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ii

INSTITUTO AGRONÔMICO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA

TROPICAL E SUBTROPICAL

EXPRESSÃO DIFERENCIAL PARA A TOLERÂNCIA

A ESTRESSE INDUZIDO POR ALUMÍNIO EM Coffea

arabica.

BÁRBARA REGINA BAZZO

Orientador: Dr. Carlos Augusto Colombo

Dissertação submetida como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre em

Agricultura Tropical e Subtropical, Área de

Concentração em Genética, Melhoramento e

Biotecnologia Vegetal

Campinas, SP

2012

Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico B634e Bazzo, Bárbara Regina Expressão diferencial para a tolerância a estresse induzido por alumínio em coffea arabica./ Bárbara Regina Bazzo. Campinas, 2012. 64 fls Orientador: Carlos Augusto Colombo Dissertação (Mestrado) em Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto Agronômico 1 Café – alumínio 2. Solos ácidos I. Colombo, Carlos Augusto II. Título CDD 633.73

iii

DEDICATÓRIA

A realização deste trabalho muito se deve a ajuda e ao apoio de muitas pessoas. Dedico essa

dissertação às pessoas que participaram da transformação desse projeto em realização. Em

especial à minha família. Ela fez a diferença, pois quando o tempo fechou e a tempestade

chegou, ela estava lá, pronta para me levantar. Ao meu orientador, amigo e segundo pai

Carlos, que esteve comigo, me guiou, me explicou, me ajudou, riu comigo. À minha amiga

Daiane, que além da amizade e dos conselhos, ajudou na elaboração e realização do projeto e

dispensou de suas horas para que o trabalho se realizasse; às minhas amigas de laboratório

Míriam, Paula, Manu, Aline, Luciana, Lúcia e Daiana que incentivaram minhas idéias e

acreditaram em mim.

Obrigada a todos.

iv

AGRADECIMENTO

Ao IAC e a Pós-Graduação, pela oportunidade.

Aos professores e funcionários pelo tempo e pela contribuição.

A CAPES, pela concessão da bolsa.

Ao Pólo APTA de Mococa, por fornecer o material de estudo.

v

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. vi

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. vii

RESUMO ................................................................................................................................ viii

ABSTRACT .............................................................................................................................. ix

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 10

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 11

2.1 O Café no Brasil ................................................................................................................. 12

2.1 O gênero Coffea .................................................................................................................. 11

2.2 Solos Ácidos ....................................................................................................................... 14

2.3 O Alumínio Fitotóxico ....................................................................................................... 14

2.4 Estresse Oxidativo .............................................................................................................. 17

2.5 Mecanismos de Defesa ....................................................................................................... 18

2.5.1 Mecanismos simplásticos e apoplásticos ......................................................................... 19

2.6 Genética e Biologia Molecular da Defesa ao Alumínio ..................................................... 22

3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 25

3.1 Material Vegetal ................................................................................................................. 25

3.2 Ensaio Biológico ................................................................................................................ 25

3.2.1 Germinação ...................................................................................................................... 25

3.2.2 Indução de estresse ao alumínio ...................................................................................... 26

3.3 Extração de RNA ................................................................................................................ 26

3.4 Purificação do RNA ........................................................................................................... 27

3.5 Síntese de cDNA ................................................................................................................ 27

3.6 Mineração de Dados e Desenho de Primers ....................................................................... 27

3.6.1 Busca de sequências ........................................................................................................ 27

3.6.2 Desenho de Primers ......................................................................................................... 28

3.7 Reações de qRT-PCR ......................................................................................................... 28

3.8 Análise dos Dados .............................................................................................................. 28

3.8.1 Estabilidade do Normalizador ......................................................................................... 29

3.8.2 Teste de Eficiência........................................................................................................... 29

3.8.3 Quantificação relativa ...................................................................................................... 29

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 30

4.1 Ensaio Biológico ................................................................................................................ 30

4.2 Extração de RNA ................................................................................................................ 31

4.3. PCR quantitativa ................................................................................................................ 33

4.3.1 Mineração de Dados e Desenho de Primers .................................................................... 33

4.3.1.1 Busca de sequências ..................................................................................................... 33

4.3.1.2 Desenho de primers ...................................................................................................... 35

4.4 Análise dos Dados .............................................................................................................. 37

4.4.1 Estabilidade do Normalizador ......................................................................................... 37

4.4.2 Teste de Eficiência........................................................................................................... 37

4.4.3 Quantificação relativa ...................................................................................................... 40

4.5 Contigs 5351, 1441 e 6750 relacionados a detoxificação interna de espécies reativas de

oxigênio. ................................................................................................................................... 46

4.6 Contigs 3026, 17520 relacionados a utilização de ácidos orgânicos. ................................. 50

5 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 53

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 54

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Genes relacionados à defesa contra o estresse causado pelo íon alumínio Nome da

enzima, organismo de origem e referência no banco de dados

NCBI......................................................................................................................33

Tabela 2 - Contigs de Coffea arabica potencialmente relacionados com o estresse provocado

pelo íon alumínio. Enzima, contigs de C. arabica no PBGC, valor de e-value e

similaridade com sequências de outros

organismos.............................................................................................................34

Tabela 3 – Enzima e contigs similares do PBGC selecionados para a síntese dos primers;

comprimento (Pb), temperatura de anelamento (Tm) e porcentagem de

nucleotídeos guanina e citosina (% CG) das sequências de oligonucleotídeos

direto e reverso obtidas pelo programa PRIMER EXPRESS (Applied

Biosystems)............................................................................................................36

Tabela 4 - Eficiência dos genes alvo potencialmente relacionados com a resposta

antioxidativa induzida pela toxicidade ao alumínio em C. arabica e normalizador

calculado de acordo com o coeficiente angular da reta (slope) (RAMAKERS et

al., 2003)................................................................................................................38

Tabela 5 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) pelo método de

PFAFFL (2001) de moléculas alvo nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por

alumínio nos tempos 1 hora, 12 horas e 48 horas (duas repetições por amostra –

C1, C1‟)..................................................................................................................42

Tabela 6 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por alumínio entre amostras de

Catuaí e Icatu sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo

induzidas pelo alumínio com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em

negrito....................................................................................................................45

Tabela 7 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por alumínio entre amostras de

Icatu e Catuaí sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo

induzidas pelo alumínio com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em

negrito....................................................................................................................45

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Possíveis mecanismos de toxicidez e detoxificação ao alumínio utilizado pelas

plantas (KOCHIAN et al., 2005)...........................................................................20

Figura 2 - Medição de raízes de plântulas de Coffea arabica Catuaí com 40 dias de

germinação.............................................................................................................31

Figura 3 - Plântulas de Coffea arabica Catuaí e Icatu submetidas a estresse por alumínio em

cultivo hidropônico................................................................................................31

Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose 1% para verificação da integridade das amostras de

RNA total extraído de pontas de raízes de café mostrando as bandas 28S e

18S..........................................................................................................................32

Figura 5 - Curva padrão gerada para ilustrar o cálculo de eficiência de amplificação do gene

Glutationa Redutase a partir de RNA extraído de pontas de raízes de café. Em

destaque, o coeficiente angular da reta (slope) e o valor da eficiência

(E)...........................................................................................................................37

Figura 6 - Curvas de amplificação da diluição seriada com sete concentrações de cDNA

(concentrado e seis diluições) para análise de eficiência dos genes ACT (Actina -

A), APX (Ascorbato Peroxidase - B), CAT (Catalase - C), FER (Ferritina - D),

GLUTRed (Glutationa Redutase - E) e SOD (Superoxido Dismutase - F)

(Continua)..............................................................................................................39

Figura 7 - Curva de amplificação para o gene APX para o genótipo Icatu nos tempos 1 hora,

12 horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada tempo) gerada pelo

software 7500 Fast System SDS (Sequence Detection System) v 1.3.1 (Applied

Biosystems)............................................................................................................40

Figura 8 - Curva de melting para o gene APX no genótipo Catuaí nos tempos 1 hora, 12

horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada

tempo)................................................................................................................... 40

Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo

nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por alumínio nos tempos 1 hora, 12

horas e 48 horas (C1, C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu)

(Continua)..............................................................................................................43

‘Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo

nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por alumínio nos tempos 1 hora, 12

horas e 48 horas (C1, C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu)

(Continuação)‟......................................................................................................44

viii

Expressão Diferencial para a Tolerância a Estresse Induzido por Alumínio em Coffea

arabica.

RESUMO

As principais regiões agrícolas no Brasil estão localizadas em solos ácidos que possuem

teores de alumínio em quantidades suficientes para alterar o crescimento de muitas espécies

de plantas cultivadas. A ação do alumínio na planta é diretamente na raiz, inibindo o

crescimento do ápice radicular e a formação de raízes secundárias, resultando em um sistema

radicular pouco desenvolvido e com limitações para mais bem explorar água e nutrientes,

sobretudo de camadas profundas do solo. Embora haja um número grande de pesquisas a

respeito dos efeitos tóxicos do alumínio e dos mecanismos de defesa a este íon em várias

plantas de valor econômico, poucos trabalhos relatam os seus efeitos na cultura do café. A fim

de analisar a expressão diferencial de genes potencialmente relacionados com a tolerância

desta cultura ao alumínio, duas cultivares comerciais de Coffea arabica foram submetidas a

um ensaio hidropônico sob tratamento com e sem alumínio (controle negativo) nos tempos 1

hora, 12 horas e 48 horas. Os genes diferencialmente expressos foram quantificados por meio

da técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (q-PCR). Dos sete genes analisados

relacionados com o estresse oxidativo causado pelo estresse ao alumínio, três (Contigs 1441,

5351 e 6750) revelaram aumento de expressão relativa em raízes na cultivar Icatu em relação

a cultivar Catuaí e dois, Contigs 3026 e 17520 na cultivar Catuaí em relação à Icatu, todos

descritos na literatura como potencialmente induzidos. Os contigs são similares aos genes

ascorbato peroxidase, superoxido dismutase, catalase, malato dehidrogenase e citrato sintase,

conforme literatura. Nossos resultados corroboram que estudos posteriores de caracterização

funcional sejam realizados em que poderão ser utilizados em projetos de seleção assistida ou

ensaios de transgenia visando à produção de cultivares de café mais tolerantes a solos ácidos.

Palavras-chave: Estresse abiótico, expressão gênica, estresse oxidativo, PCR Quantitativo em

Tempo Real (q-PCR), Sustentabilidade.

ix

Differential Expression to Tolerance of Aluminum - Induced Stress in Coffea arabica.

ABSTRACT

The main Brazilian agricultural regions areas are located in acid soils, which have

exchangeable aluminum contents enough to damage the growth of many cultivated plants

species. The aluminum acts directly in plant roots systems, inhibiting the apex growth and the

formation of secondary roots, resulting in a poorly developed root system and limitations to

better exploit water and nutrients, especially of deep soil layers. Despite the researches in

several important cultivated plants about the aluminum toxic effects and it defense

mechanisms, few reports the effects of this ion in coffee. In order to analyze the differential

expression patterns of genes related to potentially aluminum tolerance that culture, two Coffea

arabica cultivars were tested under hydroponic treatment with and without aluminum

(negative control) in 1 hour, 12 hours and 48 hours. The differentially expressed genes were

quantified by Real-Time Quantitative PCR (q-PCR). Of the seven genes related to stress by

aluminum stress, three (Contig 1441, Contig 5351 and Contig 6750) revealed a relative

expression increased in roots growing in Icatu over Catuaí and two, Contig 3026 e Contig

17520 in Catuaí over Icatu, all described in the literature as potentially induced. The contigs

1441, 5351, 6750, 3026 and 17520 are similar to described genes ascorbate peroxidase,

superoxide dismutase, catalase, malate dehydrogenase and citrate synthase, according to the

literature. Our results suggest that later functional characterization studies should be

conducted and, if its functions are confirmed, may be used in assisted selection

or transgenic experiments projects aimed at coffee cultivars more tolerant to acid soils.

Keywords: Abiotic stress, gene expression, oxidative stress, Real-Time Quantitative PCR (q-

PCR), Sustainability.

10

1 INTRODUÇÃO

Os solos brasileiros se caracterizam por serem ácidos, com pH por volta de 5,1, não

recomendado para o desenvolvimento do cafeeiro, cuja faixa aceitável está entre 6 e 6,5

(COOXUPE, 2008). O alumínio é o terceiro elemento químico mais abundante na crosta

terrestre, depois do oxigênio e do silício, com 7,1%, e um dos principais fatores abióticos

limitantes da agricultura praticada em solos acidificados.

Segundo estimativas do CONAB (2011), Minas Gerais é o maior estado produtor de

café, com 68% do produto beneficiado, sendo as regiões Sul de Minas e Cerrado as mais

importantes e o solo dessas duas regiões é predominantemente ácido.

A ação do alumínio na planta é diretamente na raiz, inibindo o crescimento do ápice

radicular e a formação de raízes secundárias (KOCHIAN et al., 2004), o que resulta em um

sistema radicular pouco desenvolvido e incapaz de explorar camadas profundas do solo,

diminuindo a capacidade da planta em absorver água e nutrientes.

Pela presença dos mecanismos de tolerância e resistência, o alumínio é uma força

seletiva importante na natureza, tornando diversas espécies adaptadas ao estresse abiótico

(KOCHIAN et al., 2004).

As plantas desenvolveram mecanismos de proteção contra os efeitos tóxicos ao

alumínio, os quais podem ser divididos em duas classes: i) os mecanismos simplásticos ou de

tolerância, que permitem a imobilização do metal ou neutralização do mesmo dentro da

célula; ii) mecanismos apoplásticos ou de resistência, que impedem a entrada em função da

sua imobilização na rizosfera. (KOCHIAN, 1995).

Nos processos apoplásticos, a defesa contra o alumínio, mediada pela exsudação de

ácidos orgânicos e outros compostos, parece ser o mais comum. Esses quelantes incluem os

malatos, citratos e oxalatos, quem podem se ligar ao alumínio dentro ou fora da célula

(mecanismos simplásticos ou apoplásticos). Quando ligados dentro da célula, o alumínio

permanece inativo dentro de vacúolos ou no citoplasma, prevenindo seus efeitos negativos

nos processos celulares (KOCHIAN et al., 2002).

O estresse oxidativo, no entanto, é um evento biológico originado por inúmeros

estresses, sendo um mecanismo secundário. Muitos dos estresses abióticos conhecidos, como

seca, salinidade, temperatura e alumínio quebram o balanço metabólico das células,

resultando no aumento de produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) (MITTLER,

11

2002). Estas, quando se acumulam nos tecidos, podem levar a alteração da atividade das

enzimas do complexo antioxidativo, que desempenham papel importante no combate a esses

radicais e são requeridas quando o equilíbrio entre produção e remoção das EROs é afetado

por fatores ambientais adversos (como o estresse por alumínio) (APEL & HIRT, 2004).

Dentro desta classe de enzimas, as mais importantes são a Superoxido Dismutase

(SOD) (EC number 1.15.1.1), Catalase (CAT) (EC number 1.11.1.6) e enzimas do complexo

Ascorbato-Glutationa (APX, GPX) (EC number 1.11.1.11, 1.11.1.9).

Respostas adequadas às mudanças ambientais são cruciais para o crescimento e

sobrevivência da planta. No entanto, os mecanismos de toxicidade/defesa ao íon Al+3

e as

respostas moleculares e bioquímicas que permeiam estas respostas em relação ao estresse não

são bem esclarecidas para o café. O grande número de genes descritos na literatura envolvidos

nos mecanismos de resistência e/ou tolerância das plantas mostra a gama de vias metabólicas

que o alumínio afeta, sugerindo a presença de tantos outros genes presentes nesses processos

bioquímicos. Assim, o presente estudo pretende utilizar ferramentas da biologia molecular

para: (I) quantificar o produto da expressão dos genes potencialmente relacionados aos

mecanismos de defesa aos efeitos tóxicos do alumínio; (II) analisar os genes encontrados

quanto ao padrão de transcrição gênica temporal das raízes do material de estudo; (III) e

relacionar os genes estudados com as diferentes respostas entre as cultivares Catuaí e Icatu. A

descoberta de tais genes amplia o conhecimento em relação aos mecanismos de defesa do

cafeeiro e abre perspectivas para novas estratégias de melhoramento genético visando ao

desenvolvimento de cultivares tolerantes a solos ácidos.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 O gênero Coffea

O cafeeiro pertence à família Rubiaceae, do gênero Coffea. A família Rubiaceae

abrange mais de 10 mil espécies agrupadas em 630 gêneros. O gênero Coffea se divide em

quatro seções: Eucoffea que apresenta 24 espécies, Marcarocoffea com 18 espécies,

Argocoffea com 11 espécies e Paracoffea com 13 espécies (BRIDSON, D. M. &

VERDCOURT, B., 1988). A sessão de maior importância econômica é a Eucoffea, pois as

espécies Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre estão dentro. São as espécies mais

cultivadas para o consumo do café, respondendo, respectivamente, por 70% e 30% do café

12

comercializado no mundo sendo, portanto as de maior importância econômica dentro das

inúmeras espécies existentes (MELO, B. & SOUZA, L. B., 2010).

C. arabica é uma espécie tetraplóide (2n = 4x = 44 cromossomos) e autógama, com

apenas 10% de polinização cruzada. Sua origem é de terras altas, a mais de 1000 m de altitude

da Etiópia e do Sudão, onde cresce em estado semi-silvestre nos estratos inferiores da floresta,

enquanto que C. canephora é diplóide (2n = 2x = 22 cromossomos) e alógama, sendo a

fecundação controlada por um sistema de incompatibilidade do tipo gametofítico (CONAGIN

& MENDES, 1961).

Segundo DAVIS et al. (2006) existem no total 103 espécies do gênero Coffea

distribuídas em 41 espécies na África, 59 na ilha de Madagascar e três nas Ilhas Mascarenhas.

2.2 O Café no Brasil

A produção cafeeira é uma atividade de grande impacto econômico, tanto pela

formação de capital no setor agrícola como pela geração de emprego nos diferentes setores da

economia, ou seja, a indústria, agricultura e o comércio. A empregabilidade nesses setores

chega ao número de três milhões e meio de empregos diretos, sendo um dos setores com

maior capacidade de geração de empregos no país. O café caracteriza-se por ser o segundo

maior produto do mundo em volume de negócios, perdendo apenas para o petróleo (CONAB,

2012; SAES & NAKAZONE, 2002).

O café foi trazido da Guiana Francesa em 1727, e quatro anos depois, já aconteciam as

primeiras exportações. Em 1849, a produção brasileira já atingia 40% da produção mundial e

chegou à casa dos 70% no período de 1925/1929; em 2007 foram 33,4 milhões de sacas

produzidas, em uma área de 2,7 milhões de hectares (CARVALHO, 2007).

O café é um dos produtos agrícolas brasileiros de maior importância econômica. O

Brasil é o maior produtor e exportador de café, com participação média de 24% nas

exportações mundiais. Em 2002, as exportações brasileiras bateram o recorde de 27,9 milhões

de sacas, o que representou uma porção de mercado de 32%, o maior dos últimos 12 anos

(SAES & NAKAZONE, 2004). Em 2011, o consumo deste produto aumentou 3,11%,

passando de 19,13 milhões de sacas para cerca de 20 milhões de sacas. Para 2012, a ABIC

(Associação Brasileira da Indústria de Café) espera um crescimento de 3,5% do volume

(ABIC, 2011). A estimativa de produção de café para 2012 é de que o país colherá entre 48,97

e 52,27 milhões de sacas do produto. Esse valor é um aumento de 12,6% a 20,2%, quando

comparada com a produção obtida na temporada anterior que foi de 43,48 milhões de saca.

(CONAB, 2012).

13

Segundo estimativas do CONAB (2011), o estado de Minas Gerais é o maior produtor,

com 68% do café beneficiado do país, sendo as regiões Sul de Minas e Cerrado as mais

importantes. Neste bioma o solo predominante (com abrangência de 46%) é o latossolo, cujas

características são a baixa fertilidade e a acidez (pH abaixo de 5,5). Além disso, nesses solos

normalmente são encontradas altas concentrações de Al+3

e baixos teores de Ca2+

e Mg2+

abrangendo as camadas superficiais e subsuperficiais (OLIVEIRA et al., 2005; EMBRAPA,

2007).

Em 1932, o Instituto Agronômico (IAC) deu início a um amplo estudo biológico e

agronômico do cafeeiro (C. arabica) e, particularmente, de seu melhoramento. Os estudos

envolviam sistemática, citologia, biologia da reprodução, genética e técnicas agronômicas,

tendo como objetivo, reunir informações básicas para o melhoramento da cultura

(CARVALHO, 2007). O melhoramento genético convencional tem obtido sucesso atendendo

o setor produtivo, realizando estudos pelos métodos tradicionais de cruzamentos e seleção de

progênies. Entretanto, hoje em dia, há a necessidade de ampliar o conhecimento e aplicar

novas abordagens tecnológicas para o melhoramento do cafeeiro.

A biotecnologia aplicada, através de técnicas de cultura de tecidos, marcadores

moleculares e transformação genética, tem-se revelado uma ferramenta importante de apoio

aos programas de melhoramento, auxiliando na identificação e avaliação de novos genótipos e

obtendo novos materiais genéticos em tempo reduzido.

O recente desenvolvimento de técnicas biomoleculares produziu enorme quantidade

de informações na área da genômica de plantas com importante potencial de aplicação no

melhoramento genético das espécies. O sequenciamento de ESTs (Expressed Sequences Tags)

em larga escala, por exemplo, nos permite dispor de um banco de genes cujas funções podem

atribuídas a determinadas características agronômicas de interesse agrícola.

No caso do café, como resultado do Projeto Brasileiro do Genoma Café, uma

iniciativa da FAPESP, Cenargen e do Consórcio Brasileiro de Pesquisas Cafeeiras, foram

produzidas cerca de 215 mil sequências ESTs de C. arabica, C. canephora e C. racemosa, a

partir do RNA extraído de diferentes tecidos e ou órgãos das plantas. Após tratamento por

ferramentas de bioinformática, esse banco ficou representado por cerca de 30 mil sequências

de genes putativos, que se encontram depositados em uma base de dados on – line. A partir do

conhecimento destas seqüências, pesquisas importantes e inéditas visando ao melhoramento

do café poderão ser realizadas (VIEIRA et al., 2006).

14

2.3 Solos Ácidos

Em torno de 30% da área da crosta terrestre é

que corresponde a mais de 50% dos solos potencialmente agricultáveis no mundo, sendo que

as regiões tropicais e subtropicais contam com a maior porção (60%) (VON UEXKÜLL &

MUTERT, 1995).

Os solos ácidos em regiões tropicais são úmidos, devido aos altos índices de

precipitação pluviométrica, fazendo com que os nutrientes solúveis do solo, como cálcio,

magnésio e potássio, sejam lixiviados e, consequentemente, quando não repostos, o pH do

solo diminuídos. Em pH baixo, os íons hidrogênios (H+) atuam sobre os minerais liberando

Al+3

que estava retido por cargas negativas de argila do solo. Assim, a quantidade de Al+3

em

solução aumenta com a acidez do solo (NOLLA & ANGHINONI, 2004). O alumínio é o

terceiro elemento químico mais abundante na crosta terrestre com 7,1%, e apresenta-se como

um dos principais fatores abióticos limitantes para a agricultura, chegando a restringir a

produção em mais da metade das terras agricultáveis na África, Ásia e América do Sul

(SILVA & SOUZA, 1998).

Os solos brasileiros se caracterizam por serem solos ácidos, com pH por volta de 5,1,

não recomendado para o desenvolvimento do cafeeiro, cuja faixa aceitável está entre 6 e 6,5

(COOXUPE, 2008).

O processo de acidificação é muitas vezes intensificado por práticas agrícolas, pela

mineração ou pelo descarte de resíduos (RAO et al., 1993), podendo ser corrigidos por

calagem, um processo de neutralização dos íons H+ e Al

3+. Entretanto, a aplicação de calcário

na superfície do solo não soluciona os problemas de acidez nas camadas inferiores e a

calagem a grandes profundidades geralmente não é possível por apresentar dificuldades

técnicas e econômicas (MARIA et al., 1993).

Por esta razão, o uso de cultivares tolerantes ao Al+3

torna-se a estratégia mais efetiva

para a produção cafeeira.

2.4 O Alumínio Fitotóxico

É importante compreender como o Al+3

apresenta o efeito tóxico na planta, quais os

mecanismos de defesas para o estresse e quais os efeitos fisiológicos, bioquímicos e genéticos

envolvidos na tolerância.

Vários estudos mostram os resultados do Al+3

em diversas plantas de interesse

comercial. A maior parte deles comprova que a ação do Al+3

na planta é diretamente na raiz,

inibindo o crescimento do ápice radicular e a formação de raízes secundárias, como

15

apresentado nos trabalhos de PANDA et al. (2003) com Vigna radiata, YANG et al. (2008)

com arroz e CAMBRAIA et al. (1991) com sorgo; o Al+3

ainda pode afetar a disponibilidade

de fósforo para a planta, importante nutriente para os processos de fotossíntese e respiração.

O café caracteriza-se por ser uma espécie moderadamente tolerante ao Al+3

, pois altas

saturações deste metal podem comprometer o desenvolvimento de raízes nas camadas

subsuperficiais do solo (RODRIGUES et al., 2001). Como conseqüência, pode ocorrer

retardamento do crescimento e desenvolvimento radicular, aumento do diâmetro das raízes e

diminuição do número de raízes secundárias (PAVAN & BINGHAN, 1982).

BRACCINI et al. (2000), utilizando o método do papel-solução, concluíram que a

cultivar Icatu Vermelho IAC 4045 foi a mais tolerante ao Al+3

. Entretanto MAURI et al.

(2004) mostraram que o clone originado de Catuaí Amarelo, em comparação com clones de

Coffea canephora, apresentou os maiores valores de massa seca, área e comprimento

radicular.

Em café, são encontradas diferenças entre as cultivares para a tolerância à toxicidade

ao Al+3

e entre linhagens dentro de uma mesma cultivar. Em um estudo com duas cultivares

de café, Catuaí e Icatu, RODRIGUES et al. (2006) notaram que a primeira cultivar mantinha

inalterada as concentrações de Al+3

nas folhas, mas as concentrações radiculares aumentavam

com a crescente saturação do metal. Já Icatu, mantinha as concentrações radiculares fixas,

transportando o Al+3

para as partes aéreas. Segundo os autores, os dados sugerem mecanismos

de resposta diferentes, em que Catuaí responderia com a compartimentalização e exclusão do

metal na raiz, enquanto que Icatu agiria com mecanismos de defesa interna, como a ação de

enzimas. Entretanto, pouco se sabe a respeito de compostos orgânicos ou genes envolvidos no

processo de combate ao estresse nesta cultura.

Em estudos realizados por BRACCINI et al. (1998a) com cultivares café, plantas

cultivadas em solução nutritiva com Al+3

apresentaram inibição de crescimento e

desenvolvimento das partes aéreas e da raiz, além de redução do comprimento da raiz

principal, altura das plantas e área foliar. Entretanto, os autores observaram aumento da

proliferação de raízes secundárias, o que foi interpretado como sendo uma resposta à restrição

da absorção por nutrientes. Num segundo estudo, os mesmos autores observaram ainda uma

redução de concentração de fósforo e cálcio nas folhas superiores e inferiores devido à

retenção desses minerais nas raízes (BRACCINI et al., 1998b).

Os efeitos do Al+3

na nutrição mineral de plantas dependem, além das condições

experimentais, da cultura e do nutriente envolvido no estudo. O Al+3

pode afetar diretamente a

16

absorção de fósforo pela precipitação de fosfato de alumínio na raiz, impedindo-o de

participar de processos de transferência de energia (CLARKSON, 1966).

Devido à competição catiônica, o Al+3

pode também inibir a absorção de cálcio. Seu

transporte dentro das células é energicamente passivo (DELHAIZE & RYAN, 1995) e pode

ser deslocado pela competição por ligantes ou pela redução da diferença do potencial elétrico

da membrana (RENGEL, 1992) que é fundamental para a estabilidade celular. O Al+3

se liga a

moléculas de pectina na parede celular, por fazer uma ligação mais forte e rápida do que o

Ca2+

. O deslocamento leva a uma situação de rigidez, o que ocasiona uma menor capacidade

de extensibilidade, característica essa necessária para expansão celular (KOCHIAN et al.,

2004).

Dentro da célula, os íons Al+3

interagem com vias de transdução de sinais relacionadas

com o cálcio. A exposição do metal pode levar a alterações nos níveis citosólicos de Ca2+

, que

por sua vez afetam a atividade de enzimas como a fosfolipase C da via do fosfoinositídeos


A rápida resposta da raiz indica que num primeiro momento o Al+3

inibe a expansão e

elongação das células das raízes, e depois a divisão celular também passa a ser inibida

(KOCHIAN, 1995). O sítio da toxicidade do Al+3

está localizado no ápice da raiz e desta

forma, as pesquisas envolvendo Al+3

são focadas nestas regiões (RYAN et al., 1993;

SIVAGURU et al., 1999).

A intoxicação por esse elemento resulta, então, em um sistema radicular pouco

desenvolvido e incapaz de explorar camadas profundas do solo, diminuindo a capacidade da

planta em absorver água e nutrientes. Como resultado, as plantas sensíveis ao Al+3

apresentam

maior suscetibilidade à deficiência hídrica e nutricional, ocasionando perdas na produtividade

e instabilidade de produção das culturas.

Os efeitos causados pelo Al+3

nas raízes são visíveis com pouco tempo de indução do

estresse, que são seguidos por efeitos secundários em longo prazo, não causados diretamente

pelo Al+3

, mas como conseqüência a esse estresse (KOCHIAN et al., 2002).

O estresse oxidativo pode ser considerado um efeito secundário importante. É uma

condição biológica causada pelo desequilíbrio entre a produção de EROs (Espécies Reativas

de Oxigênio) e a desintoxicação do organismo. Em plantas tolerantes submetidas a essas

condições, a enzima superóxido dismutase tem papel importante na decomposição de

superóxidos e sua atividade aumentada em trigo (BABOURINA et al., 2006), soja

(CAKMAK & HORST, 1991), triticale (cultivar sensível) (LIU et al., 2008), Arabidopsis

thaliana (RICHARDS et al., 1998), milho (ROCHA, 2006) e arroz (SHARMA e DUBEY,

17

2007). O estresse oxidativo também causa a peroxidação de lipídeos em soja (CAKMAK &

HORST, 1991), arroz (MERIGA et al., 2004), tabaco (ONO et al., 1995; YIN et al., 2010).

Em estudos com milho (WANG et al., 2011) foi detectada a oxidação de proteínas após a

inibição do crescimento radicular pelo Al+3

, algo até então desconhecido em plantas,

indicando que existem outros alvos da toxidez deste íon (BOSCOLO et al., 2003).

2.5 Estresse Oxidativo

Em muitas situações de estresse abiótico, como seca, salinidade, temperatura e Al+3

,

ocorre quebra do balanço metabólico das células, resultando no aumento de produção das

espécies reativas de oxigênio (MITTLER, 2002).

A evolução do processo metabólico aeróbio, como a respiração e a fotossíntese, leva à

produção de EROs nas mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos. Originadas a partir da

transformação de O2 em H2O, essas espécies intermediárias do oxigênio incluem os radicais

superóxidos (O2-•), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (OH

•) e o oxigênio

singlet. O oxigênio que origina esses radicais é participante da cadeia respiratória, mas uma

parte escapa, resultando na redução parcial do oxigênio molecular (MITTLER, 2002). Esses

radicais são formados durante funções metabólicas normais ou induzidos por estímulos

ambientais. Quando se acumulam nos tecidos, podem levar a alteração da atividade das

enzimas do complexo antioxidativo, que desempenham papel importante no combate a esses

radicais e são requeridas quando o equilíbrio entre produção e remoção das EROs é afetado

por fatores ambientais adversos (APEL & HIRT, 2004).

Dentro desta classe de enzimas, as mais importantes são a Superoxido Dismutase

(SOD) (EC number 1.15.1.1), Catalase (CAT) (EC number 1.11.1.6) e enzimas do complexo

Ascorbato-Glutationa (APX, GPX) (EC number 1.11.1.11, 1.11.1.9). Elas formam uma

maquinaria eficiente e a SOD age na primeira linha de frente contra as EROs, dismutando os

superóxidos em H2O2. Os superóxidos são produzidos em vários compartimentos celulares,

como peroxissomos, mitocôndrias, cloroplastos e glioxissomos. Assim, a SOD também é

encontrada em todos esses lugares e baseado no co-fator metal usado pela enzima, ela é

classificada em: SOD-ferro (FeSOD) (cloroplasto), SOD-manganês (MnSOD) (mitocôndria e

peroxissomo) e SOD-cobre e zinco (Cu-ZnSOD) (cloroplasto e citosol) (ALSCHER et al.,

2002).

Nas plantas, o substrato mais importante para detoxificação do H2O2 é o

ascorbato. Após a dismutação do superóxido para H2O2, este oxidante não pode ser

18

acumulado, por exemplo, em cloroplastos, onde pode oxidar grupos tiol, importantes para

enzimas envolvidas na fotossíntese. A CAT catalisa a reação de quebra do H2O2 em água e

oxigênio, junto com as enzimas APX e GPX e Glutationa S-Transferase (EC number

2.5.1.18) (NOCTOR & FOYER, 1998).

Nesse ciclo, são empregadas quatro enzimas: ascorbato peroxidase (APX), dehidroascorbato

redutase (EC number 1.8.5.1) (DHA), monodehidroascorbato redutase (MDA) e Glutationa

Redutase (GR) (EC number 1.6.4.2). O H2O2 é removido pela APX através do ascorbato

como redutor, formando o radical monodehidroascorbato (MDA) (APEL & HIRT, 2004;

MITTLER, 2004).

Respostas adequadas às mudanças ambientais são cruciais para o crescimento e

sobrevivência da planta, contudo, os mecanismos moleculares e bioquímicos que permeiam

estas respostas em relação ao estresse com Al+3

, ainda são pouco compreendidos.

Pesquisas envolvendo a análise da atividade destas enzimas têm sido feitas em várias

culturas, como Allium cepa L. (ACHARY et al., 2008), milho (BOSCOLO et al., 2003),

triticale (LIU et al, 2008), Arabidopsis thaliana (RICHARDS et al., 1998), batata (TABALDI

et al., 2007), arroz (SHARMA & DUBEY, 2007), cevada (ŠIMONOVIČOVÁ et al., 2004) e

tabaco (YIN et al., 2010).

2.6 Mecanismos de Defesa ao Al+3

As plantas desenvolveram diversos mecanismos de proteção contra os efeitos tóxicos

ao Al+3

, os quais podem ser divididos em duas classes: 1) os mecanismos simplásticos ou de

tolerância, que permitem a imobilização do metal ou neutralização do mesmo dentro da

célula; 2) mecanismos apoplásticos ou de resistência, que impedem a entrada em função da

sua imobilização na rizosfera (KOCHIAN, 1995).

Os mecanismos simplásticos permitem acumular o Al+3

em locais específicos da

planta, que por sua vez entraria no simplasto e a tolerância seria alcançada através de sua

imobilização, compartimentalização ou detoxificação. Tal via incluiria quelação do Al+3

no

citosol, compartimentalização no vacúolo e expressão de proteínas ligantes de Al+3

(KOCHIAN, 1995; DELHAIZE & RYAN, 1995; TAYLOR, 1988).

Os mecanismos apoplásticos ou de resistência, no entanto, impedem a entrada do

metal pela raiz, protegendo os sítios intracelulares sensíveis ao ataque do íon. Estes

mecanismos incluem: imobilização do Al+3

na parede celular, permeabilidade seletiva da

membrana plasmática, formação de uma barreira de pH na rizosfera, exsudação de quelantes e

efluxo de Al+3

(TAYLOR, 1988; KOCHIAN et al., 2004).

19

2.6.1 Mecanismos simplásticos e apoplásticos

Pela presença dos mecanismos de tolerância e resistência, o Al+3

é uma força seletiva

importante na natureza, tornando diversas espécies adaptadas ao estresse abiótico (KOCHIAN

et al., 2004).

Os mecanismos de resistência ao Al+3

baseiam-se na formação de complexos com

carboxilatos. Os mecanismos de exclusão envolvem a liberação destes ânions através de

canais aniônicos ligados ao Al+3

na membrana plasmática, enquanto que os mecanismos de

desintoxicação interna envolvem a quelação do Al+3

citosólico por ânions carboxilato com o

subseqüente seqüestro no vacúolo através de transportadores (Figura 1) (KOCHIAN et al.,

2005).

Nos processos apoplásticos, a defesa contra o Al+3

, mediada pela exsudação de ácidos

orgânicos e outros compostos, parece ser o mais comum.

Esses quelantes incluem os malatos, citratos e oxalatos, que podem se ligar ao Al+3

dentro ou fora da célula (mecanismos simplásticos ou apoplásticos). Quando ligados dentro

da célula, o Al+3

permanece inativo dentro de vacúolos ou no citoplasma, prevenindo seus

efeitos negativos nos processos celulares.

A primeira evidencia na literatura de resistência ao Al+3

mediada por ácido orgânico

foi descrita por MIYASAKA et al. (1991), que demonstraram que cultivares de feijão

(Phaseolus vulgaris) tolerantes ao Al+3

excretavam oito vezes mais citrato que os genótipos

sensíveis. O citrato é um importante quelador do Al+3

e o complexo Al+3

-carboxilato não é

absorvido pelas raízes.

Como apresentado em soja (SHEN et al., 2005), Lupinus albus (GERKE et al., 2007;

WANG et al., 2007) e feijão (Phaseolus vulgaris L.) (RANGEL et al., 2007), a exsudação de

citrato ou ácido cítrico pelas raízes das plantas é um mecanismo primordial para caracterizar

tolerância ao Al+3

e permitir o crescimento da planta sob a condição de estresse.

Além do citrato, outros ácidos orgânicos são de grande importância para a

imobilização e liberação do Al+3

. Plantas de espinafre (Spinacia oleracea L. cv. Quanneng)

mantidas em cultivo protegido, sob condições de estresse em Al+3

, mostraram efluxo de

oxalato como forma de resistência, com inicio em um período de 30 minutos sob o estresse

abiótico e duração de até 6 horas (YANG et al., 2005). Este mesmo composto, em trigo

mourisco fornece tolerância à planta por meio da complexação do metal nas folhas, formando

um composto insolúvel com o metal que impede sua ligação com os compostos celulares (MA

et al., 1998).

20

Assim como a planta pode produzir substâncias que complexam e exsudam o Al+3

, os

compostos fenólicos (classe de antioxidantes importantes para o combate ao envelhecimento

das células) colaboram para os mecanismos de tolerância. TOLRÀ et al.(2009) sugerem que

esses compostos têm função no processo de desintoxicação da planta, fornecendo proteção

contra frações do Al+3

que escapam dos mecanismos de resistência ao metal. Eles observaram

em milho Cateto, que apresenta tolerância significativa ao Al+3

, que o nível de catecol, ácido

cafeico e catequinas (compostos antioxidantes) foi maior nesta raça do que nas plantas

sensíveis. Em Sorghum bicolor, os níveis de compostos fenólicos foi maior nas plantas

sensíveis, salientando a função destes na proteção da planta (PEIXOTO et al., 2007).

Figura 1 - Possíveis mecanismos de toxicidez e detoxificação ao Al+3

utilizado pelas plantas


21

Diversos estudos fisiológicos e moleculares têm investigado os mecanismos de defesa

através dos canais iônicos na membrana plasmática que transportam estes compostos, e nos

últimos anos eles parecem ser a chave para atingir a resistência ao Al+3

. O primeiro gene

relacionado ao transporte de compostos foi identificado em trigo (Triticum aestivum), o

TaALMT1, um transportador de malato ativado por Al+3

. Ele está expresso especificamente e

constitutivamente em ápice de raízes de linhas de trigo tolerantes ao Al+3

(SASAKI et al.,

2004).

ZHANG et al. (2001) mostraram que ânions ativados por Al+3

ocorrem em

protoplastos de ápices de raízes tanto de genótipos tolerantes quanto genótipos sensíveis de

trigo. Entretanto, em isolinhas resistentes, o fluxo de íons foi melhor e permaneceu mais ativo

do que nas isolinhas sensíveis. Essas descobertas mostraram que os mecanismos internos de

detoxificação são os mesmos, independentemente do genótipo, porém aparecem mais

abundantes e mais ativos naqueles resistentes ou tolerantes.

Há três possíveis cenários para regulação do Al+3

mediada por canais de ânions que

regulam o efluxo de ácidos orgânicos: (I) o Al+3

se liga diretamente ao canal e ele se abre; (II)

o Al+3

se liga a um receptor desconhecido que medeia a abertura de canais por meio de uma

via de sinalização; (III) o Al+3

entra na célula e inicia uma cascata de eventos que envolve

componentes citoplasmáticos e da membrana plasmática (KOCHIAN et al., 2002).

Os três ácidos orgânicos descritos (oxalato, citrato e malato) possuem perfis de

quelação próprios, com diferentes habilidades para isso. A partir disso, dois tipos de padrões

para a secreção de ácidos orgânicos têm sido identificados, de acordo com o tempo entre

exposição-secreção: o padrão I, em que não há diferença de tempo entre a adição de Al+3

e o

começo da secreção do ácido (resposta rápida); e o padrão II, em que existem algumas horas

de diferença entre os dois eventos (MA et al., 2001). O primeiro perfil indica que o Al+3

ativa

canais iônicos pré-existentes e a indução dos genes não é requerida, enquanto que o padrão II

mostra que a indução é requerida, e esses genes estariam relacionados ao metabolismo e ao

transporte dos ácidos orgânicos. (MA & FURUKAWA, 2003)

Embora vários trabalhos mostrem a eficiência dos ácidos orgânicos no combate ao

Al+3

, este não é o único mecanismo de defesa conhecido. Em 2005, PIÑEROS et al.

mostraram que tanto genótipos resistentes quanto tolerantes de milho possuíam uma

significante exudação de citrato. Eles ainda investigaram outros mecanismos potenciais, como

liberação de quelantes, alcalinização da rizosfera ou mesmo translocação do Al+3

para a parte

área, não obtendo resultados conclusivos.

22

2.7 Genética e Biologia Molecular da Defesa ao Alumínio

As espécies vegetais respondem de maneira diferente quando cultivadas em solos com

alta saturação de Al+3

. A seleção de plantas tolerantes é considerada a alternativa mais

adequada para aumentar a produção em solos ácidos com altas concentrações de Al+3

. Assim

o primeiro passo nesta abordagem é estabelecer um sistema rápido e preciso para

identificação e seleção de grande número de plantas tolerantes.

O controle genético dessa característica é conhecido para algumas espécies.

Entretanto, na maioria dos casos o assunto não é bem esclarecido. Entre os cereais, a espécie

mais tolerante é o centeio, seguida por aveia, trigo e cevada (GALLEGO & BENITO, 1997).

Em trigo, a tolerância parece ser controlada por um ou dois genes maiores

(CAMARGO, 1981). LAGOS et al. (1991) referem-se a dois genes controlando essa

característica, baseados na análise de cruzamentos da variedade brasileira BH 1146 com

CI14124 e Atlas 66, com o principal deles localizado no cromossomo 4D (ANIOL &

GUSTAFSON, 1984).

A herança simples também foi observada em cevada (MINELLA & SORRELLS,

1992). Esses autores identificaram um gene de efeito maior (Alp) e concluíram que os

diferentes graus de tolerância ao Al+3

, observados entre as cultivares, foram devidos a

ocorrência de alelos distintos nesse loco e à presença de outros genes de efeito menor. Eles

também observaram que as taxas de segregação, enquanto monogênicas, deslocavam de

dominantes para recessivas, com o aumento das concentrações, sugerindo que a tolerância era

uma característica genética dependente de dosagem. Mais tarde TANG et al. (2000)

mapearam o gene Alp no braço longo do cromossomo 4H. Eles também sugerem que os genes

ligados à tolerância em cevada e trigo seriam ortólogos, já que as duas espécies possuem a

mesma marca próxima aos genes de tolerância.

Para o milho, a resistência ao Al+3

apresenta-se como uma característica complexa. As

descobertas indicam que o controle se dá por múltiplos genes (MAGNAVACA et al., 1987),

mas MOON et al. (1997), em cruzamentos de linhas somaclonais S1587 com linhagens Cat-

100-6, mostraram que provavelmente um único gene, parcialmente dominante, controlaria a

tolerância, cuja denominação foi dada como ALM1.

Em arroz, NGUYEN et al. (2001) mostram que o controle também é influenciado por

muitos genes. Em análise de RFLP, estes autores encontraram nove regiões diferentes em oito

cromossomos que provavelmente conferiam resistência ao Al+3

. Esses resultados concordam

com os encontrados por KHATIWADA et al. (1996), que demonstraram o envolvimento de

23

vários genes na tolerância com efeito aditivo e que a herança é quantitativa com interação

alélica de dominância nos diversos locos.

Estudos similares, em soja, indicaram um efeito aditivo na absorção de elementos

minerais e crescimento da raiz na presença de Al+3

(SPEHER & GALWEY, 1996).

BIANCHI-HALL et al. (2000) encontraram cinco QTLs com efeitos reduzidos, indicando que

o controle da tolerância ao Al+3

nessa espécie é quantitativo.

Em centeio, GALLEGO & BENITO (1997) propuseram a existência de três genes Alt

controlando a tolerância ao Al+3

nesta espécie, o que concorda com análises prévias feitas por

ANIOL & GUSTAFSON (1984), que usando linhas de adição e substituição trigo-centeio

(linhagens com cromossomos extras ou cromossomos substituídos), localizaram três genes de

tolerância ao Al+3

nos cromossomos 3, 4 e 6 do genoma R dessa espécie.

Mudanças na expressão dos genes e no controle normal dos processos fisiológicos

parecem ser os maiores efetores das respostas celulares aos estresses abióticos e bióticos

(MILLA et al, 2002). Por esse motivo, nos últimos anos o alvo dos estudos tem sido os genes

induzidos pelo estresse e relacionados ao transporte de ácidos orgânicos, a síntese de

proteínas ligantes ou da via de combate do estresse oxidativo (YAMAJI et al., 2009; HUANG

et al., 2009; XIA et al., 2010).

A primeira família de genes relacionados com a tolerância ao Al+3

foi identificada,

clonada e seqüenciada por SASAKI et al. (2004), que mostraram a expressão maior do gene

transportador de malato ALMT (Aluminum Activated Malate Transporter) em plantas de trigo

resistentes ao Al+3

. A alta expressão deste gene em muitos genótipos resistentes ao Al+3

está

associada com elementos repetidos em “tandem” no promotor (SASAKI et al., 2006). Em

cevada, o gene HvAACT1 foi identificado pela primeira vez por FURUKAWA et al. (2007),

responsável pela secreção de citrato dependente de Al+3

, pertencente à família MATE

(Multidrug and Toxic Compound Extrusion).

Essa família é formada por um grupo de transportadores de proteínas em um largo e

diverso grupo de células procarióticas e eucarióticas (RYAN et al., 2010). Muitos parecem

funcionar como carreadores secundários, para remover compostos orgânicos do citosol. Ela é

composta por três grandes famílias e 14 subfamílias. A classe I é composta por MATEs

bacteriais, a classe II por MATEs de eucariotos (que por sua vez é dividido em subclasse: (1)

fungos e bactérias, (2) plantas, (3) protozoários e (4) animais) e a classe III que incluem

MATEs bactérias e archaeas (MAGALHÃES et al., 2010).

A família MATE de Arabidopsis contém pelo menos 56 membros (LI et al., 2002,

ROGERS & GUERINOT, 2002) além de apresentar uma região QTL próxima ao gene

24

AtALMT1 no cromossomo 1 que representa uma maior tolerância ao Al+3

do que o gene em

questão (HOEKENGA et al., 2006).

Outras espécies de plantas também já tiveram genes dessas famílias identificados,

como em Arabidopsis (AtALMT1) (HOEKENGA, 2006; LIU et al., 2009), sorgo (ALTSB)

(MAGALHÃES et al., 2007), milho (ZmASL) (MARON et al., 2010), arroz (OsFRDL1)

(YOKOSHO et al., 2009).

Mais recentemente, novas classes de genes têm sido identificadas como responsáveis

pela tolerância ao Al+3

.

HUANG et al. (2009) mostraram que em arroz, os genes que medeiam essa

característica não são genes da família MATE e sim os genes STAR1 e STAR2 (nomeados

como OsSTAR1 e OsSTAR2). O primeiro codifica um domínio de ligação de nucleotídeos e o

segundo codifica um domínio transmembrana de transportadores ABC (ATP binding cassette

transporter). Eles mostraram que OsSTAR1 interage com OsSTAR2 formando um complexo

localizado na membrana de vesículas das células da raiz, que tem atividade específica de

efluxo de UDP-glucose para o apoplasma, podendo alterar a membrana celular e

provavelmente assim conferindo a tolerância. YAMAJI et al. (2009) identificaram um fator

de transcrição ART1 (Al resistance transcription factor 1) que regula a expressão dos genes

relatados em arroz e de outros 30 genes, cujos alguns também participam da detoxificação

interna e externa. Em Arabidopsis thaliana também foi identificados gene dessa família, o

AtSTAR1, cujo transportador está em células de raiz e parte superior da planta (HUANG et al.,

2010).

Esse mesmo fator de transcrição regula um gene identificado por XIA et al.(2010), o

Nrat1, pertencente à família de transportadores de Al+3

tipo Nramp (natural resistance-

associated macrophage protein) específico para o Al+3

trivalente (não carreia outros cátion

como manganês, cádmio ou ferro). Quando nocauteado, o resultado foi a diminuição da

captação de Al+3

, aumento da ligação do mesmo na parede celular e da sensibilidade ao metal.

Esse transportador, como relatado pelos autores, parece ser a primeira etapa para

detoxificação por seqüestro de Al+3

pelos vacúolos.

Outras culturas também tiveram perfis de expressão traçados recentemente. Em milho,

NINAMANGO-CÁRDENAS et al. (2003) mapearam cinco QTLs em três cromossomos, que

juntos explicavam 60% da variação fenotípica. Em 2010, MARON et al. clonaram e

caracterizaram dois genes relacionados com a tolerância ao Al+3

nesta planta, ZmMATE1 e

ZmMATE2, que estão subjacentes à dois QTLs descritos. No mesmo ano, KRILL et al. (2010)

confirmaram quatro genes como contribuidores para a tolerância ao Al+3

: Zea mays AltSB like

25

(ZmASL), Zea mays aluminum-activated malate transporter 2 (ALMT2), S-adenosyl-L-

homocysteinase (SAHH), and Malic Enzyme (ME).

Em café, estudos de suspensão celular tratada com Al+3

resultaram no aumento da

atividade de uma fosfolipase C (PLC), na produção de IP3 em ate duas vezes mais que o

normal (MARTINEZ-ESTEVEZ et al., 2003), como também na indução de uma proteína

MBP (Myelin Basic Protein), membro da família gênica MAPK (ARROYO-SERRALTA et

al., 2005).

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Vegetal

O ensaio biológico foi conduzido com duas cultivares comerciais de Coffea arabica,

Icatu vermelho IAC 4045 e Catuaí Amarelo IAC 62, para análise de expressão de genes

responsivos ao Al+3

. Os genótipos foram com base em um screening prévio de cinco

cultivares comerciais (Obatã 1669-20, Tupi IAC 4993, Mundo Novo MP 38817-1, Catuai

Amarelo IAC 62, Icatu Vermelho IAC 4045) para a identificação de cultivar tolerante e

sensível (Catuai e Icatu).

A cultivar Catuaí Amarelo IAC 62 apresenta porte baixo, frutos amarelos e foi obtida

pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), através do método de hibridização entre

cafeeiros da variedade „Caturra Amarelo‟ selecionados pelo vigor e produtividade (FILHO et

al., 2006)

Icatu possui porte alto, frutos vermelhos, excelente bebida para café expresso, obtida

pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), tendo como característica resistência à

maioria das raças do patógeno causador da ferrugem alaranjada do cafeeiro (FILHO et al.,

2006).

3.2 Ensaio Biológico

3.2.1 Germinação

Para obtenção das plântulas, 3.500 sementes (número estimado a partir da taxa de

germinação) das duas cultivares, oriundas do Pólo Regional Nordeste Paulista (Mococa) da

APTA, foram embebidas em hipoclorito de sódio 2,5% por um período de seis horas para a

retirada do pergaminho (MEIRELES et al., 2007), descascadas e tratadas com fungicida

Tyran 70% PS (0,2% do peso das sementes) para evitar contaminação. Depois disso, as

26

sementes foram colocadas em câmara de germinação B.O.D., a uma temperatura de 26 ºC no

escuro, e retiradas após atingirem o tamanho de raiz de aproximadamente três centímetros.

Após a etapa de germinação, as plântulas foram transferidas para solução nutritiva de

HOAGLANG & ARNON (1950), adaptado conforme BRACCINI et al. (1998a),

permanecendo 24 horas para aclimatação a 25 ºC e fotoperíodo de 12 horas.

3.2.2 Indução de estresse ao alumínio

Para determinar a quantidade de material necessária, ensaios preliminares foram feitos,

e a quantidade de material macerado necessária para a extração de RNA foi determinada em

no mínimo 100 plântulas (coleta em “bulk”) (rendem 100 mg de material).

Cerca de 1200 plântulas de cada variedade foram utilizadas para o ensaio biológico,

divididas em 4 caixas plásticas com aproximadamente 300 plântulas cada, dispostas em

bandejas de isopor e mantidas com aeração por bombas.

A partir de então, uma soluções de Al+3

à concentração de 0,370 µM na forma de

AlCl3+

foi adicionada à solução nutritiva, descrita por MISTRO et al. (2007). A partir de

então, 100 plântulas (coleta em “bulk”) de cada genótipo foram coletadas nos tempos 1 hora,

12 horas e 48 horas. Para certificar as análises de expressão, foram coletadas amostras

controles (sem adição de Al+3

) nos mesmos tempos descritos, totalizando ao final 12

tratamentos por genótipo (6 tratamentos em duplicatas).

A região meristemática das 100 raízes de cada tratamento foi excisada (3 a 5

milímetros de comprimento) e congelada para extração de RNA, síntese de cDNA e q-PCR.

Neste período, as plântulas foram mantidas a 25 ºC sob fotoperíodo de 12 horas e o pH

das soluções nutritivas foi adequado diariamente para 4,2 com HCl 0,1 mol.L-1

ou NaOH 0,1

mol.L-1

.

3.3 Extração de RNA

Para a extração de RNA dos ápices congelados foi utilizado o reagente TRIZOL®

(Invitrogen), de acordo com protocolo adaptado para plantas (MONTE & SOMERVILLE,

2001). A qualidade de todos os RNAs foi verificada em corrida eletroforética em gel de

agarose 1% com coloração por fluorescência Gel Red (Biotium) e a quantidade determinada

por espectrofotometria em comprimento de 260-280 ηm ressuspendido em Tris-HCl 10 mM;

pH 7.5.

27

3.4 Purificação do RNA

Para a purificação do RNA extraído, foi utilizado o kit RNeasy Mini Kit® (Qyagen)

com protocolo específico do fabricante para plantas e adaptado pelo nosso laboratório de

acordo com testes realizados. O RNA limpo foi ressuspendido em 30 µL de água DEPC

(dietilpirocarbonato) 0,2% tratada.

3.5 Síntese de cDNA

A quantidade de 3 µg de RNA total de cada amostra foi tratada com

Deoxyribonuclease I, Amplification Grade (DNAse) (Invitrogen) para a degradação do DNA

genômico contaminante (volume final de cada amostra= 22 µL).

Os cDNAs foram sintetizados a partir de 1 µg do RNA tratado utilizando a enzima

transcriptase reversa do kit SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix for q-PCR

(volume total da amostra= 21µL). Todos os métodos descritos neste item foram realizados de

acordo com a recomendação do fabricante.

Os cDNAs não foram quantificados, mas suas concentrações foram baseadas na

quantidade inicial de RNA utilizada nas sínteses. Os cDNAs foram diluídos em solução

estoque de 4,7 ηg/µL.

3.6 Mineração de Dados e Desenho de Primers

3.6.1 Busca de sequências

Sequências de genes descritas na literatura como expressas em condição de estresse

causado por Al+3

foram buscadas na base de dados do NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) por palavras-chave em Arabidopsis thaliana. Possíveis

isoformas de proteínas destes genes também foram selecionados para posterior blast no

Projeto Brasileiro Genoma Café (PBGC).

Tanto genes envolvidos nos mecanismos simplásticos como apoplásticos foram

considerados nas atividades de busca in silico. Ou seja, genes relacionados com o estresse

oxidativo e com a utilização de ácidos orgânicos foram selecionados por blastn e por

palavras-chave dos genes de interesse na base de dados do PBGC (Coffea Genome Projects).

Desta forma foi possível a identificação de contigs de café similares às sequências de

nucleotídeos de Arabidopsis thaliana, que por sua vez, possuíam funções idênticas aos genes

descritos na literatura. A procura por blastn foi escolhida, pois possibilita a obtenção de

28

sequências de nucleotídeos a partir de sequências de nucleotídeos; dessa maneira, possibilita

uma comparação e identificação de sequências similares.

A seleção das sequências de café foi baseada em seus valores de e-value, sua

identidade (mínimo de 70%), suas análises estruturais (qualidade do seqüenciamento) e suas

anotações no banco de dados PBGC. A validação das sequências de café selecionadas foi

realizada por buscas blast contra a base de dados UniProt (Swiss-Prot

http://www.uniprot.org). As sequências que retornaram seqüências similares que não seguiam

a restrição foram eliminadas da pesquisa.

3.6.2 Desenho de Primers

As sequências dos contigs validados e selecionados pela mineração de dados foram

utilizadas para o desenho de oligonucleotídeos específicos por meio do software PRIMER

EXPRESS v 3.0 (Applied Biosystems), de acordo com o tutorial do fabricante.

Os primers sintetizados foram selecionados e analisados pela ausência de formação de

dímeros, cross-dímeros, harpins e penalidades descritas pelo programa, temperatura de

anelamento (60º C), tamanho de amplicon (entre 50 e 150) e região de anelamento do primer.

3.7 Reações de q-PCR

O volume total das reações de q-PCR foi de 10 µL, sendo 5 µL de reagente Platinum®

SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG, 1,0 µL de oligonucleotídeo específico direto (200

ηM), 1 µL de oligonucleotídeo especifico inverso (200 ηM), 1 µL de água DEPC tratada e 1

µL de cDNA. As reações foram preparadas em triplicata, adicionadas em placas ópticas

MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) (Applied

Biosystems) e realizadas em amplificador modelo 7500 Fast Systems (Applied Biosystems,

Foster City, CA, USA).

3.8 Análise dos Dados

Para a análise dos dados o software usado foi 7500 Fast Systems SDS (Sequence

Detection Systems) v. 1.3.1 (Applied Biosystems). A especificidade dos produtos

amplificados foi avaliada pela análise das curvas de dissociação, geradas pelo software, de

cada gene alvo e do normalizador estudado.

29

3.8.1 Estabilidade do Normalizador

Os normalizadores Actina (ACT) e Proteína Ribossomal S19, indicados para café por

GOULÃO et al. (2011) e BOTTCHER et al. (2011) foram testados pelo método da

quantificação absoluta com o intuito de selecionar o normalizador com CT (Cycle Threshold)

mais estável em todas as amostras estudadas. Para padronização da quantidade das amostras

de cDNA, a amplificação do gene normalizador escolhido foi realizada em triplicata em todas

as placas de reação de q-PCR.

3.8.2 Teste de Eficiência

Sete diluições em série (concentrado, 0,5 – 0,015) foram feitas de um pool de cDNAs

escolhidos aleatoriamente para a realização das reações de eficiência da PCR (E), cujas

quantificações foram realizadas em triplicata, para gerar curvas padrão para cada par de

primers. A eficiência da PCR (E) para cada gene alvo foi estimada pela equação E= 10(-1/slope)

(RAMAKERS et al., 2003), em que o slope é o valor da inclinação da curva em regressão

linear; os valores de E foram levados em consideração em todos os cálculos subseqüentes.

3.8.3 Quantificação relativa

A quantificação dos genes potencialmente relacionados à tolerância do cafeeiro aos

efeitos tóxicos do íon Al+3

nas duas cultivares (Catuaí e Icatu) e nos seis tratamentos (1 hora,

12 horas e 48 horas e controles negativos) foi realizada pelo método de quantificação relativa

utilizando o gene ACT como normalizador, previamente selecionado (item 3.8.1), e os cDNAs

dos controles negativos como calibradores.

A quantidade relativa (QR) das moléculas alvo foi calculada a partir dos métodos de

PFAFFL (2001), que considera a eficiência (E) de cada gene alvo no calculo da quantificação

relativa em relação ao gene calibrador e dispensa a utilização de curva padrão e a necessidade

das eficiências dos genes alvo e normalizador serem iguais a dois (Ealvo = Enormalizador = 2)

como ocorre no método do CT comparativo (ΔΔCT) (LIVAK & SCHIMITTGEN, 2001).

As QRs das moléculas alvo foram obtidas pela seguinte fórmula:

QR = (Ealvo)ΔCt alvo (Ct controle – Ct amostra)

/ (Enormalizador) ΔC

T normalizador (C

T controle – C

T amostra)

, sendo Ealvo

a eficiência da reação de PCR com o gene alvo, CT o número de ciclos no qual a taxa de

amplificação é mais exponencial para todas as amostras avaliadas e Enormalizador a eficiência da

reação de PCR com o gene normalizador ACT.

30

A análise de expressão diferencial (ED) das moléculas alvo foi realizada levando-se

em conta seus valores de CT do normalizador presente nas placas da reação. As Eds foram

obtidas pela seguinte fórmula:

ED = (Ealvo) ΔC

T alvo (C

T Icatu – C

T Catuaí)

/ (Enormalizador) ΔC

Tnormalizador (C

T Icatu – C

T Catuaí)

, sendo CT Icatu

a média dos valores de CT das duas repetições biológicas realizadas.

Para identificar a expressão diferencial unicamente causada pela toxicidade ao Al+3

(EDAl), os valores de expressão diferencial (ED) de cada tratamento foram comparados com

os valores de ED de seus calibradores (controles negativos) por meio do seguinte cálculo

(EIRAS, 2010):

EDAl = ED tratamento / ED controles negativos

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Ensaio Biológico

As plântulas crescidas em câmara de germinação B.O.D. foram transferidas para a sala

de hidroponia (com controle de temperatura a 25 oC constantes), após 40 dias de incubação,

onde permaneceram por dois dias para a realização do ensaio biológico. Raízes de mesmo

comprimento foram selecionadas (Figura 2) e em seguida dispostas em bandejas postas em

caixas contendo 4,5 litros de solução nutritiva (Figura 3).

As plântulas permaneceram um dia em aclimatação na solução nutritiva e após esse

período foram submetidas ao tratamento de estresse induzido por Al+3

.

Nos tempos de coleta determinados, as pontas de raízes foram excisadas com bisturi

estéril e imediatamente colocadas em nitrogênio líquido e acondicionadas em biofreezer.

31

Figura 2 - Medição de raízes de plântulas de Coffea arabica Catuaí com 40 dias de

germinação.

Figura 3 - Plântulas de Coffea arabica Catuaí e Icatu submetidas a estresse por Al+3

em

cultivo hidropônico.

4.2 Extração de RNA

O RNA total extraído da ponta de raiz das amostras foi submetido à eletroforese em

gel de agarose 1% para verificação da integridade e rendimento. A figura 4 ilustra as bandas

correspondentes às subunidades 28S e 18S do RNA ribossômico das amostras, evidenciando

integridade ou baixo nível de degradação do RNA extraído.

32

Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose 1% para verificação da integridade das amostras de

RNA total extraído de pontas de raízes de café mostrando as bandas 28S e 18S.

Em seguida, o RNA total extraído de cada amostra foi purificado em coluna de

afinidade RNeasy Plant Mini Kit® (QIAGEN) e posteriormente quantificado por

espectrofotometria em leitura de absorbância a 260 ηm e 280 ηm (estimativa da concentração

de proteínas nas amostras) e 320 ηm (outros contaminantes). Calculou-se então a razão entre

as leituras a 260 ηm e 280 ηm, visando estimar a pureza. O valor das razões das amostras

analisadas estavam entre 1,6 e 2,0, como desejado.

33

4. 3 PCR quantitativa

4.3.1 Mineração de Dados e Desenho de Primers

4.3.1.1 Busca de sequências

A partir de revisão bibliográfica, genes para sete enzimas do sistema de defesa

relacionadas com detoxificação interna das espécies reativas de oxigênio e com a síntese de

ácidos orgânicos foram identificados e selecionados em Arabidopsis thaliana, Glycine max e

Vitis vinifera (Tabela 1), descritos em trabalhos com estresse induzido por estresses abióticos,

inclusive por Al+3

. Isoformas de proteínas destes genes também foram selecionados para

posterior blast no PBGC.

Tabela 1 - Genes relacionados à defesa contra o estresse causado pelo íon Al+3

. Nome da

enzima, organismo de origem e referência no banco de dados NCBI.

Gene Organismo de Origem Referência

Glutationa Redutase citosólica (GR1) Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

Glutationa Redutase GR2 Arabidopsis thaliana Kubo et al., 1998.

Glutationa Redutase (GR) Glycine max Tang & Webb, 1994.

Ascorbato Peroxidase (APX1) Arabidopsis thaliana Theologis et al., 2000.

Ascorbato Peroxidase (APX2) Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

Ascorbato Peroxidase (APX3) Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.




Ferritina (FER) 1 Arabidopsis thaliana Petit et al.,2001.

Ferritina (FER) 2 Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

Ferritina (FER) 3 Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

Ferritina (FER) 4 Arabidopsis thaliana Lin et al., 1999.

Catalase 1 Vitis vinifera Jaillon et al.,2007.

CAT 1 Arabidopsis thaliana Theologis et al., 2000.

CAT 2 Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.

CAT 3 Arabidopsis thaliana Theologis et al., 2000.

MnSOD Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

Malate Dehidrogenase Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

Citrato Sintase Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.

As sequências dos genes pesquisados, assim como as isoformas, foram usadas para

blastn contra a base de dados do PBGC (Coffea Genome Projects), bem como sequências

encontradas por palavra-chave. Assim, uma lista de contigs para cada gene relacionado com

34

tolerância ao Al+3

foi identificada (Tabela 2). Os contigs que apresentaram identidade menor

que 70% ou e-value maior que -15 foram descartados.

Tabela 2 - Contigs de Coffea arabica potencialmente relacionados com o estresse provocado

pelo íon Al+3

. Enzima, contigs de C. arabica no PBGC, valor de e-value e similaridade com

sequências de outros organismos.

Enzima (Gene)

Sequências

ortólogas de

Coffea arabica

(PBGC)

e-value Similaridade Organismos Similares

aos contigs

ASCORBATE

PEROXIDASE

Contig1441 1e -135 83% Capsicum annuum

Contig15271 1e -130 80% Gossypium hirsutum

Contig2000 1e -114 82% Nicotiana tabacum


Contig6830 0.0 82% Nicotiana tabacum

Contig14517 0.0 74% Vitis vinifera

Contig10989 1e -131 66% Vitis vinifera

SUPERÓXIDO

DISMUTASE [Mn] Contig5351 1e -118 86% Nicotiana plumbaginifolia

FERRITINA Contig6305 1e -102 73% Avicennia marina

Contig671 2e -76 67% Pyrus pyrifolia

CATALASE

Contig3524 0.0 86% Nicotiana plumbaginifolia

Contig13838 0.0 93% Vitis vinifera

Contig6750 0.0 93% Soldanella alpina

Contig10180 0.0 88% Nicotiana plumbaginifolia

Contig13901 1e -118 88% Glycine max

GLUTATIONA

REDUCTASE

Contig 4215 1e -130 85% Vitis vinifera

Contig14336 5e -95 82% Populus trichocarpa

Contig 11032 1e -121 71% Vitis vinifera


CITRATE SINTHASE Contig 17520 0.0 89% Cucurbita cv. Kurokawa

Amakuri

MALATO

DEHIDROGENASE Contig 3026 1e -154 86% Solanum tuberosum

35

4.3.1.2 Desenho de primers

Dentre os contigs pesquisados e relacionados com a tolerância ao Al+3

, foram

selecionados para as reações de q-PCR 11 contigs, e destes, 7 foram usados para o desenho de

primers, mostrando boas características, como temperatura de anelamento, região de

anelamento, sequência de oligonucleotídeos direto e reverso, obtidas pelo programa PRIMER

EXPRESS (Applied Biosystems) (Tabela 3).

36

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59

39

37

4.4 Análise dos Dados

4.4.1 Estabilidade do Normalizador

Dentre os normalizadores testados, o mais estável nas amostras estudadas foi ACT,

com bom perfil de amplificação e eficiência próxima de 100% (E=2).

4.4.2 Teste de Eficiência

O valor de CT (threshold cycle) refere-se ao ciclo de PCR em que há o aumento na

fluorescência acima do sinal basal. Em se tratando de uma reação de PCR em que o número

de cópias do gene sintetizado in vitro aumenta em progressão geométrica, a diferença do valor

de CT entre as amostras é indicativo do número inicial de cópias do gene alvo de cada

tratamento (GIULIETTI et al., 2001).

A eficiência de amplificação (E) para cada primer foi calculada utilizando-se o valor

referente ao coeficiente angular da reta (Slope) (Figura 5). Para sua estimativa, foram

utilizadas curvas padrão de diluição de cDNA. Assim, foi tomado um pool de cDNAs

contendo amostras escolhidas aleatoriamente de Catuaí e Icatu. A partir deste, foram feitas as

seguintes diluições seriadas (incluindo o concentrado): 5x10-1

, 2,5x10-1

, 1,25x10-1

, 6,25x10-2

,

3,12x10-2

e 1,5x10-2

. Em função desses resultados, foi realizada uma reação de q-PCR onde se

obteve o valor de CT, relativo à concentração de cDNA de cada uma das amostras (Figura 6).

Figura 5 - Curva padrão gerada para ilustrar o cálculo de eficiência de amplificação do gene

Glutationa Redutase a partir de RNA extraído de pontas de raízes de café. Em destaque, o

coeficiente angular da reta (slope) e o valor da eficiência (E).

y = -3,6841x + 21,939E = 1,86826

0

5

10

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20

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35

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Log da Concentração

Glutationa Redutase

Y

Y previsto

Linear (Y

previsto)

38

O cálculo da eficiência de amplificação dos genes alvo e normalizador (ACT) resultou

em valores que variaram de 1,46 (Contig 6750 – CAT) a 2,09 (Actina – ACT) (Tabela 4).

Esses valores podem variar de 1 (valor mínimo) ate 2 (valor máximo e considerado ótimo)

(PFAFFL et al., 2002).

Tabela 4 - Eficiência dos genes alvo potencialmente relacionados com a resposta induzida

pela toxicidade ao Al+3

em C. arabica e normalizador calculado de acordo com o coeficiente

angular da reta (slope) (RAMAKERS et al., 2003).

Eficiência dos genes

Actina 2,0923

Catalase 1,4653

Glutationa Redutase 1,8683

Ascorbato Peroxidase 1,7857

Superoxido Dismutase 1,61

Ferritina 1,6979

Malato Dehidrogenase 1,4968

Citrato Sintase 1,7765

39

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A

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D

40

4.4.3 Quantificação relativa

Para o cálculo de quantificação relativa (QR) foi considerado que todas as moléculas

alvo com valores maiores ou iguais a dois (QR ≥ 2) foram induzidas pelo estresse abiótico

causado pelo íon Al+3

, uma vez que tais dados demonstram um aumento igual ou maior que

100% de tais moléculas nas amostras estudadas. Nas figuras 7 e 8 estão ilustradas as curvas de

amplificação e melting geradas para o gene APX, respectivamente.

Figura 7 - Curva de amplificação para o gene APX para o genótipo Icatu nos tempos 1 hora,

12 horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada tempo) gerada pelo software 7500

Fast System SDS (Sequence Detection System) v 1.3.1 (Applied Biosystems).

Figura 8 - Curva de melting para o gene APX no genótipo Catuaí nos tempos 1 hora, 12

horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada tempo).

41

O cálculo de QR para os controles negativos (sem Al+3

) das moléculas alvo nas

amostras das cultivares Catuaí e Icatu sob tratamento com Al+3

nos tempos 1 hora, 12 horas e

48 horas revelou aumento de expressão dos contigs 6750 (Catalase), 11032 (Glutationa

Redutase), 1441 (Ascorbato Peroxidase), 5351 (Superoxido Dismutase - SOD), 3026 (Malato

Dehidrogenase - MDH) e 17520 (Citrato Sintase - CS) (Tabela 5) (Figura 9).

Para a cultivar Catuaí, as enzimas SOD e MDH tiveram expressão aumentadas no

tempo 1 hora. Para as enzimas catalase e glutationa redutase os maiores valores de expressão

foram nos tempos 48 e 12 horas.

Em Icatu, o aumento da expressão do contig para a enzima SOD foi maior no tempo 1

hora, catalase e glutationa no tempo 12 horas e ascorbato, catalase e citrato sintase no tempo

48 horas.

O contig 6305 para o gene de Ferritina não apresentou QRs maiores que dois para

nenhuma das cultivares em nenhum dos tempos.

Estes resultados demonstram uma possível indução na expressão dos contigs 6750,

11032, 1441, 5351, 3026 e 17520 estudados em Coffea arabica resultante do estresse abiótico

causado pelo Al+3

.

42

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45276406

0,5

3273945

C12'

0,7

24455288

2,2

6605685

1,2

7103876

0,2

92461131

0,1

57813282

0,0

27923088

0,5

24900864

C48

7,3

65151104

0,2

75251524

0,4

10174791

0,0

42659253

0,0

06032021

0,0

47403727

0,9

15261063

C48'

3,0

84485523

0,7

18870553

0,3

24938012

0,3

0365924

0,0

00446969

0,0

13145811

1,8

76793202

I1

0,2

37940961

0,5

99047579

0,1

86531736

2,1

68619052

0,0

51013472

0,9

90982936

0,0

82387431

I1'

0,1

47414254

1,8

9884487

0,4

62166406

1,6

9551863

0,0

61476642

0,8

25021928

0,6

16403148

I12

9,6

38629857

2,0

21074821

0,8

11865414

0,0

60850744

0,1

23466793

0,0

13025079

0,3

50198439

I12

' 4,3

10258127

1,5

37201888

0,9

92968624

0,1

09169433

0,1

9670395

0,0

65859888

0,4

4637836

I48

6,3

26188758

0,3

73984136

3,2

80942022

0,8

78363885

0,1

96925057

1,3

7580918

2,5

69084707

I48

' 2,5

1989214

1,0

43865985

3,1

06134183

0,6

65559484

0,2

62130664

2,5

23712354

2,1

82825498

43

Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo

nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por Al+3

nos tempos 1 hora, 12 horas e 48 horas (C1,

C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu) (Continua).

0

2

4

6

8

10

12

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 6750 (Catalase)

0

1

2

3

4

5

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 11032 (Glutationa

Redutase)

0

1

2

3

4

5

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 1441 (Ascorbato

Peroxidase)

0

1

2

3

4

5

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 1609 (Superoxido

Dismutase)

0

1

2

3

4

5

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 3026 (Malato

Dehidrogenase)

44

‘Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo

nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por Al+3

nos tempos 1 hora, 12 horas e 48 horas (C1,

C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu) (Continuação)‟.

O cálculo de expressão diferencial entre as cultivares foi realizado e as moléculas alvo

com valores maiores ou iguais a dois nos diferentes tratamentos analisados foram

consideradas mais induzidas pelo Al+3

em uma cultivar e, portanto, consideradas envolvidas

na defesa contra o estresse oxidativo causado por este íon.

Como pode ser observado (tabelas 6 e 7), cinco dos seis contigs mostraram uma

expressão diferencial significativa. O contig para Catalase teve aumento acentuado para os

dois genótipos, em diferentes tempos. Já os contigs para ascorbato peroxidase e superoxido

dismutase demonstraram um aumento significativo na expressão na cultivar Icatu.

Os contigs 3026 e 17520 relacionados à síntese de ácidos orgânicos tiveram uma

expressão diferencial significativa para a cultivar Catuaí. O contigs 17520 teve expressão

tardia (12 e 48 horas) para a cultivar Icatu.

0

0,5

1

1,5

2

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 6305 (Ferritina)

0

1

2

3

4

5

C1 I1 C12 I12 C48 I48

Contig 17520 (Citrato

Sintase)

45

Tabela 6 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por Al+3

entre amostras de

Catuaí e Icatu sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo induzidas

pelo Al+3

com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em negrito.

Tratamentos

Similaridade 1 hora 12 horas 48 horas

Contig 6750 Catalase 4,12872517 0,030457 1,193768596

Contig 11032 Glutationa Redutase 0,556897459 0,922364 0,711936484

Contig 1441 Ascorbato Peroxidase 1,603582982 0,279921 0,669753416

Contig 1609 Superoxido Dismutase 1,633772363 0,107602 0,148856979

Contig3026 Malato dehydrogenase 3,867410193 0,210983 0,067575025

Contig 17520 Citrato Sintase 11,68592273 1,613136 0,553454577

Tabela 7 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por Al+3

entre amostras de

Icatu e Catuaí sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo induzidas

pelo Al+3

com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em negrito.

Tratamentos

Similaridade 1 hora 12 horas 48 horas

Contig 6750 Catalase 0,242205514 32,83282 0,837683286

Contig 11032 Glutationa Redutase 1,795662709 1,08417 1,404619685

Contig 1441 Ascorbato Peroxidase 0,623603525 3,572435 1,493086823

Contig 1609 Superoxido Dismutase 0,612080375 9,293493 6,717857666

Contig 3026 Malato dehydrogenase 0,713062649 4,739724 14,79836672

Contig 17520 Citrato Sintase 0,085573046 0,619911 1,806833011

Os resultados de expressão diferencial com valores maiores que dois indicam que os

genes estão sendo expressos sob a condição de estresse por Al+3

mostrando a possível relação

das enzimas APX, CAT, SOD MDH e CS no combate ao estresse causado pelo Al+3

nestas

cultivares, um balanço enzimático interno para a detoxificação interna das EROs e utilização

de ácidos orgânicos para complexação do Al+3

, mostrando diferenças de perfis enzimáticos

entre as cultivares.

46

4.5 Contigs 5351, 1441 e 6750 relacionados a detoxificação interna de espécies reativas de

oxigênio.

A rede antioxidante das plantas consiste em componentes enzimáticos, como a SOD

(que detoxifica os superoxidos), a ascorbato peroxidase e catalase (que quebram os peróxidos

em água e oxigênio). Elas são enzimas associadas com a manutenção do estado redox

constante das células (SHARMA & DIETZ, 2008).

Os dados obtidos neste trabalho confirmam os estudos da literatura, que sugerem ou

comprovam o envolvimento de enzimas do complexo anti-oxidativo de várias plantas aos

efeitos tóxicos pelo Al+3

. As enzimas APX, CAT e SOD estão potencialmente envolvidas com

vias metabólicas do estresse oxidativo, apontado como efeito secundário e resultado da

toxicidade causada por Al+3

. Cada uma delas é capaz de detoxificar o organismo de diferentes

maneiras.

Neste contexto, o estresse oxidativo pode ser considerado um efeito secundário

importante causado pelo Al+3

. É uma condição biológica gerada pelo desequilíbrio entre a

produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a desintoxicação do organismo. Para

minimizar os efeitos, as plantas possuem um sistema antioxidante, composto por moléculas

como a Superoxido Dismutase (SOD) e a Ascorbato Peroxidase (APX), que participam

ativamente da eliminação e quebra das moléculas de H2O2 e O2-•

(FOYER & NOCTOR,

2003).

Estudos genéticos para estresse oxidativo causado por Al+3

envolvendo plântulas já

foram feitos com Arabidopsis thaliana, trigo (Triticum aestivum) e em culturas de células de

tabaco. Estes estudos sugerem uma ligação entre o estresse por Al+3

e o estresse oxidativo,

uma vez que este íon induz a expressão de diversos genes codificantes de enzimas

antioxidantes (PANDA & MATSUMOTO, 2010).

O aumento de expressão ou atividade de enzimas antioxidantes tem sido descrito em

diversas culturas, como Allium cepa L. (ACHARY et al., 2008), milho (BOSCOLO et al.,

2003), triticale (LIU et al, 2008), Arabidopsis thaliana (RICHARDS et al., 1998), batata

(TABALDI et al., 2007), arroz (SHARMA & DUBEY, 2007), cevada (ŠIMONOVIČOVÁ et

al., 2004) e tabaco (YIN et al., 2010).

As plantas possuem sistemas enzimáticos de defesa para vários tipos de espécies

reativas de oxigênio, que envolvem as superoxido dismutases, catalases, ascorbato

peroxidases, glutationas redutase, etc. É bem documentado que os genes codificantes destas

enzimas são ativados em resposta ao estresse oxidativo (MILLA, et al., 2002; RICHARDS et

al., 1998; WATT et al., 2003).

47

Uma superexpressão de determinados genes induzidos pelo Al+3

podem providenciar

proteção contra o estresse ao Al+3

e em alguns casos contra o estresse oxidativo (EZAKI et

al., 2000).

O contig 5351 é similar ao gene WMnSOD (Mitochondrial Manganese Superoxide

Dismutase) de Triticum aestivum, que conferiu maior resistência aos efeitos tóxicos do Al+3

quando superexpresso em canola (B. napus) (BASU et al., 2001). Neste trabalho, a

superexpressão do gene para superoxido dismutase, levou as canolas transgênicas

apresentarem menor extravazamento de eletrólitos, menor acúmulo de MDA

(malondialdeído) e menor inibição do crescimento radicular, sugerindo um menor estresse

oxidativo nestas plantas.

Estudos com superexpressão deste gene também foram feitos em plantas de tabaco,

feito por BOWLER et al. (2001) mostram que o a quantidade de danos celulares foi menor

quando comparado e o nível de proteção contra o estresse oxidativo aumentou.

A metaloenzima superoxido dismutase (SOD) catalisa a dismutação dos radicais

superoxidos em oxigênio e peróxido de hidrogênio, agindo na linha de frente contra as EROs.

Estes radicais são produzidos em qualquer compartimento onde tenha uma cadeia de

transporte de elétrons e por esse motivo, as SODs são encontradas em vários compartimentos

celulares (mitocôndria, peroxissomos ou citosol) (ALSCHER, 2002).

Os resultados encontrados no nosso trabalho sugerem uma elevada quantidade de

radical superoxido, uma vez que a expressão da enzima SOD foi elevada para a cultivar Icatu.

A grande quantidade destes radicais se dá principalmente quando as concentrações de Al+3

interferem fortemente no crescimento radicular das plantas (ŠIMONOVIČOVÁ et al., 2004).

Um aumento na atividade da SOD também foi encontrada nos trabalhos de CAKMAK &

HORST (1991) com soja, Arabidopsis thaliana (RICHARDS et al., 1998) e raízes de sorgo

(PEIXOTO et al., 1999).

Uma maior quantidade de SOD leva a uma superprodução e ao acúmulo de radicais

peróxidos de hidrogênio, que são citotóxicos e em excesso podem causar danos celulares.

Assim, um aumento na expressão das enzimas APX e CAT (que possuem grande afinidade

com estes radicais) ajuda no processo de detoxificação interna.

O balanço enzimático entre a SOD e diferentes enzimas de detoxificação interna é

considerado crucial na determinação de um nível basal de O2-

e H2O2. Então a expressão

maior dos contigs 1441 e 6750 (APX e CAT) indicam este balanço interno de proteção contra

as EROs e a quebra dos radicais peróxidos acumulados. Em um estudo com genótipos

tolerante e sensível de trigo, DARKÓ et al. (2004) mostraram que as três enzimas

48

apresentavam uma maior atividade em resposta ao estresse por Al+3

, mostrando a estreita

ligação dentro da rede antioxidativa celular.

Dentre as vias metabólicas importantes para a detoxificação interna de espécies

reativas de oxigênio, o ciclo da Ascorbato-Glutationa é o principal deles (APEL & HIRT,

2004). A APX tem um papel essencial na proteção das células em plantas superiores, algas e

outros organismos (GILL & TUTEJA, 2010).

Ela usa duas moléculas de ascorbato (utilizado como doador de elétrons) para reduzir

uma molécula de peróxido, com a concomitante formação de duas moléculas de

monodehidroascorbato (APEL & HIRT, 2004). Estudos feitos por PASTORI et al. (2003)

mostraram que o ascorbato regula a expressão de genes de defesa das plantas e modula o

crescimento de desenvolvimento via sinalização por fitormonios.

Neste trabalho, foi possível notar uma expressão aumentada no tempo de 12 horas na

cultivar Icatu, sugerindo um papel importante na detoxificação de peróxidos sob as condições

de estresse propostas neste genótipo, como suposto em CONKLIN et al. (2000), onde

mutantes deficientes em ácido ascórbico de Arabidopsis thaliana apresentaram-se

hipersensíveis a estresse ambiental. Em estudos com plântulas em fase de germinação de

abóbora (Cucurbita pepo L.) (DIPIERRO et al., 2004) e trigo (DE GARA et al., 1997) a

atividade da ascorbato peroxidase foi medida sob estresse com Al+3

, em que, nestes estudos,

foi maior.

O aumento na atividade da APX indica uma elevada produção de H2O2 aumentada

pelo Al+3

em tecido de raiz. Esta suposição parte do princípio de que a atividade desta enzima

e da catalase sejam elevadas. Esta sugestão já foi feita por MIZUNO et al. (1988), onde essas

enzimas agiriam protegendo a célula e suas organelas.

A APX possui uma alta afinidade para o peróxido (taxas de µM), mais do que as

catalases (intervalo de mM) e outras peroxidases, e é capaz de detoxificar baixas

concentrações de H2O2 (WANG et al., 1999).

A Catalase é uma enzima importante para a tolerância ao estresse oxidativo, uma vez

que em plantas de tabaco transgênicas com CAT suprimida tem níveis aumentados de EROs

em resposta a estresses bióticos e abióticos (CHAMNONGPOL et al., 1998).

O contig 6750 é similar ao gene codificante de catalase, enzima antioxidante que tem

o potencial de dismutar diretamente o H2O2 em O2 e H2O e é indispensável para a

detoxificação interna das espécies reativas de oxigênio (GILL & TUTEJA, 2010), radicais

esses gerados nos peroxissomos pelas oxidases envolvidas na β-oxidação de ácidos graxos e

fotorespiração.

49

O aumento de expressão da Catalase nos primeiros tempos para as duas cultivares

pode ser explicado pela grande disponibilidade de peróxidos difusos nos compartimentos

celulares, levando a sua indução. Esse aumento de atividade contribui para uma efetiva

redução dos danos oxidativos nas raízes durante a fase de germinação, uma vez que os

radicais peróxidos estão sendo quebrados ativamente pela CAT (LI et al., 2010).

Seu posterior decréscimo no tempo de 48 horas pode estar envolvido a alta

concentração de Al+3

, que pode levar a uma inibição da síntese da enzima ou a uma mudança

conformacional das subunidades enzimáticas, como descrito por USHIMARU et al. (1999).

Resultados assim foram descritos por SHARMA & DUBEY (2007), em que plântulas de

arroz cultivadas a 80 µM tiveram um aumento da atividade enzimática, diferente daquelas

cultivadas a 160 µM, cujos valores de atividades foram menores. Em pimenta (Capsicum

annuum L.), o gene CaCat1 isolado foi induzido pelo estresse Al+3

em raiz, sugerindo que a

toxicidez induz ao estresse oxidativo.

A regulação do metabolismo enzimático antioxidante em plantas é altamente

complexa, envolve uma série de enzimas com várias isoformas que atuam em diferentes

compartimentos celulares. O funcionamento desse sistema ainda não está bem esclarecido,

mas existem evidencias de sistemas compensatórios entre os diferentes sistemas antioxidantes

(BLOKHINA et al., 2003).

As diferenças quanto a tolerância entre os genótipos pode ter explicação para as

diferentes vias de defesa ao estresse. RODRIGUES et al. (2006) mostraram que os genótipos

Catuaí e Icatu apresentam diferentes mecanismos para adaptação ao Al+3

. O primeiro manteve

inalteradas as concentrações de Al+3

nas folhas, mas as concentrações radiculares aumentaram

com a crescente saturação de Al+3

, enquanto que o segundo manteve as concentrações

radiculares de Al+3

fixas. Isso mostra que, em Catuaí, mecanismos de compartimentalização e

exclusão estão atuando na raiz, ao passo que, em Icatu, mecanismos de tolerância, como a

ação de enzimas antioxidantes, estão agindo no mesmo órgão.

Os contigs relacionados ao estresse oxidativo relacionados à tolerância de Coffea

arabica sofrem maior indução após 12 horas de tratamento, com exceção para a superoxido

dismutase que mantém o perfil no tempo 48 horas. Esses resultados reforçam a relação do

estresse causado pelo Al+3

com o estresse oxidativo e sugerem que as respostas celulares

relacionadas a oxidação estão mais presentes em Icatu. Esta cultivar em presença do Al+3

apresentou maior eficiência do sistema antioxidativo, exibindo maior atividade das enzimas e

evidenciando uma forma de proteger as células contra a formação de espécies reativas de

oxigênio.

50

As enzimas APX, SOD e CAT possuem um papel importante de combate as espécies

reativas de oxigênio e o aumento de expressão delas mostra que os mecanismos de tolerância

estão agindo em ação ao estresse causado por Al+3

.

4.6 Contigs 3026, 17520 relacionados a utilização de ácidos orgânicos.

Os mecanismos de defesa ao Al+3

baseiam-se na formação de complexos com

carboxilatos (KOCHIAN et al., 2005). Nos processos apoplásticos, a defesa contra o Al+3

,

mediada pela exsudação de ácidos orgânicos e outros compostos, parece ser o mais comum

como descrito por diversos autores, como TAYLOR (1988), MIYASAKA et al. (1991),

DELHAYZE & RYAN (1995), KOCHIAN et al. (2005), entre outros. Esse mecanismo é

baseado na liberação de ácidos orgânicos através de canais ligados ao Al+3

na membrana

plasmática, que possuem a capacidade em complexar os íons Al+3


A primeira evidencia na literatura de resistência ao Al+3

mediada por ácido orgânico

foi descrita por MIYASAKA et al. (1991), que demonstraram que cultivares de feijão

(Phaseolus vulgaris) tolerantes ao Al+3

excretavam oito vezes mais citrato que os genótipos

sensíveis. O citrato é um importante quelador do Al+3

e o complexo Al-carboxilato não é

absorvido pelas raízes. A partir disso, estudos de caracterização funcional tem sido realizados

em diferentes culturas a fim de relacionar a superexpressão de genes relacionados com a

síntese, transporte e exsudação de ácidos orgânicos (OAs) com o aumento da tolerância de

plantas à toxicidade do íon Al+3

.

O contig 3026 é similar ao gene NeMDH (Nodule Enhanced Malate Dehydrogenase)

de Medicago sativa (TESFAYE et al., 2001) que codifica a enzima metabólica malato

dehidrogenase (EC number 1.1.1.37), envolvida na síntese de malato. Esse processo químico

consiste na carboxilação do fosfoenolpiruvato (via fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC) a

oxaloacetato, com adicional formação de ATP. O oxaloacetato então é reduzido a malato pela

enzima malato dehidrogenase, que é armazenado como ácido málico nos vacúolos (KENYON

et al., 1985).

Plantas transformadas de alfafa (M. sativa) para o gene codificante da enzima malato

dehidrogenase submetidas a estresse por Al+3

mostraram um aumento na atividade da enzima,

na concentração e no número de transcritos (TESFAYE et al., 2001). Em plantas transgênicas

de tabaco superexpressando MDH, houve um aumento significante na exsudação de malato

em comparação com as plantas não transformadas; as plantas transformadas também

mostraram uma forte tolerância ao Al+3

em comparação com as outras (WANG et al., 2010) e,

em um estudo feito por LÜ et al. (2012), esta mesma espécie superexpressando MDH

51

mitocondrial mostrou um aumento na absorção de fósforo, em comparação com as plantas

selvagens. A eficiência da utilização do fósforo geralmente é baixa em solos ácidos, uma vez

que este ânion se liga a moléculas de Al+3

, precipitando-as. A melhor absorção de P está

associada a superexpressão de malato, uma vez que este OA a uma eficiente quelação dos

íons Al+3

.

Embora uma rápida liberação de malato seja observada em diferentes plantas, estudos

mostram que uma diferença de fase pode existir entre a exposição de raízes ao Al+3

e a

exsudação de ácidos orgânicos (DENG et al., 2009). LI et al. (2000), em raízes de centeio,

observaram uma diferença de 10 horas entre a exposição e liberação de citrato.

Além do malato, o citrato está envolvido na amenização da toxicidade do Al+3

. O

efluxo ou acumulação de citrato pode ser reforçado pelo aumento de enzimas envolvidas na

síntese deste AO, como a citrato sintase (CS) (EC number 2.3.3.1).

O contig 17520 é semelhante ao gene citrate synthase, enzima chave envolvida na

condensação de oxaloacetato (OAA) e acetil CoA para produzir citrato:

acetil-CoA + H2O + oxaloacetato Citrato + CoA

(EXPASY, Bioinformatic Resource Portal, 2012)

A exsudação de citrato (ânion citrato tricarboxílico) é vista num grande número de

espécies, como em soja (SHEN et al., 2005), Lupinus albus (GERKE et al., 2007; WANG et

al., 2007) e feijão (Phaseolus vulgaris L.) (RANGEL et al., 2007) e a capacidade de quelar o

Al+3

é muito maior que o malato (malato dicarboxílico): valores de 9.6 e 5.7 para formação de

Al:citrato e Al:malato; desta maneira, o citrato é mais efetivo na detoxificação do Al+3

comparado ao malato (KOCHIAN et al., 2004).

Estudos de transformação genética mostram com o gene codificante de CS tem papel

importante na tolerância ao Al+3

. ANOOP et al. (2003) mostraram que canola (Brassica napus

cv. Westar) superexpressando gene de CS de Arabidopsis apresentavam aumento no efluxo de

citrato e conseqüente aumento na resistência ao Al+3

, assim como em plantas de tabaco,

mamão (de la FUENTE et al., 1997) e em Nicotiana benthamiana (DENG et al., 2009).

BARONE et al. (2008) introduzindo em alfafa o gene de CS de Pseudomonas aeruginosa

observaram que plantas transgênicas apresentavam uma tolerância maior que as não

modificadas. A maior tolerância encontrada nestas culturas a partir da superexpressão deste

gene leva a uma promissora utilização da técnica em plantas agronomicamente úteis.

Os três ácidos orgânicos descritos (oxalato, citrato e malato) possuem perfis de

quelação próprios, com diferentes habilidades para isso. A partir disso, dois tipos de padrões

para a secreção de ácidos orgânicos têm sido identificados, de acordo com o tempo entre

52

exposição – secreção: o padrão I, em que não há diferença de tempo entre a adição de Al+3

e o

começo da secreção do ácido (resposta rápida); e o padrão II, em que existem algumas horas

de diferença entre os dois eventos (MA et al., 2001). Para este estudo é possível notar que o

padrão I age em C. arabica, indicando que o Al+3

ativa canais iônicos pré-existentes e que a

indução dos genes não é requerida.

A exsudação de citrato e malato esta ligada tanto a produção pelas enzimas MDH e CS

como pelo transporte, por meio dos transportadores de malato e citrato (ALMT e ALCT), que

desempenham o papel de liberação dos ácidos orgânicos, pertencentes a família MATE

(Multidrug and Toxic Compound Extrusion). Essa família é formada por um grupo de

transportadores de proteínas em um largo e diverso grupo de células procarióticas e

eucarióticas (RYAN et al., 2010). Muitos parecem funcionar como carreadores secundários,

para remover compostos orgânicos do citosol.

De acordo com os mecanismos de defesa propostos, a expressão diferencial dos

contigs 3026 e 17520 na cv. Catuaí no tempo de 1 hora sugere sua possível relação com a

tolerância desta cultivar (nas condições propostas) aos efeitos tóxicos do Al+3

por meio da

complexação do metal no citosol e, que nesta cultivar, mecanismos de compartimentalização

do Al+3

podem estar agindo.

A partir dos resultados obtidos, ficam claros os efeitos do Al+3

nas duas cultivares,

induzindo estresse e danos celulares, que são amenizados por moléculas, como enzimas e

ácidos orgânicos, evitando danos maiores à planta.

Após a caracterização funcional, estes genes poderão ser utilizados em ensaio em

plantas transgênicas ou projetos de seleção assistida. Estudos de controle genético da

tolerância, número de genes que influenciam a característica e a herdabilidade já foram feitos

em outras culturas. Trabalhos nesse sentido são necessários para o melhoramento do cafeeiro

a tolerância ao Al+3

, em que os diferentes mecanismos de respostas envolvidos na tolerância

ao Al+3

podem ser a chave, em função de cada gene diferencialmente expresso nas cultivares.

53

5 CONCLUSÕES

1. A expressão dos genes de catalase, ascorbato peroxidase, glutationa redutase,

superoxido dismutase, malato dehidrogenase e citrato sintase de Coffea arabica é

induzida pelos efeitos tóxicos do íon Al+3

principalmente no período de 12 horas.

2. Os genes de catalase, ascorbato peroxidase e superoxido dismutase de C. arabica

pertencentes ao banco de dados do PBGC possuem maior expressão relativa no tempo

de 12 horas na cultivar Icatu quando comparada com a cultivar Catuaí, demonstrando

as relações dos mecanismos de exsudação de ácidos orgânicos e estresse oxidativo de

C. arabica aos efeitos tóxicos causados pelo íon Al+3

.

3. A maior expressão relativa dos genes de catalase, ascorbato peroxidase e superoxido

dismutase indica a maior atividade de vias antioxidantes na cv. Icatu em resposta aos

efeitos tóxicos do Al+3

presente no sistema radicular. A expressão diferencial destes

genes constitui uma evidência genética que relaciona o estresse oxidativo com o

causado pelo íon Al+3

.

4. Os genes codificantes das enzimas malato dehidrogenase e citrato sintase de C.

arabica pertencentes ao banco de dados do PBGC possuem maior expressão relativa

no tempo 1 hora na cultivar Catuaí quando comparada a Icatu, demonstrando os

diferentes mecanismos de defesa aos efeitos tóxicos do Al+3

em C. arabica.

5. A expressão relativa dos genes de malato dehidrogenase e citrato sintase na cultivar

Catuaí indica que um mecanismo de síntese e exsudação de ácidos orgânicos constitui

em um mecanismo de tolerância induzido em Coffea arabica sob estresse induzido por

Al+3

.

6. A maior expressão relativa dos genes de catalase, ascorbato peroxidase e superoxido

dismutase na cultivar Icatu em relação a cultivar Catuaí sugere que no primeiro

genótipo mecanismos de tolerância estão agindo nas raízes, enquanto que a maior

expressão relativa de malato dehidrogenase e citrato sintase na cultivar Catuaí em

relação a Icatu indica mecanismos de resistência.

7. Diante dos resultados, estudos de caracterização funcional dos genes identificados no

presente estudo e descritos acima são necessários em plantas adultas em condições

reais de cultivo para esclarecimentos sobre seus papéis nos mecanismos antioxidativos

de combate as espécies reativas de oxigênio de C. arabica ao estresse abiótico causado

pelo íon Al+3

.

54

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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EXPRESSÃO DIFERENCIAL PARA A TOLERÂNCIA A … · dispensou de suas horas para que o trabalho se...

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