influencia do teor de lignina, celulose e hemicelulose na densidade
Extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar ... · comprometimento fez com que esses...
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MICHEL BRIENZO
Extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar para produção de
xilo-oligossacarídeos
Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências do Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial na área de concentração: Microbiologia Aplicada.
Orientadora: Dra. Adriane M. F. Milagres
Lorena - SP 2010
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação Biblioteca “Cel. Luiz Sylvio Teixeira Leite”
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
Brienzo, Michel
Extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar para produção de xilo-oligossacarídeos / Michel Brienzo ; orientadora Adriane M. F. Milagres. – Lorena: 2010.
134 pág. : fig.
Tese (Doutor em Ciências – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial na Área de Microbiologia Aplicada) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo.
1. Xilo-oligossacarídeos 2. Hemicelulose 3. Thermoacus aurantiacus 4. Hidrólise
enzimática 5. Bioconversão 6. Endo-β-1,4-xilanase. I. Título 547.458 - CDU
Dedico esse trabalho:
A minha esposa Águeda; A minha avó Amélia;
Aos meus pais Diogo e Aparecida; Aos meus irmãos Gilmar, Gislaine e Ricardo;
A minha sobrinha Rayssa
Pelo carinho e incentivo
AGRADECIMENTOS
É com muita satisfação que agradeço:
A prof. Adriane pela oportunidade, orientação, confiança e ensinamentos, os quais
foram muito além desse trabalho. O seu interesse pela pesquisa, dedicação e
comprometimento fez com que esses anos de trabalho passassem de forma harmoniosa e
prazerosa.
Aos professores André Ferraz, George Rocha e Walter Carvalho pelos ensinamentos,
observações, comentários e sugestões, as quais contribuíram para o desenvolvimento desse
trabalho. Agradeço também pela irrestrita disponibilidade para conversar e discutir
problemas.
A todos os professores do Departamento de Biotecnologia que contribuíram através
das disciplinas para o ensinamento e desenvolvimento intelectual e científico.
A todos os funcionários do Departamento de Biotecnologia e do Programa de Pós-
Graduação, principalmente aos técnicos Djalma, Fabrício, Cibele, Jussara, José Carlos e
Bárbara, que de forma direta ou indireta contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho.
Aos amigos Celso, Daniela B., Daniela C., Débora, Fernanda, Germano, Hévila,
Jéssica, Joseana, Luiz Carlos, Márcio, Paula, Ricardo, Robson, Sérgio, Valdeir, Victor e todos
os colegas pela amizade e convívio. Em especial gostaria de agradecer as alunas de iniciação
científica Andressa e Thaianne, que além da amizade contribuíram para o desenvolvimento
desse trabalho.
Aos amigos, que de longe acompanham minha vida, Aline, Claudia, Dorival, Manoela,
Noeli, Fabrício, Peterson, Rose e Stivens e, também ao Sérgio, Celina e Érick.
A FAPESP pelo financiamento do projeto.
RESUMO
BRIENZO, M. Extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar para produção de xilo-oligossacarídeos. 2010. 137p. Tese (Doutorado em Ciências) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo – Lorena, 2010. Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis.
Palavras-chave: Xilo-oligossacarídeos. Hemicelulose. Thermoascus aurantiacus. Hidrólise enzimática. Bioconversão. Endo-β-1,4-xilanase.
ABSTRACT
BRIENZO, M. Extraction of hemicellulose from sugarcane bagasse for xylooligosaccharides production. 2010. 137p. Thesis (Doctoral of Science) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo – Lorena, 2010.
Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics. Keywordes: Xylooligosaccharides. Hemicellulose. Thermoascus aurantiacus. Enzymatic hydrolysis. Bioconversion. Endo-β-1,4-xylanase.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura da celulose (FENGEL; WEGENER, 1984). .............................................. 20Figura 2. Estrutura dos monossacarídeos da hemicelulose (FENGEL; WEGENER, 1984). ... 21Figura 3. A - Estrutura esquemática de hemicelulose (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2004),
B- estrutura representativa de L-arabino-(4-O-metil-D-glucurono)-D-xilana: 1- Xilopiranose; 2- L-arabinofuranose; 3- ácido 4-O-metil-glucurônico; 4- grupo acetil (McDOUGALL et al., 1993). ....................................................................................... 23
Figura 4. Álcoois precursores da lignina (FENGEL; WEGENER, 1984). .............................. 24Figura 5. Estruturas propostas para as diferentes ligações entre lignina e carboidratos
(adaptado: WATANABE, 2003). ................................................................................. 25Figura 6. Sequência de reações de degradação de lignina em meio alcalino (XIANG; LEE,
2000). ............................................................................................................................ 31Figura 7. Mecanismo oxidativo de clivagem de carboidratos por radicais hidroxilas (GUAY et
al., 2001). ...................................................................................................................... 32Figura 8. Mecanismo proposto para formação de celobiose por radicais hidroxilas a partir de
metil-β-celobiose (GUAY et al., 2001). ....................................................................... 32Figura 9. Thermoascus aurantiacus ATCC 204492. (A) Crescimento em ága-malte; (B) Hifas
e esporos; (C) Ascósporos; (D) Liberação dos esporos por rompimento do ascósporo. (ampliação de 400 vezes). ............................................................................................. 37
Figura 10. Representação esquemática dos procedimentos utilizados para separação dos constituintes principais do bagaço de cana-de-açúcar e extração alcalina da hemicelulose. ................................................................................................................ 53
Figura 11. Superfície de resposta mostrando o efeito do peróxido de hidrogênio (x2) e tempo de reação (x3) no rendimento de hemicelulose. ............................................................ 70
Figura 12. Superfície de resposta descrita pelo modelo linear para o teor de lignina residual na hemicelulose em função das variáveis significativas. .................................................. 72
Figura 13. Aspecto visual das hemiceluloses obtidas dos experimentos relativos ao planejamento 24 completo. ............................................................................................ 74
Figura 14. Espectro de FT-IR das hemiceluloses obtida por extração com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento experimental 24 completo). .................................................................... 76
Figura 15. Análise dos componentes principais do espectro de FT-IR da hemicelulose obtida com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento completo 24). ............................................................... 77
Figura 16. Valores de contrastes entre PC1 e PC2 do espectro de FT-IR das amostras de hemicelulose extraídas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino. ...................... 77
Figura 17: pH final do meio de cultivo de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei . .................... 79Figura 18. Produção de xilanase por A. niger, T. aurantiacus e T. reesei em meio sólido com
farelo de trigo (75 % umidade). .................................................................................... 80Figura 19. Produção de endoglucanase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com
farelo de trigo (75 % umidade). .................................................................................... 81Figura 20. Produção de β-xilosidase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com farelo
de trigo (75 % umidade). .............................................................................................. 82Figura 21. Atividades enzimáticas de T. aurantiacus detectadas no meio com xilose ( ),
xilobiose ( ) e HXSB. Atividade enzimática detectada nos cultivos: xilanase ( ), β-xilosidase ( ), endo-glucanase ( ), β-glucosidase ( ), arabinofuranosidase ( ). ........................................................................................... 84
Figura 22. Efeito do pH na atividade de xilanase de A niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo. ....................................................................................... 85
Figura 23. Efeito da temperatura na atividade de xilanase de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo. ............................................................................ 86
Figura 24. Estabilidade térmica a 50 e 60°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo. ........................................................................................................................ 87
Figura 25. Estabilidade térmica a 70°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo. .............................................................................................................................88
Figura 26. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de A. niger cultivado em farelo de trigo. .............................................................................................................................88
Figura 27. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de T. reesei cultivado em farelo de trigo. .............................................................................................................................89
Figura 28. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. aurantiacus em diferentes concentrações de substrato e enzima. ......................................................................................................................... 94
Figura 29. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. reesei em diferentes concentrações de substrato e enzima. .. 95
Figura 30. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas enzimas de T. aurantiacus. ........................................................................................... 96
Figura 31. Conversão total durante hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus. ................................................................................... 97
Figura 32. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose em XOs, obtido pela hidrólise com enzimas de T. aurantiacus. ............................................................................................................. 99
Figura 33. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas enzimas de T. reesei. .................................................................................................. 101
Figura 34. Conversão total durante a hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. reesei. .......................................................................................... 102
Figura 35. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose (2 – 5 %) em XOs, obtido pela hidrólise com extrato de T. reesei (60 – 100 U/g). ........................................................................... 105
Figura 36. Espectro de infravermelho das amostras de hemicelulose de bagaço e dos resíduos sólidos obtidos após hidrólise com enzimas de T. aurantiacus (60 U/g de xilanase, 2 % de hemicelulose por 96 h) e T. reesei (80 U/g de xilanase, 3,5% de hemicelulose por 6 h). 107
Figura 37: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de hemiceluloses de bagaço, bétula e semente de aveia por extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação. (1: padrões, 2: xilana do bagaço + 10 U/g endo-xilanase; 3: xilana do bagaço + 30 U/g endo-xilanase; 4: xilana bétula + 10 U/g endo-xilanase; 5: xilana bétula + 30 U/g; 6: xilana de semente de aveia + 10U/g endo-xilanase; 7: xilana de semente de aveia + 30 U/g endo-xilanase; 8: xilana do bagaço; 9: xilana bétula; 10: xilana de semente de aveia). ......................................................................................................................... 111
Figura 38: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus. (1: padrões; 2: ácido aldourônico; 3: hidrolisado com 3 h de reação; 4: 6 h; 5: 48 h; 6: 96 h; 7: extrato enzimático; 8: hemicelulose do bagaço). ................................................................... 112
Figura 39. Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de xilo-oligossacarideos (Amostra) obtidos da ação da xilanase de T. aurantiacus sobre a hemicelulose do bagaço. (1: padrões; 2: aldotetraurônico; 3: Amostra + endo-xilanase da família 5 (EX5); 4: Amostra + EX10; 5:Amostra + EX11; 6: Amostra + EX5 + β -xilosidase; 7: Amostra + EX10 + β-xilosidase; 8:Amostra + EX11 + β-xilosidase; 9: Amostra + β-xilosidase; 10: β-xilosidase). ................................................................ 112
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Planejamento fatorial completo 24 para avaliação do processo de extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar sob diferentes condições operacionais. . 54
Tabela 2- Planejamento fatorial completo 22 para avaliação da hidrólise enzimática da hemicelulose. .............................................................................................................. 59
Tabela 3- Composição química do bagaço de cana-de-açúcar. .................................................. 63Tabela 4- Composição do bagaço de cana-de-açúcar de diferentes procedências. ..................... 64Tabela 5- Rendimento de extração e composição da hemicelulose obtida com NaOH 1 M,
NaOH/AQ e NaOH/Sulfito a 25°C por 18 h. ............................................................. 65Tabela 6. Rendimento de hemicelulose (%) extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2
em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo. .................................... 67Tabela 7 - Significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o rendimento de extração de
hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino. ................. 68Tabela 8 - Significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o teor de lignina residual da
hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. ............................................................... 71Tabela 9- Análise de variância para os modelos estatísticos correspondentes às variáveis
respostas: rendimento de extração e lignina residual da hemicelulose, em função das variáveis estudadas. .................................................................................................... 71
Tabela 10- Composição química da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo. .......................... 73
Tabela 11. Massa molar média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e polidispersidade (Mw/Mn) das frações de hemicelulose extraídas do bagaço de cana-de-açúcar. ....... 78
Tabela 12- Linhagens de Aspergilus sp produtoras de xilanase. ................................................ 80Tabela 13 - Linhagens de T. aurantiacus produtoras de xilanase. .............................................. 80Tabela 14: Atividades enzimáticas de A. niger, T. aurantiacus, T. reesei e de preparados
comerciais aplicadas na hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. .... 91Tabela 15- Efeito da carga enzimática na hidrólise da hemicelulose do bagaço (2 % m/v) pelos
extratos de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei, após 24 h de reação. ....................... 91Tabela 16. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. aurantiacus. ................ 92Tabela 17. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. reesei. .......................... 93Tabela 18- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições
no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. aurantiacus) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 96 h de reação. ................................................................................................... 98
Tabela 19- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação. ......... 98
Tabela 20- Conversão da hemicelulose em XOs com extrato de T. reesei em função do tempo segundo o planejamento 22 completo. ...................................................................... 103
Tabela 21- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. reesei) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 6 h de reação. ............................................................................................................... 104
Tabela 22- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores (2-5% substrato e 60-100 U/g enzima) sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. reesei após 6 h de reação. ......................................................................................... 104
Tabela 23- Produtos de hidrólise da hemicelulose (2 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar por xilanases comerciais (80 U/g). ................................................................................. 108
Tabela 24 – Hidrólise enzimática de diferentes hemiceluloses (2,6 %) pelas enzimas de T. aurantiacus em 96 h de reação. ............................................................................... 110
Tabela 25- Composição química do bagaço após auto-hidrólise a 190°C, 10 % (m/v). .......... 113Tabela 26- Produtos da auto-hidrólise (190°C, 10 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar
presentes na fração líquida. ...................................................................................... 114
ABREVIATURAS
AQ Antraquinona
BCA Bagaço de cana-de-açúcar
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
DNS Ácido dinitrossalicílico
EX10 Endoxilanase da família 10
EX11 Endoxilanase da família 11
EX5 Endoxilanase da família 5
FOs Fruto-oligossacarídeos
FT-IR Espectroscopia de infravermelho médio
gp Grau de polimerização
HBCA Hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar
LCC Complexo lignina-carboidrato
PCA Análise de componentes principais
t 1/2 Tempo de meia vida
TLC Cromatografia de camada delgada
X1 Xilose
X2 Xilobiose
X3 Xilotriose
X4 Xilotetraose
X5 Xilopentaose
XOs Xilo-oligossacarídeos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 172. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 192.1 COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR .............................................. 192.1.1 Celulose ........................................................................................................................... 202.1.2 Hemicelulose (Polioses) .................................................................................................. 202.1.3 Lignina ............................................................................................................................. 232.2 PRÉ-TRATAMENTO DE MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS .................................. 262.2.1 Auto-hidrólise .................................................................................................................. 262.2.2 Processo alcalino ............................................................................................................. 292.2.2.1 Processo alcalino oxidativo .......................................................................................... 302.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE POLISSACARÍDEOS .................................................. 332.3.1 Hidrólise enzimática de xilanas ....................................................................................... 342.4 PRODUÇÃO DE XILANASES ......................................................................................... 352.4.1 Hemicelulases de Aspergillus niger ................................................................................ 362.4.2 Hemicelulases de Thermoascus aurantiacus ................................................................... 362.4.3 Hemicelulases de Trichoderma reesei ............................................................................. 392.5 PRODUÇÃO DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS ............................................................ 402.6 PROPRIEDADES E APLICAÇÕES DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS ....................... 432.7 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE XOs .......................................................... 463. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 483.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 483.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 484. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................. 494.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS ............................................................................................. 494.2 ENZIMAS COMERCIAIS ................................................................................................. 494.3 DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS .............................................. 504.3.1 Endo-β-1,4-xilanase ......................................................................................................... 504.3.2 Endo-β-1,4-glucanase ...................................................................................................... 504.3.3 β-xilosidase ...................................................................................................................... 514.3.4 α-L-arabinofuranosidase ................................................................................................. 514.3.5 Efeito do pH na atividade de xilanase ............................................................................. 514.3.6 Efeito da temperatura na atividade e na estabilidade da xilanase .................................... 524.4 EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM
NaOH ................................................................................................................................ 524.5 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM
H2O2 EM MEIO ALCALINO .......................................................................................... 544.6 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO E DA HEMICELULOSE ................... 554.6.1 Determinação do teor de cinzas ....................................................................................... 554.6.2 Determinação de ácidos urônicos .................................................................................... 564.7 EFICIÊNCIA DA EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR ......................................................................................................................... 564.8 SOLUBILIDADE DA HEMICELULOSE ....................................................................... 574.9 ANÁLISE DA HEMICELULOSE POR ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO 574.10 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLAR DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE
CANA ............................................................................................................................... 574.11 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE EXTRAÍDA DO BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR ...................................................................................................... 584.12 HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS SUCESSIVAS DA HEMICELULOSE ....................... 594.13 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ..................................... 59
4.14 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS .................. 604.15 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES, ÁCIDO ACÉTICO E
FURFURAL ..................................................................................................................... 604.16 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (TLC) ............................................. 614.17 ENSAIOS DE INDUÇÃO DE ENZIMAS DE T. aurantiacus ....................................... 615. RESULTADOS .................................................................................................................... 635.1 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ........... 635.1.1 Análise química do bagaço de cana-de-açúcar ............................................................... 635.1.2 Extração alcalina da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar ................................... 645.1.3 Otimização da extração da hemicelulose ........................................................................ 665.1.4 Avaliação do teor de lignina residual na hemicelulose ................................................... 705.1.5 Caracterização das hemiceluloses ................................................................................... 735.1.5.1 Análise espectroscópica (infravermelho médio) da hemicelulose do bagaço de cana-
de-açúcar .......................................................................................................................... 755.1.5.2 Determinação da massa molar da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar ........... 785.2 PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES ................................................. 795.2.1 Indução das enzimas de T. aurantiacus por sacarídeos relacionados à hemicelulose .... 825.2.2 Efeito do pH e temperatura na atividade enzimática de endo-xilanase .......................... 855.2.3 Estabilidade térmica da endo-β-1,4-xilanase .................................................................. 865.2.3.1 Thermoascus aurantiacus ............................................................................................ 865.2.3.2 Aspergilus niger ........................................................................................................... 885.2.3.3 Trichoderma reesei ...................................................................................................... 895.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR ......................................................................................................................... 895.3.1 Efeito da carga enzimática na produção de XOs ........................................................... 905.3.2 Efeito do tempo na produção de XOs ............................................................................. 925.3.3 Otimização da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar ................................. 935.3.3.1 Produção de xilose ....................................................................................................... 935.3.3.2 Produção de xilo-oligossacarídeos ............................................................................... 955.3.3.2.1 Hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. aurantiacus ................................. 955.3.3.2.2 Hidrólise da hemicelulose com enzimas de T. reesei ............................................. 1005.3.4 Hidrólise enzimática sucessiva da hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar ........... 1065.3.5 Hidrólise da hemicelulose do bagaço com xilanases comerciais .................................. 1075.3.6 Hidrólise enzimática de diferentes xilanas com enzimas de T. aurantiacus ................ 1095.3.6.1 Identificação por cromatografia em camada delgada (TLC) dos produtos de hidrólise
da hemicelulose .............................................................................................................. 1105.4 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR .................................... 1136. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 115REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 117ANEXO .................................................................................................................................. 137
17
1. INTRODUÇÃO
Os materiais lignocelulósicos representam uma fonte de matéria prima praticamente
sub-explorada em processos biotecnológicos. Seu uso está baseado principalmente na geração
de energia através da queima e na alimentação animal, entretanto, novas aplicações estão
surgindo e proporcionado um melhor aproveitamento desses materiais.
Atualmente, a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentescíveis para
produção de combustíveis vem sendo considerada como uma alternativa promissora para
aumentar a produção de etanol visando atender à demanda mundial. Para chegar à celulose, a
qual é o principal composto da parede celular vegetal, deve-se remover as hemiceluloses que
recobrem as microfibrilas. As operações empregadas no fracionamento do bagaço de cana-de-
açúcar dependem da finalidade do processo, ou seja, o que se deseja obter destas frações. Tais
operações implicam em tratamentos físicos e/ou químicos, os quais têm sido objeto de muitos
estudos. O pré-tratamento do bagaço, em condições alcalinas com temperatura e pressão
moderadas é considerado uma etapa importante para a recuperação da hemicelulose,
entretanto, a maioria dos trabalhos relacionados à extração não informa características como
solubilidade, um importante fator para aplicação desse polissacarídeo como em hidrólise
enzimática. Há necessidade de estudos visando à otimização da extração de hemicelulose,
mas que apresente características adequadas. Após uma revisão da literatura constatou-se que
existem poucas informações referentes ao uso de peróxido de hidrogênio nesse processo, o
que justifica uma investigação mais detalhada que leve a melhores resultados.
Dentre muitas aplicações biotecnológicas, a hemicelulose pode ser empregada na
confecção de biofilmes e como aditivos na fabricação de papel. Na sua forma hidrolisada, é
aplicada como oligossacarídeos para fins terapêuticos e analíticos ou na forma de monômeros
para a produção de xilitol. A busca por um estilo de vida saudável através de cuidados com a
alimentação tem impulsionado o interesse por alimentos funcionais, ou seja, àqueles que
auxiliam o bom funcionamento do organismo. Entre esses componentes destacam-se os
oligossacarídeos de xilose (XOs), aos quais se atribuem diversos efeitos benéficos, como a
prevenção de cáries, a diminuição de níveis séricos de colesterol e o estímulo do crescimento
de bifidobactérias no trato gastrointestinal. O seu efeito benéfico à saúde está relacionado às
suas propriedades físico-químicas, por serem moderadamente doces, estáveis em uma ampla
faixa de pH e temperatura e conferirem características organolépticas aos alimentos.
Considerando que as operações de fracionamento do material lignocelulósico
contribuem para o alto custo do processo, a auto-hidrólise do bagaço seria uma forma
18
alternativa de se produzir oligossacarídeos. Entretanto, a hidrólise enzimática da hemicelulose
pode permitir a obtenção de xilo-oligossacarídeos de forma controlada e em maior
concentração quando comparada à auto-hidrólise. As condições reacionais e a ação de
xilanases com propriedades diferentes são importantes para a obtenção de xilo-
oligossacarídeos, pois seu uso controlado pode favorecer a obtenção de produtos com graus
de polimerização e ramificações distintos.
A utilização de xilo-oligossacarídeos é uma realidade em poucos países. No Japão, por
exemplo, essas substâncias já são comumente empregadas em vários produtos alimentícios
para humanos e animais. Além do efeito prebiótico, os XOs tem apresentado uma variedade
de aplicações, tais como, antioxidantes, antialérgicos e na prevenção de anemia e
arteriosclerose. Com o desenvolvimento de uma metodologia eficiente para a produção de
hemicelulose e XOs a partir de materiais lignocelulósicos, como o bagaço de cana-de-açúcar,
espera-se impulsionar o desenvolvimento de muitos estudos relacionados às suas aplicações.
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Entre os materiais lignocelulósicos destaca-se no Brasil o bagaço de cana-de-açúcar
(que representa de 10 a 16% da planta), do qual 50 (FROLLINI; PIMENTA, 1997) a 90%
(GONÇALVES; ESPOSITO; BENAR, 1998) é utilizado para produção de energia por meio
da co-geração, tornando a usina auto-sustentável energeticamente. Em 2006 o Brasil contava
com 355 usinas de açúcar e álcool e previa-se até 2010 cerca de 89 novas usinas seriam
instaladas no país (OLIVEIRA e VASCONCELOS, 2006). A safra de cana-de-açúcar de 2009
foi de 629 milhões de toneladas (CONAB, 2009), uma tonelada de cana gera 140 quilos de
bagaço e 140 quilos de palha (RODRIGUES et al., 2003), sendo seu custo em torno de US$
15 por tonelada (MARQUES, 2009). O material fibroso, obtido após a moagem da cana para
a extração do caldo, é composto de água (46-52 %), fibras (43-52 %) e pequenas quantidades
de sólidos (2-6 %), sendo essa composição dependente da espécie, do tempo de cultivo, do
método de colheita e da eficiência da moagem (CARVALHO, 2000).
Quimicamente o bagaço apresenta um conteúdo de 46,2 % de celulose, 27,8 % de
hemicelulose, 21,1 % de lignina e 1 % de cinzas (SANTOS et al., 2009). Substâncias
orgânicas de baixa massa molar, denominadas de extrativos, estão associadas à estrutura
lignocelulósica. Estas substâncias não estão ligadas quimicamente a matriz lignocelulósica e
localizam-se em canais de resina e células de parênquima. Os extrativos são compostos por
uma série de componentes como resinas (terpenos, lignanas e outros compostos aromáticos),
ácidos graxos, álcoois, taninos, flavonóides, entre outros (FENGEL; WEGENER, 1984).
As características morfológicas atribuídas aos componentes da parede celular do
material lignocelulósico são responsáveis pela dificuldade em empregá-los como matéria
prima. Naturalmente, os lignocelulósicos são resistentes à degradação enzimática ou
microbiana, o que ocorre graças à organização dos componentes, onde a celulose encontra-se
embebida em uma matriz composta por hemicelulose e lignina. A hemicelulose está
quimicamente ligada à lignina, enquanto que sua associação à celulose é feita por interações
físicas (FENGEL; WEGENER, 1984).
20
2.1.1 Celulose
A celulose é o principal constituinte da parede celular vegetal, composta por uma
cadeia linear de 7000 a 15000 resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas β -1,4, sem
ramificações. A ligação do tipo β provoca uma rotação de 180 graus alternando a unidade de
glicose, resultando em uma cadeia linear (Figura 1) (FENGEL; WEGENER, 1984).
Em função da sua linearidade, as moléculas de celulose apresentam tendência em
formar pontes de hidrogênio inter e intramolecular. Existem pontes de hidrogênio entre
grupos OH de unidades de glicose adjacentes da mesma molécula de celulose (ligação
intramolecular – responsável pela rigidez) e entre grupos OH de moléculas adjacentes de
celulose (ligação intermolecular – responsável pela formação da estrutura supramolecular).
Assim, feixes de moléculas de celulose se agregam na forma de microfibrilas, as quais
formam regiões altamente ordenadas (cristalinas) e regiões menos ordenadas (amorfas). As
microfibrilas se organizam em fibrilas e estas originam as fibras celulósicas. Devido a
estrutura fibrosa a celulose possui resistência à tração e é insolúvel na maioria dos solventes
(FENGEL; WEGENER, 1984).
Figura 1. Estrutura da celulose (FENGEL; WEGENER, 1984).
2.1.2 Hemicelulose (Polioses)
Hemiceluloses, em geral, são constituídas de 80 a 200 unidades de resíduos de açúcar,
dos quais se destacam as pentoses (D-xilose, L-arabinose e L-ramnose), hexoses (D-glicose,
D-manose e D-galactose) e ácidos urônicos (ácidos 4-O-metil-D-glucurônico e D-
galacturônico) (Figura 2) (TIMELL, 1964). A cadeia de hemicelulose pode ser constituída por
um único monossacarídeo (xilanas) ou por duas ou mais unidades (xiloglucanas, 4-O-metil-
glucuronoxilana). A constituição desse polissacarídeo tem relação com o tipo de tecido
21
vegetal que faz parte e da espécie de planta a que pertence (FENGEL; WEGENER, 1984).
As ramificações da cadeia principal determinam a solubilidade, a conformação física
da molécula com os demais componentes lignocelulósicos e influenciam no modo e na
extensão da hidrólise enzimática (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999). Ainda, comparada
à celulose, apresenta maior reatividade devido à maior acessibilidade pelos reagentes, por
exemplo, na hidrólise ácida, por ser relativamente amorfa e apresentar grande
polidispersidade (FENGEL; WEGENER, 1984).
Figura 2. Estrutura dos monossacarídeos da hemicelulose (FENGEL; WEGENER, 1984).
Apesar de apresentar estrutura amorfa, a hemicelulose é capaz de formar ligações de
hidrogênio e possui tendência a cristalizar após a remoção das cadeias laterais. Os grupos
substituintes, arabinosil e acetil, diminuem a adsorção da hemicelulose à celulose (KABEL et
al., 2007). A partir dessas propriedades tem se verificado que a adição de hemicelulose a
polpas celulósicas aumenta em até 30% as propriedades mecânicas, como a resistência ao
estouro (LIMA; OLIVEIRA; BUCKERIDGE, 2003). Tem-se avaliado a propriedade da
hemicelulose em formar filmes quando combinada com pequenas concentrações de quitosana
22
(5 a 10%). A adição desses níveis de quitosana à hemicelulose aumenta a cristalinidade do
filme devido às interações entre grupos ácidos da xilana e grupos amino da quitosana
(GABRIELII et al., 2000).
Em materiais lignocelulósicos a hemicelulose apresenta grande variação de proporção
e conteúdo, dependendo da espécie, do tipo de tecido, estágio de crescimento, condições
ambientais e fisiológicas. Existe uma grande variedade no conteúdo e composição da
hemicelulose nos talos, folhas, raízes e casca. Por exemplo, a hemicelulose do trigo apresenta
diferentes graus de substituição entre os tecidos. A relação arabinose/xilose é igual a 1,
quando se analisa a parte externa do grão (pericarpo), enquanto que a parte interna apresenta
baixo grau de substituição (0,3) (BRILLOUET; JOSELEAU, 1987).
A xilana é a hemicelulose presente em maior proporção no bagaço, é o segundo
polissacarídeo mais abundante encontrado na natureza, correspondendo a aproximadamente
um terço da fonte de carbono renovável do planeta (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005).
Xilana de gramíneas, citando o exemplo do bagaço de cana e cereais, apresenta uma cadeia
linear constituída de D-xilopiranosil com ligações β-D-(1,4), podendo ser substituída com α-
L-arabinofuranosil no carbono 2 ou 3, o qual pode apresentar ligações éster com ácido
cumárico e ferúlico (WENDE; FRY, 1997). Aparecem também como substituintes no carbono
2 α-D-glucuronopiranosil ou unidades derivadas de 4-O-metil (CARPITA; GIBEAUT, 1993).
A figura 3 mostra uma representação esquemática de uma hemicelulose com suas
ramificações.
Estudos realizados através de Ressonância Nuclear Magnética (1H e 13C) da
hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar definiram sua estrutura como L-arabino-(4-O-
metil-D-glucurono)-D-xilana com ácido ferúlico e cumárico quimicamente ligados (SUN et
al., 2004a). Outro lignocelulósico abundante, a palha de trigo, apresenta hemicelulose
definida como β-D-xilana substituída no carbono 2 com ácido D-glucurônico ou ácido 4-O-
metil-α-glucurônico e L-arabinofuranosil no carbono 3. A cada 26 xiloses na cadeia principal
existe um ácido urônico e a cada 13 xiloses existe uma arabinose (SUN; LAWTHER;
BANKS, 1996).
23
A
B
Figura 3. A - Estrutura esquemática de hemicelulose (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2004), B- estrutura representativa de L-arabino-(4-O-metil-D-glucurono)-D-xilana: 1- Xilopiranose; 2- L-arabinofuranose; 3- ácido 4-O-metil-glucurônico; 4- grupo acetil (McDOUGALL et al., 1993).
2.1.3 Lignina
A lignina é composta basicamente de unidades de fenilpropano: unidades guaiacil (G),
unidades siringil (S) e unidades p-hidroxifenil (H). O acoplamento das unidades fenilpropano
não ocorre de forma regular e repetitiva, devido ao mecanismo de biossíntese, que se processa
via radicalar a partir da reação de três álcoois cinamílicos precursores (Figura 4), formando
uma macromolécula tridimensional e amorfa (FENGEL; WEGENER, 1984). Sua composição
varia entre os diversos grupos de plantas: em gimnospermas predomina o tipo G (guaiacila),
em angiospermas, G-S (guaiacila-siringila) e em gramíneas como o bagaço de cana-de-açúcar,
destaca-se a lignina tipo G-S-H (guaiacila-siringila-p-hidroxifenila) (HIGUCHI, 2006). Nas
gramíneas, a lignina incorpora níveis similares de G e S e possuem mais resíduos H do que
dicotiledôneas (BAUCHER et al. 2003).
24
Figura 4. Álcoois precursores da lignina (FENGEL; WEGENER, 1984).
Na estrutura da célula vegetal a lignina está ligada à hemicelulose através de ligações
covalentes. Durante a biossíntese da parede celular, arabinoxilanas com grupos ferulatos são
ligadas pela junção dos ferulatos em diferulato e pela copolimerização de ferulato e diferulato
com monolignóis (GRABBER; RALPH; HATFIELD, 2002) caracterizando o complexo
lignina-carboidrato (LCC) (LAWOKO; HENRIKSSON; GELLERSTED, 2003; WALLACE
et al., 1995). As ligações éster são hidrolisadas facilmente em condições alcalinas, entretanto
as ligações benzil éter são estáveis. De acordo com Watanabe (2003), lignina e carboidratos
podem estar ligados das seguintes formas (Figura 5):
I) ligação benzil éter entre grupos α-hidroxil da lignina com um grupo hidroxil de
carboidrato;
II) ligação benzil éster entre grupos α-hidroxil da lignina com um grupo de ácido
carboxílico de carboidrato;
III) ligação glicosídica entre grupo hidroxil alifático ou aromático de lignina com um
terminal redutor de carboidrato;
IV) ligação acetal entre grupo carbonil da lignina com dois grupos hidroxil de
carboidrato.
25
Figura 5. Estruturas propostas para as diferentes ligações entre lignina e carboidratos
(adaptado: WATANABE, 2003).
A lignina apresenta importante papel no desenvolvimento de plantas, contribui como
força mecânica e as protege contra o ataque de insetos e fungos. Do ponto de vista da
característica da fibra, a lignina representa um dos principais entraves para processos
industriais como a polpação da madeira para fabricação de papel e para produção de açúcares
solúveis a partir de biomassa vegetal. Para viabilizar o emprego dos materiais lignocelulósicos
na biotecnologia é interessante que a lignina seja removida, podendo ser utilizada em
aplicações específicas como produção de quelantes através de oxidação enzimática
(GONÇALVES; OVIEDO, 2002), produção de adesivos para madeira (EL MANSOURI;
SALVADÓ, 2006), vanilina e ácido gálico (HOWARD et al. 2003; PRIEFERT;
RABENHORST; STEINBÜCHEL, 2001).
26
2.2 PRÉ-TRATAMENTO DE MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
A estrutura dos materiais lignocelulósicos os torna resistente à degradação tanto dos
polissacarídeos quanto da lignina. A heterogeneidade dos materiais lignocelulósicos, sua
composição química e características físicas são pontos críticos no isolamento de seus
componentes, sendo necessário às vezes, uma combinação de vários procedimentos
(CONVERSE; OOSHIMA; BURNS, 1990).
A alteração nas características estruturais da matriz lignocelulósica pode ser feita por
diversos pré-tratamentos, os quais são classificados em físicos, químicos, físico-químicos e
biológicos. O pré-tratamento deve ser escolhido com base no componente que se deseja isolar,
e se será mantida ou não a sua integridade física. De modo geral, é desejável que o pré-
tratamento apresente características operacionais e efeitos como: a) produção de fibras
reativas, b) rendimento em pentose não degradada, c) não produza compostos de degradação
que possam inibir fermentações, d) que possa trabalhar em reator de tamanho razoável com
custo moderado, e) não produza resíduos sólidos, e) que tenha um alto grau de simplicidade
(LYND; ELANDER; WYMAN, 1996).
Tratamentos com ácido geralmente removem a hemicelulose e, em função da
severidade, atacam também a celulose e lignina, enquanto os tratamentos com álcali permitem
separar a hemicelulose e lignina da celulose sem degradar os polissacarídeos. Entretanto, em
condições extremas de alcalinidade e temperatura podem ocorrer reações de degradação dos
polissacarídeos.
Será apresentada uma revisão da literatura sobre dois pré-tratamentos utilizados nesse
trabalho: auto-hidrólise e processo alcalino. Na auto-hidrólise será dada ênfase à hidrólise da
hemicelulose e no processo alcalino ao uso de peróxido de hidrogênio.
2.2.1 Auto-hidrólise
A auto-hidrólise é um tratamento hidrotérmico realizado em temperaturas entre 150 e
220°C, em reatores batelada com controle de temperatura e pressão (GARROTE;
DOMINGUEZ; PARAJÓ, 2002a). O reator é preenchido com o material no estado sólido
adicionado de água e as reações são conduzidas em temperatura e tempo pré-fixados
(LADISCH; BREWER; HENDRICKSON, 1997; LYND et al., 1997). Nesse tratamento
ocorre fracionamento do material lignocelulósico (GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ,
27
1999). A hemicelulose pode ser completamente solubilizada, grupos acetil são clivados e
pequenas alterações são causadas na lignina e celulose (CONNER; LORENZ, 1986).
Tradicionalmente, a auto-hidrólise é aplicada em subprodutos agrícolas, nos quais as
hemiceluloses são principalmente xilanas (GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999).
Os licores típicos de auto-hidrólise contêm uma mistura de oligômeros de açúcares
(principalmente xilo-oligômeros), monossacarídeos (principalmente xilose), ácido acético,
produtos da decomposição de açúcar, tais como furfural e hidroximetilfurfural. Sob condições
operacionais severas, reações de condensação entre furfural, lignina e/ou reações
intermediárias podem ocorrer (DEKKER; WALLIS, 1983; LORA; WAYMAN, 1978;
MUZZY et al., 1983). Em condições de hidrólise mais brandas os produtos de decomposição
de açúcar são produzidos em menores quantidades, porém ocorre um menor rendimento nos
produtos de interesse, sendo necessário efetuar uma nova hidrólise do material.
Os xilo-oligossacarídeos obtidos por auto-hidrólise apresentam estrutura mais conservada
em relação à forma nativa da xilana, quando comparado a outros métodos. Por exemplo, em
tratamentos hidrotérmicos somente parte dos grupos ésteres são removidos, enquanto que em
processos alcalinos ocorre saponificação desse grupo (MOURE et al., 2006).
A temperatura e tempo de reação são as principais variáveis no processo de auto-
hidrólise. Através da relação entre essas duas variáveis determina-se o fator de severidade do
processo, o qual apresenta efeito direto sobre a acidificação do meio pela clivagem dos grupos
acetil, geração dos produtos de degradação de açúcares e grau de polimerização dos XOs
(GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999).
Em comparação com a hidrólise ácida, na qual um ácido mineral é adicionado no meio
de reação (MALONEY; CHAPMAN; BAKER, 1985; PARAJÓ; ALONSO; VÁZQUEZ,
1993; PARAJÓ; ALONSO; SANTOS, 1995; RANGANATHAN; MACDONALD;
BAKHSHI, 1985), na reação de auto-hidrólise a espécie catalítica vem do ácido acético
gerado dos grupos acetil (AOYAMA; SEKI; SAITO, 1995; BARNET; EXCOFFIER;
VIGNON, 1989; GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999; HEITZ et al., 1991;
OVEREND; CHORNET, 1989; WEIL et al., 1997).
Em termos comparativos de processo, tratamentos hidrotérmicos mostram vantagens em
relação às reações de hidrólise ácida, tais como a ausência de reagentes diferentes da água e
do material lignocelulósico (OVEREND; CHORNET, 1989), o que classifica esse processo
como ecologicamente correto (KUBIKOVA et al., 1996). Ainda, apresenta corrosão limitada
de equipamentos (ABATZOGLOU et al., 1992), como também a ausência de lamas
neutralizadoras (CONNER; LORENZ, 1986) e fases de recuperação de ácidos (SASKA;
28
OZER, 1995).
Uma diferença entre auto-hidrólise e a explosão a vapor (repentina descompressão do
reator no final do processo) é a quantidade e concentração de produtos solubilizados. Na auto-
hidrólise a quantidade de produtos é maior, enquanto que a concentração desses é baixa ao se
comparar com o tratamento a vapor, o que ocorre devido ao conteúdo de água empregado na
auto-hidrólise em relação ao tratamento a vapor (HENDRIKS; ZEEMAN, 2009). Outra
diferença é o teor dos produtos de degradação de açúcar, que são gerados em menor
quantidade na auto-hidrólise, em relação ao processo de explosão a vapor (TAHERZADEH;
KARIMI, 2008).
A auto-hidrólise de resíduo de cervejaria (bagaço de malte) a 190°C por 5 min de
reação produziu 61 % de XOs, com predominância de xilobiose (CARVALHEIRO et al.,
2004), experimentos realizados a 150°C por 20 min permitiram um maior acúmulo de
xilobiose e xilotriose. Os autores observaram que o aumento da temperatura reduziu a
distribuição de massa molar dos oligômeros e em tempo longo ocorreu o aumento de
conversão em monossacarídeos, com consequente diminuição dos XOs e acúmulo de
produtos de degradação de açúcares, como observado em outros trabalhos (AOYAMA; SEKI;
SAITO, 1995; GARROTE; DOMINGUEZ; PARAJÓ, 1999).
Arabinose e ácido metilglucurônico foram encontrados como produtos da auto-
hidrólise (160°C por 60-75 min) de farelo de trigo, resíduo de cervejaria e sabugo de milho.
Os XOs apresentaram estrutura variada em função da origem da xilana. XOs ramificados com
arabinose foram encontrados no hidrolisado de resíduo de cervejaria, e ramificados com ácido
4-O-metilglucurônico foram encontrados no hidrolisado de sabugo de milho e eucalipto. No
hidrolisado de eucalipto também foi encontrado XOs ramificados com grupos acetil (KABEL
et al., 2002).
Xilo-oligossacarídeos obtidos da auto-hidrólise de casca de amêndoas apresentaram
estrutura neutra e ácida (ácido 4-O-metilglucurônico) e pequena quantidade de grupos
fenólicos (NABARLATZ et al., 2007a). Os autores observaram que essa mistura de XOs
apresentou atividade indutiva sobre o sistema imunológico (proliferação de linfócitos-T) de
ratos, e ainda sugeriram que esse efeito pode ter sido potencializado pela presença de grupos
fenólicos.
29
2.2.2 Processo alcalino
Algumas bases também podem ser utilizadas para o pré-tratamento de materiais
lignocelulósicos e a sua eficácia depende do conteúdo de lignina presente na biomassa. A
ação alcalina é atribuída a uma saponificação da ligação éster que separa a hemicelulose da
lignina. Além disso, o tratamento da biomassa com uma solução de NaOH, provoca um
inchamento interno na estrutura da celulose e consequentemente aumenta a área superficial. O
inchamento reduz a interação entre a lignina e os carboidratos, causando ainda, rompimento
na estrutura da lignina que é solúvel nessas condições (WEIL et al., 1994). O tratamento
alcalino tem sido testado em resíduos como casca de trigo (85°C, 3 h), madeira (150°C, 6 h e
14 atm), grama (100°C por 2 h) e sabugo de milho (100°C, 13 h) (MOSIER et al., 2005).
As propriedades mecânicas da fibra do bagaço de cana-de-açúcar mudam após o
tratamento alcalino e em determinadas condições apresentam propriedades superiores à fibra
sem tratamento. Segundo Cao, Shibata e Fukumoto (2006), o tratamento do bagaço a 25°C
por 2 h em uma razão líquido/sólido de 20:1, com solução de NaOH 1 % (m/v), mostrou a
melhor transformação nas características físicas, elevando em 13 % a resistência à tração, 14
% em relação à flexão e 30 % na força de impacto. Um aumento na concentração de NaOH
para 3 % resultou em um leve aumento na flexão, no entanto, a resistência à tração diminuiu.
Uma maior concentração de NaOH (5 %) diminuiu tanto a resistência à flexão quanto à
tração.
Trabalho de Xu et al. (2006) com bagaço de cana-de-açúcar mostrou que em alta
concentração de hidróxido de sódio (1 M) obtém-se um baixo rendimento de extração da
hemicelulose (55,5 %), quando realizado a 25 °C. O rendimento aumentou para 62,1 % a
40°C. Os autores observaram, também, que o aumento da temperatura para 40°C promove
maior remoção da lignina do bagaço.
Em pH e temperatura elevados os carboidratos podem sofrer reações de degradação
que provocam a formação de extremidades redutoras e diminuição da massa molar. Para
minimizar tal degradação pode-se empregar antraquinona, a qual causa a oxidação do grupo
redutor dos carboidratos, estabilizando-os na forma de ácido aldônico, contra as reações de
despolimerização terminal (GOMIDE; OLIVEIRA, 1979). A antraquinona auxilia na quebra
das ligações β -éter reduzindo a massa molar da lignina, o que intensifica a deslignificação
(GIERER, 1980). Em processos de polpação, o emprego de soda-antraquinona leva a maior
formação de fragmentos de lignina de baixa massa molar, quando comparado ao processo
soda (VENICA; CHEN; GRATZL, 2008).
30
2.2.2.1 Processo alcalino oxidativo
O peróxido de hidrogênio é um excelente oxidante em meio alcalino, tem baixa
toxicidade e é de fácil manuseio. Os dois produtos de decomposição do H2O2, água e
oxigênio, não são poluentes. O tratamento com peróxido de hidrogênio é um processo
eficiente para remoção de lignina e hemicelulose de lignocelulósicos e, remove também, sílica
e graxas (CURRELI et al., 1997). O peróxido reage com as estruturas aromáticas e alifáticas
da lignina, sendo muito utilizado em processos de branqueamento de polpa (LIU, 2003). A
ação desse agente pode gerar produtos de degradação devido à formação de radicais
oxidantes. A influência do pH já foi bastante estudada e a literatura apresenta como ótimo o
valor de 11,6 (SUN et al., 2000a; YANG et al., 2002). Em meio alcalino o peróxido de
hidrogênio se decompõe no ânion peroxidrila (HOO-), o principal agente na degradação de
grupos cromóforos, de acordo com a reação 1 (pka = 11,6 a 25°C) (KADLA; CHANG, 2001):
(1) H2O2 + OH- → H2O + HOO-
(2) HOO- + H2O2 → H2O + O2 + OH-
Por outro lado, quando o peróxido é usado como agente de deslignificação em
extração alcalina, a sua decomposição ocorre devido à formação de hidroxila e de oxigênio,
que são os oxidantes que iniciam as reações de deslignificação (reação 2). Embora a
decomposição do peróxido seja necessária para que ocorra a deslignificação, a velocidade de
decomposição deve ser reduzida para que não ocorra formação em excesso de radicais livres,
o que pode levar a uma degradação excessiva dos polissacarídeos.
Alguns metais como ferro, cobre e manganês aceleram a decomposição do peróxido
de hidrogênio em meio alcalino, nos radicais hidroxila (HO·) e ânion superóxido (O2-·), os
quais participam do mecanismo de deslignificação (reações 3, 4 e 5) (SUN; TOMKINSON,
2002). Tais radicais apresentam efeito positivo para o processo de deslignificação, entretanto,
também atuam hidrolisando os carboidratos, o que é indesejável para o rendimento do
processo. Como as conseqüências negativas são maiores, os metais devem ser eliminados do
processo.
31
(3) H2O2 + M(n) → OH- + ·OH + M(n+1)
(4) H2O2 + OH- → H2O + ·OOH
(5) H2O + ·OOH → O2-· + H3O+
Onde: M representa o metal
O ânion peroxidrila é considerado a espécie ativa do peróxido de hidrogênio, age sobre
a macromolécula de lignina decompondo-a em ácidos mono e dicarboxílicos e compostos não
fenólicos, e em menor quantidade ácidos aromáticos e aldeídos (XIANG; LEE, 2000). Entre
os produtos derivados do ácido carboxílico destacam-se os ácidos oxálico, fórmico, acético,
malônico e succínico, e entre os produtos de origem não fenólica e aldeídos destaca-se ácido
vanílico, benzodicarboxílico, vanilina, seringaldeído e hidroxibenzaldeído. A figura 6 mostra
a sequência de degradação da lignina por ação de alta carga de peróxido de hidrogênio (3,7
g/g). Produtos derivados da lignina como vanilina e seringaldeído são formados na via A,
entretanto, estes compostos são rapidamente degradados, sendo encontrados em pequena
concentração. Os compostos cromóforos são formados nas vias B e C, os quais são
responsáveis pelo escurecimento do meio. Estes compostos podem ser degradados a ponto de
rompimento de anel até a formação de ácidos de baixa massa molar (XIANG; LEE, 2000).
Figura 6. Sequência de reações de degradação de lignina em meio alcalino (XIANG; LEE, 2000).
32
O radical hidroxila, produto de decomposição do peróxido, degrada carboidratos pelo
ataque ao carbono 2, formando uma estrutura de cetona e em seguida ocorre a quebra da
ligação glicosídica pela β-eliminação (Figura 7) (GUAY et al., 2001). Entretanto, no mesmo
trabalho os autores afirmam que a etapa de eliminação do superóxido (O2-·) é energeticamente
desfavorável. Utilizando um sistema UV/H2O2 os autores sugeriram que os radicais hidroxilas
provocam uma reação de substituição no carbono 1 do açúcar, clivando a ligação glicosídica e
formando um terminal redutor (Figura 8). Miller e Fry (2001) observaram que o ataque de
radicais hidroxilas diminui o grau de polimerização das cadeias de xilana, entretanto, não
ocorre a formação de oligossacarídeos.
Figura 7. Mecanismo oxidativo de clivagem de carboidratos por radicais hidroxilas (GUAY et al., 2001).
Figura 8. Mecanismo proposto para formação de celobiose por radicais hidroxilas a partir de metil-β-celobiose (GUAY et al., 2001).
33
Íons Mg+2 em meio alcalino origina o hidróxido de magnésio (Mg(OH)2), o qual
apresenta capacidade de complexar metais de transição como ferro, manganês e cobre.
Quando não quelados e na forma iônica, tais metais catalisam a decomposição do peróxido
produzindo espécies reativas de oxigênio, como os íons hidroxila e peroxidrila, que atacam os
carboidratos (THAKORE et al., 2005).
A hemicelulose pode ser extraída de materiais lignocelulósicos em grande proporção
utilizando peróxido de hidrogênio alcalino. Fang et al. (1999) extraíram 92 % da hemicelulose
da palha de trigo empregando 2 % de H2O2 a 50°C por 16 h. Esse polissacarídeo apresentou
massa molar entre 54.980 a 63.730 g/mol, composição de 72 % de xilose, 8,9 % de glicose,
15,6 % de arabinose, pequenas quantidades de ramnose, galactose e 4,7 % de lignina residual.
Os autores observaram que a hemicelulose extraída com H2O2 apresentou cor mais clara que a
extraída com KOH, o que foi atribuído à ação do peróxido sobre grupos cromóforos.
O peróxido de hidrogênio além de extrair a hemicelulose, auxilia também na remoção
da lignina do material lignocelulósico. A aplicação de 4 % de H2O2 a 200°C por 8 min
removeu 63 % da hemicelulose e 64 % da lignina de Miscanthus giganteus (WANG; WANG;
FANG, 2010). Um estudo comparativo de processos de extração da hemicelulose mostrou que
peróxido de hidrogênio (2 % m/m, 30 min por 121°C/1 atm) solubilizou 30 % da xilana e 29,5
% da lignina; o hidróxido de sódio (2 % m/m, 90 min a 121°C/1 atm) solubilizou 25 % da
xilana e 65,6 % da lignina e o ácido sulfúrico (2 % m/m, 90 min a 121°C/1 atm) solubilizou
95 % da xilana e 25 % da lignina (SILVERSTEIN et al., 2007). Nesse estudo, os autores
chamaram a atenção para o baixo desempenho do peróxido de hidrogênio, que nas condições
empregadas deve ter sido degradado.
2.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE POLISSACARÍDEOS
O uso de enzimas na hidrólise de resíduos lignocelulósicos é vantajoso pela alta
especificidade das reações enzimáticas, pelas condições amenas de reação, pouca modificação
química e formação de subprodutos. Apesar de décadas já terem sido dedicadas a esses
estudos, ainda não estão totalmente compreendidas as características do substrato que
atribuem maior eficiência de hidrólise. A hidrólise enzimática não leva a formação de
resíduos tóxicos da catálise, como por exemplo, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural.
A hidrólise enzimática requer o contato direto entre a enzima e o substrato. A enzima
deve ultrapassar barreiras físicas para adsorver a superfície do substrato e finalmente catalisar
34
a hidrólise. Caso o substrato tenha um alto teor de lignina ou seja altamente cristalino a
efetividade da enzima será baixa, do contrário a efetividade será alta e consequentemente o
tempo necessário para hidrólise será menor (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000). Além desses
fatores, a hidrólise enzimática sofre influência da heterogeneidade do material lignocelulósico
(BERLIN et al., 2005).
2.3.1 Hidrólise enzimática de xilanas
A hidrólise da hemicelulose ocorre através da ação de endo-enzimas, que atuam
internamente na cadeia principal, e exo-enzimas que clivam oligossacarídeos e produzem
monossacarídeos (KALOGERIS et al., 2001). A endo-β-1,4-D-xilanase (EC 3.2.1.8) age
sobre a cadeia principal de xilana e gera xilo-oligossacarídeos de baixo grau de polimerização
que são substratos da exo-β1,4-xilanase (EC 3.2.1.37), a qual age através do terminal não
redutor gerando D-xilose (BEG et al., 2001; WONG; TAM; SADDLER, 1988). As enzimas
que atuam nas ramificações são a arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) que remove a arabinose,
a α-glucuronidase (EC 3.2.1.131) que remove os ácidos glucurônicos e acetil-xilana-esterase
(EC 3.1.1.72) que remove os grupos acetil (JUHÁSZ et al., 2005).
Com base na sequência primária de aminoácidos e de seu domínio catalítico, as
xilanases são predominantemente classificadas nas famílias 10 e 11. As xilanases da família
10 em geral apresentam massa molar maior que 30 kDa e ponto isoelétrico baixo, enquanto
que as enzimas da família 11 apresentam baixa massa molar e ponto isoelétrico alto
(COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005; FENEL; ZITTINGA; KANTELINEN, 2006). As
xilanases da família 10 apresentam uma maior versatilidade catalítica, ou seja, menor
especificidade. As xilanases dessa família também podem apresentar atividade sobre celulose
de pequena massa molar. Em contraste, as xilanases da família 11 são consideradas como
verdadeiras, porque agem exclusivamente sobre xilanas (COLLINS; GERDAY; FELLER,
2005). Em função das diferenças catalíticas, xilanases da família 10 produzem XOs menores
do que xilanases da família 11 (MASLEN et al., 2007).
Trabalhos de Li et al. (2000) mostraram que os grupos substituintes influenciam na
taxa de hidrólise da cadeia de xilana, o que é regulado pelo grau de ramificação da cadeia
principal. Puchart e Biely (2008) observaram que, na ausência de β -xilosidase e das enzimas
acessórias α-glucuronidase e α-arabinofuranosidase, a hidrólise de glucuronoxilana por
endoxilanase da família 11 de Thermomyces lanuginosus levou a produção de XOs
35
ramificados.
A presença de ramificação pode ser um entrave mais ou menos acentuado dependendo
do modo de ação da enzima. Xilanase de Aspergillus niger hidrolisa melhor xilana não
ramificada, enquanto xilanase de Trichoderma longibrachiatum age sobre ambas xilanas
(AKPINAR; ERDOGAN; BOSTANCI, 2009). Iwamoto, Sasaki e Inaoka (1973), e Takenishi
e Tsujisaka (1975) observaram que xilanases purificadas de A. niger podem hidrolisar
xilotriose, mas não hidrolisam arabinoxilotriose. A presença de substituintes, os quais
geralmente localizam-se no terminal não redutor de XOs, protege a ligação glicosídica da
cadeia principal (COMTAT; JOSELEAU, 1981).
2.4 PRODUÇÃO DE XILANASES
As enzimas xilanolíticas podem ser induzidas por xilana, na maioria das vezes seu
melhor indutor (FERNÁNDEZ-ESPINAR et al., 1994), entretanto alguns autores evidenciam
o efeito indutor de fragmentos de xilana (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2005) e sua repressão
por açúcares prontamente assimiláveis como glicose, lactose e xilose (GASPAR et al., 1997).
Os substratos lignocelulósicos são usados para a obtenção de enzimas xilanolíticas em larga
escala e com baixo custo em cultivo submerso ou em meio sólido (MISHRA et al.,1990).
Durante o crescimento em xilana, várias espécies microbianas produzem xilanases
específicas com pouca ou nenhuma celulase. Entretanto, quando crescidas em celulose,
celulases são produzidas juntamente com xilanases. Uma estratégia usada para obter o
complexo xilanolítico livre de celulases é o crescimento dos microrganismos em xilana não
contaminada com celulose (BIELY et al., 1986).
Para alguns organismos a síntese de xilanases e celulases é regulada separadamente,
enquanto em outros organismos, a produção de xilanases está ligada à produção de celulases.
Em Trichoderma reesei, xilana e xilobiose induzem seletivamente a formação de xilanases,
enquanto soforose induz a produção tanto de celulases quanto de xilanases (HRMOVÁ;
BIELY; VRSANSKA, 1986).
Fungos filamentosos são particularmente interessantes como produtores de xilanases do
ponto de vista industrial, pois os níveis de xilanases de culturas de fungos são tipicamente
mais altos do que aqueles de leveduras ou bactérias. Além das xilanases, fungos produzem
muitas enzimas auxiliares necessárias à hidrólise das ramificações das xilanas (HALTRICH et
al., 1996).
36
2.4.1 Hemicelulases de Aspergillus niger
Aspergilus niger é um fungo filamentoso que cresce em materiais orgânicos
depositados em solos, lixo e plantas em decomposição. Produzem hemicelulases na presença
de xilose, xilana ou polissacarídeos como celulose e pectina, mas não na presença de glicose e
galactose. O farelos de arroz e trigo promovem um excelente crescimento e produção de
celulases e hemicelulases (HAMIL et al., 2004).
Van Peij et al. (1998) realizaram estudos do promotor XlnR de A. niger a fim de
avaliar seu papel na regulação dos genes envolvidos na degradação de xilana e celulose. Os
autores observaram que este promotor ativa a expressão de duas endoxilanases (xlnB e xlnC),
uma β-xilosidase (xlnD), uma arabinofuranohidrolase (axhA), uma acetil-xilana-esterase
(axeA), uma α-glucuronidase (aguA), uma feruloil esterase (faeA), e duas endoglucanases
(eglA e eglB), entretanto, verificaram que β-glicosidase (bglA) não é regulada por esse
promotor.
A. niger produz quinze xilanases extracelulares (COLLINS; GERDAY; FELLER,
2005) com propriedades físico-químicas, estrutura e atividade específica diferentes. A ação
conjunta deste complexo enzimático pode aumentar a eficiência e o grau de hidrólise das
xilanas (VRIES; VISSER, 2001).
2.4.2 Hemicelulases de Thermoascus aurantiacus
O fungo termófilo Thermoascus aurantiacus é um ascomiceto que foi isolado pela
primeira vez em 1907 por Hugo Miehe, a partir de pilhas de feno aquecidas (COONEY;
EMERSON, 1964). T. aurantiacus apresenta uma cor laranja luminosa, ascósporos elípticos
e não apresenta fase assexuada (MAHESHWARI; BHARADWAJ; BHAT, 2000), embora no
passado Cooney e Emerson (1964) descreveram tal fase. Esse fungo está presente em diversos
ambientes, como plantas de tabaco, solo, cavacos de madeira, vagem de cacau, esterco de
aves, efluentes, entre outros. A cepa brasileira de T. aurantiacus (Figura 9) foi isolada de
pilhas de cavacos de eucalipto em uma empresa de polpa e papel (AUER; KRUGNER;
BARRICHELO, 1988) e os estudos mostraram que ela possui características diferentes da
maioria das cepas deste mesmo fungo, pois além de enzimas que degradam a celulose e
hemicelulose, ainda produz lacases (MACHUCA, 1991 e 1995).
A temperatura ótima e máxima para a germinação dos ascósporos de T. aurantiacus é
37
de 47,5°C e 60°C, respectivamente (DEPLOEY, 1995), a qual é maior que a relatada para o
crescimento de hifas (40 – 45°C) (COONEY; EMERSON, 1964). As temperaturas mínimas
para a germinação dos ascósporos estão entre 32,5-35°C (DEPLOEY, 1995) e para o
crescimento de hifas entre 20 e 25°C (COONEY; EMERSON, 1964).
Figura 9. Thermoascus aurantiacus ATCC 204492. (A) Crescimento em ágar-malte; (B) Hifas e esporos; (C) Ascósporos; (D) Liberação dos esporos por rompimento do ascósporo. (ampliação de 400 vezes) (Fonte: autor).
Em fermentações em estado sólido conduzidas em reatores, a taxa de aeração exerce
grande efeito na produtividade das xilanases uma vez que uma diminuição na aeração pode
levar a finalização do processo (SANTOS et al., 2003, MILAGRES et al., 2004).
T. aurantiacus cresce em materiais lignocelulósicos de origem agrícola e florestal,
como serragem, sabugo e palha de milho, grama seca ou verde, bagaço de laranja, farelo de
arroz (Da SILVA et al., 2005), bagaço de cana-de-açúcar (MILAGRES et al., 2004), farelo e
palha de trigo (KALOGERIS et al., 2003) e produzem enzimas do complexo celulolítico e
hemicelulolítico (KALOGERIS et al., 1998; MARTINS et al., 2007; SANTOS et al., 2003;
SOUZA; ROBERTO; MILAGRES, 1999).
Trabalhos de Souza, Roberto e Milagres (1999) e Santos (2001), mostraram que a
produção de xilanase por T. aurantiacus ATCC 204492 é regulada principalmente pela
A B
C D
A B
C D
38
natureza e concentração do substrato. O farelo de trigo e o bagaço de cana-de-açúcar
induziram altos níveis de xilanase em cultivo em estado sólido, quando comparados com o
meio líquido. O cultivo do fungo em farelo ou bagaço produziu 2700 U de xilanase/g de
substrato e o nível de enzimas foi dependente da umidade inicial e da massa de substrato
(SOUZA; ROBERTO; MILAGRES, 1999).
Kalogeris et al. (2003) cultivaram T. aurantiacus IMI 216529 em farelo de trigo
(relação sólido: líquido de 1:4) e encontraram 1572 U/g de endo-glucanase e 101 U/g de β-
glicosidase. As enzimas apresentaram elevada estabilidade térmica, com tempo de meia-vida
de 42 e 18 min, respectivamente a 80°C. Kalogeris et al. (1998) relataram a produção de 6193
U/g de xilanase, em cultivo com palha de trigo.
O cultivo de fungos termófilos apresenta baixo risco de contaminação, sendo um
atrativo para processos biotecnológicos, e ainda, tem recebido muita atenção devido a
vantajosas propriedades de suas enzimas (KULKARNI; SHENDYE; RAO, 1999). A
produção de enzimas termoestáveis é de grande interesse industrial, em função das condições
de processos que geralmente ocorrem em temperaturas altas (MAHESHWARI;
BHARADWAJ; BHAT, 2000; YU et al., 1987).
Em uma seleção de linhagens termofílicas realizadas por Yu et al. (1987), a xilanase
de T. aurantiacus C436 foi a mais termoestável. Esta linhagem produziu uma endo-xilanase
cuja atividade manteve-se superior a 90% a 50°C por 12 semanas. Uma menor estabilidade
foi observada por Alam et al. (1994) quando trabalharam com outra linhagem, que apresentou
atividade superior a 80% a 55°C durante 15 dias.
Em geral, xilanases de T. aurantiacus apresentam massa molar entre 39 – 33 kDa
(VISWAMITRA et al., 1993; KALOGERIS et al., 2001), temperatura ótima entre 70 e 75°C,
e pH ótimo próximo de 5 (ALAM et al., 1994; GOMES et al., 2000; YU et al., 1987), mas são
estáveis em uma ampla faixa de pH (3-9) em temperatura ambiente (Da SILVA et al., 2005).
Uma endo-xilanase purificada de T. aurantiacus IMI 216529 mostrou preferência em
hidrolisar a xilana pelo terminal redutor e propriedades catalíticas similares às da família 10.
Essa enzima tolerou alguns substituintes na cadeia principal da xilana, quando agiu sobre
oligômeros acetilados (VARDAKOU et al., 2003; KALOGERIS et al., 2001). Nesse trabalho
foram detectadas duas isoenzimas com pI 6.8 e 5.5, entretanto, a literatura não relata muitos
casos de isoenzimas de T. aurantiacus, diferente de outros microrganismos como Aspergilus
niger (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005).
A β-xilosidase é uma enzima que hidrolisa xilo-oligômeros de cadeia curta e xilobiose
a partir do terminal não redutor liberando unidades de xilose (SHALLOM; SHOHAM 2003).
39
A expressão dessa enzima é normalmente induzida pelo dissacarídeo (xilobiose) ou
oligossacarídeos curtos, o que depende do microrganismo (GOMES; GOMES; STEINER,
1994). A literatura contém poucos trabalhos sobre a produção dessa enzima por T.
aurantiacus. Em um estudo investigatório de indução de hemicelulases por 14 carboidratos,
Gomes, Gomes e Steiner (1994) verificaram a produção de baixos níveis dessa enzima, até
mesmo na presença de indutores. Entretanto quando cultivado em farelo de trigo, T.
aurantiacus IMI 216529, produziu β-xilosidase com pI 3,5 (KALOGERIS et al., 1998) e
atividade de 40 UI/g (KALOGERIS et al., 1999), o que foi um nível considerado alto para
esse microrganismo.
Gomes et al. (2000) detectaram baixos níveis de exo-α-L-arabinofuranosidase em
cultivos com T. aurantiacus. Essa enzima hidrolisa resíduos de arabinofuranose a partir da
extremidade não redutora de oligossacarídeos curtos e arabinoxilanas substituídas nos
carbonos 2 e 3 por β-D-xilopiranosil. A condição ótima de cultivo para a produção de
arabinofuranosidase foi em meio com polpa de beterraba com 77,8 % de umidade,
suplementado com solução mineral e extrato de levedura (1,2%) em pH 9,5. Essa enzima
apresentou máxima atividade a 70°C e em pH 4, e manteve-se estável por 48 h a 50°C (Roche
et al., 1994).
Uma α-D-glucuronidase de T. aurantiacus apresentou uma única cadeia de
polipeptídeo com massa molar de 118 kDa (base SDS-PAGE), clivou ligações α -(1-2) entre
ácido 4-O-metil-α-D-glucurônico e resíduos de xilose em xilana e várias glucurono-xilo-
oligossacarídeos. Essa enzima apresentou estabilidade em 70°C com tempo de meia vida de
40 min, temperatura e pH ótimos de 65°C e 4,5, respectivamente (KHANDKE;
VITHAYATHIL; MURTHY, 1989a).
2.4.3 Hemicelulases de Trichoderma reesei
Trichoderma sp é encontrado em quase todos os tipos de solo, principalmente aqueles
ricos em matéria orgânica. Esse fungo foi responsável por estimular pesquisas do exército
norte-americano que observavam a rápida deterioração de material composto de algodão,
como barracas, uniformes e pára-quedas quando atuavam em regiões tropicais. A
denominação T. reesei foi homenagem a Elwyn T. Reese, um dos principais pesquisadores
daquele grupo, que também estudou a biossíntese, estrutura e mecanismos de degradação da
celulose por esse fungo (REESE; MANDELS, 1980).
40
Trichoderma reesei apresenta capacidade de produzir um sistema multienzimático e
induzível de enzimas celulolíticas (EVELEIGH et al., 1985), ao qual já foi relatado a
produção de 2 celobiohidrolases, 6 endo-glucanase e 2 β-glicosidases (GRISHUTIN et al.,
2004; SALOHEIMO et al., 2002). Outras espécies destacam-se pela produção de quitinases,
que degradam a parede celular de fungos fitopatogênicos, assim podem ser empregadas como
agentes de controle biológico, por exemplo, o T. harzianum (SAMUELS, 1996).
Trichoderma reesei é também um eficiente produtor de enzimas do complexo
hemicelulolítico (DURAND et al., 1988; FURUKAWA et al., 2009), composto por 3 endo-
xilanases e uma β-xilosidase (OGASAWARA et al., 2006). A expressão do gene xyn1 ocorre
principalmente pela indução por xilose (MACH et al., 1996), xyn2 por xilobiose e soforose
(ZEILINGER et al., 1996) e xyn3 por celulose e derivados (XU et al., 2000). Xilanases de T.
reesei foram isoladas e caracterizadas, as enzimas XYNI e XYNII apresentaram massa molar
de 19 e 20 kDa e ponto isoelétrico de 5,1 e 9, respectivamente (TÖRRÖNEN; ROUVINEN,
1995). De acordo com Tenkanen, Puls e Poutanen (1992), essas enzimas parecem ser
produzidas por genes distintos, além de agirem preferencialmente sobre a cadeia de xilana do
que sobre XOs.
2.5 PRODUÇÃO DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS
Xilo-oligossacarídeos são oligômeros constituídos de xilose e apresentam variedades
na proporção e tipo de grupos substituintes como acetil, ácidos urônicos e fenólicos. A
composição depende da origem do material e do processo de extração (KABEL et al., 2002).
Os XOs podem ser obtidos basicamente por processos hidrolíticos: básico, ácido ou
enzimático. Uma solução extremamente alcalina remove os grupos acetil e ácidos urônicos,
mas pode despolimerizar a hemicelulose.
A hidrólise da fração hemicelulósica de materiais lignocelulósicos com ácidos seguida
ou não por descompressão súbita (explosão), tem-se mostrado bastante eficiente na produção
de XOs. Na auto-hidrólise ocorre acidificação do meio pela clivagem dos grupos acetil do
substrato, o que pode ocorrer de forma parcial em função da severidade do processo, gerando
XOs acetilados. Nesse processo a produção de XOs depende do conteúdo de grupos acetil na
hemicelulose (NABARLATZ; ENBRIGEROVÁ; MONTANÉ, 2007). A hidrólise pode ser
feita com adição de ácidos e aquecida por certo tempo. A composição de XOs obtidos pela
hidrólise com ácido depende da concentração usada e do tempo de reação. A hidrólise ácida
41
de materiais lignocelulósicos (talo de tabaco, talo de algodão, talo de girassol e palha de trigo)
com 0,25 M de ácido sulfúrico por 30 min de reação, produziu entre 8 e 13% de XOs. Nessa
condição foram produzidos 6 % de xilobiose, 3,5 % de xilotriose e 2 % de xilotetraose,
entretanto produziu cerca de 15 % de xilose e 0,018 % de furfural (AKPINAR; ERDOGAN;
BOSTANCI, 2009). Os autores observaram perfil semelhante para a hidrólise ácida dos
diferentes materiais, porém observaram que nos materiais que contém hemicelulose mais
ramificada há uma maior formação de monossacarídeos e furfural, o qual chegou a 0,5 % na
hidrólise de xilana de palha de trigo.
A auto-hidrólise de sabugo de milho com rampa de temperatura (não isotérmica), de
170 a 216°C por 48 min, extraiu 94 % da xilana e solubilizou 26% da lignina (GARROTE;
DOMÍNGUEZ; PARAJÓ, 2009). A concentração de arabinose no hidrolisado foi de 2 g/L a
195°C. A reação de degradação da hemicelulose ocorreu durante a hidrólise chegando a
furfural (GARROTE; DOMÍNGUEZ; PARAJÓ, 2002b).
A auto-hidrólise de palha de trigo com rampa de aquecimento (150 – 240°C, por 24
min) extraiu 64 % da xilana, sendo 80 % obtido na forma de XOs. A solubilização da lignina
foi de 15 % e de glucana de 16 % (CARVALHEIRO et al., 2009). Devido a remoção de
hemicelulose a fração de glucana no material sólido enriqueceu, chegando a 61 %. A rampa
de temperatura (3,8°C/min) alterou a concentração de ácido acético no meio de 0,64 a 3,19
g/L, e o pH variou de 6,28 a 3,7. A concentração de XOs foi máxima na temperatura de
215°C (10,1 g/L), com o aumento do tempo a concentração diminuiu, chegando a 0,17 g/L a
240°C. Na melhor condição de produção de XOs a concentração de furfural foi de 0,16 g/L,
atingindo 1,37 g/L na temperatura máxima.
A hidrólise ácida apresenta vantagem de ser realizada em curto tempo de reação, mas a
formação de furfural e monossacarídeos são fatores negativos ao ponto de destacar a hidrólise
enzimática como mais apropriada à produção de XOs. A característica de formação de maior
quantidade de xilose do que XOs na hidrólise ácida ocorre independente da origem da xilana
hidrolisada (AKPINAR; ERDOGAN; BOSTANCI, 2009).
A obtenção de XOs por hidrólise enzimática ocorre através da degradação da
hemicelulose isolada. A extração da hemicelulose é feita por método alcalino e obtém-se um
material acessível às enzimas (CARA et al. 2009).
Bagaço de cana, sabugo de milho, farelo de trigo e casca de amendoim foram tratados
com solução de NaOH 4 % (m/v) a 100°C por 3 h, extraindo 15,7, 12,5, 18,5 e 3,5 % de
hemicelulose, respectivamente (YANG; YANG; LIU, 2007). A hidrólise enzimática da
hemicelulose de bagaço com 500 U/g de xilanase, 1,75 U/g de β-xilosidase e 1 U/g de acetil
42
esterase de Thermobifida fusca NTU22 produziu 23,7 % de XOs e 2,85 % de xilose. A
proporção de XOs foi enriquecida para 71,4 % com emprego de carvão ativado (YANG;
YANG; LIU, 2007).
Xilo-oligossacarídeos ramificados podem ser obtidos de algumas fontes de
hemicelulose, como de milho, utilizando extratos enzimáticos deficientes nas enzimas β -
xilosidase, α-glucuronidase e α-arabinofuranosidase. A hemicelulose ramificada de milho
apresenta arabinose:xilose:galactose:ácidos urônicos na proporção 33,8:51,9:6,5:7,4
(PUCHART; BIELY, 2008). Os autores verificaram que o emprego de xilanase da família 11
de Thermomyces lanuginosus produziu XOs, ramificados, com grau de polimerização entre 4
e 8, na ausência das enzimas que removem grupos pendentes. Baseado nos grupos
substituintes, 35 % do total de ácidos urônicos se manteve associado aos XOs.
A hidrólise de xilana de bétula por de xilanase de Thermotoga maritima MBS8,
expressa em E. coli, produziu 66 % de xilobiose, 20 % de xilose e pequenas quantidades de
X3 e X4 (JIANG et al., 2004). O emprego de endoxilanase pura não levou a formação de XOs
ramificados, provavelmente porque essa xilana era pouco ramificada.
Um estudo comparativo entre os diferentes métodos de pré-tratamentos de sabugo de
milho com objetivo de produzir XOs: térmico (121°C por 30 min), ácido (1 g/L H2SO4, 12 h a
60°C) e alcalino (2 % NaOH, temperatura ambiente por 1 noite), revelou melhores resultados
para o processo alcalino. Nesses ensaios o resíduo sólido foi submetido à hidrólise com
enzimas de Aspergilus orizae e os produtos de hidrólise (xilose + XOs) foram cerca de duas
vezes maior para o material pré-tratado com álcali, em relação ao obtido por tratamento
térmico. O tratamento ácido apresentou a menor conversão, o que foi atribuído à prévia
hidrólise da hemicelulose (AACHARY; PRAPULLA, 2009). Os principais produtos da
hidrólise enzimática foram xilobiose (73 %) e xilose (19 %) e outros (7,5 %).
Uma opção promissora para hidrólise enzimática é o emprego de enzima imobilizada,
técnica que permite a reutilização da enzima, podendo inclusive melhorar a sua estabilidade
térmica. Outro aspecto que pode auxiliar no desempenho desse processo é a possibilidade de
uso de hemicelulose solúvel. Um trabalho mostrou que xilanase de Streptomyces
olivaceoviridis E-86 imobilizada em Eudragit S-100 alcançou 80 % de conversão total (xilose
+ XOs) (AI et al., 2005).
43
2.6 PROPRIEDADES E APLICAÇÕES DE XILO-OLIGOSSACARÍDEOS
Os xilo-oligossacarídeos (XOs) apresentam notável potencial para a utilização em
muitos campos, incluindo o setor alimentício (alimentos funcionais, prebióticos, aditivos em
ração de animais domésticos e peixes); no setor farmacêutico (controle da obesidade,
tratamento de infecções gastrointestinais, agente ativo contra osteoporose, otite e disfunções
na pele e cabelo) e na agricultura (estimulante e acelerador do crescimento) (VÁZQUEZ et
al., 2001).
Diversas pesquisas estão sendo realizadas para evidenciar as propriedades físico-
químicas e biológicas de oligossacarídeos. Há estudos relacionados à doçura, amargor,
higroscopicidade, atividade de água, ativação e estabilização de proteína, sabor e cor,
destacando-se sua aplicação como agente de reforço organoléptico em bebidas. Entre as
propriedades biológicas investiga-se a digestibilidade e não-digestibilidade, propriedades anti-
cariogênicas e não-cariogênicas, ação bacteriostática, seletividade a proliferação de
bifidobactéria (NAKAKUKI, 2002). Além dessas vantagens, essas substâncias não
apresentam toxicidade ou exibem efeitos negativos em humanos.
O mercado japonês foi pioneiro na incorporação de XOs aos alimentos (GIBSON et
al., 1995) e em 2001 já existiam aproximadamente 60 empresas utilizando XOs em cerca de
100 produtos alimentícios, sendo alguns de caráter prebióticos (VÁZQUEZ et al., 2001). Um
prebiótico é um ingrediente não-digerível do alimento que afeta beneficamente e estimula
seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um número limitado de bactérias, melhorando
assim a saúde do hospedeiro (GIBSON et al., 2004). Fooks e Gibson (2002) investigaram o
efeito seletivo de prebióticos em microrganismos probióticos e alguns patogênicos comuns à
flora intestinal humana. Os probióticos cresceram em oligofrutose (FOs) e XOs, inibindo o
crescimento dos patógenos Escherichia coli, Campilobacter jejuni e Salmonella enteritidis. A
adição de xilo-oligossacarídeos mostrou potencial em inibir o crescimento de Clostridium sp e
apresentou ação como agente bacteriostático contra Vibrio anguillarum (IZUMI; AZUMI,
2001).
Os xilo-oligossacarídeos apresentam melhor estabilidade a temperatura e pH quando
comparados aos FOs. Quando foram submetidos a condições de pasteurização (30 min, 60 –
100°C em pH 2) os XOs sofreram degradação de cerca de 3 %, enquanto 35 % de FOs foram
degradados. A 121°C/50 min em pH 2 ocorreu degradação de cerca de 16 % dos XOs, os FOs
foram completamente degradados (WANG et al., 2009). Os XOs não são degradados no trato
gastrointestinal pelo baixo pH ou por enzimas digestivas humana e também não são
44
assimilados pela maioria dos microrganismos indesejáveis presentes na flora intestinal
(GIBSON et al., 1995; OKAZAKI; FUJIKAWA; MATSUMOTO, 1990). O trato intestinal
humano contém um complexo ecossistema microbiológico composto por inúmeras espécies
de bactérias. A maioria destas bactérias apresenta capacidade de assimilar açúcar, e algumas
espécies são consideradas como benéficas ao hospedeiro, enquanto outras podem apresentar
potencial patogênico. Em função de seu efeito benéfico é desejável o aumento de
microrganismos probióticos. A aplicação de XOs promove aumento desse tipo de bactérias,
principalmente Bifidobactérias e Lactobacilos. As bifidobactérias utilizam principalmente
xilobiose e xilotriose para seu desenvolvimento (OKAZAKI et al., 1990).
Os oligossacarídeos são considerados como ingredientes em alimentos funcionais,
onde são utilizados em um grau de polimerização de 2 a 12 (NABARLATZ; FARRIOL;
MONTANE, 2004). Além de fornecer modificações úteis ao sabor e às características físico-
químicas do alimento, muitos destes açúcares possuem propriedades que são favoráveis à
saúde dos consumidores, pois não são cariogênicos, possuem baixo valor calórico e
estimulam o crescimento de bactérias benéficas no colon. As aplicações potenciais mais
importantes de XOs, em termos de mercado, correspondem a ingredientes para alimentos
funcionais (por exemplo, em combinação com extrato solúvel de soja, refrigerantes, chá,
produtos derivados de leite (CRITTENDEN; PLAYNE, 1996), iogurtes, doces, bolos,
biscoitos, massas, e em alimentos especiais para idosos e crianças) ou como componentes
ativos de preparações simbióticas (MOURE et al., 2006).
No processamento de alimentos os XOs mostram maiores vantagens em relação à
inulina, em termos de resistência térmica e a ácidos, permitindo sua utilização em sucos com
baixo pH e bebidas carbonatadas (VÁZQUEZ et al., 2001).
Em recentes estudos, ésteres e éteres de xilo-oligossacarídeos têm sido utilizados
como matéria-prima para produção de compostos termoplásticos biodegradáveis, filme
solúvel em água, cápsulas e hidrogel de quitosana-xilana (MOURE et al., 2006). Esses
produtos apresentam valor agregado e uma nobre característica, a biodegradação, que
colabora para um meio ambiente livre de resíduos. Na área de saúde investiga-se a síntese de
compostos a base de xilana e XOs com atividade contra vírus e processos carcinogênicos. A
ação desses compostos é dependente da estrutura do polissacarídeo (MOURE et al., 2006).
Xilo-oligossacarídeos exibem uma série de outras propriedades e revelam uma ampla
gama de aplicações: antioxidante (devido à presença de grupos fenólicos) (HAYASHI;
SAKAKI; DOI, 2005(a); HAYASHI; SAKAKI; DOI, 2005(b); KATAPODIS et al., 2003;
YUAN; WANG; YAO, 2005; INAFUKU et al., 2002); prevenção de anemia e arteriosclerose
45
(MATSUOKA, 2005; KATAPODIS et al., 2003); antialérgico (TAKAHASHI; IKEMIZU,
2005); citotoxicidade contra células com leucemia linfoblástica (ANDO et al., 2004); indutor
de apoptose em células cancerígenas (ITO; YAMAGUCHI; IZUMI, 2001).
Xilo-oligossacarídeos obtidos por hidrólise enzimática de xilana de bétula com
xilanase de T. aurantiacus apresentou atividade contra Helicobacter pilori e moderada
atividade contra Bacilus cereus e Micrococus flavus (Gram-positivo) (CHRISTAKOPOULOS
et al., 2003). Os ensaios de inibição revelaram que 500 µg/mL de XOs apresentaram efeito
semelhante a 100 µg/mL de ampicilina. XOs com grau de polimerização entre 2 e 25 obtidos
por auto-hidrólise de sabugo de milho e eucalipto foram fermentados in vitro por bactérias da
flora intestinal de porco, onde estimulou a proliferação de bifidobactérias e lactobacilos
(MOURA et al., 2008). XOs acetilados e não acetilados obtidos da auto-hidrólise de casca de
amêndoas apresentaram atividade imunoestimulatória, induziram atividade miogênica e
melhoraram a proliferação de células T (NABARLATZ et al., 2007a).
Linhagens de Leuconostoc lactis SHO-47 e SHO-54 foram cultivadas em hidrolisado
de xilana para produção de ácido láctico. XOs com grau de polimerização de 2 a 6 foram
consumido mais rapidamente que xilose, enquanto XOs com grau de polimerização superiores
a 6 não foram consumidos (OHARA; OWAKI; SONOMOTO, 2006). Segundo os autores,
esses microrganismos produzem xilanases intracelulares, sendo necessária a carreação dos
XOs, o que ocorre pelo sistema de transporte fosfoenolpiruvato e fosfotransferase dependente
de açúcar (PEP-PTS). Lactobacilos assimilam lactose, galactose, glicose, manose e frutose,
sendo verificada a absorção preferencial de XOs à xilose. Os autores sugerem que a xilose
formada em excesso pode ser secretada, assim como xilanases induzidas pela presença de
XOs no meio intracelular.
Para comprovar a ação in vivo têm sido realizado testes em humanos. A adição de
arabino-xilo-oligossacarídeos (AXOs) na alimentação humana não influenciou a absorção de
lipídios, mas apresentou a vantagem de não interferir na absorção de proteínas. Foi
comprovado o efeito da colonização do trato gastrointestinal por bactérias não patogênicas. A
análise foi realizada pelo monitoramento do CO2 liberado na respiração de 10 voluntários para
detectar a digestão de lipídios e proteínas (marcados com 14C), na presença e ausência de
AXOs (CLOETENS et al., 2008).
46
2.7 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE XOs
Após a produção dos oligossacarídeos, seja por processos hidrotérmicos ou
enzimáticos, a etapa mais importante é a purificação. Os oligossacarídeos de menor massa
molar são separados dos de alta massa e dos compostos que não apresentam interesse. Nessa
etapa, podem ser empregados processos como evaporação, extração com solvente ou métodos
cromatográficos. Recentemente processos com membranas têm sido utilizados na separação e
concentração de oligossacarídeos.
Os oligossacarídeos de diferentes massas molares podem ser separados por
precipitação com gradiente de etanol, metanol ou acetona, ou por cromatografia com os géis
Sephadex, Sephacryl e Sepharose (YANG; ZHANG, 2009). A purificação de XOs é realizada
por permeação em gel usando grandes colunas empacotadas com Bio Gel P-2 em temperatura
de 26°C usando água como eluente (AACHARY et al., 2009). Os oligossacarídeos ácidos
podem ser separados por cromatografia de troca iônica em DEAE-cellulose e DEAE-
Sepharose (YANG; YANG; LIU, 2007).
Há vários métodos apropriados à análise de oligossacarídeos, baseados principalmente
na separação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou cromatografia gasosa
dos oligossacarídeos pré-derivatizados (CHURMS, 1996). A cromatografia de íons (HPAEC)
combinada à detecção amperométrica é muito eficiente na separação de oligossacarídeos
(LEE, 1996). A cromatografia de camada delgada (TLC), por outro lado é um método simples
que provê muitas informações sobre a composição dos oligossacarídeos na mistura
(PUCHART; BIELY, 2008). A identificação de oligossacarídeos por métodos
cromatográficos é geralmente muito difícil tendo em vista que a eluicão dos oligossacarídeos
não é previsível e que os padrões nem sempre estão disponíveis.
A composição dos oligossacarídeos pode ser determinada por ressonância magnética
nuclear (RMN) através de análise quantitativa do espectro. Normalmente, é necessário uma
grande quantidade de material (1 mg) e a análise é relativamente longa. Contudo, NMR
fornece dados inquestionáveis da caracterização dos oligossacarídeos (HOFFMAN et el.,
1992; KOVAC; HIRSCH, 1980). O uso de MALDI-TOF-MS para análise de oligômeros
revela pequenas diferenças na estrutura dos oligossacarídeos como a presença de diferentes
ferulatos e grupos acetil em diversas posições (SORENSEN et al. 2006)
A auto-hidrólise de materiais lignocelulósicos produz uma grande variedade de
compostos derivados da hemicelulose, lignina e extrativos, o que faz necessário a purificação
do produto de interesse (VÁZQUEZ et al., 2005). A adição prévia de acetato de etila em
47
hidrolisado de eucalipto extraiu vários compostos (ácido esteárico 23 %, ácido palmítico 19
%, e em menor quantidade os ácidos oléico, octadecanodióico, tetradecanodióco), compostos
fenólicos como ácido gálico 7,8 %, e outros compostos originados da lignina (vanilina 1,2 %,
trihidroxibenzeno 2,4 %, seringaldeído 4,8 %, ácido dihidroxibenzóico 0,5 %). A subsequente
extração com propanol resultou na recuperação de 93,8 % de sólidos, entretanto nessa fração
não estavam presentes os derivados de hemicelulose. Com acetona o teor de sólidos foi de
89,2 %, sendo 82,7 % correspondente aos derivados de hemicelulose. O menor teor de sólidos
foi obtido na precipitação com etanol (52,3 %), entretanto foi a maior concentração de
derivados de hemicelulose (86 %), e a menor concentração de monossacarídeos (3,6 %).
Esses resultados foram semelhantes aos obtidos com etapa de purificação mais onerosa, como
cromatografia de troca iônica (ENDO; KURODA, 2000).
Uma solução de XOs (58 %) contendo 16 % de lignina, 4,9 % de monossacarídeos,
4,8 % de compostos inorgânicos e 15 % de compostos não identificados (por exemplo,
produtos provenientes de extrativos) foi submetida à ultrafiltração com membranas de cortes
de 1; 2,5; 3,5 e 8 kDa em pressões de 2,6 a 9 atm (NABARLATZ et al., 2007b). Os autores
observaram uma significante porção dos produtos derivados da lignina junto com
monossacarídeos e XOs mesmo quando utilizaram a membrana de 1 kDa. Apesar dos
esforços, uma única etapa de purificação com membrana não permitiu a separação dos
compostos indesejáveis. Vegas et al. (2008) realizaram auto-hidrólise de talo de arroz e
obtiveram uma fração de 21 % de carboidratos. Esse hidrolisado foi concentrado com
membrana de 1 kDa (6 atm) aumentando essa fração para 71 %, mas manteve ainda 30 % de
compostos não carboidratos (derivados de lignina, extrativos e cinzas). A aplicação desse
concentrado em coluna de troca iônica diminuiu a fração não-carboidrato para 9 %.
Paralelamente, o concentrado foi extraído com acetato de etila e submetido à troca iônica,
obtendo-se uma fração de não-carboidratos de 5,6 %, enquanto a fração de carboidratos
apresentou 91 % de XOs.
48
3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi estudar a extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-
açúcar para aproveitamento através da produção enzimática de xilo-oligossacarídeos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudar as condições de pré-tratamento com peróxido de hidrogênio para extração da
hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar através de planejamento experimental;
Estudar a hidrólise enzimática da hemicelulose do bagaço com xilanases de diferentes
fungos para obtenção de xilo-oligossacarídeos;
Estudar a auto-hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar para obtenção de xilo-
oligossacarídeos;
Avaliar o hidrolisado enzimático da xilana do bagaço como indutor de hemicelulases e
celulases.
49
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Bioquímica e Microbiologia
Aplicada do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena – EEL/
Universidade de São Paulo.
O bagaço de cana-de-açúcar utilizado neste trabalho foi obtido da Companhia
Açucareira do Vale do Rosário, em Orlândia-SP.
4.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS
Os fungos utilizados foram o Thermoascus aurantiacus ATCC 204492, Aspergilus
niger e Trichoderma reesei QM6A.
A. niger, T. aurantiacus e T. reesei foram inoculados em tubos de ágar-malte
inclinado. A. niger e T. reesei foram incubados em estufa com temperatura controlada de
28°C por cerca de 4 dias, enquanto T. aurantiacus foi incubado a 45°C pelo mesmo período.
O meio de cultivo sólido foi preparado com farelo de trigo e solução mineral Czapek
(NaNO3, 2 g/L; KH2PO4, 1 g/L; MgSO4, 0,5 g/L; KCl, 1 g/L e FeSO4, 0,01 g/L) a 75% de
umidade em pH inicial 6. Os frascos foram autoclavados por 15 min a 121°C e inoculados
com 2 x 106 , 2,5 x 106 e 3,7 x 106 esporos/g (contagem em Câmara de Neubauer),
respectivamente para A. niger, T. reesei e T. aurantiacus. Os cultivos foram realizados até 10
dias, sendo um frasco para cada dia de cultivo. No final de cada período de cultivo
acrescentou-se 50 mL de tampão acetato de sódio 20 mM, pH 5,4 aos frascos que foram
agitados durante 1 h em banho de gelo. Seguiu-se a filtração em tecido (gaze) e centrifugação
a 6000xg durante 10 min a 4°C. No sobrenadante foram quantificadas as enzimas.
4.2 ENZIMAS COMERCIAIS
As xilanases comerciais utilizadas foram a Luminase PB-200 (Verenium) (enzima
termoestável), EnzOx® e xilanase de Thermomyces lanuginosus (Sigma).
50
4.3 DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS
Uma unidade (UI) de atividade enzimática foi definida como 1 µmol de produto
liberado por minuto de reação, sendo expressas em U/g de substrato.
4.3.1 Endo-β-1,4-xilanase
A atividade de xilanase foi determinada de acordo com o método de Bailey, Biely e
Poutanen (1992), seguido da quantificação de açúcares redutores liberados a partir da xilana,
pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS - MILLER, 1959). O método consiste em
acompanhar a reação de 900 μL de xilana 1 % (preparada em tampão acetato de sódio 50 mM,
pH 5,4) com 100 μL de extrato enzimático a 50°C por 5 minutos. A reação foi interrompida
pela adição de 1,5 mL do reagente DNS (ácido 3,5- dinitrossalicílico). No ensaio controle o
reagente de DNS foi adicionado antes da adição da enzima. Os tubos de ensaio foram fervidos
a 100°C em banho-maria por 5 minutos e depois de resfriados foi feita a leitura da
absorbância em espectrofotômetro a 540 nm, a qual foi convertida em concentração de xilose
através da curva analítica (2 a 20 µmol/mL).
4.3.2 Endo-β-1,4-glucanase
A atividade de endo-β-1,4-glucanase foi determinada segundo técnica descrita por
Tanaka et al. (1981), seguido da quantificação de açúcares redutores, determinada pelo
método do DNS (MILLER, 1959). O método consiste em acompanhar a reação de 900 μL de
carboximetilcelulose 0,44% (preparada em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4) com 100
μL de extrato enzimático a 50°C por 30 minutos.
A reação foi interrompida pela adição de 1,5 mL do reagente DNS (ácido 3,5-
dinitrossalicílico). No ensaio controle o reagente de DNS foi adicionado antes da adição da
enzima. Os tubos de ensaio foram fervidos a 100°C em banho-maria por 5 minutos e depois
de resfriados foi feita a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 540 nm, a qual foi
convertida em concentração de glicose através da curva analítica (1 a 11 µmol/mL).
51
4.3.3 β-xilosidase
A atividade β-xilosidase foi determinada utilizando p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo
(pNPX) como substrato enzimático. O p-nitrofenol liberado após ação da β -xilosidase foi
determinado pela leitura da absorbância a 410 nm (TAN; MAYERS; SADDLER, 1987). Os
valores de absorbância obtidos foram transformados em micromoles de p-nitrofenol
relacionados à curva analítica de p-nitrofenol (50 a 300 µmol/mL). Uma unidade de atividade
enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol
de p-nitrofenol por minuto. O método consiste em acompanhar a reação de 400 μL de pNP X
a 0,1% (preparado em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8) com 100 μL de extrato
enzimático a 50°C por 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 1,0 mL de
bicarbonato de sódio 10%. O ensaio controle foi realizado com a adição do bicarbonato de
sódio antes da enzima.
4.3.4 α-L-arabinofuranosidase
A atividade α-L-arabinofuranosidase foi determinada utilizando p-nitrofenil-α-L-
rabinofuranosideo (pNPA). O método consiste em acompanhar a reação de 400 μL de pNPA a
0,1% (preparado em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8) com 100 μL de extrato
enzimático a 50°C por 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 1,0 mL de
bicarbonato de sódio 10 %. O ensaio controle foi realizado com a adição do bicarbonato de
sódio antes da enzima. O p-nitrofenol liberado pela a ação da α-L-arabinofuranosidase foi
determinado pela leitura de absorbância a 410 nm (TAN; MAYERS; SADDLER, 1987), os
valores foram convertidos com curva analítica (50 a 300 µmol/mL).
4.3.5 Efeito do pH na atividade de xilanase
O efeito do pH foi determinado através da medida da atividade de xilanase em
soluções de xilana (birchwood) 1% (Sigma, USA) preparada em tampão citrato fosfato 50
mM (pH 3 – 7) e tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 7 – 9), seguindo a metodologia de
Bailey et al., (1992) para a determinação da atividade enzimática.
52
4.3.6 Efeito da temperatura na atividade e na estabilidade da xilanase
Para determinação do efeito da temperatura a reação enzimática foi conduzida nas
temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90°C, nas condições descritas no método padrão para
determinação da atividade (BAILEY et al., 1992).
Para determinação da estabilidade térmica as enzimas de T. aurantiacus foram
incubadas a 50, 60 e 70°C e de A. niger e T. reesei a 30, 40 e 50°C. A atividade de xilanase
foi monitorada em função do tempo de incubação. As enzimas foram colocadas em tubos
“eppendorf” de 1 mL e em tempos definidos foram retirados do banho com temperatura
controlada e um volume de 100 µl de enzima foram transferidos para tubos contendo solução
de xilana 1% para determinação da atividade enzimática. Considerou-se que a atividade
enzimática diminui exponencialmente ao longo do tempo obedecendo a um modelo de
primeira ordem de desativação das enzimas, cuja equação pode ser representada por:
-(dA/dt) = kd*A
A = Ao*exp(-kd*t)
Onde:
Ao= atividade enzimática inicial;
A= atividade enzimática no tempo t;
Kd= constante de desativação (min-1);
t= tempo de reação (min)
O tempo de meia vida (t1/2) das enzimas foi definido como o tempo no qual após
incubação a uma definida temperatura, a atividade residual da enzima foi 50 % da atividade
original, sendo determinado de acordo com a equação 6:
ln(A/Ao) = -kd* t1/2
t1/2 = ln2/kd (6)
4.4 EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM
NaOH
O bagaço foi seco em estufa a 60°C por cerca de 12 h, moído em um moinho de facas
(Manesco & Manieri) e selecionado por uma peneira de 25 mesh. O bagaço foi caracterizado
quimicamente de acordo com o item 4.6.
53
A Figura 10 mostra o esquema usado para a extração da hemicelulose do bagaço.
Inicialmente foi feita uma extração do bagaço em etanol 95% (v/v) por 6 h, em aparelho
Soxhlet. Após extração o material foi seco em estufa com circulação de ar a 60°C durante 12
h. Cem gramas do material foram hidrolisados com 2,5 L de NaOH 1 M por 18 h a 25°C, com
atmosfera de nitrogênio e agitação mecânica. Após a reação, o material foi filtrado e o
resíduo rico em celulose foi lavado com água destilada até a neutralidade e seco em estufa a
60°C. O pH do filtrado foi imediatamente corrigido para 6,0 com adição de HCl 6 M. Esta
solução foi concentrada cerca de 3 vezes (relação volume) em uma estufa com circulação de
ar a 45°C e precipitada utilizando 3 volumes de etanol 95%. Após a sedimentação do
material, o sobrenadante foi removido e ao precipitado adicionado uma solução de etanol
70%. Esta etapa, lavagem com etanol, foi repetida (cerca de 4 vezes) até que obteve-se um
sobrenadante límpido (XU et al., 2006). O resíduo foi separado e seco em estufa a 45°C.
Foram também avaliados os efeitos da adição antraquinona (AQ) 0,3 % (m/m) e
sulfito de sódio 0,3 % (m/m) à solução de NaOH na extração da hemicelulose.
Extração com etanol 95% (v/v) em Soxhlet por 6 h
Figura 10. Representação esquemática dos procedimentos utilizados para separação dos constituintes principais do bagaço de cana-de-açúcar e extração alcalina da hemicelulose.
Bagaço de cana-de-açúcar
Bagaço livre de extrativos
Tratamento com NaOH 1 M por 18 h a 25°C
Resíduo rico em celulose
filtrado
Neutralizado com HCL 6 M para pH 6 Concentrado em estufa a 45°C Precipitação com etanol 3 volumes
Lavagem com etanol 70 % e seca a 45°C
filtrado pellets
Lignina solúvel
Hemicelulose solúvel em meio
alcalino
54
4.5 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM
H2O2 EM MEIO ALCALINO
O bagaço moído a 25 mesh foi tratado com solução de ácido tetracético etilenodiamina
(EDTA) 0,2 % (m/v) durante 1h a 90°C para remoção de metais (FANG et al., 1999). Dez
gramas de bagaço foram colocados em frascos plásticos de 1L, seguido da adição dos
reagentes preparados em um volume de 200 mL, o pH foi ajustado em 11,6, e o meio foi
agitado a 80 rpm.
Para avaliar a influência das variáveis: temperatura, concentração de peróxido de
hidrogênio, tempo reacional e concentração de sulfato de magnésio na extração de
hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar foi empregado um planejamento fatorial completo
24 com três repetições no ponto central (Tabela 1).
Tabela 1- Planejamento fatorial completo 24 para avaliação do processo de extração da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar sob diferentes condições operacionais. Níveis codificados das variáveis Níveis reais das variáveis
Exp A B C D Temp (°C) H2O2 % (m/v) Tempo (h) MgSO4 % (m/m)
1 - - - - 20 2 4 0
2 + - - - 60 2 4 0
3 - + - - 20 6 4 0
4 + + - - 60 6 4 0
5 - - + - 20 2 16 0
6 + - + - 60 2 16 0
7 - + + - 20 6 16 0
8 + + + - 60 6 16 0
9 - - - + 20 2 4 0,5
10 + - - + 60 2 4 0,5
11 - + - + 20 6 4 0,5
12 + + - + 60 6 4 0,5
13 - - + + 20 2 16 0,5
14 + - + + 60 2 16 0,5
15 - + + + 20 6 16 0,5
16 + + + + 60 6 16 0,5
17* 0 0 0 0 40 4 10 0,25
*experimento realizado em triplicata, correspondente ao ponto central.
55
Após atingir os tempos de reação, os procedimentos de filtração e etapas seguintes
foram realizados como descrito no item 4.4. A análise estatística dos dados obtidos foi
realizada utilizando-se os programas “Design Expert” e “Estatistica 6.0”.
4.6 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO E DA HEMICELULOSE
Em tubo de ensaio foi pesado aproximadamente 300 mg de bagaço ou hemicelulose. A
massa seca da amostra foi anotada e a ela adicionou-se 1,5 mL de H2SO4 72 % (m/m), a
reação ocorreu a 45ºC por 7 minutos. A reação foi interrompida com adição de 45 mL de água
destilada, transferindo o conteúdo do tubo para um Erlenmeyer de 250 mL. Essa mistura foi
autoclavada a 121ºC por 30 minutos (ROCHA, 2000).
O conteúdo do Erlenmeyer foi filtrado em filtro de placa porosa de vidro sinterizado nº
4, previamente tarado. O resíduo sólido foi lavado com água destilada, seco em estufa a
105ºC até peso constante para a determinação da massa de lignina insolúvel (Klason). A
fração solúvel foi diluída para 100 ml em um balão volumétrico e utilizada para a
determinação dos teores de glicose, xilose e ácido acético por cromatografia líquida. A partir
dessas concentrações foram calculados os teores de glucana, xilana e acetil, multiplicando as
porcentagens de cada composto por 0,9, 0,88 e 0,72, respectivamente. Os fatores
mencionados se referem à adição de água aos polissacarídeos durante a hidrólise ácida.
O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado por medida de absorbância em 205
nm. Para o cálculo da concentração de lignina solúvel foi utilizada uma absortividade de 105
L/g.cm nesse comprimento de onda (DENCE, 1992).
4.6.1 Determinação do teor de cinzas
O teor de cinzas do bagaço foi determinado de acordo com metodologia de Silva e
Queiroz (2005). Dois gramas do bagaço foram pesados em cadinho de porcelana previamente
calcinado e tarado a 300°C por 2 h a 1100°C pelo mesmo tempo. Após a calcinação do
material nas mesmas condições, o cadinho foi resfriado em dessecador e pesado. O teor de
cinzas foi calculado pela diferença entre as massas do cadinho com cinzas e vazio (Equação
7).
56
Cinzas (%) = (M2 – M1)/M3x100 (7)
Onde:
M1 = massa do cadinho calcinado;
M2 = massa do cadinho com cinzas;
M3 = massa do bagaço seco.
4.6.2 Determinação de ácidos urônicos
A determinação de ácidos urônicos foi realizada pelo método colorimétrico do ácido
sulfúrico-carbazole de acordo com Li et al. (2007). Um volume de 0,4 mL do hidrolisado
ácido, obtido da hidrólise da hemicelulose com ácido sulfúrico concentrado (item 4.6), foi
adicionado em tubo de ensaio, seguido por 2,4 mL de ácido sulfúrico concentrado. Quando a
mistura atingiu temperatura ambiente foi adicionado 0,1 mL de solução carbazole (0,1 % m/v
em etanol). O tubo foi fechado com filme de polietileno e aquecido em banho-maria a 100°C
por 20 min, seguido por resfriamento em banho de gelo. Realizou-se leitura da absorbância
em espectrofotômetro a 525 nm, a qual foi convertida em concentração de ácido urônico
através da curva analítica com ácido galacturônico (17 a 139 nmol/mL).
4.7 EFICIÊNCIA DA EXTRAÇÃO DE HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR
A eficiência da extração de hemicelulose foi calculada relacionando a quantidade de
hemicelulose obtida (g) pela quantidade de bagaço submetido ao pré-tratamento (g), segundo
a equação 8.
E= Wx * 100 (8) F*Wb Onde:
E = eficiência da extração (%)
Wx = massa de hemicelulose obtida
Wb = massa de bagaço hidrolisado
F= porcentagem de hemicelulose presente no bagaço.
57
4.8 SOLUBILIDADE DA HEMICELULOSE
A solubilidade da hemicelulose foi determinada de acordo com método de Bailey;
Biely; Poutanen, 1992. O método consistiu em preparar uma solução de xilana 1% em tampão
acetato de sódio 50 mM, pH 4,8, em um Erlenmeyer de 250 mL. O frasco foi tampado com
filme de policloreto de vinila (PVC) e aquecido sob agitação magnética até atingir o ponto de
ebulição, em seguida a solução foi resfriada e permaneceu sob agitação de 80 rpm por uma
noite a 25°C. A solução foi centrifugada a 10000xg por 15 min para separação do material
insolúvel, o qual foi seco em estufa a 60°C até massa constante.
4.9 ANÁLISE DA HEMICELULOSE POR ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO
As amostras de hemicelulose foram secas em estufa a 60°C por uma noite, moídas em
almofariz e armazenadas em dessecador. A análise foi realizada com cerca de 2 mg de
amostra homogeneizada com 225 mg de KBr, utilizando um equipamento Perkin Elmer -
Spectrum GX. Os espectros de IR foram obtidos a partir de 32 scans, na região entre 4000 e
400 cm-1, e digitalizados em intervalos de 4 cm-1. A linha de base foi corrigida em regiões
próximas a 4000, 2400 e 800 cm-1, e o espectro normalizado em 900 cm-1. Os dados foram
analisados por análise de componentes principais (PCA) utilizando os softwares FAEN e
BIOTEC.
4.10 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLAR DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE
CANA
A massa molar da hemicelulose foi determinada por cromatografia de exclusão
molecular em uma coluna Superdex 200 (30 x 1 cm – Amershan Bioscience). As amostras
foram dissolvidas em solução NaOH 0,5 % em uma concentração de 2 g/L de hemicelulose, o
volume de injeção foi de 100 µL, fluxo de 0,3 mL/min sendo o eluente solução de NaOH 0,1
% (SARBU; GONÇALVES; PINHO, 2003). A coluna foi calibrada com polietileno glicol
(PEG) (10000 e 6000 g/mol), albumina (67000 g/mol), tripsinogênio (24000 g/mol) e
lisozima (14000 g/mol). Os dados da calibração foram linearizados em uma equação do tipo
log M= a + bVe, onde M é a massa molar e Ve o volume de eluição, a e b representam os
58
coeficientes da equação.
A detecção da hemicelulose eluída da coluna foi feita pelo método do fenol/ácido
sulfúrico (DUBOIS et al., 1956). A área dos cromatogramas correspondente aos picos foi
dividida em n áreas parciais. Cada área parcial foi aproximada à área de um trapézio, sendo
que cada incremento de volume de eluição a massa molar (Mi) foi calculada pela curva de
calibração. A massa molar numérica média (Mn) e massa molar média (Mw) foram
calculados através das seguintes equações 9 e 10:
Mn = ∑Áreai Eq. (9)
∑Áreai/Mi
Mw = ∑Áreai
4.11 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE EXTRAÍDA DO BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR
Mi Eq. (10)
∑Áreai
A polidispersidade foi calculada pela relação Mw/Mn.
Os experimentos foram conduzidos em tubos de centrífuga de 50 mL com tampa,
contendo 6,0 mL de tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5) em banho-maria a 50°C com
agitação de 120 rpm. Dependendo do experimento variou-se a concentração de hemicelulose,
enzimas e tempo de incubação. Para prevenir a contaminação microbiológica foi adicionado
azida sódica 0,01 % (m/v). A reação foi conduzida com as enzimas de A. niger, T. reesei e T.
aurantiacus produzidas em farelo de trigo (item 4.1). Em intervalos de tempo foram coletados
os tubos para o monitoramento do teor de açúcares e xilo-oligossacarídeos. Após atingir o
tempo reacional, o pH da reação foi corrigido para 6,5, e os tubos aquecidos em banho-maria
a 100°C durante 5 minutos (ISHIHARA et al., 1997). As amostras foram previamente
centrifugadas a 10000xg por 15 minutos (KALOGERIS et al., 2003).
Para maximizar a hidrólise da hemicelulose foram realizados ensaios com as variáveis:
concentração de substrato (% m/v) e atividade enzimática (U/g), de acordo com um
planejamento fatorial 22 completo com triplicata no ponto central (Tabela 2). A variável-
resposta foi conversão em xilo-oligossacarídeos (XOs total).
59
Tabela 2- Planejamento fatorial completo 22 para avaliação da hidrólise enzimática da hemicelulose.
Experimento Substrato (% m/v) Enzima (U/g)
1 0,5 80
2 0,5 40
3 3,5 80
4 3,5 40
5* 2 60
* experimentos realizados em triplicata, correspondentes ao ponto central
A conversão da hemicelulose em XOs foi calculada pela relação entre a massa de
oligômeros gerados pela massa de hemicelulose inicial. A conversão da hemicelulose em
xilose foi calculada pela relação entre a massa de xilose gerada pela massa inicial de
hemicelulose. A conversão total foi calculada pela relação entre a soma das massas de xilose e
XOs gerados pela massa de hemicelulose inicial. A concentração de XOs (mg/mL) foi obtida
pela soma das concentrações de X2 + X3 + X4 + X5 presentes no hidrolisado, determinados
por cromatografia líquida.
4.12 HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS SUCESSIVAS DA HEMICELULOSE
O resíduo não hidrolisado, proveniente da hidrólise enzimática (item 4.11), foi
separado por centrifugação a 10000xg por 15 min. Uma nova hidrólise foi realizada nas
mesmas condições. A massa de resíduo não hidrolisado foi determinado pela diferença da
massa inicial pela massa de produtos formados (XOs e xilose).
4.13 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
A auto-hidrólise foi realizada com o bagaço in natura e moído a 14 e 25 mesh. Foram
utilizadas ampolas de capacidade 200 mL, confeccionadas em aço-inox, com aquecimento
em banho de óleo com controle de temperatura. Ao final das reações (5, 15, 20, 25, 30, 35
45 e 60 min) o resíduo sólido e o hidrolisado foram separados por filtração e caracterizados
quanto à concentração de xilose, arabinose, xilo-oligossacarídeos e furfural por
60
cromatografia líquida. Uma amostra do resíduo seco foi caracterizada quimicamente para
avaliar a eficiência do processo de remoção da fração hemicelulósica do material
lignocelulósico, segundo metodologia apresentada no item 4.6.
4.14 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS
As concentrações de oligossacarídeos foram determinadas por cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE), em equipamento WATERS, nas seguintes condições: coluna BIO-
RAD Aminex HPX-42A (300 x 7,8 mm); temperatura: 60°C; eluente: água ultrapura com
fluxo 0,6 mL/min; volume de amostra: 20 µL; detector: índice de refração (Waters 2414). O
pH das amostras foram previamente ajustados para 6,5 com NaOH 1 M e filtradas em filtro
“Sep-Pack” C18. Foram utilizados como padrões soluções de xilose (Sigma) e de xilobiose
(X2), xilotriose (X3), xilotetraose (X4) e xilopentaose (X5) (Megazyme-Irlanda).
4.15 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES, ÁCIDO ACÉTICO E
FURFURAL
As concentrações de glicose, xilose, arabinose e ácido acético foram determinadas por
CLAE, utilizando uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) mantida a 45°C,
detector de índice de refração WATERS 2414, fase móvel de H2SO4 0,005 M, fluxo de 0,6
mL/min, volume de amostra injetada de 20 μL. As amostras foram previamente filtradas em
filtro “Sep-Pack” C18 (Millipore).
As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram determinados utilizando
uma coluna Waters Resolve C18 (300 x 3,9 mm) mantida a 30°C, detector UV em 276 nm
(WATERS 2489), fase móvel composta por acetonitrila:água 1:8 com 1 % de ácido acético
(degaseificada), fluxo de 0,8 mL/min, volume de amostra injetada de 20 μL. As amostras
foram previamente filtradas em membrana de 0,45 µm (Millipore). As concentrações de
furfural e hidroximetilfurfural foram calculadas com curva de calibração obtida com padrões
e convertidas nos respectivos polissacarídeos de origem através dos fatores 1,29 e 1,37,
respectivamente para celulose e hemicelulose.
61
4.16 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (TLC)
Os produtos da hidrólise enzimática de xilanas de bagaço de cana-de-açúcar, bétula e
semente de aveia foram analisados por cromatografia em camada delgada para identificar os
XOs formados. A cromatografia ascendente foi realizada em placas de sílica gel 60 F254
(Merck) empregando como solvente uma mistura de acetato de etila:ácido
acético:propanol:ácido fórmico:água (25:10:5:1:15) (PUCHART; BIELY, 2008). A solução
reveladora foi preparada dissolvendo-se 1,8 g de N-(1-Nafitil)-etilenodiamina dihidrocloreto
em 200 mL de etanol e, sob agitação constante, foi adicionado lentamente 20 mL de ácido
sulfúrico concentrado.
As amostras e padrões foram colocadas a 1 cm da parte inferior da placa através de
aplicações sucessivas de 1 μL (2 a 4 aplicações), a uma distância de 0,8 cm uma da outra,
secas com um secador de ar quente a cada aplicação. Uma cuba com tampa foi utilizada para
acondicionar o solvente e a placa, que foi colocada na posição vertical. Após o solvente
ascender ao topo da placa, esta foi retirada e seca com secador de ar quente até que estivesse
livre de solvente. A revelação das amostras foi realizada por imersão da placa na solução
reveladora e seca em estufa a 110°C por aproximadamente 5 min ou até o aparecimento de
manchas.
4.17 ENSAIOS DE INDUÇÃO DE ENZIMAS DE T. aurantiacus
Cerca de 104 esporos de T. aurantiacus foram inoculados em 25 mL de meio
preparado com sais de Vogel e 1 % de glicose (pH 5,8) em Erlenmeyer de 125 mL. Os frascos
foram incubados a 45°C por 72 h em condição estática. O excesso de líquido foi então
retirado e o micélio lavado com 100 mL de água destilada e autoclavada (15 min/1 atm).
Meios preparados com sais de Vogel e 20 mM de xilose, xilobiose ou xilana hidrolisada
enzimaticamente (HXBC) foram adicionados aos frascos contendo micélio. A concentração
final foi de 20 mM, correspondente a 3,5 mg/mL de xilose, 7 mg/mL de xilobiose e 6.8
mg/mL de HXBC. A composição de HXBC era xilose, xilobiose e XOs e foi produzido pela
hidrólise da hemicelulose do bagaço com enzimas de T. aurantiacus (2,6 % de hemicelulose,
60 U/g de xilanase, 96 h a 50°C).
Após 6, 10, 24 e 30 h de cultivo a 45°C e 120 rpm amostras foram retiradas e
62
centrifugadas a 10000xg por 15 min e no sobrenadante foram determinadas as atividades de
celulases e hemicelulases, o consumo de substrato foi monitorado por cromatografia líquida.
63
5. RESULTADOS
5.1 EXTRAÇÃO DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Com o objetivo de maximizar a extração de hemicelulose foram investigadas as
condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com hidróxido de sódio, realizando
a análise dos efeitos das variáveis: tempo, temperatura e concentração de peróxido de
hidrogênio.
5.1.1 Análise química do bagaço de cana-de-açúcar
A composição química do bagaço está apresentada na tabela 3. A conversão dos
açúcares em seus respectivos polissacarídeos revelou 44,9 % de celulose e 27,5 % de
hemicelulose. O teor de lignina foi calculado como a soma dos valores de lignina solúvel e
insolúvel em ácido sulfúrico e correspondeu a 22,1 %. Para o cálculo de rendimento de
extração de hemicelulose foi utilizada a porcentagem de hemicelulose de 25,2 % (xilose +
arabinose, sem ácido acético), uma vez que no processo de extração da hemicelulose em meio
alcalino ocorre saponificação dos grupos acetil.
Os valores obtidos para a composição do bagaço estão próximos da faixa reportada em
outros trabalhos, ou seja, 32-44 % de celulose, 27-32 % de hemicelulose, 19-24 % de lignina
e 1,5-5 % de cinzas (PANDEY et al., 2000; SIXTA, 2006). As variações no teor desses
componentes ocorrem em função de fatores como a espécie da cana e o tempo de colheita
(Tabela 4).
Tabela 3- Composição química do bagaço de cana-de-açúcar. Componentes % (m/m)
Glicose 49,89 ± 0,70
Xilose 25,33 ± 0,12
Arabinose 3,31 ± 0,10
Ácido acético
Lignina
3,20 ± 0,08
22,1 ± 1,03
Cinzas 1,61 ± 0,16
Extrativos 4,11 ± 0,07
64
Tabela 4- Composição do bagaço de cana-de-açúcar de diferentes procedências.
Composição (% massa seca)
Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas Referências
50 25 25 2,4 Pandey et al., 2000
38,9 26,19 23,9 - Rodríguez-Chong et al., 2004
41 25,2 23 1,1 Pessoa et al., 1997
40 24 25 - Saha, 2003
35 35,8 16,1 - Sasaki et al., 2003
43,6 33,5 18,1 2,3 Sun et al., 2004a
46,2 27,8 22,1 1,0 Santos et al., 2009
44,9 27,5 22,1 1,6 Presente trabalho
(-) não apresentado
Com relação ao percentual de hemicelulose, o valor encontrado para o bagaço de cana-
de-açúcar foi semelhante ao da palha de trigo (26 %) (CANILHA, 2006) e um pouco superior
ao da palha de arroz (22 %) (GARROTE et al., 2007; MUSSATO, 2002) e eucalipto (17,3 %)
(KABEL et al., 2002; PARAJÓ; ALONSO; SANTOS, 1995).
O bagaço apresentou um baixo teor de cinzas (1,61 %) quando comparado com alguns
materiais, como a palha de arroz (13,3 %) (SUN et al., 2000a), sabugo de milho (8,6 %)
(GASPAR et al., 2005) e palha de trigo (10,1 %) (THOMPSON et al., 2003).
5.1.2 Extração alcalina da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar
As hemiceluloses extraídas com álcali apresentaram cor escura e baixa solubilidade
em água (34 ± 4 %). O tratamento com NaOH, NaOH/antraquinona (NaOH/AQ) e
NaOH/sulfito resultou em uma extração de 72,7, 76,5 e 76,4 % da hemicelulose,
respectivamente (Tabela 5). O rendimento foi próximo para as três extrações e superiores ao
obtido por Xu et al. (2006) (55,7 a 57,3 %) quando utilizaram NaOH. Uma explicação para
essa diferença pode estar relacionada ao modo de separação da hemicelulose. No trabalho de
Xu et al. (2006) a hemicelulose foi separada por filtração e neste trabalho o procedimento
usado foi a decantação. Esse procedimento evitou perdas de hemicelulose, por exemplo por
aderência ao filtro.
65
Tabela 5- Rendimento de extração e composição da hemicelulose obtida com NaOH 1 M, NaOH/AQ e NaOH/Sulfito a 25°C por 18 h. Composição da hemicelulose (% massa seca)
Rendimento
extração (%) Lignina Xilose Arabinose Glicose Ac urônico Total
NaOH1 72,70a ± 4,43 9,09b ± 0,37 54,79± 1,98 6,05± 0,19 3,79 ± 0,35 5,14 ± 0,14 78,86
NaOH/AQ2 76,50a ± 4,22 11,17c ±1,02 52,88± 2,14 5,73± 0,15 3,26 ± 0,25 5,12 ± 0,37 78,16
NaOH/Sulfito3 76,40a ± 3,37 7,43d ± 0,34 57,82± 1,15 6,39± 0,13 3,94 ± 0,26 4,57 ± 0,22 80,15
Concentração de AQ e Sulfito: 0,3 % (m/m) a, b, c e d: Letras semelhantes, na mesma coluna, indicam médias estatisticamente iguais (análise de semelhança estatística realizada com Design Expert); Rendimento de extração calculado descontando-se a massa de lignina.
As hemiceluloses extraídas do bagaço com NaOH, NaOH/AQ e NaOH/Sulfito
apresentaram respectivamente 9,0, 11,2 e 7,4 % de lignina (Tabela 5). No trabalho de Xu et
al. (2006) o conteúdo de lignina foi de cerca de 3 % quando utilizaram NaOH. Verificou-se
que a adição de 0,3% de antraquinona na etapa de extração proporcionou um pequeno
aumento no rendimento total, mas que não foi causado por maior retenção de carboidratos.
Sun et al. (2000b) mostraram que a adição de 0,05 % (m/v) de AQ resultou em pouco efeito
sobre a deslignificação da palha de trigo, mas resultou em aumento de 2,8% no rendimento de
extração da hemicelulose com peróxido de hidrogênio.
As condições utilizadas na extração da hemicelulose do bagaço não eliminaram toda a
lignina, tendo em vista que as ligações éter glicosídicas e a ligação carboidrato-lignina são
relativamente estáveis nessas condições (LAWOKO; HENRIKSSON; GELLERSTED, 2003).
Em função dessa ligação, a lignina comercial apresenta de 2 a 8% de carboidratos (SINGH et
al., 2005). Saake et al. (2004) também relataram a extração de hemicelulose de semente de
aveia com teor de 14,5 % de lignina e rendimento em massa de polissacarídeo de 34,6%. Os
autores observaram que nas condições experimentais: NaOH 5 % (m/v), 1h e temperatura (70
- 90°C), obteve-se um rendimento de extração de 34,6-40,4 % e 14,5-15,4 % de lignina
residual.
66
5.1.3 Otimização da extração da hemicelulose
O pré-tratamento alcalino mostrou-se efetivo para a extração da hemicelulose do
bagaço de cana, no entanto para melhorar o rendimento de extração e obter uma hemicelulose
mais solúvel foram testadas novas variáveis de tratamento que levassem a um menor teor de
lignina sem comprometer o rendimento da extração. Desta forma, os reagentes antraquinona e
sulfito foram desconsiderados na otimização da extração da hemicelulose já que não
trouxeram grandes benefícios ao processo.
Para a otimização da extração da hemicelulose, variou-se o tempo, a temperatura, a
concentração de peróxido de hidrogênio e de sulfato de magnésio. Optou-se por um
planejamento 24 completo, esperando encontrar o máximo global nesse intervalo. As análises
referentes à composição de açúcares e concentração de lignina estão apresentadas na tabela 6
que mostra as variáveis para cada um dos ensaios realizados, sendo os ensaios 17, 18 e 19
repetições no ponto central.
Os rendimentos de extração da hemicelulose variaram de 38,3 a 94,5%. O menor
rendimento foi obtido usando as variáveis no nível mais baixo, exceto para sulfato de
magnésio (ensaio 9) e o maior rendimento foi obtido na condição do ponto central (Tabela 6).
Observa-se uma tendência de aumento do rendimento de hemicelulose ao variar o peróxido de
hidrogênio de 2 para 6%. O tempo foi outro fator que influenciou a eficiência de extração da
hemicelulose, indicando que maiores tempos de extração podem ser importantes para maiores
rendimentos, contudo tempos de extração maiores que 10 h podem ocasionar alterações na
estrutura molecular do polissacarídeo (CAI et al., 2008).
A análise estatística foi realizada com a massa de extração de hemicelulose para
considerar o teor de lignina residual presente em cada ensaio. A concentração de peróxido de
hidrogênio e o tempo de tratamento tiveram um efeito significativo com um sinal positivo,
indicando que o rendimento da hemicelulose foi maior quando essas variáveis foram
aumentadas. A maior influência na resposta foi produzida por peróxido de hidrogênio (p <
0,01). O sulfato de magnésio resultou em efeito negativo na extração da hemicelulose, e
apenas a temperatura (A) não influenciou significativamente o rendimento de extração de
hemicelulose, entretanto, apresentou interações com as demais variáveis (Tabela 7). As
interações da temperatura com peróxido de hidrogênio (AB) e sulfato de magnésio (AD)
apresentaram efeito positivo, enquanto que a interação com o tempo (AC) foi negativa. Deste
modo, o seu efeito não deve ser descartado, principalmente em função da interação negativa
entre as variáveis, temperatura e tempo de reação. A combinação da temperatura e tempo nos
67
níveis altos deve ser evitada para a obtenção de maior rendimento de extração. Xu et al.
(2006) observaram que fixando o tempo reacional, a temperatura apresentou baixa influência
no rendimento de extração da hemicelulose. Nas temperaturas de 20 e 40°C obteve 55,5 e
62,1% de rendimento de extração, respectivamente.
Tabela 6. Rendimento de hemicelulose (%) extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo.
Nível das variáveis
Ensaio A B C D Rendimento de extração
da hemicelulosea (%) Ligninab (%)
1 20 2 4 0 52 10 2 60 2 4 0 49,1 10,2 3 20 6 4 0 86 5,9 4 60 6 4 0 74,2 12,2 5 20 2 16 0 67 14,1 6 60 2 16 0 49,5 13,7 7 20 6 16 0 78 7,4 8 60 6 16 0 60,8 9,6 9 20 2 4 0,5 38,3 9,3
10 60 2 4 0,5 46 9,1 11 20 6 4 0,5 52,5 5 12 60 6 4 0,5 79,8 7,2 13 20 2 16 0,5 72,6 12,9 14 60 2 16 0,5 66,6 9,2 15 20 6 16 0,5 60,9 4,6 16 60 6 16 0,5 64,9 6,1 17 40 4 10 0,25 90,5 11 18 40 4 10 0,25 93,5 10,4 19 40 4 10 0,25 94,5 8,9
A: Temperatura (oC); B: Concentração de H2O2 (%); C: Tempo de reação (h); D: Sulfato de magnésio (%)
(a) Rendimento de extração calculado descontando-se a massa de lignina.
(b) Representa o conteúdo de lignina associado às hemiceluloses
Muitos trabalhos reportam que a extração de hemicelulose é proporcional ao aumento
no tempo e concentração de peróxido de hidrogênio (FANG et al., 1999; SUN et al., 2000a,
CAI et al., 2008), entretanto, os resultados mostraram um mesmo rendimento de extração da
hemicelulose usando o maior tempo e menor concentração de peróxido de hidrogênio ou vice-
versa.
68
Tabela 7 – Análise de variância do modelo e significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o rendimento de extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino.
Fatores Efeitos Soma quadrática Graus de
liberdade
Média
quadrática
Nível de
significância (p)
A -2,41 10,68 1 10,68 0,5259
B* 18,15 607,0 1 607,0 0,0030
C* 9,38 162,24 1 162,24 0,0112
D* -8,95 147,56 1 147,56 0,0123
BC* -20,77 83,49 1 83,49 0,0214
AD* 14,33 286,03 1 286,03 0,0064
AC* -12,46 378,4 1 378,4 0,0048
CD* 9,95 795,66 1 795,66 0,0023
BD* -9,76 175,63 1 175,63 0,0103
AB* 6,73 182,45 1 182,45 0,0099
Curvatura 38,56 2739,39 1 2739,39 0,0004
Erro total 6,73 3,68 2 3,68
Total 5717,67 18 5717,67
Modelo 2889,6 13 222,28 0,0221
Resíduo 88,68 4 22,17
Falta de
ajuste
145,43 5 29,09 0,0606
Erro puro 3,68 2 1,84
Total 5717,67 18
Variáveis: A: Temperatura; B: Concentração de H2O2; C: Tempo de reação; D: Sulfato de magnésio
(*) Efeito significativo ao nível de 95% de probabilidade (p ≤ 0,05), R2 = 0,97
O sulfato de magnésio e sua interação com peróxido de hidrogênio apresentaram
efeitos negativos na extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. A resposta à
adição de MgSO4 no rendimento de extração deve ser analisado com cautela, podendo
desempenhar ou não uma ação positiva durante o tratamento com peróxido de hidrogênio,
dependendo do grau de contaminação do material por metais. Em meio alcalino, o peróxido se
decompõe gerando o anion peridroxila (HOO-), um oxidante poderoso e seletivo capaz de atacar
a maior parte da lignina que está fortemente ligada à hemicelulose (FANG et al., 1999;
LAPIERRE; BERRY; BOUCHARD, 2003). O fato dos íons Mg+2 preservarem o peróxido,
evitando sua decomposição catalítica a radicais hidroxilas (HO·) que atacam tanto a
hemicelulose quanto a lignina, traz como resultado uma melhor deslignificação, mas do ponto
69
de vista do rendimento total significa perda de massa. Embora a decomposição do peróxido
seja necessária para que ocorra a deslignificação, a velocidade de decomposição deve ser
reduzida.
A adição de sulfato de magnésio em baixas concentrações resultou em maior
rendimento da hemicelulose, como pode ser evidenciado na condição do ponto central. Nessa
condição, a presença de íons magnésio não prejudicou o rendimento da extração, atingindo
valores superiores a 90 %.
A adição de MgSO4 em excesso (0,5 % m/m) limitou a extração da hemicelulose
ocasionada provavelmente pela redução do álcali pela formação de Mg(OH)2, condição em
que ocorre a complexação de metais (FANG et al., 1999). Um efeito negativo do excesso de
magnésio também foi reportado no branqueamento de polpas, o que segundo o autor, ocorreu
porque em excesso o magnésio torna a consumo do peróxido muito lento (WÓJCIAK, 2006).
Verifica-se um decréscimo do rendimento de extração de hemicelulose ao trabalhar
com as variáveis no nível alto ou no nível inferior. Este comportamento indica que o ponto
ótimo da extração de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar localiza-se dentro da região
estudada, provavelmente próximo das condições do ponto central.
A análise de variância indica que o modelo linear é significativo, o que ocorre se
considerar a falta de ajuste não significativa para 90 % de confiança (Tabela 7).
Considerando-se que a curvatura apresentou significância estatística, um modelo quadrático
provavelmente explicaria melhor o rendimento de extração de hemicelulose. Entretanto, os
rendimentos obtidos no ponto central, 90,5 a 94,5 %, são bastante satisfatórios e torna-se
desnecessária a expansão do planejamento fatorial com o objetivo de otimização (Figura 11).
Empregando a análise de regressão múltipla nos dados experimentais a resposta predita para o
rendimento de hemicelulose pode ser obtida pela equação 11, onde um modelo linear foi
utilizado para ilustrar o efeito do peróxido de hidrogênio e tempo de reação no rendimento de
extração da hemicelulose:
y1 = 59.38 + 6.86x2 + 2.49x3 − 3.37x1x3 + 4.88x1x4 − 5.80x2x3 −2.83x2x4 + 3.22x3x4 (11)
Onde x1, x2, x3 e x4 são as variáveis codificadas, temperatura de extração (°C), concentração
de peróxido de hidrogênio (%), tempo de extração (h) e concentração de sulfato de magnésio
(%), respectivamente.
70
O melhor rendimento de extração da hemicelulose ocorreu na condição de baixa
remoção de lignina (Tabela 6), entretanto para algumas aplicações esta hemicelulose não é a
mais apropriada. A hemicelulose extraída com 6 % de peróxido de hidrogênio por 4 h a 20°C
apresenta maior potencial de uso, pois apresenta um teor reduzido de lignina sem
comprometer muito o rendimento da extração (86 %).
Figura 11. Superfície de resposta mostrando o efeito do peróxido de hidrogênio (x2) e tempo de reação (x3) no rendimento de hemicelulose.
5.1.4 Avaliação do teor de lignina residual na hemicelulose
O conteúdo de lignina, baseado na massa seca da hemicelulose, variou de 4,6 a 14,1%,
dependendo da condição de extração (Tabela 6). Os experimentos realizados em altas
concentrações de peróxido de hidrogênio causaram a maior remoção de lignina e praticamente
não interferiram no rendimento de extração da hemicelulose. Apenas as concentrações de
peróxido de hidrogênio e sulfato de magnésio influenciaram significativamente no teor de
lignina residual da hemicelulose (Tabela 8), com um sinal negativo indicando que a remoção
de lignina foi maior quando os níveis de peróxido de hidrogênio e sulfato de magnésio foram
mais altos.
Conforme a tabela 9, um modelo linear apresenta significância estatística (p< 0,05) e
71
boa capacidade de predição, conseguindo explicar acima de 95% da variabilidade
experimental para a resposta lignina residual, conforme mostrado pelo valor de R².
Considerando-se a boa concordância entre os valores observados e preditos pelo modelo, além
de sua significância estatística, os valores do teor de lignina residual foram ajustados ao
modelo linear, o qual está apresentado na Equação 12.
Tabela 8 - Significância estatística dos efeitos das variáveis sobre o teor de lignina residual da
hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar. Fatores Efeitos Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática
Nível de
significância (p)
A 1,95 4,07 1 4,07 0,3005
B* -7,36 57,90 1 57,90 0,0013
C 2,11 4,76 1 4,76 0,2647
D* -4,75 24,12 1 24,12 0,0210
Curvatura 1,48 2,34 1 2,34 0,4282
Erro total 2,14 2 2,14
Total 138,75 18 138,75
A: Temperatura; B: Concentração de H2O2; C: Tempo de reação; D: Sulfato de magnésio (*) Efeito significativo ao nível de 95% de probabilidade (p ≤ 0,05), R2 = 0,96.
Tabela 9- Análise de variância para os modelos estatísticos correspondentes às variáveis respostas: rendimento de extração e lignina residual da hemicelulose, em função das variáveis estudadas.
Variável
resposta
Fonte Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática
Nível de
significância (p)
Lignina Modelo 82,03 2 41,01 0,0010
residual Resíduo 15 3,63
Falta de ajuste 43,41 11 3,95 0,2324
Erro puro 2,14 2 1,07
R² =0,96 Total 138,75 18
Y1= 9,16 – 1,90x2 – 1,23x4 (12)
Onde x2 e x4 foram as variáveis codificadas, concentração de peróxido de hidrogênio (%), e
concentração de sulfato de magnésio (% m/m), respectivamente.
72
A equação apresentada permitiu a obtenção de superfície de resposta para a resposta
teor de lignina residual em função da concentração de peróxido de hidrogênio e sulfato
magnésio, dentro da região estudada, conforme mostrado na figura 12. A superfície foi obtida
considerando o efeito da temperatura (A) no nível baixo (-1), uma vez que esta variável não
influenciou significativamente no teor de lignina residual. O tempo reacional (C) foi
considerado no nível alto (+) por ter influenciado significativamente no rendimento de
extração da hemicelulose.
Figura 12. Superfície de resposta descrita pelo modelo linear para o teor de lignina residual na
hemicelulose em função das variáveis significativas.
A superfície de resposta para o teor de lignina residual indica que o menor teor de
lignina está presente quando se trabalha com o nível alto das variáveis concentração de
peróxido de hidrogênio e sulfato de magnésio. Entretanto, nessas condições, a extração de
hemicelulose é inferior a 70 % (Tabela 6). A obtenção de baixo teor de lignina residual
proporciona também um baixo rendimento na extração de hemicelulose. A condição do ensaio
3 (Tabela 6) foi a que resultou em uma hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9 %) e
ainda assim apresentou um alto rendimento de extração (86 %).
73
5.1.5 Caracterização das hemiceluloses
As hemiceluloses do bagaço, obtidas nas diferentes condições de extração
apresentaram conteúdo semelhante de xilose, mas diferenças nos outros componentes (Tabela
10). Os maiores teores de arabinose e glicose foram obtidos em experimentos com a
temperatura no nível mais alto. O conteúdo de glicose (3,8 – 7,9 %) foi superestimado por
pequenas quantidades de manose e galactose presentes nas hemiceluloses.
Tabela 10- Composição química da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar com H2O2 em meio alcalino proveniente do planejamento 24 completo.
Composição da hemicelulose (%) Exp Xilose Arabinose Glicose ácidos
urônicos Total
1 80,4 4,4 3,9 4,4 93,1 2 79,3 5,7 6,0 5,5 96,5 3 80,9 3,8 4,2 3,9 92,8 4 77,0 6,0 5,0 6,9 94,8 5 79,0 5,1 4,6 5,5 94,1 6 79,2 6,5 6,1 6,5 98,3 7 77,9 4,8 3,8 4,3 90,7 8 74,9 6,1 6,4 5,2 92,6 9 76,9 5,7 5,4 7,0 95,0
10 80,1 6,5 7,9 4,4 98,9 11 75,5 5,3 4,7 5,2 91,0 12 73,1 7,2 7,2 5,8 93,4 13 74,9 5,3 5,8 5,3 91,3 14 73,5 6,9 6,6 6,5 93,5 15 76,7 7,0 5,4 6,6 95,6 16 79,1 5,8 5,2 3,6 93,8 17 78,6 6,8 6,5 6,5 98,4 18 78,1 5,8 5,4 6,5 95,9 19 82,6 6,2 5,6 5,2 99,7
A: Temperatura (oC); B: Concentração de H2O2 (%); C: Tempo de reação (h); D: Sulfato de magnésio (%)
Alguns pesquisadores relataram que além de promover a deslignificação e
branqueamento, o peróxido de hidrogênio tem efeito positivo na solubilização da
hemicelulose (SUN; TONKINSON, 1999; SUN; FANG; TONKINSON, 2000).
O ensaio de solubilidade foi realizado com a hemicelulose proveniente do ponto 3
(Tabela 6), a qual apresentou 90 ± 2,5 % de solubilidade em massa, muito superior à
hemicelulose extraída apenas com NaOH 1M (25°C/18 h) (34 ± 4 %). Essa diferença na
74
solubilidade pode estar relacionada à estrutura das hemiceluloses, pois segundo Fang et al.
(1999) a hemicelulose extraída com H2O2 permanece mais ramificada do que quando extraída
com NaOH. Isso ocorre porque na extração com H2O2 emprega-se uma concentração de álcali
muito menor, o que evita reações de degradação.
A figura 13 mostra fotografias das hemiceluloses obtidas em cada experimento, onde
se observa que as amostras com menor teor de lignina apresentam tonalidade mais clara. As
amostras correspondentes ao ponto central, os quais apresentaram maior rendimento de
extração, estão entre as de coloração escura. A análise visual das hemiceluloses aliada aos
dados de rendimento e conteúdo de lignina sugerem que o tratamento 3 seja o mais apropriado
para se obter uma hemicelulose com condições apropriadas para hidrólise enzimática.
Figura 13. Aspecto visual das hemiceluloses obtidas dos experimentos relativos ao planejamento 24 completo.
75
5.1.5.1 Análise espectroscópica (infravermelho médio) da hemicelulose do bagaço de cana-
de-açúcar
Os espectros de FT-IR de algumas amostras de hemiceluloses, com níveis
contrastantes de lignina e hemicelulose estão apresentados na figura 14. As amostras 1 e 16
foram escolhidas para análise de infravermelho por serem provenientes de condições opostas
do planejamento (nível baixo e alto), ao mesmo tempo apresentaram características como
rendimento e cor opostas ao experimento 17 (ponto central). Já as amostras 3 e 12 foram
selecionadas por apresentarem características inversas de rendimento e cor, mas teor de
lignina semelhante.
Os espectros de FT-IR apresentaram picos em 900 cm-1 que indica a presença
predominante de ligações β -glicosídicas (C-O-C) na hemicelulose (SUN; TOMKINSON,
2002). O pico em 980 cm-1 é referente à presença de arabinose, o qual é utilizado para
identificar a estrutura de arabinoxilana (SUN e TOMKINSON, 2002). O pico em 1050 cm-1
corresponde às vibrações das ligações C-O, C-C e C-OH (Figura 14). O pico em 1240 cm-1
indica a presença das ligações C-H, OH ou CH2 e em 1465 cm-1 indica CH2. A presença de
lignina é indicada pelo pico em 1510 cm-1, referente à vibração de anel aromático e confirmou
a presença de lignina principalmente nas amostras 1 e 17.
De modo geral a hemicelulose extraída do bagaço apresentou espectro típico desse
polissacarídeo sem muitas diferenças em função do tratamento com peróxido de hidrogênio.
Entretanto a intensidade do pico em 1650 cm-1 variou entre as amostras apresentando
correlação com a cor do material. O pico em 1650 cm-1 indica a presença de grupos C=O e
aumentou a intensidade das amostras mais claras (1 e 3) para as mais escuras (17 e 12). Além
do conteúdo de lignina, a cor do material pode ter relação, provavelmente, com processos
oxidativos que levam a formação de ácidos hexenurônicos, e cromóforos originados da
lignina. De acordo com Dalimova (2005), a intensidade do pico em 1650 cm-1 depende do
grau de oxidação. A ausência de picos na região de 1720 a 1750 cm-1 indica que o tratamento
com peróxido alcalino removeu os grupos ésteres da hemicelulose (FANG et al., 1999).
76
Figura 14. Espectro de FT-IR das hemiceluloses obtida por extração com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento experimental 24 completo).
Para uma melhor exploração dos dados espectroscópicos foi realizada uma análise dos
componentes principais (PCA). Esta análise permite uma projeção multidimensional dos
dados construída através de uma combinação linear das variáveis originais, e identifica grupos
de amostras semelhantes.
Os dados do espectro de FT-IR correspondentes a região de 1800 a 800 cm-1 foram
tratados por análise de componentes principais (PCA). Nesta análise as principais variações
espectrais são descritas pelo primeiro componente principal (PC1), sendo as demais descritas
por PC2, PC3, etc, dos quais a combinação dos respectivos valores permite a construção de
gráficos onde são identificadas semelhanças ou diferenças entre as amostras em função da
dispersão. Os valores de PC1 mostraram distinção entre as amostras obtidas por extração
alcalina com peróxido de hidrogênio (Figura 15). A amostra 16 foi discriminada de um grupo
composto pelas amostras 1, 3 e 12, os quais também foram separados da amostra 17, ao longo
do eixo PC1, que contém a maioria das informações espectrais (85 %). As amostras 1, 3 e 12
foram discriminadas ao longo do eixo PC2.
77
Figura 15. Análise dos componentes principais do espectro de FT-IR da hemicelulose obtida com H2O2 em meio alcalino (Os números 1, 3, 12, 16 e 17 são referentes aos experimentos do planejamento completo 24).
A figura 16 indica em quais comprimentos de onda ocorre discrepância no cálculo dos
valores de PC1 e PC2. O gráfico mostrou que os comprimentos de onda mais relevantes estão
nas regiões de 1010, 1240, 1510 e 1650 cm-1, os quais são responsáveis pela maioria das
diferenças espectrais. Modificações nas ligações CH, OH e CH2 indicados pela alteração em
1240 cm-1 podem indicar a degradação de polissacarídeo. As diferenças em 1510 e 1650 cm-1
podem indicar a variedade entre as amostras no teor de lignina e grau de oxidação (ácido
hexenurônico e cromóforos), respectivamente.
-0,04-0,02
0,000,020,04
0,060,080,10
0,120,14
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
cm-1
PC1PC2
Figura 16. Valores de contrastes entre PC1 e PC2 do espectro de FT-IR das amostras de hemicelulose extraídas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino.
78
5.1.5.2 Determinação da massa molar da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar
A tabela 11 apresenta os valores da massa molar média e a polidispersidade das
hemiceluloses de bagaço de cana-de-açúcar. As frações de hemicelulose extraídas com
hidróxido de sódio, hidróxido de sódio/antraquinona e hidróxido de sódio/sulfito
apresentaram alta massa molar. As hemiceluloses extraídas com peróxido de hidrogênio em
meio alcalino apresentaram massa molar média inferior às extraídas com NaOH.
Provavelmente o peróxido extraiu fragmentos menores de hemicelulose que estavam ligados à
lignina, e também clivou internamente a cadeia de hemicelulose através das reações de
degradação, o que leva a redução da massa molar.
O emprego de H2O2 em concentrações de 4 ou 6 % (m/v) não causou diferença na
massa molar média, ensaios 19 e 11, respectivamente (Tabela 11). No entanto, se uma
concentração de peróxido da ordem de 0,5 % tivesse sido usada poderia ter obtido uma
hemicelulose com maior massa molar. Esse resultado foi relatado por Sun et al. (2004a) que
determinaram que o aumento na concentração de H2O2 de 0,5 para 3% levou a redução na
massa molar média de 34.070 para 23.340 g/mol, na hemicelulose extraída de bagaço de cana-
de-açúcar, em reação de 2 h a 55°C.
As frações de hemicelulose extraídas com hidróxido de sódio acrescido ou não de
antraquinona e sulfito e com peróxido de hidrogênio apresentaram um baixo índice de
polidispersidade (1,21 – 1,67). Sun et al. (2004) obtiveram índices de polidispersidade na
faixa de 4,4 a 8,1, indicando ampla faixa de distribuição molar. Apesar da massa molar da
hemicelulose extraída com peróxido de hidrogênio ser relativamente baixa, o baixo grau de
polidispersidade indica que as hemiceluloses apresentam cadeias homogêneas.
Tabela 11. Massa molar média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e polidispersidade (Ip: Mw/Mn) das frações de hemicelulose extraídas do bagaço de cana-de-açúcar.
Condição de extração
da hemicelulose Mw (g/mol) Mn Ip
NaOH 46.396,81 38.475,83 1,21
NaOH + Antraquinona 41.188,57 33.909,09 1,21
NaOH + Sulfito 37.529,92 29.566,28 1,27
ensaio 3 (6 % H2O2) 21.118,97 14.928,35 1,41
ensaio 11 (6 % H2O2) 21.391,05 14.765,05 1,45
ensaio 19 (4 % H2O2) 22.185,75 13.309,37 1,67
Ensaios 3, 11 e 19 referem-se às hemiceluloses extraídas nas condições apresentadas na tabela 9.
79
5.2 PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES
Thermoascus aurantiacus, Aspergilus niger e Trichoderma reesei apresentaram uma
rápida colonização do meio preparado com farelo de trigo, em 10 dias de cultivo o meio
estava completamente tomado pelos fungos. De acordo com Dobrev et al. (2007) o farelo de
trigo apresenta de 20 a 30 % de arabinoxilana, o que provavelmente induziu a produção de
xilanases.
T. aurantiacus aumentou o pH do meio do segundo para o terceiro dia e depois disso o
pH permaneceu constante até 10 dias. O pH do meio da cultura de A. niger reduziu durante
os três primeiros dias, seguido por um aumento, enquanto o crescimento de T. reesei
provocou pouca variação do pH final do meio de cultivo (Figura 17).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
tempo (dias)
A. niger
T. aurantiacus
T reesei
Figura 17: pH final do meio de cultivo de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei .
A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g) em 5
dias de cultivo. A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g no mesmo período (Figura 18).
A comparação dos resultados de xilanase com a de outros fungos (Tabelas 12 e 13) evidencia
o potencial de produção das xilanases por essas linhagens, apesar dos processos serem
diferentes no que diz respeito à aeração, umidade, agitação e fonte de carbono, variáveis que
afetam a produção de enzimas.
80
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Xila
nase
(U
/g)
tempo (dias)
A. niger
T. reesei
T. aurantiacus
Figura 18. Produção de xilanase por A. niger, T. aurantiacus e T. reesei em meio sólido com farelo de trigo (75 % umidade).
Tabela 12- Linhagens de Aspergilus sp produtoras de xilanase. Linhagem Xilanase UI/g Substrato Referência
A. niger B03 3750 Farelo de trigo Dobrev et al., 2007
A. niger Na-1.15 500 Sabugo de milho Yuan et al., 2005
A. niger 3T5B8 76,55 Farelo de trigo Couri et al., 2000
A. niger USM A1 I 33,99 Núcleo de palma Kheng et al., 2005
A. niger 500 Farelo de trigo Presente trabalho
Tabela 13 - Linhagens de T. aurantiacus produtoras de xilanase.
Linhagem Atividade (U/g)
Estabilidade térmica
Temperatura/ pH ótimo
Substrato Referência
- 45,5 - - farelo de trigo Stoilova et al., 2005 Miehe 535 60°C/1 h 75/5 sabugo de milho
- grama verde Da Silva et al., 2005
ATCC 204492 1597 - - BCA Milagres et al., 2004 - 500 - - BCA + farelo
arroz Santos et al., 2003
IMI 216529 6193 t½ 41 min/80°C
70/4,5 palha de trigo Kalogeris et al., 1998
- 705,7 55°C/15 dias 70/5 farelo de trigo Alam et al., 1994 179-5 1288,8 - - BCA + BL Martins et al., 2003 ATCC 204492 1500 50°C/30 dias 70-80/5 BCA Presente trabalho
BCA = bagaço de cana-de-açúcar; BL = bagaço de laranja; (-) = não informado/conhecido
81
T. aurantiacus e A niger não produziram altas atividades de celulases em farelo de
trigo, corroborando os resultados de Alam et al. (1994); Kitpreechavanich; Hayashi; Nagai
(1984) e Yu et al. (1987) que definiram esses fungos muito mais xilanolíticos do que
celulolíticos. T. aurantiacus produziu 6 U/g de endoglucanase a partir do quarto dia de
cultivo, enquanto que A. niger atingiu 15 U/g no terceiro dia (Figura 19).
Figura 19. Produção de endoglucanase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com farelo de trigo (75 % umidade).
Aspergilus niger produziu cerca de 30 U/g de β-xilosidase a partir do quarto dia de
cultivo (Figura 20), valor superior ao obtido no trabalho de Couri et al. (2000) que relataram a
produção de 3,5 U/g de β -xilosidase. Entretanto há relatos de produção de elevados níveis
desta enzima por linhagens mutantes cultivadas em materiais lignocelulósicos (100 U/g)
(KANG et al., 2004).
T. aurantiacus produziu atividades inferiores a 0,5 U/g de β-xilosidase (Figura 20), o
que parece ser uma característica desta cepa, conforme já descrito por Milagres et al. (2004).
A presença de baixa atividade de β -xilosidase no extrato de T. aurantiacus é um aspecto
positivo, uma vez que o objetivo principal deste estudo é a obtenção de xilo-oligossacarídeos
por hidrólise enzimática, e essa enzima leva à formação de xilose.
82
Figura 20. Produção de β-xilosidase por A. niger e T. aurantiacus em meio sólido com farelo de trigo (75 % umidade). 5.2.1 Indução das enzimas de T. aurantiacus por sacarídeos relacionados à hemicelulose
A síntese de xilanase por T. aurantiacus é induzida durante o crescimento em xilanas e
em materiais lignocelulósicos. A indução das enzimas por esses substratos é geralmente
baixa, pois esses compostos não podem penetrar na célula por possuírem alta massa molar.
Fragmentos de xilana devem ser gerados para servirem de indutores das xilanases, conforme
já descrito para vários microrganismos (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2005). A busca de tais
compostos ainda permanece um desafio para indução de xilanase em muitos microrganismos,
inclusive para T. aurantiacus.
Foi realizado um estudo com produtos de degradação da hemicelulose para indução de
xilanase de T. aurantiacus. Para isso utilizou-se uma grande massa micelial e uma pequena
concentração de indutores. Desta forma obtém-se uma resposta rápida, o que é esperado de
um verdadeiro indutor. Os experimentos de indução foram conduzidos em cultivos contendo
xilose, xilobiose e xilana hidrolisada enzimaticamente (HXBC) nas respectivas concentrações
de açúcares totais: 3,5, 7,0 e 6,8 mg/mL (Figura 21). Não foi detectada atividade na ausência
de indutores, portanto as atividades enzimáticas detectadas nos cultivos foram induzidas pelos
sacarídeos.
A xilanase foi produzida nos três meios de cultivo, mas a atividade em xilose e
xilobiose foi maior que em HXBC. A concentração de xilose empregada para induzir a
xilanase provavelmente foi alta, porque a indução ocorreu depois que parte do substrato foi
consumido. O pico de produção de xilanase em cultivo com xilose ocorreu após a exaustão do
83
açúcar, em 25 h de indução. Estudos com outros microrganismos mostraram que em altas
concentrações, a xilose pode reprimir a síntese de xilanase (ARO; PAKULA; PENTTILÄ,
2005). A indução de xilanase por xilose parece depender da concentração desse substrato
(GOMES et al., 1994). Esse trabalho mostrou que substratos facilmente metabolizáveis como
arabinose, glicose, lactose e xilose na concentração de 1% não induzem a xilanase de T.
aurantiacus. Outros estudos mostraram que xilose induz genes que codificam as xilanases de
Thermomyces lanuginosus (PURKARTHOFER; STEINER, 1995) e de A. niger, além dos
genes de α-glucuronidase, acetilxilana esterase e feruloil esterase (ARO; PAKULA;
PENTTILÄ, 2005).
A xilose não induziu a produção de β -xilosidase, mas induziu atividade de
arabinofuranosidase, sendo a menor atividade dessa enzima, detectada entre os indutores
testados. A fase lag de indução de xilanase em cultivo com xilobiose foi curta e a maior
atividade foi alcançada em 10 h, mesmo com baixo consumo desse substrato. Após esse
tempo a atividade permaneceu constante, sugerindo que a entrada de baixas concentrações de
xilobiose na célula seja suficiente para a indução enzimática (Figura 21).
Uma pequena atividade de xilanase foi determinada no meio com HXBC em 6 h de
indução. Nesse meio houve produção principalmente de endoglucanase e β-glicosidase.
Xilose foi consumida em 18 h, enquanto xilobiose foi consumida mais lentamente que no
meio onde era a única fonte de carbono. No final do experimento apenas 24% da xilobiose
havia sido consumida (Figura 21), em contraponto com 62% de consumo no meio com
xilobiose pura. A incubação em HXBC provocou um consumo simultâneo de xilose e
xilobiose, sem efeito de repressão catabólica.
A β-xilosidase foi induzida pelos XOs presentes em HXBC, uma vez que no meio
cultivado com xilose essa enzima não foi detectada. A atividade de arabinofuranosidase foi
cerca de três vezes superior à produzida em xilose, o que pode indicar que a indução ocorre
principalmente pela presença de xilobiose.
84
Figura 21. Atividades enzimáticas de T. aurantiacus detectadas no meio com xilose ( ), xilobiose ( ) e hidrolisado da xilana de bagaço (HXSB). Atividade enzimática detectada nos cultivos: xilanase ( ), β-xilosidase ( ), endoglucanase ( ), β-glicosidase ( ), arabinofuranosidase ( ).
O perfil da atividade de endoglucanase foi coincidente com a xilanase nos meios com
xilose e xilobiose e as atividades foram três vezes mais baixas do que em HXBC. No meio
com HXBC, xilanase e endoglucanase foram detectadas em diferentes tempos de cultivo. Esse
resultado exclui a possibilidade de que uma única enzima com especificidade cruzada
estivesse sendo produzida por T. aurantiacus.
85
5.2.2 Efeito do pH e temperatura na atividade enzimática de endo-xilanase
A máxima atividade de xilanase no extrato de T. aurantiacus foi obtida em pH 5,0
(Figura 22), concordando com os resultados de Alam et al. (1994) e Da Silva et al. (2005). A
xilanase de T. aurantiacus apresentou cerca de 80% da atividade em pH 6, 50% em pH 4 e
40% em pH 8. A xilanase produzida por A. niger também apresentou máxima atividade em
pH 5,0, porém mostrou um decréscimo mais acentuado da atividade na região alcalina.
Diversos trabalhos com xilanase de A. niger mostraram que o melhor pH restringe-se a uma
faixa entre 4 e 6 (FOURNIER et al., 1985; FREDERICK et al., 1981; GORBACHEVA;
RODIONOVA, 1997; SHEI et al., 1985).
A máxima atividade de xilanase de T. reesei foi em pH próximo de 6,5, próximo do
pH em que foi cultivado (pH 6). A atividade em pH 7 diminuiu sensivelmente e foi mais
afetada do que em pH ácido. Estudos anteriores mostraram que T. reesei produz xilanases
com diferentes valores de pH ótimos dependendo do pH em que é cultivado (XIONG et al.,
2004). As xilanases I, II, III e IV apresentaram pH ótimos entre 4-4,5; 4-6; 6-6,5 e 3,5-4;
respectivamente. As xilanases I e II foram classificadas como pertencentes à família 11
(TÖRRÖNEN; ROUVIENE, 1997) e a xilanase III à família 10 (XU et al., 1998). De modo
geral, para T. reesei a xilanase é produzida em maior quantidade em pH próximo do neutro,
enquanto pH próximo de 4 favorece a produção de celulases (BAILEY; BUCHERT;
VIICARI, 1993).
Figura 22. Efeito do pH na atividade de xilanase de A niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo.
86
A máxima atividade da xilanase de A. niger foi determinada a 50°C, enquanto que a
60°C ocorreu uma redução de 10 % na atividade (Figura 23). Alguns trabalhos mostram uma
estreita faixa para a sua temperatura ótima, que varia entre 42 e 55°C (FOURNIER et al.,
1985; FREDERICK et al., 1981; GORBACHEVA; RODIONOVA, 1997; SHEI et al., 1985).
A xilanase de T. aurantiacus apresentou máxima atividade entre 70 e 80°C (Figura
23). De forma geral, xilanases produzidas por esse fungo apresentam temperaturas ótimas
entre 60 e 80°C (ALAM et al., 1994; KHANDKE; VITHAYATHIL; MURTHY, 1989b;
TAN; MAYERS; SADDLER, 1987.
A maior atividade da xilanase de T. reesei foi obtida próximo de 55°C, mas a 70°C a
atividade foi cerca de 20 % da atividade máxima (Figura 23). Cobos e Estrada (2003)
determinaram a máxima atividade da xilanase de T. reesei em 55°C, e nessa temperatura
ocorre perda de 50 % de sua atividade em 30 min.
Figura 23. Efeito da temperatura na atividade de xilanase de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei cultivados em farelo de trigo.
5.2.3 Estabilidade térmica da endo-β-1,4-xilanase
5.2.3.1 Thermoascus aurantiacus
A xilanase de T. aurantiacus manteve mais de 80 % de sua atividade após 50 dias de
incubação a 50°C, e a 60°C, a enzima ficou ativa por 25 dias (Figura 24). Essa estabilidade,
típica da xilanases de T. aurantiacus, permite uma ampla aplicação industrial com um bom
87
aproveitamento do seu potencial catalítico, uma vez que essa xilanase pode suportar
operações em altas temperaturas por longos períodos. Yu et al. (1987), reportaram que este
fungo produziu xilanases muito estáveis, mantendo sua atividade por até 84 dias a 50°C.
A 70°C, a meia vida dessa enzima foi de 1 hora e 54 min (Figura 25), uma redução
causada provavelmente pelo aumento no movimento intracadeia da estrutura protéica das
xilanases que levou a alteração na estrutura protéica, e a consequente perda da atividade
enzimática. Existe um balanço natural entre a rigidez (estabilidade) e flexibilidade (atividade)
a qual é definida pelas interações e forças estabilizadoras da proteína (GOMES et al., 2007).
A xilanase de T. aurantiacus apresenta uma única ligação dissulfeto (SRINIVASA et al.,
1991) e mais de 10 interações do tipo ponte salina, o que se conserva na maioria das
xilanases. Entretanto, xilanase de T. aurantiacus apresenta pontes salinas diferenciadas, entre
Arg124-Glu232 e Arg190-Glu150, sendo que é atribuída a primeira ponte salina o papel de
contribuir para a termoestabilidade por ligar as folhas β4 e β7 estabilizando a cadeia
(NATESH et al., 1999).
Figura 24. Estabilidade térmica a 50 e 60°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo.
88
Figura 25. Estabilidade térmica a 70°C da xilanase de T. aurantiacus cultivado em farelo de trigo.
5.2.3.2 Aspergilus niger
A xilanase de A. niger apresentou meia vida de 52 h a 40°C e um aumento em dez
graus na temperatura reduziu a meia vida para 12 h. Quando incubado a 40°C, a enzima
permaneceu estável por um tempo maior, apresentando cerca de 40 % da atividade inicial
após 65 h (Figura 26). A 30°C a atividade caiu para 70 % da inicial em 8 h e manteve-se
constante por cerca de 30 dias. Quando à enzima foi adicionado tampão acetato de sódio 50
mM (pH 4,8) a perda de atividade foi menor, a atividade diminuiu para 80 % em 8h e
manteve-se constante por 25 dias.
Figura 26. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de A. niger cultivado em farelo de trigo.
89
5.2.3.3 Trichoderma reesei
A xilanase de T. reesei apresentou tempo de meia vida 44 h a 40°C e de 7 h a 50°C
(Figura 27). A 30°C o resultado de atividade residual foi semelhante ao de A. niger, porém
um pouco menos acentuado, mantendo cerca de 5 % a mais de atividade.
Na temperatura de 60°C a atividade diminuiu acentuadamente e o tempo de meia vida
(t 1/2) foi de 2,7 min. Esse baixo tempo de meia vida pode ser melhorado com a adição de
polióis ao extrato enzimático de T. reesei (COBOS; ESTRADA, 2003). Os autores
observaram que a adição de etileno glicol, glicerol, xilitol e sorbitol ao extrato enzimático
elevou o tempo de meia vida para 3,6; 4,6; 87 e 303 min, respectivamente.
Figura 27. Estabilidade térmica a 40 e 50°C da xilanase de T. reesei cultivado em farelo de trigo.
5.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA HEMICELULOSE DO BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR
Os ensaios foram realizados com a hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar
com 6 % (m/v) de peróxido de hidrogênio em pH 11,6 por 4 h a 20°C (condições do ensaio 3
-Tabela 6). Essa hemicelulose é constituída por 80,9 % de xilose, 3,8 % de arabinose, 4,2 %
de glicose e 3,2 % de ácidos urônicos. Através desses valores pode-se deduzir uma relação
entre xilose:arabinose e xilose:ácido urônico de aproximadamente 20:1, indicando que em
média há uma ramificação a cada 10 resíduos de xilose.
A hidrólise foi realizada com enzimas de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei. As
90
xilanases comerciais utilizadas foram: luminase PB 200, EnzOx e de Thermomyces
lanuginosus (Sigma). Foram avaliadas diferentes preparações enzimáticas, nas quais as
proporções das enzimas variaram, assim obteve-se diferentes produtos em cada reação
(Tabela 14).
5.3.1 Efeito da carga enzimática na produção de XOs
Foram avaliadas entre 10 e 200 U de xilanase/g de hemicelulose (U/g) na produção de
XOs. A maior conversão em XOs foi de 31,5% com 120 U/g de xilanase de T. aurantiacus,
entretanto observa-se que a partir de 40 U/g a taxa de hidrólise da hemicelulose diminuiu.
Esse efeito é observado em substratos poliméricos, que se modificam com a hidrólise e novos
substratos são produzidos, os quais normalmente apresentam afinidade diferente com a
enzima e a velocidade da reação é alterada. A geração de pequenos fragmentos de xilana,
assim como a presença de ramificações na cadeia, que não foram retiradas devido a ausência
de enzimas auxiliares, também reduzem a ação das xilanases à hemicelulose (KHANDKE;
VITHAYATHIL; MURTHY, 1989a; ROCHE et al., 1994).
As xilanases de T. aurantiacus são da família 10 e clivam a cadeia da xilana do bagaço
produzindo principalmente xilobiose e xilose (Tabela 15). Essa xilanase também é capaz de
hidrolisar xilobiose, xilotriose e são muito ativas em xilo-oligossacarídeos curtos, indicando
que o sítio se liga a pequenos substratos (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). A ação
dessa enzima é restringida em parte na hemicelulose do bagaço, que possui ramificações de
arabinose e ácidos urônicos. Mesmo em altas concentrações de enzimas o rendimento de
xilobiose foi maior que xilose (Tabela 15). A produção de xilotriose (X3) e xilopentaose (X5)
foi baixa e o aumento da carga enzimática favoreceu sua liberação, enquanto que xilotetraose
(X4) não foi produzido em níveis detectáveis. Os resultados da tabela 15 mostram uma
redução na conversão em xilose e xilobiose quando se empregou 200 U/g de xilanase, e nessa
condição detectou-se 0,006 U/g de β-xilosidase. Houve uma maior produção de xilotriose e
xilopentaose o que pode ser atribuído ao efeito de transxilosidação da β-xilosidase. Matsuo et
al. (1998) relataram a atividade de transxilosidação para a β -xilosidase de T. aurantiacus, o
que ocorreu até 1 h de reação produzindo X3 e X4 em pequena proporção a partir de
xilobiose.
As enzimas de A. niger produziram principalmente xilose da hemicelulose do bagaço.
O emprego de altas atividades das enzimas de A. niger resultou na hidrólise de
91
aproximadamente 50 % da hemicelulose do bagaço em xilose (Tabela 15). Uma vez que a
produção de xilobiose e de outros xilo-oligossacarídeos foi muito baixa, decidiu-se não
prosseguir com as enzimas de A. niger para hidrólise da hemicelulose.
As enzimas de T. reesei hidrolisaram a hemicelulose principalmente a xilose, mas
xilobiose também foi produzida. XOs com maior massa molar foram produzidos em
quantidades muito baixas, sendo que X4 não foi detectado a partir de 40 U/g de xilanase e X5
não foi produzido.
Tabela 14: Atividades enzimáticas nos extratos de A. niger, T. aurantiacus, T. reesei e de preparados comerciais aplicadas na hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar.
Endo-xilanase
(U/g)
β-xilosidase
(U/g)
Arabinofuranosidase
(U/g)
A. niger 60 0,53 0,012
T. aurantiacus 60 0,0018 0,26
T. reesei 60 0,0024 0,095
Xilanase PB 200 80 0 0
EnzOx 80 0 0
Tabela 15- Efeito da carga enzimática na hidrólise da hemicelulose do bagaço (2 % m/v) pelos extratos de A. niger, T. aurantiacus e T. reesei, após 24 h de reação.
Composição do hidrolisado (% massa hemicelulose)
U/g Xilose X2 X3 X4 X5 XOs
mg/mL A. niger 10 11,95 2,64 0,06 0,03 0,01 0,62 40 29,66 0,42 0,02 - - 0,08 80 38,02 0,01 0,01 - - - 120 44,93 - - - - - 200 51,34 - - - - - T. aurantiacus 10 17,1 3,8 0,08 - 0,01 0,61 40 9,78 17,5 0,19 - 0,04 2,96 80 14,2 24,8 0,15 - 0,03 3,92 120 18,0 31,5 0,13 - 0,03 4,75 200 16,8 21,3 0,29 - 0,08 3,04 T. reesei 10 4,00 0,78 0,05 0,02 - 0,20 40 17,46 9,28 0,08 0,02 - 2,00 80 26,13 11,00 0,06 - - 2,47 120 31,90 8,51 0,04 - - 1,74 200 40,30 10,72 0,04 - - 2,15
X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos; (-) não detectado.
92
Comparativamente, os extratos de T. aurantiacus e T. reesei, continham baixa
atividade de β-xilosidase, e por consequência produziram xilobiose (X2) em maior
concentração do que o extrato de A. niger.
5.3.2 Efeito do tempo na produção de XOs
A hidrólise da xilana do bagaço foi conduzida com 60 U/g de xilanase por vários
tempos (Tabela 16). A produção de xilose e XOs aumentou com o tempo de hidrólise,
obtendo-se o maior rendimento com 96 h. A soma da xilose e xilobiose alcançou a conversão
máxima teórica de 60 % e o restante foi principalmente material com alta massa molar. Yang
e Zhang (2007) reportaram a produção de 3,7 mg/mL de XOs da hemicelulose de bagaço com
48 h de reação. O resultado da hidrólise com as enzimas de T. aurantiacus nesse mesmo
tempo foi maior, 4,36 mg/mL, correspondente a 29 % de XOs (Tabela 16).
Com o decorrer da reação observou-se diminuição na concentração de xilotriose e
aumento de xilobiose e xilose, o que evidencia a predominância de endoxilanase da família 10
no extrato enzimático de T. aurantiacus. Xilo-oligossacarídeos maiores que xilobiose foram
produzidos em baixa quantidade, mas principalmente em 6 h de reação.
Tabela 16. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. aurantiacus. Tempo (h) Conversão em xilose e xilo-oligossacarídeos (%)a XOs
(mg/mL)
xilose X2 X3 X5 XOs
3 9,34 ± 0,57 13,94 ± 0,94 0,22 ± 0,01 0,05 ± 0 14,21 ± 0,94 2,13
6 9,65 ± 0,71 11,79 ± 1,81 0,20 ± 0 0,05 ± 0 12,04 ± 1,81 1,81
12 10,61 ± 0,73 13,75 ± 0,99 0,19 ± 0,02 0,07 ± 0,01 14,01 ± 1,02 2,10
24 12,97 ± 0,21 21,58 ± 0,67 0,19 ± 0 0,05 ± 0 21,82 ± 0,68 3,27
48 19,42 ± 2,37 28,87 ± 3,01 0,13 ± 0,02 0,05 ± 0,01 29,05 ± 3,04 4,36
72 20,33 ± 1,11 33,01 ± 1,43 0,11 ± 0,01 0,04 ± 0,01 33,17 ± 1,45 4,98
96 22,48 ± 0,77 38,48 ± 0,99 0,08 ± 0 0,02 ± 0 38,58 ± 1,0 5,79
X2: xilobiose; X3: xilotriose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos; (a) ensaios realizados em triplicata
93
A hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. reesei resultou em um aumento na
produção de xilose com aumento do tempo reacional, enquanto que a produção de xilobiose
atingiu um máximo em 24 h e diminuiu após esse tempo (Tabela 17). Uma baixa
concentração de xilopentaose e xilotetraose foi detectada no início da reação. Xilopentaose foi
totalmente convertido em outros produtos após 24 h e X4 apareceu somente até 6 h, em
concentrações inferiores a X5. A máxima produção de X3 ocorreu entre 12 e 24 h, a partir de
então sua taxa de formação foi menor que a de hidrólise.
Tabela 17. Hidrólise da xilana do bagaço com xilanase (60 U/g) de T. reesei.
Tempo (h) Conversão em xilose e xilo-oligossacarídeos (%)(a) XOs
(mg/ml)
xilose X2 X3 X5 XOs
3 8,52 ± 0,82 6,44 ± 0,18 0,07 ± 0,04 0,02 ± 0,02 6,53 ± 0,10 1,24
6 11,36 ± 0,04 12,18 ± 0,28 0,10 ± 0 0,02 ± 0 12,30 ± 0,29 1,84
12 15,12 ± 1,06 13,66 ± 1,16 0,13 ± 0,03 0,00 ± 0 13,79 ± 1,17 2,07
24 21,35 ± 1,33 18,12 ± 1,79 0,10 ± 0,01 0,01 ± 0 18,23 ± 1,81 2,73
48 31,05 ± 2,18 12,23 ± 1,96 0,08 ± 0,02 0,00 ± 0 12,31 ± 1,98 1,85
72 37,49 ± 0,27 9,98 ± 0,63 0,05 ± 0 0,00 ± 0 10,03 ± 0,63 1,50
96 40,50 ± 0,05 8,50 ± 0,25 0,03 ± 0 0,00 ± 0 8,53 ± 0,25 1,29
X2: xilobiose; X3: xilotriose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos; (a) ensaios realizados em triplicata
5.3.3 Otimização da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar
A escolha de uma condição de hidrólise que maximize a formação de XOs é de grande
interesse para facilitar a sua recuperação. A partir das informações obtidas nos ensaios
preliminares foi realizado um planejamento experimental para avaliar o efeito interativo da
carga de enzima e substrato na produção de XOs.
5.3.3.1 Produção de xilose
A maior conversão da xilana em xilose com as enzimas de T. aurantiacus (37 %)
ocorreu na menor concentração de substrato (0,5 % m/v). Nessa condição o aumento do
X3,
X4
e X
5 (u
g/m
L)
94
tempo de reação de 6 para 48 h melhorou a conversão em apenas dez por cento (Figura 28).
Adicionalmente, não se observou um efeito positivo na conversão de hemicelulose em xilose
quando se aumentou a carga de enzima.
Nos meios com maior concentração de substrato (3,5 % m/v) observou-se uma
redução na conversão em xilose, o aumento da carga enzimática provocou um discreto efeito
positivo na conversão em xilose. A menor eficiência de conversão em xilose observada nas
maiores concentrações de substrato pode ser causada pela menor disponibilidade de água no
meio, o que geralmente reduz a velocidade de hidrólise, como observado em outros trabalhos
(MOURE et al., 2006; YOON; WOODANS; HANG, 2006).
A hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. reesei alcançou 65 % de conversão
em xilose na menor concentração de substrato (0,5 % m/v) e alta carga de enzima (80 U/g)
(Figura 29). Em concentrações mais altas de substrato a conversão em xilose reduziu, porém o
aumento da carga de enzima resultou em uma melhora na conversão da hemicelulose tanto
quando o substrato estava em baixa quanto em alta concentração.
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tempo (h)
Xilo
se (%
)
S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g
Figura 28. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. aurantiacus em diferentes concentrações de substrato e enzima.
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3 6 12 24 48 72 96
tempo (h)
Xilo
se (%
)
S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g
Figura 29. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana em xilose durante a hidrólise com extrato enzimático de T. reesei em diferentes concentrações de substrato e enzima.
5.3.3.2 Produção de xilo-oligossacarídeos
5.3.3.2.1 Hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. aurantiacus
A conversão da hemicelulose do bagaço em xilobiose aumentou com o progresso da
de reação. A maior concentração de xilobiose foi obtida na condição intermediária da região
de estudo, ou seja, quando se utilizou 2% de hemicelulose e 60 U/g de enzima, porém
observa-se uma redução na taxa de formação de xilobiose após 48 h (Figura 30). A redução na
velocidade da hidrólise enzimática pode ter ocorrido pela maior dificuldade de acesso das
enzimas ao substrato, que sofreu mudanças durante a reação e também pela inibição das
xilanases pelos produtos da hidrólise da hemicelulose (ARO; PAKULA; PENTTILÄ, 2005).
A carga enzimática contribuiu pouco para o aumento da produção de XOs, uma
indicação a mais de que após uma hidrólise inicial rápida deve ocorrer uma limitação
estrutural do substrato às xilanases de T. aurantiacus. Outro fator que poderia cessar a
hidrólise seria a perda de atividade da enzima, entretanto, já foi verificado que esse extrato
mantém total atividade a 50°C em 96 h de reação e mais de 80% da atividade inicial até 50
dias (item 5.2.3).
A hidrólise da hemicelulose do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus gerou em
ordem decrescente xilobiose, xilose, xilotriose e xilopentaose, nas condições que favoreceram
96
a produção de XOs. A conversão total da hemicelulose foi de 59,8% em xilobiose e 40 % em
xilose, em relação ao total de XOs produzidos a xilobiose corresponde a 99 % (Figura 31).
Possivelmente a β-xilosidase presente no extrato de T. aurantiacus, mesmo em baixas
concentrações agiu nos xilo-oligossacarídeos transformando-os em xilose. As xilanases de T.
aurantiacus hidrolisam a hemicelulose pela extremidade não redutora liberando xilose e
oligossacarídeos curtos, lineares ou ramificados (BIELY et al., 1997, KALOGERIS et al.,
2001; VARDAKOU et al., 2003). Kalogeris et al. (2001) observaram que em tempos longos
de hidrólise de xilana de bétula por xilanase de T. aurantiacus quase toda xilotriose foi
hidrolisada, enquanto o ácido aldopentaurônico foi convertido em ácido aldotetraurônico.
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Xilo
bios
e (%
)
tempo (h)
S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60 U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g
Figura 30. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas enzimas de T. aurantiacus.
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ão to
tal (
%)
tempo (h)
S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g
Figura 31. Conversão total durante hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus.
A tabela 18 mostra a conversão total da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-
açúcar pelas enzimas de T. aurantiacus em 96 h de reação. A maior conversão (61 %) foi
obtida com 2 % (m/v) de substrato e 60 U/g de xilanase, sendo 38,5 % de XOs e o restante foi
xilose (22,5 %). Quando se usou a maior concentração de substrato (3,5 % m/v) a conversão
total foi sempre menor, independente do tempo de hidrólise e da carga de enzima.
Como continuidade da análise estatística a influência da concentração de substrato e
carga enzimática foi avaliada com um planejamento 22 com face centrada, uma vez que a
condição de máxima conversão em XOs parece estar dentro da região em estudo. A matriz do
planejamento e os resultados obtidos estão apresentados na tabela 18. Os dados confirmam o
ponto central como região de máxima conversão em XOs.
A significância estatística dos efeitos para a resposta conversão em XOs está
apresentada na tabela 19. Apenas o efeito individual do substrato (componente Linear) não foi
significativo. A interação entre substrato e enzima foi significativa ao nível de 90 % de
confiança.
98
Tabela 18- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. aurantiacus) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 96 h de reação.
Níveis
codificados Níveis reais
XOs (% massa hemicelulose)
Ensaio V1 V2 Substrato
(%) Enzima (U/g) Xilose
Arabinose X2 X3 X5
XOs (mg/mL)
1 -1 -1 0,5 40 35,98 0 11,30 0,03 0,01 0,43 2 -1 1 0,5 80 34,91 0 8,49 0,05 0,01 0,32 3 1 -1 3,5 40 13,65 1,48 25,65 0,08 0,02 6,76 4 1 1 3,5 80 16,83 2,73 30,30 0,04 0,01 7,97 5 0 -1 2 40 16,61 2,52 27,29 0,10 0,03 4,11 6 0 1 2 80 28,03 2,67 27,04 0,05 0,02 4,07 7 -1 0 0,5 60 37,87 2,89 11,28 0,12 0,02 0,43 8 1 0 3,5 60 17,56 1,38 34,97 0,05 0,02 9,20 9 0 0 2 60 22,08 2,25 38,11 0,08 0,02 5,73
10 0 0 2 60 21,98 1,04 37,72 0,07 0,02 5,67 11 0 0 2 60 23,37 1,22 39,60 0,08 0,02 5,96
Experimentos de 9 a 11 correspondem ao ponto central
V1: substrato; V2: carga enzima; X2: xilobiose; X3: xilotriose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos.
Tabela 19- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação.
(*) valores com 95 % de confiança (p < 0,05); (**) valores com 90 % de confiança (p < 0,1); V1: substrato; V2: carga de enzima; SQ: soma dos quadrados; GL: Grau de liberdade; MQ: Média dos quadrados
Através da análise de variância de regressão do modelo verifica-se que as variáveis
respostas apresentam valores de coeficientes de determinação (R2) superior a 0,96. O modelo
Fator SQ GL MQ p
Modelo 249,86 5 249,86 0,0010
Substrato (L) 0,421 1 0,421 0,5801
Planejamento Substrato (Q)* 144,9 1 144,9 0,0067
22 completo Enzima (L)* 597 1 597 0,0016
Com Enzima (Q)* 341,08 1 341,08 0,0028
Face Centrada V1V2 ** 13,91 1 13,91 0,0640
Falta de ajuste 42,98 3 14,32 0,0649
Erro 1,96 2 0,98
Total 1307,15 10
R2= 0,96
99
matemático não apresentou falta de ajuste ao nível de 95% de confiança (p < 0,05) (Tabela
19). Deste modo, os valores obtidos experimentalmente se ajustam à equação do modelo,
sendo a diferença com os valores previstos pela equação explicada pelo erro experimental. O
modelo matemático para descrever a conversão em XOs, na região em estudo, está
apresentado na equação 13.
Y1= 37 + 9,97v1 – 11,62v12 – 7,59v2
2 (13)
Onde:
Y1= conversão em XOs (%);
v1= variável codificada que representa a concentração de hemicelulose (% m/v);
v2= variável codificada que representa a carga de enzima (U/g).
A equação 13 possibilitou a obtenção da superfície de resposta da conversão em XOs na
região em estudo (Figura 32).
A
B
Figura 32. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose em XOs, obtido pela hidrólise com enzimas de T. aurantiacus.
100
Para avaliar o modelo matemático um ponto foi escolhido dentro da região de máximo
(valores codificados: S= 0,4 e E= 0; valores reais S= 2,6 % e E= 60 U/g). Os valores de
conversão em XOs obtidos nesse ponto (41,65 ± 0,45 %) confirmaram que o modelo descreve
bem a região em estudo, uma vez que o resultado está dentro da faixa de variação prevista por
esse modelo (37,08 ± 4,27 %).
A fim de verificar a adequação do modelo na hidrólise da hemicelulose em maior
escala, o ensaio foi repetido na condição otimizada empregando-se um volume de reação dez
vezes maior. Os resultados foram similares aos obtidos na menor escala e corresponderam a
39,4% de xilobiose e 24,1% de xilose.
5.3.3.2.2 Hidrólise da hemicelulose com enzimas de T. reesei
A maior produção de XOs com o extrato de T. reesei foi obtida com 3,5 % (m/v) de
substrato e 80 U/g de enzima entre 6 e 24 h de reação (Figura 33). Em tempos menores
observa-se que a formação de XOs foi maior com os níveis altos de substrato e enzima, assim
é possível que níveis superiores dessas variáveis poderia promover uma maior conversão da
hemicelulose em XOs.
A conversão total de hemicelulose em 24 h foi 45 %, sendo 22 % xilobiose e 23 %
xilose. Em 6 h a conversão em xilose foi de 11 %, com pouca alteração na conversão em XOs
(20 %). Entre os XOs produzidos, a xilobiose correspondeu a 99% do total. O extrato
enzimático de T. reesei contém várias xilanases (TÖRRÖNEN et al., 1992) e uma β-
xilosidase multifuncional que cliva xilo-oligossacarídeos gerando xilose, tem atividade de
arabinofuranosidase e de transglicosilação (HERMANN et al., 1997). Além dessas enzimas,
T. reesei produz arabinofuranosidase (CLARK et al., 1996; NOGAWA et al., 1999),
confirmada pela liberação de arabinose na reação de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar
(Tabela 21). Nos ensaios a carga de β-xilosidase foi de 0,0024 U/g, quando foi aplicado 60
U/g de endo-β-1,4-xilanase, o que certamente incrementou a produção de xilose no
hidrolisado.
As enzimas de T. reesei apresentaram uma conversão 50% menor do que as de T.
aurantiacus por razões que podem estar associadas a diferenças na estabilidade térmica e no
conjunto de hemicelulases presentes em cada extrato (JUHÁSZ et al., 2005; TÖRRÖNEN et
al., 1992; YU et al., 1987). Muitas endo-β-1,4-xilanase são estericamente impedidas de
agirem na hemicelulose que apresenta substituinte na cadeia principal, enquanto outras
101
xilanases agem bem sobre xilose adjacente a grupos substituintes (AKPINAR; ERDOGAN;
BOSTANCI, 2009). T. reesei produz xilanases da família 11, que apresentam menor
versatilidade catalítica, agem apenas em xilanas cuja cadeia principal é constituída apenas por
xilose e são capazes de clivar ligações mais afastadas das ramificações. Como resultado, essas
endoxilanases liberam produtos ramificados maiores que as xilanases da família 10, no
entanto podem hidrolisar xilobiose e xilotriose (TÖRRÖNEN et al., 1992; TÖRRÖNEN,
ROUVINEN, 1995).
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Xilo
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e (%
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tempo (h)
S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60 U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g
Figura 33. Conversão da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em xilobiose pelas
enzimas de T. reesei.
A maior conversão total da hemicelulose com as enzimas de T. reesei foi de 66 % com
0,5 % (m/v) de substrato e 80 U/g de enzima, nos tempos de 72 a 96 h (Figura 34). O
principal produto foi xilose e a conversão em xilobiose foi semelhante para os tempos de 6, 12
e 24 h. O controle do tempo de reação enzimática permite direcionar a formação de XOs ou
xilose, enriquecendo o meio em um ou outro açúcar.
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tempo (h)
S=0,5% E=40U/gS=0,5% E=80U/gS=2% E=60U/gS=3,5% E=40U/gS=3,5% E=80U/g
Figura 34. Conversão total durante a hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar
com enzimas de T. reesei.
Os resultados do planejamento para os níveis de 0,5 – 3,5 % de substrato e 40 e 80 U/g
de xilanase estão apresentados na tabela 20. Verifica-se que a conversão em XOs foi maior no
experimento 4, onde os níveis das variáveis foram alto. Os melhores resultados de conversão
foram obtidos entre 6 e 24 h, com pouca diferença entre esses tempos. Quando o substrato foi
empregado no nível baixo o aumento da carga de enzima não provocou efeito perceptivo. O
efeito da carga enzimática ficou claro no nível alto de substrato, elevando a conversão em
XOs.
Uma maior conversão em XOs poderia ser obtida se utilizasse níveis ainda maiores de
substrato, uma vez que o melhor resultado foi obtido no nível alto dessa variável. Para
confirmar essa hipótese, quatro passos de ascensão foram gerados pelo programa “Design
Expert”, os níveis de substrato e enzima foram: 1 (3,5 %, 44,6 U/g), 2 (5 %, 49,2 U/g), 3 (6,5
%, 53,8 U/g) e 4 (8 %, 58,4 U/g) e apresentaram conversão de 9,7, 10,9, 13,4 e 17,9 %,
respectivamente (os passos calculados resultaram da relação entre o coeficiente angular da
enzima (X2) pelo coeficiente angular do substrato (X1) encontrados na equação determinada
pelos dados experimentais: y = 6,21 + 6,14X1 + 1,4X2). Esses dados evidenciaram que o
aumento da concentração de substrato promove uma maior conversão, mas inferior a condição
usada anteriormente (3,5 % de substrato e 80 U/g de enzima). Desta forma, os níveis das
103
variáveis foram alterados para 2 e 5 % de substrato e 60 e 100 U/g de atividade xilanase a fim
de que a região de máxima conversão em XOs ficasse localizada dentro da região de estudo,
próxima do novo ponto central (3,5 % de substrato e 80 U/g de xilanase).
Tabela 20- Conversão da hemicelulose em XOs com extrato de T. reesei em função do tempo segundo o planejamento 22 completo.
Níveis das variáveis Conversão em XOs (% massa seca hemicelulose)
Exp V1 V2 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h
1 -1 -1 0,09 0,1 0,1 0,07 0,04 0,06 0,34
2 -1 1 0,1 0,09 0,05 0,07 0,03 0 0,01
3 1 -1 5,44 12,65 17,81 21,02 14,67 15,39 15,53
4 1 1 14,53 20,28 20,23 22,34 15,94 14,28 13,97
5 0 0 8,5 12,35 13,09 18,48 11,53 9,5 8,53
6 0 0 8,25 12,56 13,13 19,9 10,84 9,86 8,28
7* 0 0 2,85 11,99 15,14 16,31 14,56 10,73 8,78
* Experimentos de 5 a 7 correspondem ao ponto central V1: substrato (0,5 – 3,5 %); V2: carga enzima (40 – 80 U/g);
A nova região de estudo foi realizada com 6 h de reação e empregou-se um
planejamento experimental completo 22 com face centrada, uma vez que a máxima conversão
em XOs está dentro da região de estudo. Verificou-se o efeito positivo da carga de enzima
tanto em nível baixo quanto em nível alto de substrato (Tabela 21). Os dados confirmam o
ponto central como região próxima da máxima conversão, sendo a condição intermediária de
substrato (3,5 %) e enzima (80 U/g) que favorece a maior conversão.
A análise estatística de variância está apresentada na tabela 22, onde observa-se que a
variável substrato é significativa com 90 % de confiança e a variável enzima e interações são
significativas com 95 % de confiança.
104
Tabela 21- Matriz do planejamento experimental completo 22 com face centrada e 3 repetições no ponto central, aplicado para avaliação da influência da concentração de substrato (V1) e carga de enzima (T. reesei) (V2) na conversão da hemicelulose em XOs após 6 h de reação.
Níveis
codificados Níveis reais
XOs (% massa hemicelulose)
Ensaio V1 V2
Substrato
(%)
Enzima
(U/g) Xilose
Arabinose X2 X3 X4
XOs
(mg/mL)
1 -1 -1 2 60 30,01 1,24 5,52 0,43 0,1 1,83
2 -1 1 2 100 30,51 1,15 8,39 0,49 0,2 1,65
3 1 -1 5 60 6,33 0,44 5,82 0,20 0,1 1,79
4 1 1 5 100 14,79 0,40 18,07 0,16 0,0 7,42
5 0 -1 3,5 60 14,42 0,58 14,83 0,19 0,1 3,76
6 0 1 3,5 100 20,80 0,63 18,88 0,18 0,0 4,40
7 -1 0 2 80 27,98 0,29 15,46 0,42 0,1 1,64
8 1 0 5 80 12,36 0,43 15,26 0,15 0,0 6,58
9 0 0 3,5 80 11,46 0,49 19,14 0,18 0,1 2,91
10 0 0 3,5 80 12,36 0,49 21,28 0,20 0,1 3,24
11 0 0 3,5 80 11,86 0,51 20,18 0,19 0,1 3,07
Experimentos de 9 a 11 correspondem ao ponto central.
V1: substrato; V2: carga enzima; X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; XOs: xilo-oligossacarídeos
Tabela 22- Análise de variância dos efeitos principais e interação dos fatores (2-5% substrato e 60-100 U/g enzima) sobre a conversão da hemicelulose em XOs pelo extrato de T. reesei após 6 h de reação.
(*) valores com 95 % de confiança (p < 0,05); (**) valores com 90 % de confiança (p < 0,1); V1: substrato; V2: carga de enzima; SQ: soma dos quadrados; GL: Grau de liberdade; MQ: Media dos quadrados
Fator SQ GL MQ p
Modelo 64,47 5 64,47 0,0034
Substrato (L)** 15,96 1 15,96 0,0653
Planejamento Substrato (Q)* 97,09 1 97,09 0,0117
22 completo Enzima (L)* 61,18 1 61,18 0,0183
Com Enzima (Q)* 55,89 1 55,89 0,0200
Face Centrada V1V2 * 22,0 1 22,0 0,0487
Falta de ajuste 17,26 3 5,73 0,1716
Erro 2,31 2 1,15
Total 325,69 10
R2= 0,94
105
Através da análise de variância de regressão do modelo verifica-se que as variáveis
respostas apresentam valores de coeficientes de determinação (R2) de 0,94. O modelo
matemático (p < 0,05) não apresentou falta de ajuste ao nível de 95 % de confiança. Deste
modo, os valores obtidos experimentalmente se ajustam à equação do modelo, sendo a
diferença com os valores previstos pela equação explicada pelo erro experimental. O modelo
matemático para descrever a conversão de XOs pelo extrato de T. reesei, na região em estudo,
está apresentado na equação 14.
Y2= 20,74 – 6,19 v12 + 3,19v2 – 4,7v2
2 + 2,35v1v2 (14)
Onde:
Y2= conversão em XOs (%);
v1= variável codificada que representa a concentração de hemicelulose (% m/v);
v2= variável codificada que representa a carga de enzima (U/g).
A equação 8 possibilitou a obtenção da superfície de resposta da conversão em XOs na
região em estudo (Figura 35).
A
B
Figura 35. (A) Superfície de resposta; (B) Gráfico de contorno descrito pelo modelo que representa a conversão de hemicelulose (2 – 5 %) em XOs, obtido pela hidrólise com extrato de T. reesei (60 – 100 U/g).
106
Para avaliar o modelo matemático um ponto foi escolhido dentro da região de máxima
conversão (valores codificados: S= 0,5 e E= 0,375; valores reais S= 3,875 % e E= 87,5 U/g).
Os valores de conversão em XOs obtidos nesse ponto (19,32 ± 1,82 %) confirmaram que o
modelo descreve a região em estudo, uma vez que o resultado está dentro da faixa de variação
prevista por esse modelo (20,17 ± 2,37 %).
5.3.4 Hidrólise enzimática sucessiva da hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar
Após a hidrólise da hemicelulose do bagaço com os extratos de T. aurantiacus e T.
reesei, o resíduo sólido foi separado por centrifugação e submetido a uma segunda hidrólise.
Ao resíduo sólido foi adicionado 60 U/g de xilanase de T. aurantiacus, nas mesmas
condições empregada na primeira hidrólise resultando em 9,8 % de xilose e 4,8 % de
xilobiose. A conversão de cada produto foi respectivamente 3 e 8 vezes menor que a obtida
na primeira hidrólise e não houve formação de XOs com massa molar maior que xilobiose.
O resíduo sólido obtido da primeira hidrólise da hemicelulose com enzimas de T.
reesei foi novamente hidrolisado nas mesmas condições. Os resultados foram 11,8 % de
xilose e 4,8 % de xilobiose, correspondente a 4 e 10 vezes menos produto. Nessa reação
também não foram detectados XOs com massa molar superiores a xilobiose.
A formação de produtos na segunda hidrólise enzimática gerou conversões muito
inferiores à primeira hidrólise, principalmente em xilobiose. Isto confirma que mudanças
estruturais na hemicelulose, causada pela degradação das partes mais acessíveis do
polissacarídeo na primeira hidrólise, tenha resultado em um polissacarídeo mais recalcitrante
e menos susceptível à ação das xilanases. No caso do extrato enzimático de T. aurantiacus,
uma segunda hidrólise parece inviável em função da baixa produtividade, entretanto para T.
reesei a segunda hidrólise pode ser viável para obtenção de xilose, dado seu curto tempo de
reação.
A análise de infravermelho do resíduo obtido após a primeira hidrólise enzimática da
hemicelulose evidencia a remoção de arabinose através do desaparecimento do pico em 980
cm-1. Grande parte da hemicelulose (60 % com enzima de T. aurantiacus e 40 % com enzimas
de T. reesei) foi hidrolisada, no entanto o espectro de infravermelho apresentou poucas
mudanças (Figura 36). O fato de a arabinose ser removida parece não ter sido de grande
relevância para a continuidade da hidrólise da hemicelulose, na segunda hidrólise.
107
O espectro de infravermelho não mostra um aumento na intensidade do pico de 1510
cm-1, referente à vibração de anel aromático, o qual é atribuído à lignina. A caracterização
química confirmou que a lignina não se acumulou no resíduo sólido obtido após hidrólise
enzimática. A proporção de lignina na hemicelulose antes e após a hidrólise enzimática é a
mesma, como mostrado pelo espectro de infravermelho, o que evidencia que parte da lignina
está sendo removida durante a reação. Essa fração de lignina provavelmente foi solubilizada
com fragmentos de hemicelulose.
Figura 36. Espectro de infravermelho das amostras de hemicelulose de bagaço e dos resíduos sólidos obtidos após hidrólise com enzimas de T. aurantiacus (60 U/g de xilanase, 2 % de hemicelulose por 96 h) e T. reesei (80 U/g de xilanase, 3,5% de hemicelulose por 6 h).
5.3.5 Hidrólise da hemicelulose do bagaço com xilanases comerciais
Nos extratos comerciais detectaram-se apenas atividade de endoxilanase,
diferentemente dos extratos de T. aurantiacus e T. reesei que apresentaram em sua
108
composição atividade de arabinofuranosidase e β-xilosidase (Tabela 14). O fungo T.
aurantiacus produz várias enzimas das quais a arabinofuranosidase (KATAPODIS;
CHRISTAKOPOULOS, 2004; ROCHE; DESGRANGES; DURAND, 1994) e α-
glucuronidase (KHANDKE; VITHAYATHIL; MURTHY, 1989a) que agem sobre os grupos
substituintes, auxiliando na hidrólise da cadeia de xilana. Uma maior conversão em XOs foi
observada por Verbruggen, Beldman e Voragen (1998) quando misturaram xilanases
diferentes com arabinofuranosidases, em comparação às enzimas isoladas. A formação de
XOs e de xilose pelas xilanases comerciais foi menor que a obtida com as enzimas de T.
aurantiacus e T. reesei (Tabela 23).
Tabela 23- Produtos de hidrólise da hemicelulose (2 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar por xilanases comerciais (80 U/g). Conversão (%, massa hemicelulose)
Xilanases Tempo (h) X1 X2 X3 X4 X5 XOs (mg/mL)
2 10,31 9,93 0,11 0,02 0,02 1,12
EnzOx B 4 10,98 8,51 0,12 0,02 0,02 0,91
8 10,91 15,35 0,08 - 0,02 1,65
24 10,46 14,17 0,07 - 0,02 1,70
48 12,69 19,53 0,07 - 0,02 2,03
2 10,36 14,48 0,06 - - 1,53
Luminase 4 9,79 9,77 0,09 - 0,01 1,05
PB 200 8 12,20 19,23 0,09 - 0,03 2,20
24 12,21 15,40 0,09 - 0,02 1,60
48 12,41 18,76 0,06 - 0,01 2,05
2 - 1,27 0,06 0,01 - 0,26
Thermomyces 4 - 9,23 0,05 0,03 - 1,82
lanuginosus 18 - 12,62 0,12 0,05 - 2,49
24 - 10,97 0,09 0,02 - 2,16
X1: xilose; X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: Xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos
A xilanase de T. lanuginosus gerou um resultado muito promissor para a produção de
xilo-oligossacarídeos, pois não houve produção de xilose. Na natureza esse fungo cresce em
associação a outros organismos tendo em vista que ele não possui todas as enzimas
necessárias para a completa degradação da parede celular vegetal. Não produz celulases e as
enzimas desramificadoras da hemicelulose (PUCHART; BIELY, 2008), por esse motivo a
hidrólise é relativamente baixa e incompleta (Tabela 23). A xilanase de T. lanuginosus
109
pertence à família 11, que produz oligossacarídeos com maior massa molar que as xilanases
da família 10. A xilanase de T. lanuginosus apresenta atividade máxima em pH 7, e em
temperatura entre 60 e 70°C, é totalmente estável em uma faixa de pH entre 5 e 9, em
temperatura de 60°C por 96 h o que amplia sua aplicação na hidrólise de hemiceluloses
(CÉSAR; MRSA, 1996).
5.3.6 Hidrólise enzimática de diferentes xilanas com enzimas de T. aurantiacus
Determinou-se o efeito da concentração de enzimas na conversão das xilanas de
bagaço, bétula e semente de aveia. Há diferenças entre a composição das hemiceluloses
comerciais e a extraída do bagaço. As hemiceluloses comerciais não possuem lignina na sua
composição, enquanto a de bagaço contém 5,9 % de lignina. A hemicelulose de bétula contem
9,4% de ácidos urônicos, quase o dobro da hemicelulose extraída do bagaço.
A estrutura da xilana do bagaço de cana-de-açúcar, com base na sua composição
química pode ser classificada como arabinofuranosil-(4-O-metil)-glucuronoxilana, a xilana de
bétula é uma metilglucurono-xilana (TIMELL, 1967) e a xilana de semente de aveia é uma
arabinoxilana (KABEL et al., 2007). A hidrólise enzimática das xilanas produziu
principalmente xilobiose e xilose e uma pequena quantidade de xilotriose (X3) e xilopentaose
(X5) (Tabela 24). Observou-se uma maior produção de xilose e xilobiose com o aumento da
carga enzimática, porém esse aumento não foi linear. Considerando que todos os sítios
disponíveis das enzimas estejam ocupados pelo substrato, o aumento na concentração de
enzimas poderia incrementar a taxa de digestão da hemicelulose, entretanto o que se observou
foi uma diminuição na taxa de degradação com a suplementação de enzimas. Esses resultados
reforçam que a discussão anterior para a xilana do bagaço, em relação à formação de
inibidores da reação ou de formação de novos substratos menos apropriados à hidrólise,
também é válido para xilanas de outras origens.
As xilanas do bagaço e de bétula, que possuem composições semelhantes foram
hidrolisadas na mesma extensão, tendo xilose e xilobiose como principais produtos. A
arabinose foi detectada nas reações com as hemiceluloses de bagaço de cana (4,6 %) e de
semente de aveia (6,5 %). A liberação de arabinose é consequência da presença de uma
pequena atividade de arabinofuranosidase (0,0024 U/mL) no extrato enzimático de T.
aurantiacus. A arabinofuranosidase cliva grupos pendentes de arabinose, o que auxilia a ação
de xilanases na hidrólise da cadeia principal da hemicelulose.
110
Tabela 24 – Hidrólise enzimática de diferentes hemiceluloses (2,6 %) pelas enzimas de T. aurantiacus em 96 h de reação. Conversão (%, massa hemicelulose)
Hemicelulose U/g Xilose X2 X3 X5 arabinose XOs1 (mg/mL)
5 7,63 14,06 0,20 0,05 0,60 2,79
Bagaço 10 10,32 20,16 0,20 0,05 1,01 3,98
20 14,21 27,08 0,17 0,05 0,68 5,32
30 16,78 32,55 0,13 0,04 0,31 6,38
5 9,73 15,82 0,11 - 0,07 3,11
Bétula 10 11,89 20,31 0,09 - - 3,98
20 14,90 26,71 0,06 - - 5,22
30 17,00 35,21 - - - 6,87
5 9,63 9,26 0,14 0,04 - 1,84
Semente 10 13,16 14,99 0,15 0,04 1,51 2,96
Aveia 20 16,58 21,22 0,14 0,04 1,05 4,17
30 19,13 25,69 0,12 0,03 0,49 5,04
X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos
XOs1 mg/mL: soma da concentração de xilobiose (X2), xilotriose (X3 ) e xilopentaose (X5).
5.3.6.1 Identificação por cromatografia em camada delgada (TLC) dos produtos de
hidrólise da hemicelulose
Os produtos resultantes da aplicação de diferentes cargas de xilanases de T.
aurantiacus nas hemiceluloses de bagaço, bétula e de semente de aveia foram analisados por
cromatografia de camada delgada (Figura 37). Em todas as reações foi confirmada a presença
de xilose e oligossacarídeos (X2 a X4). A hidrólise da xilana de semente de aveia (amostras 6
e 7 ) liberou oligômeros maiores, provavelmente X5. A ausência de manchas nos ensaios
controles das amostras de hemiceluloses (Figura 37-colunas 8, 9 e 10), indica que não há
formação de produtos por outros fatores além da ação enzimática.
111
Figura 37: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de hemiceluloses de bagaço, bétula e semente de aveia por extrato de T. aurantiacus após 96 h de reação. (1: padrões, 2: xilana do bagaço + 10 U/g endo-xilanase; 3: xilana do bagaço + 30 U/g endo-xilanase; 4: xilana bétula + 10 U/g endo-xilanase; 5: xilana bétula + 30 U/g; 6: xilana de semente de aveia + 10U/g endo-xilanase; 7: xilana de semente de aveia + 30 U/g endo-xilanase; 8: xilana do bagaço; 9: xilana bétula; 10: xilana de semente de aveia).
Um ensaio com 60 U de xilanase por grama de xilana do bagaço foi realizado em
diferentes tempos de reação (Figura 38). Xilobiose e xilotriose aparecem após 3 h, entretanto
a mancha correspondente a xilose é nítida apenas após 48 h de reação. A intensidade das
bandas de xilose e xilobiose aumentou com o tempo de hidrólise provavelmente pela
conversão de xilotriose em xilose e xilobiose. Bandas com menor intensidade referentes à
XOs com grau de polimerização superior a 3 aparecem no cromatograma.
Os xilo-oligossacarídeos provenientes da reação da hemicelulose do bagaço com 60
U/g de xilanase de T. aurantiacus foram reincubados com uma xilanase da família 5. A
xilanase da família 5 foi obtida de Erwinia chrysanthemi (HURLBERT; PRESTON, 2001), e
age sobre os xilo-oligossacarídeos ramificados com ácido glucurônico entre o primeiro e o
segundo resíduo de xilose substituído a partir do terminal não redutor liberando xilose e
ácidos aldourônicos (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005). Os únicos produtos obtidos
após essa hidrólise foram xilobiose e xilotriose (Figura 39, coluna 3), desaparecendo
completamente a banda correspondente a X4 que aparecia no cromatograma anterior (Figura
38 – coluna 2). Esse resultado mostra que os XOs formados não são ramificados. A fim de
dirimir qualquer dúvida que ainda pudesse existir sobre a linearidade dos oligossacarídeos
obtidos da hidrólise com as enzimas de T. aurantiacus, foi realizada a pós-hidrólise dessa
112
amostra com β-xilosidase obtendo se xilose como único produto, comprovando que os XOs
que aparecem no cromatograma são lineares (Figura 39 - amostra 6).
Figura 38: Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T. aurantiacus. (1: padrões; 2: hidrolisado com 3 h de reação; 3: 6 h; 4: 48 h; 5: 96 h; 6: extrato enzimático; 7: hemicelulose do bagaço).
Figura 39. Cromatografia em camada delgada dos produtos da hidrólise de xilo-oligossacarideos (Amostra) obtidos da ação da xilanase de T. aurantiacus sobre a hemicelulose do bagaço. (1: padrões; 2: aldotetraurônico; 3: Amostra + endo-xilanase da família 5 (EX5); 4: Amostra + EX10; 5:Amostra + EX11; 6: Amostra + EX5 + β-xilosidase; 7: Amostra + EX10 + β-xilosidase; 8:Amostra + EX11 + β-xilosidase; 9: Amostra + β-xilosidase; 10: β-xilosidase).
113
5.4 AUTO-HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
O tratamento hidrotérmico do bagaço foi realizado na temperatura de 190°C por até 60
min. Ensaios com bagaço in natura e moído a 14 mesh não formaram XOs ou xilose em
níveis detectáveis, provavelmente porque nesse processo a superfície de contato é uma
variável muito importante na eficiência do pré-tratamento. Esperava-se que a adição de água
ao bagaço promovesse a solubilização de parte da hemicelulose do bagaço, pelo menos em
locais de fácil acesso. Outro fator que favorece a hidrólise da hemicelulose de
lignocelulósicos é o conteúdo de grupos acetil que catalisa a hidrólise (NABARLATZ;
EBRINGEROVÁ; MONTANÉ, 2007).
O bagaço com granulometria menor que 25 mesh foi submetido ao tratamento
hidrotérmico em ampolas de aço-inox. A tabela 25 mostra a composição do resíduo de bagaço
insolúvel em água nas condições de pré-tratamento. Como esperado a auto-hidrólise atacou
preferencialmente a hemicelulose. O resíduo sólido obtido após 60 min de auto-hidrólise
apresentou 15,5 % de hemicelulose, 48,9 % de celulose e 29 % de lignina (Tabela 25). A
remoção de hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar aumentou com o tempo de reação.
Tabela 25- Composição química do bagaço após auto-hidrólise a 190°C, 10 % (m/v).
Composição do material tratado (%)
tempo (min) Hemicelulose Celulose Lignina Total
0 27,50 44,90 22,10 94,50
5 24,77 44,90 25,72 95,37
15 22,19 44,90 26,98 94,07
30 17,74 45,72 28,29 91,75
45 16,39 46,58 29,04 92,01
60 15,55 48,92 29,08 93,55
A produção de XOs atingiu 6,9 % com 30 min de pré-tratamento, e chegou a 8 % após
60 min, com o aumento do tempo de pré-tratamento verificou-se que a maior parte da
hemicelulose foi convertida em xilose (31,6 %) (Tabela 26). Provavelmente houve formação
de XOs durante todo o tempo de reação, mas simultaneamente ocorreu a degradação desses a
xilose, sendo essa taxa de conversão em XOs semelhante à de degradação. Estima-se que 35
114
% da hemicelulose foi removida do bagaço em 30 min de reação, e desse percentual, cerca de
10 % foi convertido em XOs e 22 % obtido como xilose. Laser et al. (2002), observaram que
em temperatura de 200°C por 10 min a remoção da fração hemicelulósica do bagaço de cana
foi de 84 %. Nesse ensaio, o bagaço selecionado em peneira de 14 mesh (retido), foi
previamente aquecido com vapor antes da introdução de água aquecida. Os autores não
discutem o tempo para atingir a temperatura de trabalho e nem de resfriamento do reator de
25 L, fator que pode colaborar para maior solubilização da hemicelulose.
A xilose foi bastante estável, com pequena parte (0,6%) sendo convertida a furfural
em 60 min. A produção de hidroximetilfurfural manteve-se inferior a 0,1 % durante todo o
tempo de reação.
Tabela 26- Produtos da auto-hidrólise (190°C, 10 % m/v) do bagaço de cana-de-açúcar presentes na fração líquida.
Conversão (% - base massa hemicelulose)
Tempo
(min) Xilose X2 X3 X4 X5 Furfural HMF
XOs
(mg/mL) Total
5 0,65 0,24 0 0 0 0,01 0,06 0,06 0,89
15 1,36 0,3 0 0 0 0,02 0,08 0,08 1,66
20 2,74 0,7 0 0 0 0,02 0,07 0,18 3,44
25 5,23 2,89 0,01 0 0 0,05 0,07 0,72 8,13
30 15,11 6,92 0,06 0 0 0,43 0,07 1,75 22,1
45 15,72 6,56 0,06 0,04 0,02 0,39 0,05 1,67 22,41
60 31,63 8,04 0,08 0,04 0,06 0,59 0,12 2,06 39,86
X2: xilobiose; X3: xilotriose; X4: xilotetraose; X5: xilopentaose; XOs: xilo-oligossacarídeos;
HMF: hidroximetilfurfural
A recuperação total dos açúcares derivados da hemicelulose, expressada como
açúcares no filtrado dividido pelos açúcares no bagaço, foi de aproximadamente 40 % no
maior tempo de reação.
Comparativamente à hidrólise enzimática da hemicelulose, a produção de xilobiose
pela auto-hidrólise do bagaço foi 5,8 vezes menor. Uma alternativa para aumentar o teor de
XOs na solução seria concentrar os produtos da auto-hidrólise, entretanto, outros
procedimentos para remoção do furfural e hidroximetilfurfural teriam que ser avaliados para a
115
obtenção de um produto final purificado. Além disso, esse hidrolisado é mais indicado para
obtenção de xilose, pois a sua produção foi de duas a quatro vezes maior.
6. CONCLUSÕES
A partir dos resultados apresentados pode-se concluir que:
Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 produz a maioria das enzimas do complexo
celulolítico e hemicelulolítico. Apresentou bom crescimento em farelo de trigo, destacando a
predominância na produção de endo-β-1,4-xilanase perante as demais enzimas. Os ensaios de
estabilidade térmica confirmaram a estabilidade da xilanase em temperaturas elevadas.
A hemicelulose foi extraída com alto rendimento com peróxido alcalino e apresentou
alta solubilidade, coloração clara e baixo teor de lignina. De acordo com sua composição
química pode ser classificada como L-arabino-(4-O-metil-D-glucurono)-D-xilana. As
propriedades desse polissacarídeo foram adequadas para emprego em ensaios de hidrólise
enzimática, diferente da hemicelulose extraída com hidróxido de sódio, a qual apresentou
baixa solubilidade.
A hidrólise da hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar com enzimas de T.
aurantiacus e T. reesei resultou em maior conversão em XOs do que as enzimas de A. niger.
O uso de xilanases comerciais na hidrólise da hemicelulose não superou o desempenho das
enzimas de T. aurantiacus na produção de XOs, provavelmente pela presença de várias
enzimas acessórias além da xilanase no extrato de T. aurantiacus. A xilanase de T.
lanuginosus mostrou-se uma excelente enzima para a obtenção de xilobiose, uma vez que não
produziu xilose.
A xilanase de T. aurantiacus hidrolisou de modo semelhante as hemiceluloses de
bagaço de cana-de-açúcar, bétula e semente de aveia. As diferenças estruturais como
ramificações e presença de lignina não interferiram na ação dessa enzima. Em todos os casos
houve formação apenas de xilo-oligossacarídeos lineares.
A hidrólise da hemicelulose com as enzimas de T. aurantiacus e T. reesei apresentou
algumas diferenças. T. aurantiacus produziu XOs principalmente em tempos longos de reação
(acima 48 h) e T. reesei produziu XOs em tempos mais curtos (6 a 24 h), sendo que o
aumento do tempo favoreceu a produção de xilose. Os resultados mostram diferenças entre as
xilanases, evidenciando diferenças nas propriedades bioquímicas e atividade específica, o que
116
consequentemente causam diferenças na eficiência e extensão da hidrólise.
A auto-hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar gerou predominantemente xilose e uma
baixa quantidade de XOs. Entre os XOs formados destacou-se a xilobiose, como na hidrólise
enzimática, porém houve formação de furfural.
A produção de XOs pela auto-hidrólise do bagaço foi 5,8 vezes menor que na hidrólise
enzimática da hemicelulose e desta forma etapas de concentração e purificação seriam
necessárias para a obtenção de um produto final com as características desejadas. Por outro
lado, o tempo de reação foi curto e a moagem foi a única operação realizada no bagaço antes
do tratamento térmico.
Os melhores resultados de produção de XOs pelas enzimas de T. aurantiacus foram
diferentes das enzimas de T. reesei. Deve ser levado em consideração o custo de cada etapa,
enquanto a reação com enzimas de T. aurantiacus produz 41,6 % de XOs em 96 h, a reação
com enzimas de T. reesei produz 20 % em 6 h. Entretanto, com T. reesei deve ser empregado
mais substrato e enzima. Considerando o custo de extração de hemicelulose e de produção de
enzima, T. aurantiacus seria mais indicado para esse processo.
Enfim, a produção de XOs se torna possível através de uma etapa de extração da
hemicelulose e outra etapa de hidrólise enzimática. A primeira etapa deve ocorrer em meio
alcalino com peróxido de hidrogênio, por gerar um polissacarídeo solúvel e passível de
hidrólise enzimática. Na segunda etapa, destaca-se a ação das enzimas de T. aurantiacus, pela
maior conversão da hemicelulose em XOs e também pela alta produção de xilanase no cultivo
em meio sólido, fatores que contribuem para viabilidade econômica.
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ANEXO
A) Trabalhos que já foram publicados em periódicos científicos a partir de resultados obtidos nesta tese.
BRIENZO M.; ARANTES, V.; MILAGRES, A.M.F. Enzymology of the thermophilic ascomycetous fungus Thermoascus aurantiacus. Fungal Biology Reviews, v. 22, p. 120-130, 2009. BRIENZO, M.; SIQUEIRA, A.F.; MILAGRES, A.M.F. Search for optimum conditions of sugarcane bagasse hemicellulose extraction. Biochemical Engineering Journal, v. 46, p. 199–204, 2009. BRIENZO M.; CARVALHO, W.; MILAGRES AMF. Xylooligosaccharides production from alkali-pretreated sugarcane bagasse using xylanases from Thermoascus aurantiacus. Applied of Biochemistry and Biotechnology, DOI 10.1007/s12010-009-8892-5, 2010. BRIENZO, M.; MONTE, J.R.; MILAGRES, A.M.F. Hemicelluloytic and cellulolytic activities in the culture filtrate of Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 induced by products of xylan hydrolysis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (submetido).