EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE ~-XILOSIDASE POR...

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE ~-XILOSIDASE POR MICELAS REVERSAS

. -·.,.... --

Francislene Andréia Hasmann

Lorena - SP - Brasil Fevereiro de 2000

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA.


PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE (3-XILOSIDASE POR MICELAS REVERSAS

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca Examinadora:

Dr. Adalberto Pessoa Junior (presidente)

Dr. Elias Tambourghi

Ora. Inês Conceição Roberto

Estudante:

Francislene Andréia Hasmann


FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA


PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE J3-XILOSIDASE POR MICELAS REVERSAS

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora


RESUMO

Extração líquido-líquido de f3-xilosidase por micelas reversas. Francislene Andréia Hasmann. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adalberto Pessoa Jr. (Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP - CP 66083, CEP 05315-970, São Paulo/SP, Brasil). Banca examinadora:Dr. Elias 8. Tambourgi e Ora. Inês Conceição Roberto. Fevereiro de 2000.

O objetivo deste trabalho foi estudar a recuperação da enzima !3-xilosidase, produzida pelo fungo Penicillium janthinellum, através da técnica de extração líquido- líquido por micelas reversas. Para tanto utilizaram-se três sistemas micelares distintos formados a partir de BDBAC (agente tensoativo catiônico), AOT (agente tensoativo aniônico) e CTAB (agente tensoativo catiônico).

Foram utilizados planejamentos estatísiticos (distintos para cada sistema micelar) com o intuito de se realizar uma triagem das variáveis significativas a cada processo. A metodologia de superfície de resposta foi empregada para quantifificação dos níveis das variáveis significativas. O trabalho resultou em dois modelos matemáticos otimizados; um representando o processo de extração da enzima f3-xilosidase por micelas reversas de BDBAC e o outro modelo matemático para o agente tensoativo CTAB. No entanto, nas condições averiguadas, as extrações da enzima utilizando sistema de micelas reversas formadas a partir do agente tensoativo aniônico AOT resultaram em valores de recuperação iguais a zero.

Rendimentos em atividade da ordem de 43% foram previstos e observados experimentalmente para ambos os modelos obtidos. Observou-se ainda um aumento na atividade específica da enzima de 2 e 5,34 vezes, para o processo de extração por micelas reversas de BDBAC e CTAB, respectivamente.

ABSTRACT

This a study on the recovery of J3-xylosidase enzyme produced by Penicillium

janthinellum fungus, through liquid-liquid extraction by reversed micelles. Three

distinct micelar systems formed from BDBAC (cationic surfactant), AOT (anionic

surfactant) and CTAB (cationic surfactant) were employed. Statistical designs (one for

each micelar system) were used to select the most significant variables for each

process. Surface responce methodology was used to quantify the leveis of the

significant variables. The work resulted in two optimized mathematical models: one

for extraction by BDBAC reversed micelles and one for extraction by CT AB reversed

micelles. However, in the conditions tested, the extractions using the system formed

from AOT resulted in recovery values equal to zero. Activity yield of about 43% were

predicted and experimentally observed for both models. lncreases of 2 and 5.34

times in the specific enzyme activity were observed for the extractions by BDBAC and

CTAB reversed micelles, respectivelly.

Aos meus pais/ irmãs e scombos. Ao meu mando Luiz Cláudio.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Adalberto Pessoa Jr. não somente pela orientação dedicada

durante a realização deste trabalho, mas também pelos constantes incentivos e

amizade.

À Prof. Ora. Inês Conceição Roberto, pela amizade, orientação e freqüente

colaboração no desenvolvimento deste trabalho.

Ao querido e sempre disponível, o amigo e professor Dr. Arnaldo Márcio R.

Prata, pela interminável paciência e valiosa colaboração.

Ao Paulinho e Rita, pela amizade e auxílios prestados dentro e fora do

laboratório.

Á Maria Eunice pela inestimável participação.

Aos demais funcionários e professores do Departamento de Biotecnologia.

Aos alunos que com seu companheirismo, amizade e principalmente, festas,

tornaram o desenvolvimento deste trabalho ainda mais prazeroso.

Ao Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de

Lorena, pelo apoio durante o desenvolvimento deste trabalho.

À FAPESP e CAPES, pelo apoio financeiro.

ii

CONTEÚDO

LISTA DE FIGURAS v LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE ABREVIATURAS x

1 - INTRODUÇÃO 1

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3

2.1 - PROCESSOS DE RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS-("DOWNSTREAM PROCESSING") ............................................................................................................................ 3 2.2 - PRECIPITAÇÃO 5

2.2.1 - Precipitação por Adição Fracionada de Etanol 6 2.3 - EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO POR MICELAS REVERSAS 7

2.3.1 - Micelas 7 2.3.2 - Tipos de Solventes 8 2.3.3 - Tipos de Co-solventes 8 2.3.4 - Tipos de Tensoativos 9 2.3.5 - Parâmetro Wo······················································································ 10 2.3.6 - Composição das Micelas Reversas 11 2.3.7 - Sistemas Micelares Reversos 12

2.4 - EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM SISTEMAS DE MICELAS REVERSAS 14 2.4.1 - Mecanismo de Formação de Mice las Reversas 16 2.4.2 - Modelos de Absorção de Biomoléculas 17 2.4.3 - Fatores que Afetam a Extração de Proteínas 18

2.4.3. 1 - pH 18 2.4.3.2 - Força iônica e tipo de íon 20 2.4.3.3 - Tipo de proteína 22 2.4.3.4 - Temperatura 22 2.4.3.5 - Tensoativo 23 2.4.3.6 - Tamanho das mice/as 26 2.4. 3. 7 - Influência da velocidade de agitação 27

2.5 - UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS 27 2.5.1 - f3-xilosidase 29

2.5.1.1 - pH ótimo 30 2.5.1.2 - Temperatura ótima 30

3. OBJETIVOS 31

4 - MATERIAIS E MÉTODOS 33

4.1 - MICRORGANISMO 33 4.2 - MEIO DE MANUTENÇÃO DO FUNGO 33 4.3 - HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 34 4.4 - PRODUÇÃO DA ENZIMA f3-XILOSIDASE 34

iii

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4.5 -AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA \t ·~· .. ·: .. ~ ~ ~i4 • \(.V '

4.5.1 - Xilanases \~ ';' .!/ 34 4.5.2 - f3-xilosidase >:-~./~.a.1:.~_:::r. 35

4.6 - PRECIPITAÇÃO PELA ADIÇÃO FRACIONADA DE ETANOL --:-:·:·.::~~ 36 4. 7 - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS 36 4.8 - DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE À ESTOCAGEM DA ENZIMA f3-XILOSIDASE 37 4.9 - EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO POR MICELAS REVERSAS 37 4.10 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL. 39 4.11 - DETERMINAÇÃO DO RAIO MICELAR - W0 43 4.11 - ENSAIOS ELETROFORÉTICOS 44

4.11. 1 - Preparo das Amostras 44 4.11.1.1 - Diálise 44 4.11.1.2 - Liofilização 44

4. 11.2 - Condução dos Ensaios eletroforéticos 45 4.12 - DOSAGEM DO TEOR TOTAL DE PROTEÍNAS - MÉTODO DE LOWRY 4 7 4.13 -ANÁLISE DOS RESULTADOS 47

5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES 49

5. 1 - A ENZIMA f3-XILOSIDASE 49 5.1. 1 - Estabilidade 49 5.1.2 - Parâmetros Cinéticos 51

5.2 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA f3-XILOSIDASE POR SISTEMA DE MICELAS REVERSAS FORMADO A PARTIR DO AGENTE TENSOATIVO CATIÔNICO BDBAC 54

5.2.1 - Otimização do Processo de Extração por Micelas Reversas de BDBAC em lsooctano e Hexanol 65 5.2.2 - Determinação do Raio Micelar 70 5.2.3 - Eletroforese 71

5.3 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA f3-XILOSIDASE POR SISTEMA DE MICELAS REVERSAS FORMADO A PARTIR DO AGENTE TENSOATIVOANIÔNICOAOT 74 5.4 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA f3-XILOSIDASE POR SISTEMA DE MICELAS REVERSAS FORMADO A PARTIR DO AGENTE TENSOATIVO CATIÔNICO CTAB 76

5.4. 1 - Otimização do Processo de Extração por Micelas Reversas de CTAB em lsooctano, Hexanol e Butanol 86 5.4.2 - Determinação do Raio Micelar 93

5.5 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA f3-XILOSIDASE POR MICELAS REVERSAS DE BDBAC E CTAB, DIRETAMENTE DO MEIO FERMENTADO 94

6 - CONCLUSÕES 97

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 99

iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 Produção Nacional de Enzimas versus Importações (Adaptado de ENZITEC, 1999). 4

Figura 2.2 Esquema de Micela, Micela Reversa Vazia e Micela Reversa Contendo Proteína em seu Interior. 7

Figura 2.3 Composição de uma Micela Reversa (Adaptado de SEOUD, 1999). 12

Figura 2.4 Estruturas que Formam o Sistema Genérico/Tensoativo/Solvente/ H20 (Adaptado de SEOUD 1999). 13

Figura 2.5 Diagramas de Fases dos Agentes Tensoativos CTAB (I) e AOT (II). 13

Figura 2.6 Representação Esquemática do Processo de Extração em Sistemas Micelares Reversos. 15

Figura 2.7 Mecanismo de Formação de Micelas Reversas (Adaptado de DUNGAN, 1991). 17

Figura 2.8 Modelos de Proteínas Englobadas por Micelas Reversas (Adaptado de LUISI, 1988). 18

Figura 2.9 Evolução da Formação de Estruturas no Sistema de Micelas Reversas (Adaptado de SEOUD et ai., 1999). 25

Figura 4.1 Representação Esquemática da Etapa de Extração de uma Biomolécula por Micelas Reversas. 38

Figura 4.2 Representação Esquemática da Etapa de Reextração de uma Biomolécula por Micelas Reversas. 38

Figura 5.1 Atividade da í3-xilosidase após Precipitação Fracionada com Etanol em Função da Concentração de Substrato (pNpX) para os Valores de pH 3,0; 6,0; 7,0 e 9,0. 51

Figura 5.2 Curvas Correspondentes ao Inverso dos Valores das Atividades (1/v) de í3-xilosidase em Função do Inverso das Concentrações do Substrato (1/s). 52

Figura 5.3a Recuperação da í3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Temperatura e do pH, usando BDBAC O, 15M, Condutividade Elétrica de 7,0mS/cm, 7,5% de Hexanol. 58

Figura 5.3b Recuperação da í3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Temperatura e da Concentração do BDBAC, usando pH6,0, Condutividade Elétrica de 7,0mS/cm, 7,5% de Hexanol. 58

Figura 5.3c Recuperação da í3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Concentração de BDBAC e do pH, temperatura de 26ºC, 7,0mS/cm, 7,5% de Hexanol. 59

V

Figura 5.3d Recuperação da '3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Condutividade Elétrica e da Concentração de Hexanol, usando BDBAC O, 15M, 7,0mS/cm, 7,5% de Hexanol. 59

Figura 5.4 Extração de uma Proteína por Micelas Reversas Considerando a Existência de Forças Hidrofóbicas de Interação (Adaptado de LUISI, et ai., 1988). 61

Figura 5.5 Superfície de Resposta Descrita pelo Modelo da Equação 5.2, que Representa a Extração em Condições Otimizadas de '3- xilosidase por Micelas Reversas do Agente T ensoativo Catiônico BDBAC em lsooctano e Hexanol. 69

Figura 5.6 Eletroforese em Condições Desnaturantes (SDS-PAGE) das Etapas do Processo de Extração da Enzima '3-xilosidase por Micelas Reversas Pré Purificada por Precipitação Fracionada com Etanol: Linha 1 e 2 - Marcadores de Massa Molar (205, 116, 97, 84, 66, 55, 45, 36, 29, 24, 20 e 6,5 kDa), Linha 3 - Precipitado Solubilizado, Linha 4 - F AI e Linha 5 - F AII. 72

Figura 5. 7a Recuperação da p-xilosidase por Micelas Reversas em função do pH e da Concentração de CTAB, usando, Condutividade Elétrica de 7,0mS/cm, 7.5% de Hexanol e 15% de butanol. 80

Figura 5.7b Recuperação da '3-xilosidase por Micelas Reversas em Função do pH e da Concentração de Butanol, usando CTAB O, 15M, 7,0mS/cm e 7,5% de Hexanol. 80

Figura 5.7c Recuperação da '3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Condutividade Elétrica e da Concentração de CTAB, usando pH 5,5, 7,0 mS/cm e 7,5% de Hexanol. 81

Figura 5.7d Recuperação da '3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Concentração de CTAB e da Concentração de Butanol, usando pH 5,5, 7,0mS/cm e 7,5% de Hexanol.

81

Figura 5.7e Recuperação da '3-xilosidase por Micelas Reversas em Função da Concentração de Hexanol e da Concentração de Butanol, usando pH 5,5, 7,0mS/cm e CTAB O, 15M. 82

Figura 5.8 Esboço do Planejamento em Estrela Ortogonal. 87

Figura 5.9 Superfície de Resposta Descrita pelo Modelo da Equação 5.4, que Representa a Extração em Condições Otimizadas de 13- xilosidase por Micelas Reversas do Agente T ensoativo Catiônico CT AB em lsooctano, Hexanol e Butanol. 92

Figura 5.10 Efeito do Número de Etapas de DSP no Rendimento Final do Bioproduto. 94

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1 Valores das Variáveis Empregadas nos Planejamentos para 39 Recuperação da 13-Xilosidase por Micelas Reversas

Tabela 4.2 Matriz do Planejamento Fatorial Fracionário 2s-1 com 01 Repetição Utilizada para Avaliação da Influência do pH, da Condutividade Elétrica, da Concentração de BDBAC, da 40 Concentração de Hexano! e da Temperatura na Recuperação da 13-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico BDBAC

Tabela 4.3 Matriz do Planejamento Fatorial Completo 24 com 03 Repetições no Ponto Central Utilizada para Avaliação da Influência do pH, Condutividade Elétrica, Concentração de AOT e Temperatura na 41 Recuperação da 13-Xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Aniônico AOT

Tabela 4.4 Matriz do Planejamento Fatorial Fracionário 25•1 com 03 Repetições no Ponto Central Utilizada para Avaliação da Influência do pH, da Condutividade Elétrica, da Concentração de 42 CTAB, da Concentração de Hexanol e da Concentração de Butano! na Recuperação da 13-xilosidase por Micelas Reversas do Agente T ensoativo Catiônico CT AB

Tabela 4.5 Seqüência Usada para Desenvolvimento do Processo Otimizado 46 de Coloração de Géis SDS-PAGE por Prata

Tabela 5.1 Atividade da 13-xilosidase em Diferentes Valores de pH, em 50 Função do Tempo, a 4°C

' --

Tabela 5.2 Atividade da 13-xilosidase em Diferentes Valores de pH, em Função do Tempo, a -4ºC 50

Tabela 5.3 ~(app) e Vm da 13-xilosidase Obtidos após Precipitação Fracionada com Etanol em Função do Inverso das 53 Concentrações do Substrato para Diferentes Valores de pH

Tabela 5.4 Planejamento Fatorial Fracionário 2s-1 com 1 Repetição Utilizado para Avaliação da Influência do pH, condutividade elétrica, concentração de hexanol e Temperatura na Recuperação da 54 13-xilosidase por Micelas Reversas de Agente Tensoativo Catiônico BDBAC

Tabela 5.5 Estimativa dos Efeitos, Erros-padrão e teste t (Student) para os Parâmetros Estudados na Recuperação da 13-xilosidase por 56 Micelas Reversas de BDBAC

vii

Tabela 5.6 Parâmetros da Análise de Variância (ANOVA) dos Fatores Significativos ao Processo de Extração da Enzima í3-xilosidase 63 por Micelas Reversas do Agente Tensoativo BDBAC

Tabela 5. 7 Análise de Variância de Regressão para o Modelo Representativo do Processo de Extração de í3-xilosidase por 64 Micelas Reversas de BDBAC, na Região em Estudo

Tabela 5.8 Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 Com Face Centrada e 03 Repetições no Ponto Central Utilizada para Avaliação da Influência do Binômio pH e Temperatura na 66 Recuperação da f3-xilosidase por Micelas Reversas de Agente T ensoativo Catiônico BDBAC

Tabela 5.9 Variáveis, Coeficientes, Teste t (Student), Valores de p do Planejamento Completo com Face Centrada 22 com 03 Repetições no Ponto Central para Extração de f3-xilosidase por 68 Micelas Reversas de BDBAC

Tabela 5.10 Parâmetros da Análise de Variância (ANOVA) dos Fatores Significativos ao Processo de Extração de í3-xilosidase por 69 Micelas Reversas de BDBAC

Tabela 5.11 Aumento de Pureza para Enzima í3-xilosidase Extraída por 70 Micelas Reversas de Agente Tensoativo Catiônico BDBAC

Tabela 5.12 Wo e Rm Determinados na FAI E FAII Obtidas após Extração por Micelas Reversas de BDBAC a 0,2M, 1 O % de Hexanol, Condutividade Elétrica de 4 mS/cm, Temperatura de 24ºC e pH 71

3,3

Tabela 5.13 Planejamento Fatorial Completo 24 com 2 Repetições no Ponto Central Utilizado para Avaliação da Influência do pH, Condutividade Elétrica, Concentração de AOT e Temperatura na 74 Recuperação da í3-xilosidase por Micelas Reversas de Agente T ensoativo Aniôníco AOT

Tabela 5.14 Planejamento Fatorial Fracionário 25-1 para Estudo da Influência do pH, Concentração de CTAB, Condutividade Elétrica, Concentração de Hexano!, Concentração de Butano!, na 76 Recuperação de f3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Tabela 5.15 Estimativa dos Efeitos, Erros-padrão e teste t (Student) para os parâmetros Estudados na Recuperação da í3-xilosidase por 78 Micelas Reversas de CTAB

Tabela 5.16 Parâmetros de Análise de Variância para os Efeitos 83 Significativos ao Processo de Extração de f3-xilosidase por

t -- .,._

. ---

viii

Micelas Reversas de CTAB

Tabela 5.17 Análise de Variância de Regressão para o Modelo Representativo do Processo de Extração de 13-xilosidase por 85 Micelas Reversas de CTAB, na Região em Estudo

Tabela 5.18 Níveis Codificados E Valores Utilizados Na Realização Dos Ensaios Do Passo Ascendente no Processo de Extração de 87 13-xilosidase por Micelas Reversas de Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Tabela 5.19 Planejamento Ortogonal Completo 22 com 03 Repetições no Ponto Central para Estudo da Influência da Concentração de CT AB e da Concentração de Butanol, na Recuperação de 88 j3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Tabela 5.20 Parâmetros de Análise de Variância para os Efeitos Significativos ao Processo de Extração de 13-xilosidase por 90 Micelas Reversas de CTAB

Tabela 5.21 Variáveis, Coeficientes, Teste t (Student), Valores de p do Planejamento Completo Ortogonal 22 com 03 Repetições no 90 Ponto Central para Extração de 13-xilosidase por Micelas Reversas de CTAB

Tabela 5.22 Parâmetros da Análise de Variância (ANOVA) dos Fatores Significativos ao Processo de Extração de 13-xilosidase por 91 Micelas Reversas de BDBAC

Tabela 5.23 Aumento de Pureza para Enzima f3-xilosidase Extraída por 92 Micelas Reversas de Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Tabela 5.24 W0 e Rm Determinados na FAI E FAII Obtidas após Extração por Micelas Reversas de CTAB a 0,26M, com 10% de Hexanol e 29,4% de butanol, em pH 8,0, Condutividade Elétrica de 93 4 mS/cm, Temperatura de 26ºC

Tabela 5.25 Comparação entre a Porcentagem de Recuperação da Extração por Micelas Reversas de BDBAC e CTAB de j3-xilosidase Sem 95 Precipitação e Com Precipitação por Etanol

ix

Abreviaturas

DSP

CTAB

BDBAC

AOT

TOMAC

DDAB

CPB

NaDEHP

Wo Nag

Rm

pi CMC

ROH

DNS

pNpX

KM Vm FAI FAII FMI

FMII

BSA

%R

ANOVA

LISTA DE NOMENCLATURAS

Definições

"Downstream Processing"; recuperação de produtos biotecnológicos

brometo de cetiltrimetil amônio

cloreto de benzil dodecil bis(hidroxietil) amônio

bis(2-etilhexil) sulfosuccinato de sódio

cloreto de trioctilmetil amônio

brometo de didodecil dimetil amônio

brometo de cetil piridínio

bis(2-etilhexil) fosfato de sódio

"Water in oil"; quantidade de água presente no interior da micela

Número de moléculas de tensoativo agregadas na micela

Raio micelar

Ponto isoelétrico

Concentração micelar crítica, concentração mínima de tensoativo necessária para a formação de micelas Solvente qualquer

Ácido 3,5 dinitrosalicílico

p-nitrofenil-f3-D-xilopiranosídeo

Constante de Michaelis e Menten

Velocidade máxima de reação enzimática

Fase aquosa I

Fase aquosa II

Fase micelar I

Fase micelar II

"Sovine serum albumine"; albumina de soro bovino

Porcentagem de enzima recuperada

Análise de Variância

X

Introdução

1 - INTRODUÇÃO

Existem inúmeras alternativas para extração seletiva de enzimas dentre as

quais podemos citar: precipitação, extração líquido-líquido em sistemas de duas

fases aquosas e extração líquido-líquido por micelas reversas.

Este trabalho tem como objetivo a recuperação da enzima 13- xilosidase,

utilizando a técnica de extração por micelas reversas, esta enzima pertence ao

complexo de xilanases e possui vasta aplicação no setor industrial, como na

clarificação de sucos e vinhos e na filtração de cerveja. A aplicação mais promissora

de xilanases é na etapa de branqueamento de polpas de celulose, na indústria de

papel e celulose, como alternativa para redução no uso de agentes clorados, no

intuito de se diminuir a agressão ao ambiente causada por tais agentes. Consiste de

uma alternativa auxiliar para remoção da lignina residual que confere à polpa uma

cor escura (CHRISTOV & PRIOR, 1996; MILAGRES & PRADES, 1994;VIIKARI et ai.,

1991).

4 -· -

Assim, o principal objetivo do desenvolvimento de novos processos de

separação é a possibilidade de recuperação e purificação de enzimas a custos

viáveis.

Apesar do interesse de vários grupos de pesquisa em desenvolver e aplicar a

técnica de extração por micelas reversas para separação e purificação de enzimas,

Introdução

sabe-se que o processo pode ser modificado por um grande número de variáveis que

alteram a solubilização das proteínas.

As variáveis mais importantes são aquelas que regulam as interações entre as

proteínas e os outros componentes formadores das micelas reversas. São o pH, a

força iônica do meio e outras variáveis que definem a forma e tamanho das micelas

reversas, tais como temperatura, concentração do agente tensoativo e agitação.

Assim, devido ao grande número de variáveis importantes para o processo de

extração por micelas reversas, o uso da ferramenta estatística, através de

planejamentos experimentais, torna-se de suma importância para identificação da

significância de cada uma das variáveis ao processo estudado.

Na presente dissertação, foram estudadas as seguintes variáveis que atuam

sobre o rendimento da extração líquido-líquido de j3-xilosidase por micelas reversas:

pH, concentração do agente tensoativo, condutividade elétrica (força iônica),

concentração de co-solvente e temperatura.

2

Revisão Bibliográfica

2 • REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 - PROCESSOS DE RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS ("OOWNSTREAM PROCESSING")

O objetivo do "Downstream Processing" (DSP) é recuperar o produto de um

biorreator obtendo-o no nível desejado de pureza e com a formulação correta. Para

isso, diferentes tipos de operações são envolvidas. Com exceção do rompimento

celular, da secagem e da formulação (a qual inclui imobilização), processos de

biosseparação formam o centro do "Downstream Processing" (KRIJGSMAN, 1991 ).

DSP é particularmente importante em biotecnologia onde as formas finais dos

produtos são, usualmente, muito diferentes do estado em que são obtidos no

biorreator. Como exemplo, pode ser citado um típico processo de fermentação que

fornece uma mistura de massa celular com outros componentes do meio nutriente. O

produto desejado pode estar dentro da célula, como constituinte de uma mistura

muito complexa, no meio aquoso diluído, ou ainda distribuído entre os dois. Em

qualquer caso, sua recuperação, concentração e purificação necessita de várias

operações, as quais muitas vezes são limitadas por aspectos econômicos (SCOPES,

1994). Muitas operações padrões nos laboratórios tornam-se impraticáveis, ou

dispendiosas, em processos industriais. Além disso, bioprodutos são freqüentemente

compostos sensíveis, cujas estruturas ativas só podem ser preservadas sob

condições limitadas de pH, temperatura e força iônica. Em função destas restrições

não existem técnicas gerais, ou mesmo uma seqüência de operações que possa ser

3

Revisão Bibliogrãfica

recomendada para recuperação e purificação de qualquer produto biotecnológico.

Cada caso requer o estudo aprofundado para definição das operações unitárias

ideais (GLATZ, 1990; SCAWEN et ai., 1985).

Mesmo sendo onerosas as operações necessárias para purificar diversos

produtos biotecnológicos, há uma tendência crescente da demanda desses produtos

na próxima década. Pesquisas recentes apontam um aumento médio anual de 12%

nas vendas de produtos biotecnológicos nos Estados Unidos, partindo de US$1 O, 1

bilhões no ano de 1996, para uma previsão de US$32,4 bilhões no ano de 2006. As

enzimas fazem parte de um segmento de expressiva participação no contexto geral

de produtos biotecnológicos, o qual deve saltar de US$275 milhões em 1996 para

US$1,6 bilhão no ano de 2006, correspondendo a uma alta nas vendas de 19% ao

ano durante este período (SHAMEL & KEOUGH, 1995).

A Figura 2.1 ilustra claramente a dependência do mercado interno brasileiro

de enzimas importadas.

MERCADO DE ENZIMAS NO BRASIL (US$ J rf)

«oco flTílTITnTITTTr,rr--r-r-- 30000

20000

10000

º~~~~~~~~~,!!~ 19 lmpo,tação -:-- • Exportação

....

Figura 2.1 - Produção Nacional de Enzimas versus Importações (Adaptado de ENZITEC, 1999)

Para satisfazer a demanda destes produtos, várias são as técnicas de DSP

empregadas, dentre as quais podem ser citadas a precipitação por sais, a

precipitação por polietilenoglicol, a precipitação por solventes orgânicos,

ultrafiltração, a cromatografia, a extração em sistemas de duas fases aquosas e por

4


micelas reversas, entre outras (PESSOA JR & VITOLO, 1998; SILVA et ai., 1998;

CORTEZ et ai., 1998; COSTA et ai., 1998; ASENJO, 1990).

A extração líquido-líquido usando micelas reversas é potencialmente atrativa

em processos biotecnológicos, pois com a manipulação de alguns fatores que regem

o processo, é possível não somente a extração de proteínas, mas também a sua

separação e concentração, utilizando-se de uma única etapa de DSP (RAHAMAN &

HA TTON, 1988).

2.2 - PRECIPITAÇÃO

A precipitação é uma operação unitária amplamente utilizada em recuperação

e purificação de biomoléculas. Com amplo consenso, a precipitação pode ser

definida como um processo no qual a relação entre um soluto e um solvente é

alterada, sendo que no geral, a solubilidade é reduzida pela adição de um reagente

que modifica o balanço de energia entre eles (GARCIA, 1993).

Segundo GARCIA (1993), a precipitação é um processo através do qual uma

proteína no estado coloidal é desestabilizada, o que promove a agregação de suas

moléculas. Isto requer a adição de um agente apropriado e agitação, fatores que

modificam o balanço de atração e repulsão entre as partículas.

Para o desenvolvimento de um processo de precipitação existem fatores que

devem ser considerados: seleção do método de precipitação, seleção e dosagem do

agente precipitante para que desestabilize a solução e a dinâmica da precipitação.

Os métodos de precipitação incluem: precipitação pela adição de um sal

neutro ("salting-out"), pelo controle do pH no ponto isoelétrico, pela adição de

polímeros hidrofílicos não iônicos, pela adição de íons metálicos polivalentes e

finalmente pela adição de solvente orgânico miscível. Este último tem se mostrado

efetivo na precipitação da j3-xilosidase (PESSOA JR & VITOLO, 1999; CORTEZ, 1998).

5


2.2.1- Precipitação por Adição Fracionada de Etanol

A precipitação fracionada é uma importante operação para recuperação e

purificação de proteínas (tanto para escala laboratorial quanto industrial). Tem como

objetivo separar seletivamente uma proteína de interesse de uma mistura de

proteínas e contaminantes não protéicos (lipídeos e ácidos nucléicos, por exemplo)

(CLARKSON et ai. 1996).

Esta técnica é usualmente executada em dois "cortes": no primeiro, são

removidas proteínas de baixa solubilidade através da fase precipitada, sendo que no

geral, apenas pequena parcela da proteína de interesse é arrastada pela

precipitação. No segundo corte, recupera-se a proteína de interesse através da fase

precipitada. No entanto, proteínas de alta solubilidade consideradas contaminantes

(sem interesse), podem permanecer em solução, sendo necessário desta forma, a

otimização destes dois pontos de corte, de modo a se obter um nível aceitável de

purificação sem prejuízos para o rendimento do processo (SCOPES, 1994; CORTEZ &

PESSOA, 1999).

CORTEZ (1998), partindo de um caldo enzimático contendo o complexo

xilanolítico, observou que com a adição de uma quantidade de etanol equivalente a

20% (v/v) do meio total, grande parcela das proteínas, analisadas pelo método de

BRADFORD (1976), sofriam precipitação, e com a fração equivalente a 60% (v/v) de

etanol, promovia-se a precipitação da 13-xilosidase, originando um meio onde

praticamente só esta enzima está presente em quantidades apreciáveis.

A precipitação fracionada causa uma pequena perda de rendimento em

função da precipitação de parte da proteína de interesse juntamente com aquelas

consideradas contaminantes, no entanto, o aumento de pureza compensa esta perda

(CORTEZ, 1998).

6


2.3 - EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO POR MICELAS REVERSAS

2.3.1 - Mice/as

O termo "micela" foi utilizado pela primeira vez por McBain, em 1913, para

descrever os agregados de eletrólitos anfifílicos (substâncias que possuem uma

parte hidrofílica e outra hidrofóbica) em soluções aquosas. As micelas reversas são

agregados de moléculas de agentes tensoativos contidos em um solvente orgânico

apoiar.

A técnica de extração utilizando micelas reversas baseia-se na propriedade

que os agentes tensoativos (moléculas que possuem em sua estrutura uma

extremidade hidrofóbica e outra hidrofílica) têm de se auto-organizar quando em

solução aquosa. A extremidade apoiar da molécula de tensoativo procura um

ambiente apoiar. Sendo o único ambiente apoiar existente no meio a própria

extremidade apoiar da outra molécula, formam-se estruturas esféricas e elipsoidais,

que são chamadas micelas. Porém quando em meio apoiar estas micelas

apresentam orientação inversa em relação à formação da estrutura micelar em água,

sendo esta formação denominada micela reversa. Ela contém água em seu núcleo

interno e fica dispersa num meio com solvente orgânico (KREI & HUSTEDT, 1989). A

Figura 2.2 mostra a diferença entre os dois tipos de micelas.

Mi cela Micelas Reversas

- .. - ... - ...... - -- .,,

~-~ --,= -,~~ ' -

. . - - - ,,. - - - - .. - . _- \ - ..::::- . ..,_

~ Meio Aquoso Biomolécula

0 Meio Orgânico

Figura 2.2 - Esquema de Micela, Micela Reversa Vazia e Micela Reversa Contendo Proteína em seu Interior.

7


Os sistemas micelares representados na Figura 2.2 apresentam formas

aproximadamente esféricas, no entanto, micelas reversas podem ser elípticas; o

diâmetro varia em torno de 15 a 20 A, porém pode chegar até a 200 A (KREI &

HUSTEDT, 1989).

Tanto a forma e o tamanho, quanto a transferência de enzimas presentes

numa fase aquosa para a pseudofase micelar dependem da natureza do solvente e

do co-solvente, do tipo de tensoativo, da temperatura, da força iônica e do pH, dentre

outros (RODRIGUES et ai., 1999; ZAMARRO et ai., 1996; KADAM, 1986).

2.3.2- Tipos de Solventes

Para que haja a formação das micelas reversas é necessário que o solvente e

a água sejam imiscíveis. Dos diversos solventes que podem ser usados nos

sistemas de micelas reversas, os mais comuns são hidrocarbonetos alifáticos, como

o isooctano, o n-octano, o n-heptano e o ciclo hexano (RODRIGUES et ai., 1999;

CHANG & CHEN, 1996; LUISI et ai., 1988).

O tipo de solvente pode influenciar no tamanho da micela reversa. Sistemas

com hexano, isooctano, octano e querosene formam micelas reversas com diâmetros

maiores que sistemas com ciclo hexano, xileno e clorofórmio (CHANG & CHEN, 1996;

KADAM, 1986). A diminuição da concentração do solvente, ocasiona a redução na

transferência de proteínas para o interior da micela reversa, prejudicando o processo

de extração (KREI & HUSTEDT, 1992).

2.3.3 - Tipos de Co-solventes

Os co-solventes são utilizados como auxiliares em sistemas de micelas

reversas de tensoativos catiônicos para aumentar o seu tamanho, pois micelas

formadas por estas substâncias são muito pequenas. O co-solvente assemelha-se a

uma solução tampão que provoca uma forte repulsão entre as interações íon-íon dos

núcleos do tensoativo, permitindo a formação do núcleo interno da micela reversa

(LUISI et ai., 1988). Geralmente utilizam-se, como co-solventes, álcoois de cadeias

8


não muito curtas como hexanol, n-butanol e octanol (KREI & HUSTEDT, 1992; CHANG

& CHEN, 1996; PIRES et ai., 1996).

Os co-solventes também podem ter influência sobre as estruturas das micelas

reversas, como é o caso da água solubilizada na micela reversa de TOMAC que

sofre variação em função da quantidade de co-solvente do meio (CHANG & CHEN,

1996). Também a extração de a-amilase, utilizando Aliquat 336 mostrou-se sensível

às variações no tipo de co-solvente utilizado no sistema (HILHORST et ai., 1995).

2.3.4 - Tipos de Tensoativos

Os agentes tensoativos (ou surfactantes) são moléculas anfifílicas com um

núcleo polar (parte hidrofílica) e uma cauda hidrofóbica. Eles são classificados de

acordo com a carga de sua parte polar em neutros, aniônicos e catiônicos

(MEYER, 1992; KREI & HUSTEDT, 1989). De acordo com a literatura, o agente

tensoativo aniônico AOT, tem sido amplamente utilizado (PATEL et ai., 1996;

REGALADO et ai., 1996; ZAMARRO et ai., 1996; HUANG & LEE, 1994; HENTSCH et

ai., 1992; AIRES-BARROS et ai., 1991) e mostra-se adequado para separação de

proteínas de elevado ponto isoelétrico. Para proteínas de baixo ponto isoelétrico, são

recomendados agentes tensoativos catiônicos como o BDBAC. No entanto, tais

tensoativos formam micelas reversas pequenas, tornando-se necessária a adição de

um co-solvente, ou ainda de um outro tensoativo não iônico, para obtenção de

micelas maiores (HILHORST et ai., 1995).

Apesar da existência de inúmeros tensoativos diferentes, os mais utilizados

para a formação de micelas reversas são:

a) Catiônicos:

brometo de cetiltrimetil amônio - CTAB;

cloreto de benzi! dodecil bis(hidroxietil) amônio - BDBAC;

cloreto de trioctilmetil amônio - TOMAC;

brometo de cetil piridínio - CPB;

brometo de didodecil dimetil amônio - DDAB.

9


b) Aniônico:

bis(2-etilhexil) sulfosuccinato de sódio - AOT;

bis(2-etilhexil) fosfato de sódio - NaDEHP.

e) Neutros:

lecitina de soja;

lecitina de clara de ovo;

Rewopal HV5;

Tergitol NP-4.

2.3.5 - Parâmetro W0

A quantidade de água nas micelas reversas, definida pelo parâmetro Wo

("water in oil"), pode ser obtida pela Equação 2.1, que exprime a relação entre a

concentração molar de água e de tensoativo (LUISI et ai., 1988). Este é um parâmetro

de suma importância no sistema, pois determina a estrutura e o tamanho das micelas

reversas, e também o número de moléculas de tensoativo por micela reversa

(CASTRO & CABRAL, 1988; AIRES-BARROS, 1991 ). Assumindo a hipótese de que as

micelas reversas sejam esféricas e que existe uma distribuição monodispersa dos

raios dos núcleos aquosos, o raio micelar (Rm) pode ser equacionado pela Equação

2.2. É possível ainda, equacionar-se o número de moléculas de tensoativo que forma

cada micela, que é o número de agregação (Nag). Tal parâmetro pode ser calculado

utilizando-se a Equação 2.3. No entanto esse valor pode variar com a presença da

proteína no interior da micela (L YE et ai., 1995).

- -_.,..,

Wo = [H20]/[tens.]

Rm (A)= 1,64 Wo

Nag = 0,611 Wo

Equação 2.1

Equação 2.2

Equação2.3

10


O tamanho das micelas reversas pode ser determinado também através de

métodos experimentais como ressonância magnética e técnicas de dispersão de luz

(SEOUD et ai., 1999).

2.3.6- Composição das Mice/as Reversas

A micela reversa é formada por três regiões: uma primeira região formada

pelas caudas hidrofóbicas das moléculas do tensoativo, que fica em contato direto

com o solvente apoiar, a segunda região é a periferia micelar onde as moléculas de

água estão fortemente ligadas aos núcleos polares do tensoativo e, por fim, a

terceira região, o centro micelar, formado pela água contida no interior da micela que

está ligada ao tensoativo ou água livre (AIRES-BARROS, 1991). A Figura 2.3 ilustra a

composição de uma micela reversa.

A água que fica na periferia micelar possui propriedades físico-químicas

diferentes da água em solução, principalmente em micelas de diâmetro pequeno,

uma vez que suas moléculas se ligam fortemente ao tensoativo, alterando a estrutura

e viscosidade.

Normalmente, a cada molécula de tensoativo aniônico, encontra-se de 4 a 1 o moléculas de água ligadas ao seu núcleo polar. Em tensoativos catiônicos, esse

número se reduz para uma molécula de água (AIRES-BARROS, 1991 ).

Por outro lado, a água do centro micelar tem propriedades semelhantes às da

água, pois essa está livre e portanto não teve sua estrutura modificada; tal

característica é importante visto que a água do centro micelar entra em contato com

a substância de interesse (LUISI et ai., 1988; KADAM, 1986).

11


____ cauda Hidrofóbica

Figura 2.3 - Composição de uma Micela Reversa (Adaptado de SEOUD et ai., 1999).

2.3. 7 - Sistemas Mice/ares Reversos

No preparo de sistemas contendo tensoativo, solvente e água é necessário

definir as proporções entre os componentes de modo que ocorra a formação de

micelas reversas. Para tanto pode-se utilizar diagramas de fases específicos para

cada sistema. O diagrama de fases para os sistemas de micelas reversas são, no

geral, do tipo triangular, ou seja ternários, semelhantemente aos diagramas

tradicionais, onde cada componente ocupa um vértice do triângulo (no caso,

tensoativo, solvente e água). Os diagramas são compostos de diferentes regiões

(Figura 2.4): regiões de cristais líquidos hexagonais e lamelares, solução micelar

aquosa e solução micelar reversa (SEOUD et ai., 1999).

12


Tensoativo

Mi cela Aquosa

Solvente Cristal Líquido Hexagonal

Figura 2.4 - Estruturas que Formam o Sistema GenéricoTensoativo/Solvente/ H20 (Adaptado de SEOUD et ai., 1999).

A Figura 2.5 mostra o diagrama de fases para CTAB e AOT (TAMAMUSHI &

WATANABE, 1980), os quais são de grande importância na determinação das

proporções entre as substâncias que constituem as microemulsões utilizadas.

Através do diagrama de fases, é possível se identificar quantas e quais fases estão

presentes. A determinação de tais diagramas é difícil devido à existência de regiões

muito distintas e são portanto, dificilmente encontrados na literatura.

HEXANO!.

•

(I} (II)

Figura 2.5 - Diagramas de Fases dos Agentes Tensoativos CTAB (I) e AOT (li).

13


Após a determinação dos componentes responsáveis pela formação dos

sistemas micelares, deve-se definir as condições de extração, tais como: pH, força

iônica e temperatura. Existem três maneiras de se preparar os sistemas de micelas

reversas, sendo que a primeira delas consiste da adição de pequena quantidade de

solução aquosa contendo a proteína à solução contendo o solvente orgânico e o

tensoativo (microemulsão). Após a agitação, formar-se-á uma solução límpida de

micelas reversas contendo proteína. Na segunda (aplicável a proteínas de baixa

solubilidade ou insolúveis em água) usa-se a proteína na forma de pó, injetando-a

diretamente na microemulsão. Na terceira, denominada transferência de fases,

mistura-se volumes iguais de solução aquosa contendo a proteína e de

microemulsão, separa-se as fases por centrifugação. (RODRIGUES, et ai., 1999;

PESSOA JR, 1995; LUISI et ai. 1988).

2.4 - EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM SISTEMAS DE MICELAS REVERSAS

' - . ·-~ A extração de uma proteína de um caldo fermentado, visando sua separação

e purificação é feita em duas etapas. A primeira etapa, denominada extração, visa

transferir a proteína, que está na fase aquosa para a fase micelar; a segunda etapa

consiste da reextração da proteína para uma nova fase aquosa. A Figura 2.6 ilustra o

processo de extração descrito.

14


Figura 2.6 - Representação Esquemática do Processo de Extração em Sistemas Micelares Reversos.

A escolha do tensoativo (catiônico ou aniônico) é fundamental neste processo

de separação e purificação de proteínas. Para que o tensoativo exerça atração sobre

a proteína, é necessário que tenham cargas líquidas totais opostas. No que se refere

à proteína, a carga líquida total é determinada pelo pH da fase aquosa. Assim,

tensoativos aniônicos são indicados para processos de separação em que a proteína

desejada possua pi elevado, desta forma, a diferença entre o pi e pH, também será

alta (LUISI et ai., 1988).

Outro fator que merece atenção é a força iônica da fase aquosa. Esta não

deve ser elevada o suficiente para prejudicar a eletroneutralidade necessária para

que ocorram as interações eletrostáticas entre a proteína e o tensoativo (HATTON,

1987).

Assim, para que se obtenha condições, as mais favoráveis possíveis, para

extração de proteínas por micelas reversas, deve-se usar baixa força iônica, pH<pl

para tensoativos aniônicos e pH>pl para tensoativos catiônicos. No entanto, para a

etapa de reextração, a situação se inverte, uma vez que se deseja que a proteína

seja "expulsa" da micela. Portanto usa-se: alta força iônica, pH>pl para tensoativos

aniônicos e pH<pl para tensoativos catiônicos (PYLE, 1994).

15


2.4.1 - Mecanismo de Formação de Mice/as Reversas

O mecanismo de formação das micelas reversas não está totalmente

elucidado. No entanto, a teoria mais aceita descreve a formação da micela reversa

como um mecanismo cooperativo entre proteína e tensoativo: a interface entre as

duas fases (aquosa e micelar) se deforma em torno da proteína, formando a micela e

transferindo-a para a fase orgânica, conforme ilustrado na Figura 2.7 (DUNGAN, et ai.,

1991 ). Um dos fatores que causam a deformação da interface seria a interação

eletrostática provocada pela ação da força iônica e pH.

A Equação 2.4, da força eletrostática, auxilia no entendimento do mecanismo

de formação de micelas reversas:

Fe = 1t - % i, E2 Equação 2.4

Onde: Fe = força eletrostática 1t = pressão osmótica i, = constante dielétrica E2 = campo elétrico

Quanto mais distante a proteína estiver da interface micelar, maior será a

diferença de potencial entre elas, uma vez que a carga da proteína é oposta à do

tensoativo. Assim, será maior também o segundo termo da equação (% i, E2),

aumentando a força de atração e fazendo com que a proteína se aproxime da

interface (Figura 2. 7a). Devido à aproximação entre proteína e tensoativo, a

concentração de cargas opostas aumenta e com isso ocorre a elevação da pressão

osmótica do núcleo aquoso, que age em sentido contrário ao da força eletrostática

(Figura 2.7b). Este fenômeno faz com que haja ruptura da interface e,

consequentemente, deslocamento da micela reversa formada em direção à fase

orgânica (Figura 2. 7c). Desse modo, a superfície interfacial é atraída para junto da

proteína, fechando a micela reversa (Figura 2. 7d).

A tensão superficial juntamente com a força eletrostática, tendem a resistir às

deformações das camadas superficiais e portanto, a interface deforma até que a

tensão superficial e a força eletrostática fiquem equilibradas (DUNGAN et ai., 1991).

16


localizadas em contato com a cauda do tensoativo e até mesmo com o

solvente);

),,> Situação V - várias micelas reversas englobando diversas proteínas.

Figura 2.8 - Modelos de Proteínas Englobadas por Micelas Reversas (Adaptado de LUISI et ai., 1988).

2.4.3 - Fatores que Afetam a Extração de Proteínas

Existem alguns fatores que afetam a transferência da proteína da fase aquosa

para a pseudofase micelar e também sua reextração. Dentre eles, destacam-se: pH,

força iônica, tipo de íon, tipo da proteína, temperatura, tipo e concentração do

tensoativo, tamanho da micela e velocidade de agitação. Cada um dos fatores serão

discutidos a seguir.

2.4.3.1-pH

Esta variável determina a rede de cargas da proteína, influenciando o estado

de ionização dos grupos eletricamente carregados em sua superfície. A solubilização

de proteínas é favorecida por interações eletrostáticas entre os núcleos do tensoativo

e a superfície da proteína, que ocorrem quando a carga líquida total da proteína é

18

e,:,::. =· ~ ~ ~ ~ ~

Fase ~ Aquosa~ ~ e.::::

Fase Aquosa


Fase Aquosa -a

-e Fase

Aquosa

.,;<:;. ~ ~ «s»: ~~~

5~·.··~ -d e,:::; ~ · Micela· ~ . . ~ · Reversa .,;<:;. ~

Fase Orgânica Proteína

~ Tensoativo

-b

Figura 2. 7 - Mecanismo de Formação de Micelas Reversas (Adaptado de DUNGAN et ai., 1991 ).

2.4.2 - Modelos de Absorção de Biomoléculas

A localização da proteína no interior da micela reversa depende da natureza

da proteína e do tipo de tensoativo. Existem inúmeros possíveis modelos que visam

ilustrar a absorção de proteínas pelas micelas reversas. As diferentes situações são

descritas abaixo e ilustradas na Figura 2.8 (LUISI et ai., 1988):

),> Situação I - proteínas hidrofílicas estariam localizadas no centro

micelar;

),> Situação II - molécula de proteína ativa, pode interagir fortemente

com a parede da micela reversa;

),> Situação III - proteínas hidrofílicas localizadas no centro micelar

solubilizadas juntamente com outras proteínas contaminantes;

),> Situação IV - grande número de micelas reversas solubilizando uma

proteína com caráter dominantemente hidrofóbico (proteínas

17


oposta à carga do núcleo do tensoativo. Assim, quando se usa agente tensoativo

aniônico, em processos de extração líquido-líquido por micelas reversas, deve-se

trabalhar com valores de pH inferiores ao do ponto isoelétrico, pois desta forma a

proteína apresentará carga líquida positiva, condição que favorece a atração

eletrostática entre a proteína e o agente tensoativo.

De modo oposto, para tensoativos catiônicos, a transferência da proteína seria

favorecida em valores de pH acima do ponto isoelétrico da proteína. Segundo

ASENJO (1990), o pH de uma solução também afeta as características de

solubilização das proteínas, principalmente porque modifica a distribuição de cargas

na sua superfície, podendo ocorrer repulsão eletrostática e inibição da transferência

de proteínas para o interior da micela reversa (MEYER,1992).

No entanto, tal comportamento pode não ser observado. Por exemplo, PIRES

et ai. (1996), em trabalhos de extração de a-quimiotripsina (que possui pI = 8,3) e

pepsina (pi < 1, 1) utilizando em ambos os casos TOMAC (tensoativo catiônico),

observaram perfis de pH idênticos para ambas as proteínas. A explicação para tal

fato consiste na existência de íons em solução aquosa que exerceriam maior

influência que o pH (PIRES et ai., 1996, CASTRO & CABRAL, 1988, DEKKER et ai.,

1989).

Via de regra, para proteínas de elevada massa molar, a diferença entre o pH

da fase aquosa e o seu pi dever suficiente para obter uma transferência de massa

satisfatória. No entanto para proteínas de massa molar menores, não existe esta

necessidade, uma vez que serão solubilizadas mesmo quando o valor do pH estiver

próximo ao do pi da enzima. O pH influi na transferência da proteína em função do

sua massa molar pois, para proteínas de massas molares elevadas, são necessárias

micelas reversas maiores que a micela vazia, tornando o processo energeticamente

desfavorável. Para viabilizá-lo, deve-se favorecer as interações eletrostáticas ( entre

proteína e tensoativo) através do aumento da densidade de cargas da proteína, o

que ocorre com o aumento da diferença entre o pH e o pi. Assim, para proteínas

menores, o tamanho necessário da micela também é menor, portanto não há a

necessidade de uma diferença grande entre o pH e o pi.

19


No entanto, deve-se dar atenção especial ao valor de pH empregado, uma vez

que valores muito elevados podem levar à desnaturação da proteína. ANDREWS et

ai. (1994), verificaram que uma ou duas unidades de pH abaixo do pi é suficiente

para transferência de praticamente 100% da proteína. Porém em alguns casos,

podem existir intervalos de pH em que ocorre redução na solubilização da proteína

para o interior da micela, voltando a subir em seguida. Como exemplo, pode-se citar

BRANDANI et ai. (1993) que durante a extração de a-amilase (pi = 5,5) utilizando o

sistema TOMAC/isooctano/octanol, não observaram a solubilização da enzima em

valores de pH inferiores a 9. No entanto, no intervalo de pH entre 9,3 e 9,9 houve a

solubilização da a-amilase, provavelmente devido ao aumento de cargas negativas

na superfície da enzima. No intervalo de 9,9 a 10,5 foi observado um decréscimo na

solubilização causado, provavelmente, pela grande quantidade de íons OH- em

solução, o que ocasionou a redução da interação eletrostática entre a carga da

proteína e o núcleo do tensoativo. Ao aumentarem ainda mais o valor do pH, entre

11, 5 e 12,4, a transferência da a-amilase para as micelas reversas voltou a

aumentar.

2. 4. 3. 2 - Força iônica e tipo de íon

A transferência das proteínas para as micelas reversas depende das

interações eletrostáticas entre a proteína e o núcleo do tensoativo. Portanto, a força

iônica e o tipo de íon da fase aquosa são muito importantes, devido às cargas

presentes na solução (PYLE, 1994).

A força iônica, que pode ser expressa em termos de condutividade elétrica,

controla a solubilização de proteínas no sistema micelar, pois o alcance da força

eletrostática da micela depende da força iônica do meio. O aumento da concentração

de íons no meio ocasiona uma redução na eficiência de transferência de proteínas

pelas micela, seguida de um enfraquecimento das trocas eletrostáticas entre as

proteínas e as porções polares dos tensoativos, e conseqüente diminuição da

solubilidade das proteínas na micela. Também as enzimas de maior massa molar

20


presentes na micela tornam-se menos solúveis em decorrência do aumento da força

iônica (KREI & HUSTEDT, 1989; HA TTON, 1987).

ANDREWS et ai. (1994) verificaram que a força iônica pode afetar o tamanho

da micela, pois os grupamentos polares dos agentes tensoativos repelem-se, e com

isto micelas maiores são formadas quando submetidas à baixa força iônica. Este fato

está relacionado com a teoria de Debye (HATTON, 1987), segundo a qual a

capacidade de aproximação da proteína e dos grupamentos polares do tensoativo é

inversamente proporcional à raiz quadrada da força iônica do meio. Desta forma, à medida que a força iônica da solução que contém a proteína aumenta, as interações

entre a proteína e o agente tensoativo diminuem, devido à redução do efeito

repulsivo entre os grupos polares do tensoativo. Esse fato leva a um decréscimo do

transporte de água ou outras moléculas e, consequentemente, à formação de menos

e menores micelas reversas.

O tipo de íon pode afetar significativamente a transferência de proteínas para

o interior das micelas reversas. Em estudos visando analisar o efeito do tipo de íon

sobre a extração da ribonuclease A e da taumatina, ANDREWS & HA YWOOD

(1994), verificaram que na presença de íons maiores, como o K+. a solubilização da

proteína é diminuída, devido provavelmente à formação de um campo eletrostático

que reduz as interações entre a proteína e o tensoativo (o chamado "screening'). No

entanto, com íons menores como Na+. este efeito não é verificado. Ainda, ao

utilizarem MgCl2, verificaram um aumento na transferência da enzima, confirmando a

influência do tamanho do íon sobre a extração da enzima, pois o raio atômico do

Mg2+ é inferior ao dos dois cátions anteriores.

Também na etapa de reextração foi analisada a influência do tipo de íon

empregado. MARCOZZI et ai. (1991) verificaram que a adição de CaC'2 ao tampão

fosfato 20mM pH 7,5, torna a reextração de a-quimiotripsina mais eficiente que

quando usados os sais: NaCI, KCI e LiCI.

21


2.4.3.3 - Tipo de proteína

Outro fator de suma importância nos processos de extração em sistemas de

micelas reversas é a natureza da proteína, devido principalmente às interações entre

ela e o tensoativo. As diferentes interações entre eles podem sofrer alterações em

função do tipo de proteína, afetando até mormente a transferência da proteína que a

força iônica (CASTRO & CABRAL, 1988).

As interações podem até permitir a solubilização de proteínas maiores que o

espaço interno das micelas reversas, não sendo encontrados dados literários que

permitam definir o tamanho máximo da molécula a ser encapsulada por elas. O

caráter hidrofílico das proteínas de alta massa molar é muito relevante na formação

das micelas reversas, pois favorecem a formação de uma camada de tensoativo ao

redor da proteína devido à solubilização com a camada de água, possibilitando a

transferência de proteínas maiores, mesmo que sua carga líquida total seja igual a

do tensoativo (CASTRO & CABRAL, 1988).

Por outro lado, a proteína pode apresentar caráter hidrofóbico. Neste caso, as

interações predominantes são as hidrofóbicas. Normalmente, tais proteínas não

apresentam um comportamento tradicional, podendo ser extraídas em pH

desfavorável ou em força iônica elevada (PIRES et ai., 1996). Como por exemplo

pode-se citar a tau matina, que apresenta 100% de transferência pelo sistema

AOT/isooctano mesmo em valores de pH acima do pi e força iônica entre 0,3 e 0,8 M

(ANDREWS et ai., 1994).

Com relação a reextração de proteínas hidrofóbicas, podem surgir problemas

com a recuperação, pois o processo pode tornar-se irreversível. Nesse caso, o uso

de um álcool polar surge como alternativa para auxiliar no rompimento das

interações hidrofóbicas entre a proteína e o tensoativo (PIRES et ai., 1996).

2.4.3.4 - Temperatura

A temperatura também é um fator de importância na absorção de proteínas

pela micela, pois dela depende a capacidade máxima de absorção da micela. Dentro

de uma determinada faixa de temperatura, as micelas reversas são formações

22


estáveis, o que favorece a absorção de moléculas. Segundo LUISI et ai. (1988), a

presença de enzimas no interior da micela a temperaturas mais elevadas vai

depender mais da sua termoestabilidade do que da capacidade de absorção da

micela. A temperaturas inferiores a uma faixa ótima, as micelas encolhem e perdem

sua capacidade de absorção. Temperaturas elevadas afetam o coeficiente de

partição do agente tensoativo, de modo que, praticamente, este não permaneça mais

na fase orgânica e só seja encontrado na fase polar (KREI & HUSTEDT, 1989).

Também, segundo estes autores, a capacidade máxima da micela é dependente da

temperatura, ou seja, existe uma faixa de temperatura na qual esta apresenta-se

estável, favorecendo portanto a absorção de proteínas.

PESSOA JR & VITOLO (1998), em trabalhos de extração da enzima inulinase,

também constataram que o tamanho da micela reversa é bastante dependente da

temperatura e, na faixa de 5 a 45°C, as micelas reversas, em solventes orgânicos,

são formações estáveis e podem favorecer a absorção desta enzima.

2.4.3.5 - Tensoativo

O tipo de tensoativo influencia na transferência da proteína para o interior das

micelas reversas devido, principalmente às interações eletrostáticas entre o seu

núcleo e a proteína. Influi também no tamanho das micelas reversas e na energia

necessária para o encapsulamento de uma proteína de maior tamanho quando existe

uma força de atração ou repulsão elevada entre os núcleos do tensoativo (AIRES-

BARROS, 1991). Estes autores em estudos de extração de amiloglicosidase

utilizando o sistema micelar TOMAC/isooctano/1-octanol alcançaram resultados de

recuperação que variaram entre 20 e 30% após a reextração da enzima. No entanto,

quando o sistema foi substituído por CTAB/isooctano/hexanol/butanol, os resultados

chegaram a 90%.

Outro fator que afeta a recuperação de proteínas é a adição de um tensoativo

não iônico em um tensoativo iônico. Um exemplo é a partição da a-amilase onde foi

adicionado um tensoativo neutro ao TOMAC em isooctano (DEKKER et ai., 1989). Um

aumento na transferência da enzima foi observado por estes autores, com o aumento

23


na proporção do tensoativo neutro adicionado. Tal comportamento é verificado

devido à influência deste tensoativo na densidade de cargas das micelas reversas,

aumenta-se a concentração de tensoativo no meio sem que se promova aumento de

cargas, ocorrendo ainda mudanças no tamanho das micelas reversas pela adição

das moléculas do tensoativo em sua estrutura.

Também a concentração do tensoativo é um fator importante no uso de

sistemas de micelas reversas, por influenciar a formação destas. Existe uma

concentração mínima de tensoativo necessária para formar as micelas reversas,

chamada concentração micelar crítica (CMC) e que depende de fatores como:

temperatura, pressão, solvente e estrutura química do tensoativo. Os valores de

CMC podem ser obtidos através das propriedades do sistema, tais como: tensão

superficial, turbidez e pressão osmótica (SEOUD et ai., 1999). No entanto, devido não

apresentarem precisão, são normalmente expressos através de intervalos (CASTRO

& CABRAL, 1988; KADAM, 1986). A Figura 2.9, ilustra a evolução do sistema formado

por tensoativo e solventes (ROH), levando à formação de sistemas de micelas

reversas.

24


Mice la Reversa

Micela

Cristal Líquido Reverso

Tensoativo

Tensoativo

Cristal Líquido Lamelar

Tensoativo

> Cristal Líquido Cúbico

Cristal Líquido Hexagonal

Figura 2.9 - Evolução da Formação de Estruturas no Sistema de Micelas Reversas (Adaptado de SEOUD et ai., 1999).

25


O aumento da concentração de tensoativo provoca o aumento no tamanho

das micelas, aumentando a transferência de proteínas para o interior destas. Estudos

de extração de a-amilase tiveram os resultados de recuperação melhorados com o

aumento da concentração de tensoativo (TOMAC) de 0,01 para 0,04 M. Porém uma

outra hipótese é levantada de que o aumento da concentração de tensoativo altera o

número e não o tamanho das micelas existentes (BRANDANI et ai., 1993; AIRES-

BARROS, 1991 ). Existe no entanto, um limite para a concentração de tensoativo no

sistema; concentrações muito elevadas dificultam a etapa de reextração da proteína,

pois fortes interações eletrostáticas entre a proteína e o tensoativo provocam

redução nos valores de recuperação.

2.4.3.6- Tamanho das mice/as

O parâmetro que define o tamanho das micelas reversas e as propriedades

físico-químicas da água solubilizada no seu interior é o Wo ("water in oil"), dado este,

importante para o estudo da biocatálise em micelas reversas. Esta variável que

exprime a relação entre a concentração molar de água e a concentração de --

tensoativo (LUISI et ai., 1988) é de suma importância no sistema, pois determina a

estrutura, o tamanho das micelas reversas e também o número de moléculas de

tensoativo por micela reversa (CASTRO & CABRAL, 1988; AIRES-BARROS, 1991 ).

Mudanças no valor de Wo podem influenciar a partição da proteína, uma vez

que a quantidade de água no interior das micelas reversas interfere nas interações

eletrostáticas entre proteína e tensoativo. Além disso, afeta a estabilidade da

proteína quando a quantidade de água é pequena, pois as propriedades e

densidades de cargas desta água sofrerão alterações, podendo ocasionar

modificações na proteína e influindo em seu desempenho (KRIEGER, 1995; KADAM,

1986).

O valor do Wo pode ser maior, quanto maior for a concentração de proteínas,

pois a quantidade de proteína extraída é proporcional à quantidade de água

solubilizada. Se o valor de Wo diminui, a fração de micelas reversas menores que a

proteína aumenta, o que minimiza a solubilização das moléculas de proteína. Com o

26


aumento de W0 essa fração aumenta, e com isso o sistema é capaz de armazenar

proteínas maiores (ISHIKAWA et ai., 1992).

2.4.3. 7 - Influência da velocidade de agitação

A velocidade de agitação pode afetar a separação da proteína, pois interfere

no transporte de massa e nas resistências existentes na interface entre as fases

aquosa e orgânica. Quando a proteína está se movimentando da fase aquosa para a

micelar, ela encontra a resistência difusional, associada ao transporte do soluto de

dentro da solução para a interface e vice-versa. Com o aumento da velocidade de

agitação entre as duas fases, ocorre a diminuição drástica da resistência ao

englobamento da proteína devido à redução da camada limite entre as duas regiões.

Quando o valor do pH e a concentração de sais são elevados, a partição da proteína

independe da velocidade de agitação. Nessas condições a força iônica predomina

sobre a resistência na interface (DUNGAN et ai., 1991 ).

2.5 - ENZIMAS XILANOLÍTICAS

As xilanases têm como substratos naturais as hemiceluloses, geralmente

localizada na lamela média das plantas em toda a extensão da fibra, intimamente

associadas à celulose (SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997; DEKKER, 1985; WOODWARD,

1984; JANES, 1969). A forma estrutural de hemicelulose mais comumente encontrada

na parede celular de plantas terrestres é a xilana, representando mais de 30% em

peso seco (JOSELEAU et ai., 1992). As xilanas são compostas de resíduos de ligações

13(1-4)-D-xilopiranosídicas, sendo que a maioria se apresenta na forma de

heteropolissacarídeos, contendo diferentes grupos substituintes nas cadeias centrais

e laterais. Os substituintes mais comuns encontrados na cadeia central das xilanas

são os grupos acetil, arabinosil e glucuronosil. Homoxilanas, por outro lado,

consistem exclusivamente de resíduos de xilosil e não são muito comuns na

natureza, mas foram isoladas de gramíneas e talos de tabaco (PULS & POUNTANEN,

1989; BIELY, 1985).

27


A poluição do meio ambiente tornou-se assunto de grande interesse público

em todo o mundo, pois tanto países desenvolvidos quanto aqueles em

desenvolvimento vêm sendo afetados por problemas ambientais resultantes do

crescimento econômico acelerado, em conseqüência da exploração dos recursos

naturais. É inegável a urgência de se adotar medidas de prevenção e controle da

poluição, a fim de se evitar danos cada vez maiores e, possivelmente irreparáveis.

Tais medidas freqüentemente são definidas em termos da melhor tecnologia

disponível, cuja determinação depende de dois fatores essenciais: informação

disponível e condições econômicas. Dentro deste contexto, as enzimas xilanolíticas

exercem papel de destaque.

2.5.1 - p.xilosidase

As p-xilosidases (E.C. 3.2.1.3. 7) são responsáveis pela hidrólise de xilobiose

liberada pela ação das endo-xilanases sobre a xilana, produzindo xilose. A xilose é o

principal açúcar obtido da hidrólise ácida ou enzimática da xilana e é fermentescível

à etanol por várias linhagens de leveduras (JEFFRIES, 1983). A atividade de P- xilosidase gera D-xilose de oligossacarídeos de cadeias curtas e xilobiose.

Desempenha um papel crucial na liberação do produto final de inibição da atividade

das endo-xilanases por xilobiose (RIELLY, 1981). A importância das p-xilosidases no

auxílio à hidrólise da xilana tem sido mostrada como sendo análoga a das celobioses

na hidrólise da celulose (DEKKER & RICHARDS, 1976).

De forma geral, enzimas degradadoras de xilana produzidas por fungos, têm

recebido maior atenção que as produzidas por bactérias, sendo que inúmeras p-

xilosidase extracelulares fúngicas têm sido parcialmente ou totalmente

caracterizadas (CORTEZ, 1997; MILAGRES, 1994; UZIIE, et a/., 1985; MATSUO & YASUI,

1984), desta forma, o desenvolvimento do presente trabalho, pôde ser alicerçado em

informações sobre a enzima, tornando o estudo da técnica de recuperação mais

confiável.

29


2.5.1.1 - pH ótimo

As J3-xilosidases podem apresentar uma ampla faixa de pH ótimo de atividade,

dependendo da origem. De forma geral apresentam atividade dentro da faixa de pH

de 3,0 a 7,0; embora a J3-xilosidase de uma linhagem termofílica da bactéria

Thermonospora sp tenha sido descrita por exibir uma faixa de pH ótimo de atividade

que vai de 5,0 à 9,0 (RISTROPH & HUMPHREY, 1985) e a J3-xilosidase da levedura

Aureobasidium pul/ulans (DOBBERSTEIN & EMEIS, 1978) tenha apresentado uma

faixa mais ampla de atividade (2,0 à 9,0). As í3-xilosidases de Neurospora crassa

(DESHPANDE et ai., 1994), Trichoderma reesei (PULS & POUNTANEN, 1989},

Emericella nidulans (MATSUO & YASUI, 1984) possuem pH ótimo de atividade

próximo de 4,0.

2.5.1.2 - Temperatura ótima

As í3-xilosidases podem ter temperatura ótima de atividade na faixa que vai de

25°C a 80°C (RUTTERSMITH & DANIEL, 1993; KERSTERS-HILDERSON et ei., 1969).

º Linhagens de Thermonospora têm atraído atenção considerável como fonte de

enzimas altamente termoestáveis para sacarificação de lignocelulose em geral

(BACHMANN & McCARTHY, 1989).

-: -· - -_..,.,

30

Objetivos

3. OBJETIVOS

O presente trabalho de dissertação teve como objetivo principal o estudo da

técnica de extração de enzimas por micelas reversas. Para tanto foram utilizados três

tensoativos no preparo dos sistemas micelares: os agentes tensoativos catiônicos

BDBAC e CTAB e o agente tensoativo aniônico AOT. A enzima alvo, (3-xilosidase, foi

produzida pelo fungo Penicillium janthinellum (através de processo fermentativo, sob

condições estabelecidas anteriormente ao presente trabalho) em hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os seguintes objetivos específicos

foram cumpridos durante a execução deste projeto:

a) estudar da estabilidade da f3-xilosidase frente às variações de temperatura

(-4° e 4°C) e pH (3,0 a 9,0), determinando desta forma os limites que

poderiam ser usados nos ensaios de extração;

b) determinar os fatores (pH, temperatura, condutividade elétrica,

concentração e tipo do agente tensoativo, concentração de co-solvente)

que favorecem a extração da f3-xilosidase da fase aquosa para a fase

micelar, com o auxílio de planejamento estatístico específico para cada

tensoativo testado;

c) determinar os parâmetros que se mostrarem efeito significativo no processo

de extração líquido-líquido por micela reversa da f3-xilosidase, para os três

31

Objetivos

agentes tensoativos testados (BDBAC, AOT e CTAB) e avaliar dos

rendimentos obtidos;

d) otimizar o processo, através da determinação do modelo estatístico que

descreve o processo, teste do ponto ótimo e construção de superfícies de

resposta;

e) extrair da enzima í3-xilosidase diretamente do meio fermentado, sem pré

purificação por etanol, utilizando-se para isto as condições otimizadas do

planejamento que apresentou melhores valores de recuperação para

enzima.

32

Materiais & Métodos

4 · MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 - MICRORGANISMO

O microrganismo utilizado no presente trabalho foi o fungo

Penicilliumjanthinellum CRC 87M-115, isolado de madeira em decomposição em

Lorena-SP por MILAGRES (1988).

4.2 - MEIO DE MANUTENÇÃO DO FUNGO

O meio de cultura para obtenção de esporos de P. janthinellum foi o mesmo

usado por MILAGRES (1988): 2% de glicose, 0,25% de extrato de levedura, 2% (v/v)

de solução mineral (VOGEL, 1956) e 2% de ágar-ágar.

Preparada a mistura, a mesma foi dividida em porções de 5 ml e colocada em

tubos de ensaio devidamente arrolhados os quais foram autoclavados por 15 minutos

a 112ºC e deixados em superfície inclinada (cerca de 20°). Após resfriamento, os

tubos foram inoculados com esporos de P. janthinellum de um tubo matriz e

incubados em estufa termostatizada a 30 ºC.

33


4.3 - HIDROLISADO HEMICELULÔSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Para produção do hidrolisado foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar

proveniente da Usina Nova América (Tarumã-SP). O procedimento de hidrólise foi

realizado conforme descrito por MILAGRES & LACIS (1991).

Foram utilizados 46 mg de H2S04 p.a. por grama de matéria seca, com uma

relação de matéria seca: solução ácida de 1: 1 O. O bagaço foi seco a 80 ºC até ser

atingida a umidade de 10%, passando em seguida por um moinho com peneira de 20

"mesh" (aproximadamente 1,27 mm de diâmetro). Posteriormente foi tratado com

ácido (20 mL de ácido sulfúrico p.a. e 8 L de água para 800 g de bagaço) e

autoclavado a 121 ºC por 45 minutos. A fração líquida, foi recuperada por filtração

em papel de filtro qualitativo (Klabin) e sendo o pH elevado para 5,5 com NaOH 1 N.

4.4 - PRODUÇÃO DA ENZIMA l3-XILOSIDASE

A partir do hidrolisado hemicelulósico, foi preparado um meio para o cultivo de

P. janthinellum, adicionando-se ao mesmo solução mineral de Vogel (2% v/v) e

extrato de levedura (O, 1%). A obtenção do complexo xilanolítico (no qual está

presente a í3-Xilosidase), se deu através do cultivo de P. Janthinellum em meio à

base de hidrolisado hemicelulósico, obtido como descrito no item 4.3. Os frascos

utilizados no processo fermentativo (Erlenmeyers de 125 mL contendo 25 mL de

meio) foram autoclavados por 15 minutos a 112ºC e posteriormente inoculados com

1 mL de solução de esporos em água autoclavada nas mesmas condições (105

esporos/mL) e incubados a 30°C sob agitação orbital de 60 rpm, por 5 dias.

4.5 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

4.5.1 -Xilanases

A atividade de xilanase extracelular foi determinada pela quantidade de

açúcares redutores liberados a partir de xilana, de acordo com o método de BAILEY

34


et ai. (1992). Os açúcares redutores totais (ART) foram dosados pelo método do

ácido 3, 5-dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959).

Uma mistura de reação contendo 900 µL de xilana e 100 µL do meio

fermentado devidamente diluído em tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,5) foi

incubada a 50 ºC por 5 min. A reação foi interrompida pela adição de 1,5 ml de ácido

3,5-dinitrosalicílico (DNS) e a mistura foi aquecida em banho de água fervente por

5 min. A absorbância foi medida em espectrofotômetro, a 570 nm, e comparada com

uma curva padrão. O branco para leitura foi preparado segundo a mesma

metodologia, sendo que o meio fermentado foi adicionado ao final, após os demais

reagentes.

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de

enzima necessária para liberar 1 µmolde ART, expressos como xilose, por minuto, a

50°C.

4.5.2 - {J-xilosidase

A atividade da f3-Xilosidase foi determinada através da quantidade de

p-nitrofenol liberada após a ação da enzima numa solução de p-nitrofenil-f3-D-

xilopiranosídeo (pNpX) em água (KUMAR & RAMÓN, 1996).

Uma mistura de reação contendo 250 µL de solução 2 mM de pNpX em água

e 250 µL do meio fermentado, devidamente diluído em tampão acetato de sódio (50

mM, pH 5,5), foi incubada a SOºC por 30 min. A reação foi interrompida pela adição

de 1 ml de solução de carbonato de sódio 2 M. A absorbância deste meio foi medida

em espectrofotômetro, a 400 nm, e comparada com uma curva padrão. O branco foi

preparado segundo a mesma metodologia, sendo que o meio fermentado foi

adicionado ao final, após os demais reagentes.

Uma unidade de atividade de 13-Xilosidase foi definida como a quantidade de

enzima necessária para liberar 1 µmol de p-nitrofenol/min. ml, nas condições

descritas anteriormente.

35


4.6 - PRECIPITAÇÃO PELA ADIÇÃO FRACIONADA DE ETANOL

A precipitação das proteínas do meio fermentado foi realizada segundo as

condições estabelecidas por CORTEZ & PESSOA JR (1998). O meio, previamente

tamponado (na proporção de 9 partes de meio para 1 de tampão acetato 1 M, pH

4,0), foi colocado em um becker de 25 ml o qual, juntamente com um tubo de ensaio

contendo etanol, foi levado a um banho termostatizado (Marca Heto, modelo CB 15-

25) de água e monoetilenoglicol à temperatura de -4 ºC, e deixado para a

estabilização da temperatura. Este procedimento evita que a temperatura ultrapasse

4 ºC quando da adição de etanol ao meio fermentado. Através de bomba peristáltica,

em volume de etanol correspondente a 20% (v/v) do meio foi transferido lentamente

para o becker contendo o meio fermentado. A temperatura foi conferida

constantemente e a agitação executada manualmente com bastão de vidro. Após a

adição completa do etanol, a mistura foi mantida em repouso sob refrigeração (a -

4 ºC) por 15 minutos, e então, centrifugada a 2000xg por 15 min, a uma temperatura

de o ºC (± 2 ºC). Após a centrifugação, o sobrenadante foi levado novamente ao

banho termostatizado, nas mesmas condições e, também através de bomba

peristáltica, um volume de etanol correspondente a 60% (v/v) do meio foi adicionado

lentamente a este. Nesta etapa também se monitorou a temperatura e se agitou a

mistura. Novamente após a adição do etanol, a mistura foi mantida em repouso sob

refrigeração (-4 ºC) por 15 minutos, e centrifugada nas mesmas condições da

primeira etapa. Após a centrifugação o precipitado (contendo í3-Xilosidase) foi

separado do sobrenadante e solubilizado em tampão adequado, conforme o pH a ser

estudado.

4.7 - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS

A determinação dos parâmetros cinéticos aparentes: kM (app) (constante de

Michaelis/Menten) e Vm (velocidade máxima da reação enzimática) foi feita através

da medida da atividade enzimática (item 4.5.2) da í3-xilosidase precipitada com

etanol (item 4.6), utilizando-se as seguintes concentrações de substrato (pNpX):

0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3;0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 15,0 e 20,0 mM. Os valores de

36


kM (app) e Vm foram determinados pelo método de Lineweaver-Burk (LEHNINGER,

1976).

4.8 - DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE À ESTOCAGEM DA ENZIMA J3-XILOSIDASE

A determinação da estabilidade da enzima !3-xilosidase em função do tempo,

foi feita para diferentes valores de pH nas temperaturas de estocagem de -4 ºC e

4 ºC. Foi feito o acompanhamento da atividade enzimática, após a precipitação com

etanol e solubilização em tampão de pH desejado (item 4.6): acetato de sódio para

pH de 3,0, fosfato de potássio para pH 6,0 e 7,0 e Tris-HCI para pH 9,0.

4.9 - EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO POR MICELAS REVERSAS

A enzima J3-xilosidase foi extraída do meio fermentado previamente

precipitado por etanol, por micelas reversas de BDBAC, AOT e CTAB. O processo foi

conduzido em duas etapas. como mostrado nas Figuras 4.1 e 4.2. O pH da fase

aquosa foi definido pelo tampão (de pH apropriado) utilizado na solubilização da

amostra após a precipitação. Nesta etapa, denominada extração, a solução aquosa

contendo !3-xilosidase foi misturada a microemulsão em partes iguais (5ml). Após

agitação em agitador tipo vórtice por 1 min, a mistura foi centrifugada (Centrifuga

Jouan Mod.1812, Saint Herblain) a 1677xg por 1 O min para separação das fases

(FMI e FAI). Para a segunda etapa, a fase superior do tubo (FMI) foi retirada e

utilizada nos ensaios de reextração. Tal etapa foi realizada misturando-se 2,0 mL da

pseudofase micelar (FMI) com 2,0 mL de tampão acetato de sódio 1,0M pH 5,5

adicionado de NaCI (de modo a se obter solução final 1,0 M do mesmo), com a

finalidade de transferir (reextrair) a enzima da micela para a nova fase aquosa (FAII).

Na segunda etapa, a amostra foi novamente agitada e centrifugada nas condições

anteriormente citadas. Os resultados da extração foram expressos em termos da

atividade total recuperada (%) da enzima, tendo como referencial a quantidade de

proteínas do precipitado solubilizado no valor de pH estudado.

37


1ª Etapa: Extração

Fase MicelarI

Fase Aquosa!

O Proteína

A!t Tensoatlvo

~t' Mlcela Reversa

EITl Fase Aquosa (Tampão com baixa força iônica)

Fase ~ Mlcelar

Figura 4.1 - Representação Esquemática da Etapa de Extração de uma Biomolécula por Micelas Reversas.

2ª Etapa: Reextração

Vórtice 1mln

Centrif. 1677xg 10min

- Fase Micelarn

- Fase Aquosa II

~-./-..: --Tampão+ NaCI

O Proteína

A!t Tensoativo

k Mlcela Reversa

EITfil Fase Aquosa Ili ~:~ ( Tampão com alta força iônica)

Figura 4.2 - Representação Esquemática da Etapa de Reextração de uma Biomolécula por Micelas Reversas.

38


4.10 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Foram utilizados planejamentos estatísticos específicos (BOX et ai., 1978),

para cada tensoativo estudado.

As variáveis estudadas no planejamento foram codificadas em -1 , O e +1 e

seus valores reais constam da Tabela 4.1. Os ensaios foram realizados em ordem

aleatória, de forma a minimizar a ocorrência de erros sistemáticos.

Tabela 4.1 - Valores das Variáveis Empregados nos Planejamentos para Recuperação da 13-Xilosidase por Micelas Reversas

Tensoativo Usado Variável Estudada Valores -1 o +1

pH 3,0 6,0 9,0 Condut. Elétrica (mS/cm) 4,0 7,0 10,0

BDBAC Concentração de BDBAC (M) O, 1 O, 15 0,2 Concentração de Hexanol (%) 5,0 7,5 10,0 Temperatura (ºC) 4 15 26

.. - -_.,.,

pH 3,0 6,0 9,0

AOT Condut. Elétrica (mS/cm) 4,0 7,0 10,0 Concentração de AOT (M) O, 1 0, 15 0,2 Temperatura (ºC) 4 15 26

pH 3,0 5,5 8,0 Concentração de CT AB (M) O, 1 O, 15 0,2

CTAB Condut. Elétrica (mS/cm) 4,0 7,0 10,0 Concentração de Hexanol (%) 5,0 7,5 10,0 Concentração de Butanol (%) 10 15 20

Os planejamentos utilizados para verificar a influência das variáveis pH,

condutividade elétrica, concentração de tensoativo, concentração de co-solvente e

temperatura, sobre a recuperação da enzima 13-Xilosidase, foram os seguintes:

39


a) Para o agente tensoativo BDBAC: utilizou-se um planejamento

fatorial fracionário 25-1 com repetição, conforme mostrado na

Tabela 4.2;

b) Para o agente tensoativo AOT utilizou-se um planejamento fatorial

completo 24 com 4 repetições no ponto central, conforme mostrado na

Tabela 4.3;

c) Para o agente tensoativo CTAB: utilizou-se um planejamento

fatorial fracionário 25-1 com

Tabela 4.4;

repetição, conforme mostrado na

Tabela 4.2 - Matriz do Planejamento Fatorial Fracionãrio 25-1 com 01 Repetição Utilizada para Avaliação da Influência do pH, da Condutividade Elétrica, da Concentração de BDBAC, da Concentração de Hexanol e da Temperatura na Recuperação da (3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico BDBAC

Ensaio Variãveis Codificadas

n. pH Condutividade BDBAC Hexanol Temperatura Elétrica (mS/cm) (M) (%) (ºC)

1 -1 -1 -1 -1 +1 2 +1 -1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 +1 5 -1 -1 +1 -1 -1 6 +1 -1 +1 -1 +1 7 -1 +1 +1 -1 +1 8 +1 +1 +1 -1 -1 9 -1 -1 -1 +1 -1 10 +1 -1 -1 +1 +1 11 -1 +1 -1 +1 +1 12 +1 +1 -1 +1 -1 13 -1 -1 +1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 -1 15 -1 +1 +1 +1 -1 16 +1 +1 +1 +1 +1

40


Tabela 4.3 - Matriz do Planejamento Fatorial Completo 24 com 03 Repetições no Ponto Central Utilizada para Avaliação da Influência do pH, Condutividade Elétrica, Concentração de AOT e Temperatura na Recuperação da 13-Xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Aniônico AOT

Ensaio Variáveis Codificadas

n. pH Condutividade AOT Temperatura Elétrica (mS/cm) (M) (ºC)

1 -1 -1 -1 -1 2 +1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 5 -1 -1 +1 -1 6 +1 -1 +1 -1 7 -1 +1 +1 -1 8 +1 +1 +1 -1 9 -1 -1 -1 +1 10 +1 -1 -1 +1 11 -1 +1 -1 +1 12 +1 +1 -1 +1 13 -1 -1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 15 -1 +1 +1 +1 16 +1 +1 +1 +1 17 o o o o 18 o o o o 19 o o o o

41


Tabela 4.4 - Matriz do Planejamento Fatorial Fracionário 25•1 com 03 Repetições no Ponto Central Utilizada para Avaliação da Influência do pH, da Condutividade Elétrica, da Concentração de CT AB, da Concentração de Hexanol e da Concentração de Butanol na Recuperação da f3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Ensaio Variáveis Codificadas

n. pH CTAB Condutividade Hexanol Butanol (M) Elétrica (mS/cm) (%) (%)

1 -1 -1 -1 -1 +1 2 +1 -1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 +1 5 -1 -1 +1 -1 -1 6 +1 -1 +1 -1 +1 7 -1 +1 +1 -1 +1 8 +1 +1 +1 -1 -1 9 -1 -1 -1 +1 -1 10 +1 -1 -1 +1 +1 11 -1 +1 -1 +1 +1 12 +1 +1 -1 +1 -1 13 -1 -1 +1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 -1 15 -1 +1 +1 +1 -1 16 +1 +1 +1 +1 +1 17 o o o o o 18 o o o o o 19 o o o o o

42


Os dados experimentais foram analisados estatisticamente, de acordo com o

planejamento estabelecido, para verificar o efeito dos fatores em estudo. A análise

dos dados foi feita com o auxílio de "software" específico para este fim, utilizando

como variável resposta a porcentagem de recuperação da enzima 13-Xilosidase.

Os modelos foram determinados por regressão linear pelo método dos

mínimos quadrados, representados pela Equação 4.1:

Equação 4.1

onde: Y; = variável resposta (recuperação da enzima),

bo, b, b;;, bij os coeficientes da regressão;

X; e Xj as variáveis independentes estudadas.

4.11 - DETERMINAÇÃO DO RAIO MICELAR - W0

A determinação do valor de Wo (conteúdo de água) da fase orgânica foi feita

por titulação, através da reação de Karl-Fisher (WIELAND, 1987), utilizando-se um

titulador automático Metler DL 18. A reação ocorreu em metanol (isento de água),

utilizando uma solução de dióxido de enxofre, iodo e piridina (reagente de Karl-

Fisher) para titular a água do sistema. Esta reação pode ser representada por:

A detecção do ponto final da titulação baseia-se nas diferenças de

condutividade entre a espécie r e 12. Após a titulação de toda a água presente no

sistema, ocorre a acumulo de li, provocando uma queda de tensão entre os

terminais do eletrodo.

43


4.11 • ENSAIOS ELETROFORÉTICOS

Os ensaios eletroforéticos foram realizados no equipamento Phast System

(PHARMACIA®) do Laboratório de Enzimologia Industrial, do Departamento de

Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da

USP.

Para a eliminação de prováveis problemas decorrentes do uso de amostras

com elevada concentração salina e interferência de peptídeos de baixa massa molar

nos ensaios eletroforéticos, bem como aumentar a concentração de proteínas, as

amostras que foram utilizadas na realização das eletroforeses passaram por um

processo de tratamento que consistiu de duas etapas: diálise e liofilização.

4.11.1- Preparo das Amostras

4.11.1.1- Diálise

Com o intuito de se eliminar os efeitos causados pela elevada concentração

de sais e peptídeos de baixa massa molar nos ensaios eletroforéticos, optou-se por

dialisar as amostras que seriam posteriormente utilizadas nestes ensaios.

Utilizou-se para realização da diálise, membranas de 12k Da de corte

(SIGMA), pois em trabalhos anteriores, não se identificou a presença de proteínas de

massa molar inferior a 14k Da (RODRIGUES, 1997). Desta forma eliminou-se os

íons presentes, bem como prováveis peptídeos, sem no entanto provocar perdas de

proteínas.

As amostras colocadas nos "sacos" de diálise imersos em frasco (becker) com

água bidestilada, foram deixadas em ambiente de temperatura controlada a -4 ºC

(câmara fria) sob agitação (agitador magnético), por 48 horas.

4. 11. 1. 2 - Liofilização

As diferentes frações previamente dialisadas (precipitado solubilizado, fases

aquosas I e II) passaram por um processo de liofilização com o intuito de se

44


aumentar a concentração de proteínas nas frações para posterior utilização nos

ensaios eletroforéticos.

Para a condução do processo de liofilização, volumes conhecidos das frações,

foram levados ao "biofreezer" a uma temperatura de -70 ºC (Forma Scientific lnc. -

Ohio/USA) até completo congelamento. A seguir, as amostras foram liofilizadas em

liofilizador (L YOLAB-G) por 48 horas ou até completa sublimação da porção líquida;

obtendo-se assim, a máxima concentração possível das amostras.

4.11.2- Condução dos Ensaios eletroforéticos

As eletroforeses foram realizadas no aparelho Phast System®

(PHARMACIA®) (WEBER et ai. ,1972). Utilizou-se gel de poliacrilamida a 12,5%,

fornecido pela PHARMACIA®, sendo a corrida eletroforética conduzida a 15ºC,

utilizando uma mistura contendo tampão tricina 0,2 M e tampão tris/HCI 0,2 M com

pH 8, 1 e SOS 0,55%.

A coloração dos géis foi feita automaticamente em uma câmara acoplada ao

equipamento de corrida eletroforética. Na Tabela 4.5, encontra-se as soluções, o

tempo de exposição dos géis às diferentes soluções e à temperatura, para coloração

por prata.

45


Tabela 4.5 - Seqüência usada para desenvolvimento do processo otimizado de coloração de géis SDS-page por Prata

TCG* Temperatura Função da Solução Etapa Solução

(min) (ºC) sobre os géis

1 10% etanol, 5% 2,0 50 Lavagem inicial dos géis ácido Acético

2 10% etanol, 5% 4,0 50 Lavagem inicial dos géis ácido Acético

3 5% glutaraldeído 6,0 50 Aumentar a sensiblidade das proteínas

4 10% etanol, 5% 3,0 50 Lavagem dos resíduos ácido Acético da etapa anterior

5 10% etanol, 5% 5,0 50 Lavagem dos resíduos ácido Acético da etapa anterior

6 Água deionizada 2,0 50 Lavagem dos resíduos da etapa anterior

7 Água deionizada 2,0 50 Lavagem dos resíduos da etapa anterior

8 0,4% nitrato de 6,5 40 Coloração das bandas prata nos géis

9 Água deíonizada 0,5 30 Lavagem dos resíduos da coloração

10 Água deionizada 0,5 30 Lavagem dos resíduos da coloração

11 Reveladora 0,5 30 Revelação dos géis

12 Reveladora 4,0 30 Revelação dos géis

13 Redutora 2,0 30 Diminuição de rastros deixados por peptídeos

14 10% glicerol 5,0 50 Preservação/interrupção

* tempo de contato da solução com o gel

Para o preparo da solução reveladora do gel, adicionou-se o conteúdo de uma

ampola (PHARMACIA®) contendo solução de formaldeído 2% a 150mL de carbonato

de sódio a 2,5 %. A solução redutora, por sua vez, foi preparada pela dissolução de

1,6 g de tiossulfato de sódio e 3,7 g de Trisma base em 100 mL de água deionizada.

46


4.12 - DOSAGEM DO TEOR TOTAL DE PROTEÍNAS- MÉTODO DE LOWRY

O teor de proteínas foi determinado de acordo com o método de LOWRY

(1959). Foi utilizado como padrão a albumina de soro bovino (BSA -"bovine serum

albumine"). Visando a identificação de prováveis interferências na determinação do

teor de proteínas no meio, foi realizado um ensaio em branco para proteínas, sendo

adicionado ao meio reacional, em substituição à amostra contendo enzima, uma

solução tampão com características de pH e de condutividade elétrica idênticas a da

amostra estudada.

4.13 - ANÁLISE DOS RESULTADOS

Para avaliação dos processos de extração foram analisados os seguintes

parâmetros: Ae, AP, np, 11A , descritas pelas equações abaixo:

a) Aumento de atividade específica da enzima: obtido através da

relação entre as atividades específicas da enzima antes (Ae2) e

após a purificação (Ae1). Define-se atividade específica (Ae) como:

Ae = AJP [U/mg] Equação 4.3

onde: A=atividade da enzima expressa em [U];

P=proteínas totais expressa em [mg], ambas relativas à mesma fase

analisada.

b) Define-se portanto aumento de pureza (AP):

Equação 4.4

onde: Ae=atlvídade específica na fase extraída - FAII [U/mg];

Ae2=atividade específica da amostra antes da purificação [U/mg].

47


e) Rendimento expresso em proteínas totais ( np ): que será definido por:

np = P2 / P1 X 100 Equação 4.5

onde:

P2=proteínas totais da fase extraída [mg];

Pr=protelnas totais antes da purificação [mg].

As massas P2 e P1 correspondem à concentração de proteína multiplicada

pelo volume da fase considerada.

d) Rendimento expresso em atividade ou Recuperação (R) definido

por:

R = A2 I A1 X 100 Equação 4.6

onde: A2=atividade na fase extraída [U];

Ai=atividade da amostra antes da purificação [U].

As atividades A1 e A2 correspondem à atividade enzimática multiplicada pelo

volume da fase considerada.

48

Resultados & Discussões

5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 - A ENZIMA (3-XILOSIDASE

5. 1. 1 - Estabilidade

O estudo da estabilidade é importante para caracterização da enzima

(3-Xilosidase produzida pelo P. janthinellum assim como para o conhecimento de

suas limitações de manuseio durante a realização dos estudos de extração líquido-

líquido. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 5.1 e 5.2:

Para ambas as temperaturas estudadas (4 ºC e -4 ºC}, a enzima, quando

solubilizada em pH ácido (3,0 ou 6,0) e neutro (7,0), apresentou grande estabilidade.

Sua atividade catalítica não variou significativamente, sendo que as oscilações

observadas, podem ser atribuídas a deficiências na homogeneização das amostra

analisadas. No entanto, quando a (3-Xilosidase foi solubilizada em pH 9,0, em ambas

as temperaturas, observou-se uma nítida redução de sua atividade catalítica: a partir

do 3° dia a 4 ºC e do 29° dia a -4 ºC. Tais resultados estão de acordo com os

encontrados na literatura (RODINOVA et ai., 1983; PULS et ai., 1995), que mostram

ter esta enzima melhor estabilidade e atividade catalítica em valores de pH ácido.

49


Tabela 5.1 - Atividade da p-xilosidase em diferentes valores de pH, em função do tempo, a 4ºC

Atividade da 13-Xilosidase [U/ml]

Tempo (dias) pH o 1 2 3 6 29 52 96

3,0 0,15 0,20 0,20 O, 16 0,19 O, 15 O, 12 O, 16

6,0 0,24 0,29 0,21 0,26 0,26 0,32 0,17 0,20

7,0 O, 11 O, 12 O, 12 O, 10 O, 11 O, 10 0,08 O, 12

9,0 0,15 O, 13 O, 10 0,05 0,03 o o o

Tabela 5.2 - Atividade da J3-xilosidase em diferentes valores de pH, em função do tempo a -4°C

Atividade da p-Xilosidase [U/ml]

pH Tempo (dias) ..

o 1 2 3 6 29 52 96 - - ...,. _____ ........_ __ ........_.,,......_. ___ . ---

3,0 O, 15 O, 14 0,24 0,25 0,20 0, 17 0, 12 0, 17 6,0 0,24 0,16 0,37 0,28 0,31 0,26 0, 17 0,27

7,0 O, 11 0,14 0,17 O, 18 0,14 0,10 0,08 0, 12

9,0 O, 15 0,14 0,35 0,33 0,29 0,08 0,05 0,03

RODINOVA et ai. (1983), em estudos da estabilidade desta enzima, para faixa

de pH de 4,0 a 6,0, observaram que a mesma é estável por 8 horas quando mantida

à temperatura ambiente. Essa faixa de pH muito se assemelha à avaliada neste

trabalho de dissertação, sendo que provavelmente, a temperatura exerça grande

influência sobre a atividade catalítica da enzima, visto que, apesar da similaridade da

faixa de pH estudado, após 96 dias, a enzima J3-xilosidase teve sua atividade

catalítica reduzida somente quando solubilizada e estocada em pH 9,0. Neste caso a

enzima perdeu a atividade em ambas as temperaturas estudadas.

50


5.1.2- Parâmetros Cinéticos

Na Figura 5. 1 são apresentadas as atividades enzimáticas (U/mL) da enzima

f3-xilosidase em função da concentração do substrato (pNpX), para a enzima obtida

após precipitação por etanol e solubilizada nos valores de pH 3,0; 6,0; 7,0 e 9,0.

• pH 3,0 • pH 6,0 & pH 7,0 ..- pH 9,0

000-+-~--~--.-~--,,~~.--~---~-.-~-.-~-,-~--. o s [I

pNpXfmM] f5

Figura 5.1 - Atividade da f3-xilosidase após precipitação fracionada com etanol em função da concentração de substrato (pNpX) para os valores de pH 3,0; 6,0; 7,0 e 9,0.

A maioria das enzimas apresenta um valor de pH característico em que sua

atividade é máxima; acima ou abaixo desse valor, a atividade se reduz. A inter-

relação da atividade enzimática com o pH para qualquer enzima depende do

comportamento ácido-básico e do substrato, bem como de muitos outros fatores que

são, em geral, difíceis de analisar quantitativamente. Nas Figuras 5.2a a 5.2d, são

apresentadas as curvas correspondentes ao inverso dos valores das atividades (1/v)

em função do inverso das concentrações do substrato ( 1 /s} para os valores de pH

estudados. Estas curvas foram construídas para a determinação dos valores de

51


KM(app) e V m-. sendo que a regressão linear dos pontos permitiu obter as equações

das quais extraiu-se tais valores, os quais são apresentados na Tabela 5.3.

5,0

pH3,0

40,0 35,0

30,0

25,0 ~ 200 "l'"" •

15,0 y = 7,-:rl'Jfx + 5,21:93 10,0 R2=0,9:ffi

5,0

o.o co 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

1/s

a)

pH 6,0 ---1 40,0

35,0

30,0

1 25,0

~ 200 1 ..... . 1

15,0

10,0 y = 7, 1643x + 5,2541 R2=0,9993

5,0

o.o o.o 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

1/s

b)

pH7,0

45,0

«),O

::6,0

:D,O

> 25,0· - "'"" ai.o 15,0 ·

10,0

5,0

o.o -~---·~--,-----,----.

y = 9,:JlBc + 4,8317 R'=0,9:87

5,0

º·º 1,0 2.0 3,0 4,0

Figura 5.2 - Curvas Correspondentes ao Inverso dos Valores das Atividades (1/v) de J3-xilosidase em Função do Inverso das Concentrações do Substrato (1/s).

1/s -----·---

No presente trabalho, os valores de KM(app) foram pouco influenciados pelo pH

(Tabela 5.3), sendo que o pH de solubilização 6,0, proporcionou o menor valor para o

parâmetro cinético KM(app), 1 ,39 mM.

e)

pH 9,0

45,0

40,0

35,0

30,0

~ 25,0 ..... 20,0

y = 8,862x + 6,0387 R2 = 0,9978

0,0 · ----------r---------·,·---- ··--··--·--,----· ·-- -··--,-----·-· ·-- ··-··,

o.o 1,0 2,0 3,0 4,0

1/s

d)

52


Tabela 5.3 - KM(app) e Vm da 13-xilosidase obtidos após precipitação fracionada com etanol em função do inverso das concentrações do substrato para diferentes valores de pH

pH v; (U/ml) KM(app) (mM)

3,0 O, 19 1,42

6,0 O, 19 1,39

7,0 0,22 2,01

9,0 O, 17 1,47

RISTROPH & HUMPHREY (1985) calcularam a velocidade de reação da

í3-Xilosidase do caldo fermentado produzido por Thermonospora crassa e obtiveram

um KM de 0,82 mM e um Vm de 0,0085 U/ml, utilizando pNpX como substrato nas

concentrações de 0,049 a 8,9 mM. KUMAR & RAMÓN (1996), utilizando a mesma

metodologia de medida de atividade citada no presente trabalho, encontraram para a

í3-Xilosidase pura de Aspergillus nidulans, valores de 1, 1 mM e 2,56 U/ml para KM e

V m, respectivamente.

Comparando os resultados obtidos no presente trabalho (para o pH 6,0) com

aqueles dos autores citados, verifica-se que KUMAR & RAMÓN (1996) obtiveram um

KM 21 % menor, e que RISTROPH & HUMPHREY (1985) um v-, 95 % menor para

um KM 59 % menor. Estes autores, citam ainda, valores de KM de 0,22, 1,43 e 3,01

respectivamente, para Aspergillus, Bacillus e Malbranchea. Desta forma, o KM da

í3-Xilosidase encontrado no presente trabalho, é um valor condizente com a literatura,

pois este parâmetro apresenta significativa variação (para a enzima í3-Xilosidase),

quando analisados diferentes microrganismos produtores.

É importante ressaltar, que os valores de KM(app) e de V m obtidos neste

trabalho provavelmente seriam diferentes daqueles da enzima pura, pois as

determinações foram feitas com a í3-Xilosidase parcialmente purificada, portanto são

valores aparentes (app). Entretanto, são valores com boa aproximação das reais

condições de aplicação industrial, pois enzimas xilanolíticas normalmente não são

utilizadas na forma pura (CORTEZ, 1998).

53


5.2 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA (3-XILOSIDASE POR SISTEMA DE MICELAS REVERSAS FORMADO A PARTIR DO AGENTE TENSOATIVO CATIÔNICO BDBAC

Na Tabela 5.4 estão apresentados os resultados da extração, em termos de

porcentagem de recuperação (Ro/o) da enzima (3-xilosidase por micelas reversas do

agente tensoativo BDBAC, obtidos nos ensaios realizados conforme o planejamento

fatorial 25-1.

Tabela 5.4 - Planejamento Fatorial Fracionário 25•1 com 1 Repetição Utilizado para Avaliação da Influência do pH, condutividade elétrica, concentração de hexanol e Temperatura na Recuperação da (3-xilosidase por Micelas Reversas de Agente Tensoativo Catiônico BDBAC

Ensaio nº.

pH Condutividade Elétrica (mS/cm)

BDBAC (M)

Hexanol (%)

Temp. (ºC)

y (%)

1 3,0 4,0 2 9,0 3 3,0 4 9,0 5 3,0 6 9,0 7 3,0 8 9,0 9 3,0 10 9,0 11 3,0 12 9,0 13 3,0 14 9,0 15 3,0 16 9,0

4,0 10 10 4,0 4,0 10 10 4,0 4,0 10 10 4,0 4,0 10 10

0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 O, 1 O, 1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 10 10 10 10 10 10 10 10

26 4 4 26 4 26 26 4 4 26 26 4 26 4 4 26

19,9 18,7 0,1 0,3 2,0 3,7 0,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 30,4 42,5 6,1 6,2 1,1 0,8 0,4 0,4 2,7 3,3 5,5 8,5 44,2 43,2 2,6 2,7 0,0 0,0 1,4 0,5

19,3 0,2 2,9 0,2 0,0 0,0 36,4 6,1 1,0 0,4 3,0 7,0 43,7 2,6 0,0 0,9

54


Com base nos resultados obtidos, pode-se observar que em todos os ensaios

realizados em pH 9,0, independente da combinação das outras variáveis, a

recuperação da enzima foi muito baixa (< 8%). Tal fato pode ser explicado

principalmente devido ao pH ótimo de atividade catalítica da enzima se encontrar na

faixa ácida (DESHPANDE et ai., 1994). Provavelmente nesta condição, ou seja em

pH 9,0, tenha ocorrido perda de atividade da enzima e consequentemente redução

na porcentagem de recuperação.

Baixa recuperação (<8%) para a enzima foi também encontrada em todos os

ensaios realizados no menor nível de temperatura (4ºC). Estes resultados

possivelmente se devem ao pequeno diâmetro das micelas reversas formadas

quando da utilização de tal temperatura, diminuindo assim sua capacidade de

absorção e englobamento da enzima. Segundo KREI & HUSTEDT (1989) a

capacidade máxima da micela é dependente da temperatura, ou seja, existe uma

faixa de temperatura na qual estas apresentam-se como formações estáveis,

favorecendo portanto a absorção de proteínas. PESSOA JR & VITOLO (1998), em

trabalhos de extração da enzima inulinase, também constataram que o tamanho da

micela reversa é bastante dependente da temperatura e, na faixa de 5 a 45ºC, as

micelas reversas em solventes orgânicos são formações estáveis e podem favorecer

a absorção desta enzima. Os resultados acima indicam que as variáveis pH e

temperatura influem na recuperação das biomoléculas em estudo.

Os maiores valores de recuperação para 13-Xilosidase (19,3, 36,4 e 43,7 %)

foram obtidos nos ensaios 01, 07 e 13, respectivamente (Tabela 5.4). Comparando-

se o ensaio 1 com o ensaio 7 (em que os níveis para o pH, temperatura e hexano!

foram mantidos constantes) verifica-se que o aumento da condutividade elétrica de 4

para 1 O mS/cm e da concentração de BDBAC de O, 1 para 0,2 M promoveu um

aumento na recuperação da enzima de 88,52 %. Este aumento foi ainda maior

(126, 13%) quando foram mantidos pH, condutividade elétrica e temperatura, e

aumentou-se a concentração de BDBAC de O, 1 para 0,2 M e a concentração de

hexanol de 5 para 10% (ensaios 1 e 13, respectivamente). Estes resultados sugerem

que diferentes combinações das variáveis interferem nos resultados de recuperação,

o que dificulta uma análise direta dos efeitos destas variáveis. Desta forma, os

55


efeitos principais das variáveis pH, condutividade elétrica, concentração de BDBAC,

concentração de hexanol e temperatura, bem como os efeitos interativos entre elas,

podem ser melhor avaliadas empregando-se a análise estatística.

As estimativas dos efeitos, erros-padrão e o teste t ( de Student) para a

recuperação da 13-xilosidase estão representados na Tabela 5.5. Os resultados da

análise estatística confirmam os efeitos sugeridos pela análise direta dos dados, e

também a existência de efeitos de interação entre as variáveis.

Tabela 5.5 - Estimativa dos Efeitos, Erros-padrão e teste t (Student) para os Parâmetros Estudados na Recuperação da 13-xilosidase por Micelas Reversas de BDBAC

Efeitos Estimativas Erros-padrão t

Média 7,73 +/-0,397 19,49 Fator A ( pH) -11, 11 +/-0,793 14,00*

Fator B (Condutividade) -1,35 +/-0,793 1,70

Fator C (Cone. BDBAC) 6,99 +/-0,793 8,81*

Fator D (Cone. Hexanol) -0,82 +/-0,793 1,03

Fator E (Temperatura) 10,52 +/-0,793 13,26*

AB 4,09 +/-0,793 5, 16*

AC -6,51 +/-0,793 8,21*

AD 1,92 +/-0,793 2,42*

AE -14, 13 +/-0,793 17,82*

BC 0,63 +/-0,793 0,78

BD -7,87 +/-0,793 9,92*

BE -4,39 +/-0,793 5,53*

CD 1,99 +/-0,793 2,50*

CE 7,55 +/-0,793 9,52*

DE -1, 17 +/-0,793 1,48 Valor de t para 95% de confiança com 16 GL (t = 2, 12043) * Significativo ao nível de 95% de Confiança

Como pode ser visto na Tabela 5.5, os maiores efeitos principais observados

para a recuperação da enzima foram os das variáveis pH e temperatura, que

56


apresentaram estimativas de -11, 11 e + 1 O, 52, respectivamente. Observa-se ainda

efeito interativo, ao nível de 95% de significância, entre estas variáveis, o qual

apresenta uma estimativa de valor elevado (-14, 13). O fato desta interação

apresentar sinal negativo indica que os resultados de recuperação são melhorados

com a condução dos ensaios em menores valores de pH e temperaturas mais

elevadas, nas respectivas faixas estudadas.

Nas Figuras 5.3a a 5.3d estão representadas as superfícies de resposta das

interações mais significativas. A superfície mostrada na Figura 5.3a, que representa

a interação entre as variáveis pH e temperatura, permite visualizar o comportamento

anteriormente citado.

A concentração de BDBAC também apresentou efeito principal significativo

(estimativa de 6,99) na recuperação da enzima, sugerindo que o aumento da

concentração de BDBAC promove um aumento no valor da variável resposta. Foi

constatada ainda a existência de interações significativas entre BDBAC e todas as

outras variáveis avaliadas, impossibilitando desta forma uma análise isolada do efeito

do mesmo. As Figuras 5.3b e 5.3c representam as superfícies de resposta referentes

as interações da concentração de BDBAC (C) com a temperatura (E) e com o pH (A).

Nota-se que, para estas duas interações houve aumento na recuperação da enzima

com o aumento da concentração de BDBAC, sendo que a recuperação foi maior com

o aumento da temperatura (Figuras 5.3b) e com a diminuição do pH (Figura 5.3c).

57


Figura 5.3a - Recuperação da f3-xilosidase por micelas reversas em função da temperatura e do pH, usando BDBAC O, 15M, condutividade elétrica de 7 ,OmS/cm, 7 ,5% de hexanol.

Figura 5.3b - Recuperação da f3-xilosidase por micelas reversas em função da temperatura e da concentração do BDBAC, usando pH 6,0, condutividade elétrica de 7,0mS/cm, 7,5% de hexanol.

58


Figura 5.3c - Recuperação da í3-xilosidase por micelas reversas em função da concentração de BDBAC e do pH, usando temperatura de15°C, 7,0mS/cm, 7,5% de hexanol.

- ·~

Figura 5.3d - Recuperação da í3-xilosidase por micelas reversas em função da condutividade elétrica e da concentração de hexanol, usando BDBAC O, 15M, pH 6,0, 7,5% de hexanol.

59


Por se tratar de uma molécula grande, da ordem de 100 kDa

(SULISTYO et ai., 1995; CORTEZ & PESSOA JR, 1999), a enzima 13-xilosidase

necessita de micelas reversas de raios maiores para englobá-la. Desta maneira o

uso do nível superior para a variável concentração de BDBAC se justifica, pois as

micelas podem apresentar variações de tamanho, dependendo, entre outros fatores,

da concentração do agente tensoativo e da temperatura (KREI & HUSTEDT, 1989;

PESSOA JR & VITOLO, 1998). Tal fato é previsível, visto que a micela é uma

organização de moléculas de um tensoativo que se orientam de modo a formar

micelas em soluções polares e micelas reversas e soluções apoiares. Seu tamanho

portanto, depende do número de moléculas de tensoativo. De fato, a temperatura

também influi diretamente sobre a estabilidade micelar, ou seja, a diminuição da

temperatura promove o encolhimento da micela e a diminuição da sua capacidade de

absorção. Por outro lado, temperaturas elevadas ocasionam o desaparecimento da

pseudofase micelar, deixando de existir na forma orgânica. Embora haja uma faixa

ideal de temperatura para formação de micelas reversas estáveis, no presente

trabalho (Figura 5.3b) ficou demonstrado que a recuperação foi dependente de

ambos os fatores, ou seja, houve o aumento da recuperação com o aumento da

concentração de BDBAC e da temperatura.

Para extração de biomoléculas por micelas reversas empregando tensoativo

catiônico, espera-se obter melhores resultados quando da utilização de valores de

pH superiores ao pI da biomolécula estudada, devido ao favorecimento das

interações eletrostáticas entre as enzimas e o agente tensoativo. Entretanto, no

presente trabalho, este comportamento não foi observado, visto que os melhores

rendimentos de extração ocorreram em valores de pH inferiores ao pI da

13-Xilosidase, que, conforme citado na literatura (PULS et ai., 1995; SUL YSTIO et

ai., 1995) está na faixa de 4,9 a 6,0. Pela Figura 5.3c pode-se constatar este fato,

uma vez que a maior recuperação ocorreu no nível -1 para o pH, que corresponde

ao valor 3,0. Esta mudança da faixa de pH considerada ótima para extração pode ser

explicada pela existência de interações hidrofóbicas entre a enzima e o agente

tensoativo, conforme modelo proposto por LUISI et ai. (1988), ilustrado na Figura 5.4.

60


Enzima Fase Orgânica Fase Aquosa

Figura 5.4 - Extração de uma Proteína por Micelas Reversas Considerando a Existência de Forças Hidrofóbicas de Interação (Adaptado de LUISI, et ai., 1988).

Outras importantes interações podem ser observadas como entre pH e

condutividade elétrica (AB), pH e concentração de hexano! (AD), condutividade

elétrica e concentração de hexano! (BD) e concentração de BDBAC e concentração

de hexano! (CD). Dentre estas, a que apresentou maior efeito foi a interação BD

(-7,87). A Figura 5.3d mostra a superfície de resposta para esta interação, sendo que

a recuperação aumenta quando se usam os níveis +1 da concentração de hexano! e

-1 de condutividade elétrica, e para o inverso, isto é -1 e +1, caracterizando, desta

forma, uma interação antagônica entre estes fatores.

ANDREWS et ai. (1994) verificaram que a força iônica pode afetar o tamanho

da micela, pois os grupamentos polares dos agentes tensoativos repelem-se e, com

isto, micelas maiores são formadas quando submetidas à baixa força iônica. Desta

forma, à medida que a força iônica da solução que contém a proteína aumenta, as

interações entre a proteína e o agente tensoativo diminuem, devido à redução do

efeito repulsivo dos grupos polares do tensoativo. Isto leva a um decréscimo do

transporte de água ou outras moléculas e, consequentemente, à formação de menos

e menores micelas reversas.

61


A interação antagônica observada no presente trabalho entre o co-solvente e

a condutividade elétrica não foi ainda elucidada pela literatura. Mas, segundo KREI &

HUSTEDT (1992), os co-solventes são adicionados aos sistemas de micelas

reversas de tensoativos catiônicos para aumentar o tamanho das mesmas. Eles se

assemelham a soluções tampão, que provocam repulsão entre as interações íon-íon

dos núcleos do tensoativo, permitindo a formação do núcleo interno da micela

reversa. Desta forma, a opção pelo uso da força iônica em seu nível inferior, isto é

4 mS/cm, implica na utilização do co-solvente no nível superior (10%), ou o inverso,

sem que haja prejuízo dos rendimentos.

Após a seleção das variáveis que apresentam efeitos significativos sobre o

processo estudado, conduziu-se uma análise de variância (ANOVA) para verificação

da possibilidade de ajuste de um modelo linear aos dados experimentais, o que foi

confirmado pelo elevado coeficiente de correlação múltiplo, ou seja R2 = 0,98. Os

parâmetros desta análise encontram-se na Tabela 5.6.

62


Tabela 5.6 - Parâmetros da Análise de Variância (ANOVA) dos Fatores Significativos ao Processo de Extração da Enzima P-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo BDBAC

Fonte de SQ GL QM Fator - f Valor - P Variação Fator A 987,01 1 987,01 189,74 0,0000* Fator B 14,47 1 14,47 2,78 0, 1136*

Fator e 390,88 1 390,88 75,14 0,0000*

Fator D 5,33 1 5,33 1,02 0,3256

Fator E 885,36 1 885,36 170, 19 0,0000*

AB 133,91 1 133,91 25,74 0,0001*

AC 339, 17 1 339, 17 65,20 0,0000*

AD 29,49 1 29,49 5,67 0,0292*

AE 1598, 10 1 1598, 10 307,21 0,0000*

BD 494,87 1 494,87 95,13 0,0000*

BE 153,91 1 153,91 29,59 0,0000*

CD 31,52 1 31,52 6,06 0,0248* .. - ._,..,

CE 456, 17 1 456, 17 87,69 0,0000*

Bloco 6,27 1 6,27 1,2 0,2877

Erro Total 94,71 18 5,03

Total 5614,90 31 R2 = 0,98 GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática * Significativos a 95%.

A validade do modelo linear foi verificada pela análise de variância de

regressão do modelo (Tabela 5.7). Através do teste F, ou seja, comparando-se o

valor F do modelo (80,7) com o valor de F tabelado (2,3), fica claro que o modelo é

altamente significativo. Além disso, ele não apresenta falta de ajuste, isto é, a

diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pela

equação do modelo pode ser explicada pelo erro experimental.

63


Tabela 5.7 -Análise de variância de regressão para o modelo representativo do processo de extração de J3-xilosidase por micelas reversas de BDBAC, na região em estudo

Causa de SQ GL MQ F

Variação

Modelo 5520,20 13 424,63 80,71

Erro 94,70 18 5,26

Total 5614,90 31 R =0,98 GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática

Desta forma, podemos descrever um modelo matemático para representar o

processo, o qual pode ser expresso pela equação 5.1, onde Y representa

porcentagem de recuperação da J3-xilosidase, A o pH, B a condutividade elétrica,

C a concentração de BDBAC, D a concentração de hexano! e E a temperatura.

Y=7,73 • 5,55A • 0,678 + 3,49C • 0,410 + 5,26E + 2,05A8 • 3,26AC

+ 0,96AO • 7,07AE • 3,9380 • 2,198E + 0,99CO + 0,78CE Equação 5.1

A equação 5.1 prevê valores de recuperação para a J3-xilosidase de 40%, para

as seguintes condições: pH 3,0, condutividade elétrica 4,0 mS/cm, concentração de

BDBAC 0,2M, concentração de hexano! 10% e temperatura 26ºC. Nestas condições,

realizou-se um novo ensaio visando a confirmação do modelo e obteve-se 39,5% de

recuperação. Este resultado demonstra que o modelo se adequou perfeitamente aos

resultados experimentais, pois nenhuma diferença significativa entre o valor previsto

e o experimental foi observada.

64


5.2.1 - Otimização do Processo de Extração por Mice/as Reversas de BDBAC em lsooctano e Hexano/

Os resultados obtidos anteriormente mostraram que dentre os 05 fatores

inicialmente estudados para esse sistema (pH, condutividade elétrica, concentração

de BDBAC, concentração de hexanol e temperatura), apresentaram significância em

ordem decrescente os seguintes fatores: pH>temperatura>concentração de BDBAC.

Os maiores efeitos foram causados pela influência negativa do pH e positiva da

temperatura. Isto equivale a dizer que os valores para a variável resposta, são

aumentados quando o fator pH é utilizado no seu nível inferior (3,0) e temperatura no

superior (26 ºC).

Desta forma, com o objetivo de se otimizar o processo de extração de

j3-xilosidase por micelas reversas do agente tensoativo catiônico BDBAC, estudou-se

a influência do binômio pH e temperatura sobre o processo.

Buscando-se obter um modelo otimizado que pudesse ser usado para o

sistema de micelas reversas formados pelo tensoativo BDBAC em isooctano e

hexano!, empregou-se um planejamento fatorial completo 22 com face centrada e 03

repetições no ponto central, sendo estudadas as variáveis pH e temperatura. A

Tabela 5.8 mostra os níveis utilizados nos ensaios para as duas variáveis estudadas

e os valores obtidos para a variável resposta, porcentagem de recuperação da

enzima.

Os níveis dos fatores usados na otimização foram codificados em -1, O, +1,

correspondendo respectivamente ao nível superior, ponto central e nível inferior.

65


Tabela 5.8 - Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 Com Face Centrada e 03 Repetições no Ponto Central Utilizada para Avaliação da Influência do Binômio pH e Temperatura na Recuperação da (3-xilosidase por Micelas Reversas de Agente Tensoativo Catiônico BDBAC

Variáveis Valores Ensaio Codificadas Empregados Recuperação

Nº pH Temperatura pH Temperatura (%) 1 -1 -1 2 22 o 2 +1 -1 4 22 24

3 -1 +1 2 30 o 4 +1 +1 4 30 o 5 -1 o 2 26 o 6 +1 o 4 26 41

7 o -1 3 22 49

8 o +1 3 30 o 9 o o 3 26 38 ..

10 o o 3 26 40

11 o o 3 26 31

Os dados experimentais foram analisados estatisticamente, de acordo com o

planejamento preestabelecido, para verificar o efeito dos fatores em estudo. A

análise dos dados foi feita com o auxílio de software específico para este fim,

utilizando como variável resposta a porcentagem de recuperação da enzima

(3-Xilosidase.

Como pode ser visualizado na Tabela 5.8, independentemente da temperatura

utilizada, em valores de pH 2,0, os resultados de recuperação obtidos foram iguais a

zero. Isto se deve provavelmente à desnaturação da enzima. Os mesmos resultados

nulos foram observados quando empregada no processo de extração a temperatura

de 30ºC, independente do pH utilizado no ensaio. Tais resultados nulos de extração

podem ter sido ocasionados pela inexistência de fase micelar a 30 ºC, quando da

utilização deste sistema. Porém, a existência ou não de fase micelar, somente

66


poderia ser elucidada pelo estudo do diagrama de fases do sistema formado por

BDBAC/hexanol/isooctano/água. No entanto, tal sistema não encontra-se disponível

na literatura.

Por outro lado, as extrações realizadas nas condições definidas pelo ponto

central (pH 3,0 e 26ºC), a recuperação da enzima J3-xilosidase alcançou maiores

valores (da ordem de 40%). Isto sugere a existência de efeitos quadráticos para

ambas as variáveis avaliadas e que o ponto máximo de recuperação encontra-se na

região estudada.

Tensoativos catiônicos, tais como o BDBAC, normalmente favorecem o

transporte de enzimas para o interior micela quando essas possuem carga elétrica

negativa, o que é alcançado com o uso de valores de pH superiores ao pi da enzima.

O ponto isoelétrico da J3-xilosidase de diferentes microorganismos encontra-se entre

4,9 e 6,0, segundo dados encontrados na literatura (DESHPAND et ai. 1994;

SULYSTIO et ai., 1995) e portanto é esperado que com o uso de agentes tensoativos

catiônicos a enzima migre para o interior das micelas reversas quando o pH do meio

é superior ao seu pi.

Todavia, neste trabalho, a situação é oposta ou seja, maiores valores de

recuperação da enzima foram obtidos em pH inferior ao pI da enzima, sugerindo que

a transferência da enzima para a fase micelar seja governada por interações

hidrofóbicas entre a proteina e o tensoativo (LUISI et ai. 1988).

Os parâmetros de um modelo de segunda ordem (quadrático) usados para

estimar a porcentagem da enzima recuperada em função do pH e da temperatura

foram obtidos através da análise de regressões múltiplas, mostrada na Tabela 5.9.

- --

67


Tabela 5.9 - Variáveis, Coeficientes, Teste t (Student), Valores de p do Planejamento Completo com Face Centrada 22 com 03 Repetições no Ponto Central para Extração de (3-xilosidase por Micelas Reversas de BDBAC

Variáveis Coeficientes t p

Média 36,89 5,74 <0,005 pH (A) 10,83 2,12 0,08

Temperatura (B) -12, 17 -2,38 0,06 pH x Temperatura (AB) -6 -0,96 0,38

pH x pH (A2) -17,24 -2, 18 0,08 Temperatura x Temperatura (82) -13,24 -1,68 0, 15

A significância estatística do modelo quadrático (Tabela 5.1 O) foi avaliada pelo

teste F, e revelou que esta regressão é estatisticamente significativa a um nível de

10% de probabilidade. O modelo não apresenta falta de ajuste e o coeficiente de

determinação (R2 = 0,81) indica que 81% das variações na recuperação da enzima

por este sistema podem ser explicadas pelo modelo. Assim, um modelo matemático

que represente a recuperação de (3-xilosidase por micelas reversas de BDBAC (em

isooctano e hexanol) pode ser expresso pela Equação 5.2:

Y = 36,89 + 10,83A-12,178-6,00AB • 17,24A2 -13,2482 Equação 5.2

onde: Y=recuperação da enzima(%), A e B valores codificados de pH e temperatura,

respectivamente.

68


Tabela 5.10 - Parâmetros da Análise de Variância (ANOVA) dos Fatores Significativos ao Processo de Extração de J3-xilosidase por Micelas Reversas de BDBAC

Fonte de SQ GL QM F Variação p

Modelo 3356,36 5 671,27 4,27 0,068 Resíduo 785,82 5 157, 16

Total 4142, 18 10

R2= 0,81 GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática

O máximo valor de recuperação de (3-xilosidase, 42%, corresponde ao ponto

definido pelo pH 3,4 (A = 0,41) e temperatura de 24ºC (B = -0,55). A Figura 5.5

apresenta a superfície de resposta obtida usando os valores ótimos previstos para as

variáveis.

Ensaios de extração da enzima nas condições ótimas previstas pelo modelo

foram feitos, encontrando-se o valor médio para a recuperação de 43%, confirmando

assim o valor previsto pelo modelo.

Figura 5.5 - Superfície de Resposta Descrita pelo Modelo da Equação 5.2, que Representa a Extração em Condições Otimizadas de J3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico BDBAC em lsooctano e Hexanol.

69


A extração da enzima J3-xilosidase por micelas reversas de BDBAC, nas

condições otimizadas previstas pelo modelo obtido: pH 3,4, temperatura de 24ºC,

condutividade elétrica 4mS/cm, concentração de tensoativo 0,2M e concentração de

hexano! de 10%, proporcionou um aumento de pureza de 2 vezes para a enzima

extraída para FAII (em relação ao precipitado solubilizado), como pode ser visto na

Tabela 5.11.

Tabela 5.11 - Aumento de Pureza para Enzima J3-xilosidase

Atividade Específica U/mg

Ae (após a extração) Ae ( antes da extração)

5,98 3,0

Ap 2 Ae = atividade específica; Ap = aumento de pureza

Apesar do aumento de pureza ser modesto, os resultados mostram mais uma

vez, ser possível a utilização da extração por micelas reversas, para separação de

enzimas de interesse. No entanto, os valores obtidos no presente são similares a

outros encontrados na literatura para purificação de enzimas por micelas reversas

(PESSOA JR & VITOLO, 1997; GIOVENCO & VERHEGGEN, 1987).

5.2.2 - Determinação do Raio Mice/ar

Foi determinado o raio das micelas reversas no ponto de ótimo do

planejamento, utilizando microemulsão com concentração de BDBAC de 0,2 M, 10 %

de hexano!, condutividade elétrica de 4 mS/cm, temperatura de 24°C e pH 3,3.

O raio micelar obtido (Tabela 5.12) foi superior a 5nm, valor indicado por KREI

& HUSTEDT (1992) para que uma proteína de 100 kDa possa ser englobada. Assim,

como a J3-Xilosidase possui massa molar nesta ordem de grandeza, o raio micelar

não constituiu um obstáculo à extração. Pode-se verificar, também, na Tabela 5.12

que o raio micelar na fase micelar II (FMII) é menor (1,8 nm) que 5 nm e indica que a

70


micela reversa teve seu diâmetro reduzido para um valor que não permite que a

enzima p-xilosidase esteja ainda englobada.

Tabela 5.12 - Wo e Rm Determinados na FAI E FAII Obtidas após Extração por Micelas Reversas de BDBAC a 0,2M, 10 % de Hexanol, Condutividade Elétrica de 4 mS/cm, Temperatura de 24°C e pH 3,4

Fase da Extração Rm (nm)

FMI

FMII

84,19

11,04

13,80

1,80

Apesar do raio micelar ser favorável à absorção da p-xilosidase, verificou-se

que a extração da enzima foi regida por forças hidrofóbicas, pois mesmo com o uso

de agente tensoativo catiônico, os melhores resultados de extração foram

conseguidos nos ensaios onde valores de pH eram inferiores ao pi da enzima.

Portanto provavelmente a proteína não estava localizada no interior da micela

reversa, e sim, ligada às suas partes hidrofóbicas, conforme proposto por LUISI et ai.

(1988).

- ·-

5.2.3 - Eletroforese

Foi realizada eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) para

identificação das proteínas presentes no precipitado solubilizado, na FAI e na FAII.

Para realização do processo de extração e obtenção das amostras que foram

analisadas, utilizaram-se as condições otimizadas obtidas, ou seja, microemulsão

com concentração de BDBAC de 0,2M, 1 O % de hexano!, condutividade elétrica de 4

mS/cm, temperatura de 24ºC e pH 3,3.

Na Figura 5.6, as linhas 1 e 2 correspondem aos marcadores de massa molar,

as linhas 3, 4 e 5, o precipitado solubilizado, a FAI e a FAII, respectivamente.

71


205.000

116.000 -110kDa 91.UOO

-1001dla

84.000 66.000

55.lJOO 45.000 36.000

29.000 24JJOO -20kDa 20.000 .

6..500

1 2 3 4 5

Figura 5.6 - Eletroforese em Condições Desnaturantes (505-PAGE) das Etapas do Processo de Extração da Enzima f3-Xilosidase por Micelas Reversas pré Purificada por Precipitação Fracionada com Etanol: Linha 1 e 2 - Marcadores de Massa Molar (205, 116, 97, 84, 66, 55, 45, 36, 29, 24, 20 e 6,5 kDa), Linha 3 - Precipitado Solubilizado, Linha 4 - FAI e Linha 5 - FAil.

A linha 3 da eletroforese, cuja amostra foi obtida após precipitação

francionada com etanol a 20 e 60%, permite verificar a presença de proteínas com

bandas nítidas na faixa de 100, 11 O kDa e 20 kDa. Semelhante aos resultados

obtidos por CORTEZ & PESSOA ( 1999), as bandas obtidas de 100 e 11 O kDa

correspondem à !3-xilosidase. VAN-PEIJ-N-N-M-E et ai. ( 1997), cultivando

Aspergíllus níger em arabinoxilana, obtiveram e purificaram uma !3-xilosidase de

massa molar de 110 kDa identificada por SDS-PAGE. A banda obtida a 20 kDa,

provavelmente se deva a uma endoxilanase, cuja identificação foi feita por

RODRIGUES (1997) utilizando como técnica de purificação a extração por micelas

reversas.

72


Nas linhas 4 e 5, correspondente a FAI e FAII respectivamente, observa-se

somente as bandas de 100 e 11 O kDa, constatando assim que somente a enzima

13-xilosidase está presente em ambas as fases em quantidade apreciáveis.

Assim, conclui-se que a extração por micelas reversas nas condições

utilizadas, mostrou-se eficiente na separação da enzima de interesse.

73


5.3 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA (3-XILOSIDASE POR SISTEMA OE MICELAS REVERSAS FORMADO A PARTIR DO AGENTE TENSOATIVO ANIÔNICO AOT

Na Tabela 5.13 estão apresentados os resultados obtidos nos ensaios para

recuperação (R%) da enzima (3-xilosidase por micelas reversas do agente tensoativo

AOT, bem como os valores empregados para as variáveis em estudo. Os ensaios

foram realizados conforme o planejamento fatorial 24 com 2 repetições no ponto

central. Como pode ser observado, em todos os ensaios o valor da variável resposta

foi igual a zero.

Tabela 5.13 - Planejamento Fatorial Completo 24 com 2 Repetições no Ponto Central Utilizado para Avaliação da Influência do pH, Condutividade Elétrica, Concentração de AOT e Temperatura na Recuperação da (3-xilosidase por Micelas Reversas de Agente Tensoativo Aniônico AOT

Ensaio nº pH

Condutividade Elétrica (mS/cm)

AOT (M)

Temperatura (ºC) R (%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

3,0 9,0 3,0 9,0 3,0 9,0 3,0 9,0 3,0 9,0 3,0 9,0 3,0 9,0 3,0 9,0 6,0 6,0 6,0

4,0 4,0 10,0 10,0 4,0 4,0 10,0 10,0 4,0 4,0 10,0 10,0 4,0 4,0 10,0 10,0 15 15 15

0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 O) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2

0,15 0,15 0,15

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 26,0 26,0 26,0 26,0 26,0 26,0 26,0 26,0 15,0 15,0 15,0

o o o o o o o o o o o o o o o o o o o

74


5.4 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA !3-XILOSIDASE POR SISTEMA DE MICELAS REVERSAS FORMADO A PARTIR DO AGENTE TENSOATIVO CATIÔNICO CTAB

Para o estudo da influência das variáveis pH, concentração de CTAB,

condutividade elétrica, concentração de hexanol e concentração de butanol, sobre a

extração de !3-xilosidase utilizou-se um planejamento fatorial fracionário 25-1 com 03

repetições no ponto central. Esse planejamento foi proposto para identificar os

fatores significativos para o sistema de extração sem que o número de ensaios fosse

demasiadamente grande. A matriz da Tabela 5.14 mostra os níveis utilizados para

cada variável nos diferentes ensaios, bem como os resultados de recuperação por

micelas reversas da enzima f3-xilosidase obtidos.

Tabela 5.14 - Planejamento Fatorial Fracionário 25-1 para Estudo da Influência do pH, Concentração de CT AB, Condutividade Elétrica, Concentração de Hexanol, Concentração de Butanol, na Recuperação de 13-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Ensaio nº pH CTAB (M)

Condutividade Elétrica (mS/cm)

Hexanol Butanol Recuperação (%) (%) (%)

1 3,0 2 8,0 3 3,0 4 8,0 5 3,0 6 8,0 7 3,0 8 8,0 9 3,0 10 8,0 11 3,0 12 8,0 13 3,0 14 8,0 15 3,0 16 8,0 17 5,5 18 5,5 19 5,5

0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 O, 1 0,2 0,2 0,1 O, 1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0,15 0,15 0,15

4,0 4,0 4,0 4,0 10,0 10,0 10,0 10,0 4,0 4,0 4,0 4,0 10,0 10,0 10,0 10,0 7,0 7,0 7,0

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 7,5 7,5 7,5

20 10 10 20 10 20 20 10 10 20 20 10 20 10 10 20 15 15 15

o.o 0,6 0,0

59,3 7,0 18,7 1,7 0,0 7,3 17,5 2,9

32,3 1,5

18,8 0,0 35,3 5,1 4,5 9,5

76


RODRIGUES (1997), obteve 9% de rendimento em atividade de xilanases, em

condições semelhantes de extração (temperatura, pH, concentração de AOT).

Porém, é importante ressaltar que as xilanases têm sua atividade enzimática

determinada pelo método descrito por MILLER (1959), que mede a quantidade de

açúcares redutores totais liberados após reação de hidrólise. Sendo as xilanases um

complexo formado por diversas enzimas hidrolíticas, este método não possui grande

especificidade e portanto todas enzimas do complexo apresentam resposta quando

de sua utilização. Essa diferença de metodologia empregada por RODRIGUES

(1997) em relação ao presente trabalho de dissertação, pode explicar as diferenças

encontradas nos resultados. Além disso, outras possibilidades de ter-se obtido

resultados nulos no presente trabalho, é a baixa concentração de f3-xilosidase e o

uso de um método de determinação de atividade específico para esta enzima

(KUMAR & RÁMON, 1996), o qual pode ter sido influenciado pelos componentes do

meio de extração por micelas reversas como o solvente isooctano ou o tensoativo

AOT.

75


Observa-se nos resultados obtidos, que na maioria dos ensaios realizados em

pH 8,0, a recuperação da enzima foi superior a 15%, chegando a 59,3 % no ensaio

de número 04. Por outro lado, verifica-se que em todos os ensaios conduzidos em

pH 3,0, independente do nível das outras variáveis, os resultados de recuperação da

enzima obtidos foram baixos (inferiores a 8%). Tais resultados diferem daqueles

obtidos anteriormente com o uso do agente tensoativo também catiônico BDBAC, em

que os melhores resultados de extração foram obtidos com o uso de pH 3,0. Essa

diferença nos resultados se deve, principalmente, às forças que atuam no sistema ou

seja, no presente caso, a extração por micelas reversas do agente tensoativo CT AB

é muito provavelmente governada por atrações eletrostáticas. Esses resultados

foram análogos aos obtidos por SILVA et ai. (1998) em estudos de extração de

p-xilosidase e RODRIGUES et ai. (1999) na extração de xilanases, ambas enzimas

produzidas por P. janthínellum e extraídas por micelas reversas de BDBAC.

Nos ensaios 04 e 12, foram obtidos valores de recuperação de 59,3 e 32,3%

respectivamente. Em ambos os casos utilizou-se o pH 8,0, concentração de CTAB

de 0,2 M e condutividade elétrica de 4mS/cm. Verifica-se ainda que o aumento da

concentração de butano! de 1 O para 20% e a diminuição da concentração de hexano!

de 10 para 5% ocasionou um aumento no valor da recuperação da enzima de 84%.

Observou-se, também, aumento na recuperação (cerca de 10%), nos ensaios 12 e

16 quando aumentou-se a concentração de butano! de 1 O para 20% e a

condutividade elétrica do meio de 4 para 1 O mS/cm, mantendo-se os mesmos

valores de pH, concentração de CTAB e concentração de hexano!. Em ambos os

casos, a recuperação foi beneficiada com o aumento da concentração de butano! no

sistema. Uma vez que o papel desta substância no sistema é a de um segundo co-

solvente, tal comportamento era esperado, visto que os co-solventes são

freqüentemente adicionados aos sistemas de micelas reversas formadas por agentes

tensoativos catiônicos para aumentar o tamanho das micelas reversas (KREI &

HUSTEDT, 1992).

Conclui-se, portanto, existirem diferentes combinações de variáveis

interferindo no processo de extração de p-xilosidase por micelas reversas de CTAB.

Em função disso, conclui-se que é recomendável a utilização de um planejamento

77


estatístico para análise dos resultados uma vez que a análise direta dos dados seria

difícil.

Para que se pudesse explicar melhor os efeitos principais e as interações

significativas entre as variáveis avaliadas na extração da í3-xilosidase por micelas

reversas de CTAB, fez-se o teste t (Student). Observa-se que os fatores principais A

e E (pH e concentração de butano!, respectivamente) são significativos; sendo que o

fator C (condutividade elétrica) não devem ser desconsiderado, pois juntamente com

o fator B, na interação BC, possui grande significância.

Na Tabela 5.15, encontra-se a análise da estimativa dos efeitos, erros-padrão

e teste t para as variáveis pH, concentração de CTAB, condutividade elétrica,

concentração de hexano! e concentração de butano!.

Tabela 5.15 - Estimativa dos Efeitos, Erros-padrão e teste t (Student) para os parâmetros Estudados na Recuperação da í3-xilosidase por Micelas Reversas de CTAB

Efeitos Estimativas Erros-padrão t ....... -=--- .. - ...........

Média 11,68* +/-1,430 8, 17* A (pH) 20,26* +/-3, 117 6,50* B (Cone. Tensoativo) 7,50 +/-3, 117 2,41 ** e (Condutividade Elétrica) -4,61 +/-3, 117 1,48 D (Cone. Hexanol) 3,53 +/-3, 117 1, 13 E (Conc.Butanol) 8,86 +/-3, 117 2,84** AB 10,32* +/-3, 117 3,31* AC -4,61 +/-3, 117 1,48 AD 2,79 +/-3, 117 0,89 AE 10,92* +/-3, 117 3,50* BC -9,77 +/-3, 117 3,14 BD -1, 17 +/-3, 117 0,37 BE 7,88 +/-3, 117 2,52** CD 3,51 +/-3, 117 1, 12 CE -1,02 +/-3, 117 0,32 DE -9, 17 +/-3, 117 2,95**

*significativo ao nível de 95% de confiança Valor de t para 95% de confiança com 3 GL (t=3, 182) *significativo ao nível de 90% de confiança Valor de t para 90% de confiança com 3 GL (t=2,353)

78


Como pode ser visto na Tabela 5.15, os maiores efeitos principais observados

para a recuperação da enzima foram os das variáveis pH e concentração de butano!,

que apresentaram estimativas de (+20,26) e (+8,86), respectivamente. Observa-se

ainda efeito interativo, ao nível de 90% de significância, entre as variáveis AB com

estimativas de (+10,32) e BC de (-9,77). A interação AB, por apresentar sinal

positivo, significa que os valores de recuperação da enzima 13-xilosidase por micelas

reversas de CTAB, serão melhorados com a condução do processo em maiores

valores de pH e concentração de tensoativo, ou seja pH 8,0 e 0,2 M,

respectivamente. Este fato confirma a hipótese da atuação da atração eletrostática

entre as moléculas do tensoativo e a proteína, como sendo a força motriz para

transferência da enzima para o interior das micelas (LUISI, et el., 1989). Neste caso

a utilização da concentração de CTAB em seu valor máximo de 0,2 M, foi necessária

para obtenção de micelas maiores e em maior número, capazes de englobar maior

quantidade de enzima. Com relação à interação de sinal negativo, BC, significa que

os valores da variável resposta, recuperação, são melhorados quando se utilizar nos

ensaios os maiores valores para concentração de tensoativo (análogo a interação

AB) e menores para condutividade elétrica, ou seja 4 mS/cm.

Assim, uma vez identificadas as variáveis que influenciam significativamente o

processo de extração de !3-xilosidase por micelas reversas de CT AB, foram

elaboradas as superfícies de resposta com as interações significativas (5.7a a 5.7e).

79


Figura 5.7a - Recuperação da f3-xilosidase por micelas reversas em função do pH e da concentração de CTAB, usando, condutividade elétrica de 7,0mS/cm, 7 ,5% de hexanol e 15% de butanol.

,' -· . ~_..,

Figura 5. 7b - Recuperação da f3-xilosidase por micelas reversas em função do pH e da concentração de butano 1, usando CT AB O, 15M, 7 ,OmS/cm e 7 ,5% de hexanol.

80


Figura 5.7c - Recuperação da f3-xilosidase por micelas reversas em função da condutividade elétrica e da concentração de CT AB, usando pH 5,5, 7 ,O mS/cm e 7 ,5% de hexano 1.

Figura 5.7d - Recuperação da f3-xilosidase por micelas reversas em função da concentração de CT AB e da concentração de butano 1, usando pH 5,5, 7,0mS/cm e 7,5% de hexanol.

81


Figura 5. 7e - Recuperação da J3-xilosidase por micelas reversas em função da concentração de hexanol e da concentração de butanol, usando pH 5,5, 7,0mS/cm e CTAB 0,15M.

Após seleção dos fatores e interações significativos, num intervalo de

confiança superior a 90%, conduziu-se a análise de variância do modelo (ANOVA).

Na Tabela 5. 16, encontram-se os parâmetros analisados para as variáveis e

interações significativas para o processo estudado.

82


Tabela 5.16 - Parâmetros de Análise de Variância para os Efeitos Significativos ao Processo de Extração de [3-xilosidase por Micelas Reversas de CT AB

Efeitos SQ GL MQ F p

A (pH) 1642,48 1 1642,48 218,49 0,004*

B (Cone. Tensoativo) 225,53 1 225,53 30,00 0,032*

E (Conc.Butanol) 313,91 1 313,91 41,76 0,023*

AB 426,32 1 426,32 56,71 0,017*

AE 477,31 1 477,31 63,50 0,015*

BC 382, 11 1 382, 11 50,83 0,019*

BE 248,30 1 248,30 33,03 0,029*

DE 336,26 1 336,26 44,73 0,021 *

Falta de Ajuste 411,98 8 51,50 6,85 0,133

Erro Puro 15,04 2 7,52

Total 4479,23 18 *significativo ao nível de 95% de confiança

GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática R2 = 0,905

As superfícies de resposta das interações significativas entre as variáveis

avaliadas no planejamento experimental para extração de í3-xilosidase por sistema

de micelas reversas de CT AB permitem visualizar que os valores de recuperação

são aumentados quando se utiliza o nível superior para CTAB (+1),

independentemente das outras variáveis. Na Figura 5. 7a, na interação da variável

concentração de CTAB com a variável pH os melhores valores de recuperação são

obtidos com uso destas variáveis em seu nível superior (+1). Tal fato evidencia mais

uma vez, que as forças agindo no processo de extração são governadas por

interações eletrostáticas (pH de extração>pI da enzima) e que também a enzima í3-

xilosidase é extraída da fase aquosa para o interior da micela reversa, com o auxílio

de micelas reversas que possuem tamanho e quantidade suficiente para englobar a

enzima. Desta forma, se justifica o uso de concentração superior de tensoativo.

83


A concentração de butanol (E) também apresentou efeito principal significativo

(estimativa de 8,86) sobre a recuperação da enzima, sugerindo que o aumento de

sua concentração promove um aumento no valor da variável resposta. Foi

constatada ainda a existência de interações significativas da variável butanol com pH

e CTAB (Figura 5.7b e 5.7d), novamente sugerindo melhora nos valores de

recuperação da enzima estudada com o uso de pH e concentração de butanol em

seus níveis superiores 8,0 e 20%, respectivamente. Micelas reversas formadas a

partir de tensoativos catiônicos, no geral, apresentam pequenos diâmetros, sendo

necessário o uso de co-solventes que auxiliam a formação do núcleo interno destas

micelas reversa. Eles agem como soluções salinas, provocando uma repulsão entre

as partes hidrofóbicas do tensoativo e aumentando o tamanho das micelas reversas.

No caso a p-xilosidase que é uma enzima com massa molar da ordem de 1 OOkDa,

necessita-se de micelas reversas de raios maiores (aproximadamente 5nm) (KREI &

HUSTEDT, 1992; KREI & HUSTEDT, 1989).

A Figura 5. 7c apresenta a superfície de resposta referente à interação entre

condutividade elétrica (C) e da concentração de CTAB. Verifica-se um aumento na

variável resposta com o aumento da concentração de CTAB e com a diminuição da

condutividade elétrica. Estes resultados estão de acordo com a literatura, pois

elevada condutividade, ou seja, elevadas concentrações salinas, poderiam provocar

o rompimento das formações micelares e ainda dificultar o processo de reextração

da enzima. (PESSOA JR & VITOLO, 1999; KREI & HUSTEDT, 1992).

Com relação à interação entre a concentração dos co-solventes, hexano! e

butanol (DE), observa-se, na Figura 5.7e, a existência de efeito antagônico entre

eles. Ou seja, para que seja favorecida a extração da enzima p-xilosidase por

micelas reversas de CT AB nas condições averiguadas, deve-se optar pelo uso de

um dos co-solventes em seu nível superior (+1) e do outro em seu nível inferior (-1).

No entanto, nota-se que, para esta interação, houve um aumento maior na

recuperação da enzima com o aumento da concentração de butanol. Assim, o uso da

variável concentração de butanol em seu nível superior (20%), em detrimento do uso

do hexanol, o qual deve ser usado em seu nível inferior (5%), aumentariam o valor

84


da recuperação da enzima em cerca de 45% (a recuperação passaria de 20% para

29%).

A validade do modelo linear foi verificada pela análise de variância de

regressão para o modelo. Na Tabela 5.17 é apresentado o teste F para o modelo.

Tabela 5.17 - Análise de variância de regressão para o modelo representativo do processo de extração de P-xilosidase por micelas reversas de CTAB, na região em estudo

Causa de SQ GL MQ F

Variação

Modelo 4052,22 8 506,53 11,86

Erro 427,02 10 42,70

Total 4479,24 18

R = 0,905 GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática

Analisando a Tabela 5.17 verifica-se que todos os fatores são significativos a

5% de probabilidade. Através do teste F, ou seja, comparando-se o valor de F do

modelo (F=11,86) com o valor de Ftabelacto (Ftab=3,35) fica evidente a significância do

modelo.

Com base nos resultados discutidos até o momento, foi possível obter uma

equação para o modelo linear, tendo a finalidade de descrever a extração da enzima

p-xilosidase por micelas reversas de CTAB, para região em estudo, (Equação 5.3):

Y = 11,69 + 10,13A + 3,758 + 4,43E + 5,16AB + 5,46AE • 4,89BC - 3,94BE - 4,58DE

Onde: Y = recuperação da enzima (%)

A=pH;

B = CTAB;

C = Condutividade elétrica;

D= Concentração de hexano!;

E = Concentração de butanol.

Equação 5.3

85


Para validação do modelo, o qual prevê valores de recuperação de 44%,

foram realizados experimentos no ponto indicado pela análise estatística: pH 8,0,

concentração de CTAB 0,2 M, condutividade elétrica 4mS/cm, concentração de

hexanol de 5% e concentração de butanol 20%. O resultado médio alcançado foi de

38, 7 % de recuperação para enzima !3-xilosidase, mostrando a adequação do modelo

aos resultados experimentais.

5.4.1 • Otimização do Processo de Extração por Mice/as Reversas de CTAB em lsooctano, Hexano/ e Butano/

Tendo em vista as constatações feitas anteriormente, o passo seguinte para

buscar a otimização do processo de extração de 13-xilosidase por micelas reversas de

CTAB foi a busca de uma região ótima obtida com o uso da metodologia de

superfície de resposta. Esta metodologia prevê o deslocamento da região analisada

através do uso de um planejamento na região vizinha.

Neste caso, para buscar-se a otimização do processo de recuperação da

enzima 13-xilosidase por micelas reversas de CTAB, propôs-se primeiramente um

passo ascendente, com o intuito de se definir a nova região a ser estudada.

Devido às limitações da enzima quanto ao pH de solubilização, tal variável foi

fixada em seu nível superior (pH 8,0).

Desta forma, foram alterados os níveis e valores, segundo um passo

ascendente os fatores: concentração de CT AB e concentração de Butanol. Na

Tabela 5.18 encontram-se os novos valores utilizados e os rendimentos de

recuperação obtidos.

86


Tabela 5.18 - Níveis Codificados e Valores Utilizados na Realização dos Ensaios do Passo Ascendente no Processo de Extração de f3-xilosidase por Micelas Reversas de CTAB

Valores Recuperação(%)

CTAB (M) Butanol (%)

0,2

0,225

0,25

0,30

20,9

23,8

26,8

32,7

38,6

31,8

45,74

18,6

Após a definição da nova região optou-se por utilizar um planejamento em

estrela, uma vez que este é mais abrangente que o de face centrada, podendo ser

portanto, mais eficiente na procura da resposta otimizada.

Assim, um planejamento ortogonal 22 completo com 03 repetições no ponto

central (a=1,41) foi utilizado. A distribuição ortogonal resultante deste planejamento,

consiste da agregação ao planejamento já existente um outro, idêntico, porém com

inclinação de 45° em relação à orientação de partida (Figura 5.8).

+21'2

+1

o

-1 -21'2

-·· r_·_-_._._._. : ~----------.-.i ,,r ~~~~

•. l • i .•

-, 1:::::,.,:- .... _/::::1·· .,.. -21'2 -1 o +1 +21'2

Figura 5.8 - Esboço do Planejamento em Estrela Ortogonal.

87


Na Tabela 5.19 encontra-se a planilha com os valores das variáveis:

concentração de CTAB e concentração de butanol, utilizados segundo o

planejamento proposto acima, bem como os valores de recuperação da enzima

J3-xilosidase extraída por micelas reversas do agente tensoativo CTAB em isooctano,

hexano! e butano!.

Tabela 5.19 - Planejamento Ortogonal Completo 22 com 03 Repetições no Ponto Central para Estudo da Influência da Concentração de CTAB e da Concentração de Butanol, na Recuperação de J3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico CTAB

Variável Codificada Variável Ensaio nº Recuperação

CTAB (M) Butano! (%) CTAB (M) Butano! (%) (%)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

-1 -1

-1

o o o

o o o o o

O, 15

0,35

O, 15

0,35

0,25

0,25

0,39

O, 11

0,25

0,25

0,25

15

15

39

39

44

10

27 27 27 27 27

21,8

0,0

16,5

17,4

2,6

0,0

0,0

24,2

45,74

42,10

39,2

- ·- +1

-1 +1

+1

o o

+1 +21/2

-i'2

Como pode ser visualizado na Tabela 5.19, resultados de recuperação nulos

foram obtidos quando empregados no processo de extração os seguintes níveis para

as variáveis CTAB e butanol, respectivamente: +1 e -1 (ensaio 02), o e -2112 (ensaio

88


06), +i12 e O (ensaio 07) Observa-se que tais ensaios têm em comum a utilização de

nível mais elevado para o CTAB (A) em detrimento do butanol (B). Assim conclui-se

que a concentração do tensoativo, nos três casos, é excessiva para concentração de

butanol presente, ocasionando provavelmente desaparecimento da fase micelar, que

existe numa determinada região de equilíbrio para os diferentes componentes que

formam o sistema. A Figura 2.9 (Revisão Bibliográfica) ilustra as mudanças ocorridas

nos sistemas micelares quando da modificação das proporções entre seus

componentes. No entanto, tal fato somente poderia ser confirmado com a utilização

do diagrama de fases dos componentes do sistema: CT AB, isooctano, hexanol e

butanol. Porém este diagrama não encontra-se disponível na literatura.

Por outro lado, nas extrações realizadas nas condições definidas pelo ponto

central (CTAB 0,25 e 27% de Butanol) a recuperação da enzima í3-xilosidase

alcançou valores médios de 40%. Isto sugere a existência de efeitos quadráticos

para ambas as variáveis avaliadas (CTAB e butanol), e que o ponto máximo de

recuperação encontra-se na região estudada.

Quando utiliza-se tensoativos catiônicos, o transporte de enzimas para o

interior das micelas reversas é favorecido quando estas possuem carga elétrica

negativa, o que é alcançado com o uso de valores de pH superiores ao pi da enzima

(pi í3-xilosidase entre 4,9 e 6,0). Portanto espera-se que com o uso de agentes

tensoativos catiônicos a enzima migre para o interior das micelas reversas quando o

pH do meio é superior ao seu pi. Nos ensaios em análise usou-se pH 8,0, tendo sido

portanto, a transferência da enzima para a fase micelar governada por interações

eletrostáticas. Desta forma, o uso de concentrações elevadas de CT AB se faz

necessário de modo a se obter micelas maiores, capazes de englobar a í3-xilosidase

(100kDa).

A análise de variância para os parâmetros estudados encontra-se na Tabela

5.20.

89


Tabela 5.20 - Parâmetros de Análise de Variância para os Efeitos Significativos ao Processo de Extração de (3-xilosidase por Micelas Reversas de CTAB

Causa de SQ GL MQ F p

Variação

pH (A) 75,50 1 75,50 7,03 O, 117 CTAB (B) 268,24 1 268,24 24,98 0,037*

AB 128,82 1 128,82 12,00 0,074*

AA 1978,32 1 1978,32 184,23 0,005*

BB 1001,47 1 1001,47 93,26 0,011 *

Falta de Ajuste 202,67 3 67,56 6,29 0,140

Erro Puro 21,48 2 10,74

Total 3052,30 10 R2=0,93 *95% de significãncia GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática

Observa-se, que o modelo não possui falta de ajuste significativo para o

intervalo de confiança considerado e que existe interação quadrática (AA e BB)

significativa entre os parâmetros avaliados. Assim, os parâmetros de um modelo de

segunda ordem (quadrático) usados para estimar a porcentagem da enzima

recuperada em função do CT AB e butanol foram obtidos através da análise de

regressões múltiplas, mostrada na Tabela 5.21.

Tabela 5.21 - Variáveis, Coeficientes, Teste t (Student), Valores de p do Planejamento Completo Ortogonal 22 com 03 Repetições no Ponto Central para Extração de (3-xilosidase por Micelas Reversas de CTAB

Variáveis Coeficientes t p

Média 42,35 10,97 <0,005 CTAB (A) -3,07 -0,65 O, 12

Butano! (B) 5,79 1,22 0,03 AB 5,67 0,84 0,07 AA -18,72 -3,32 0,005 BB -13,32 -2,36 0,01

90


A significância estatística do modelo (Tabela 5.22) foi avaliada pelo teste F e

revelou que esta regressão é estatisticamente significativa (Fmode1o>Ftabelado=5,05). O

modelo não apresenta falta de ajuste e o coeficiente de determinação (R2 = 0,93)

indica que 93% das variações na recuperação da enzima por este sistema podem

ser explicadas pelo modelo.

Tabela 5.22 - Parâmetros da Análise de Variância (ANOVA) dos Fatores Significativos ao Processo de Extração de J3-xilosidase por Micelas Reversas de CTAB

Fonte de SQ GL MQ F Variação Modelo 3452,35 5 690,47 15,40

Erro 224, 15 5 44,83

Total 3676,50 10

GL=graus de liberdade, SQ=soma quadrática, MQ=média quadrática

Assim, um modelo matemático que represente a recuperação de !3-xilosidase

por micelas reversas de CTAB (em isooctano e hexanol), pode ser expresso pela

Equação 5.4:

Y = 42,35-3,07A + 5,798 + 5,67A8-18,72A2 -13,3282 Equação 5.4

Onde: Y = recuperação da enzima(%);

A = concentração de CTAB;

B = concentração de Butano!.

O máximo valor de recuperação de J3-xilosidase, 43%, corresponde ao ponto

definido pela concentração de CTAB igual a 0,26 M (A = -0,05) e concentração de

butanol de 29,4% (B = 0,2). A Figura 5.9 corresponde à superfície de resposta obtida

usando os valores ótimos previstos para as variáveis.

Ensaios nas condições ótimas previstas, foram feitos com o intuito de se

validar o modelo. O valor médio obtido para a recuperação foi de 44,3%, confirmando

assim o valor previsto pelo modelo que foi de 43%.

91


Figura 5.9 - Superfície de Resposta Descrita pelo Modelo da Equação 5.4, que Representa a Extração em Condições Otimizadas de f3-xilosidase por Micelas Reversas do Agente Tensoativo Catiônico CTAB em lsooctano, Hexanol e Butanol.

A extração da enzima f3-xilosidase por micelas reversas de CTAB, nas

condições otimizadas previstas pelo modelo obtido, proporcionou um aumento de

pureza de 5,34 vezes para a enzima extraída para FAII (em relação ao precipitado

solubilizado), como pode ser visto na Tabela 5.23.

Tabela 5.23 - Aumento de Pureza para Enzima f3-xilosidase

Atividade Específica U/mg

Ae ( após a extração) Ae ( antes da extração)

21,58 4,04

Ap 5,34 Ae = atividade específica; Ap = aumento de pureza

Os resultados mostram mais uma vez ser possível, com a utilização de um

método simples a extração por micelas reversas, o isolamento de enzimas de

92


interesse, sem o inconveniente das várias etapas utilizadas nos processos

convencionais.

5.4.2- Determinação do Raio Mice/ar

Foi determinado o raio das micelas reversas no ponto de ótimo do

planejamento, utilizando as seguintes condições experimentais: pH 8,0,

concentração de hexanol 1 O %, condutividade elétrica de 4 mS/cm, temperatura de

26ºC, concentração de CTAB de 0,26M e concentração de butanol de 29,4%.

Na Tabela 5.24 encontram-se os raios micelares obtidos. O raio médio para as

micelas reversas formadas sob as condições experimentais anteriormente citadas. O

valor apresentado é superior a 5nm, valor indicado por KREI & HUSTEDT (1992)

para que uma proteína de 100 kDa possa ser englobada. Como a 13-Xilosidase

possui massa molar nesta ordem de grandeza (100kDa), o raio micelar permitiu o

englobamento da enzima contribuindo para o processo de extração da enzima, o que

reforça a existência de interações eletrostáticas agindo no processo de extração

desta enzima.

Tabela 5.24 - W0 e Rm Determinados na FAI E FAII Obtidas após Extração por Micelas Reversas de CT AB a 0,26M, com 10% de Hexanol e 29,4% de butanol, em pH 8,0, Condutividade Elétrica de 4 mS/cm, Temperatura de 26ºC

Fase da Extração Rm (nm)

FMI

FMII

85,13

11,00

13,95

1,80

Da mesma forma que o raio das micelas reversas presentes na FMI é suficiente para o englobamento da enzima, na FMII o valor de 1,80 nm mostra ser

improvável que a enzima {3-xilosidase possa estar contida no interior das micelas

reversas, indicando que o processo de reextração da enzima para a FAII foi

eficiente.

93


5.5 - EXTRAÇÃO DA ENZIMA (3-XILOSIDASE POR MICELAS REVERSAS DE BDBAC E CTAB, DIRETAMENTE DO MEIO FERMENTADO

Uma vez obtidas as condições otimizadas de extração da enzima f3-xilosidase

pré purificada por precipitação fracionada com etanol, utilizando micelas reversas de

BDBAC e CTAB, partiu-se para utilização dessas condições na condução da

extração da enzima diretamente do meio fermentado.

Tais experimentos visaram confirmar a possibilidade do uso da extração por

micelas reversas como uma única etapa; uma vez que a cada etapa de DSP que se

adiciona ao processo de recuperação de um bioproduto, agrega-se custo ao produto

final devido às perdas inevitáveis em cada etapa e a conseqüente diminuição do

rendimento final, como pode ser observado na Figura 5.1 o.

% Final 100

20

Rendimento da Etapa 80

60

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nº de Etapas de DSP

Figura 5.10 - Efeito do Número de Etapas de DSP no Rendimento Final do Bioproduto (Adaptado de PESSOA JR., 1997).

Os resultados de extração da enzima (3-xilosidase diretamente do meio

fermentado constam da Tabela 5.25.

94


Tabela 5.25 - Comparação entre a Porcentagem de Recuperação da Extração por Micelas Reversas de BDBAC e CT AB de f3-xilosidase sem Precipitação e com Precipitação por Etanol

Recuperação Recuperação Tensoativo Condições de Extração % %

sem precipitação com precipitação

Concentração de Tensoativo = 0,2M

Concentração de Hexano! = 10% 43 BDBAC 8,5

Temperatura= 24ºC

pH 3,3

Concentração de Tensoativo = 0,26M

Concentração de Hexano! = 10% 44,3 CTAB Concentração de Butano! = 29 ,4 % 35

(aproximadamente) Temperatura= 26ºC pH 8,0

Nos ensaios realizados sem prévia precipitação com etanol, não foi possível

incluir a variável condutividade elétrica em seu nível previsto nos modelos

otimizados, ou seja, em 4,0 mS/cm. Como objetivava-se estudar a viabilidade do uso

da técnica de extração líquido-líquido por micelas reversas em uma única etapa de

DSP, não fez-se a diálise da amostra contendo 13-xilosidase. Assim, a condutividade

elétrica utilizada nestes ensaios foi de 14,98 mS/cm.

A elevada condutividade elétrica do meio, apresenta-se como um obstáculo à

extração de f3-xilosidase por micelas reversas de BDBAC. Como anteriormente

proposto, a extração desta enzima no sistema formado por este agente tensoativo

catiônico ocorre via interações hidrofóbicas. Ao que tudo indica, a elevada

concentração de íons em solução promove o enfraquecimento destas forças inibindo

a extração da enzima, pois grande parte da atividade enzimática é encontrada na

FAI, ou seja, não foi transferida para o interior das micelas reversas.

Por outro lado, os resultados de recuperação da enzima 13-xilosidase por

micelas reversas formadas a partir do agente tensoativo CTAB, mostraram ser

possível a utilização da técnica de extração por micelas reversas em uma única

95


etapa. Os resultados alcançados para o sistema sem pré purificação da enzima

(35%) são semelhantes aos obtidos com a prévia precipitação com etanol (da ordem

de 40%). Para este sistema, a condutividade elétrica do meio não interferiu no

processo de extração. Esta "imunidade" do sistema micelar à elevada condutividade

elétrica pode ser ocasionada pela elevada concentração de solventes na

microemulsão, que auxiliam na formação do centro micelar com maiores diâmetros

(HATION, 1989). Assim extrações governadas por interações eletrostáticas (como no

caso do CTAB), não seriam influenciados pela força iônica da fase aquosa inicial,

uma vez que o diâmetro do núcleo interno da micela obtida com o uso de dois co-

solventes (hexano! e butano!) seria suficiente para o englobamento da enzima.

96

Conclusões

6 • CONCLUSÕES

Os resultados alcançados no presente trabalho, levaram às conclusões que se

seguem:

1. A enzima (3-xilosidase produzida pelo fungo P. janthinellum apresentou, nas

condições averiguadas na presente dissertação, estabilidade frente à estocagem

sob refrigeração a -4ºC e 4°C, na faixa ampla de pH de 3,0 a 7,0, por 96 dias.

2. Para as condições de extração por micelas reversas estudadas no presente

trabalho, os agentes tensoativos catiônicos BDBAC e CT AB, promovem

resultados satisfatórios de recuperação (em atividade) para a enzima í3-xilosidase.

No entanto o agente tensoativo aniônico AOT (em isooctano), não mostrou-se

efetivo ao processo nas condições averiguadas: concentração de 0, 1 O a 0,2 M,

temperatura de 4° a 26ºC, condutividade elétrica de 4,0 a 10 mS/cm e pH de 3,0 a

9,0.

3. Com o uso do agente tensoativo BDBAC, construi-se um modelo matemático

otimizado, que prevê valores de recuperação para enzima í3-xilosidase de 42%,

sendo que nos ensaios para confirmação do modelo foi observado 43% de

recuperação.

4. Com a otimização do processo de extração de í3-xilosidase por micelas reversas

do agente tensoativo CT AB, o modelo obtido prevê valores de recuperação para

97

Conclusões

enzima de 43%, tal valor foi confirmado experimentalmente, onde se obteve

44,3% de recuperação.

5. O agente tensoativo catiônico CTAB, utilizado num dos sistemas de extração por

micelas reversas estudados no presente trabalho, ocasionou um aumento na

atividade específica da enzima de 260% maior que o com o uso do agente

tensoativo BDBAC.

6. Os resultados obtidos na extração de 13-xilosidase por micelas reversas do agente

tensoativo catiônico CT AB diretamente do meio fermentado, sem pré purificação

por etanol, mostrou mais uma vez ser este processo, viável para a extração direta

do meio fermentado, diminuindo portanto etapas dispendiosas de DSP.

7. As extrações feitas com o agente tensoativo CTAB mostraram que o efeito da

força iônica do meio sobre a extração da enzima !3-xilosidase é menor quando se

utiliza dois co-solventes (hexanol e butanol), pois a força iônica não afeta

significativamente o diâmetro interno da micela reversa.

8. Por tudo o que foi exposto acima, conclui-se portanto que a extração por micelas

reversas oferece uma alternativa para purificação de enzimas bastante

satisfatória: consiste de uma técnica de desenvolvimento simples, onde os

reagentes e equipamentos utilizados são comuns aos laboratórios.

98

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