EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO DESOXIRIBONUCLÉICO _DNA_CONDOEIRA,Silva
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CONDOEIRA
UNIVERSI
FDEP
EXTRACÇÃO
DESO
Estágio Laboratorial
Discente:
Docentes
ADE EDUARDO MO
CULDADE DE CIÊNCIASARTAMENTO DE QUIMICA
E QUANTIFICAÇÃO
IRIBONUCLÉICO (
CONDOEIRA, Silva Benedito
: Prof. Doutor Victor Skripet
dr. Jaime Cumbe
1
DLANE
DE ÁCIDO
NA)
Maputo, Abril de 2011
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I. RESUMO TEÓRIC
Os tripanossomas fazem pa
mamíferos, incluindo o hom
transmitido pela mosca tsé-ts
podem acarretar alterações he
A técnica de PCR (polymera
processo de replicação de D
termoestável isolada da bacté
Com a PCR, quantidades mín
em poucas horas, permitindo
infecciosas, cancro ou doença
Durante o PCR são usadas el
duas cadeias simples, permi
também em cadeia simples e
química. Para amplificar
complementares das sequênc
terminais 3', de modo a perm
complementar, usando como
amplificar (figura 1).
Para realizar PCR são nece
contendo a polimerase, prime
Figura 1: Processo de replicação
rte do grupo dos protozoários e podem inf
em. Trypanosoma vivax (género Trypan
é para ruminantes, ocasionando infecções
matológicas severas e mortalidade dos anima
se chain reaction - reacção de polimerase e
A. A chave para a PCR é a DNA Taq po
ia Thermus Aquaticus.
imas de material genético podem ser amplifi
a detecção rápida e fiável dos marcadores
s genéticas.
evadas temperaturas de forma a separar as
tindo então a ligação de oligonucleótidos
eralmente constituídos por 15 a 30 nucleóti
uma determinada região são necessár
ias que flanqueiam o fragmento de DNA
itir a actuação da DNA Taq polimerase dura
molde cada uma das duas cadeias simples c
ssárias pequenas quantidades do DNA al
rs, os quatro desoxinucleótidos constituinte
de DNA através da reacção de polimerase em cadeia
2
ctar insectos e vários
soma) é um parasita
gudas e crónicas, que
is.
cadeia) baseia-se no
limerase, uma enzima
adas milhões de vezes
genéticos de doenças
oléculas de DNA em
iniciadores ( primers),
os, obtidos por síntese
ios dois iniciadores
amplificar, nos seus
nte a síntese da cadeia
onstituintes do DNA a
o, um tampão salino
do DNA e o cofactor
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Mg2+. Esta mistura é submeti
que se repete um número esp
1) Desnaturação: (94-96
2) Hibridização ou An
hidrogénio ao DNA al
3) Extensão: (72ºC) amp
de cada cadeia molde,
Demonstração esquemática d
desnaturação, de annealing e
Normalmente são realizados
exponencial (2ciclos).
O resultado é analisado atrav
acordo com sua massa e sua cDurante a eletroforese, as pa
elétrica aplicada nele. Depen
migrar para o cátodo (+) ou
rapidamente que moléculas d
fará o DNA ou RNA "brilhar"
Figura 2: Demonstração esquem( (ºC) e tempo de desnat
da a vários ciclos de amplificação que cons
cífico de vezes:
ºC) de modo a separar as duas cadeias.
ealing: (50-65ºC) Associação dos inicia
vo em cadeia simples.
lificação dos iniciadores através da síntese d
catalisada pela DNA Taq polimerase.
programação no termociclador, indicando a
e extensão.
de 25 a 40 ciclos para cada reacção na qual
és de uma eletroforese em gel, que é a mig
arga, ela pode ser de agarose ou de poliacrilatículas se movem entre os poros do gel de
endo da carga das partículas que estão send
para o ânodo (-). Moléculas de menor m
e maior massa. Após a corrida, coloca-se
quando exposto ao UV.
tica da programação dos ciclos da PCR com temperatração, de anelamento e de extensão.
3
istem em três passos e
ores por ligações de
cadeia complementar
s temperaturas de
a taxa de replicação é
ração de partículas de
midaacordo com a corrente
o separadas, estas irão
assa irão migrar mais
rometo de etídio, que
ura
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4
1. Objectivos
Geral
Aplicar as técnicas básicas de biologia molecular na extracção e quantificação de
ácido desoxiribonucléico (DNA).
Aplicar as técnicas de diagnóstico da tripanossomose bovina baseada na reacção dePCR.
Específicos
A partir de uma amostra de sangue bovino existente fazer a extracção de DNA de
trypanossona vivax e quantificar por espectofotometria em um Nanodrop,
Aplicar a reacção de PCR na amplificação do DNA de trypanossona vivax colhida
da amostra de sangue bovino e diagnosticar esse DNA com base na electroforese
em gel de agarose.
2. PARTE EXPERIMENTAL
Nas tabelas abaixo estão representados os materiais, equipamentos e reagentes usados durante a
experiência
Tabela 1: Materiais e equipamentos
Materiais e Equipamentos
Centrifugadores Lamparina Microondas Geleira
Tubos Eppendorf Nanodrop Fluxo laminar Luvas
Balança Analítica Transiluminador UV Micropipetas e Pontas Tesoura
Termociclador iCycler BIORAD® Equipamentos de Electroforense
Tabela 2: reagentes usados
Reagentes
PBS Primers Chelex dNTPmix
PBS-Saponina PCR buffer TBE Dream Taq
Brometo de Etídio Agua destilada Agarose MgCl2
Tampão de carregamento (azul de bromofenol)
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II. EXTRACÇÃO DE D
1. Esterilizou-se uma
lamparina, e com el
pedaços (equivalente
papel de filtro conte
(Sangue Bovino co
Mangaze no dia
depositou-se num tub
2. Preparou-se e adiciocontendo a amostra e i
3. Após a incubação cent
papel de filtro, pois ne
Levou-se novamente a
4. Após a incubação cen
Após isto, adicionou-
maria por 10min a 95°
5. Centrifugou-se nova
mistura em três fases,
e a fase orgânica (fo
transferida para um no
Observações:
Durante o processo de extra
plasmáticas e nucleares de mpara remover o resto da sapon
do papel de filtro e o banho-
As soluções, assim obtidas, f
determinar se da amostra foi
ng/µL) o DNA extraído da a
NA NAS MANCHAS DE SANGUE EM P
tesoura, numa
a corta-se em
s a 1mm2) o
ndo a amostra
hido por M.
16.11.10) e
de centrífugo.
ou-se 1mL de PBS – Saponina a 0,5%ncubou-se a mistura durante 4h a 4°C
rifugou-se e descartou-se do tubo a parte liq
le estava contido o DNA, tendo-se adicionad
incubadora, por 1h.
rifugou-se durante 5min e descartou-se nov
e ao tubo 100µL de Chelex a 10% e levou-
C e sob agitação constante.
ente a mistura durante 5min a 1400rpm.
uma aquosa (contém o DNA a extrair), interf
rmada basicamente de lipideos). A fase aq
vo tubo.
ção, o complexo PBS – Saponina adiciona
do a expor o DNA do tripanossoma. O seguina não descartada. A adicção de Chelex ma
aria desnatura as proteínas.
oram levadas para o nanodrop (um espectr
-nos possível extrair o DNA, ou seja de m
ostra preparada.
Figura 2: Amostra de Sang
5
APEL DE FILTRO
o tubo de centrífugo
ida deixando apenas o
o depois 1mL de PBS.
mente a parte líquida.
e a mistura ao banho-
Houve separação da
ase (contém proteinas)
uosa foi descartada e
do quebra membranas
ndo PBS é adicionadoscara o DNA e o retira
fotometro) de modo a
odo a quantificar (em
ue Bovino
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III. ANALISE QUALIT
Quantificação de DNA n
1. Com o computador
programa ND-1000
opção Nucleic Acid.
2. Levantou-se o pe
sensores (superior e i
macio e depositou-
1,5µL de água desti
baixou-se o pedestaloperação.
3. Novamente levant
limpamo-los com pa
1,5µL de Blank, b
seleccionou-se a opç
diálogo. Após esta
pedestai e limpou-se
4. Depositou-se 1,5µL
se o pedestal, preenc
opção MESURE. Ter
amostras e duas veze
5. Terminada as analise
de DNA na amostra,
Tabela 3: Registo de concentraç
Amostras ng/µ
1M"- Preto 33,9
2M"- Preto 39,9
3M"- Preto -1,33
1M"- Azul 46,3
2M"- Azul 62,5
H2O -0,05H2O 0,46
Depois da quantificação, cons
TIVA E QUANTITATIVA DOS ÁCIDO
o Nanodrop
activado, activou-se o
3.7 e seleccionou-se a
estal, limpou-se os
nferior) com um papel
e, no sensor inferior,
lada até formar bolha;
e esperou-se o fim da
u-se o pedestal e
el macio. Depositou-se
ixou-se o pedestal e
ão Blank na janela de
peração levantou-se o
s dois sensores (superior e inferior).
a amostra preparada na secção anterior no s
eu-se o SAMPLE ID com códigos da amos
minada a operação, procedeu-se do mesmo
com a água.
s limpou-se os pedestais e registou-se os va
bsorvância e Ratio, conforme mostra a tabe
es e Absorvância de ADN extraído da amostra
l A260 A280 A
0,68 0,958
0,799 1,14
-0,027 -0,132
0,927 1,316
1,252 1,696
-0,001 -0,0020,009 0,013
ervou-se a amostra de DNA extraído a 4°C.
Figura 3: Nanod
6
NUCLÉICOS
nsor inferior, baixou-
tra e seleccionou-se a
odo para as restantes
lores da concentração
la a seguir:
260 /A280
0,71
0,7
0,2
0,7
0,74
0,660,72
rop (ND)
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IV. REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Para a realização da reacção de polimerase em cadeia (PCR), preparou-se num fluxo laminar amistura de reacção (master mix) com os componentes da tabela abaixo em um tubo de eppendorf
de volume equivalente a 0,5mL:
Tabela 4: Componentes usados para a mistura de reacção
Componente (Conc, stock) Conc. Final µL/reacção Vtotal (µL)x10
PCR buffer (10x) 1x 2 20
MgCl2 (25mM) 2,5mM 2 20
dNTP-mix (10mM) 0,5mM 1 10
Primer PGP-Fw (10µM) 0,25 µM 0,5 5
Primer PGP-Rv (10µM) 0,25 µM 0,5 5
Dream Taq (5U/µL) 0,5 µ/µl 0,25 2,5
H2O detilada # 12,75 127,5
DNA # 1 µL 10 µL
Volume Total 20 µL 200 µL
Da solução master mix preparada foi retirado sucessivamente 20µL para 10 tubos de eppendorf.
Esses tubos, foram posteriormente levados a um termociclador, onde ocorre a reacção de PCR
propriamente dita. As condições de reacção de PCR estão representadas na tabela abaixo:
Tabela 5: Condições de Reacção
Etapa Objectivo Temperatura Temo N° de ciclos
1 Desnaturação inicial 94°C 5min
2 Desnaturação 94°C 40s3 Pareamento ou anneling 65°C 40s 38
4 Extensão 72°C 90s
5 Extensão final 72°C 10min
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V. ELECTROFORESE
1.
Preparou-se a cubpara se depositar o
2. Preparou-se o gel
arrefecer até 50%.
3. Adicionou-se bro
deixou-se até poli
4. Após a polimeriz
certo volume de ta
5. Misturou-se 2µL
permitir o acomp
master mix e o D
6. Retirou-se pequen
diferentes poros d
7. Conectou-se os el
durante 20min.
8. Terminada a corri
ultravioleta confor
Figura 4: Visualização
EM GEL DE AGAROSE
a de alectroforese e colocou-se os pentes ds componentes a analisar,
de agarose (a preparação está na pagina e
eto de etídio, verteu-se a mistura na cu
erizar.
ção retirou-se o pente e mergulhou-se a cu
mpão de corrida.
e tampão de carregamento, de modo a adici
nhamento da corrida, para cada um dos 10
A extraído.
as quantidades, em cada tubo, da mistura e
gel.
ctrodos a fonte e submeteu-se as amostras
a, retirou-se a tina contendo gel e observou
me mostra a figura a seguir:
de bandas de DNA em electroforese de gel de a
8
e modo a fazer poros
m anexo) e deixou-se
ba de electroforese e
ba numa tina com um
onar cor as amostras e
tubos que continha o
5 e depositou-se nos
a uma corrida a 100V
-se no transiluminador
arose
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VI. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
A tabela 3 apresenta as concentrações de DNA e as relações de absorbância em 260 e 280 nmobtida das amostras de coágulo sanguíneo extraidos em bovinos, após análise
espectrofotométrica no Nanodrop. Como se observa, as amostras de DNA obtidas apresentam
um garu de pureza relativamente proximo do ideal, com excepção da amostra 3M"- preto que
apresenta um valor muito equidistante.
Estes valores indicam que o DNA extraidos estão, de certa forma, contaminadas por proteinas
visto que a razão A260 /A280 está, de certo modo, abaixo de 1,44 a 1,90 que indicam amostras com
alto grau de pureza.
Nota: Todos os cálculos relativos a preparação das soluções estão na folha em anexo.
A avaliação do DNA extraído em electrforese em gel de agarose não mostrou existências de
DNA do tripanossoma vivax no DNA genômico extraido das amostras de coágulos sanguíneos
bovinos, entretanto, este resultado leva-nos a duas possiveis análise:
1)
Durante o processo de extracção de DNA pode ter ocorrido uma inibição promovidapelo Chelex que conjuntamente com o DNA teria sido tranferido para o novo tubo
durante o processo descrito em 5 na extração de DNA ou pelas proteinas que não
foram desnaturadas nem pelo processo de desnaturação em banho-maria. Estes
provavelmente se teriam acoplado/reagido com master mix inibindo o processo de
amplificação na reacção de PCR.
2) Durante a reacção de PCR não ocorreu a amplificação do DNA do tripanossoma
vivax pelo facto de a amostra analisada não o conter, ou seja, o coágulo de sanguebovino analisado não apresenta nenhum grau de contaminação pela tripanossomose.
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VII. CONCLUSÃO
As análises colocadas na discussão dos resultados não indicam que a experiência não tenha de
melhor forma, nem ainda, que não se tenha atingido os objectivos preconizados, porém suscinta
que as experiências deste género sejam repetidas por duas ou mais vezes para que não se tenha
resultados ambíguos e ainda para que cada resultado das experiências se sustentem entre si dando
mais credibilidade aos resultados. Não obstante, nesta experiencia foi-nos possível aplicar as
técnicas básicas de biologia molecular na extracção e quantificação de ácido desoxiribonucléico
(DNA), aplicar a reacção de polimerase em cadeia (PCR) na amplicação de uma quantidade
mínima de um material genético e com base na electroforese em gel de agarose fazer o seu
diagnóstico.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
1)
McMurry, John, Organic Chemistry, Thomson –Brooks/Cole, 7 Edition, 2008, USA,p.p. 1117 – 1118.
2) Anónimo 2, Tripanossoma, http://pt.wikipedia.org/wiki/Tripanossoma, consultado no dia
17.03.2011
3) Anónimo 1, PCR - Amplificação de DNA in vitro, http://www.e-
escola.pt/topico.asp?hid=339, consultado no dia 17.03.2011
4) Anónimo 3, Eletroforese em Gel, http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel,
consultado no dia 21.03.2011
5) Anónimo 4, Electroforese,
http://www.sabedoria.ebrasil.net/db/biologia/estudos/biologia/biologiag/eletroforese.php.
htm, consultado no dia 24.03.2011
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ANEXO
1. Preparação da solução de PBS 1x
Foi-nos dado uma solução tampão de PBS 10x e tínhamos que prepara-la a 1x num copo
de 50mL
PBS (10x) PBS (1x) em 50mL
Usando a lei de diluição tem-se: . = .
=
= 5
Foram tomados 5mL da solução tampão de PBS (pH = 6,89) a 10x para se
preparar uma solução 1x. O volume foi completado com água destilada.
2. Preparação de PBS – Saponina a 0,5%
Quantidade de saponina a pesar para preparar a solução de PBS – Saponina a 0,5% a
partir da solução anterior.
1 100 1%
0,25 25 1%
0,5%
= 0,125
Pesado 0,125g de saponina, dissolveu-se na solução de PBS 1x preparado
anteriormente, obtendo-se assim PBS – Saponina a 0,5%
3. Preparação da solução de Chelex a 10%
Massa de Chelex a pesar para prepara-lo a 10% num volume de 5mL
Tem-se que: % ℎ = 10 % =
çã100
çã = 5 logo
=? = 0,5
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12
Em uma balanca analítica, pesou-se 0,5g de Chelex e com ajuda de micro pipeta
adicionou-se 5ml de agua destilda.
4. Preparação de Gel de Agarose (1%)
Massa de agarose a pesar para preparar o gel a 1% num volume de 5mL
Tem-se que: % = 1 % =
çã100
çã = 50 logo
=? = 0,5
Pesou-se 0,5g de agarose e dissolveu-se em 50mL de TBE (1x), colocou-se a solução no
microondas de modo que a solução se solubilizasse completamente.
Deixou-se a mistura arrefecer por uns minutos de modo que o gel se polimerizasse e
adicionou-se depois 2,5µL de brometo de etídio (0,5µL por cada 10mL de solução).
5. Preparação de Tampão de Carregamento
Foi-nos dado o azul de bromofenol, um tampão de carregamento, a 6x e tinha que sepreparar uma solução a 1x num volume de 20µL.
Usando a lei de diluição tem-se: . = .
=
= 3,5 µ
Foram tomados 3,5µL da solução tampão de carregamento a 6x para se preparar
uma solução de 1x.