substrato e separação dos derivados da caseína não digeridos. Os

métodos com substratos marcados com radio apresentaram problemas

similares (TANG, ROWELL & CUMMING, 1997).

Buroker-Kilgore & Wang, 1993, pesquisaram um método

espectrofotométrico para medir a atividade da calpaína e outras proteinases,

como a papaína, utilizando o substrato Coomassie Brilliant Blue G-250-

Based. Este envolveu a incubação com o substrato caseína, seguido da

retirada de uma alíquota do corante Coomasie Brilliant blue G-250 que foi

adicionada e interagiu somente com a proteína e não com os produtos

proteolíticos (pequenos peptídeos ou aminoácidos). Diferente do método

existente da caseinólise, a metodologia não exigiu a separação de produtos

e a medida foi realizada no comprimento de onda de 595nm. O autor afirmou

que o método apresentou maior sensibilidade que os colori métricos que

30

empregam substratos de proteínas conjugadas (BUROKER-KILGORE &

WANG, 1993).

Gauthier et aI., 1993, sintetizaram um novo substrato para a papaína

baseado na seqüência do sítio inibitório da cistatina. Este método foi

baseado na seqüência conservada em todos os membros da família da

cistatina que participou da inibição de cisteína proteinase. Este substrato, 0-

aminobenzoil (Abz)-OWAGA-etilenodiamino-2-4-dinotrofenil (QWAGA -

seqüência da cistatina usada) foi considerado sensível para a papaína. A

reação ocorreu a 30 °C, em meio de tampão fosfato pH 6,8. A atividade

enzimática foi medida por espectrofluorímetro, a 320nm de excitação e

420nm de emissão (GAUTHIER, et ai 1993).

Dois tipos de métodos rápidos para enzimas proteolíticas foram

relatados por Tang, Rowell & Cumming em 1996 e 1997, ambos

empregaram substratos de proteína marcados com flúor, como a albumina

bovina sérica. No primeiro, foi empregado um bioreator com um substrato de

proteína, marcado com flúor, imobilizada numa fase sólida. Este bioreator foi

exposto a solução de enzima proteolítica liberando fragmentos de peptídeos

flúor que foram detectados fluorimetricamente, com tempo de . resposta de

3,8 minutos, para a concentração de 5ng de subtilisina. O segundo método,

utilizou uma proteína marcada com dois reagentes fluorescentes o lúcifer

ye/low VS (L YV) e o tetrametilrodamina (TMR) com transferência de energia

fluorescente característica. Esta metodologia baseou-se na detecção da

redução da transferência da energia, onde a subtilisina hidrolisou o substrato

marcado, liberando o marcador fluorescente na solução e diminuindo a

transferência de energia fluorescente nas moléculas separadas, resultando

no aumento da intensidade emissão da fluorescência do L YV e diminuição

do TMR, proporcional a concentração da enzima usada. Nos dois casos não

apresentaram apenas a vantagem de ser métodos diretos como também

foram sensíveis e rápidos (TANG, ROWELL & CUMMING, 1996 e 1997).

Novos métodos de detecção têm sido relatados incluindo os baseados

na quimioluminescência, Edwards & Townshed, 1995, estudaram a

determinação de proteases por quimioluminescência. Os pesquisadores

31

desenvolveram um sistema de injeção de fluxo que utilizou uma coluna de

politetrafluoretileno para a determinação de proteases, as enzimas testadas

foram a a-chimotripsina e a tripsina. O substrato sintético utilizado foi o

Alalina-alanina-phenilalanina-isoluminol-HBr (AAPIL-HBr), que foi

imobilizado na coluna e a solução amostra foi injetada, utilizando-se uma

bomba peristáltica, misturada a uma solução de Co+2 e mantida a 30 °C. Na

seqüência, foi adicionado peróxido de hidrogênio para sua detecção e a

quimioluminescência foi medida pela emissão de luz resultante da reação

química. A principal vantagem em se utilizar substrato imobilizado não ligado

é a utilização do sistema de fluxo. A proteína passou pela coluna e por

hidrólise liberou o isoluminol imobilizado (EDWARDS, TOWNSHEND &

STODDART, 1995).

Koritas & Atkinson, 1995, desenvolveram um método para detecção

de enzimas proteolíticas na ordem de nanogramas. Foi baseado no emprego

de uma fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina utilizada para

detectar um substrato de proteína biotinilada, previamente fixada em uma

fase sólida, que formou um complexo com gelatina adsorvida em

microplacas. A medida da atividade da enzima estava envolvida na perda de

biotina, resultado da ação proteolítica no complexo gelatina-biotina. O

substrato não digerido pela proteína foi doseado com estreptavidina

fosfatase alcalina. Os autores utilizaram este método para papaína, pepsina,

termolisina e a tripsina, que hidrolisaram o substrato biotinilado em graus

variados (KORITAS & ATKINSON, 1995).

Schade et aI. , 1996, descreveram um método utilizando fluorescência

polarizada. A técnica de polarização foi baseada no princípio que um

composto fluorescentemente marcado, quando excitado por uma luz

polarizada plana, emitirá luz polarizada fluorescente. A polarização emitida

será diferente daquela de excitação devido a molécula fluorescente estar em

movimento durante o tempo no qual ela passa da excitação, para a emissão.

A molécula marcada de menor massa terá um movimento maior e emitirá

valores reduzidos de polarização fluorescente. No experimento foi utilizada a

caseína marcada, em solução, e seu valor de polarização fluorescente foi

32

relativamente alto. Após a introdução da proteinase, a polarização

fluorescente diminui com o tempo devido a formação de moléculas menores

que se movimentaram com velocidade maior e a luz polarizada plana foi

despolarizada, refletindo na diminuição da atividade proteolítica. O novo

substrato fluorescente utilizado foi o BODIPY-a-caseína (4,4 difluor- 5,7-

dimetil-4-boro-3a, 4a - diaza -s- indacene -3- ácido propiônico, succinimidil

éster) designado para estudos de fluorescência polarizada, para a medida

de atividade proteolítica em amplo intervalo de pH (2 a 11). Esse método foi

simples, rápido e reprodutível e permitiu detectar 1 mU de papaína em meio

de pH 6,0 (SCHADE et aI., 1996).

Bock et aI. , 1998, utilizaram como substrato a FITC-caseina (kit do

Sigma) em valor de pH 6,0, utilizando microplacas. Para interromper a

reação foi adicionado ácido tricloroacético a 5% e a solução resultante foi

centrifugada para separação dos peptídeos solúveis. A leitura foi realizada

em um leitor de fluorescência de microplacas, para excitação foi utilizado

485/20nm e para emissão 530/25nm (BOCK ET AL., 1998).

Em um estudo sobre a afinidade e cinética da inibição de cisteína

proteinase pelo contato de cistatina C recombinante bovino, realizado por

OLSSON, EK & BJORK; 1999, a atividade da enzima foi medida com a

utilização do substrato carbobenzoxi-l-fenilalanina-l-arginina-4-

metilcoumarina-7 -amido, em microplacas. O equipamento usado para

detecção da fluorescência foi o Elisa f1uorímetro Fluoroscan II-Labsystems e

o comprimento de onda de excitação foi de 355nm, e de emissão 460 nm

(OLSSON, EK & BJORK, 1999).

Muller & Bordusa, 2000, apresentaram um método de doseamento da

atividade de proteinases baseado no uso de um pequeno substrato sintético,

o tert-butiloxi-carbonil-Glu-p-guanidinafenil éster), contendo apenas um

aminoácido. A hidrólise deste substrato foi detectada pela mudança da

absorção. A enzima foi encubada com o mesmo na temperatura ambiente e

após 1 minuto, efetuou-se a leitura. A absorção máxima foi em comprimento

de onda de 470nm e a concentração mínima de papaína detectada foi 0,13U

(MULLER & BORDUSA, 2000).·

33

2.3 - ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTICOS

A definição de produto cosmético pela legislação brasileira é a

seguinte:

"São preparações constituídas por substâncias naturais ou sintéticas,

de uso externo nas diversas partes do corpo humano, pele, sistema capilar

(pelos e anexos), unhas, lábios, órgãos genitais externos, dentes e

membranas mucosas da cavidade oral , com o objetivo exclusivo ou principal

de limpá-los, perfumá-los, alterar sua aparência e ou corrigir odores

corporais e ou protegê-los ou mantê-los em bom estado" (BRASIL-RDC 79,

2000).

Os produtos cosméticos podem sofrer alterações físicas e químicas,

causadas por diferentes fatores, se eles forem fatores externos são

conhecidos como fatores extrínsecos, se forem inerentes à formulação são

conhecidos como intrínsecos.

• Fatores extrínsecos: tempo, temperatura, luz, oxigênio, umidade,

material de acondicionamento, microrganismos e vibração.

• Fatores intrínsecos: incompatibilidade física e química, como valor de

pH, reações de óxido-redução e hidrólise, interações entre os

componentes da formulação e o material de acondicionamento.

As alterações normalmente observadas nas formulações envolvem:

aspecto, uniformidade, cor, odor e sabor; valores de pH; viscosidade;

condutividade; contaminação microbiológica e teor de princípio ativo

(BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS · COSMÉTICOS,

2004).

As formulações que têm como base uma emulsão podem apresentar

sinais de instabilidade como: cremeação, coalescência, floculação e

separação de fases (ROLAND, et aI. , 2003).

34

o estudo de estabilidade fomece indicações sobre o comportamento

do produto, em determinado intervalo de tempo, frente a condições

ambientais a que possa ser submetido. Para isso, são realizados Testes de

Estabilidade Preliminar e Acelerado, conduzidos em condições de

temperatura, umidade e luminosidade que favoreçam a degradação do

produto. Estas etapas fomecem ao formulador informações para selecionar

as formulações de melhor desempenho que serão submetidas ao Teste de

Estabilidade Normal onde as preparações são avaliadas por um período de

90 a 120 dias e as temperaturas recomendadas são (RIBEIRO, KHURY &

GOTTARDI, 1996; MORETTO, 1999; DREGER, 2000; RIEGER, 2000;

MAIA, 2002; RIBEIRO, 2002; BABY et aI. , 2004; BRASIL - GUIA DE

ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004):

• Ambiente: 20 a 25 ± 2 °C

• Elevadas: 37, 40, 45 e 50 ± 2 °C

• Baixas: -5, 5 e 10 ± 2 °C

Os parâmetros normalmente avaliados nos Testes de Estabilidade são:

características organolépticas, (aspecto, cor, odor e sabor) uniformidade,

valores de pH, de viscosidade, de condutividade, contaminação

microbiológica, ponto de ruptura, índice de saponificação, teor alcoólico, de

princípio ativo, dentre outros (RIBEIRO, KHURY & GOTTARDI, 1996;

MORETTO, 1999; DREGER, 2000; RIEGER, 2000; MAIA, 2002; BABY et

aI. , 2004; BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS

COSMÉTICOS, 2004).

35

9f

SOJ\I.l3raO -t

o presente trabalho tem como objetivos:

+ Desenvolver formulações cosméticas do tipo emulsão não-iônica óleo em

água (O/A) contendo papaína não modificada e modificada;

+ Validar metodologia analítica, para determinação da atividade enzimática

da papaína incorporada em emulsões, utilizando o método

espectrofluorimétrico e microplacas;

+ Avaliar a estabilidade física. físico-química e química da papaína não

modificada e modificada, veiculada em formulações cosméticas do tipo

gel hidrofílico (preparação de referência) e emulsões.

37

8S

SOaO.l311\1 3 1"1~3.l ,,11\1 -t I

4.1 - MATERIAL

4.1.1 - Reagentes

• Ácido acético Merck, grau de pureza anal ítico;

• Ácido clorídrico fumegante 37% Merck, grau de pureza analítico;

• Água ultra-pura MilliQ®;

• Cloridrato de Carbobenzoxi-L-fenilalanina-L-argina-4 metilcumarina- 7

amido (N-CBZ-PHE-ARG-7 -MCA) - Sigma, grau de pureza analítico;

• Cloridrato de cisteína monohidratada Merck, grau de pureza analítico;

• Dimetilsulfoxido Synth, grau de pureza analítico;

• Etilenodiaminotetracetato de sódio (E.D.T.A.) Merck, grau de pureza

analítico;

• Fosfato de sódio dibásico anidro Synth, grau de pureza analítico;

• Hidróxido de sódio, Merck, grau de pureza analítico;

• Papaína Wallerstain 450 MS, grau de pureza farmacêutico.

4.1.2 - Padrão de referência

• Papaína, substância química de referência, Merck teor de

30000USP/mg.

4.1.3 - Equipamentos

• Agitador mecânico tipo "mixer" - Walitta®;

• Balança analítica - Sartorius® modelo BL21 OS;

• Banho de ultrassom - Unique®, modelo Ultrsonic Cleaner;

• Banho-maria digital - Nova Ética® , modelo 5000;

• Centrífuga - Donner® , modelo CD100;

• Condutivímetro Digimed®, modelo DM31;

• Destilador de água - Fabbe® , modelo 106;

39

• Espectrofluorímetro de placas - Packard FluorocountTM modelo

AF1 0.000 e BF1 0.000 para fonte de xenônio;

• Estufa - Fanem, modelo 902 CB;

• Freezer - Consul , modelo Slim 200;

• Geladeira - Bosch, modelo ecoplus 370;

• Potenciômetro- Hanna®, modelo 8417;

• Pipeta automática monocanal 10 a 100IJ.L - Brand® , modelo

Transferpette;

• Pipeta automática monocanal 100 a 1000IJ.L - Labsystems® , modelo

Finnpipette;

• Placas de ELISA, 96 poços, propileno, natural, não estéril;

• Purificador de água - Millipore®, modelo MilliQ Academic;

• Termômetro com graduação de O a 100°C;

• Viscosímetro - Fungilab S.A. modelo Visco Star-R, agulhas TR9, TR

10 e TR11 .

4.1.4 - Outros materiais

• Potes de polietileno branco opaco, capacidade de 50g;

• Placas de Petri.

4.1.5 - Matérias-primas

Grau de pureza farmacêutico

• Adipato de dibutila, Cognis;

• Aristoflex® AVC, copolímero do ácido sulfônico

acriloildimetiltaurato e vinilpirrolidona neutralizado, Clariant;

• Carbopol® 940, polímero carboxívinílico, BF - Goodrich;

• Carbopol ETO 2020, copolímero do ácido poliacrílico, BF -

Goodrich;

• Cetiol® V, oleato de decila, lonquímica;

40

• Cremerol® HMG, glicerídeos hidroxilados do leite, lonquímica;

• Essência, Givaudan;

• Lactato de miristila, Croda;

• Natrosol® 250 HH, hidroxietilcelulose, Galena;

• Óleo mineral, Mapric;

• Palmitato de isopropila, Croda;

• Papaína Wallerstain 450 MS, grau de pureza farmacêutico;

• Papaína Merck® 30.000 USP modificada;

• pemulen® TR1 , polímero cruzado acrilato C1 0-30 alquil-acrilado,

BF - Goodrich;

• Phenoben®, fenoxietanol e parabenos, lonquímica;

• Propilenoglicol , Cosmotec;

• Silicone DC® 5225, ciclopentasiloxano e PEG/PPG -18/18, Dow

Corning;

• Uniox® C, cera auto-emulsionane não iônica, Chemyunion.

ADIPATO DE DIBUTILA

CAS NO. 105-99-7

Fórmula molecular: C14H2604

Definição: adipato de butila é o diéster do álcool butílico e do ácido

adipato e corresponde a seguinte fórmula estrutural :

C4HgOCO(CH2)COOC4Hg

Função química: éster

Funções nas formulações cosméticas: agente condicionador da pele,

agente plastificante e solvente (BRANDÃO, 2000; WENNINGER,

CANTERBERY & MCEWEN, 2000).

41

ARISTOFLEX® Ave

Definição: co-polímero do ácido sulfônico acriloildimetiltaurato e

vinilpirrolidona neutralizado.

Fórmula estrutural :

O .... ~NH

H3C~ H3C CH2 I

S03NH4

Lr°

Características: polímero sintético, pré-neutralizado. Aparência (20

°C): pó branco; teor de sólidos 92,0 %; pH 4,0 - 6,0 (solução 1 % p/vem

água); viscosidade 48.000 - 65.000 mPas (solução 1 % p/vem água).

Funções em formulações cosméticas: agente formador de gel em

sistemas aquosos e como espessante em emulsões óleo em água.

Compatível com solventes orgânicos (etanol, acetona); estável a radiação

ultra violeta e à alta tensão de cisalhamento (CLARIANT, 2001).

CARBOPOL ® 940

CAS NO. 76050-42-5

Definição: polímero sintético do ácido poliacrílico

Função química: polímero sintético

Características: pó branco de odor levemente acético

Funções em formulações cosméticas: agente regulador da

viscosidade e estabilizador de emulsão.

Usos em produtos cosméticos: gel e creme para o rosto, corpo e

mãos; preparações para cabelos e maquiagem (CTFA, 1988; MERCK

INDEX, 1996; BRANDÃO, 2000; WENNINGER, CANTERBERY &

MCEWEN, 2000; HOUSEHOLD,2005; NOVEON, 2004)

42

CARBOPOL ® ETD 2020

CAS N°. 176429-87-1

Definição: copolímero ácido de poliacrílico

Funções em formulações cosméticas: espessante, confere boa

capacidade de escoamento e aparência brilhante nas formulações

cosméticas. Eleva a estabilidade da formulações quando expostas ao

congelamento (NOVEON, 2004).

CETIOL®V

Denominação química: oleato de decila

CAS N°. 3687-46-5

Fórmula molecular: C28Hs402

Definição: oleato de decila é o éster do álcool da decila e do ácido

oleico e corresponde à fórmula estrutural:

o 11

CH3(CH2) 7CH=CH(CH2) 7C- OCH2(CH2)aCH3

Função química: éster de ácidos graxos

Funções nas formulações cosméticas: emoliente de oleosidade

média, melhora o espalhamento e atua como: sobreengordurante da pele,

solubilizante de princípios ativos nas preparações cosméticas e

farmacêuticas e agente condicionador da pele.

Uso em produtos cosméticos: preparações para mãos, corpo, face e

pescoço; maquiagem para os olhos; hidratante; máscara facial ; loção de

limpeza e condicionador de cabelos (CTFA, 1988; BRANDÃO, 2000;

WENNINGER, CANTERBERY & MCEWEN, 2000).

43

CREMEROL ® HMG

Denominação: glicerídeos hidroxilados do leite

Função química: produto biológico

Funções nas formulações cosméticas: emoliente, hidratante e

umectante nas emulsões água em óleo e óleo em água. Eleva a estabilidade

das emulsões, atuando como co-emulsionante.

Usos em produtos cosméticos: creme e loção para mãos, rosto e

corpo (CTFA, 1988; BRANDÃO, 2000; IONQuíMICA, 2002).

EDTA

CAS NO: 60-00-4

Fórmula molecular: C1oH1 6N20s

Definição: diamina substituída que corresponde a fórmula estrutural:

HOOCCH 2 CH2 COOH I I N-CH2CH2- N I I

HOOCCH2 CH2COOH

Função química: aminoácidos substituídos do grupo alquil

Peso molecular: 292,25u; C 41 .10 %; H 5,52; N 9.59 % e O 43.80 %

Solúvel em água a 25°C. O ácido livre é menos estável que a forma

sal, e tende a descarboxilar quando aquecido a temperaturas igualou

superior a 150°C. Estável quando armazenado e submetido à ebulição em

solventes aquosos.

Função nas formulações cosméticas: agente quelante

Usos em produtos cosméticos: produto de limpeza para o corpo

(creme, loção e solução); cuidados da pele, mãos e corpo; creme hidratante;

44

fotoprotetor em gel , creme e solução e produto de limpeza pessoal. Outro

uso: antioxidante em alimentos (CTFA, 1988; BRANDÃO, 2000).

HIDROXIETILCELULOSE

CAS NO. 9004-62-0

Definição: polímero não iônico derivado de celulose, solúvel em água

e estável em valores de pH ácido.

Funções nas formulações cosméticas: agente regulador da

viscosidade, estabilizador de emulsão, espessante (com eficiência em

formulações com laurilsulfato de sódio); formador de filme e ligante.

Uso em produtos cosméticos: indicado para a incorporação de

substâncias ativas que conduzam a uma redução do valor de pH final da

formulação, como por exemplo, o ácido glicólico e ácido ascórbico;

condicionador de cabelos; xampu; sabonete líquido; loção para mão e corpo

e foto protetor (BRANDÃO, 2000; DEG, 2004).

LACTATO DE MIRISTILA

CAS NO. 1323-03-1


Definição: é um éster líquido viscoso, do álcool miristílico e ácido

lático, com a seguinte fórmula estrutural :

HO ~ CH36HCOCH2(CH2)1 2CH3


Funções nas formulações cosméticas: como derivado de um alfa

hidróxiácido, o ácido lático, possui propriedades de umectação elevada sem

45

causar esfoliação na pele, proporcionando toque suave e sedoso. Também

promove brilho e melhor espalhamento das emulsões sobre a pele, podendo

ainda ser adicionado a produtos hidroalcoólicos promovendo lubricidade não

gordurosa.

Usos em produtos cosméticos: devido sua capacidade de hidratação

é indicado para todos tipos de formulações cosméticas e também

farmacêuticas destinadas ao tratamento facial , corporal e capilar (CTFA,

1988; BRANDÃO, 2000; WENNINGER, CANTERBERY & MCEWEN, 2000;

CHEMYUNION, 2003).

ÓLEO MINERAL

CAS NO: 8012-95-1 , 8042-47-5, 8020-83-5

Definição: mistura líquida de hidrocarbonetos obtidos do petróleo.

Função química: hidrocarbonetos

Características: líquido incolor e oleoso, praticamente insípido e

inodoro mesmo quando aquecido. Densidade relativa entre 0,83 - 0,905 e

tensão superficial a 25°C é cerca de 35 dinas/cm. Insolúvel em água e

álcool e solúvel em benzeno, clorofórmio, éter e óleos.

Funções nas formulações cosméticas: solvente de fragrância, agente

condicionador dos cabelos e da pele, promovendo emoliência e protetor da

pele.

Usos em produtos cosméticos: emulsão para mãos, corpo, face e

pescoço; óleos de banho; emulsão foto protetora e maquiagem (CTFA, 1988;

MERCK INDEX, 1996; BRANDÃO, 2000; WENNINGER, CANTERBERY &

MCEWEN, 2000).

PALMITATO DE ISOPROPILA

CAS NO. 142-91-6


46

Definição: éster do álcool isopropílico e ácido palmítico, e corresponde

à fórmula estrutural :

o II

CH 3 (CH2)'4C-OCH(CH3h


Funções nas formulações cosméticas: ligante; solvente de fragrância;

agente condicionador da pele, conferindo emoliência e agente condicionante

para os cabelos.

Usos em produtos cosméticos: batom; hidratante para mãos e corpo,

face e pescoço; maquilagem; limpeza da pele; óleo de banho; loção pós

barba; perfume; talco; xampu e condicionador; máscara facial ; removedor de

maquilagem; sabonete e detergente (CTFA, 1988 BRANDÃO, 2000;

WENNINGER, CANTERBERY & MCEWEN, 2000; COGNIS, 2002;

IONQuíMICA, 2002).

PEMULEN ® TR1

Definição: polímero de ácidos poliacrílicos de peso molecular elevado.

Possuem uma pequena parte da molécula com afinidade pela fase oleosa da

preparação (I ipofílica), e a maior parte com afinidade pela fase aquosa

(hidrofílica).

Função química: polímero

Funções nas formulações cosméticas: agente emulsificante primário

em emulsões tipo óleo em água. A porção lipofílica de sua estrutura é

adsorvida na interface óleo/água, e a porção hidrofílica entumece na água,

formando uma rede de gel em torno das gotas de óleo, fornecendo

estabilidade elevada para emulsões com grande variedade de óleos

incorporados.

47

É um emulsificante polimérico versátil que pode emulsificar até 30%

de óleo na formulação, dentro de um intervalo de pH de 4 a 5,5 e até 20% de

óleo com variação de pH de 3 a 11 (NOVEON, 2004).

PHENOBEN®

Denominação química: fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno,

porpilparabeno e butilparabeno

Funções nas formulações cosméticas: agente conservante de amplo

espectro de ação. Utilizado na conservação de produtos cosméticos e

farmacêuticos de uso tópico.

Fenoxietanol CAS NO. 122-99-6

Fórmula molecular: CaHlO0 2

Definição: éter alcoólico aromático

Função química: éter, álcool

Funções: antimicrobiano, componente de fragrância

Metilparabeno

CAS NO. 99-76-3

Fórmula molecular: CaHa03

Definição: éster do álcool metílico e do ácido p-hidroxibenzóico

Função química: éster, fenol

Funções: antimicrobiano

Etilparabeno

CAS NO. 120-47-8

Fórmula molecular: C9HlO0 3

Definição: éster do álcool etílico e do ácido p-hidroxibenzóico



48

Propilparabeno

CAS NO. 94-13-3

Fórmula molecular: C1QH120 3

Definição: éster do álcool n-propílico e do ácido p-hidroxibenzóico


Funções: antimicrobiano e componente de fragrância

Butilparabeno

CAS NO. 94-26-8

Fórmula molecular: C11 H1403

Definição: éster do álcool butílico e do ácido p-hidroxibenzóico



(BRANDÃO, 2000; WENNINGER, CANTERBERY & MCEWEN, 2000;

IONQuíMICA, 2002).

PROPILENOGLlCOL

Denominação química: 1,2- propanodiol; metilglicol

CAS NO. 57-55-6

Fórmula molecular: C3Ha0 2

Definição: álcool alifático que corresponde a fórmula estrutural:

Função química: álcool

CH3CHCH20H I OH

Funções nas formulações cosméticas: umectante; hidratante para a

pele; solvente; agente de redução de viscosidade.

Usos em produtos cosméticos: produtos cosméticos para mãos,

corpo, face e pescoço; cuidado da pele; limpeza da pele (creme, loção e

solução); máscara em pasta e maquiagem.

49

Mesmo para o uso interno, o propilenoglicol é seguro para uso.

Miscível em água, acetona e clorofórmio, mas imiscível com óleos estáveis.

Sob condições normais, o propilenoglicol é estável, mas em temperaturas

elevadas tende a oxidar, dando origem a produtos como ácido lático, ácido

pirúvico e ácido acético. LD50 oral em ratos: 25mllkg

Outros usos: como anticongelante não tóxico em cerveJanas e

leiterias. Substituto para o etilenoglicol e do glicerol. Na produção de resina

sintética. Como inibidor de fermentação e do crescimento de bolor em

alimentos. (CTFA, 1988; MERCK INDEX, 1996; WENNINGER,

CANTERBERY & MCEWEN, 2000).

SILlCONE DOW CORNING~ 5225C

Características: líquido viscoso, translúcido, com odor característico.

Dispersão de silicone poliéter de peso molecular elevado em

decametilciclopentasiloxano.

Funções nas formulações cosméticas: emoliência e maciez; melhora

a espalhabilidade; reduz a oleosidade e a pegajosidade.

Usos em produtos cosméticos: maquilagem; preparações de creme

para mãos; corpo, rosto e pescoço e formulações destinadas ao tratamento

dos cabelos (DOW CORNING, 2001) .

UNIOX® C

Definição: cera auto emulsionante não iônica, usada na concentração

de 2 a 15%. Apresenta estabilidade com grande variedade dos princípios

ativos.

Funções nas formulações cosméticas: constitui sozinho um sistema

de emulsão. Proporciona estabilidade e viscosidade adequadas para

emulsões sob a forma de creme e loção. Forma emulsões economicamente

viáveis e elaboração simples, sendo adequado nos sistemas para os quais

as ceras auto emulsionantes aniônicas são contra-indicadas. Em

50

formulações do tipo óleo em água, onde a manutenção da estabilidade é

difícil , pode-se utiliza-lo como auxiliar de emulsificação para estabilizar a

emulsão e equilibrar as fases.

Usos em produtos cosméticos: condicionador para cabelo; para

emulsificação dos aditivos da fase oleosa (CHEMYUNION, 2003; DEG,

2004).

4.2 - MÉTODOS

4.2.1 - Doseamento da atividade da papaína

A papaína foi doseada por espectrofluorimetria utilizando-se o método

das microplacas, que consistem em placas com 96 poços e um substrato

sintético fluorimétrico, o cloridrato de Carbobenzoxi-L-fenilalanina-L-argina-4

metilcoumarina- 7 amido (N-CBZ-PHE-ARG-7 -MCA) e o produto hidrolítico

da reação é o 4-metilcumarina-7amido. O método sensível , pode ser

empregado na determinação da atividade da papaína e os filtros usados

para detecção foram: para excitação 360nm, e para emissão 460nm

(KANAOKA & TAKAHASHI, 1977; BARRET, 1980; CHAMBERS, et aI. , 1998;

KORITAS & ATKINSON, 1995; BOCCK et aI. , 1998; OLSSON, EK &

BJORK, 1999).

4.2.1.1 - Soluções empregadas

Solução tampão fosfato de císteína - EDTA

Dissolveram-se cerca de 3,55g de fostato dibásico anidro em 400mL

de água ultra-pura (Milli Q) em um balão volumétrico de 500mL.

Adicionaram-se 7,Og de EDTA e 3,05 de cloridrato de cisteína

monohidratado. Ajustou-se o valor de pH para 6, O +/- 0,1 com solução de

ácido clorídrico 1 N ou de hidróxido de sódio 1 N e completou-se o volume

com água destilada (LOPES, 1999; USP 25, 2002; VELASCO, 1993). 51

Solução de ácido acético 30% v/v

Transferiram-se 30mL de ácido acético para um balão volumétrico de

100mL completou-se o volume com água destilada.

Solução do substrato Cloridrato de Carbobenzoxi-L-fenilalanina-L

argina-4 metilcumarina- 7 amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA)

Pesaram-se exatamente 25mg do substrato (N-CBZ-PHE-ARG-7-

MCA) e dissolveram-se em exatamente 38,5mL de dimetilsulfoxido em

erlenmeyer de 50 mL, utilizando pipeta volumétrica automática. No

momento do doseamento, transferiram-se 400f.lL desta solução para um

balão volumétrico 25mL e completou-se o volume com a solução tampão

fosfato de cisteína - EDT A.

52

de 3 colunas e 4 fileiras, corresponde a um valor de concentração diferente

da papaína, doseada em triplicata. Os demais espaços foram preenchidos

por outras amostras.

b) Curva de calibração

Para a construção da curva de calibração pesaram-se exatamente

25mg de papaína padrão secundário Merck 30000USP/mg, dissolvidos em

solução tampão fosfato de cisteína - EDTA em balão volumétrico de 250m L.

Dessa solução, transferiram-se alíquotas de 180llL a 1500llL para 5 balões

volumétricos de 100mL, completando-se o volume com tampão fosfato de

cisteína - EDTA e obtendo-se as seguintes concentrações:

• 0,18; 0,3; 0,6; 1,2 e 1,5Ilg/mL

Em cada conjunto de 3 colunas e 4 fileiras de poços da microplaca,

Figura 2, foram adicionadas as seguintes soluções, na seqüência:

• tampão fosfato de cisteína EDTA 551lL;

• substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA 1251lL; solução de papaína -

Padrão secundário 30000USP/mg, 20llL e ácido acético 30% v/vem

intervalos de 15 minutos, iniciando-se no tempo O e terminando aos

45 minutos, 40 1lL.

A microplaca foi conduzida ao banho-maria na temperatura de 40°C.

O teste foi realizado em triplicata e a leitura foi efetuada em

espectrofluorímetro. Por meio da elaboração dos gráficos de tempo em

função do aumento da fluorescência, obteve-se a velocidade de aumento de

unidades de fluorescência por minuto para cada concentração.

As concentrações da papaína nos poços da microplaca foram as

seguintes: 0,450; 0,750; 1,500; 3,000 e 3,750 USP/mL.

54

c) Especificidade - Estudo de interferentes dos excipientes da emulsãobase e gel-base sem papaína

Com o objetivo de analisar a interferência dos excipientes no método

proposto, foram analisadas as formulações bases 2, 3 e Gel, Tabela 5, sem

adição da papaína.

Pesaram-se exatamente cerca de 3,125g de cada formulação

selecionada, diluindo-se em solução tampão fosfato de cisteína - EDT A em

balão volumétrico de 50mL. Transferiram-se 2,5mL para balão volumétrico

de 25mL, completou-se o volume com tampão citado anteriormente. Dessa

solução tomaram-se 0,3mL para balão volumétrico de 25mL e completou-se

o volume com o mesmo diluente, realizando o procedimento como descrito

no item 4.2.1.2, b (BRASIL, RESOLUÇÃO 899, 2003).

d) Precisão

A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou

coeficiente de variação (CV%) segundo a equação (BRASIL, RESOLUÇÃO

899,2003):

DPR = DP X 100

CMD

Onde:

DP = desvio padrão

CMD = concentração média determinada = média das 10 determinações

DPR = desvio padrão relativo

Para a avaliação da precisão intra-dia do método, realizaram-se 10

determinações de cada amostra na concentração 1,5USP/mL, no poço da

microplaca e calculou-se o coeficiente de variação segundo a equação

acima.

55

e) Exatidão

Para verificar a exatidão do método, foi realizado o teste de

recuperação. Onde foi adiciona à amostra quantidade conhecida de solução

da substância padrão (BRASIL, RESOLUÇÃO 899, 2003).

Solução Padrão - Merck 30000USPlmg

Pesaram-se exatamente 25mg de papaína, padrão secundário Merck

30000USP/mg, que foram dissolvidos em solução tampão fosfato de cisteína

- EDTA em balão volumétrico de 250m L.

Solução da amostra

Pesaram-se quantidades de amostras equivalentes a exatamente

25mg de papaína Wallerstain , que foram dissolvidas em solução tampão

fosfato de cisteína - EDTA em balão volumétrico de 250mL.

Procedimento

Foram transferidas alíquotas da solução padrão e da amostra para

balões volumétricos de 50 mL, conforme o esquema da Tabela 3.

Tabela 3 - Volumes adicionados das soluções das amostras e da solução

padrão no teste de recuperação.

Balão volumétrico

(50 mL)

1

2

3

Volume adicionado (mL)

Amostra

0,150

0,150

Padrão

0,3

0,3

56

A exatidão foi calculada como porcentagem da recuperação segundo

a equação (BRASIL, RESOLUÇÃO 899, 2003):

Onde:

E = Exatidão

E=CME x 10

CT

CME = Concentraçã média experimental

CT = concentração teórica

f) Limite de detecção

O limite de detecção (LO) foi estabelecido pela construção de 3

curvas de calibração do padrão secundário Merck 30000 USP/mg, nas

concentrações: 0,075; 0,225; 0,750; 1,5; 3,0 e 3,750 USP/mL em cada poço,

de onde se obteve o DP e a IC sendo expresso pela equação (BRASIL,

RESOLUÇÃO 899, 2003):

Onde:

LO = OPa X 3

IC

OPa = Desvio padrão do intercepto com o eixo y das 3 curvas de calibração

IC = Inclinação da curva de calibração

g) Limite de quantificação

O limite de quantificação (LO) é a menor quantidade da substância que

pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis, sob condições

experimentais estabelecidas.

Este valor foi estabelecido, analisando-se soluções contendo

concentrações decrescentes de papaína. A partir dos resultados obtidos,

57

construíram-se 3 curvas de calibração, aplicando-se os resultados na

equação descrita a seguir (RESOLUÇÃO 899, 2003):

Onde:

LQ = OPa X 10

IC

OPa = Desvio padrão do intercepto com o eixo y das 3 curvas de calibração

IC = Inclinação da curva de calibração

As concentrações usadas para a construção das curvas de calibração

foram; 0,075; 0,225; 0,750; 1,5; 3,0 e 3,750 USP/mL

4.2.2 -Modificação da enzima

O processo de alteração da enzima foi realizado em colaboração com

o Laboratório de Enzimologia Industrial do Departamento de Tecnologia

Bioquímica-Farmacêutica, sob coordenação do Prof. Dr. José Abrahão

Neto. A modificação da enzima foi realizada com polietilenoglicol modificado,

com peso molecular médio de 5000, que gera um derivado de succinimida e

ácido cianúrico. Este derivado reage especificamente com as aminas livres

da cadeia lateral de lisinas da enzima. Esta reação foi realizada em meio de

tampão pH 7,5 e à temperatura de 15 °C com duração de tempo de 12

horas. A concentração de papaína utilizada foi de 5% (p/v) .

Como controle do processo de peglação, incorporação do

polietilenoglicol na papaína, foi realizada uma análise de eletroforese em gel

de poliacrilamida e doseamento do grupo de polietilenoglicol incorporado na

papaína por meio de espectrofotometria utilizando o ácido trimetil benzeno

sulfônico (TNBS) e comparando-se com padrão de referência (HABEEB,

1966; MATSUYAMA et aI. , 1991.).

58

4.2.3 - Teste de Estabilidade Preliminar

4.2.3.1 - Pré-formulações

Preparam-se 23 pré-formulações, variando-se o tipo e a concentração

dos polímeros adicionados, e suas misturas com hidroxietilcelulose. Os

emolientes e a cera não iônica que se encontram na fase oleosa, foram

mantidos sem alterações de concentração. A fase complementar onde se

encontram o conservante, o silicone e a essência, também foi mantida sem

alteração para todas as formulações. Na fase aquosa o componente que não

sofreu alteração de concentração foi o propilenoglicol. Estas pré-formulações

foram preparadas com intuito de selecionar aquelas de maior estabilidade

macroscópica, avaliadas por análise visual , após 24 horas da adição da

papaína, onde se observaram alterações das características organolépticas,

homogeneidade, cor e odor com o objetivo de identificar processos de

instabilidade, como cremeação, floculação e coalescência. Consideram-se

também as características sensonalS, avaliadas segundo critério

preconizado pelo analista (espalhamento na pele e toque sedoso). A partir

dos resultados apresentados, escolheram-se 10 pré-formulações que foram

submetidas ao Testes de Estabilidade Preliminar (centrifugação e estresse

térmico) . A composição de cada pré-formulação está descrita nas Tabelas 4

e 5 (FERRARI , 1998; MAIA 2002, BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE

PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004).

59

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61

Preparam-se 200g de cada pré-formulação, empregando aquecimento

dos componentes das Fases oleosa e aquosa, separadamente, a 70-75 °C

em recipiente de aço inox e com posterior mistura, empregando-se a técnica

de inversão de fases, ou seja, a Fase aquosa foi vertida sobre a Fase

oleosa de forma constante e lenta, com o auxilio do agitador mecânico, tipo

mixer. Após o preparo das mesmas e seu resfriamento até 35 °C,

adicionaram-se, separadamente, os Componentes da fase complementar,

homogeneizando-os com o auxílio de espátula (MAIA, 2002).

Após um período de 24 horas de repouso para estabilização da

emulsão, foram incorporados 0,8% p/p de papaína nativa (não modificada) e

0,16% p/p de cloridrato de cisteína, previamente diluídos em quantidade

suficiente de água destilada. Foram acondicionadas 30g das pré

formulações em frascos de poli etileno branco e de boca larga com

capacidade de 50g e foram mantidas à temperatura ambiente a 22 1: 2 °C

(DREGER, 2000; RIEGER, 2000).

4.2.3.2 - Condições do Teste Preliminar de Estabilidade e variáveis

analisadas

As formulações consideradas estáveis macroscopicamente, segundo

o item 4.2.3.1 , foram submetidas aos testes de centrifugação e estresse

térmico, avaliando-se as características organolépticas (aspecto, cor e odor)

e de valor o pH (somente para as formulações macroscopicamente estáveis,

ao final do teste). As amostras foram avaliadas no início e no final de cada

teste, à temperatura ambiente (MAIA, VELASCO & DAZZI, 2000; MAIA,

2002; ROLAND et aI. , 2003; BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE

PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004).

Para avaliação das características organolépticas, cor, odor e

aspecto, foi empregada a seguinte nomenclatura para classificá-Ias:

62

COR

N - Normal, sem alterações ( cor branca)

LM - Levemente Modificada (cor gelo)

M - Modificada (cor palha)

IM - Intensamente modificada (cinza)

ODOR

N - Normal, sem alterações (odor da essência)

LM - Levemente Modificado (perda do odor da essência)

M - Modificado (odor característico da degradação da papaína)

IM - Intensamente modificado (odor intenso característico da degradação da

papaína)

ASPECTO

N - Normal, sem alterações (homogêneo)

LM - Levemente Modificado (início de alterações como a separação de

fases, a cremeação ou a f1oculação)

M - Modificado (alterações caracterizadas de separação de fase, cremeação

ou f1oculação)

IM - Intensamente modificado (alteração completa da formulação com

separação total das fases, intensa cremeação ou floculação )

a) Centrifugação

Dez gramas de cada formulação foram submetidas a ciclos de

centrifugação de 1000, 2500 e 3500rpm em centrífuga, durante quinze

minutos para cada velocidade (FERRARI, 1998; MAIA, 2002; ROLAND et

aI., 2003).

b) Estresse térmico

Acondicionaram-se as pré-formulações em frascos de polietileno

branco e de boca larga com capacidade de 50g, que foram transferidos para 63

banho-maria no intervalo de temperatura entre 40 e 80°C. Realizou-se a

elevação de 10 em 10°C mantendo-se por trinta minutos em cada valor

(FERRARI, 1998; MAIA 2002).

4.2.4 - Teste de Estabilidade Acelerada

As pré-formulações consideradas aprovadas nos testes preliminares,

(total de 4) , foram submetidas ao Teste de Estabilidade Acelerada

(RIBEIRO, KHURY & GOTIARDI, 1996; FERRARI, 1998; MAIA, 2002;

BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004;

BABY et aI. , 2004).

4.2.4.1 - Avaliação inicial

As formulações foram avaliadas inicialmente quanto às características

organolépticas, aspecto, cor e odor, valor de pH, de viscosidade aparente e

de condutividade (RIBEIRO, KHURY & GOTIARDI, 1996; FERRARI, 1998;

MAIA, VELASCO & DAZZI, 2000; MAIA, 2002; BRASIL- GUIA DE

ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004; BABY et aI. , 2004).

4.2.4.2 - Condições do teste

Após 24 horas de preparo e incorporação da papaína e cisteína nas

formulações, estas foram submetidas às condições e períodos de avaliação,

descritos da literatura científica (RIBEIRO, KHURY & GOTTARDI, 1996;

FERRARI, 1998; MAIA, 2002; BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE

PRODUTOS COSMÉTICOS, 2004; BABY et aI., 2004) .

a) Geladeira (5 ± 1°C)

As formulações foram mantidas em geladeira durante 12 dias e avaliadas

nos 3°, 7° e 12° dias.

64

b) Temperatura ambiente (22 ± 2°C)

As formulações foram mantidas à temperatura ambiente, durante 12 dias,

sendo avaliadas no 3°, YO e 12° dias.

c) Estufa (45 ± 2°C)

As formulações foram mantidas em estufa durante 12 dias, sendo

avaliadas nos 1 0, 3°, YO e 12° dias.

d) Ciclo gela e degela (45 ± 2 °C/-10 ± 1°C)

As formulações foram submetidas a períodos de congelamento (-10 ±

1°C) por 24 horas em freezer, seguido de descongelamento em estufa (45 ±

2°C) por 24 horas, completando-se dessa forma um ciclo. Foram realizados

6 ciclos, sendo as amostras avaliadas no 3° (6° dia) e 6° ciclos (12° dia).

e) Freezer (-10 ± 1°C)

As formulações foram mantidas à temperatura de -10 ± 1°C, em freezer

durante 12 dias e avaliadas nos 3°, YO e 12° dias.

4.2.4.3 - Variáveis analisadas

a) Características organolépticas

As características organolépticas das amostras foram observadas

com o auxílio de placas de Petri, analisando a homogeneidade, separação

de fases, presença de grumos e precipitados, odor e cor. As amostras de

65

referência foram mantidas a 5 ± 1 °C. Foi adotada a nomenclatura descrita

no item 4.2.3.2 (MAIA, VELASCO & DAZZI 2000).

b) Valor de pH

As amostras foram diluídas em água recém-destilada e com pH

neutralizado, na proporção de 1: 1 O p/v e submetidas à leitura em

potenciômetro à temperatura ambiente (DAVIS, 1977).

c) Viscosidade aparente

Aproximadamente 15g de cada amostra foram analisadas em

viscosímetro, à temperatura ambiente, utilizando-se as agulhas e

velocidades descritas em Resultados, Tabelas 13, 14, 15 e 16 de acordo

com cada formulação (MAIA, 2002, BANOV, 2002).

d) Condutividade elétrica

A condutividade elétrica das emulsões foi avaliada, inserindo-se o

eletrodo diretamente na amostra (DAVIS, 1977; PRISTA, BAHIA & VILAR,

1995; MARTIN, MEDWICK & KING, 1990).

4.2.5 - Teste de Estabilidade Normal

Avaliando-se os resultados do Teste de Estabilidade Acelerada foram

escolhidas 2 formulações submetidas ao Teste de Estabilidade Normal.

Prepararam-se 1300g de cada formulação. Aproximadamente 30g foram

distribuídas em frascos de polietileno branco e de boca larga com

capacidade para 50g (BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS

COSMÉTICOS, 2004).

66

4.2.5.1 - Amostras

Como formulação de referência foi utilizada uma preparação sob a

forma de gel Formulação Gel, descrita na Tabela 6 (Velasco, 1993). As

amostras submetidas ao teste foram as formulações de números 2 e 3

(Tabela 6), acrescidas de 0,8% p/p de papaína (não modificada) e 0,16% p/p

de cisteína, pois apresentaram melhor desempenho de acordo com os

resultados obtidos no Teste de Estabilidade Acelerada. A formulação de

número 2 foi escolhida para ser incorporada com a papaína modificada,

denominada Formulação 2M (Tabela 6). Após um período de 24 horas de

preparo da desta formulação foram incorporados 22,06% (p/v) da papaína

modificada e 0,16% p/p de cisteína.

67

Tabela 6 - Formulações submetidas ao Teste de Estabilidade Normal. Gel

(Referência), e preparações números 2 e 3, acrescidas de 0,8% (p/p) de

papaína (não modificada) e 0,16% p/p de cisteína e a preparação 2M

adicionada de 22,06% (p/v) papaína modificada e 0,16% p/p de cisteína.

Formulação

Componentes Gel 2 3 2M .. _ .. _ .. - --.. _ .. _-._ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _.-_.-_. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. - .. - .. _ .. _ .. _ .. _ .. - .. _-._ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. _ .. -

Fase oleosa % p/p

Uniox® C 1,5 1,5 1,5

Óleo mineral 0,5 0,5 0,5

Lactato de miristila 1,0 1,0 1,0

Palmitato de isopropila 2,0 2,0 2,0

Cetiol® V 2,0 2,0 2,0

Cremerol® HMG 0,5 0,5 0,5

Adipato de dibutila 1,0 1,0 1,0

Aristoflex® AVC 1,5 1,5

Fase aquosa

Carbopol® 940 0,6 1,0

Propilenoglicol 5,0 2,5 2,5 2,5

Água destilada q.s.p. 100,00 100,0 100,0 100,0

Fase Complementar

Meti Iparabeno 0,3 0,3 0,3 0,3

Phenoben® 0,5 0,5 0,5

Silicone®OC 5225 2,5 2,5 2,5

Essência 0,5 0,5 0,5

Papaína nativa (não modificada) 0,8 0,8 0,8

Papaína modificada 22,06

Cloridrato de cisteína 0,16 0,16 0,16 0,16

Legenda

- Componentes não adicionados

68

4.2.5.2 - Condições do teste de estabilidade nonnal

Após 24 horas de preparo e incorporação da papaína e cisteína nas

formulações, as mesmas foram submetidas às seguintes condições e

períodos de avaliação, adaptando-se da literatura científica (RIBEIRO,

KHURY & GOTIARDI, 1996; FERRARI,1998; MAIA, 2002; ROLAND et aI.,

2003; BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS COSMÉTICOS,

2004; BABY et aI., 2004).

• Geladeira (5 ± 1°C);

• Temperatura ambiente (22 ± 2°C);

• Estufa (40 ± 2°C).

As formulações foram analisadas após 24 horas de repouso nos 3Q, 7Q

,

15Q, 30Q

, 60Q, 90Q dias.

4.2.5.3 - Variáveis analisadas

A avaliação das formulações envolveu: características organolépticas,

(procedimento descrito no item 4.2.3.2); valores de pH, de viscosidade e de

condutividade (descritos no item 4.2.3.3) e doseamento da atividade da

papaína, conforme item 4.2.1 (~IBEIRO, KHURY & GOTTARDI, 1996;

FERRARI,1998; MAIA, VELASCO & DAZZI, 2000; MAIA, 2002; ROLAND et

aI. , 2003; BRASIL - GUIA DE ESTABILIDADE DE PRODUTOS

COSMÉTICOS, 2004; BABY et aI. , 2004).

69

OL

O\fssn~Sla 3 SOa\f.llnS3~ -g -

5.1 - CURVA DE CALlBRAÇÃO

Na Tabela 7 e Figura 3 são apresentados os resultados da curva de

calibração da papaína Merck 30000, padrão secundário.

Tabela 7. Resultados experimentais obtidos na curva de calibração para a

papaína Merck 30000, USP/mg, padrão secundário.

Concentração de leitura

USP/mL

0,450

0,750

1,500

3,000

3,750

Velocidade*

4,15

5,46

10,32

20,96

25,55

* Média de três determinações para cada concentração

ê 35 "1

~ I I

30 i '13 c 25 -1 a><Q)

"O u i ro ~ 20 ~ "O .... '13 g ;

.Q<;:::: 15 1 Ql Ql >"0 10 ~ Ql

"O ro 5 ~ "O '2 2- o i

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000

USP/mL

Figura 3 - Curva de calibração da papaína Merck 30000USP/mg.

A partir da curva de calibração obteve-se a Equação 1.

Equação 1: y = 6,6388x + 0,7391 R2 = 0,999

Onde: y = Velocidade do aumento de unidades de fluorescência por

minuto

x = Concentração de papaína em unidades USP por mL

R2 = Coeficiente de correlação linear 71

De acordo com os dados apresentados na Tabela 7, Figura 3 e

Equação 1 e pela construção da curva de calibração, verificou-se a

proporcionalidade entre a concentração da papaína padrão secundário

utilizada (30000USP/mg) e o aumento da velocidade de formação do

composto fluorescente. O coeficiente de correlação linear R2 foi igual a 0,999

correspondendo ao valor de R= 0,999, estando de acordo com o limite

apresentado pela literatura (R ;::: 0,99) e demonstrando linearidade do

método analítico empregado (BRASIL, RESOLUÇÃO 899, 2003).

72

5.2 - ESPECIFICIDADE - ESTUDO DE INTERFERENTES DOS

EXCIPIENTES, A PARTIR DAS EMULSÕES-BASE E GEL-BASE SEM

PAPAíNA

Os resultados da análise dos excipientes empregados nas formulações

2, 3 (emulsão-base)e Gel, sem adição de papaína são apresentados nas

Tabelas 8, 9 e 10 e Figuras 4,5 e 6.

Tabela 8 - Resultados experimentais do estudo de interferentes dos excipientes

obtidos no doseamento da formulação 2, sem adição de papaína.

tempo (minutos)

cu 'õ c:

<<1) (J cn <1) .... o ~ u: <1)

"O cn Q)

"O cu

"O °c ::J

o 15

30

45

100,0 -. I i • 50,0 -1

0,0 O 10

* Média de 3 determinações

•

Unidades de Fluorescência·

............... =c::: • 20 30

tempo (minutos)

65,0

80,S

62,3

72,0

40

•

50


doseamento da formulação 2, sem adição de papaína.

A partir da Figura 4 foi elaborada a Equação 2

Equação 2: y = O,0189x + 69,53 R2 = 0,002

Onde: y = unidades de fluorescência

x = tempo (minutos)

R2 = coeficiente de correlação linear 73


excipientes obtidos no doseamento da formulação 3, sem adição de

papaína.

tempo (minutos)

o 15

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45


tU 'ü c: 1 100,0 l g I li: 50,0 1 ~ I "O o o i tU , "O

o 'c ::> 10


•

Unidades de Fluorescência*

•

20 30

75,0

62,7

68,S

74,0

tempo (minutos)

•

40 50

Figura 5 - Curva de 4 tempos (tempo x unidades de fluorescência) obtida

pelo doseamento da formulação 3, sem adição de papaína.

A partir da Figura 5 foi elaborada a Equação 3.

Equação 3: y = 0,0189x + 69,62


x = tempo (minutos)

R2 = coeficiente de correlação linear

R2 = O 0041 ,

74


excipientes obtidos no doseamento da formulação Gel, sem adição de

papaína.

tempo (minutos)

o 15

30

45

." Média de 3 determinações

m 'u c

'Q) u CI)

~ o :l ~

100,0

50,0

Unidades de Fluorescência·

78,0

67,0

71,0

75,0

Q) 'O CI) Q) 'O m 'O 'c :::J

0,0 -t-------"T------,-- ---,-------,----------.

O 10 20 30 40 tempo (minutos)


Figura 6 - Curva de 4 tempos (tempo x unidades de fluorescência) obtida no

doseamento da formulação Gel, sem adição de papaína

A partir da Figura 6 foi elaborada a Equação 4.

Equação 4: y = -0,0333x + 75,5


x = tempo (minutos)

R2 = coeficiente de correlação linear

R2 = 0,0182

75

50

A especificidade é a habilidade do método em avaliar,

inequivocamente, o analito, na presença de componentes que poderão estar

presentes durante a análise, como impurezas, produtos de degradação e

componentes da matriz. Nesta pesquisa este parâmetro foi avaliado por

meio da verificação se o método não foi afetado por substâncias, que

estavam presentes no veículo da formulação (USP 25, 2002, PINTO,

FERRARINI & GA TIl, 2003).

A pesquisa de interferentes das formulações escolhidas para o

Estudo de Estabilidade Nonnal apresentou resposta de baixa velocidade

do aumento de unidades de fluorescência por minuto, como apresentado

nas Figuras 4, 5 e 6 , Tabelas 8, 9 e 10, confirmando a especificidade do

método e não interferência dos excipientes (BRASIL, RESOLUÇÃO 899,

2003).

76

5.3 - PRECISÃO

Nas Tabela 11 estão apresentados os resultados da precisão intra

dia, obtidos da análise das formulações 2, 3, e Gel acrescido de papaína

0,8% (p/p) de papaína.

Tabela 11 - Precisão intra-dia - Resultados experimentais obtidos da

avaliação da precisão intra-dia das amostras 2, 3 e Gel. As leituras foram

obtidas no mesmo dia.

Fonnulação

Determinação

2 3 Gel

Concentração obtida (USP/mL)

1 289,9 279,2 256,1

2 298,6 306,0 258,5

3 284,1 304,7 257,5

4 284,2 288,4 257,3

5 301,1 270,0 253,0

6 262,7 300,5 257,3

7 281,4 276,2 241,9

8 283,5 272,5 254,8

9 304,7 276,2 270,4

10 285,1 302,3 253,9

M* 285,06 302,34 253,87

D.P.R.%** 4,2 5,0 2,7

Onde:

• M*- Média D.P.R.** - Desvio padrão relativo

77

Verificamos que a partir dos resultados obtidos na Tabela 11 a precisão

do método foi considerada adequada, com desvio padrão relativo inferior a

5,0 estando de acordo com a recomendação da literatura, confirmando a

validação do método (BRASIL, Resolução 899, 2003).

Em situações mais complexas, que exigem operações múltiplas ou

delicadas de extração, derivação, ou na análise de traços, são aceitos

valores de 5 a 10% (PINTO, FERRARINI & GA TIl, 2003).

78

5.4 - EXATIDÃO

Os resultados dos testes de recuperação efetuados nas amostras são

apresentados na Tabela 12.

Tabela 12 - Resultados obtidos no teste de recuperação da papaína

aplicado nas amostras das formulações 2, 3 e Gel.

Quantidade de padrão Quantidade de padrão Exatidão

Fonnulação adicionado recuperado·

(USP/rnL) (USP/rnL) (%)

2 1,5 1,43 95,3

3 1,5 1,48 98,7

Gel 1,5 1,45 96,7

* média de três determinações

5.5 - LIMITE DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

Na Tabela 13 são apresentados os resultados da análise do limite de

detecção e quantificação da papaína.

Tabela 13 - Resultados para calculo do limite de detecção e quantificação da

papaína pelo método espectrofluorimétrico de microplacas.

Curvas Intercepto com o

eixo Y

Inclinação

1

22

3

M

DP

0,4990

0,6576

0,5808

0,079

M - Média da inclinação obtida com a construção das três curvas

OP - Desvio Padrão do intercepto das três curvas

6,82

6,54

6,44

6,60

79

o Limite de Detecção calculado, segundo a literatura, utilizando-se a

equação descrita no item 4.2.1.2 f, foi de 0,040 USP/mL (BRASIL,

Resolução 899, 2003; PINTO, FERRARINI & GA TTI, 2003).

O Limite de Quantificação calculado, segundo a literatura, utilizando

se a equação descrita no item 4.2.1.2 9 foi de 0,12 USP/mL (BRASIL,

Resolução 899, 2003; PINTO, FERRARINI & GA TTI, 2003).

Estes resultados demonstram que o método é bastante sensível

comparado aos resultados do método espectrofluorimétrico que utiliza a

caseína como substrato, onde o limite de detecção foi de 3420 USP/mL

e o limite de quantificação foi de 10380 USP/mL. O método que utiliza o

substrato cloridrato de benzoil dl-arginina p-nitroanilina, o BAPA, apresentou

limite de detecção igual a 8400USP/mL (LOPES et aI., 2003).

O substrato Benzoil-L -arginina-4-metilcoumarina-7 amida foi estudado

por Kanaoka & Takahashi, 1977, para medir a atividade da papaína e da

tripsina, tendo como produto hidrolítico o 7 -amin0-4-metilcoumarina. A

linearidade da fluorescência versus tempo de incubação foi satisfatória e a

razão da hidrólise foi proporcional à concentração da enzima, sendo entre

30-600ng/mL. A sensibilidade do método foi 100 vezes superior comparada

com a do substrato cromogênico benzoil-L-arginina-p -nitroanilida

(KANAOKA & TAKAHASHI , 1977).

OLSSON, EK & BJORK; 1999, utilizaram o substrato carbobenzoxi-I

fenilalanina-l-arginina-4-metilcoumarina-7-amido, em microplacas e

detectaram 111M de papaína em um estudo sobre a afinidade e cinética da

inibição de cisteína proteinase pelo contato de cistatina C recombinante

(OLSSON & BJORK, 1999).

80

5.6 - MODIFICAÇÃO DA ENZIMA

Após a formação da papaína imobilizada, determinou-se sua atividade

por meio do método proposto neste trabalho no item 4.2.1. A atividade

enzimática decaiu 44,14% comparada a enzima não modificada.

5.7 - TESTE DE ESTABILIDADE PRELIMINAR

o critério para escolha das pré-formulações que foram conduzidas

nos testes preliminares tentou contemplar pelo menos um tipo de formulação

para cada espessante, emulsificante e formador de filme utilizado

(Aristoflex® AVC, Pemulen® TR 1, Carbopol® 940 e ETD 2020), com e sem

hidroxietilcelulose, sendo apenas uma formulação com hidroxietilcelulose e

outra sem nenhuma das substâncias citadas acima, esta última utilizada com

o objetivo de verificar a influência de auxiliares de emulsificação e

espessamento nas formulações. A técnica de preparo foi similar para todas

as formulações.

Foram preparadas 23 pré-formulações e após a avaliação sensorial que

envolveu espalhamento na pele e toque sedoso foram selecionadas 10,

submetidas ao Teste de Estabilidade Preliminar, pois apresentaram as

melhores características.

Os resultados das características organolépticas (aspecto, cor e odor)

e valores de pH das 10 pré-formulações selecionadas avaliadas inicialmente

e após a teste de centrtfugação e de estresse térmico, estão apresentados

na Tabela 14.

81

Tabela 14 - Avaliação das características organolépticas e físicas das pré-

formulações contendo 0,8% (p/p) de papaína no Teste de Estabilidade

Preliminar.

Parâmetro avaliado

pH

Pré-Fonnulação Teste Aspecto Cor Odor Antes Depois

C N N N 6,5 6,6

2 ET N N M 6,5 6,5

C N N N 6,6 6,8

3 ET N N M 6,6 6,7

C IM N N

6 ET IM N M

C IM N N

10 ET IM N M

C N N N 6,0 5,9

14 ET N N M 6,0 5,8

C N N N 6,7 6,7

16 ET N N M 6,7 6,7

C IM N N

18 ET M N M

C IM N N

20 ET IM N M

C IM N N

22 ET IM N M

C M N N

23 ET IM N M

Legenda:

Teste: C - Centrifugação; E T - Estresse Térmico;

Aspecto: N - Normal, sem alteração; IM - Intensamente modificado;

Cor: N - Normal, sem alteração;

Odor: N - Normal, sem alteração; M - Modificado,

pH: - pré-formulação macroscopicamente não estável.

82

Os testes preliminares possibilitaram identificar sinais de instabilidade

em 6 das 10 pré-formulações (Tabela 14) submetidas ao estresse térmico e

à centrifugação, como separação de fases, formação de grumos e mudança

de odor. Foram consideradas aprovadas 4 pré-formulações, posteriormente

submetidas ao Teste de Estabilidade Acelerada.

Os resultados obtidos na Tabela 14 indicaram que as formulações

que continham os polímeros Pemulen® TR1e Carbopol ETO® 2020, não

permaneceram estáveis após os testes preliminares, o que pode ser

justificado pois as preparações exigiam técnica de elaboração diferenciada

em relação às velocidades de agitação e tempo de dispersão.

O comportamento de uma emulsão submetida à centrifugação

depende da diferença de densidades entre a fase oleosa e aquosa e

também da resistência interfacial das fases. O estresse térmico acelera o

processo de degradação dos componentes da formulação. Após as

formulações serem submetidas aos testes, aquela que não continha nenhum

tipo de espessante, emulsificante e formador de filme não resistiu às

condições do teste, fato esperado, pois a concentração do componente auto

emulsionante era inferior à recomendada pelo fabricante (2,0%). A

formulação que continha apenas derivado de celulose, hidroxietilcelulose,

também não resistiu , similarmente ao experimento realizado por Velasco,

1993, e Traversa 2003, onde a preparação gel a base de derivado de

celulose apresentou menor estabilidade que a elaborada com Carbopol® 940

(VELASCO, 1993; ROLANO et aI., 2003; TRAVERSA, 2003).

As formulações da Tabela 14 mais estáveis, após o Teste

Preliminar, foram as que continham os polímeros Aristoflex® AVC

(Formulações 2 e 14) e Carbopol® 940 (Formulações 3 e 16) em sua

composição, apresentando apenas modificações no odor após o teste de

estresse térmico, pois em temperaturas elevadas ocorreu degradação da

enzima e liberação de odor característico de enxofre. Os polímeros

provavelmente elevaram a estabilidade da emulsão pois diminuíram a

velocidade de separação de fases (SILVA, 2000).

83

5.8 - TESTES DE ESTABILIDADE ACELERADA

Os resultados da avaliação das quatro pré-formulações selecionadas,

quanto às características organolépticas (aspecto, cor e odor) e valores de

pH, de viscosidade e de condutividade, inicialmente e após a exposição às

condições do teste: geladeira (5 ± 1,0 °C), temperatura ambiente (22 ±

2,0°C), estufa a (45 ± 2,0 °C), ciclos gela e degela (45 ± 2 °C/-10 ± 1 0C) e

freezer (-10 ± 1°C) estão apresentados nas Tabela 15 a 18 correspondendo

as formulações 2, 3, 14 e 16, respectivamente e Figuras 7, 8 e 9 para a

análise das variáveis: pH, condutividade e viscosidade, respectivamente.

84

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-C

on

dutiv

ida

de

(S/c

m a

25

°C)

•

Cic

lo g

ela

/de

ge

la

(45

± 2

/-10

± 1

°C)

6 12

6,1

6,0

5233

46

33

3,0

2,9

N

N

N

LM

N

LM

Est

ufa

(45

°C ±

2,0

°C

)

1 3

7 12

6,3

6,1

6,1

6,0

6966

38

00

4300

42

00

3,0

2,9

2,9

2,5

N

N

N

N

N

N

LM

LM

N

N

N

LM

88

Estabilidade Acelerada - pH Temperatura 5 ± 1,0°C

I 110,0 1 -+-2 a. __ 3

:~ 100,0 1 ........... =: :::R 14

>(\1 90,0 ~16

<fi 80,0 i i

O 5tempo (dias)10 15

Estabilidade Acelerada - pH Temperatura 22± 2,0°C

~ 110,0 L -+-2

o 100 O ~. --...... -;;;;jIl;:;;;;:="..",:A:====:M 1(\1 'jl --- . ~ =III .. 3 ~ S- __

~ 90,0 14 ~ o 80,0 i i ~16

O 5 10 15

te/lllo (dias)

Estabilidade Acelerada - pH Temperatura -10 ± 1°C

110,00~ !10000 -+-2

:~ ' i = =::::= ::::::::::::::=1=1 -- 3 (\I 90,00 14 >

<fi 80,00 i i ~ 16

O 5 10 15

te/lllo (dias)

Estabilidade Acelerada - pH Temperatura 45 ± 2,0 1-10 ± 1,0°C

110,00 1 i 1°o,ooi~ 1 'iij 90,00

~ 80,00 + - - - --,----,--- - --,

O 5 10 15

tempo (dias)

Estabilidade Acelerada - pH Temperatura 45 ± 2,0°C

~ 110,00~

l:il 1 00,00 -=9,,-=::::::===-II~ ' c 9000 ~ , ~ j ~------~ =- ~

<fi 80,00 +-_ _ _ ,.-_ _ _ ,--_ _ --, O 5 10 15

tempo (dias)

-+-2 __ 3

14

~16

-+-2 __ 3

14

~16

Figura 7 - Variação do valor de pH (%) para as formulações 2, 3, 14 e 16, nas

diferentes condições do Teste de Estabilidade Acelerada,

89

Estabilidade Acelerada - Condutlvidade-Temperatura 5 ± 1,0·C

, 140,OO l i SJ 110,00 - :

~~ . ~ j -! N ao,oo

50,00

° 5 10 15 tempo (dias)

Estabilidade Acelerada - CondutlvidadeTemperatura 22 ± 2,0·C

,;, 140,00 1 h l1o,oof~

-- -~ .. ~ ; N 80,00 -

50,00

° 5 10 15 tempo (dias)

-+-2

_ 3

14

~16

--+-2 _ 3

14

~16

Estabilidade Acelerada - CondutividadeTemperatura -10 ± 1"C

, 14O,00~ ~ --+-2

'~~ 11o,00] ~ _ 3 .~ N 80,00 14

~ ~ ~ 16 50,00 +-- ---,---- ---,-- - - ---,

O 5 10 15 tempo (dias)

Estabilidade Acelerada - Condutividade-140 00 Temperatura 45 ± 2/ -10 ± 1,0·C

~ 110' 00 1 . ~ -::-=:::t -+- 2 ,rol) , ~ ~ !;t~ j _ 3 ! N 80,00 14

50,00 ~ ~ 16

° 5 10 15

tempo (dias)

Estabilidade Acelerada - Condutividade-

140,00 ~ Temperatura 45± 2,0·C

--+-2 ~ l) 110,00 Jt ~~ ~~ j _ 3

14 ! N 80,00

~16 50,00

O 5 10 15 .

tempo (dias)

Figura 8 - Variação do valo da condutividade (%) para as formulações 2,314 e 16,

nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Acelerada.

90

Estabilidade Acelerada - Viscosidade aparenteTemperatura 5± 1,0°C

~115,0~ . J g' 90,0

,(ti 1 -.-2 ___ 3

! 65,0 14

~16 *" 40,0 - - --.-----o 5 (dO )jO tempo taS

15

Estabilidade Acelerada - Viscosidade aparente-Temperatura 22 ± 2,0°C

:I '::~r :::: -.-2 ___ 3

14 {:! 65,0

*" 40,0 ~16 O 5 10 15

tempo (dias)

Estabilidade Acelerada - Viscosidade aparenteTemperatura -10 ± 1,OOC

,g"5,0 k-:: -=:;:::2 -.-2

f 90,0 1 __ 3 > 65,0 14 ~ o

40,0 ~16


Estabilidade Acelerada - Viscosidade aparenteTemperatura 45 ± 2,0 1-10 ± 1,0°C

,g 115,0 i -.-2

! ::~l == ! __ 3

14

40,0 I ~16


Estabilidade Acelerada - Viscosidade aparenteTemperatura 45 ± 2,0°C

~115,0~

f::: lr c =-==-: ~: -.-2 ___ 3

Cf: 40,0 +-------r:------.------, O 5 10 15

tempo (dias)

14

~16

Figura 9 - Variação do valo da viscosidade aparente (%) para as formulações 2,

3, 14, 16, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Acelerada.

91

o Teste de Estabilidade Acelerada forneceu infonnações sobre as

preparações mais estáveis nas diferentes condições a que foram

submetidas. As fonnulações 14 e 16 (Tabela 5), que além dos polímeros

Aristoflex® A VC e Carbopol® 940 continham em sua composição a

hidroxietilcelulose, apresentaram as maiores variações das características

analisadas.

A partir dos resultados obtidos, verificamos a tendência de melhor

perfonnance das fonnulações que apresentavam apenas uma dessas

substâncias mencionadas anterionnente, e não a sua mistura com um

derivado de celulose. As fonnulações 2 e 14 (Tabelas 4 e 5) apresentaram

valores de pH mais alterados que as demais, sendo o máximo de 0,6

unidades, na condição 45 ± 2/-10 ± 1°C (ciclo gela-degela) (Tabelas 15 e

17, Figura 7). Este comportamento era esperado, pois esta condição é muito

drástica para fonnulações que contêm enzimas. Apesar das variações

ocorridas, as fonnulações mantiveram o valor de pH adequado para a

manutenção da atividade enzimática (VELASCO, 1993; MERCK INDEX,

1996).

Os valores da viscosidade aparente apresentaram variação maior na

condição 45 ± 2 °C (Estufa) (Figura 9), ocorrendo diminuição de 40% para a

fonnulação 16 e de 35% para a fonnulação 14 (Tabela 17 e 18). Este

resultado era aguardado, pois a temperatura elevada promove a degradação

da enzima, podendo interferir na viscosidade da fonnulação. As

concentrações empregadas de Aristoflex® AVC (1,0%p/p) e Carbopol® 940

(0,5% p/p) nestas preparações foram insuficientes para manter o perfil de

viscosidade das mesmas, aliado ao fato da hidroxietilcelulose não ter

auxiliado as fonnulações neste quesito. Observações de instabilidade na

presença, de hidroxietilcelulose, incorporadas nas preparações adicionadas

de papaína foram observadas por Traversa, 2003. Este pesquisador

preparou um gel de papaína e submeteu sua preparação ao teste de

centrifugação (Teste Preliminar), sendo observadas a fonnação de cristais e

a decantação da enzima.

92

Houve variação da condutividade, observando-se maior diferença na

condição -10 ± 1 °C (Freezer) (Figura 8), verificando-se tendência de

elevação para todas as formulações, com maior variação (40%) para a de

número 14 (Tabela 17), as outras formulações apresentaram variações

menores que 25%. A condutividade elétrica é uma técnica freqüentemente

utilizada para monitorar a estabilidade das emulsões, verificando a

integridade da fase externa, principalmente daquelas armazenadas por

longos períodos e do tipo aIA. Este resultado demonstrou a formulação 14,

não apresentou integridade da fase externa, quando exposta a temperatura

-10 ± 1 °C (Freezer) (Figura 8) (GRIFFIN et aI., 1967; LATREILLE &

PAQUIN, 1990; FERRARI, 2002).

Avaliando-se esses resultados obtidos e descritos anteriormente

foram escolhidas para o Teste de Estabilidade Normal as formulações 2 e

3.

5.9 - TESTE DE ESTABILIDADE NORMAL

Os resultados do Teste de Estabilidade Normal para as formulações

2 e 3, selecionadas no Teste de Estabilidade Acelerada e a formulação 2M

que é igual a de número 2 mas com inclusão de papaína modificada e o Gel

de papaína (formulação de referência) estão apresentados para atividade da

enzima, variações (%) de pH, de viscosidade e de condutividade nas

Tabelas 19 a 28 e Figuras 10 a13. O gel de papaína foi analisado apenas

na condição de gela'deira 5 ± 1,0 oCo Todas as formulações foram analisadas

após 24 horas após preparo (início), pois após este período ocorre

estabilização da forma cosmética emulsão e gel.

93

Tabela 19 - Avaliação da atividade enzimática, características organolépticas, físicas e físico

químicas a 5 ± 1,0 °e da formulação 2, acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de

Estabilidade Nonnal

Condição de armazenamento

Geladeira (5 ± 1,0 °C)

Parâmetros Início Tempo (dias)

3 7 15 30 60 90

Atividade* 236,2 257,4 191,6 137,5 156,0 151,4 186,3

pH 5,9 6,2 6,2 6,2 6,0 6,0 6,0

11** 8950 9950 9750 9100 9800 10600 11050

Cond 6,5 6,2 6,5 6,9 6,9 6,3 6,6

Aspecto Homogêneo N N N N N N

Cor Branca N N N N N N

Odor Essência N N N N N LM

Legenda:

N - Normal, sem alteração / LM - Levemente modificado / * - USP/mL / Cond - Condutividade (S/em a 25

0c) /11** - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR10 e velocidade de 20 rpm (Cp)


químicas a 22 ± 2,Ooe da formulação 2, acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de

Estabilidade Nonnal.

Condição de armazenamento

Ambiente (22 ± 2,0°C)


3 7 15 30 60 90

Atividade· 236,2 240,2 193,34 149,3 116,9 84,4 112,0

PH 5,9 6,0 6,2 6,1 6,0 5,8 5,5

'l •• 8950 9700 10200 8600 10050 10553 10550

Cond 6,5 6,1 6,2 7,0 6,6 6,1 6,8



Odor Essência N N N LM LM LM

Legenda:

N - Normal, sem alteração / ·LM - Levemente modificado J * - USP/mL J Cond - Condutividade (S/em a 25

0c) J 11 .... - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR10 e velocidade de 20 rpm (Cp)

94


químicas a 40± 2,0 °C da formulação 2, acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de


Condição de annazenamento

Estufa (40± 2,0 CC)


3 7 15 30 60 90

Atividade" 236,2 218,3 155,8 117,6 63,5 13,2 18,1

pH 5,9 5,9 6,0 5,8 5,3 5,13 5,2

r(" 8950 9800 9750 8700 9500 10400 10850

Cond 6,5 5,8 6,3 6,9 6,7 6,4 7,0


Cor Branca N N N LM LM LM

Odor Essência N N LM M M M

Legenda:

N - Normal, sem alteração / LM - Levemente modificado / M - Modificado / * - USP/mL / Cond -

Condutividade (S/cm a 25 °C) / TJ·* - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR10 e velocidade de 20 rpm

(Cp)


químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação 3, acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de


I Condição de annazenamento

Geladeira (5 ± 1,0 CC)


3 7 15 30 60 90

Atividade" 294,7 219,7 170,5 138,1 141,4 97,3 174,2

pH 6,3 6,2 6,6 6,6 6,5 6,5 6,6

TJ" 31516 33750 34800 33350 34100 33350 33000

Cond 4,0 4,0 4,1 4,2 4,3 4,0 4,2



Odor Essência N N N N LM LM

Legenda:

N - Normal, sem alteração / LM - Levemente modificado /. - USP/mL / Cond - Condutividade (S/cm a 25

0c) / r(* - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR10 e velocidade de 20 rpm (Cp)

95


químicas a 22 ± 2,0 °C da formulação 3, acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de

Estabilidade Normal.


Ambiente (22± 2,0 °C)


3 7 15 30 60 90

Atividade· 294,7 238,7 139,4 123,9 119,5 59,0 68,8

PH 6,3 6,0 6,6 6,6 6,5 6,4 6,5

11·· 31516 33750 33300 32400 32600 32050 32150

Cond 4,0 3,8 4,0 4,4 4,3 4,1 4,4


Cor Branca N N N N LM LM


Legenda:

N - Normal, sem alteração / LM - Levemente modificado / * - USP/mL / Cond - Condutividade (S/em a 25

0c) /11** - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR 1 O e velocidade de 20 rpm (Cp)


químicas a 40± 2,0 °C da formulação 3, acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de



Estufa (40± 2,0 °C)


3 7 15 30 60 90

Atividade· 294,7 202,6 102,7 102,3 32,6 17,9 27,03

PH 6,3 6,1 6,5 6,5 6,4 6,3 6,3

11·· 31516 31300 31950 29900 29300 30200 29650

Cond 4,0 4,0 4,3 4,5 4,7 4,5 4,7




Legenda:

N - Normal, sem alteração I LM - Levemente modificado 1 M - Modificado 1* - USP/mL 1 Cond - Condutividade

(S/cm a 25 0c) 111** - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR10 e velocidade de 20 rpm (Cp)

96

Tabela 25 - Avaliação da atividade enzimática, características organolépticas, físicas e físico -

químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação 2M, acrescida de papaína modificada p/p, durante o

Teste de Estabilídade Normal. Condição 5 ± 1,0 oCo




3 7 15 30 60 90

Atividade* 154,76 203,5 234,4 166,6 299,2 254,5 341 ,9

pH 6,4 6,5 6,6 6,5 6,5 6,2 6,2



Odor Essência N N N N N N

- ----------

Legenda:

N - Normal, sem alteração I LM - Levemente modificado I * - USP/mL

Tabela 26 -Avaliação da atividade enzimática, características organolépticas, físicas e físico

químicas a 22± 2,0 °C da formulação 2M, acrescida de papaína modificada p/p, durante o

Teste de Estabilidade Normal.


Ambiente (22± 2,0 °C)


3 7 15 30 60 90

Atividade* 154,7 164,7 202,0 222,8 346,3 329,5 329,5

pH 6,4 6,5 6,6 6,3 6,3 6,2 6,0


Cor Branca N N LM LM LM LM


Legenda:

N - Normal , sem alteração I LM - Levemente modificado I * - USP/mL

97


químicas a .40 ± 2,0 °C da formulação 2M, acrescida de papaína modificada p/p, durante o

Teste de Estabilidade Normal.


Estufa (40± 2,0°C)


3 7 15 30 60 90

Atividade· 154,76 258,3 257,8 301,8 255,4 193,7 133,

1

pH 6,4 6,4 6,4 6,6 6,1 5,6 5,5

Aspecto Homogêneo N LM M M M M

Cor Branca N LM M M M M


Legenda:

N - Normal, sem alteração / LM - Levemente modificado I M - Modificado I * - USP/mL

Tabela 28 - Avaliação da atividade enzimática, características organolépticas e físico

químicas a 5 ± 1,0 °C da formulação Gel acrescida de papaína 0,8% p/p, durante o Teste de




Parâmtros Início tempo ( dias)

3 7 15 30 60 90

Atividade· 208,3 189,1 188,1 172,3 172,3 139,7 146,0

pH 6,6 6,6 6,7 6,6 6,5 6,5 6,4

r(· 7100 7100 6950 6650 7100 6300 71 00

Cond 3,0 3,1 3,1 3,2 3,1 3,23 3,0


Cor Transparente N N N N N LM

Odor Caracterí stico N N N LM LM LM

Legenda:

N - Normal, sem alteração / LM - Levemente modificado / * - USP/mL / Cond - Condutividade (S/cm

a 25 0e) .

Tl** - Viscosidade aparente, utilizando a agulha TR10 e velocidade de 20 rpm (Cp)

98

\

I I ., I ~ I ",

I ~ I '" , Q)

i ", ift... ,

... ·1

Estabilidade Normal - Atividade Temperatura 5 ± 1,O·C

H~i == ;~ terrpo (dias)

-+-2 ___ 3

2M

_Gel

Estabilidade Normal- Atividade - Temperatura 22 ± 2,0 "C

I Q) , ... 1 . i ~ 'J I 1:!2 .... -+- 2 I

I ~ l ! l (ú . ... • __ 3 I

I ; r~ 2M ! I .. -~ --: I . .. i terrpo (dias)

Q) ", <ti ",

Estabilidade Normal - Atividade Temperatura 40 ± 2,O·C

~ i! ~ .~ o , .

6" i J.--- ~._ ..... !

terrpo (dias)

-+- 2

-4- 3

2M I

Figura 10 - Variação da Atividade da papaína (%) para as formulações 2, 3, 2M

e Gel, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Normal.

De acordo com a Tabela 28 e Figura 10 na condição de 5 ± 1,0 °C

(geladeira) o Gel de papaína (amostra de referência) , inicialmente, apresentou

velocidade de decaimento da atividade enzimática menor que as formulações

99

-' BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêutica ,

Universidade de São Paulo

com Aristoflex® AVC e Carbopol® 940, respectivamente formulações 2 e 3, até

o tempo de 30 dias, mantendo 82% de atividade remanescente. A provável

explicação para este fato seria a inclusão do emulsificante não iônico Uniox® C

nas duas últimas preparações, que interagiria inicialmente com a enzima,

reduzindo sua estabilidade. No caso do Gelo veículo é mais simples e inclui um

geleificante polimérico que estabiliza a enzima. Após este período de tempo,

estas 3 formulações comportam-se de maneira similar e as diferenças de

atividade praticamente se igualam. Aos 90 dias obtiveram-se valores, próximos

de 70%, em média, para as três formulações. O mesmo comportamento foi

observado por Velasco, 1993, quando estudou a papaína veiculada em

formulações a base de gel e constatou que nesta condição a preparação a base

de Carbopol® 940, reteve aproximadamente 70% da atividade inicial aos 57

dias.

As formulações 2 e 3, quando expostas a condição 22,0 ± 2,0 °C

(Tabelas 20 e 23 e Figura 10), apresentaram perfil de decaimento um pouco

diferenciado, onde a formulação 3 perdeu praticamente 50% da atividade da

papaína em 7 dias, com decaimento de aproximadamente 80%, aos 90 dias. A

formulação 2 apresentou perda de 50% aos 30 dias, com decaimento de

aproximadamente 60%, aos 90 dias.

Na condição de 40 ± 2,0 °C (Tabelas 21 e 24), até os 30 dias do estudo,

os resultados demonstraram que a formulação 3 apresentou aproximadamente

metade do valor remanescente de atividade em relação a formulação 2, após

este prazo o perfil praticamente se igualou. As duas formulações apresentaram

atividade remanescente de papaína abaixo de 10% do valor inicial no prazo de

60 dias, mantendo este valor até o final do teste. Este fato era esperado, pois o

aumento da temperatura acelerou o processo de decomposição da enzima

(RAJALAKSHMI & SUNDARAM, 1995).

De acordo com os resultados do doseamento da atividade da papaína,

veiculada nas formulações , 2, 3 e Gel, durante o Teste de Estabilidade

Normal, a atividade da enzima foi afetada pelo aumento da temperatura. Aos

100

90 dias os resultados foram: na condição 40 ± 2,0 °C, a atividade remanescente

para as formulações 2 e 3 foi menor que 10%; a 22,0 ± 2,0 °C os dados obtidos

foram de 47 e 23% respectivamente e a 5 ± 1,0 °C, as três formulações (2, 3 e

Gel), apresentaram em média 70% de atividade remanescente. Nesta

temperatura as formulações apresentaram menor perda de atividade, resultado

concordante com a literatura (VELASCO, 1993; RAJALAKSHMI & SUNDARAM,

1995).

A enzima modificada apresentou elevação na atividade enzimática no

decorrer do tempo para todas as condições estudas. No início do experimento,

a enzima estava complexada com polietilenoglicol e sua atividade apresentou

diminuição de 44%. Durante o estudo de estabilidade, a enzima vai sendo

liberada para a ação proteolítica.

Na temperatura de 40 ± 2,0 °C (Tabela 27, Figura 10), aos 15 dias de

estudo esta apresentou 200% de atividade em relação ao valor inicial, com

posterior decaimento chegando a 133% aos 90 dias. Na temperatura de 22 ±

2,0 °C (Tabela 26, Figura 10) este valor foi obtido com 30 dias e mantido até os

90 dias. Na geladeira (5 ± 1,0 °C) (Tabela 25 e Figura 10), este valor somente

foi alcançado aos 90 dias. Uma possível explicação para este comportamento

seria o fato da estrutura da enzima imobilizada, inicialmente, não estar

disponível para a ação, e com o decorrer do tempo ocorreu a liberação da

estrutura do sítio catalítico que estava complexado com polietilenoglicol. Este

perfil de atuação seria acelerado pelo aumento da temperatura.

Comportamento similar ao obtido no experimento foi observado por

Rajalakshmi & Sundaram, 1995. Os pesquisadores modificaram a papaína com

uma sacarose polimérica e observaram a enzima quando exposta a uma

solução de uréia 8M a 37°C, por um períOdO de 24 horas. Estas condições

foram críticas para a papaína, pois além da temperatura elevada a enzima

sofreu acréscimo de solução de uréia como agente inibidor. Nesta pesquisa, foi

observado que no período de tempo de 4 horas a enzima apresentou aumento

101

de 170% em relação à atividade enzimática inicial (RAJALAKSHMI &

SUNDARAM, 1995).

Miyamoto, Watanabe & Ishikara, 2004 realizaram um estudo onde, a

papaína foi modificada com o polímero poli-2-metracriloilexietilfosforilcolina. A

enzima foi mantida à temperatura de 25°C, sendo observada elevação gradual

da atividade, atingindo 150% do valor inicial aos 28 dias. Este fenômeno foi

explicado pela formação de agregados da papaína conjugada que é liberada

com o tempo (MIYAMOTO, WATANABE & ISHIKARA, 2004b).

O objetivo da preparação de uma enzima modificada é elevar sua

estabilidade no decorrer do tempo e promover sua liberação gradual no local de

ação, propiciando melhor eficácia terapêutica/cosmética.

Considerando as três temperaturas do estudo, a formulação com

papaína modificada apresentou~se mais estável na condição 22 ± 2,0 °C

(Tabela 26 e Figura 10), onde foi observada elevação da atividade até os 30

dias com posterior estabilização. Na condição geladeira a enzima não

apresentou perfil de estabilização até o período de 90 dias. Na condição de

estufa a enzima apresentou variação com rápida elevação, nos primeiros 15

dias, e após este período o perfil de atividade da enzima não se estabilizou. A

partir dos resultados verificou-se que a condição 22 ± 2,0 °C é a mais adequada

para a papaína modificada, considerando-se os objetivos do tratamento com a

enzima. Este resultado pode ser considerado positivo comparado com a

formulação que continha a enzima livre e que necessita da condição geladeira 5

± 1,0 °C para seu armazenamento mais adequado.

102

I c. o

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Estabilidade Normal - pH Temperatura 5 ± 1,0 °C%

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tempo (dias)

Estabilidade Normal - pH Temperatura 22 ± 2,0 °C

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100

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tempo (dias)

Estabilidade Normal - pH Temperatura 40 ± 2,0 °C

130 ,0

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o 20 40 60 80 100

tempo (dias)

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2M

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2 M

_ 2

_ 3

2M

Figura 11 - Variação do valor de pH (%) para as formulações 2, 3, 2M e Gel,

nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Normal.

Considerando a variável pH, (Tabelas 21 e 27) e (Figura11), as

formulação 2 e 2M foram as que apresentaram a maior variação,

aproximadamente 15% na condição estufa (40 ± 2,0 °C), pois como comentado

anteriormente para a atividade enzimática o aumento da temperatura promove

maior degradação da enzima, propiciando alterações de pH. Nas demais

condições a variação foi inferior a 7%, entretanto a porcentagem de variação do

103

valor de pH se encontra dentro do intervalo adequado para a atividade

enzimática da papaína (5 a 7) (VELASCO, 1993; MERCK INDEX, 1996),

Estabilidade Normal - Viscosidade Aparente Temperatura 5 ± 1,0·C

1 30 ,O~ -+--2

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tempo (dias)


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tempo (dias)


70,0 +----~---~---~---~--~ o 20 40 60 80 100

tempo (dias)

GeI

-+--2

_ 3

-+--2

_ 3

Figura 12 - Variação do valor de viscosidade aparente (%) para as formulações

2,3 e Gel, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Normal,

Considerando-se os resultados das Tabelas 19 a 24 e Figura 12, a

oscilação do valor da viscosidade não ultrapassou 20% em relação ao inicial,

com tendência a elevação, sendo observado para a formulação 2, em todas as

condições apresentadas. Esta formulação apresentava em sua composição a

presença do polímero Aristoflex® AVC, que é um emulsificante polimérico não ,

104

iônico. Provavelmente houve interação deste polímero com os componentes da

formulação e os subprodutos de decomposição da papaína, embora esta

oscilação não promoveu mudanças perceptíveis na observação das

características organolépticas da preparação.

Estabilidade Normal - Condutividade Temperatura 5 ± 1,0·C

130 ,0 1 j '''' r "

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terrpo (dias)

GeI

_ 2

_ 3

_ 2

_ 3

Figura13 - Variação do valor da condutividade (%) para as formulações 2, 3 e

Gel, nas diferentes condições do Teste de Estabilidade Normal.

Embora tenha sido observada variação em torno de 17% na condição 40 ±

2,0 °C (estufa) para a formulação 3 (Tabela 24, Figura 13), nas condições de 5

105

± 1,0 °C e 22 ± 2,0 °C, (Tabelas 22 e 23 e Figura 13) os resultados foram

satisfatórios com variações inferiores a 10%. A formulação 2 apresentou

variação menor que 10% para todas as condições. Estes resultados indicaram

estabilidade das emulsões, verificando a integridade da fase externa. A

provável explicação seria a manutenção da estrutura íntegra dos polímeros

durante o estudo, não ocorrendo separação de fases da preparação (GRIFFIN

et al., 1967; LATREILLE & PAQUIN, 1990; FERRARI, 2002).

106

LO!

S3ºsnl~NO~ -9

Considerando-se as formulações contendo papaína não modificada 0,8%

(p/p), para as variáveis valor de pH, de viscosidade e de condutividade, a

emulsão contendo o polímero Carbopol® 940 foi a que apresentou resposta

mais adequada em todas as condições de temperatura (5 ± 1,0 °C; 22 ± 2,0 °C,

40 ± 2,0 °C), comparada àquela com o polímero Aristoflex® AVC.

A atividade da enzima não modificada, durante o Teste de Estabilidade

Normal, das formulações mantidas na condição 22 ± 2,0 °C, foi influenciada

pelo tipo de polímero utilizado nas formulações. A emulsão contendo Aristoflex®

A VC manteve aproximadamente o dobro da atividade enzimática comparada a

formulação que continha Carbopol® 940. Para as outras temperaturas os

diferentes polímeros não influenciaram a perda da atividade.

A temperatura influenciou o comportamento da atividade da papaína não

modificada presente nas emulsões, sendo que a 40 ± 2,0 °C, houve o

decaimento mais rápido da atividade enzimática, aproximadamente 90%, em 90

dias.

o armazenamento das formulações na geladeira (5 ± 1,0 °C) representa

a melhor condição para as emulsões contendo papaína não modificada 0,8%

(p/p) e os polímeros Aristoflex® AVC e Carbopol® 940.

o método da imobilização da papaína com o polietilenoglicol alterou o

perfil de liberação e da atividade da enzima incorporada na emulsão contendo

AristofleiEl AVC, em todas as condições avaliadas. A estabilidade da enzima foi

elevada quando comparada com as demais formulações contendo a enzima

não modificada.

A condição de 22 ± 2,0 °C foi a mais adequada para a emulsão contendo

papaína modifica e o polímero Aristoflex® AVC.

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