Expressão e Purificação de uma Proteína RecombinanteObjectivos, Resultados, Discussão e Conclusões

Objectivos:

Este relatório pretende dar a conhecer os resultados e conclusões obtidos

da experiência feita nas duas últimas aulas da disciplina de Métodos e

Técnicas em Biologia Molecular. Para que o protocolo fosse cumprido de forma

eficaz seguimos algumas linhas orientadoras que nos permitiram atingir os

objectivos do trabalho. De modo a tornar este procedimento mais

pormenorizado foi dividido em duas aulas.

Na primeira aula, os nossos objectivos prendiam-se com a produção da

proteína de fusão recombinante e respectiva purificação por cromatografia de

afinidade. Na segunda aula pretendíamos analisar por electroforese em gel de

poliacrilamida em condições desnaturantes a proteína produzida para averiguar

o seu grau de purificação.

Resultados:

No que toca a cálculos temos no protocolo os seguintes dados:

A280nm =1 [GST] = 0,5 mg/ml

Através deste valor de absorvância apenas calculamos a concentração da

proteína de fusão diluída 1x. Recorrendo ao espectrofotómetro para analisar as

eluições obteremos os valores de absorvância necessários para calcular a

concentração de GST. A partir daqui teremos de calcular os valores quando as

soluções são diluídas 1x ou 50x. O valor da proteína recombinante purificada

será o correspondente aos da diluição a 50x.

Exemplo dos cálculos para a primeira eluição (E1):

1 ----- 0,5 mg/ml

0,047—x X = 0,047 x 0,5 = 0,0235 mg/ml

E1 = 0,047 = 0,0235 x 1 = 0,0235 mg/ml

E1 = 0,0235 x 50 = 1,175 mg/ml

Seguindo este modelo calculamos os valores para as seguintes eluições. Os

resultados estão expressos na seguinte tabela:

1

A280nm[GST](mg/ml)

[GST] x 1 (mg/ml)

[GST] x 50 (mg/ml)

Proteína recombinante

purificada(mg/ml)

Valor de Referência

1 0,5 0,5 - -

E1 0,047 0,0235 0,0235 1,175 1,175E2 0,048 0,024 0,024 1,2 1,2E3 0,056 0,028 0,028 1,4 1,4

Figura 1 - Esta tabela expõe os dados e valores obtidos ao longo do processo até à obtenção da proteína recombinante purificada.

Através dos dados que nos foram fornecidos no protocolo e dos valores

obtidos na purificação da proteína recombinante, visíveis nesta tabela, foi

possível quantificar a proteína. Podemos observar na última coluna que ao

longo das eluições a concentração de proteína recombinante purificada

aumenta, sendo que a última eluição é a que apresenta maior grau de pureza.

Os valores de absorvância vão aumentando ligeira e gradualmente como

podemos analisar melhor no seguinte gráfico.

Figura 2. Gráfico exemplificativo da concentração de proteína recombinante purificada em função da absorvância.

2

Figura 3. Resultados obtidos na electroforese em gel de poliacrilamida em condições

desnaturantes.

Na primeira coluna as várias bandas são características de um padrão,

solução constituída por uma mistura de proteínas de diferentes pesos

moleculares que servirá como elemento de comparação de forma a

descobrirmos os pesos moleculares das nossas amostras.

Na coluna correspondente à fracção inicial, ou seja, a coluna constituída

pelo lisado celular, obtemos inúmeras bandas características de uma proteína

ainda não purificada.

No que toca às eluições, na primeira (E1) obtivemos várias bandas de cor

intensa, sendo que existe uma banda correspondente a proteínas de elevado

peso molecular na posição mais superior, que são contaminantes; abaixo desta

encontra-se uma banda que corresponde à CTGluR; e numa posição inferior,

outra referente à GST, resultante da clivagem de algumas proteínas

recombinantes por proteases. Na segunda eluição (E2) a cor torna-se mais

esbatida e a banda existente na zona correspondente aos contaminantes

torna-se mais clara, existindo também mais duas bandas inferiores que

correspondem à proteína recombinante e à GST, como na E1. Na terceira

eluição (E3) as bandas são muito claras devido à menor concentração de

3

proteínas, existindo apenas duas bandas devido à inexistência da banda

correspondente a contaminantes.

Quanto à coluna correspondente ao GST era suposto obtermos uma

única banda o que efectivamente aconteceu, mostrando que o GST usado

estava puro. Não tem proteínas com peso molecular superior ou inferior.

Discussão e Conclusão:

Os resultados obtidos foram os esperados, mas existindo algumas

incorrecções. Estas podem ser devido a erros de medição durante a realização

do protocolo e erros de cálculos.

Os resultados obtidos na electroforese em gel de poliacrilamida,

apresentam, para além dos dados esperados, duas bandas que correspondem

a contaminantes e a GST em determinadas eluições. As bandas

correspondentes a contaminantes encontram-se nos resultados, pois podem

ter sido provocadas por uma cromatografia errada, tendo as eluições ficado

pouco purificadas. No caso das bandas referentes a GST, o seu aparecimento

deve-se à inexistência de inibidores de proteases, o que levou a que estas

clivassem algumas proteínas de fusão dividindo-as em GST e CTGluR.

A banda referente à proteína recombinante encontra-se na posição

esperada, visto que o peso molecular desta é de 30 kDa, e está posicionada

entre a banda de 25 e a de 37 kDa da solução padrão, no entanto não está

purificada como se pode deduzir pela existência de duas bandas em vez de

apenas uma.

Para corrigir alguns erros, podia-se ter efectuado o Western Blot. Neste

processo é utilizado um anticorpo anti-GST que se ligava a todas as proteínas

excepto aos contaminantes, por não possuírem GST. Com este processo

podia-se concluir se houve ou não falhas na purificação das proteínas.

Trabalho elaborado por: Grupo 1, P2

Ana Carina Maia

Ana Cláudia Pires

Ana Rita Graça

Daniela Oliveira

Métodos e Técnicas em Biologia Molecular

Coimbra, 27 de Junho de 2008

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