Expressão de proteínas heterólogas

Objetivos: clonagem de genes e manipulação da expressão de proteínas sob o

controle de um dado promotor, cuja expressão pode ser indutível ou contínua. - a expressão de proteínas clonadas tornou-se uma abordagem poderosíssima que vem revolucionando os estudos de estrutura, função, purificação e identificação de novas proteínas.

-expressão heteróloga, espera-se que a proteína de interesse seja estável, não tóxica para o hospedeiro, solúvel, produzida em grande quantidade e possa ser facilmente purificada.

- Super-expressão/super-produção/produção de ptns em grande quant.

Clonagem em vetor de expressão

• Estratégia geral: • - gene clonado num vetor capaz de promover a transcrição do inserto em

células vivas.• Hospedeiro e DNA recomninante precisam ser compatíveis.

• é necessário respeitar o sinal de tradução de genes procarióticos (sinal de Shine-Dalgarno), em outras palavras, o DNA deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador

• Organismos hospedeiros e seus principais vetores:• - E. coli = plasmídeos• - Leveduras (Saccharomyces cerevisiae) - vetores plasmídeo 2 (derivados)• - células de insetos - vetores = baculovírus• - células de mamíferos - vetores derivados de adenovírus, retrovírus, herpes• - plantas – vetores derivados de plasmídeo Ti (de Agrobacterium tumefaciens)

Vetores e clonagem em bactérias

– tempo de crescimento reduzido que permite a obtenção de grandes quantidades de bactérias em pouco tempo.

– Possibilidade de fazer proteínas e exportar para o meio extracelular (sinais específicos)

– possibilidade de manter as bactérias em placa de cultura e fazer bibliotecas de expressão

Vetores e clonagem em leveduras

– tempo de crescimento reduzido que permite a obtenção de grandes quantidades de leveduras em pouco tempo.

– genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de mamíferos, o que simplifica análises moleculares e genéticas.

– possibilidade de manter as leveduras como células haplóides ou diplóides, o que permite a obtenção de mutações recessivas em células haplóides, bem como a realização de experimentos de complementação genética. As células de mamíferos são diplóides o que torna impossível a detecção de mutações recessivas.

Vetores em leveduras– Vetores de integração: tais vetores contém origem de replicação de bactérias e genes

marcadores para seleção em bactéria e levedura. Plasmídeo não é capaz de replicar de modo autônomo na levedura. È capaz de expressar o marcador de seleção é através da integração em um dos cromossomos de levedura.

– Vetores que replicam em levedura: - origem de replicação de bactéria e genes marcadores para seleção

em bactéria e levedura. - origem de replicação do plasmídeo de 2 m, que é de ocorrência

natural em levedura. - origens de replicação isoladas de DNA cromossomal denominadas

ARS (Autonomously Replicating Sequence, sequências de replicação autônoma).

- sequência tipo centromérica, denominada CEN, que garante replicação estável, ocorrendo uma única vez por ciclo celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequências tipo CEN são mantidos em cópia única na levedura

- YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura): variação de um vetor de cópia única, que contém sequências centroméricas (CEN) e sequências teloméricas, que permite que sejam replicados como moléculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. Sâo uma ferramenta valiosa na caracterização de grandes segmentos genômicos na medida em que é possível clonar em um YAC fragmentos que vão de 100 a 2000 kb

Vetores de expressão de leveduras

Leveduras – Ex. YACs

Clonagem em leveduras e marcas de seleção

– Marcadores de seleção: maioria genes marcadores utilizados biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos.Ex.  

GENE ENZIMA SELEÇÃOHIS3 Imidazol glicerolfosfato desidratase histidinaLEU2b Isopropilmalato desidrogenase leucina

Aplicações da expressão heteróloga

• Aplicações:• - produção de antígenos (para futura indução de

anticorpos) à fidelidade estrutural não é tãonecessária. Proteínas híbridas/quimeras.• - estudos bioquímicos ou de biologia celular

estrutura (tridimensional) correta da ptn• - estudos da estrutura da proteína tem que ser

preservada• - modificação genética – OGM´s• - terapia gênica estrutura e função precisam ser

preservados

Problemas• Assim, dentre os problemas mais comuns que ocorrem com a produção de proteínas heterólogas em E. coli,

podemos citar:

• Proteínas tóxicas: Alternativa: proteínas que são secretadas. Para tanto basta clonar o DNA codificante em fusão com uma seqüência codificante para um peptídeo sinal de procarioto. Este peptídeo é clivado pela peptidase sinal quando a proteína é secretada para o periplasma. em alguns casos: no caso de proteínas tóxicas para a bactéria; Um exemplo de sucesso é a expressão do hormônio fator de crescimento epidermal humano (hEGF) sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqüência sinal desta. A indução é obtida sob privação de fosfato do meio.

• Proteínas instáveis: isto pode ser resolvido reduzindo-se a temperatura de crescimento ou mudando-se para uma linhagem de bactéria deficiente em uma ou mais proteases. Mesmo assim é comum se obter algum nível de fragmentação da proteína expressa

• Baixos níveis de expressão: pode ocorrer pelas razões acima dentre outras, como, por exemplo, instabilidade do mRNA, término prematuro da mensagem, tradução ineficiente.

• Proteínas insolúveis: proteínas de eucariotos produzidas em bactéria são geralmente precipitadas na forma de corpos de inclusão e requerem procedimentos adicionais de desnaturação para solubilizá-las e de renaturação para mantê-las solúveis e funcionais. Isto nem sempre é um problema, pois a formação de corpos de inclusão pode proteger a proteína contra a degradação por proteases bacterianas e também facilitar a purificação, uma vez que são corpos densos, precipitados à baixa velocidade de centrifugação, enquanto a maior parte das proteínas bacterianas permanecem no sobrenadante. Mas algumas vezes não se consegue renaturação adequada da proteína purificada. Neste caso deve-se tentar atenuar a formação de corpos de inclusão alterando as condições de expressão, por exemplo, crescendo-se a cultura a temperatura mais baixa após a indução ou utilizando um promotor mais fraco.

• Ausência de glicosilação de proteínas em bactérias: muitas vezes é necessária para o funcionamento das proteínas (atividade, direcionamento e proteção)

Clonagem com proteínas carreadoras

• gene clonado logo após uma sequência carreadora (ou inverso)

• promotor seq. carreadora gene de interesse

• proteína de fusão ou híbrida

• quebra liberando a ptn de interesse

• inespecífica (química)

• específica (por proteases)

• ajuda a aumentar nível de expressão

• pode haver problema de solubilidade da ptn híbrida (o que pode ser

• vantagem: os agregados podem ser mais fáceis de recuperar na purificação)

Estratégias

Vetores de expressão• Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produção de proteínas híbridas

podemos citar: • pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa)

como proteína de fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna de agarose-glutationa

• pMAL: apresenta a proteína ligante de maltose (PLM) de bactéria (42 kDa) como fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna com amilose acoplada

• pQE: apresenta um "tag" de 6 resíduos de histidina como fusão e permite a purificação das proteínas de fusão em colunas quelantes de Ni2+

• pUR: cuja fusão é um fragmento da b -galactosidase

Questões para o Estudo Dirigido entrega em 01/03/2013

• 1) O que é necessário para que um organismo transcreva um gene heterólogo?

• 2) Por que S. cerevisae não é um organismo interessante para a expressão de proteínas heterólogas?

• 3) Como pode ser realizada de maneira simples a análise de clones de expressão de P. pastoris com diferente número de cópias do cassete de expressão da α-amilase?

• 4) Que produtos biotecnológicos já foram obtidos em leveduras?

• 5) Qual a importância da diversidade do cerrado para a expressão heteróloga e utilização de patentes?