MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA ESCOLA AGRÍCOLA DE JUNDIAÍ - EAJ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS

EXPRESSÃO GÊNICA DE TIORREDOXINAS h EM EUCALIPTO EM RESPOSTA AO

ESTRESSE SALINO

FABIANA SILVA DE ARAÚJO

Macaíba/RN

Janeiro de 2020

ii

FABIANA SILVA DE ARAÚJO

EXPRESSÃO GÊNICA DE TIORREDOXINAS h EM EUCALIPTO EM RESPOSTA AO

ESTRESSE SALINO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Florestais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como

parte das exigências para obtenção do título de Mestre

em Ciências Florestais (Área de Concentração em

Ciências Florestais - Linha de Pesquisa:

Biodiversidade, Conservação E Uso Dos Recursos

Genéticos Florestais).

Orientador:

Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio

Macaíba/RN

Janeiro de 2020

iii

Elaborado por Valéria Maria Lima da Silva - CRB-15/451

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Rodolfo Helinski - Escola Agrícola de Jundiaí – EAJ

Araújo, Fabiana Silva de.

Expressão gênica de tiorredoxinas h em eucalipto em resposta ao

estresse salino / Fabiana Silva de Araújo. - 2020.

45f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias,Programa

de Pós-Graduação em Ciências Florestais. Macaíba, RN, 2020.

Orientador: Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio.

1. Eucalipto - Dissertação. 2. RT-PCR Semi-Quantitativa -

Dissertação. 3. Família Multigênica - Dissertação. 4. Análise in

Silico - Dissertação. 5. Análise Funcional - Dissertação. I. Lúcio,

Paulo Sérgio Marinho. II. Título.

RN/UF/BSPRH CDU 582.776

iv

EXPRESSÃO GÊNICA DE TIORREDOXINAS h EM EUCALIPTO EM RESPOSTA AO

ESTRESSE SALINO

FABIANA SILVA DE ARAÚJO

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais

(Área de Concentração em Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: Biodiversidade,

Conservação E Uso Dos Recursos Genéticos Florestais) e aprovada pela banca

examinadora em 31 de janeiro de 2020.

Banca Examinadora

________________________________________

Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio – PPGCFL/UFRN

Presidente

___________________________________________

Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha – UFRN

Examinador externo ao programa

________________________________________________

Prof. Dr. Alek Sandro Dutra– UFC

Examinador externo à instituição

Macaíba/RN

Janeiro de 2020

v

À Deus, familiares e aos amigos contribuintes.

DEDICO

vi

AGRADECIMENTOS

__________________________________________________________________________

Agradeço,

À Deus acima de tudo, aos meus pais Maria Aldenize e Francisco das Chagas,

minha irmã Aldenir e seu esposo Gilvan, meu irmão Francinildo e sua esposa Márcia

maiores responsáveis pela realização deste sonho, gratidão a todos da família pelo apoio.

Agradeço também, aos professores e profissionais internos e externos do PPGCFL

(Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais) da UFRN (Universidade Federal do

Rio Grande do Norte) do que contribuíram para o desenvolvimento, ao grupo de estudo

contribuintes Diego G. Teixeira (primordial para desenvolvimento desta pesquisa) e Vitória

Cavalcante (Com estudo base para pesquisa), assim como os estagiários e amigos que

participaram da execução, coletas e desenvolvimento (análises) dos dados, em especial

meu orientador e amigo Paulo Marinho pela confiança e contribuições e ao PPGCFL pela

oportunidade de desenvolver ciência através da pesquisa. Agradeço também a Faculdade

de Tecnologia de Capão Bonito- SP e todo seu corpo docente e funcionários pela recepção

e treinamento em práticas laboratoriais e aos Laboratório de Genética Molecular de Plantas

e ao Laboratório de Estudos em Biotecnologia Vegetal da UFRN pela parceria.

vii

RESUMO

__________________________________________________________________________

EXPRESSÃO GÊNICA DE TIORREDOXINAS h EM EUCALIPTO EM RESPOSTA AO

ESTRESSE SALINO

Eucalyptus grandis é a primeira espécie de eucalipto que teve seu genoma totalmente

sequenciado e publicado em 2014. A planta é de grande interesse econômico para o Brasil

que dispõe atualmente de uma área plantada de 7,84 milhões de hectares para a produção

de celulose. A espécie também permanece alvo de estudos de melhoramento via obtenção

de híbridos e de transformação genética para a produção de plantas transgênicas algumas

já liberadas para o plantio experimental. O objetivo deste trabalho é estudar a expressão

gênica de três genes que codificam tiorredoxinas citoplasmáticas de E. grandis,

Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1. A abordagem técnica em questão

envolve análises in silico e em uma condição de resposta ao estresse salino em plântulas

em laboratório bem como em indivíduos adultos mantidos em plantio experimental. A

metodologia utilizada para obtenção de plântulas consiste em submeter sementes

peletizadas em placas contendo papel de filtro umedecidos em soluções com duas

concentrações de NaCl, além do controle em três tratamentos, controle, 50mM e 100mM de

NaCL. As plantas adultas são espécimes do experimento TECHS (Tolerância de Eucalyptus

Clonais aos Estresses Hídrico, Térmico e Biótico) mantido na Unidade Acadêmica

Especializada em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os

ensaios de RT-PCR foram realizados a partir de extrações de RNA total das plântulas

submetidas ao estresse salino e de plantas adultas do TECHS. Bibliotecas de cDNA foram

obtidas a partir do RNA total extraído do material vegetal e realizadas reações de PCR com

os oligonucleotideos iniciadores específicos para os três genes estudados. A expressão

gênica semi-quantitativa foi estimada em géis de eletroforese de DNA. Uma análise in silico

das sequências promotoras dos genes estudados também foi realizada para identificar

domínios de ligação a proteínas reguladoras envolvidas com a resposta ao estresse salino.

Os resultados obtidos mostram que plântulas de E. grandis respondem ao estresse salino e

constituem um bom material vegetal para análise funcional de genes de plantas. Ao mesmo

tempo, observa-se uma correlação entre a resposta ao estresse salino e a possível

intervenção de fatores de transcrição como é o caso de MYC1 em coexpressão com o gene

Eucgr.F01604.1

Palavras-chave: RT-PCR semi-quantitativa, família multigenica, análise in silico, análise

funcional.

viii

ABSTRACT

__________________________________________________________________________

GENE EXPRESSION OF THIOREDOXINS h IN EUCALYPT IN RESPONSE TO SALINE

STRESS

Eucalyptus grandis is the first eucalyptus species to have its genome fully sequenced and

published in 2014. The plant is of great economic interest to Brazil and currently has a

planted area of 7.84 million hectares for pulp production. The species also remains the target

of breeding studies through hybrids and genetic transformation for the production of

transgenic plants already released for experimental planting. The objective of this work is to

study the gene expression of three genes encoding E. grandis cytoplasmic thioredoxins,

Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 and Eucgr.I02383.1. The technical approach in question

involves in silico analysis and a saline stress response condition in seedlings in the

laboratory as well as in adult individuals kept in experimental planting. The methodology

used to obtain seedlings is to submit pelletized seeds in plates containing filter paper

moistened in solutions with two NaCl concentrations, besides the control in three treatments,

control, 50mM and 100mM NaCL. Adult plants are specimens of the TECHS experiment

(Clonal Eucalyptus Tolerance to Water, Thermal and Biotic Stress) maintained at the

Academic Unit Specialized in Agricultural Sciences of the Federal University of Rio Grande

do Norte. RT-PCR assays were performed from total RNA extraction from seedlings

subjected to saline stress and from adult TECHS plants. CDNA libraries were obtained from

total RNA extracted from plant material and PCR reactions were performed with the primer

oligonucleotides specific for the three genes studied. Semi-quantitative gene expression was

estimated in DNA electrophoresis gels. An in silico analysis of the promoter sequences of the

studied genes was also performed to identify regulatory protein binding domains involved

with the salt stress response. The results show that E. grandis seedlings respond to saline

stress and constitute a good plant material for functional analysis of plant genes. At the same

time, there is a correlation between the salt stress response and the possible intervention of

transcription factors such as MYC1 in coexpression with the Eucgr.F01604.1 gene.

Keywords: Semi-quantitative RT-PCR, multigenic family, in silico analysis, functional

analysis.

ix

SUMÁRIO

__________________________________________________________________________

Página 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 2

2.1. O Eucalipto .......................................................................................................... 2

2.2. As Tiorredoxinas .................................................................................................. 7

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 9

3.1. Análise in silico .................................................................................................... 9

3.2. Análise in vivo ................................................................................................... 10

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 11

5. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 18

LITERATURA CITADA .................................................................................................. 19

ANEXO 1 Alinhamento múltiplo de sequencias de proteínas de tiorredoxinas h de E.

grandis obtida com software COBALT evidenciando domínios conservados e sítio ativo

típico. ........................................................................................................................... 25

ANEXO 2 Possíveis vias de biossínteses acessadas pelas Trx segundo o KEGG ....... 25

ANEXO 3 Identificação das tiorredoxins segundo o Pfan .............................................. 26

ANEXO 4 Análise de sequencias reguladoras – PlantCARE ........................................ 27

x

LISTA DE FIGURAS

__________________________________________________________________________

Figura 1. Interação dos genes Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1 com a

totalidades dos genes expressos em Eucalyptus grandis obtida pela plataforma STRING.

Figura 2. Motivos de regulação em sequencias promotoras dos genes Eucgr.F01604.1,

Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1 que codificam tiorredoxinas h em Eucalyptus grandis

obtidos pela plataforma PlantCARE.

Figura 3. Mapa de expressão dos 9 genes que codificam TRXs h em comparação com os

fatores de transcrição MYB, ABRE, NAC, MYC1 e com a SOD, evidenciando coexpressão

da TRX F01604 com MYC1 em dados normalizados a partir de ensaio com dados da

plataforma Phytosome.

Figura 4. Coexpressão dos genes de TRX F0154 e F01605 e do gene D02287 que codifica

MYC1.

Figura 5. Obtenção de plântulas de Eucalyptus grandis submetidas a estresse salino em

laboratório ao longo de 20 dias.

Figura 6. Expressão gênica por RT-PCR semi-quantitativa em tecidos de Eucalitos híbridos

do TECHS: FJ, folha jovem; MA, meristema apical; X, xilema; FL, floema; PL, plântulas.

F00241.1, actina. (Modificado de Cavalcante, 2019).

Figura 7. Expressão genica por RT-PCR dos genes de TRX h Eucgr.F01604.1, F01854.1,

I02383.1 e do gene MYC em plântulas submetidas a concentrações de 0mM (C), 50 mM

(S1) e 100 mM (S2) de NaCl. Eucgr F0024.1, gene controle, actina.

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

__________________________________________________________________________

ATP – Adenosina trifosfato

cDNA - DNA complementar

CITRX – Cf-9 tiorredoxina interação)

DNA – ácido desoxirribonucléico

EST – expressed sequence tag

FBPase – Frutose 2,6 - bifosfato

Fdx – ferredoxina

FOREST – Eucalyptus spp EST Project

FPKM – quilo base de exóns por milhões de reads mapeados

FTR – ferredoxina tiorredoxina redutase

FT - Fatores de transcrição

KDa – quilo dalton

NCBI – National Center for Biotechnology Information

MDH – Malato desidrogenase

NADP – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina

NADPH – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina fosfato

NTR – tiorredoxina redutase dependente de NADPH

Prx – Peroxirredoxina

TECHS - Tolerância de Eucalyptus Clonais aos Estresses Hídrico, Térmico e Biótico

TCA – ácido tricarboxílico

Trx - Tiorredoxinas

Trh h – Tiorredoxina heterotrófica

RNA - ácido ribonucleico

Trxs-like – Tiorredoxinas similares

Ros – espécie reativa de oxigênio

RT – PCR – reação da transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da polimerase

WCGPC – W: triptofano, C: cisteína, G: glicina, P: prolina

1

1. INTRODUÇÃO

__________________________________________________________________________

Eucalyptus grandis foi a primeira espécie de eucalipto a ter seu genoma totalmente

sequenciado. Este projeto, realizado por grupos de pesquisa australianos e brasileiros

(MYBURG et al., 2014), permitiu o acesso, em bancos de dados de domínio público, como

Phytosome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) ou GenBank (AUSX00000000

(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AUSX00000000) à sequência completa do genoma da

espécie, bem como aos dados de expressão genica in silico por RNA-seq.

Diversas abordagens em genética molecular foram feitas a partir destes dados e para

diferentes genes de cópias únicas ou famílias gênicas. Cavalcante (2019), trabalhando com

genes que codificam tiorredoxinas (Trxs) em E. grandis, enzimas oxidoredutases presentes

em todos os organismos e particularmente abundantes em plantas (GEIGENBERGER et al,

2017), identificaram 22 genes de Trx correspondentes aos tipos cloroplásticos,

citoplasmáticos, mitocondriais e nucleares. Neste trabalho, um esforço importante em

bioinformática e em experimentos laboratoriais permitiu uma melhor caraterização desses

genes de Trxs em eucalipto e o estudo de expressão in silico deu fortes indicativos sobre em

quais tecidos se expressam estes genes.

A continuação do trabalho de Cavalcante et al (2020), desta dissertação, consiste em

aprofundar os conhecimentos sobre a expressão gênica diferencial de Trxs em Eucalyptus

grandis. O interesse se concentra naqueles genes que codificam as tiorredoxinas do tipo

citoplasmáticas, também denominadas h (heterotróficas), por serem as menos caraterizadas

do ponto de vista funcional em comparação com as já bem estudadas no cloroplasto. Nesse

trabalho, foram identificadas, por meio do mapa de expressão in silico (heatmap), as Trxs

com maior expressão tecido específica. Três genes merecem, preferencialmente, um estudo

de aprofundamento de suas funções na célula e podem revelar um bom potencial

biotecnológico.

A estratégia então utilizada neste trabalho é de confirmar e verificar os resultados já

obtidos por Cavalcante et al (2020) e progredir com caracterização funcional das Trxs

Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1 de E. grandis. As técnicas empregadas

envolvem experimentos in silico, que visam identificar a interação destas três Trxs com os

demais genes expressos no genoma do eucalipto numa abordagem sistêmica em genômica

comparativa, bem como uma análise pontual das sequências promotoras dos três genes. A

outra iniciativa, in vivo, visa estudar a resposta destes três genes alvo, através da expressão

dos seus transcritos por RT-PCR semi-quantitativa, numa situação fisiológica específica em

2

laboratório, a resposta ao estresse salino, e numa situação de campo. No laboratório, o

interesse é observar a resposta ao estresse salino de plântulas de E. grandis uma vez que

esta condição é sempre limitante para a implantação de cultivos em larga escala e há

interesse em identificar genes que promovam uma resposta de maior tolerância a este tipo

de estresse.

No campo, a abordagem visa estudar a expressão gênica dos três genes alvo a partir

de plantas de eucalipto hibridas cultivadas na Unidade Acadêmica Especializada em

Ciências Agrárias - UAECIA /Escola Agrícola de Jundiaí – EAJ da UFRN. Esta unidade

abriga, há 7 anos, um experimento do tipo TECHS (Tolerância de Eucalyptus Clonais aos

Estresses Hídrico, Térmico e Biótico). No TECHS há 11 espécies, 2 das quais são híbridas

de eucalipto E. grandis com E. camaldulensis e com E. urophylla. Elas também serão alvo

deste estudo de expressão gênica considerando a particularidade de serem árvores adultas

e de serem plantas mantidas em condições padrão em silvicultura.

Espera-se, assim, progredir na caraterização funcional desses genes em condições

particulares nunca antes estudadas e definir, eventualmente, uma aplicação biotecnológica

desses genes na silvicultura do Eucalipto no Brasil.

2. REVISÃO DE LITERATURA

__________________________________________________________________________

2.1. O Eucalipto

O gênero Eucalyptus composto por mais de 600 espécies é originário da Austrália. O

eucalipto pertence à família Myrtaceae, é a árvore mais utilizada para produção de madeira

e biomassa no mundo atualmente com uma área plantada de 20 milhões de hectares em

mais de 20 países distribuídos em todos os continentes. Nas regiões tropicais E. grandis e

híbridos são cultivados enquanto em áreas temperadas E. globulus e E. gunnii são os mais

comuns. Isto deve-se ao fato de ser uma planta de alta capacidade adaptativa, rápido

crescimento e qualidade da madeira considerada superior. A árvore também é fonte de óleos

essenciais mono e sesquiterpenos muito utilizados pela indústria com diversos usos

inclusive na indústria farmacêutica (MYBURG et al., 2007).

Introduzido no Brasil por volta de 1910 o gênero Eucalyptus vem despertando grande

interesse em várias regiões do país e do mundo e é motivo de avançados programas de

tecnologia em melhoramento e de desenvolvimento, como fertilização, manejo, e processos

industriais para fins produtivos de celulose, energia bem como para serraria. (FRIGOTTO et

al. 2015). Devido à alta procura por produtos de origem florestal, a demanda cresceu

rapidamente nos últimos anos em decorrência da limitação de oferta. Neste caso, a solução

3

do problema desta demanda veio com a implantação de florestas como alternativa para

suprir esta necessidade. O eucalipto se mostrou uma das plantas mais favoráveis neste

processo o que se pode confirmar pela maior área de exploração global (GALLO, 2014).

Segundo Costa et al. (2016), o eucalipto, em mais de 90 países, representa acima de

20 milhões de hectares cultivados satisfazendo a demanda global por produtos de fins

madeireiros e é responsável por 8% da floresta cultivada no mundo. O Brasil possui cerca

de 7,6 milhões de hectares de florestas cultivadas, sendo que 72% são do gênero

Eucalyptus e respondem por 17% da madeira colhida no mundo.

Castro et al (2016) relatam que a planta teria sido cultivada pela primeira vez no Brasil

com a chegada de mudas ao Jardim Botânico do Rio de Janeiro no ano de 1824. Em 1904,

várias espécies teriam sido introduzidas em Jundiaí- São Paulo para o estudo daquelas que

melhor serviriam à implementação das estradas de ferro (MARCHIORI, 2014).

O Brasil é considerado destaque no setor florestal devido sua alta produtividade de

florestas plantadas, sendo um sucesso global no setor industrial. No país uma área de 140

mil hectares é capaz de produzir aproximadamente 1,5 milhão de t/ano de celulose. No ano

de 2014 o país liderou o ranking mundial de produtividade florestal média de 39 m³/ha.ano

para o plantio de eucalipto e 31 m³/ha.ano para Pinus spp. Ao mesmo tempo, devido às

suas características positivas, como fácil adaptação e rápido crescimento e resistência às

variabilidades edafoclimáticas no Brasil, a planta é destaque no reflorestamento por sua

madeira e alta potencialidade econômica. (BRUDER, 2012, IBÁ, 2015). A Industria Brasileira

de Árvores (IBÁ) informa que devido ao crescimento das áreas com eucalipto, os dados de

área total de florestas plantadas são de 7,84 milhões de hectares no ano de 2016,

aumentando seu crescimento em 0,5% comparado a 2015, enquanto as espécies de Pinus

spp. e outros gêneros mantem-se estabelecidas sem alterações (IBÁ, 2017).

O que explica este sucesso em produtividade, segundo Costa et al. 2016 são as

características do gênero Eucalyptus tais como crescimento rápido, alta produtividade, boa

adaptabilidade a variações nas condições do solo e do clima, tolerância à acidez, toxicidade

ao Al (Alumínio) e baixa saturação por bases. Em uma abordagem fisiológica, por exemplo,

todo indivíduo do gênero Eucalyptus tem potencialidade abundante de brotação,

considerando as interações genotípicas e o meio é capaz de elevar suas brotações

sequenciais e otimizá-las gerando adaptação e resistência. No decorrer de seu ciclo

destaca-se também o pós-operacional de colheita florestal eliminando fontes de não

brotação e morte dos brotos (KLEIN, et al. 1997).

4

Ao longo do século passado, pesquisadores brasileiros desenvolveram vários

programas de melhoramento de espécies de Eucalyptus considerando sua capacidade

adaptativa a solos e regiões do Brasil (ASSIS, 2014). Este trabalho se iniciou no Instituto

Agronômico de Campinas (IAC), em 1941 por Edmundo Navarro e Carlos Arnaldo Krug que

começaram o primeiro programa de melhoramento do eucalipto. Com esta iniciativa e,

sobretudo, a partir de 1968 com a criação do Instituto de Pesquisas e Estudos Florestais

(IPEF) na ESALQ – Escola de Agronomia Luiz de Queiroz, surgiram vários híbridos de

eucalipto entre os quais o Eucalyptus urograndis, mostrou-se, entre outros aspectos,

resistentes ao cancro causado pelo fungo Chrysoporthecubensis spp. (ASSIS, 2014).

Em abordagens com interesse em parâmetros mais fisiológicos observou-se que em

plantios de eucalipto cujo a irrigação é com água salina, a salinidade da água afeta o

crescimento das plantas devido à baixa hidratação de seus tecidos. A salinidade e sua baixa

relação entre Na/K (Sódio e potássio) é o indicativo de que as plantas de eucalipto são

moderadamente tolerantes, onde o cálcio exerce a importe função na manutenção da

absorção de potássio e seu equilíbrio iônico. (OLIVEIRA et al. 2018).

Ainda neste tipo de abordagem, observou-se que o desempenho germinativo de

sementes de eucalipto submetidas a estresses hídrico e salino avaliadas com potenciais

osmóticos de 0,00 Mpa, -0,02 Mpa, -0,04 MPa e -0,08 Mpa as espécies Eucalyptus

camaldulensis, E. citriodora, E. grandis, E. robusta e E. urophylla, , dentre elas destacou-se

o E. camadulensis como a mais vulnerável ao estresse hídrico, no estresse salino o E.

robusta mostrou-se mais resistente e adaptada para germinação sob estresse moderado (-

0,02 e -0,04 Mpa) e E. urophylla menor onde a máxima limitação para indução da

germinação de todas as espécies é de -0,8 Mpa. Martins et al. (2014) em sua pesquisa

comprova.

O interesse sobre a planta, em diversos aspectos, foi potencializado neste século 21

conforme relata-se a seguir com exemplos de trabalhos em várias áreas do conhecimento.

Tuller et al (2017), por exemplo, demostraram que diferentes genótipos de eucalipto, entre

os quais E. urophylla, são mais resistentes aos ataques do inseto Glycaspis brimblecombei

que constitui uma praga na Austrália e que fora identificado no Brasil em 2003. Neste estudo

também foram avaliadas as respostas aos ataques dos insetos nas espécies

Eucalyptus camaldulensis e em seus híbridos E. urophylla X E. camaldulensis.

Leonardi et al (2015) realizaram o primeiro estudo em proteômica com a planta de E.

urograndis. Eles investigaram a síntese das proteínas presentes nos caules da planta em

resposta à exposição a baixas temperaturas. Observou-se, em uma plataforma de

proteômica com dados do genoma de E. grandis, que a resposta em termos de produção de

5

proteínas é rápida e foram então identificadas 11 proteínas envolvidas com esta resposta ao

estresse por baixa temperatura.

E. urograndis foi estudado por de Souza Araújo et al (2018) quanto às propriedades de

seu ácido PA (pyroligneous acid) como agente antimicrobiano contra cepas resistentes de

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Staphylococcus aureus (ATCC

25923) além das leveduras Candida albicans (ATCC 10231) e Cryptococcus neoformans.

Todas as cepas foram inibidas pela ação do PA.

Fonseca et al (2018) realizaram estudos sobre os microrganismos endofíticos

presentes em raízes de E. urograndis. Neste trabalho, observou-se que Actinobacteria é o

gênero mais comum correspondendo a 95% da comunidade microbiota da raiz. Identificou-

se igualmente outros seis gêneros, Mycobacterium, Bradyrhizobium, Streptomyces, Bacillus,

Actinospica, e Burkholderia e verificou-se uma forte influência desses microrganismos na

fixação de nitrogênio para a as plantas de eucalipto.

Ainda sobre endofíticos, Miguel et al (2016), investigando a microbiota presente em

folhas de E. urograndis, observou que estavam presentes Firmicutes, Proteobacteria e

Actinobacteria. As espécies Novosphingobium barchaimii, Rhizobium grahamii,

Stenotrophomonas panacihumi, Paenibacillus terrigena, P. darwinianus e Terrabacter lapilli

foram identificadas como endofíticos pela primeira vez, neste trabalho, e pontuou-se

igualmente a provável ação desses microrganismos fixadores de nitrogênio para E.

urograndis.

Paz et al (2012) realizaram trabalho em que bactérias foram isoladas de espécies de

Eucalipto e testadas em plântulas de E. urograndis em casa de vegetação. Após

identificação das cepas por amplificação e sequenciamento dos genes ribossômicos 16S,

Bacillus subtilis foi o mais frequente e as cepas de EUCB 10 foram responsáveis pelo maior

crescimento de raízes e partes aéreas das plantas cultivadas.

Silva et al. (2016), trabalhando com autohidrolise em E. urograndis e E. grandis em

extratos contendo lignina, holocelulose e hemicelulose, demostraram a remoção quase total

de hemicelulose a 170 e 190°C enquanto a celulose foi parcialmente degradada. Observou-

se igualmente uma diminuição da lignina nos extratos.

Barcelos, D. et al (2016) trabalhando com uma abordagem em fitorremediação em

experimento em casa de vegetação, demonstraram que E. urograndis e Pinus taeda são

altamente eficientes na descontaminação de solos contendo clorobenzeno. Neste

experimento observou-se que, nas duas plantas, a quantidade do contaminante foi reduzida

6

em até 98% sugerindo que as duas árvores são boas candidatas para a remediação do

benzeno bem como do clorobenzeno.

Santos et al (2013) utilizaram E. urograndis em estudo de cromatografia líquida de alta

(ultra) performance (UHPLC) em extratos de madeira e identificaram dezenas de compostos

bioativos. 51 compostos fenólicos foram detectados nos extratos das três plantas em

análise, E. grandis, E. urograndis e E. maidenii sendo o ácido elagico o mais abundante

composto nos três extratos.

Gomes & Favero (2013) analisaram a eficiência do óleo essencial de E. urograndis

como agente inseticida contra Rhodnius neglectus Lent (Hemiptera: Reduviidae), vetor da

doença de Chagas. Seus resultados mostram, nos métodos de aplicação empregados, por

meio tópico, fumigação ou repelente, que o óleo essencial de E. urograndis tem alto poder

de mortalidade na aplicação tópica nas primeiras 24 horas de contato. No ensaio como

repelente ele tem uma eficiência de 80% também nas primeiras 24 horas após aplicação,

mas perde tal ação após este período.

Tuffi Santos et al (2010) estudaram a morfologia das folhas de E. urograndis em

resposta ao glifosato analisando parâmetros como clorose, hipertrofia, necrose, e chegaram

à conclusão que E. urophylla é mais tolerante que o híbrido E. urograndis.

Taheri et al (2018) realizaram Modelagem de estudo comparativo na eficácia do

Eucalipto como planta fotorremediadora em solos contaminados por hidrocarbonetos de

petróleo sob estresse salino, utilizaram três modelos: Van Genuchten e Hoffman, Dirken e

Maas-Hoffman. Resultou-se que a salinidade e o óleo cru afetam características de pesos

secos e frescos da raiz e parte aérea, diâmetro do caule, número e área foliar, diâmetro e

altura (p <0,05) >0,98) do caule, volume da raiz da planta.

Os estudos em genética molecular começam propriamente com o projeto

GENOLYPTUS project (National Network of Eucalyptus Genome Research), financiado por

companhias brasileiras produtoras de celulose, que visa, entre outros aspectos, estudar a

genética da planta, seu melhoramento e marcadores moleculares (GRATTAPAGLIA, 2001).

Esta iniciativa culmina com a participação brasileira no projeto de sequenciamento do

genoma de Eucalyptus grandis realizado por MYBURG et al. (2014). Este projeto

disponibiliza a sequência do genoma completo de E. grandis, identifica 45.000 genes da

planta e passa a constituir a base para estudos de caracterização funcional de genes,

proteômica, expressão gênica e de melhoramento genético com vies molecular. Ainda nesta

linha, os primeiros estudos de genotipagem para identificação de polimorfismos de uma

7

única base foram realizados em seguida ao genoma, também com relevante participação de

grupos brasileiros (SILVA-JUNIOR et al., 2015).

Outros trabalhos com abordagem molecular podem ser citados como o de Moura et al

(2012) que realizaram experimentos pioneiros numa abordagem para determinar os genes

de E. urograndis que melhor funcionariam como controles internos em estudos de

expressão gênica por PCR em tempo real. Esses autores, trabalhando com os genes

constitutivos que codificam IDH (isocitrate dehydrogenase), SAND (SAND protein), ACT

(actina), e A-Tub (α-tubulina) chegaram à conclusão que, em experimentos envolvendo

qPCR, o melhor controle interno para expressão de RNAs é o gene IDH.

2.2. Tiorredoxinas

Tiorredoxinas são enzimas óxido-redutases presentes em todos os organismos e

responsáveis pela manutenção da homeostase da célula vegetal e estabilização do seu

estado redox. Elas foram identificadas em plantas há 40 anos como enzimas que doam

hidrogênios a outras proteínas por um mecanismo que envolve as duas cisteínas presentes

no seu sítio ativo altamente conservado WCGPC, ou variantes do tipo CXXS. Neste

mecanismo, as TRXs reduzem as proteínas alvo pela quebra de suas pontes dissulfeto

ativando-as (GEIGENBERGER et al, 2017).

Em plantas, os chamados sistemas tiorredoxina se mostraram bem mais complexos

do que em animais. Elas foram inicialmente descobertas como ativadoras da FBPase-

Frutose 1,6 bifosfatase (GUTLE et al, 2016) e da MDH – Malato desidrogenase (JACQUOT,

JP & BUCHANAN, 1981; BUCHANAN et al, 2001). Neste caso enzimas atuantes no ciclo de

Calvin-Benson e com localização celular nos cloroplastos. Foram então chamadas de f e m.

As TRXs dos cloroplastos são elas próprias reduzidas pelo sistema Fdx/Trx em que atua a

Ferredoxina Tiorredoxina Redutase - FTR. Ainda neste plastídeo foram identificadas outras

TRXs envolvidas com a resposta ao estresse oxidativo que gera espécies reativas de

oxigênio -ROS (O2, O−2O2−H2O2 e OH) e que são inativadas pela formação de pontes

dissulfeto.

As demais Trxs encontradas nos cloroplastos são as do tipo x descritas pela primeira

vez em 2003 por Collin et al (2003) capaz de ativar a 2 Cys peroxirredoxina (Prx) ligada à

resposta ao estresse oxidativo. Mutantes de inserção obtidos por Bernal-Bayal (2014) para

TRXx realizarem fotossíntese normalmente bem como fixação de carbono.

As TRXs do tipo z foram descobertas em 2010 por Arzova et al (2010) e Meng et al

(2010) e são distintas das demais. Elas têm função comprovada como mediadoras da

8

interação das proteínas FLN1 e FLN2, membros da família de pfkB-carboidrato quinase,

com a RNA polimerase PEP no cloroplasto (DIAZ et al, 2018).

No citoplasma foi identificado um segundo grupo de TRXx, as do tipo h, assim

chamadas porque se encontram em tecidos não fotossintetizantes ou heterótrofos

(JACQUOT et al, 1994; REICHHELD et al, 2002; NIKKANEN & ANDRINTAMÄKI, 2014).

Neste sistema às TRXs h são reduzidas pela NTR, tiorredoxina redutase dependente de

NADPH. Elas são abundantes e termos de número, 10 em Arabidopsis thaliana, e 11 em E.

grandis (dados não publicados).

O terceiro grupo de TRXs é composto por aquelas encontradas na mitocôndria (LALOI

et al, 2001), chamadas de TRXo. São duas em Arabidopsis thalaiana e estão envolvidas

com proteínas do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), da fotorrespiração, do transporte de

elétrons, da síntese de ATP, transporte através de membrana, tradução, e síntese de

hormônio. O sistema tiorredoxina aqui é composto pela TRXo sendo reduzidas pelas

tiorredoxinas redutases NTRB e NTRA.

Um quarto e novo grupo também foi descrito para as TRXs presentes no núcleo, as

nucleorredoxinas-NRX. Marchal et al (2014) caracterizaram essas TRXs em Arabidopsis

thaliana e mostraram que as duas nucleorredoxinas Nrx1 e Nrx2 são reduzidos pelas

tiorredoxinas redutases NTRA e NTRB.

Os genes de TRXs em Eucalipto foram identificados por Barbosa & Marinho (2005)

com base nos dados in silico do primeiro transcriptoma feito pelo consórcio FOREST

(Eucalyptus Genome Sequencing Project Consortium) /FAPESP (Vicentini et al., 2005). 15

proteínas que codificam TRXs foram então identificadas, 7 TRXs h, 4 TRXm, 2 TRXf, 1

TRXx e 1 TRXy. No Eucalipto, a complexidade de grupos e subgrupos de genes observada

em Arabidopsis thaliana e já descritos aqui se repete. No mesmo trabalho foi identificada

igualmente uma sequência de TRX atípica, a TDX, descrita em Arabidopsis thaliana (Vignols

et al, 2002). Observou-se, igualmente, que os genes de TRXs h se expressam em tecidos

jovens segundo as diferentes bibliotecas de cDNA empregadas no transcriptoma.

Os dados de Marinho & Barbosa (2005) foram confirmados por Cavalcante et al.

(2020) que trabalharam então com as sequencias de DNA disponibilizadas com a publicação

do genoma completo de Eucalyptus grandis (MYBURG et al, 2014). Observou-se que neste

genoma há pelo menos 51 genes de TRXs entre típicas, com sítio ativo CXXC, atípicas (do

tipo like), de domínios únicos e de domínios múltiplos. E. grandis codifica 11 TRXs do tipo h.

Não há outros dados sobre TRXs em eucalipto além destes relatados aqui. No

entanto, no artigo sobre genoma do Eucalipto, há menção a 5 genes identificados quando

9

do estudo de sintenia entre este genoma e o de Populus trichocarpa. São os genes

Eucgr.C00122.2, Eucgr.C00603.1, Eucgr.C00663.1, Eucgr.C00774.1, Eucgr.C03890.1

identificados entre os 894 analisados neste contexto. Estes dados estão disponíveis nos

arquivos suplementares em anexo ao artigo publicado na revista Nature (MYBURG et al,

2014).

As TRXs despertaram, ao longo dos últimos dez anos, consideráveis interesses

biotecnológicos. À medida em que se compreende cada vez mais a complexidade de

funções dessas proteínas como agentes que regulam o estado redox na célula em diversos

processos celulares, mais experimentos são conduzidos.

Yano (2014) traz uma atualização da abordagem biotecnológica envolvendo TRXs de

plantas. Observa-se que o enfoque se concentra no uso de plantas transgênicas com

diversos fins e que a quebra de pontes dissulfeto é a base da aplicação biotecnológica.

A TRXh5 do trigo, por exemplo, foi posta em superexpressão em plantas transgênicas

o que resultou na produção de massa de trigo menos alergênica (LI et al, 2009). Os mesmos

autores obtiveram plantas transgênicas também de trigo em cujo genoma se introduziu uma

construção antisenso da TRXh9. Isto evitou o fenômeno da germinação precoce ou brotação

pré-colheita (PSH-pre-harvest sprouting).

3. MATERIAL E MÉTODOS

__________________________________________________________________________

3.1. Análise in silico

A metodologia utilizada na análise in silico neste estudo consistiu em duas

abordagens, uma de caráter sistêmico, com base na genômica comparativa, e uma segunda

análise pontual das sequencias promotoras dos genes de Trxs de eucalipto Eucgr.F01604.1,

Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1. (Anexo 1)

Para a análise sistêmica, os três genes de Trx alvo deste estudo foram confrontados

com todos os 45000 genes anotados e identificados no sequenciamento do genoma

(MYBURG et al., 2014) através dos dados disponíveis na plataforma do Phytosome

(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). Para melhor compreensão dos dados, foi feita

inicialmente uma comparação entre os identificadores (ID) dos genes do eucalipto com seus

ortólogos em Populus trichocarpa e, em seguida, utilizou-se a plataforma STRING

(https://string-db.org/). Este software permite estudar a relação entre proteínas a partir dos

seus identificadores e estabelecer uma rede de interação das proteínas em estudo com

10

todas as demais expressas na planta. Ao mesmo tempo, para aprofundar a análise das

regiões reguladoras dos três genes alvo, descrita abaixo, também foi realizado um estudo

de expressão gênica com todos os genes de TRX h do eucalipto, 9 genes, em relação aos

potenciais fatores de transcrição que poderiam exercer uma regulação sobre estes genes.

Neste caso, repetiu-se a rede de interação descrita acima utilizando-se a mesma estratégia

técnica.

A análise in silico pontual das sequencias promotoras foi feita com software de

domínio público PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)

desenvolvido por Lescot et al (2002). Na janela de submissão de sequências foram

submetidos 2234 pares de base para Eucgr.F01604.1, 1538 pares de bases para

Eucgr.F01854.1 e 899 pares de bases para Eucgr.I02383.1, respectivamente. As sequências

dos respectivos promotores dos genes foram baixadas através de buscas no Genebank

(NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando parte das sequências não transcritas à

montante das regiões codantes dos três genes.

3.2. Análise in vivo

A metodologia utilizada nos ensaios in vivo considerou duas abordagens quanto ao

material vegetal utilizado, ambas visando a análise final da expressão gênica dos três genes

de Trxs alvo por RT-PCR semi-quantitativa. Na primeira, voltada ao estudo da resposta ao

estresse salino, foi feito um experimento a partir de plântulas de E. grandis originadas de

sementes submetidas aos seguintes tratamentos: controle (sem adição de sal); sal 1 (50

nM) e sal 2 (100 mM). As sementes foram distribuídas em placas de petri, contendo uma

folha de papel filtro umedecido com as soluções (0, 50 e 100 mM) na quantidade

equivalente a 2,5 vezes a massa do papel seco. Após a semeadura, as placas de petri foram

mantidas em câmaras de germinação à temperatura de 25 °C e foto-período de 12 h e o

acompanhamento do experimento foi feito diariamente, durante 24 dias. A frequência de

germinação foi avaliada nas três condições com parâmetros estatísticos baseados nos

testes de ANOVA, Tuckey, Regressão Linear utilizando o SISVAR (sistema de análises

estatísticas de dados). Ao final do ensaio de germinação das sementes submetidas ao

estresse salino, as plântulas das três condições em estudo (1g de plântulas) foram

coletadas para a extração de RNA total e realização dos ensaios de RT-PCR.

A segunda abordagem in vivo envolveu coleta de material vegetal de folhas de

indivíduos adultos de E. grandis x E. camaldulensis e de E. grandis x E. urophylla mantidos

no experimento TECHS.

A extração de RNA total e as reações de PCR, para os dois diferentes materiais

vegetais, plântulas e folhas de plantas adultas, foram realizadas segundo Cavalcante et al

11

(2020) utilizando-se Trizol (Invitrogen 15596026) e condições de PCR padrão com ciclagem

envolvendo desnaturação inicial a 95o, 2 min, seguida de 30 ciclos de PCR contendo

desnaturação a 95o, 1 min, anelamento a 55o, 30 seg, extensão a 72o, 1 min, seguido

extensão final a 72o, 4 min. Nestas amplificações foram utilizados os oligonucleotideos

iniciadores para F01604.1 5’AGA AGA TGC CCC ATG TTT TG3’ e 5’ATC GGA GCC GGT

TTA TTT TT 3’, para F01854.1, 5’ACA CCG TCG ATT CTT GGA AC 3’ e 5’ACA CCG TCG

ATT CTT GGA AC 3’, para I02383.1 5’AGC TGG TGG TTG TCG ATT TC3’ e 5’GAT CCT

TCT GGG CTC CTA CC3’ e para I00241.1 (actina) 5’AGG ATA TTC AGC CCC TCG TT e

5’TGG GCT TCA TCA CCA ACA TA3’. O gene MYC1 foi amplificado com os oligos 5’GCC

AAG AAT TCC CAC TTG AA3’ e 5’CCT CAG AAA GCT GGA TTT GC3’. Todos os

oligonucleotideos foram escolhidos a partir das sequências dos transcritos dos genes

utilizando-se os softwares do programa Primer3 disponível em plataforma de domínio

público (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

__________________________________________________________________________ A análise in silico aqui chamada de sistêmica, que envolveu o confronto da co-

expressão das três Trxs Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1 com o produto

das expressões codante de 45000 transcritos do eucalipto, ou seja, da totalidade dos genes

expressos no genoma, demonstrou a complexidade do sistema tiorredoxina. Esta é uma

primeira observação tendo em vista a interação dos genes Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1

com mais de 3300 proteínas quando somadas as interações, conforme mostra a figura 1.

12

Figura 1. Interação dos genes Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1 com

a totalidades dos genes expressos em Eucalyptus grandis obtida pela plataforma STRING.

Se consideradas individualmente, as Trxs Eucgr.F01604.1 e Eucgr.F01854.1

interagem com 2802 e com 571 proteínas respectivamente e, em conjunto, as duas se

coexpressam em comum com 787 proteínas. Isto revela a complexidade do sistema e a já

conhecida diversidade funcional dessas enzimas em vários processos celulares conforme

bem estabelece Geigenberger et al. (2017) em sua revisão. A análise mostra, igualmente,

que a Trx Eucgr.I02383.1, ao contrário, não está presente no diagrama de interação com as

duas outras Trxs. Isto pode ser interessante porque denota uma provável especificidade de

expressão que merece ser investigada. Os dados aqui mostrados para este gene,

especificamente, confirmam a análise por heatmap feita por Cavalcante et al (2020) no que

diz respeito ao perfil de expressão em diversos tecidos cujos níveis são pelo menos dez

vezes menores do que o que se observa para os outros dois genes estudados, e que

apresentam altos perfis de expressão. Não obstante, sua interação divergente com mais de

2000 proteínas lhe confere uma particularidade interessante.

O refinamento desta análise sistêmica em outros bancos de dados como o KEGG

(https://www.genome.jp/kegg/kegg1a.html) permite identificar possíveis vias metabólicas de

atuação das Trxs estudadas tais como o metabolismo do ácido linoleico, metabolismo de

glicinas, serinas e treoninas, metabolismos do ácido alfa-linoleico, metabolismos de lipídios

13

ou de metabólitos secundários (anexo 2). A mesma caracterização funcional potencial

desses genes pode ser vista na plataforma Pfam (https://pfam.xfam.org/) no anexo 3.

A análise pontual in silico, aqui definida para os três genes, visou identificar nas

sequencias promotoras das Trxs possíveis motivos onde atuariam fatores de transcrição. Os

resultados obtidos pela plataforma PlantCARE a partir desta análise (ANEXO 4) evidenciam

a presença de domínios de ligação à fatores de transcrição já descritos e envolvidos com a

resposta ao estresse salino (KUMAR et al, 2017).

No promotor do gene Eucgr.F01604 observa-se (Figura 2) a presença de seis desses

potenciais domínios, ACE, ARE, dois do tipo MYB, MYB-like sequence e MYB-binding site,

aos quais potencialmente se ligam fatores de transcrição. Identifica-se, igualmente, a

presença de sequências de regulação consenso em eucariotos como a TATA-box. Para o

gene Eucgr.F01854, identificam-se quatro domínios, do tipo ARE, ABRE e dois do tipo MYC

além das sequencias consenso TATA. Na região promotora do gene Eucgr.I02383,

apresenta-se uma situação similar àquela vista para o gene Eucgr.F01854 com os mesmos

domínios MYC e ABRE, relacionados à resposta ao estresse salino além de outros domínios

ausentes nos dois genes anteriormente citados. Esta situação se repete nos três promotores

analisados, ou seja, a presença de vários outros potenciais sítios de regulação, mas que

não são objeto de análise este momento.

14

Figura 2. Motivos de regulação em sequências promotoras dos genes Eucgr.F01604.1,

Eucgr.F01854.1 Eucgr.I02383.1 que codificam tiorredoxinas h em E, grandis obtidos

pela plataforma PalntCARE.

Para averiguar a coexpressão dos genes das Trx H, incluindo-se os três genes alvo

deste trabalho, com alguns fatores de transcrição (FT) e o gene da superóxido dismutase

(SOD), foi realizada a mesma abordagem de construção de um heatmap para observar o

número total de genes coexpressos, de acordo com phytozome. Com exceção do gene

D02287, que codifica o FT MYC1, nenhum dos outros FTs apresentou um número elevado

de genes coexpressos. O gene que codifica MYC1 apresenta 211 genes coexpressos com a

TRX F01854 e 532 genes com o gene da Trx F01604. Os resultados sugerem que gene

F01604 e o D02287(MYC) estão em situação de coexpressão. A figura 3 traz estes

resultados:

Figura 3. Mapa de expressão dos 9 genes que codificam TRXs h em comparação

com os fatores de transcrição MYB, ABRE, NAC, MYC1 e com a SOD, evidenciando

coexpressão da TRX F01604 com MYC1 em dados normalizados a partir de ensaio com

dados da plataforma Phytosome.

15

Uma vez que os genes F01604 e F01854 são os que apresentam a maior expressão

relativa dentre todas as TRX h, investigamos o contexto biológico dos genes coexpressos

entre essas duas Trx bem como, com o fator de transcrição MYC1. Observa-se, como o

diagrama da Figura 4, o número de genes coexpressos em conjunto a esses 3 genes

especificamente. Dos 211 genes coexpressos entre Trx F01854 e D02287, 208 também são

coexpressos com a TRX F01604. Esses 208 genes coexpressos estão associados a 518

proteínas anotadas na plataforma STRING e apresentam enriquecimento KEGG para as

vias de metabolismo do Ácido linoleico (egr00591), Glutationa (egr00480), Vitamina B6

(egr00750), Glicina, serina e treonina (egr00260) e Glioxilato e dicarboxilato (egr00630).

Figura 4. Coexpressão dos genes de TRX F0154 e F01605 e do gene D02287 que

codifica MYC1.

Os ensaios de coexpressão aqui mostrados sugerem a participação dos genes MYC

como reguladores da atividade das TRXs, neste caso especificamente o gene F01604

expresso de maneira significativa. Estes resultados constituem indicações interessantes

para serem confirmados in plantae. Os dados de enriquecimento com a sugestão de vias

metabólicas possíveis trazem a via do Glutatião que exerce função preponderante e

indispensável na ativação das tiorredoxinas (Reichheld et al, 2007) o que reforça os

experimentos in silico aqui realizados.

A germinação das sementes para obtenção de plântulas sob estresse salino a partir

da exposição de sementes de E. grandis às duas concentrações de NaCl permitiu, ao final

do ensaio, a coleta de material vegetal para as análises de RT-PCR semi-quantitativas.

Nesta etapa, conduzida com vistas a produzir plântulas sobre estresse salino e analisar a

expressão dos genes de Trxs aqui estudados, foi possível observar efeitos negativos sobre

16

o desempenho germinativo das sementes e o crescimento inicial das plântulas quando

comparado ao controle. A Figura 5 exemplifica esta situação ao longo do período de

experimentação em que, com o aumento da concentração de NaCl, há redução na taxa de

germinação das sementes.

Figura 5. Obtenção de plântulas de Eucalyptus grandis submetidas a estresse salino em

laboratório ao longo de 20 dias.

Os três genes de Trxs estudados neste trabalho foram identificados por Cavalcante et

al (2020) entre os 22 cuja expressão in silico foi analisada sob forma de heatmap com base

em dados de FPKM. Esta análise e a confirmação de uma possível expressão tecido

específica, bem como a intensidade desta expressão confirmada por RT-PCR por esses

autores, foram a base para a escolha desses genes para prosseguir na sua caracterização

funcional.

Neste sentido, a escolha de uma abordagem voltada à resposta destes genes ao

estresse salino se configurou pertinente, uma vez que os genes de Trxs h já foram

analisados quanto a este tipo de resposta in silico (REICHHELD et al, 2002).

A primeira análise das sequências reguladoras mostra que os promotores dos três

genes apresentam entre seus diferentes sítios de acesso a fatores de transcrição aqueles

que, na literatura, são diretamente ligados à resposta ao estresse salino. É o caso,

sobretudo, dos fatores MYB e MYC (ADLER et al.2010), presentes nos três promotores

analisados. O promotor do gene Eucgr.F01604.1, por exemplo, apresenta motivos de

ligação relacionados aos genes MYC (XIAOYU et al, 2012, YU et al, 2017), uma família

17

multigênica de fatores de transcrição diretamente relacionada à resposta aos estresses

salino e osmótico, bem como atuantes na regulação dos ácidos abcísico (ABA). É possível

que nestes mecanismos de resposta aos estresses abióticos, as Trxs, já comprovadamente

relacionadas ao estresse oxidativo que sucede o estresse salino, possam ter uma atuação

de co-expressão com os genes MYC na resposta ao estresse salino.

O interessante neste caso é que a ação destes fatores de transcrição está diretamente

relacionada à captação dos íons de sódio pelas raízes e pela sua condução via floema em

situação típica de estresse salino. No caso das Trxs aqui estudadas, a forte expressão dos

transcritos desses genes em tecidos condutores vista por Cavalcante et al (2019) indica uma

possível atuação desses genes na resposta ao estresse salino estabelecendo uma possível

relação funcional a ser comprovada.

A análise in vivo a partir das plantas adultas do TECHS foram feitas em colaboração

com Cavalcanti et al (2019) e podem ser vistas na figura 6 em que são mostradas a

expressão por RT-PCR das plantas híbridas. Neste experimento pode-se observar a

expressão dos dois genes que atuam em co-expressão segundo a análise sistêmica

realizada in silico. A expressão em folhas jovens é mais evidente para o gene F01604.1,

homólogo à Trx h1 de Arabidopis thaliana relatada por Reichheld et al (2002) e permanece o

gene alvo para caracterização funcional em experimentos futuros.

Figura 6. Expressão gênica por RT-PCR semi-quantitativa em tecidos de

Eucaliptos híbridos do TECHS: FJ, folha jovem; MA, meristema apical; X, xilema; FL, floema;

PL, plântulas. F00241.1, actina. (Modificado de Cavalcante, 2019).

Os experimentos in vivo de germinação de plântulas de E. grandis em condições de

estresse salino, mostrados na figura 7, sugerem uma confirmação da análise feita in silico

para o gene Eucgr.F01604.1. Neste experimento, observa-se que a expressão deste gene

nas condições de salinidade em plântulas de E. grandis ocorrem em coexpressão com o

fator de transcrição MYC1. Embora a função destes genes reguladores, que constituem na

realidade uma família multigênica (Ji et al, 2012), ja tenha sido bem estabelecida em

resposta ao estresse salino, este é o primeiro registro de uma possível atuação destas

proteínas com as tiorredoxinas. Ao mesmo tempo, pode-se inferir com o experimento que há

18

possivelmente um aumento da expressão de MYC1 à medida que aumenta a concentração

em sal. Estes resultados precisam, no entanto, ser confirmados com experimentos de PCR

em tempo real para que os genes em questão possam de fato se constituírem em bons

candidatos à experimentos em biotecnologia com a obtenção de plantas transgênicas de

interesse econômico.

Os demais genes de TRX estudados no experimento in vivo a partir de plântulas

submetidas ao sal também se expressam. É possível supor que os três genes em questão

atuem de forma significativa em resposta ao sal. No entanto, é necessário refinar as

análises aqui iniciadas para melhor compreender a atuação dos genes aqui estudados.

Figura 7. Expressão gênica por RT-PCR dos genes de TRX h Eucgr.F01604.1,

F01854.1, I02383.1 e do gene MYC em plântulas submetidas a concentrações de 0mM (C),

50 mM (S1) e 100 mM (S2) de NaCl. Eucgr F0024.1, gene controle, actina.

5. CONCLUSÕES

__________________________________________________________________________

O presente trabalho permitiu avançar na caracterização funcional dos três genes de

tiorredoxinas de Eucalyptus grandis Eucgr.F01604.1, Eucgr.F01854.1 e Eucgr.I02383.1. In

silico foi possível demonstrar que as três Trxs interagem com mais de 3000 proteínas na

célula e, ao mesmo tempo, que duas delas atuam em conjunto com mais de 700 proteínas

de E. grandis. O gene Eucgr.I02383.1, no entanto, não estaria atuando com os dois outros

alvos do estudo revelando uma especificidade de função a ser investigada. Nesta

abordagem, também foi possível identificar possíveis vias metabólicas onde podem atuar as

Trxs como, por exemplo como, nas vias do metabolismo do ácido linoleico, metabolismo de

glicinas, serinas e treoninas, metabolismo do ácido alfa-linoleico, metabolismo de lipídeos ou

19

de metabólitos secundários. Ainda in silico também foi possível se estabelecer uma análise

das regiões promotoras dos três genes e identificar sítios acessados por fatores de

transcrição envolvidos na resposta a estresses abióticos tais como MYB, MYC, ACE e

ABRE. In vivo, o ensaio de resposta ao sal mostrou-se eficaz como modelo para o estudo

desta condição fisiológica em plântulas de E. grandis. Os resultados de RT-PCR a partir de

folhas de plantas adultas e a forte expressão da Trx Eucgr.F01604.1 justifica experimentos

futuros e mais pontuais com este gene que parece ter uma atuação singular em E. grandis.

Ao mesmo tempo, a coexpressão de uma TRX h com o gene MYC1 em condição de

salinidade demonstra um potencial biotecnológico destes genes. Eles podem ser utilizados

em uma condição de superexpressão em plantas transgênicas mais tolerantes à salinidade.

As duas abordagens, in silico e in vivo, se mostraram complementares quanto à análise

da condição de estresse escolhida no trabalho, a resposta ao tratamento das plântulas ao

sal bem como à análise da expressão gênica em plantas adultas. Os resultados aqui obtidos

constituem uma base teórica que justifica a continuação deste trabalho em outros níveis de

caracterização funcional das tiorredoxinas citoplasmáticas em eucalipto.

LITERATURA CITADA

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25

ANEXO 1 – Alinhamento múltiplo de sequências de proteínas de tiorredoxinas h de E.

grandis obtida com software COBALT evidenciando domínios conservados e sítio

ativo típico.

ANEXO 2 – Possíveis vias de biossínteses acessadas pelas Trx segundo o KEGG

26

ANEXO 3 – Identificação das tiorredoxins segundo o Pfan

27

ANEXO 4 – Análise de sequencias reguladoras – PlantCARE

Eucgr.F01604.1

28

29

30

Eucgr.F01854

31

32

33

Eucgr.I02383.1

34