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Sedimentação

Fenómenos de Transporte

Sedimentação: para quê?

Sedimentação – movimento de

uma partícula por acção de um

campo centrífugo

Técnica usada para

separar

purificar

analisar

espécies celulares (proteínas, ácidos nucleicos,

cromossomas, mitocôndrias)

polímeros

Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 2

Sedimentação: num campo gravitacional


Peso:

m = massa da partícula

sedimentada

Força de impulsão :

= densidade do fluido

= volume efectivo da

partícula

mg

m

gmgmmgFd

1

m

Num fluido a força que

promove a queda da

partícula

Peso

Impulsão

Sedimentação: num campo gravitacional


tvfF Força de atrito velocidade terminal

que de atinge quando

dv/dt=0

A força de atrito contrapõe-se ao movimento

No equilíbrio as forças igualam-se:

f

gm

v

gmvf

t

t

1

1

Sedimentação: numa ultracentrífuga

São aplicados os mesmos princípios e fórmulas só que a aceleração

da gravidade (g) é substituída pela velocidade angular (w2 r)


f

rwm

vt

21

Vamos ver Porquê

Sedimentação numa ultracentrífuga


Estado inicial Alta velocidade

de rotação

Baixa velocidade

de rotação



Aplicando uma força

centrífuga e causando um

movimento de rotação à

partícula, com uma

frequência angular , ela é

fortemente acelerada e atinge

rapidamente a velocidade

terminal

A velocidade terminal atinge-se quando as forças envolvidas ficarem balanceadas

Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0


Fc- força centrífuga = 2 r m

(onde m reperesenta a massa da partícula e -2r representa a aceleração centrípeta)

Fd- força de fricção (viscosidade) = -f v

(onde f é o coeficiente de fricção e v a velocidade terminal)

Fb- força de impulsão = -2 r m0

(onde m0 é a massa do solvente deslocado pela partícula)


Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0


Então


00

2 fvmmr

m0 = volume específico parcial da partícula densidade

= Volume específico parcial

= densidade da solução

Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0 Relembre:

02

0

2 rmmrfv

Rearranjando



Substitua na equação anterior o m0 :

Colocar os parâmetros moleculares de um lado e os parâmetros

experimentais do outro

00

2 fvmmr

Sedimentação: Coeficiente de sedimentação


IMPORTANTE

O coeficiente de sedimentação depende da massa molecular (M)

e do coeficiente de fricção (f)

ãosedimentaç de eCoeficient S

molecular massa M

1_

2

AV

AV

sol

t

Nm

fN

M

r

vs

Definição de coeficiente de

sedimentação

)( aceleração

)( terminalvelocidade2r

vs t

Coeficiente de sedimentação: significado


O coeficiente de sedimentação é a distância (cm) percorrida pela molécula,

durante 1 segundo, sob efeito de uma força de 10-2 N kg-1, no solvente água, a

293 K.

S depende:

a) Propriedades moleculares da molécula.

m - massa molecular

- volume específico parcial

f – forma da molécula

b) Propriedades da solução.

- densidade

- viscosidade (porque f depende de )

Coeficiente de sedimentação experimental

Unidades

O coeficiente de sedimentação experimental sofre influência da

temperatura e da viscosidade

Como s depende das propriedades da solução, os valores medidos,

devem ser convertidos para as condições padrão, (temperatura é

20°C e o solvente é a água) (para poderem ser comparáveis para

diferentes moléculas)

S20,w (Svedberg)

1s= 10-13 segundos

Nota: S20,w é uma propriedade única da partícula e pode ser utilizado

para avaliar mudanças conformacionais


sscm

scm

aceleração

vs

2/

/

Relação entre difusão e sedimentação

Segundo Stokes A equação de Einstein


Velocidade de sedimentação: permite calcular

Coeficiente de sedimentação

Coeficiente de difusão (se os componentes sedimentados são bem

preparados)

Massa efectiva dos componentes do soluto

Formato das partículas (assimetria)

Homogeneidade e estados de agregação

Constantes de associação e estequiometria


EM RESUMO…….

Em condições

experimentais diversas!!!!

Sem interferências

externas!!!!

Relação entre s e M

A velocidade de sedimentação de uma partícula depende da sua M

◦ Quanto maior for M maior o valor de s

O coeficiente de atrito f , reduz o valor de s

◦ Quanto menos globular for uma proteína menor a sua velocidade de

sedimentação

Quanto maior a densidade de uma partícula maior a sua velocidade

de sedimentação

◦ Quanto maior for o valor da componente (1-) maior a velocidade de

sedimentação


_

1 D

sRTM

Nota: Os itens 2 e 3 são importantes

para o estudo estrutural de proteínas

quando comparadas com proteínas com

a mesma massa

Determinação do Coeficiente de Sedimentação:

métodos

Método da velocidade de sedimentação

Sedimentação de fronteira

◦ Sedimentação de uma macromolécula numa solução homogénea

Sedimentação em gradiente (zonal, ou em faixas ou em bandas)

◦ Sedimentação de uma macromolécula em gradiente de concentração


O valor de S deve ser extrapolado a uma diluição infinita por forma a

obter parâmetros molecularmente significativos

Método da velocidade de sedimentação


Fornece informação hidrodinâmica sobre as moléculas em solução

Parâmetros experimentalmente determinados:

Coeficiente de sedimentação, s, a constante de difusão, D, e

em alguns casos, a massa molecular, M.

Se a massa molecular é conhecida, o coeficiente de

sedimentação pode ser usado para obter uma estimativa da

forma molecular da molécula em solução

Usado para grandes moléculas que difundem lentamente.

A força de sedimentação deverá ser muito superior à força de

difusão


Começar com uma solução homogénea de macromolécula

Como a solução é centrifugada na ultracentrífuga, as

macromoléculas movimentam-se por acção desse campo , gerando-

se uma zona limite de solvente

Seguindo essa faixa limite ao longo do tempo, podemos calcular o

coeficiente de sedimentação


fN

M

r

vs

AV

sol

t

_

2

1



slope303,2

2

s

Ultracentrifugação analítica: Aparelhagem usada


Velocidade de sedimentação limite: limitações ao

método


Dispersão das zonas limite (se a difusão se torna significativa)

-Difusão e sedimentação são duas formas de transporte do

soluto

-A sedimentação gera gradiente, a difusão opõe-se a esse efeito

Dificuldade de separar componentes em misturas complexas

Necessita de equipamento caro

Difusão radial : um fenómeno que contribui para a

limitação


• A difusão radial ocorre em

consequência da forma que têm as

células de sedimentação.

• Todas as moléculas (não importa em que

posição estejam) difundirão na mesma

extensão causando uma redução na

densidade óptica observada. Para um

dado tempo, esta difusão é a mesma em

cada ponto da célula

• A Difusão radial pode ser observada

através da redução do “plateau” nos

sucessivos scans da absorvência

Efeito da difusão na sedimentação


Espalhamento de zonas : Difusão versus heterogeneidade


1- Sistema com um componente ( as

bandas espalham-se devido à difusão e dá

um aspecto sigmoidal)

2- Sistema multicomponente ( os

degraus que definem os perfis de cada

componente podem perder definição

quando aumenta a difusão)

3- Sistema multicomponente ou

monocomponente? ( sem análises

posteriores é impossível afirmar se o

limite de espalhamento é devido à

heterogeneidade de S ou se é devido à

difusão)

Dificuldade de separar componentes em

misturas complexas

Como obviar essas limitações?


Utilize o mesmo método mas em gradiente de concentração

Centrifugação por Zonas

Centrifugação em zonas ou pelo método da

velocidade de sedimentação

Preparação de um gradiente contínuo de densidade usando

sacarose centrifugando uma solução de sacarose

Aplicar a amostra sobre o gradiente.

Recolher as fracções dos componentes separados


Velocidade de sedimentação em gradiente de

concentração: vantagens e desvantagens


Limitações:

- não é exacta a medida da massa molecular

Vantagens:

- resolução completa dos componentes de uma mistura

- relativamente barata

Sucrose Density Centrifugation of

Cellular Membranes from G. violaceus


(A) Schematic of the sucrose density gradients

used for separation; the dark shading at the

bottom represents the area of sample

application in 50% sucrose (w/w).

(B) The gradient after 16 h of centrifugation at

160,000g displays an orange (1.07 g/mL) and a

green (1.16 g/mL) membrane fraction.

(C) A distinct band is formed from the green

fraction in (B) when recentrifuged on the

sucrose density gradient.

(D) A third membrane fraction with an

apparent density of 1.19 g/mL (corresponding

to the outer membrane) is obtained when the

boundary between the 48 and 50% layer is

applied to a second sucrose gradient

centrifugation.

S é determinado pelo deslocamento

da banda, no tubo de centrífuga,

com o tempo

Sedimentação

Exercício

Exercício prático


Calcular o coeficiente de sedimentação (s) e o coeficiente de fricção (f) para a E. Coli DNA ligase em soluções diluidas de tampão aquoso (20 mM de fosfato, 10 mM NH4Cl, pH 6,5 e temperatura de 20,6°C. Considere os seguintes dados:

Peso Molecular = 74,000g/mol

Vmolécula= 0,737 cm3/g

tampão= 1,010 g/cm3 a 20,6°C

= 56,050 rpm

T(min) x1/2 log x1/2

0 5,9110 0,7717

20 6,0217 0,7797

40 6,1141 0,7863

60 6,2068 0,7929

80 6,3040 0,7996

100 6,4047 0,8065

120 6,5133 0,8138

140 6,6141 0,8205

Exercício Prático


= 56,050 rpm x (2 radianos/revolução) (1 minuto/60 segundos)

=5,87 x103 rad/segundo

dt

xds 2/1

2

log303,21

213

14

min60/1087,5

min1042,3303,2

sxsrad

xxs

S= 2,31 x 10-11 segundos= 23,1 S

Exercício Prático

s

m

x

vf t

1

2

gmolmoléculas

molgm 19

231023,1

/10023,6

/000,74

seggf

segrad

gf

/1057,5

/1087,5

010,1737,011023,1

24

3

19


Calcule agora o coeficiente de fricção

Primeiro calcule o valor de m

e….

MÉTODO DO EQUILÍBRIO DE

SEDIMENTAÇÃO OU

SEDIMENTAÇÃO ISOPÍCNICA


Sedimentação: Equilíbrio de sedimentação

Baixas velocidades de rotação

◦ Balanço entre as forças de

sedimentação e as forças de

difusão (A amostra é

simultaneamente sujeita a

sedimentação e a difusão

produzindo-se um gradiente que

não variará até que o equilíbrio seja

atingido)

◦ Não há transporte efectivo

◦ Não há influência da forma das

partículas


Fenómenos de transporte: Equilíbrio Sedimentação


Distribuição das moléculas num campo

gravitacional ou centrífugo após atingir o

equilíbrio

O balanço entre a força de sedimentação

numa dada direcção e o efeito aleatório da

difusão origina um gradiente de

concentração; a concentração no fundo do

tubo é maior.

O gradiente de concentração depende do

peso molecular das moléculas

Sedimentação: equilíbrio de sedimentação

dx

dcDJ

cvJ

dif

tsed

f

xm

v

dx

dcDcv

t

t

21

0


Informação termodinâmica

Sedimentação gradiente de concentração difusão

Equilíbrio de gradiente de concentração: sedimentação é exactamente

balanceada pela difusão (moléculas exponencialmente distribuídas ao

longo da célula)

Equilíbrio: J = 0

J = Jsed + Jdifusão


xdxMRT

dcc

xdxMRT

dcc

xMRTdx

dc

c

dx

dcDcM

RT

xD

MRT

xD

f

xm

v

x

x

c

c

t

11

11

11

1

1

1

2

1

2

1

2

2

2

2

2

2

2

1

2

2

2

1

2 12

ln xxMRTc

c



12

2

MRT


Calcular M através do declive

Nota: Este método não necessita da determinação de D

Ln c

x2

Declive =

Equilíbrio de sedimentação: permite calcular

Massa / peso molecular

Homogeneidade em relação ao peso molecular

Estados de agregação

Estequiometria e constantes de equilíbrio para

processos de associação


Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente

de concentração


Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente

de concentração


Solução das macromoléculas preparada

em solução de CsCl

Centrifugação até ao equilíbrio produz

um forte gradiente de CsCl e

consequentemente um gradiente de

densidade através do tubo

Se a concentração de CsCl é

correctamente escolhida as

macromoléculas migram em banda

através do gradiente do solvente até que

(1-molécula )=0

Centrifugação: equilíbrio de sedimentação com gradiente de

concentração


Solução das macromoléculas

preparada em solução de CsCl

Centrifugação até ao equilíbrio

produz um forte gradiente de

CsCl e consequentemente um

gradiente de densidade através

do tubo

Se a concentração de CsCl é

correctamente escolhida as

macromoléculas migram em

banda através do gradiente do

solvente até que (1-molécula )=0

Em RESUMO…….

22

ln

1

2

dr

cd

v

RTM

D

s

RT

vM

1


Relação entre o coeficiente de sedimentação e o

peso molecular de proteínas


Forma, massa e densidade de proteínas

/coeficiente de sedimentação


CONCLUSÃO


ELECTROFORESE



Eletroforese: generalidades


Transporte de partículas num campo eléctrico

Técnica usada para separar e às vezes purificar

macromoléculas que diferem na carga, conformação ou

tamanho

Aplicações:

Separação de compostos com carga (aminoácidos,

péptidos, proteínas, ácidos nucleícos). Carga dependente

do pH do meio. Moléculas negativas e positivas movem-

se em direcções opostas ao campo eléctrico.

Determinação da composição das proteínas por

comparação com padrões electroforéticos

Separando fragmentos de DNA:

Eletroforese em Gel


Eletroforese de Proteinas Séricas


Eletroforese: princípios gerais


Movimento molecular sob acção de um campo eléctrico

Num solvente não condutor:

Força de eléctrica (Coulomb):

F = qE

q= Z e

Força de fricção: Ff = - f v

No equilíbrio:

V = Fe + Ft = 0

Z = nº de cargas (sem dimensões)

e = carga eléctrica (1,6022 x10-19 C)

E= campo eléctrico (volt m-1)

f = coeficiente de fricção (Kg s-1)

v= velocidae de migração

Como proceder?

Aplica-se uma diferença de potencial e a partícula move-se na

direcção do polo de carga oposta

No início há resistência devido à viscosidade do meio mas a certa

altura atinge-se um equilíbrio quando as forças electrostáticas

atractivas se igualam à resistência ao fluxo. Então a mobilidade

electroforética passa a ser constante


Recorde…

Mobilidade Electroforética (u) é a velocidade linear (v) por

unidade de gradiente de potencial eléctrico (X)

Traduz-se pela razão entre a velocidade da macromolécula (v) e o

potencial eléctrico (E) que promove o movimento , ou

Traduz-se pela razão entre a carga líquida da partícula (Z) e o seu

coeficiente de fricção (f)


11

ou

smVf

Z

E

v

X

v

Mobilidade electroforética e carga da partícula

Para uma molécula esférica

Então:

A mobilidade electroforética serve para medir a carga da partícula

num meio não condutor


rf 6

r

Zu

6

Eletroforese: mobilidade eletroforética


Contudo....

* molécula carregada rodeada por atmosférica iónica (dificulta

a interpretação dos resultados de mobilidade)

* molécula carregada altera o coeficiente de fricção

Mobilidade electroforética e peso molecular

Pode-se usar a mobilidade electroforética para

determinar o peso molecular ?

Os ácidos nucleicos podem ser separados de acordo com o

peso molecular porque possuem uma carga de fosfato por cada

base (nucleótido)

Para as proteínas o número de cargas depende da composição

dos aminoácidos e do pH do tampão

As cadeias polipetídicas de determinado comprimento podem

adquirir diferentes formas com diferentes coeficientes de fricção (f ) (é proporcional ao seu comprimento)

Para usar a electroforese para determinar o peso

molecular é necessário:

Desnaturar as proteínas

Introduzir uma carga em cada peptídeo


Electroforese em gel: determinação do peso

molecular das proteinas


A carga e as propriedades hidrodinâmicas da proteína são função do seu peso

molecular

bxaM log

M = peso molecular da

proteína;

X = distância de migração

no gel (proporcional à

mobilidade)

a e b = constantes para

um dado gel e um dado

campo eléctrico Calibrar com proteínas de peso molecular conhecido


Em Resumo……

Nota: desvios a esta relação ocorrem quando as proteínas se ligam a uma

quantidade anormal de SDS (glicoproteínas) ou transportam um número elevado de

cargas (histonas)

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