FABRICIO RODRIGUES CAMACHO · Protozoários podem ser uma importante fonte alternativa de alimento...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA E LIMNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA FABRICIO RODRIGUES CAMACHO O ELO MICROBIANO COMO ALIMENTO ALTERNATIVO PARA O ZOOPLÂNCTON EM RESERVATÓRIOS DOMINADOS POR CIANOBACTÉRIAS NATAL / RN 2012
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA E LIMNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
FABRICIO RODRIGUES CAMACHO
O ELO MICROBIANO COMO ALIMENTO ALTERNATIVO PARA O
ZOOPLÂNCTON EM RESERVATÓRIOS DOMINADOS POR
CIANOBACTÉRIAS
NATAL / RN
2012
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Camacho, Fabrício Rodrigues.
O elo microbiano como alimento alternativo para o zooplâncton em reservatórios dominados por
cianobactérias / Fabrício Rodrigues Camacho. – Natal, RN, 2012.
37 f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Renata de Fátima Panosso.
Coorientadores: Luciana Carneiro, Kemal Ali Ger.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.
Programa de Pós-Graduação em Ecologia..
1. Cianobactéria. – Dissertação. 2. Taxa de ingestão. – Dissertação. 3. Ciliados. – Dissertação. I.
Panosso, Renata de Fátima. II. Carneiro, Luciana. III. Ger, Kemal Ali. IV. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. V. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 561.232
FABRICIO RODRIGUES CAMACHO
O ELO MICROBIANO COMO ALIMENTO ALTERNATIVO PARA O
ZOOPLÂNCTON EM RESERVATÓRIOS DOMINADOS POR
CIANOBACTÉRIAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ecologia da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito parcial para a
obtenção do título de mestre em Ecologia.
Área de concentração: Ecologia Aquática
APROVADA EM 31/08/ 2012
BANCA EXAMINADORA
RESUMO
Protozoários podem ser uma importante fonte alternativa de alimento para
copépodos Calanoida em ambientes dominados por cianobactérias. Com o objetivo de
quantificar a preferência alimentar de Notodiaptomus cearensis por ciliados em
presença de cianobactérias, experimentos in vitro foram conduzidos, utilizando-se
culturas mistas em diferentes concentrações totais de alimento para o copépodo. Duas
espécies de ciliados (Paramecium sp. e Cyclidium sp.) e uma cepa tóxica de
cianobactéria (Microcystis aeroginosa) foram ofertados como alimentos. Experimentos
prévios visando identificar as taxas de ingestão máxima do copépodo através do uso de
um modelo de resposta funcional do tipo II quando cada uma das presas é ofertada
separadamente também foram realizados. O copépodo apresentou maior taxa de
ingestão máxima quando ciliados são ofertados como presa. N. cearensis mostrou
preferência significativa por protozoários em detrimento da cianobactéria testada tanto
em tratamentos com menor (correspondendo a cerca de 95,15% da dieta) quanto com
maior concentração de alimento (cerca de 91,56% da dieta), preferindo o ciliado de
maior tamanho nas menores concentrações (67,52% da dieta). A participação
significativa de organismos heterotróficos na dieta do zooplâncton dá maior ênfase à
participação da alça microbiana na passagem de energia para níveis tróficos superiores.
Tal dado colabora para o entendimento da estabilidade das interações tróficas existentes
em reservatórios sujeitos a eutrofização e auxilia estudos de cascata trófica nesses
ambientes.
Palavras-chave: Taxa de ingestão; cianobactéria; ciliados; preferência alimentar;
resposta funcional.
ABSTRACT
Protozoa may be an important alternative food source for Calanoida copepods in
these environments. Aiming to quantify the feeding preferences of N. cearensis by
ciliates in the presence of cyanobacteria, in vitro experiments were conducted, using
mixed cultures in different concentrations of total food for copepod. Two ciliates
species (Paramecium sp. and Cyclidium sp.) and a cyanobacteria toxic strain
(Microcystis aeruginosa) were offered as food. Previous experiments were done to
identify the copepod’s maximum ingestion rate through the use of a type II functional
response model when each prey is offered separately. High maximum ingestion rate
were found when those protists were offered as prey. N. cearensis showed significant
preference for protozoal prey over the cyanobacterium tested both in low
(corresponding 95.15% of the diet) and in high food concentration treatments (about
91.56% of the diet), preferring the bigger ciliate in lower concentrations (67.52% of the
diet). The meaningful involvement of heterotrophic organisms in the zooplankton diet
emphasis the microbial loop participation in the energy transition from copepods to
higher trophic levels. This data contributes to understand the stability of existing trophic
interactions in reservoirs subjected to eutrophication and assists trophic cascade studies
in these environments.
Keywords: Ingestion rate; cyanobacteria; ciliates; food preference; functional
response.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Relação entre taxa de ingestão e concentração total de alimento observada nos
experimento sem mistura de alimento considerando como presas Paramecium sp., Cyclidium sp.
e Microcystis aeruginosa. A adequação da curva de resposta funcional não foi possível para M.
aeruginosa devido a problemas com algumas réplicas. .............................................................. 21
Figura 2: Relação entre taxa de ingestão e concentração total de alimento observada no
experimento de preferência alimentar (culturas mistas). Figuras 6a, 6b e 6c referem-se às taxas
de ingestão de cada presa em particular (Paramecium sp., Cyclidium sp., e Microcystis
aeruginosa respectivamente), e Figura 6d apresenta a ingestão total de alimento. As barras
representam o erro padrão. .......................................................................................................... 23
Figura 3: Preferência alimentar do copépodo Notodiaptomus cearensis estimada pelo índice de
preferência de presas de Chesson (α1) (Chesson 1983) para três tipos diferentes de alimento, em
quatro concentrações totais de alimento. A linha pontilhada indica o valor do índice em que
todos os alimentos foram igualmente selecionados (0,33). Valores maiores que 0,33 indicam
seleção positiva, enquanto valores abaixo desse valor indicam seleção negativa. ...................... 25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média (±erro padrão) das concentrações iniciais de alimento para cada experimento
de Resposta Funcional. Os experimentos foram feitos com as presas ofertadas ao copépodo
separadamente. ............................................................................................................................ 15
Tabela 2 - Média (±erro padrão) das concentrações iniciais de alimento no experimento de
preferência alimentar. As presas foram ofertadas em mistura. As concentrações individuais bem
como a concentração total de alimento em cada tratamento estão representadas na tabela. ....... 16
Tabela 3 - Valores referentes ao ajuste ao modelo de resposta funcional do tipo II para os
experimentos de resposta funcional. Imax é a taxa de ingestão máxima; Cm é a concentração de
alimento em que a taxa de ingestão é igual a 50% da Imax; e R2 é o coeficiente de determinação.
..................................................................................................................................................... 22
Tabela 4 - Valores referentes ao teste One-Way ANOVA utilizado para conhecer diferenças
significativas entre as taxas de ingestão total de presa em todos os tratamentos do experimento
de preferência alimentar (cultura mista). As concentrações totais de alimento são: A (4,7 mgC.L-
1), B (9,2 mgC.L
-1), C (16,4 mgC.L
-1), D (20,1 mgC.L
-1). ....................................................... 24
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 8
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 11
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................................... 12
4. RESULTADOS ....................................................................................................................... 19
5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 26
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 30
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 31
ANEXO A ...................................................................................................................................... 37
8
1. INTRODUÇÃO
Os copépodos, microcrustáceos integrantes do zooplâncton das águas doces, são
um importante elo nas teias alimentares aquáticas (SOMMER, 1989). Organismos da
Ordem Calanoida são geralmente referenciados como sendo mais abundantes em
sistemas menos produtivos (GYLLSTRÖM et al., 2005; PACE, 1986; PINTO-
COELHO et al., 2005). Porém, a dominância de copépodos Calanoida no zooplâncton
em reservatórios eutróficos tem sido relatada (HAVENS; BEAVER, 2010), inclusive
em ambientes dominados por cianobactérias como é o caso de reservatórios do semi-
árido brasileiro (BOUVY et al., 2001; ESKINAZI-SANT’ANNA et al., no prelo).
A dominância de copépodos simultaneamente à ocorrência de elevada biomassa
de cianobactérias não é um padrão esperado dado que cianobactérias tem efeitos
negativos na produção de ovos e sobrevivência de copépodos (DEMOTT et al., 1991),
além de representarem uma fonte alimentar de difícil filtração (ESKINAZI-
SANT’ANNA et al., 2007; PACHECO et al., 2010; PANOSSO, R. et al., 1989) e difícil
digestão (WANG et al., 2010). Além disso, toxinas produzidas por algumas
cianobactérias podem causar efeitos negativos no zooplâncton (LAMPERT, 1982;
ROHRLACK et al., 2001). Copépodos apresentam menor tolerância às toxinas de
cianobactérias, comparados aos cladóceros, e tendem a evitar seletivamente a predação
sobre cianobactérias na presença de partículas mais nutritivas e não tóxicas (DEMOTT;
MOXTER, 1991; GER, KEMAL A et al., 2009).
As supostas defesas contra a herbivoria atribuídas às cianobactérias (agregação
celular formando partículas grandes, produção de toxinas) enfraquecem a interação
entre o fitoplâncton e o zooplâncton, reduzindo a transferência de carbono da produção
primária para níveis tróficos superiores (ELSER; GOLDMAN, 1991; GHADOUANI et
al., 2003).
Para sobreviver em ambientes com dominância de cianobactérias no
fitoplâncton, é provável que organismos zooplanctônicos sejam dotados da capacidade
de desenvolver estratégias para coexistir com fontes alimentares relativamente
impalatáveis (BOUVY et al., 2001). Copépodos Calanoida podem se adaptar à presença
9
persistente de Microcystis aeruginosa através do aumento seletivo do consumo de
alimentos alternativos (GER, KEMAL ALI et al., 2011).
Embora copépodos Calanoida sejam tidos como animais filtradores capazes de
impactar somente a comunidade fitoplanctônica, alguns trabalhos têm relatado um
comportamento onívoro desses organismos (BALSEIRO et al., 2001; DAM; LOPES,
2003), além de sua habilidade de selecionar o alimento a ser consumido (DEMOTT;
MOXTER, 1991; DEMOTT et al., 1991; MERRELL; STOECKER, 1998; ZHAO et al.,
2008). Para explicar, a alta densidade de copépodos Calanoida do gênero
Notodiaptomus coexistindo com elevada densidade de cianobactérias, alguns autores
afirmaram que organismos menores poderiam ser uma fonte energética alternativa para
esses copépodos (PANOSSO et al., 2003), viabilizando sua reprodução em reservatórios
com florações de cianobactérias.
A teoria da alça microbiana constitui uma possível explicação alternativa da
coexistência de florações de cianobactérias e elevadas densidades de copépodos nos
ecossistemas lacustres tropicais. Considerando que copépodos são capazes de predar
protozoários (DAM; LOPES, 2003; GISMERVIK, I., 2006; HANSEN, 2000;
MERRELL; STOECKER, 1998; SAAGE et al., 2009) e que copépodos calanoida
podem provocar grande impacto na comunidade microzooplanctônica (MERRELL;
STOECKER, 1998), a hipótese de que esses crustáceos estão usufruindo de carbono
proveniente desses componentes microbianos torna-se plausível.
A interação alimentar entre copépodos e protozoários, incluindo ciliados, tende a
ser mais importante em ambientes eutróficos onde a proporção de algas impalatáveis é
maior (AUER et al., 2004; HART et al., 2000). Alguns trabalhos mostraram que
copépodos preferem predar protozoários heterotróficos em detrimento de fitoplâncton
(MERRELL; STOECKER, 1998), porém estudos que avaliam protozoários como fonte
alternativa à cianobactérias estão em falta na literatura.
A relação existente entre a taxa de consumo predador e a abundância de
biomassa de alimento (resposta funcional) associada ao comportamento de predação de
copépodos calanóida vem sendo estudada (TIRELLI; MAYZAUD, 2005). Porém
estudos de resposta funcional para copépodos de grande representatividade em
reservatórios eutróficos tropicais ainda estão em falta na literatura. Tais estudos são de
grande importância para o entendimento da capacidade do copépodo de controlar
10
populações de cianobactérias, bem como na compreensão da complexidade da teia
trófica de reservatórios eutróficos.
Visando compreender a importância de protozoários de vida livre na dieta de um
copépodos de água doce, o presente trabalho investigou a preferência alimentar de
Notodiaptomus cearensis, abundante em reservatórios eutróficos do semi-árido
(BOUVY et al., 2001; ESKINAZI-SANT’ANNA et al., no prelo; SOUSA; ROCHA,
A., 2008), na presença de cianobactérias. Como o crescimento de copépodos é maior
quando se oferta suspensões mistas de alimento (acima de dois ítens), do que quando
em presença de uma só fonte de alimento (BONNET; CARLOTTI, 2001), e o nível de
consumo geralmente depende da concentração do alimento presente, este trabalho
quantificou a ingestão do copépodo alimentado com culturas monoespecíficas e mistas
de Microcystis aeruginosa e dois protozoários ciliados.
11
2. OBJETIVOS
O presente trabalho tem como objetivos gerais conhecer a preferência do
copépodo Notodiaptomus cearensis entre uma cianobactéria e duas espécies de
protozoários na escolha do recurso alimentar.
Como objetivos específicos, esse trabalho almeja:
Desenvolver culturas monoespecíficas de protozoários e copépodos
através de métodos de isolamento em microscópio óptico.
Conhecer a resposta funcional do copépodo para cada tipo de presa,
através da realização de experimento ofertando ciliados e
cianobactéria como fonte energética para copépodo em forma de
culturas isoladas, em diferentes concentrações de alimento.
Conhecer a preferência do copépodo por cada presa através da
realização de experimento ofertando ciliados e cianobactéria como
fonte energética para copépodo em forma de culturas mistas,
manipulando as concentrações de cada fonte de alimento,
objetivando.
12
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Culturas de M. aeruginosa e ciliados
Paramecium sp. foi selecionado como um dos organismos teste no presente
estudo por ser encontrado facilmente em ambientes aquáticos, ser amplamente
conhecido na literatura, além de ter sido testado como alimento com diferentes espécies
de copépodos em estudos anteriores (REISS; SCHMID-ARAYA, 2011). Com o
objetivo de oferecer uma fonte alternativa de alimento, Cyclidium sp. foi também
escolhido por ser menor e apresentar formato celular semelhante ao Paramecium sp.
Microcystis aeruginosa foi a cianobactéria selecionada por representar uma importante
fonte de alimento autotrófico em reservatórios do semi-árido brasileiro. Por ser uma
cepa tóxica, a cianobactéria usada foi primordial na tentativa de responder a questão
central deste estudo.
A cepa de Microcystis aeruginosa (MC+; identidade NPLJ4; 5µm de diâmetro)
usada no presente estudo foi obtida da Coleção de Culturas de Cianobactérias
Brasileiras, da Universidade de São Paulo, gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Maria
do Carmo Bittencourt-Oliveira, USP. Já as culturas de ciliados foram isoladas de
amostras de água do reservatório Marechal Dutra (também conhecido como
Gargalheiras), o qual apresenta constantes florações de cianobactérias (COSTA, I. A. D.
et al., 2009).
A cepa tóxica de Microcystis aeruginosa foi mantida com meio de cultura
ASM1 em banco de cultivo com temperatura de 25°C e fotoperíodo 12:12 claro/escuro.
O cultivo foi realizado em batelada de forma que culturas monoespecíficas novas foram
iniciadas a cada 10-15 dias. A renovação de meio de cultura foi feita 10 dias antes da
realização dos experimentos, de forma a manter a cultura em crescimento exponencial.
As culturas de Paramecium sp. (~47 m) e de Cyclidium sp. (~16 m) foram
iniciadas isolando-se os ciliados a partir de uma amostra do plâncton (coletada através
de arrastos com rede de 10µm de abertura de malha) do reservatório Marechal Dutra
(Gargalheiras), município de Acari (RN). Técnicas padrão para isolamento de
microrganismos foram empregadas. Os cultivos dos ciliados Paramecium sp. e
Cyclidium sp. foram mantidos em meio de cultivo complexo (ver ANEXO A) próprio
para ciliados (TAVARES; ROCHA, O., 2004) em laboratório, como culturas
13
monoespecíficas sob temperatura de 22°C em ambiente escuro. A renovação das
culturas foi efetuada a cada 10 dias transferindo-se alguns ciliados para um recipiente
com meio de cultura fresco. Com o objetivo de obter densidades maiores desses
organismos, culturas com meio renovado foram submetidas à temperatura ambiente 4
dias anteriores aos experimentos, uma vez que a taxa de crescimento da cultura é maior
à esta temperatura.
A biomassa das cianobactérias e ciliados foram expressos com base no conteúdo
de carbono por volume de cultura (mgC.L-1
) em todas as etapas do presente estudo
(preparação das suspensões alimentares para os experimentos, e quantificação da
densidade celular nas amostras após os experimentos). Para tanto, o conteúdo celular de
carbono de cada organismo foi estimado. Alíquotas das culturas de Paramecium sp.,
Cyclidium sp. e Microcystis aeruginosa foram fixadas com lugol acético e quantificadas
através do uso da câmara de Sedwick-Rafter em microscópico óptico invertido para
determinação da densidade celular. Medindo-se 50 indivíduos de cada espécie foi
possível calcular o conteúdo de carbono de cada organismo de forma aproximada
através das proporções de volume celular (forma elipsóide para os ciliados e esférica
para a cianobactéria) e conteúdo de carbono dos ciliados (PUTT; STOECKER, 1989) e
da cianobatéria (ROCHA, O.; DUNCAN, 1985). Assim foi obtido o conteúdo de
carbono individual de 0,04 gC.célula-1
, 0,001 gC.célula-1
e 0,2 x 10-5 gC.célula
-1
para Paramecium sp., Cyclidium sp. e M. aeruginosa, respectivamente. A biomassa
(mgC.L-1
) de cada componente alimentar das culturas monoespecíficas e mistas foi
então calculada multiplicando-se o conteúdo de carbono celular pela densidade de
células na amostra.
Culturas de copépodo
O copépodo Notodiaptomus cearensis foi isolado a partir de uma amostra do
reservatório Marechal Dutra (Gargalheiras), onde foi realizada coleta de zooplâncton
através de arrastos horizontais com rede de 68µm de malha. Notodiaptomus cearensis é
um copépodo Calanoida atualmente conhecido por apresentar comportamento onívoro.
Este copépodo foi escolhido como a espécie predadora nos experimentos por apresentar
ampla distribuição nos reservatórios do semi-árido brasileiro, bem como frequentemente
14
predominar a comunidade zooplanctônica nesses reservatórios dominados por
cianobactéria como componente fitoplanctônico.
Os copépodos foram cultivados em beckeres contendo água mineral comercial
(pH ~6,9), sob constante aeração, temperatura de 22°C e fotoperíodo 13:11
claro/escuro. Culturas monoespecíficas de Cryptomonas obovata foram oferecidas
como alimento para o copépodo três vezes por semana ad libitum. A água mineral foi
completamente trocada uma vez por mês, de forma a evitar a super população e o
aparecimento de parasitas devido a alta concentração de excretas na água.
Desenho experimental
Visando quantificar a taxa de consumo de N. cearensis e sua relação com as
concentrações de alimento no ambiente, experimentos de resposta funcional, usando-se
seis níveis de biomassa, foram realizados separadamente para cada uma das três presas
selecionadas no presente estudo (Paramecium sp., Cyclidium sp. e Microcystis
aeruginosa), totalizando três ensaios. Além disso, para quantificar a preferência
alimentar do copépodo frente às três presas testadas foi realizado um experimento no
qual os três itens alimentares foram oferecidos simultaneamente em culturas mistas, em
quatro níveis de biomassa total.
Todos os ensaios foram realizados na escala de microcosmo em placas de
cultura de tecidos (24 poços de 1,5cm de diâmetro e 3mL de volume), na qual cada poço
constituiu uma unidade experimental.
Nos experimentos de resposta funcional usando Cyclidium sp. e M. aeruginosa
como alimento, indivíduos de N. cearensis foram expostos a seis níveis de biomassa
(Tabela 1) da partícula alimentar (tratamento). Unidades experimentais controle, sem
adição de copépodos, foram também utilizadas. Tratamentos e controles foram
estabelecidos com três réplicas, gerando 36 microcosmos. Para melhor organização, os
18 microcosmos controle foram distribuídos aleatoriamente em uma placa, enquanto
que os outros 18 microcosmos de tratamento foram distribuídos em uma segunda placa,
também seguindo ordem aleatória. Outros 18 microscosmos adicionais foram
estabelecidos (6 níveis de alimento, com 3 réplicas cada) para a determinação da
15
concentração inicial de alimento; estes foram dispostos em uma terceira placa e fixados
com lugol acético no início do experimento. Assim, para os experimentos de resposta
funcional do copépodo alimentado com Cyclidium sp. e M. aeruginosa, 54 unidades
experimentais foram utilizadas. O experimento de resposta funcional para Paramecium
sp. também seguiu o mesmo padrão de desenho experimental, porém este consistiu de 4
réplicas para cada tratamento, totalizando 72 unidades experimentais.
Tabela 1 - Média (±erro padrão) das concentrações iniciais de alimento para cada experimento
de Resposta Funcional. Os experimentos foram feitos com as presas ofertadas ao copépodo
separadamente.
Presas Concentração dos tratamentos (mg C. L-1
)
A B C D E F
M. aeruginosa 1,3 ±
0,06
1,4 ±
0,11
3,5 ±
0,30
7,0 ±
0,04
10,4 ±
0,87
16,2 ±
1,80
Paramecium
sp.
0,8 ±
0,07
1,9 ±
0,13
4,4 ±
0,20
8,2 ±
0,39
17,7 ±
0,58
37,5 ±
0,88
Cyclidium sp. 1,1 ±
0,07
2,1 ±
0,09
3,6 ±
0,22
7,7 ±
0,81
16,9 ±
1,27
35,7 ±
1,57
O experimento de preferência alimentar do copépodo exposto à suspensão de M.
aeruginosa e ciliados foi delineado de forma semelhante aos de resposta funcional.
Porém, os tratamentos (quatro níveis de biomassa total) consistiram em culturas mistas
nas quais a concentração de cada presa (Paramecium sp., Cyclidium sp. e Microcystis
aeruginosa) correspondeu a aproximadamente 1/3 da concentração total de carbono
(Tabela 2). Para este ensaio, tratamentos com 6 réplicas foram dispostos de forma
aleatória nos microcosmos (Tabela 2), totalizando 24 poços nos tratamentos (com
adição do copépodo), e 24 unidades como controle (sem adição do copépodo). Outras
24 unidades experimentais foram preparadas (4 níveis de alimento, com 6 réplicas cada)
para a determinação da biomassa inicial das partículas alimentares, e alocadas em uma
terceira placa de cultura de tecidos
Antes do início de cada experimento, a densidade celular das culturas estoque
(Paramecium sp., Cyclidium sp. e Microcystis aeruginosa) foram determinadas, e as
biomassas (mg C. L-1
) foram estimadas. As suspensões de alimento usadas nos
experimentos foram então preparadas procedendo-se diluições das culturas, gerando as
concentrações desejadas de cada tratamento (Tabela 1 e Tabela 2). As diluições das
16
culturas estoque foram feitas com água mineral comercial utilizada no cultivo de
copépodos. Alíquotas de 2,5mL foram de cada diluição foram alocadas nos respectivos
microcosmos utilizados nos experimentos.
Tabela 2 - Média (±erro padrão) das concentrações iniciais de alimento no experimento de
preferência alimentar. As presas foram ofertadas em mistura. As concentrações individuais bem
como a concentração total de alimento em cada tratamento estão representadas na tabela.
Presas Conc. Tratamentos em mg C. L-1
A B C D
M. aeruginosa 1,5 ± 0,03 3,4 ± 0,18 5,8 ± 0,25 8,7 ± 0,5
Paramecium sp. 1,8 ± 0,09 3,3 ± 0,15 7,4 ± 0,29 8,2 ± 0,1
Cyclidium sp. 1,4 ± 0,1 2,5 ± 0,26 3,2 ± 0,13 3,2 ± 0,15
TOTAL 4,7 ± 0,22 9,2 ± 0,6 16,4 ± 0,67 20,1 ± 0,75
Indivíduos da cultura de N. cearensis foram então inseridos nos tratamentos.
Copépodos adultos com comprimento médio de 1,1 mm foram selecionados. Cada
indivíduo foi previamente analisado em microscópio óptico, para averiguação de
caracteres sexuais evidentes, como a presença de antena articulada e quinta pata
modificada em machos, e segmentos fundidos no urossomo em fêmeas. Dessa forma
evitou-se a utilização de copepoditos ou náuplios nos experimentos. Os animais
selecionados foram acondicionados em recipiente com água mineral renovada e
privados de alimentação por 24h previamente à realização do experimento. A privação
alimentar tem como objetivo promover a obtenção da taxa de ingestão máxima desses
organismos.
Somente um indivíduo de N.cearensis foi utilizado em cada microcosmo
correspondente ao tratamento. Os experimentos só foram iniciados após a adição de
todos os copépodos nos respectivos tratamentos. O período de incubação foi de seis
horas para os experimentos de resposta funcional e de 1,5 horas para o experimento de
preferência alimentar. Os microcosmos controle (sem copépodo) e de tratamento foram
fixados com lugol acético ao final do período de incubação.
Para a quantificação das taxas de ingestão, um alíquota de 1mL foi retirada de
cada réplica após homogeneização, e depositada em câmara de Sedwick-Rafter. Para
quantificação da densidade de Paramecium sp. a câmara inteira foi contada em
microscópio óptico invertido com lente objetiva em aumento de 10x. Para a
quantificação de Cyclidium sp. e Microcystis aeruginosa, campos aleatórios foram
contados até se atingir 200 e 400 célula de cada presa respectivamente em lente objetiva
17
de aumento de 20x. Dessa forma a densidade de cada organismo foi estimada em todos
os experimentos do presente trabalho. O cálculo de biomassa foi feito com base no
conteúdo celular de carbono para cada componente alimentar.
Taxa de ingestão e análise de dados
A predação do copépodo foi estimada através a taxa de ingestão, a qual consiste
no fluxo de massa ingerida pelo copépodo em um dado período de tempo. A taxa de
ingestão (g C.copépodo.h-1
) foi calculada segundo (FROST, 1972), segundo as
equações:
I = (C * g) / P
onde I é a taxa de ingestão (µg C. predador-1
. h-1
); g é o coeficiente de herbivoria (h-1
);
C é a média da densidade de presa durante o período de incubação e P é a densidade de
predador (ind. microcosmo-1
).
C = (D1 * (e(k – g) * t
– 1)) / t * (k – g)
onde k é a constante de crescimento da população da presa, o que corrige a taxa de
ingestão em caso de crescimento durante o tempo de incubação; D1 é a média de
densidade da presa (µg C. mL-1
) nos microcosmos com copépodo no início do
experimento e t é o tempo de incubação em horas.
k = ln (E2/E1) / t
onde E1 é a média da concentração de presas (µg C. mL-1
) nos microcosmos controle no
início do experimento e E2 é a concentração de presas (µg C. mL-1
) nos microcosmos
controle individuais ao final do período de incubação.
g = k – (ln (D2/D1) / t)
onde D2 é a densidade da presa (µg C. mL-1
) nos tratamentos individuais com copépodo
ao final do experimento.
As taxas de ingestão negativas foram consideradas nulas, como sugerido em
outros trabalhos (COLIN; DAM, 2002; LIU, 2005; NEJSTGAARD et al., 1997;
WAGGETT et al., 2012).
18
Os dados dos três experimentos de resposta funcional foram adequados a um
modelo de resposta funcional de tipo II, o qual é o mais comum entre diaptomídeos
(JESCHKE et al., 2004), por meio do software GraphPad Prism 6. A taxa de ingestão
máxima (Imax) bem como a concentração de alimento em metade da ingestão máxima é
atingida (Cm) foram estimadas de acordo com tal modelo.
Diferenças significativas entre as taxas de ingestão total para cada concentração
de alimento testada no experimento de preferência alimentar foram detectados
utilizando-se One-Way ANOVA, seguido de Teste de Turkey para comparação pareada
entre as concentrações. O teste estatístico foi realizado através do software SYSTAT 12.
A preferência alimentar foi estimada através do índice α1 sugerido por Chesson
(CHESSON, 1983) de acordo com a condição de não haver limitação alimentar durante
o período de incubação (a densidade da presa foi alta e o período de incubação foi
curto). A preferência de consumo foi calculada da seguinte forma:
α1 = (r1/n1) / [(r1/n1) + (r2/n2) + (r3/n3)]
onde r1, r2 e r3 representam a quantidade de alimento do tipo 1, 2 e 3 ingerido pelo
copépodo, respectivamente. Já n1, n2 e n3 representam a média da densidade do alimento
do tipo 1, 2 e 3, presentes nos microcosmos controle ao final do tempo de incubação,
respectivamente. Tal equação permite discussão sobre preferência alimentar uma vez
que o índice é calculado a partir da porção total ingerida pelo copépodo, revelando a
porção da presa 1, 2 e 3 na dieta do predador caso todas as presas fossem ofertadas na
mesma concentração (CHESSON, 1983). O índice de preferência de Chesson varia de 0
a 1. Dessa forma, como 3 presas foram testadas, se o índice não for diferente de 0,33, a
escolha da presa é considerada aleatória.
19
4. RESULTADOS
Padrões de herbivoria do copépodo N. cearensis alimentado com culturas
monoespecíficas e culturas mistas de ciliados e M. aeruginosa
A ingestão de Paramecium sp. e Cyclidium sp. pelo copépodo N. cearensis
tendeu a aumentar em função da maior disponibilidade de alimento ofertado em culturas
monoespecíficas (Figura 1). O modelo de resposta funcional do tipo II foi utilizado para
descrever a relação entre a taxa de consumo do copépodo e a biomassa dos ciliados
(Figura 1; Tabela 3).
De acordo com os coeficientes de determinação (Tabela 3), o modelo de resposta
funcional do tipo II foi capaz de explicar 72,17% da variação encontrada nas taxas de
ingestão de Cyclidium sp. e 53,3% da variação encontrada nas taxas de ingestão de
Paramecium sp. Esses valores são válidos para os ciliados oferecidos como alimento
separadamente em culturas monoespecíficas, nas condições experimentais estabelecidas
no presente estudo.
Segundo o modelo utilizado, a maior taxa de ingestão máxima (Imax = 2,9 ± 2,0
µgC.copépodo-1
.h-1
; Tabela 3) ocorreu quando a cultura monoespecífica de Cyclidium
sp. foi ofertada como alimento, o qual foi quase o triplo do valor médio encontrado para
Paramecium sp. (Imax = 0,90 ± 0,3 mg C. L-1
; Tabela 3). Os valores de Cm (concentração
de alimento na qual a taxa de ingestão corresponde à metade da ingestão máxima) foram
compatíveis com os valores de Imax (Tabela 3). Ou seja, para o consumo do copépodo
Notodiaptomus cearensis atingir a metade do consumo máximo de Cyclidum sp., é
preciso que o ciliado esteja em presente no ambiente em concentrações médias acima de
50 mg C. L-1
(Cm = 55,6 ± 54,8 mg C. L-1
; Tabela 3). Para Paramecium sp., o consumo
máximo é atingido quando este ciliado está presente no ambiente em menores
quantidades; para Paramecium sp. o Cm foi um pouco menos da metade do encontrado
para Cyclidium sp, correspondendo a 21,7 ± 15,9 mg C. L-1
(Tabela 3).
Não foi possível adequar um modelo de resposta funcional para o consumo de
Microcystis aeruginosa (cultura monoespecífica) porque dentre os seis tratamentos
utilizados nos ensaios, apenas quatro puderam ser considerados, número insuficiente
20
para gerar resultados confiáveis em modelos de resposta funcional. Dois tratamentos
(biomassa do alimento ~7,0 e 10,3 mg C.L-1
) foram desconsiderados devido a
problemas com algumas réplicas durante o experimento. Ainda assim, é possível
observar que as taxas de ingestão para M. aeruginosa foram baixas. A ingestão da
cianobactéria variou entre 0 e 0,2 µgC.copépodo-1
.h-1
entre as concentrações testadas de
monocultura.
21
Figura 1: Relação entre taxa de ingestão e concentração total de alimento observada nos
experimento sem mistura de alimento considerando como presas Paramecium sp., Cyclidium sp.
e Microcystis aeruginosa. A adequação da curva de resposta funcional não foi possível para M.
aeruginosa devido a problemas com algumas réplicas.
22
Tabela 3 - Valores referentes ao ajuste ao modelo de resposta funcional do tipo II para os
experimentos de resposta funcional. Imax é a taxa de ingestão máxima; Cm é a concentração de
alimento em que a taxa de ingestão é igual a 50% da Imax; e R2 é o coeficiente de determinação.
No experimento que investigou a preferência alimentar de N. cearensis, não
foram detectadas diferenças significativas na taxa de ingestão dos copépodos entre os
diferentes tratamentos (concentração total de alimento entre 4,7 e 20,1 mg C.L-1
),
considerando cada item alimentar individualmente (Figura 2a,Figura 2b e Figura 2c;
dados da One-Way ANOVA não mostrados). Contudo, quando a taxa de ingestão total
foi considerada (Figura 2d), foi detectada diferença significativa do consumo do
copépodo entre os diferentes tratamentos (Tabela 4). A ingestão total máxima de
alimento por N. cearensis (Figura 2d) foi significativamente maior na concentração de
alimento 16,4 mg C.L-1
(ingestão de 1,5 µgC copépodo-1
. h-1
) e marginalmente superior
na concentração de alimento 20,1 mg C.L-1
(ingestão de 1,3 µgC copépodo-1
. h-1
)
comparando-se ao consumo do copépodo alimentado com suspensão de 4,7 mg C.L-1
(
ingestão de 0,47 µgC.copépodo-1
. h-1
) (Tabela 4).
As variações das taxas médias de ingestão de N. cearensis foram semelhantes no
experimento que investigou a preferência alimentar do copépodo alimentado com
misturas de Cyclidium sp., Paramecium sp., e M. aeruginosa (Figura 2), e nos
experimentos nos quais os alimentos foram oferecidos em culturas monoespecíficas
(Figura 1). Porém, em suspensões mistas, o ciliado Paramecium sp. foi consumido em
maiores taxas de ingestão médias, variando em média de 0,3 a 0,7µgC. copépodo-1
. h-1
(Figura 2). Cyclidium sp. foi ingerido pelo copépodo em quantidades variando entre 0,1
a 0,4µgC. copépodo-1
. h-1
. Por sua vez células de Microcystis aeruginosa renderam as
menores taxas médias de ingestão, variando de 0,004 a 0,3µg C. copépodo-1
. h-1
.
Presas Imax ± EP Cm ± EP R2
Paramecium sp. 0,90 ± 0,3 21,7 ± 15,9 0,53
Cyclidium sp. 2,9 ± 2,0 55,6 ± 54,8 0,72
23
Figura 2: Relação entre taxa de ingestão e concentração total de alimento observada no
experimento de preferência alimentar (culturas mistas). Figuras 6a, 6b e 6c referem-se às taxas
de ingestão de cada presa em particular (Paramecium sp., Cyclidium sp., e Microcystis
aeruginosa respectivamente), e Figura 6d apresenta a ingestão total de alimento. As barras
representam o erro padrão.
24
Tabela 4 - Valores referentes ao teste One-Way ANOVA utilizado para conhecer diferenças
significativas entre as taxas de ingestão total de presa em todos os tratamentos do experimento
de preferência alimentar (cultura mista). As concentrações totais de alimento são: A (4,7 mgC.L-
1), B (9,2 mgC.L
-1), C (16,4 mgC.L
-1), D (20,1 mgC.L
-1).
Fonte gl SM F P-valor
Concentração total 3 1,079 5,284 0,008
Erro 20 0,204
Teste Turkey
A B C D
A
B 0,328
C 0,005 0,173
D 0,084 0,857 0,541
Os cálculos da preferência alimentar (1) tornou esse padrão mais evidente. O
copépodo N. cearensis ingeriu majoritariamente as presas eucarióticas, principalmente
Paramecium sp., nas condições testadas (Figura 3). Porém, o padrão exato de preferência
de consumo do copépodo variou entre os diferentes níveis de biomassa total de alimento
oferecidos. Por exemplo, a presa de maior tamanho, o ciliado Paramecium sp. compôs
em média 68% da preferência do copépodo no tratamento de menor biomassa total (4,7
mgC.L-1
), em contraste aos demais itens alimentares, que compuseram 31% (Cyclidium
sp.) e 2% (M. aeruginosa) do alimento selecionado (Figura 3).
No tratamento com biomassa 9,2 (± 0,6 mgC.L-1
) embora as diferenças nos
valores de 1 tenham sido menores, ainda assim apontam para a preferência de N.
cearensis pela ingestão de Paramecium sp. (1=0,56) comparando-se com Cyclidium
sp. (1=0.20) e M. aeruginosa (1=0.23). Por outro lado, nos tratamentos delineados
com maiores concentrações de alimento (16,4 ± 0,67 e 20,1 ± 0,75 mg C. L-1
), N.
cearensis preferiu igualmente Paramecium sp. e Cyclidium sp. (1 > 0,39 ), ao mesmo
tempo em que preteriu a cianobactéria (1 0,15 ) (Figura 3).
25
C o n c e n tr a ç ã o d e A lim e n to (m g C . L-1
)
Pre
ferê
nc
ia d
e p
res
a (
1)
5 1 0 1 5 2 0 2 5
0 .0 0
0 .2 5
0 .5 0
0 .7 5
1 .0 0
P a r a m e c iu m s p .
C y c l i d iu m s p .
M ic r o c y s t i s a e r o g in o s a
Figura 3: Preferência alimentar do copépodo Notodiaptomus cearensis estimada pelo índice de
preferência de presas de Chesson (α1) (Chesson 1983) para três tipos diferentes de alimento, em
quatro concentrações totais de alimento. A linha pontilhada indica o valor do índice em que
todos os alimentos foram igualmente selecionados (0,33). Valores maiores que 0,33 indicam
seleção positiva, enquanto valores abaixo desse valor indicam seleção negativa.
26
5. DISCUSSÃO
Os experimentos realizados no presente trabalho auxiliam no entendimento de
tal comportamento alimentar, uma vez que eles revelaram dados quantitativos referentes
a predação de um copépodo Calanoida.
O modelo de resposta funcional do tipo II utilizado para a adequação dos dados
dos experimentos com culturas monoespecíficas de presa, é o modelo mais comum na
natureza e, inclusive, comum entre diaptomídeos (JESCHKE et al., 2004), grupo
taxonômico no qual Notodiaptomus cearenisis é classificado. De acordo com os dados
da adequação do modelo de resposta funcional, as taxas de ingestão para presas
pertencentes ao protozooplâncton são altas. No entanto a taxa máxima de consumo do
ciliado de menor tamanho (Cyclidium sp.) pelo copépodo é provavelmente atingida
apenas em altas concentrações do ciliado. A dificuldade de encontros bem sucedidos
entre presa e predador devido à capacidade de fuga da presa (BALSEIRO et al., 2001)
pode ter sido responsável por esse padrão.
Ainda que a curva de resposta funcional para Microcystis aeruginosa não tenha
sido viável, o experimento pôde mostrar baixas taxas de ingestão da cianobactéria pelo
copépodo testado. Tal padrão de consumo de pastadores já foi comentada em alguns
estudos. De acordo com Panosso e colaboradores (PANOSSO et al., 2003) a taxa de
ingestão do copépodo Notodiaptomus iheringi para cepas coloniais de cianobactéria foi
aproximadamente 0,05µg C. copépodo-1
. h-1
em uma concentração total de alimento de
0,8mg C. L-1
, enquanto que no presente trabalho a taxa de ingestão foi em torno de
0,0205µg C. copépodo-1
. h-1
, considerando concentração de alimento semelhante
(Figura 1). A dificuldade de digestão (WANG et al., 2010), de filtração (ESKINAZI-
SANT’ANNA et al., 2007; PACHECO et al., 2010; PANOSSO, R. et al., 1989) e valor
nutricional reduzido (BURNS et al., 2011) também podem contribuir para as baixas
taxas de ingestão encontrada nesses estudos.
Em contrapartida, muitos trabalhos afirmam encontrar altas taxas de ingestão
quando ciliados são ofertados como fonte de alimento em culturas mistas. Taxas de
ingestão próximas a 0,8µg C de ciliado. copépodo-1
.h-1
em concentrações total de
alimento de 8mg C. L-1
foi encontrado por Reiss & Schimid-Araya (REISS; SCHMID-
ARAYA, 2011). Tal taxa de ingestão foi semelhante a encontrada no presente trabalho
27
considerando a concentração de alimento total semelhante em experimentos de culturas
mistas (0,74µg C de ciliado. copépodo-1. h-1) (Figura 3).
Segundo Schnetzer (SCHNETZER, 2005), ciliados e dinoflagelados compõem
de 25 a 98% da dieta de copépodos Calanoida. De acordo com Burns e Schallenberg
(BURNS; SCHALLENBERG, 2001) copépodos são capazes de impactar as populações
de ciliados em ambientes com pouca ou muita produtividade, algo que também foi
possível observar no presente trabalho. Em estudos que avaliam preferência alimentar
de copépodo em comparação ao fitoplâncton, os ciliados mostram-se palatáveis, sendo
ingeridas com velocidade semelhante a presas fitoplanctônicas eucarióticas (DAM;
LOPES, 2003), ou apresentando taxas de ingestão maiores em grandes concentrações de
alimento (SAAGE et al., 2009), como também encontrado no presente trabalho através
do teste estatístico para taxas de ingestão no experimento de preferência alimentar.
Tal preferência alimentar por ciliados vem sendo justificada por uma série de
motivos. Alguns autores afirmam que a capacidade de fuga é o fator determinante
durante a predação (BALSEIRO et al., 2001), tornando presas lentas mais suscetíveis a
predação. Ainda assim há autores que defendem que a preferência dos copépodos é
espécie-específica (GISMERVIK, I., 2006). Além disso, copépodos apresentam maior
taxa de ingestão para ciliados de maior tamanho (MERRELL; STOECKER, 1998;
REISS; SCHMID-ARAYA, 2011), algo que também pôde ser verificado no presente
trabalho quando o maior dos ciliados testados foi o mais selecionado no experimento de
preferência.
Copépodos necessitam de alimentos ricos em ácidos graxos poli-insaturados
para obter sucesso reprodutivo. Como cianobactérias são pobres nesses compostos e o
zooplâncton tende a assimilar os ácidos graxos fisiologicamente mais importantes
(BURNS et al., 2011), talvez por esse motivo os ciliados foram a presa preferida em
todos os tratamentos do experimento de preferência. Ciliados podem ser importantes na
dieta dos copépodos não apenas quantitativamente, mas também qualitativamente, já
que ciliados podem conter uma quantidade substancial de ácidos graxos poli-
insaturados (STOECKER; CAPUZZO, 1990). Além disso, toxinas produzidas pelas
cianobactérias também podem interferir na sobrevivência de copépodos, uma vez que
altas taxas de mortalidade foram encontradas para uma população de copépodos quando
cianobactérias foram oferecidas como alimento (GER et al., 2010).
28
Ainda assim, ciliados não oferecem recursos suficientes para garantir o sucesso
reprodutivo de organismos zooplanctônicos. A presença de ciliados na dieta não
aumentou a quantidade de ovos em fêmeas do copépodo Temora longicornis (DAM;
LOPES, 2003). Além disso, ciliados e flagelados incorporados na dieta não foram
suficientes para suportar o sucesso reprodutivo de rotíferos (MOHR; ADRIAN, 2002).
Como o sucesso reprodutivo do zooplâncton pode ser dependente de nutrientes
obtidos diretamente da via autotrófica (DAM; LOPES, 2003; MOHR; ADRIAN, 2002)
e sua sobrevivência de fatores de crescimentos presentes em presas detritívoras
(BRETELER et al., 1990), o copépodo, por ser onívoro, pode ser responsável por
interligar a via autotrófica e a cadeia detritíviora em ambientes eutróficos (ATTAYDE;
RIPA, 2008). Porém, informações quantitativas adicionais são necessárias para que seja
averiguada a importância da cadeia detritívora em ambientes eutróficos.
Considerando a alta ingestão de ciliados no experimento (ingestão máxima de
1,18 µg C de ciliados. copépodo-1
. h-1
) além da preferência do copépodo por ciliados em
baixas (98,15% da dieta) e altas concentrações de alimento (91,56% da dieta), o carbono
obtido pelo copépodo através de sua atividade filtradora parece ser proveniente, em
grande parte, da atividade predatória de organismos detritívoros. Apesar da assimilação
do carbono dos ciliados ingeridos pelo copépodo N. cearensis não haver sido
quantificada no presente trabalho, as altas taxas de ingestão detectadas podem indicar
que N. cearensis apresenta grande relevância na transferência de carbono da via
detritívora para níveis tróficos superiores, uma vez que Hansen (HANSEN, 2000)
afirma que o fluxo de carbono entre ciliados e um copépodo ciclopoida foi entre 2,8 –
23,5 µg C. L-1
. dia-1
em experimentos longos realizados in situ. Tais resultados
evidenciam a importância da alça microbiana na sustentação da cadeia trófica em
ambientes enriquecidos por nutrientes.
Apesar do fitoplâncton com predominância de cianobactérias não ter
apresentado relevância significativa na dieta do copépodo (ingestão máxima de 0,38 mg
C de cianobactéria. copépodo-1
. h-1
, compondo de 1,84 a 31,56% da dieta), o mesmo
pode ser importante para a reprodução desses microcrustáceos uma vez que ciliados não
interferem positivamente na produção de ovos em organismos zooplanctônicos (DAM;
LOPES, 2003; MOHR; ADRIAN, 2002) e que o fitoplâncton contribui
nutricionalmente para o sucesso reprodutivo, enquanto que a presença de ciliados na
dieta aumenta a sobrevivência desses organismos (MOHR; ADRIAN, 2002).
29
As vias autotrófica e heterotrófica parecem atuar de forma conjunta no que tange
a obtenção e assimilação de carbono através da ingestão, apesar da via detritívora
apresentar maior relevância na dieta do copépodo. Porém, dados quantitativos
adicionais verificando a origem e a qualidade nutricional do detrito presente nesses
reservatórios podem auxiliar na identificação da relevância de ciliados e de
cianobactérias na reprodução dos organismos zooplanctônicos, contribuindo também
para o entendimento da dinâmica de fluxo de energia desses reservatórios.
30
6. CONCLUSÃO
O presente estudo demonstra a importância de ciliados na dieta de
Notodiaptomus cearensis em reservatórios dominados por cianobactéria. Esses dados
revelam que o copépodo calanoida testado é fundamental na passagem de carbono do
componente microbiano heterotrófico para níveis tróficos superiores, conferindo maior
relevância a alça microbiana que ao fitoplâncton na sustentação da teia trófica em
reservatórios dominados por cianobactéria. Este padrão reforça a noção de que as
defesas contra a herbivoria presentes nas cianobactérias enfraquecem a interação entre o
fitoplâncton e o zooplâncton, minimizando a transferência de carbono da produção
primária para níveis tróficos superiores (Elser & Goldman, 1991; Ghadouani et al,
2003).
Estudos adicionais são necessários para entender tanto a contribuição relativa do
componente microbiano heterotrófico e do fitoplâncton (cianobactérias) desses
reservatórios na reprodução e fitness do zooplâncton. Dessa forma será possível
entender com mais clareza a dinâmica trófica e o fluxo de energia de reservatórios
eutrofizados.
31
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37
ANEXO A
Meio de Cultura para Cultivo de ciliados
O meio de cultura complexo utilizado para cultivo de Paramecium sp. e
Cyclidium sp. consiste em uma infusão de capim descrita no livro de Tavares e Rocha
(TAVARES; ROCHA, O., 2004). No presente trabalho, foi utilizado como fonte de
carbono uma infusão de folhas de Pennisetum purpureum (capim elefante). As folhas
eram coletadas já secas e mantidas em estufa de secagem sob temperatura de 50°C por
24h. Em seguida as folhas eram cortadas em pequenos pedaços e estocadas em
recipiente de vidro tampado.
Para produção de 1L de meio de cultura, 3g de folhas picadas de capim elefante
seco devem ser fervidos por 30min em 500mL de água destilada/deionizada. Após a
fervura, filtrar o extrato ainda quente em papel de filtro com abertura suficiente para
reter a menor partícula contida no extrato. Em seguida, adicionar ao extrato filtrado 0,4g
de Na2HPO4 ou 0,757g de Na2HPO4.7H2O e completar para 1L com água
destilada/deionizada.
O meio de cultura deve ser devidamente autoclavado no mesmo dia em que for
produzido. O meio só poderá ser utilizado quando estiver na temperatura em que o
cultivo é realizado.
