UNIVERSIDAD DE CHILE Doctorado en Nutrición y Alimentos

Programa Interfacultades

En

UNIVERSIDAD DE CHILE Doctorado en Nutrición y Alimentos

“Evaluación de la biodiversidad de Pseudomonas

alterantes de pollos refrigerados y su sensibilidad frente a Lactobacillus, potenciales

bio-preservantes de la carne de ave”

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Doctor en Nutrición y Alimentos

Programa Interfacultades

Facultad de Ciencias Agronómicas, Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas, Facultad de Medicina, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias e Instituto de Nutrición y Tecnología de Alimentos

Por Pabla Alejandra Morales Muñoz

Agosto, 2019

Director de Tesis Profesora: María Antonieta Valenzuela Pedevila

Co-director de Tesis Profesor:

Guillermo Figueroa Gronemeyer

Santiago, 2019

EVALUACIÓN DE LA BIODIVERSIDAD DE PSEUDOMONAS ALTERANTES DE POLLOS REFRIGERADOS Y SU SENSIBILIDAD FRENTE A

LACTOBACILLUS, POTENCIALES BIO-PRESERVANTES DE LA CARNE DE AVE

Por

PABLA ALEJANDRA MORALES MUÑOZ

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Grado Académico de Doctor en Nutrición y Alimentos

COMITÉ DE TESIS

DIRECTOR DE TESIS

Prof. Dra. María Antonieta Valenzuela P.

CO-DIRECTOR DE TESIS

Prof. Guillermo Figueroa G.

Jubilado

COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS

Prof. Dra María Sol Morales S.

Prof. Dra. María Angélica Ganga M.

Prof. Dr. Martín Gotteland

Prof. Luis López V.

Jubilado

FECHA DE APROBACIÓN

ii

Para mi hija… Que me ha hecho estudiar más

que cualquier doctorado. Te amo.

iii

Agradecimientos

Agradezco a mi querido profesor guía, Guillermo Figueroa, quien me entregó su conocimiento y apoyo durante todos estos años de tesis doctoral; quien me rechazó en primera instancia como tesista, pero que finalmente, con insistencia, convencí; con quien disfruté las discusiones que enriquecieron la investigación (y mi vida también); quien me enseñó a escribir documentos científicos (no “cuentos”). En resumen, a quien debo gran parte de mi formación como investigadora en el área de la inocuidad de los alimentos. Muchas muchas gracias por todo profe!

Agradezco a la profesora MAV, por haber aceptado ser la directora de esta tesis. Aún recuerdo, con cariño, su empatía con nosotros (los alumnos) el primer semestre de doctorado, donde nos alentaba cuando estábamos cansados.

Agradezco al comité de tesis, sin duda, sus comentarios fueron un aporte a la investigación y manuscrito. Mención especial a mi querida profesora, Dra. María Sol Morales, por su paciencia, motivación, criterio y aliento; ha sido un privilegio poder contar con su guía y ayuda, incluso desde antes de comenzar el doctorado.

Agradezco a CONICYT por su apoyo financiero durante el desarrollo de mi doctorado a través de la beca de doctorado nacional y de apoyo a la tesis doctoral.

Agradezco a la Comisión Chilena de Energía Nuclear (CChEN) por la irradiación de la carne de pollo, necesaria para algunos ensayos.

Agradezco, con especial cariño, a Miriam Troncoso, por compartir conmigo su conocimiento, experiencia en ensayos de laboratorio (varios incluidos en la tesis) y en la vida. Muchas gracias por sus palabras, paciencia, apoyo, empuje, cariño y humildad. A usted debo, también, gran parte de mi formación técnica en laboratorio y como investigadora. Estoy segura de que seguiremos en contacto.

Agradezco afectuosamente al Dr. Juan Aguirre, por su apoyo en esta investigación, por prestarme sus equipos y laboratorio, y por sus entretenidas (y dispersas) conversaciones intelectuales y debate de futuros proyectos.

Agradezco inmensamente el apoyo y cariño del personal, que es y fue parte del Laboratorio: Isita, María Elena, Paty, Fran, Rosita, Pata, Don Cris y José Luis. Todos ellos hicieron más grata mi estadía en el Laboratorio, y además, me facilitaron la vida, colaborando en la realización de un sinfín de ensayos.

Agradezco a mis amigos por estar ahí para compartir las angustias y gratificaciones durante estos largos y montañosos años de doctorado. En especial gracias a Marce, por empujarme en la aventura del doctorado.

Agradezco a toda mi familia por entenderme (o hacer el intento) y apoyarme en estos años; en especial a mi querida Madre, por estar ahí siempre que la necesito, y cuidar de lo más preciado que tengo, mi hija.

Y por encima de todo y con todo mi corazón, agradezco a José, mi compañero, amigo y “mejor” ayudante de laboratorio, por tu eterna paciencia y empatía en las buenas y en las malas. Comparto, en especial, contigo este logro, ya que sin tu apoyo hubiese sido mucho más difícil sortear las dificultades acontecidas durante el desarrollo de esta tesis. Este logro es mio, pero también nuestro. Te amo…

iv

ÍNDICE DE MATERIAS

Agradecimientos iii

Índice de materias iv

Lista de Tablas vii

Lista de Figuras ix

Lista de símbolos, abreviaturas o nomenclatura xiii

Resumen xvi

Abstract xvii

INTRODUCCIÓN 1

ANTECEDENTES 3

1- La industria avícola nacional 3

1.1.- Limitantes de la industria avícola nacional 5

2.- Deterioro microbiológico de la carne de pollo 6

2.1.- Bacterias alterantes 8

2.1.1. Pseudomonas 9

3.- Bio-preservación 12

3.1.- Bacterias ácido lácticas (BALs) 13

3.1.1.- Ácidos orgánicos. 13

3.1.2.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) 14

3.1.3.- Diacetilo 15

3.1.4.- Reuterina 16

3.1.5.- Bacteriocinas 16

3.2.- Requisitos para seleccionar BALs como biopreservante 18

3.3.- Evidencia in vitro e in situ de BALs con actividad antimicrobiana sobre diferentes bacterias patógenas y alterantes.

18

3.3.1.- Estudios in vitro 18

3.3.2.- Estudios in situ realizados en cecinas 19

3.3.3.-Estudios in situ realizados en carne de vacuno y ave cruda 20

HIPÓTESIS 23

OBJETIVO GENERAL 23

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23

MATERIALES Y MÉTODOS 24

1.- Diseño experimental 24

v

2.- ETAPA 1: Prevalencia, aislamiento, identificación y caracterización de Pseudomonas spp. alterantes

24

2.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado 25

2.2- Selección e identificación molecular de las especies de Pseudomonas dominantes

26

2.3- Caracterización genotípica de Pseudomonas. 27

2.4- Caracterización fenotípica de Pseudomonas 29

3.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro. 30

3.1.- Caracterización molecular Lactobacillus ssp y selección de cepas no clonales

30

3.2.- Prueba de inhibición selectiva “spot en doble capa” (SDC) 31

3.3.- Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC. 33

3.4.- Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio

35

3.5.- Aproximación a la inocuidad de las cepas de Lactobacillus spp. 36

3.5.1.- Prueba de hemólisis 36

3.5.2.- Prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar: 36

4.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión

de vida útil de la carne de pollo. 37

4.1.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC. 37

4.2.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC. 39

4.3.- Determinación de la estabilidad microbiológica de la carne fresca inoculada con el potencial bio-preservante L sakei 63.

42

4.4.- Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808 43

4.4.1.- RAPD 43

4.4.2.- PFGE 43

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45

1.- ETAPA 1: Prevalencia, aislamiento, identificación y caracterización de Pseudomonas spp. alterantes.

45

1.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado. 45

1.2- Selección e identificación molecular de las especies de Pseudomonas dominantes.

45

1.3- Caracterización genotípica de Pseudomonas. 46

1.4- Caracterización fenotípica de Pseudomonas. 49

1.5.- Comentario final de la etapa 1. 54

1.6.- Publicaciones derivadas de la etapa 1. 54

2.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro. 55

2.1.- Selección y caracterización molecular Lactobacillus ssp 55

2.2.- Prueba de inhibición selectiva “spot en doble capa” (SDC). 55

vi

2.3.- Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC. 59

2.4. Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio.

62

2.5.- Aproximación a la inocuidad de las cepas de Lactobacillus. 62

2.5.1.- Prueba de hemólisis 62

2.5.2.- Prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar: 62

2.6.- Presentaciones derivadas de la etapa 2. 64

3.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión de vida útil de la carne de pollo.

66

3.1. Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC. 66

3.2. Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC. 68

3.3. Determinación de la estabilidad microbiológica de la carne fresca inoculada con el potencial bio-preservante L sakei 63.

75

3.4. Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808 76

3.4.1. RAPD 76

3.4.2. PFGE 77

3.5. Publicaciones derivadas de la etapa 3. 77

CONCLUSIONES 78

PROYECCIÓN FUTURA 79

BIBLIOGRAFÍA 80

ANEXOS 97

vii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1: Distancias y tiempos de navegación desde el puerto de Valparaíso a otros puertos en el extranjero.

6

Tabla 2: Sustratos usados por bacterias alterantes de carne envasada en aerobiosis.

11

Tabla 3: Sustratos y reacciones necesarias para la formación de H2O2 en bacterias lácticas

15

Tabla 4: Información de las muestras (bandejas de filetes de pechuga de pollo marinado al 15%) utilizadas para evaluar la carga total de Pseudomonas spp. y RAP.

25

Tabla 5: Secuencias específicas de oligonucleótidos usados como

partidores en PCR múltiple para la identificación molecular de Pseudomonas putida, fragi y lundensis.

26

Tabla 6: Secuencias específicas de oligonucleótidos usados como partidores en PCR específica para la identificación molecular de Pseudomonas fluorescens.

27

Tabla 7: Condiciones de PCR múltiple y específica utilizados para la identificación de especies de Pseudomonas.

27

Tabla 8: Condiciones ensayadas en la estandarización de la

amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), para caracterizar genéticamente a Pseudomonas alterantes de carne de pollo, utilizando 2 partidores: M13 (5´-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

28

Tabla 9: Condiciones de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`), establecidas para caracterizar genéticamente a los aislados de Pseudomonas alterantes de carne de pollo.

28

Tabla 10: Criterios de interpretación de la sensibilidad a antibióticos mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar para no enterobacterias.

29

Tabla 11: Condiciones ensayadas en la estandarización de la

amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) y su electroforesis, para caracterizar genéticamente a Lactobacillus spp. potenciales bio-preservantes, utilizando el partidor M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`; 15 mer) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

30

Tabla 12: Condiciones de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`), establecidas para caracterizar genéticamente a Lactobacillus spp. potenciales bio-preservantes.

31

viii

Tabla 13: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 en la prueba de inhibición en caldo TSBYE a 8 ± 2 ºC durante 4 días.

34

Tabla 14: Condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,

Polymerase Chain Reaction) utilizadas para la amplificación del gen 16S rRNA de los Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio, y su posterior identificación molecular.

36

Tabla 15: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 en la prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ± 2 ºC durante 4 días.

39

Tabla 16: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes en la prueba de antagonismo in situ en carne fresca de pollo a 8 ± 2 ºC durante 4 días.

40

Tabla 17: Perfil de resistencia a antibióticos de Lactobacillus 63 y B, potenciales bio-preservantes, y cepas de referencias L. sakei CECT 4808 y L. rhamnosus LGG obtenidos mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.

63

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribución de la producción nacional de carne según especie, 2017.

3

Figura 2: Evolución de la producción de carne de ave por especie (toneladas), 2008-2017.

4

Figura 3: Evolución de la exportación de carne de ave no procesada en valor FOB, 2009-2017.

5

Figura 4: Composición de la microbiota alterante de carne de pollo (carcasa o pechuga) deteriorado a 4 y 10 ºC.

9

Figura 5: Modo de acción de las bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas (BALs).

17

Figura 6: Diseño experimental de la investigación “Evaluación de la biodiversidad de Pseudomonas alterantes de pollos refrigerados y su sensibilidad frente a Lactobacillus, potenciales bio-preservantes de la carne de ave”.

24

Figura 7: Preparación de la prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC. a) Bolsa de polietileno con 100 cubos (≈1 cm3) de pechugas de pollo, sin marinar, inoculados con 10 mL de tratamiento láctico (≈108 UFC/cm2). b) 10 cubos de carne de pollo, pre-inoculados con el tratamiento láctico (≈108 UFC/cm2), en placas petri que fueron incubadas a 8 ± 2ºC durante 4 días.

41

Figura 8: Especies de Pseudomonas dominantes en filetes de pechuga de pollo marinados sin piel deteriorados a 4 ºC durante 11 días en promedio (n=42).

46

Figura 9: Bandas de los perfiles electroforéticos de diferentes aislados de Pseudomonas predominantes aislados en filetes de pollo marinados

deteriorados a 4 ºC, en geles de agarosa al 1,8%, obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con 2 partidores diferentes: a) M13 (5´-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

47

Figura 10: Dendogramas de similitud genética de Pseudomonas predominantes aisladas a partir de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie, obtenidos mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, del inglés Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages) a partir del coeficiente de Dice, calculado según la posición de las bandas de los perfiles electroforéticos obtenidos por Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3). a) 24 P. fragi; b) 14 P. fluorescens; c) 3 P. lundensis; d) 1 Pseudomonas spp.

48

x

Figura 11: Dendogramas de similitud fenotípica de Pseudomonas predominantes aisladas a partir de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie, obtenido mediante el análisis de promedio ponderado (WAG, del inglés Weighted average linkage) a partir del coeficiente Simple Matching (Distancia SM) calculado en base a la presencia/ausencia de las variables: capacidad biosurfactante, proteolítica, lipolítica, lecitinasa y de replicación a 37 ºC. a) 24 P. fragi; b) 14 P. fluorescens; c) 3 P. lundensis; d) 1 Pseudomonas spp.

50

Figura 12: Susceptibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol-Trimetoprim, Polimixina B, Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas alterantes

dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie y en total, mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.

53

Figura 13: Perfiles de sensibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol-Trimetoprim, Polimixina B, Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas alterantes dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.

53

Figura 14: Bandas de los perfiles electroforéticos de Lactobacillus spp.,

obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con 2 partidores diferentes: A) M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`) y B) Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

55

Figura 15: Dendograma de asociación de 54 Lactobacillus spp. obtenido mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages) a partir del coeficiente de Dice calculado según la posición de las bandas de los perfiles electroforéticos obtenidos por Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3) y tamaño de halo de inhibición (HI) frente a Salmonella enteritidis ATCC 2190 y Listeria monocytogenes ATCC 19114 utilizando

prueba de spot con doble capa en agar MRS con bicarbonato al 2%, modificado, sin sustancias inhibidoras de Gram negativos (acetato de sodio, citrato de amonio).

56

Figura 16: Halos de inhibición ejercidos por 2 cepas de Lactobacillus spp., X e Y, sobre Pseudomonas lundensis 12.1 en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (izquierda) y con bicarbonato al 2% (derecha).

57

Figura 17: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 Lactobacillus sobre 10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de pollo, en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2% (MRSm+bic; azul).

57

Figura 18: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas antagonizadas por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio,

58

xi

citrato de amonio) no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2% (MRSm+bic; azul).

Figura 19: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 Lactobacillus sobre 10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de pollo, en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) con bicarbonato al 2%.

58

Figura 20: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas antagonizadas por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) con bicarbonato al 2%.

59

Figura 21: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 5 tratamientos lácticos, inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8 log UFC/mL) durante 6 días, en prueba de inhibición competitiva en caldo TSBYE a 8 ºC.

60

Figura 22: Recuentos medios de Lactobacillus desafiantes de P. fragi 1.1, inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8 log UFC/mL, en prueba de inhibición competitiva en caldo TSBYE a 8 ºC durante 6 días.

61

Figura 23: Hemolisis α o incompleta de L. rhmanosus B, L. sakei 63 y CECT 4808, usado como control, en agar Columbia 5% sangre de cordero.

62

Figura 24: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 3 tratamientos lácticos, co-inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes concentraciones iniciales, almacenados a 8 ºC durante 4 días.

66

Figura 25: Recuentos medios de Lactobacillus desafiantes de P. fragi 1.1,

co-inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes concentraciones iniciales, almacenados a 8 ºC durante 4 días.

67

Figura 26: Recuentos medios de Pseudomonas spp. en carne de pollo fresca, inoculada con 3 tratamientos lácticos diferentes, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

70

Figura 27: Recuentos medios de Enterobacterias en carne de pollo fresca inoculada con 3 tratamientos lácticos diferentes, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

70

Figura 28: Recuentos medios de Lactobacillus, potenciales bio-preservantes, inoculados en carne de pollo fresca, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

71

Figura 29: Fluorescencia emitida por Pseudomonas fluorescens y/o putida en carne de pollo bio-preservada con diferentes Lactobacillus, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, posterior a 4 días de almacenamiento a 8 ºC, observada bajo luz UV.

71

Figura 30: Rutas metabólicas de Lactobacillus sakei para la producción

de metabolitos antibacterianos. 74

Figura 31: Horas de estabilidad microbiológica, en promedio (rojo) y en cada réplica (amarillo y azul), de la carne de pollo inoculada con diferentes

75

xii

tratamientos lácticos, potenciales bio-preservantes, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

Figura 32: Bandas de los perfiles electroforéticos de Lactobacillus sakei nacional 63 y español, CECT 4808, en geles de agarosa al 1,8%, obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con partidor aleatorio Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

76

Figura 33: Dendograma de asociación de perfiles electroforéticos de Lactobacillus sakei 63, CECT 4808 y ATCC 15521, obtenidos por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE, Pulsed-field gel electrophoresis), digeridos por la enzima SmaI.

77

xiii

LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS O NOMENCLATURA

ADN: Ácido desoxirribonucleico

AN: Agar nutritivo

APA: Asociación de Productores Avícolas

ASOHUEVO: Asociación de Productores de Huevos

ATCC: American Type Culture Collection (Cultivos tipo de la colección americana)

ATP: Adenosín trifosfato

Aw: Actividad de agua

BAL: Bacteria ácido láctica

BSA: Bovine serum albumin (Albumina de suero bovino)

CCHEN: Comisión Chilena de Energía Nuclear

CECT: Colección Española de Cultivos Tipo

CFC: Agar Cefalotina, Fusidina y Cetrimida

CIM: Concentración inhibitoria mínima

Cip: Ciprofloxacino

CLSI: Clinical & Laboratory Standards Institute (Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio)

CO2: Dióxido de carbono

DE: Desviación estándar

DO: Densidad óptica

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético

EFSA: European Food Safety Authority (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria)

EPS: Exopolisacárido

FAO: Food and Agriculture Organization (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura)

GAD: Arginina deiminasa

GRAS: Generally recognized as safe (Generalmente reconocido como seguro)

H2O2: Peróxido de hidrógeno

HACCP: Hazard Analysis Critical Control PoinT (Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control)

ICMSF: Comisión Internacional de Especificaciones Microbiologicas en Alimentos (International Commission on Microbiological Specifications for Foods)

INN: Instituto Nacional de Normalización

INTA: Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos

xiv

L252: Lactobacillus 252

L63: Lactobacillus 63 (nacional; aislado en la presente tesis)

LB: Lactobacillus B

LDH: Deshidrogenasa láctica

MH: Agar Müller Hinton

MLGM: Modelo lineal general y mixto

MRS: Agar/Caldo De Man, Rogosa, Sharpe

MRS-BICm: MRS-bicarbonato al 2% modificados

MRSm: MRS modificado

NAD+: Nicotinamida adenina dinucleótido oxidado

NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido reducido

NADP+: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado

NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido

O2: Oxígeno

ºC: Grados Celsius

ODEPA: Oficina de Estudios y Políticas Agrarias

OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos)

OMS: Organización Mundial de la Salud

PCA: Agar plate count

PCR: Reacción de la polimerasa en cadena

PFGE: Electroforésis de campo pulsado

pKa: Constante de disociación ácida

Pol B: Polimixina B

P.: Pseudomonas

QPS: Qualified presumption of safety (Presunción Cualificada de Seguridad)

RAM: Recuento de aerobios mesófilos

RAP: Recuento de aerobios psicrótrofos

RAPD: Amplificación aleatoria del ADN polimórfico

S.A.: Sociedad anónima

SAG: Servicio Agrícola y Ganadero

SDC: Spot en doble capa

SOD: Superóxido dismutasa

SOMICH: Sociedad de Microbiología de Chile

spp: Se refiere a todas las especies individuales dentro de un género

S-T: Sulfametoxazol-trimetroprim

Tet: Tetraciclina.

Tris: Trisaminometano

TSA: Agar tripticasa soya

xv

TSA: Agar tripticasa soya 0,6% extracto levadura

TSB: Caldo tripticasa soya

TSBYE: Caldo tripticasa soya 0,6% extracto levadura

UFC: Unidades formadoras de colonias

USDA: United States Department of Agriculture (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos)

UV: Ultravioleta

VRBG: Agar Bilis Glucosa con cristal violeta y rojo neutro

xvi

RESUMEN

Conocer las especies y variabilidad de las Pseudomonas alterantes de carne de

pollo, es fundamental para diseñar ensayos de antagonismo in vitro e in situ que

seleccionen, eficientemente, Lactobacillus bio-preservantes.

Esta tesis evidenció una alta variabilidad fenotípica y genotípica de Pseudomonas

fragi, fluorescens y lundensis, alterantes predominantes en pollo envasado en

aerobiosis. Además demostró que aun cuando Pseudomonas no sea sensible in

vitro frente a una bacteria láctica, esta última puede poseer actividad bio-

preservante de carne de pollo; no obstante, aquellas cepas que antagonicen en

medios nutritivos, tendrán mayor actividad bio-preservante in situ, extendiendo su

vida útil en mayor magnitud.

xvii

ABSTRACT

The species and biological variability of spoilage Pseudomonas on poultry meat is a

fundamental information to design in vitro and in situ microbial antagonism assays,

to select Lactobacillus bio-preservatives.

This thesis demonstrated a high phenotypic and genotypic variability of

Pseudomonas fragi, fluorescens and lundensis, predominant spoilages bacteria in

chicken fillets packaged in aerobiosis. Also highlighted that even when

Pseudomonas were not sensitive in vitro to lactic acid bacteria, this last one can

possess bio-preservative activity on poultry; however, those strains that antagonism

spoilage bacteria in culture medium, will have greater in situ bio-preservative activity,

extending its shelf life in greater magnitude.

1

INTRODUCCIÓN

Actualmente la carne de pollo es la más consumida tanto a nivel mundial (14 kg/per cápita), como nacional (35,6 kg/per cápita) (OECD, 2019). Esto se debe a que la carne de pollo tiene un menor costo y es percibida por el consumidor como más saludable en comparación con otras carnes (Kennedy et al., 2004, Font-i-

Furnols y Guerrero, 2014).

En respuesta a este fenómeno la producción y comercio en el mundo y Chile también han aumentado y se proyecta que continúe esta tendencia en el tiempo (OECD/FAO, 2018). Las industrias avícolas de nuestro país deben aprovechar este nicho para contribuir al desarrollo del país como potencia agroalimentaria (Villalobos et al., 2006; Montanari, 2018).

No obstante lo anterior, la principal limitante de la industria avícola, es la calidad perecible de sus productos. Chile se encuentra alejado de los principales países compradores de carne de ave, por lo tanto, la probabilidad de deterioro de los productos antes de llegar al consumidor final, es mayor que para otros países exportadores. La industria avícola nacional requiere tecnologías complementarias a las actualmente utilizadas, para extender la vida útil de sus productos.

La carne de ave es un sistema complejo y biológicamente activo, en el cual suceden, simultáneamente, reacciones microbiológicas, enzimáticas y físico-químicas que merman progresivamente su calidad (Singh y Cadwallader, 2002). No obstante, la velocidad de deterioro a una temperatura constante de refrigeración, y por lo tanto, vida útil, se relaciona principalmente con la carga inicial de bacterias psicrótrofas alterantes presentes en la superficie (EFSA, 2016).

La microbiota de la carne de ave es diversa y reflejo de la carga microbiana de las aves vivas y su estatus fisiológico al momento de la faena, del medio ambiente, prácticas sanitarias e higiénicas de la industria, del diseño de los equipos existentes en el matadero y planta de proceso, del tipo de corte, uso de marinado, empaque utilizado y del control de la temperatura durante la producción, venta y distribución (Russell et al., 1996; Nychas et al., 2008; Vihavainen y Bjôrkroth, 2010; Nieminen et al., 2012). De ahí la necesidad de investigar cuáles son las especies bacterianas predominantes en la carne según el origen de la misma.

No obstante lo anterior, la mayoría de los estudios señalan que las bacterias alterantes más frecuentes en carne envasada en films permeables al oxígeno pertenecen al género Pseudomonas (Arnaut-Rollier et al.¸ 1999; Balamatsia et al.¸ 2006; Liang et al.¸ 2012; EFSA, 2016). Sin embargo, no coinciden en las especies dominantes; Arnaut-Rollier et al. (1999) señalan a P. fragi, P. fluorescens y P. lundensis como las más frecuentes, mientras que Bruckner et al. (2012a) a P. putida.

Para planificar estrategias efectivas que retarden el deterioro de la carne, es de vital importancia conocer las especies de Pseudomonas predominantes en la matriz, en conjunto con su variabilidad inter e intra especies. Está demostrado que

2

bacterias de la misma especie tienen diferente cinética frente un mismo agente antibacteriano (Foweraker et al., 2005). Esta información debe ser considerada

dentro de los ensayos de antagonismo, y eventuales modelamientos predictivos de la cinética bacteriana (Aguirre et al., 2009; Lianou y Koutsoumanis, 2011).

Entre las intervenciones tradicionales utilizadas para retardar el deterioro de la carne de ave y controlar los patógenos asociados, se encuentran el envasado al vacío o en atmósferas modificadas. Ambas tecnologías desplazan el oxígeno disponible en los envases y así inhiben la multiplicación de las bacterias alterantes aeróbicas estrictas, como la mayoría de las Pseudomonas spp. (Narasimha y Sachindra, 2002). Sin embargo, P. fluorescens puede utilizar nitratos como

aceptores finales de electrones para su respiración, no siendo afectada por estas tecnologías (Palleroni, 2007).

Otra estrategia habitualmente utilizada es la desinfección final de las carcasas con productos químicos, ya que disminuye la carga inicial de bacterias en la carne. En Chile habitualmente se aplica hipoclorito de sodio debido a su bajo costo, no obstante su uso es controversial en muchos países, ya que pueden producir residuos potencialmente genotóxicos y carcinogénicos. Otros sanitizantes químicos inocuos, como el dióxido de cloro o clorito de sodio acidificado, han sido efectivos biocidas aplicados sobre las carcasas de pollo (EFSA, 2008; FAO/OMS, 2008). No obstante lo anterior, hoy son los consumidores los que demandan productos mínimamente procesados, preparados con la menor cantidad de conservantes y aditivos químicos (Roman et al., 2017).

La biopreservación es una tecnología relativamente reciente, basada en la incorporación de bacterias vivas a la superficie de la carne que antagonizan con las no deseadas (patógenas y/o alterantes), extendiendo su vida útil (Rodgers, 2001; Garcha y Natt, 2012). Cada vez es más utilizada en reemplazo de los preservantes sintéticos, ya que se considera como una tecnología natural bastante aceptada por los consumidores (Gaggia et al., 2011; Salem, 2012; Silva et al., 2018).

Actualmente esta tecnología ha sido efectiva para retardar el deterioro de la carne de vacuno envasada al vacío o en atmósfera modificada (Katikou et al., 2005; Castellano et al., 2010), pero no se encuentra evidencia que extienda la vida útil de la carne de pollo.

Considerando que múltiples estudios señalan que el éxito de la bio-preservación radica tanto en la capacidad antimicrobiana de la cepa antagonista como en la sensibilidad de la bacteria desafiada y la matriz alimentaria utilizada (Jones et al., 2008; Dortu et al. 2008; Santini et al., 2010; Hatew et al., 2011), es que esta tesis doctoral postuló que si Pseudomonas alterantes de pollo son sensibles in vitro frente a cepas de Lactobacillus spp. a 8ºC, entonces, estos

últimos, se podrán usar como bio-preservantes que extenderán la vida útil de la carne de pollo refrigerada.

3

ANTECEDENTES

1- La industria avícola nacional

La industria avícola nacional de carne ha evolucionado en forma notable en

las últimas décadas, consolidándose como una de las principales industrias

agropecuarias chilenas. Gran parte de la producción nacional se obtiene bajo un

modelo de integración vertical, lo que ha permitido un fuerte crecimiento del rubro y

de las exportaciones (Giacomozii, 2015). Durante el año 2017, 50,3% de la carne

producida fue de aves, principalmente de pollos Broilers [Figura 1] (ODEPA, 2018).

Figura 1: Distribución de la producción nacional de carne según especie, 2017.

*Gallinas y más incluye patos, gansos, avestruces y otros (Calculado a partir de datos

publicados por ODEPA, 2018).

La producción de carne de aves ha mantenido una tendencia al alza durante

la última década. Este aumento se debe principalmente a los pollos Broilers ya que

la producción de pavos, gallinas y otras aves (patos, gansos, avestruces y otro)

disminuyó en el último decenio [Figura 2, Anexo 1] (ODEPA, 2018). Las 3 caídas

en la producción observadas en el decenio se pueden explicar por: 2010, como

consecuencia del terremoto que afectó la producción de todas las especies de aves

durante el primer semestre del año; 2014, producto del incendio ocurrido en la

planta faenadora Lo Miranda en diciembre de 2013, que afectó la producción de

pollos de la principal empresa productora a nivel nacional (Agrosuper S.A.); y 2017,

Porcinos34,5%

Bovinos14,1%

Otros*1,1%

Broilers 88,8%

Pavos 10,5%Gallinas y

más*0,7%

Aves50,3%

4

cuando ocurrió un par de Brotes de influenza aviar de baja patogenicidad afectando

algunos planteles de pavo [Figura 2] (Giacomozzi, 2015; Gutiérrez, 2017; ODEPA

2018).

Figura 2: Evolución de la producción de carne de ave por especie (toneladas), 2008-

2017.

*Incluye patos, gansos, avestruces y otros (Elaborado a partir de datos publicados por

ODEPA, 2018).

El retorno económico debido a las exportaciones de carne de ave han

aumentado constantemente durante los últimos 9 años, con una variación de un

36,6% en el total de aves, entre los años 2009 y 2017 y con un peak abrupto de

ganancias el año 2015, debido al aumento de las exportaciones tanto de pollos

Broilers como, especialmente de pavos. Esta situación fue influenciada

principalmente por los brotes de influenza aviar durante el año 2015 en Estados

Unidos. A raíz de esta situación México y China restringieron sus importaciones,

desviando sus compras a Chile, entre otros países. En cuanto a las

desaceleraciones en el crecimiento de los valores de las exportaciones (2010, 2014

y 2017) coinciden con años donde la producción industrial también disminuyó y,

adicionalmente, el 2017 hubo bloqueo de mercados por los brotes de influenza aviar

nacionales. (ODEPA, 2016; Gutiérrez, 2017) [Figura 3, Anexo 1].

Durante el 2017 un 13,6% de la producción nacional se destinó a la

exportación (calculado en base a datos obtenidos de ODEPA, 2018 y el Servicio

Nacional de Aduanas, 2018). Los principales compradores de carne de ave chilena,

de acuerdo al valor de exportación, fueron EE.UU (33,4%), México (18,1%), Puerto

Rico (14%), China (13%), Reino Unido (8,3%), Alemania (4,5%), Holanda (1,9%) y

0,0

100.000,0

200.000,0

300.000,0

400.000,0

500.000,0

600.000,0

700.000,0

800.000,0T

on

ela

da

s

Años

Broilers Pavos Gallinas Otras aves* TOTAL

5

Hong Kong (1,4%), quienes suman 94,5% del valor de los envíos (SERVICIO

NACIONAL DE ADUANAS, 2018).

Figura 3: Evolución de la exportación de carne de ave no procesada en valor

FOB, 2009-2017 (Elaborado a partir de datos publicados por el Servicio Nacional

de Aduana 2018 e INE 2014).

1.1.- Limitantes de la industria avícola nacional

La principal limitante de la industria avícola, es la calidad perecible de sus productos. El deterioro temprano de la carne de ave es un desperdicio; conduce a pérdidas del producto, afectando el nombre de la industria, la confianza del consumidor y generando un impacto económico negativo tanto para las empresas, como para minoristas y consumidores (Bruckner et al., 2012a).

En EE.UU., el año 2010 se estimó que aproximadamente el 21% de la carne de ave se perdió a nivel del consumidor y minoristas. (Buzby et al., 2014). Aunque Chile está lejos de faenar la cantidad de pollos que se crían en tal país (USDA, 2018), parece probable que los porcentajes sean similares, e incluso la tasa de deterioro podría ser mayor. Esto significa que la pérdida de la industria en 2017, podría haber sido cercana a los 150 mil toneladas de carne de pollo, los cuales hubiesen satisfecho el consumo anual de más de 4 millones de chilenos, considerando un consumo per-cápita promedio anual de 35,6 kg (ODEPA, 2018; OECD, 2019).

Si bien, la industria avícola produce carne de ave de alta calidad con la que compite en el mercado internacional (APA-ASOHUEVO, 2006), la vida útil limitada afecta la viabilidad de las exportaciones. Dado que Chile se encuentra alejado de los países compradores y los tiempos de navegación son prolongados [Tabla 1], la mantención de la cadena de frio durante el transporte es fundamental y costosa. La

0

50

100

150

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Mil

lon

es

US

$

Años

Broilers Pavos TOTAL

6

literatura da cuenta de la vulnerabilidad de la cadena de frío durante el transporte de los alimentos en el mundo. Este riesgo aumenta con la distancia de los mercados (Mercier et al., 2017), por lo tanto, la probabilidad de deterioro y porcentaje de pérdidas asociadas a productos chilenos es mayor que para otros países exportadores. Actualmente, la industria chilena sólo exporta productos congelados (Servicio Nacional de Aduanas, 2018), desperdiciando los mejores precios pagados a nivel internacional por la carne fresca (FAO, 2018; Tridge, 2018; Hahn, 2018, comunicación personal*). Si la industria nacional lograra extender la vida útil de sus productos, podría aprovechar esta oportunidad, maximizando sus ganancias.

Tabla 1: Distancias y tiempos de navegación desde el puerto de Valparaíso a otros

puertos en el extranjero.

País destino (Puerto) Distancia

(Km)

Tiempo navegación a 20

nudos de velocidad (días)

Tiempo navegación a 30

nudos de velocidad (días)

EEUU (San Francisco) 9.697 10,9 7,3 México (Acapulco) 6.393 7,2 4,8 Puerto Rico (San Juan) 6.776 7,6 5,1 China (Shanghái) 19.605 22,1 14,7 Reino Unido (Gibraltar)* 12.982 14,6 9,7 Alemania (Hamburgo) 14.362 16,2 10,8 Holanda (Róterdam) 13.827 15,6 10,4 Hong Kong (Hong Kong) 20.675 23,3 15,5

*Distancias calculadas con la herramienta en línea de MarineTraffic (2018) y corroborados con datos del SHOA (1997).

A nivel nacional, la perecibilidad de las carnes, también afecta las ganancias de la industria. La longitud del territorio de país y la centralización de la producción de la carne de ave en las regiones Metropolitana y del Libertador Bernardo O`Higgins [Anexo 1], implican prolongados tiempos de transporte terrestre, en especial para llegar a las regiones extremas del país, aumentando la vulnerabilidad de la cadena de frio, en conjunto con la probabilidad de deterioro de la carne de ave, antes de su consumo, y por ende, aumentando las pérdidas asociadas (Mercier et al., 2017).

Por todo lo anterior expuesto, la industria avícola tiene grandes desafíos y requiere tecnologías complementarias a las actualmente utilizadas, para extender la vida útil de sus productos. Además debe adherirse a la tendencia mundial, demandada por los consumidores, de producir y exportar productos inocuos, frescos, duraderos y mínimamente procesados, preparados con la menor cantidad de conservantes y aditivos químicos, asegurando al cliente un producto de excelencia y alta calidad (Silva et al., 2018).

2.- Deterioro microbiológico de la carne de pollo

Durante la transformación del pollo vivo en carne, la manipulación y los diferentes procesos industriales contaminan la superficie del producto con

*Hahn, Bill. USDA-ERS. 2018. Comunicación personal: Bulk frozen chicken v/s bulk fresh chicken Prices. Correo electrónico whahn@ers.usda.gov Fecha: 5 septiembre 2018.

7

microorganismos patógenos y alterantes que causan su deterioro (Figueroa et al., 2009; Vihavainen y Björkroth, 2010).

La microbiota de la carne de ave fresca es heterogénea, inherente al lugar de producción y evoluciona durante las etapas de la faena y desposte. Su composición depende de la carga microbiana de las aves vivas y su estatus fisiológico al momento de la faena, del medio ambiente, prácticas sanitarias e higiénicas de la industria, del diseño de los equipos existentes en el matadero y planta de proceso, del tipo de corte, uso de marinado, empaque utilizado y del control de la temperatura durante la producción, venta y distribución. De ahí la necesidad de investigar cuáles son las especies bacterianas predominantes en la carne según el origen de la misma (Upon, 1995; Nychas et al., 2008; Figueroa et al., 2009; Nieminen et al., 2012).

La multiplicación microbiana es favorecida por los atributos físico-químicos de la carne de pollo, de ahí su condición de “altamente perecible”. Se caracteriza por tener alta actividad de agua, pH relativamente neutro (5,6-6,4) y alta variedad de nutrientes, incluyendo carbohidratos (como glucógeno, glucosa, glucosa-6-fosfato, ribosa), aminoácidos, nucleótidos, minerales, y vitaminas B que soportan a las diversas poblaciones microbianas (Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).

El deterioro de la carne refrigerada se produce principalmente por la multiplicación de las alterantes en su superficie, incluso a temperaturas de almacenamiento de -4ºC (Bailey et al., 2000). Será evidenciado por un cambio progresivo de las propiedades organolépticas durante el almacenamiento, distribución y venta del pollo (Nychas et al., 2008), debido al aumento de compuestos no deseados como alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, amonio, compuestos azufrados, aminas biógenas (putrescina y cadaverina) y limo, entre otros, derivados del metabolismo bacteriano (Casaburi et al., 2015; Geornaras et al., 1995).

La temperatura y la atmósfera de envasado son los factores más importantes que afectan la multiplicación y la selección microbiana durante el almacenamiento de la carne fresca. Cuando ocurre el deterioro, la carga bacteriana total ha aumentado, sin embargo, ambos factores ejercen una presión de selección que disminuye la diversidad de especies, e incluso de cepas, en comparación con la microbiota inicial de la carne (Casaburi et al., 2015; Chaillou. et al., 2015).

La mantención de la cadena de frio es fundamental para evitar el deterioro temprano de la carne, ya que retrasa la multiplicación de las bacterias psicrótrofas, extendiendo su fase lag y tiempo de generación, e inhibe a las mesófilas. Pequeños incrementos en la temperatura pueden estimular la multiplicación microbiana, lo que tiene un efecto crítico sobre la calidad del producto (Zhang et al., 2012). La

legislación chilena indica que la carne de ave refrigerada debe almacenarse y transportarse a 4 ºC o menos (Gobierno de Chile, 2010), no obstante no es poco frecuente que la temperatura en los anaqueles de supermercados y refrigeradores del hogar sobrepasen esa temperatura (Likar y Jevsnik, 2006; Koutsoumanis et al.,

2010).

El periodo de vida útil del pollo es definido como el tiempo en el cual el producto alimenticio permanece inocuo, mantiene sus características sensoriales,

8

químicas, físicas, microbiológicas y nutricionales declaradas en la etiqueta, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas (Kilcast y Subramaniam, 2000).

La vida útil coincide con el tiempo en el que la carga bacteriana de la carne alcanza los 7,0-8,0 log UFC/g; a partir de ese nivel comienzan a ser perceptibles los cambios organolépticos de la carne (olores, color, limo) (Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).

La vida útil de la carne de ave es altamente variable, dependiente de la carga inicial de bacterias alterantes psicrótrofas, temperatura de almacenamiento, y tipo de envasado (ICMSF, 2011). La vida útil puede variar entre 4 a 12 días en envases con oxígeno o con alta actividad de agua (Aw), entre 7 y 15 días al vacío y entre 15 y 17 días en atmósfera modificada (60-80% CO2), aun cuando las carcasas hayan sido almacenadas bajo temperatura de refrigeración (Jiménez et al., 1997; James, 2000; Kim y Bin Song, 2004; Pirola et al., 2011)

2.1.- Bacterias alterantes

La microbiota alterante (o asociación alterante) de la carne de pollo al momento de su deterioro, está compuesta por microorganismos que contribuyen activamente con el deterioro y con otras que sólo se han multiplicado, pero que no causan cambios desagradables para el sentido humano (Gram et al., 2002).

Este consorcio bacteriano implica interacciones sinérgicas y antagónicas. Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir exo-enzimas que aumenta la disponibilidad de nutrientes en el medio, permitiendo el desarrollo de otras bacterias, que de otra manera, no podrían crecer. En cambio, la competencia por nutrientes esenciales, cambios en el pH por la producción de ácidos orgánicos o la producción de sustancias antimicrobianas, como bacteriocinas, afectan negativamente la supervivencia o la multiplicación de otros microorganismos (Huis in't Veld, 1996; Nychas et al., 2008).

Se consideran como bacterias alterantes primarias, a aquellas que tienen la capacidad de producir metabolitos asociados con el deterioro a partir de una matriz alimentaria, aun cuando están en un cultivo puro (Gram et al., 2002).

Las especies bacterias que componen la microbiota alterante de la carne del pollo son múltiples, e incluso varían entre los cortes y la temperatura de almacenamiento [Figura 4] (Nychas et al., 2008; Zhang et al., 2012; Lee et al., 2017).

No obstante lo anterior, Pseudomonas spp. ha sido repetidamente reportada como el principal alterante primario de la carne de pollo, envasada en aerobiosis, desde la década de 1950 (Ayres et al., 1950; Barnes y Thornley, 1966; Russell et al., 1996; Arnaut-Rollier et al., 1999; Balamatsia et al., 2006; Liang et al., 2012; Lee et al., 2017).

Otras bacterias que pueden estar presentes en la carne de ave deteriorada en ambientes con oxígeno, son Shewanella putrefaciens, enterobacterias como Hafnia spp., Serratia spp., Enterobacter spp. y Acinetobacter spp., bacterias ácido lácticas como Carnobacterium piscícola, C. divergens, Lactococcus spp,

9

Leuconostoc spp, y Brochothrix thermosphacta (Smolander et al., 2004; Björkrotha et al., 2005; Vignolo et al., 2010; Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).

Figura 4: Composición de la microbiota alterante de carne de pollo (carcasa o pechuga) deteriorado a 4 y 10 ºC

Adaptado de Lee et al., 2017.

En carne de ave envasada en atmósferas modificadas (AM) o al vacío con films de baja permeabilidad al oxígeno, las bacterias alterantes predominantes son Brochothrix thermosphacta y bacterias ácido lácticas (Gill y Newton, 1979; Kakouri y Nychas, 1994; Smolander et al., 2004).

2.1.1. Pseudomonas

Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae de la clase Gammaproteobacteria y es considerado como uno de los grupos de bacterias Gram negativas más heterogéneo y complejo. Incluye bacilos oxidasa positivos, móviles, no formadores de esporas y aerobios estrictos, aunque algunas especies, como P. fluorescens, pueden utilizar nitratos como aceptor final de electrones, lo que les permite reproducirse en anaerobiosis (Palleroni, 2007). Son bacterias ubicuas, habiéndose aislado de gran variedad de fuentes, como suelo, agua dulce, humanos, plantas, animales, cosméticos, productos e instrumentos médicos y alimentos de origen animal y vegetal (Raposo et al., 2017).

La taxonomía de las Pseudomonas continúa evolucionando progresivamente; durante los últimos 10 años se han descrito más de 70 nuevas especies, quedando en evidencia la gran diversidad del género (Peix et al., 2018).

10

La mayoría de las Pseudomonas son psicrótrofas, es decir, se han adaptado para multiplicarse en temperaturas de refrigeración e incluso, se ha observado que algunos pueden hacerlo a temperaturas de congelación (-6 ºC) (Sulzbacher, 1950).

Pseudomonas spp. ingresa al matadero de pollos, principalmente, a través de las plumas o patas de las aves vivas o por el suministro de agua o hielo o por medio de los manipuladores (Geornaras et al., 1999; Rouger et al., 2017).). Una vez

ingresada la bacteria a la planta, puede persistir en las superficies por largos periodos de tiempo, formando bio-películas, que le otorgan resistencia a condiciones medio ambientales desfavorables (Masák et al., 2014).

Pseudomonas spp. alcanza la carne de pollo por contaminación cruzada en

cualquier etapa de la faena, desposte o proceso, cuando el músculo del pollo toma contacto con superficies, agua y, eventualmente, aire contaminado con la bacteria (Hinton et al, 2004; Vihavainen et al, 2007). El recuento de Pseudomonas spp. en carne de pollo fresca es variable en inherente al origen de la carne. Además, mientras mayor sea la manipulación de la carne, mayor será también la probabilidad de contacto y la carga bacteriana en su superficie; así es como una carcasa completa de pollo tiene menor carga bacteriana que al trozarla y menor que al envasarla (3,30 log CFU/cm2, 3,81 log CFU/cm2 y 4,08 log CFU/cm2 respectivamente) (Cerveny et al., 2009). Este dato es de vital importancia considerando el mercados internacional exige productos frescos y trozados.

Pseudomonas spp. deteriora la carne gracias a sus capacidades proteolíticas, lipolíticas, sacarolíticas y biosurfactantes derivadas de la producción de diversas enzimas. Éstas aumentan la disponibilidad de nutrientes en la superficie del alimento para las bacterias, contribuyendo con su sobrevida y multiplicación (Casaburi et al., 2015; Mellor et al., 2011; Nychas et al., 2008). El tiempo de generación de Pseudomonas spp. en carne refrigerada es rápido, 7,6 horas a 2º C

y 2,8 horas a 10º C (Herbert y Sutherland, 2000). Una mayor tasa de replicación aumenta la probabilidad de deterioro de los alimentos, especialmente si la cadena de frío se rompe entre la distribución y el consumo (Doulgeraki et al., 2012).

El metabolismo versátil de las Pseudomonas spp. le otorga ventajas

comparativas frente a otras de la microbiota del pollo. En la carne utiliza, al igual que otras bacterias, la glucosa como primera fuente de energía, pero una vez agotada ésta en el medio, es capaz de metabolizar una serie de sustratos [Tabla 2] e incluso la mayor parte de los aminoácidos, multiplicándose a la misma velocidad que cuando lo hacen a expensas del carbohidrato esto explica su prevalencia en el pollo deteriorado (Gill y Newton, 1977; Casaburi et al., 2015). Derivados de su metabolismo se producen compuestos como amonio, dimetil sulfuro, dimetil disulfuro aminas no volátiles, como putrescina y cadaverina, metanol, etanol y limo, entre otros (Freeman et al., 1976; Doyle, 2007).

Viehweg et al. (1989) observaron que Pseudomonas spp. produce más compuestos azufrados que cualquier otra bacteria alterante, y que estos compuestos enmascaran otros volátiles menos odoríferos cuando se realizan evaluaciones subjetivas con un panel de humanos. Russel et al. (1996) reportaron que bacterias aisladas de carcasas de pollos deteriorados a 3 ºC, que producen consistentemente olores similares al amoniaco, azufre, trapos o calcetines sucios, entre otros, fueron Pseudomonas fluorecens, P. fragi y P. putida. Arnaut-Rollier et

11

al. (1999) reportaron que bacterias del género Pseudomonas dan cuenta de menos del 20% de la microbiota inicial de la carne fresca, mientras que al día 8 de almacenamiento en refrigeración (3 ºC) aumentan al 87,5%.

Tabla 2: Sustratos usados por bacterias alterantes de carne envasada en aerobiosis.

Sustratos* Pseudomonas spp Enterobacteriaceae Bacterias ácido

lácticas Br. thermosfacta

Glucosa 1 1 1 1 Glucosa-6-P 2 2 2 2 Ácido láctico 3 3 Ácido pirúvico 4 Ácido glucónico 5 Gluconato-6-P 6 Aminoácidos 7 4 3 Ribosa 4 Glicerol 5

*Los números indican el orden de utilización del sustrato por parte de las bacterias. Adaptado de Casaburi et al., 2015.

Las especies de Pseudomonas que predominan en la carne de pollo deteriorada son variables dependiendo del lugar de producción. Arnaut-Rollier et al. (1999) establecieron que las especies dominantes son P fragi, P. fluorescens y P. lundensis, mientras que Lee et al. (2017) aislan mayoritariamente a P. weihenstephanensis y P. psychrophila y Bruckner et al. (2012a) sólo a P. putida al momento del deterioro.

Los estudios evidencian la importancia de conocer la variabilidad genética y fenotípica de las bacterias, tanto entre especies como dentro de las especies (Foweraker et al., 2005; Aguirre et al., 2009). Falta información sobre la diversidad y capacidad de deterioro de las especies de Pseudomonas que generalmente se desarrollan en carne, incluyendo a varias cepas de la misma especie (Raposo et al., 2017). Geornaras et al. (1999) señalan que existe una gran diversidad genética entre cepas de P.fluorescens en el pollo fresco, sin embargo, la literatura sobre la variabilidad del género en la carne deteriorada es escasa, y por lo tanto, se desconoce qué tan homogéneos o diversos son los genotipos o fenotipos durante la vida útil del pollo. Esta información es fundamental para plantear ensayos de actividad antibacteriana o planificar estrategias efectivas que retarden el deterioro de la carne.

Inhibir la multiplicación de microorganismos aeróbicos como Pseudomonas spp. es una estrategia efectiva para extender la vida útil de la carne de ave. Esto queda demostrado con los envasados que limitan el oxígeno, como el vacío o las atmósferas modificadas, y que en otros países son estrategias comúnmente utilizadas para el control de los microorganismos alterantes (Narasimha y Sachindra, 2007).

Pseudomonas spp. no es considerada como un peligro biológico dentro de los planes HACCP de la industria avícola, porque su presencia no causa directamente enfermedad en los consumidores. Sin embargo, además de afectar la calidad organoléptica de la carne, se reconoce como un factor clave en la

12

generación del ambiente microaerófilo necesario para la supervivencia aeróbica de Campylobacter jejuni, un importante patógeno entérico presente en la superficie de la carne del pollo (Hilbert et al., 2010).

Se estima de vital importancia controlar la multiplicación de Pseudomonas spp. tanto para extender la vida útil, como para mejorar la inocuidad de la carne de ave.

3.- Bio-preservación

La bio-preservación es un método innovador para extender la vida útil de los alimentos y reducir el riesgo de contaminación bacteriana utilizando microorganismos o sus metabolitos (Rodgers, 2001; Garcha y Natt, 2012). Cada vez es más utilizada en reemplazo de los preservantes sintéticos, ya que, además de retrasar el deterioro, es considerada como una tecnología natural que utiliza generalmente, microorganismos probióticos, con beneficios para la salud de las personas, por lo que es bastante aceptada por los consumidores (Gaggia et al., 2011; Salem, 2012; Silva et al., 2018).

Esta tecnología se basa en el antagonismo microbiano donde la inhibición de los microorganismos se produce por la competencia de nutrientes y/o por la producción de metabolitos antimicrobianos por parte de ciertas bacterias, conocidas como agentes bio-preservantes o bio-controladores (Brashears et al., 2005; Trias et al., 2008; Vásquez et al., 2009].

La bio-preservación se utilizó en forma masiva y empírica en alimentos fermentados, hoy ha evolucionado y algunas cepas bacterianas con capacidad bio-controladora han sido seleccionadas y utilizadas en alimentos no fermentados y refrigerados, como la carne de vacuno, pero poca evidencia existe sobre su efectividad en carne de pollo (Brashears et al., 1998; Katikou et al., 2005; Dortu et al., 2008; Maragkoudakis et al., 2009; Castellano et al., 2010; Gaggia et al., 2011; Salem, 2012; Sakaridis et al., 2014).

Amézquita y Brashears (2002) indican que las BALs ejercen su antagonismo en refrigeración, incluso sin multiplicarse, cuando se adicionan al alimento en altas concentraciones (>107 UFC/g).

En general, los agentes bio-controladores más utilizados en la industria de los alimentos son las bacterias ácido lácticas (BALs), ya que poseen un largo historial de uso inocuo en los alimentos, forman parte de la microbiota intestinal de humanos y animales, se encuentran en forma natural en carne, verduras, lácteos y en alimentos fermentados (Stiles, 1996; Vaughan et al., 2002; Gaggia et al., 2011).

La bio-preservación puede ser aplicada en cárnicos por cuatro métodos básicos (Vásquez, et al., 2009):

1. Añadiendo un cultivo puro de BALs viables productoras de alguna sustancia antagonista.

2. Añadiendo BALs mesófilas como una protección contra el abuso de temperatura.

3. Añadiendo preparaciones de bacteriocina cruda (extracto crudo).

13

4. Adicionando sustancias antagónicas puras o semipuras como las bacteriocinas producidas por BAL.

No obstante lo anterior, adicionar bacteriocinas para la bio-preservación de la carne es menos recomendable que utilizar BALs, ya que se adsorben a las proteínas o grasa y se degradan por proteasas, que frecuentemente se encuentran en la carne, no quedando disponibles para ejercer su efecto antagonista con las bacterias de la microbiota (Aasen, et al., 2003; Favaro y Todorov, 2017)

3.1.- Bacterias ácido lácticas (BALs)

Las BALs son un grupo heterogéneo de microorganismos con características morfológicas, metabólicas y fisiológicas similares, que producen ácido láctico como principal producto final del proceso de fermentación de carbohidratos. Son bacterias Gram positivas, no esporuladas, catalasa y oxidasa negativas, ácido tolerantes y anaerobias facultativos. (Vaughan et al., 2002; Mayo et al., 2010; WGO, 2011). En este grupo se incluyen las bacterias de los géneros Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, reconocidos, en general, como inocuos además de algunas especies de Enterococcus y Streptococcus que pueden ser patógenos (Collins et al., 2010).

La literatura señala que las BALs producen varias sustancias derivadas de su metabolismo, con capacidad antagonista tanto para bacterias patógenas, como alterantes. Inicialmente, la utilización de los carbohidratos disponibles en el alimento a través de la fermentación y el consiguiente descenso del pH a causa de los ácidos orgánicos producidos, fue el primer mecanismo que se demostró que tenían las BALs para inhibir a los microorganismos en los alimentos. Sin embargo, hoy está descrito que las BALs son capaces de producir varias sustancias antagonistas dentro de las cuales destacan compuestos de bajo peso molecular como el peróxido de hidrógeno, diacetilo, reuterina y otros no caracterizados y de alto peso molecular como las bacteriocinas (Brashears et al., 2005; Collins et al., 2010).

3.1.1.- Ácidos orgánicos.

Desde una perspectiva bioquímica de la producción de ácidos orgánicos, las BALs pueden ser clasificadas en homofermentadoras o heterofermentadoras. Las primeras producen principalmente ácido láctico a partir de los carbohidratos del medio, y las segundas además, ácido acético, etanol, dióxido de carbono y ácido fórmico. Las bacterias homofermentadoras tienen la capacidad de cambiar su metabolismo a uno ácido-mixto, cuando la cantidad de carbohidratos disponibles es limitada, donde producirán las mismas sustancias derivadas de un metabolismo heterofermentador, incluyendo además, diacetilo y butanediol (Mayo et al.,2010).

Los ácidos orgánicos antagonizan con microorganismos alterantes y patógenos, tanto Gram positivos como negativos (Tirloni, et al., 2014). No obstante, el ácido láctico tiene menor potencial antagonista que el ácido acético, dado que su pKa es menor (3,08 v/s 4,75), y por ende, tiende a disociarse más rápido, terminando la parte no disociada del ácido en menor porcentaje a un pH dado (Hauka et al., 2014).

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La actividad antimicrobiana de los ácidos orgánicos y del pH es complementaria. No obstante, la fracción no disociada de los ácidos orgánicos es la que posee una mayor actividad inhibidora debido a su naturaleza lipofílica, ya que pueden atravesar la membrana celular y disociarse en el citoplasma (que generalmente tiene un pH mayor que el extracelular). Estas moléculas pueden ejercer dos efectos: por un lado interfieren con funciones celulares, como puede ser la translocación de sustrato y la fosforilación oxidativa, y por otro lado, la disociación de los ácidos orgánicos provoca el incremento de protones en el interior celular. Cuando la concentración de protones excede la capacidad tampón del citoplasma se transportan hacia el exterior mediante bomba de protones, reduciendo las reservas energéticas de la célula. Cuando estas reservas se agotan, la bomba de protones se detiene y se provoca el descenso del pH interno, lo cual causa a su vez desnaturalización de las proteínas y desestabilización de otros componentes estructurales y funcionales de las células, interfiriendo así con la viabilidad de la célula (Vásquez et al., 2009).

Las bacterias lácticas pueden sobrevivir y multiplicarse en presencia de pH ácido gracias a estrategias concomitantes. Poseen un sistema de eflujo simultáneo de ácido láctico y de protones al exterior celular, incluyendo bombas de protones (ATPasas transmembrana) más permeables, en mayor cantidad y más estables a pH bajo. Además pueden alcalinizar el citoplasma asociado a los sistemas glutamato descarboxilasa (GAD) y/o arginina deiminasa (ADI). El primer sistema internaliza a un aminoácido (lisina, arginina o glutamato), lo descarboxila mediante la glutamato descarboxilasa, utilizando un protón e intercambia el producto descaboxilado (cadaverina, agmatina, gama-aminobutyrato) por un nuevo aminoácido. El sistema ADI por su parte, cataboliza a la arginina en ornitina, amonio y CO2, mediante las enzimas arginina deiminasa, ornitina transcarbamilasa y carbamatokinasa (Cotter y Hill, 2003).

3.1.2.- Peróxido de hidrógeno (H2O2)

Algunas BALs son capaces de producir peróxido de hidrógeno cuando se multiplican en ambientes aeróbicos, como mecanismo de protección frente al oxígeno, reduciéndolo a través de varias enzimas sustrato dependientes [Tabla 3]. Por ejemplo, en presencia de O2, las NADH o NADPH oxidasas regeneran el NAD+ o NADP+ necesarios en la homo o hetero fermentación de los carbohidratos, y la consiguiente formación de energía de la célula. En ausencia de O2, la regeneración del NAD+ o NADP+ a partir del NADH o NADPH se produce por las enzimas deshidrogenasa láctica (LDH), acetaldehído deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa (Condon, 1987; Mayo et al., 2010; Reis et al., 2012).

Las bacterias lácticas que producen H2O2 tienen un amplio espectro de inhibición sobre bacterias psicrótrofas asociadas a alimentos, ya sean Gram positivas o negativas y tanto alterantes como patógenos (Ito et al., 2003).

El efecto citotóxico del peróxido de hidrógeno se debe a su potencial para generar radical hidroxilo (HO•), un potente ROS (especie reactiva de oxígeno) pro-oxidante que puede causar daño a nivel de los ácidos nucleicos, proteínas y lípidos de las bacterias. El H2O2 se puede convertir en HO• espontáneamente (O2- + H2O2

OH- + HO• + O2) o durante la reacción de Fenton (H2O2 + Fe2+ + H+ HO• + H2O

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+ Fe2+) o de Haber-Weiss (•O2- + H2O2 •OH + OH- + O2) (Juven y Pierson, 1996; Miyoshi et al., 2003).

Tabla 3: Sustratos y reacciones necesarias para la formación de H2O2 en bacterias lácticas

Sustrato reacción Catalizado por

NADH + H+ + O2 ↔ NAD+ + H2O2 NADH oxidasa

NADPH + H+ + O2 ↔ NADP+ + H2O2 NADPH oxidasa

Piruvato + O2 + fosfato ↔ Acetil fosfato + CO2 + H2O2 Piruvato oxidasa

Lactato + O2 ↔ Piruvato + H2O2 L-Lactato oxidasa

Ácidos grasos saturados + O2 ↔ H2O2 Acil-coenzima A graso (Acil-CoA graso)

α-Glicerolfosfato + O2↔ Dihidroxiacetona fosfato + H2O2 α-Glicerolfosfato oxidasa

O2‾ + 2H+↔ H2O2 Complejos Mn2+ o SOD

Adaptado de Juven y Pierson, 1996.

Las bacterias lácticas anaerobias aerotolerantes pueden tolerar el peróxido de hidrógeno gracias a las enzimas superoxido dismutasa (SOD) e hidroperoxidasas o utilizando manganeso (Mn2+). Este último elemento es propio y característico de las BALs, que utilizan el Mn2+ para neutralizar el O2‾; por eso los requerimientos de Lactobacillus spp por manganeso son tan altos en comparación con otras bacterias (Bruno-Barcena et al., 2004).

3.1.3.- Diacetilo

El diacetilo (2,3-butanediona) es conocido como uno de los principales compuestos responsables del aroma y flavor de la mantequilla (Jay, 1982). Es producido por la mayoría de las especies de BALs, pero su habilidad de producción varía entre cepas de la misma especie (Keenan y Lindsay, 1968; El-Gendy et al.,

1983).

Este compuesto es producido por la mayoría de las BALs que son capaces de metabolizar citrato como fuente de energía y también por las homofermentadoras cuando la concentración de carbohidratos disponibles en el medio es limitada, a partir del piruvato (Mayo et al., 2010).

El diacetilo tiene un amplio efecto antibacteriano a pH <7, inhibe a hongos, bacterias Gram negativas y, en menor medida, a Gram positivos, siendo los más resistentes Lactobacillus (Jay, 1982). El efecto antibacteriano se debe a que la molécula

reacciona con compuestos que tienen un núcleo de guanidina, como la arginina entre otros (Harden y Norrys, 1911). Así es capaz de bloquear el uso del aminoácido por parte de las bacterias y/o inactivar la zona catalítica de algunas enzimas bacterianas (Jay et al., 1983; Lindgren y Dobrogosz, 1990).

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3.1.4.- Reuterina

La reuterina (3-hidroxipropionaldehído; 3-HPA) es una sustancia neutra, soluble en agua y de naturaleza aldehídica producida, tradicionalmente, por la mayoría de las cepas de Lactobacillus. reuteri cuando metabolizan anaeróbicamente al glicerol, gracias a la glicerol dehidratasa (Talarico et al., 1988). Aquellas cepas que no poseen dicha enzima, no son capaces de producir al agente microbiano (Cadieux et al., 2008). En cambio, se ha observado que otras especies de Lactobacillus pueden hacerlo, como L. collinoides y L. coryniformis, (Sauvageot et al., 2000; Martín et al., 2005).

La reuterina es una sustancia de amplio espectro antibacteriano, que inhibe protozoos, hongos y bacterias, tanto Gram negativas, como positivas, siendo las menos sensibles las BALs (Talarico et al., 1988; Axelsson et al., 1989). El efecto antibacteriano se debe a que la reuterina induce estrés oxidativo, reaccionando con los grupos tioles de proteínas y otras pequeñas moléculas (Schaefer et al., 2010).

3.1.5.- Bacteriocinas

Las bacteriocinas son un abundante y diverso grupo de péptidos antimicrobianos, sintetizados ribosómicamente, compuestos usualmente por 30 a 60 aminoácidos y secretados extracelularmente (Dobson et al., 2012; Goda, 2012).

Actualmente se acepta que las bacteriocinas se clasifican en 2 grupos: a) Clase I o lántibioticos: pequeños péptidos (<5 KDa), termo-estables, que contienen aminoácidos modificados en su estructura (lantionina, 3-methyl-lantionina, aminoácidos deshidratados, S-aminovinil-cisteina,entre otros), como la Nisina o Lactocina S; b) Clase II: pequeños péptidos (<10 KDa), termo-estables, que no contienen aminoácidos modificados, como la Pediocina PA-1 o Sakacina. Algunos autores agrupan a los péptidos antimicrobianos grandes (>25 KDa) y generalmente termo-lábiles en la clase III, entre ellos se encuentran las enzimas líticas o bacteriolisinas y otras moléculas no líticas, como la Lisostafina o Enterolisina A. (Klaenhammer, 1993. Hugas, 1998; Cotter et al., 2005; De Vuyst y Leroy, 2007; De Freire et al., 2010).

La producción de bacteriocina es un rasgo fisiológico crecimiento dependiente y, por lo tanto, sigue una cinética de metabolitos primarios (De Vuyst y Leroy, 2007). Pueden servir como péptidos “colonizadores” de nichos ecológicos ocupados por otras bacterias, pero además se conoce que son moléculas de señalización o de percepción de quórum (“quorum sensing” en inglés), útiles tanto para autoactivar su transcripción, como para comunicarse con otras bacterias activando, eventualmente, alguno de los genes estresantes, que limitan su multiplicación (Dobson et al., 2012).

El efecto antibacteriano de las bacteriocinas es variable, puede ser bactericida o bacteriostático y afectan, en general, a especies Gram positivas, próximas con la cepa bacteriocinogénica o que se encuentran en el mismo nicho ecológico (Collins, et al., 2010). La actividad contra las bacterias Gram negativas

también se ha observado, pero sólo cuando la integridad de la membrana bacteriana externa se encuentra comprometida, como por ejemplo después de un shock osmótico, pH bajo, en la presencia de detergentes o quelantes o después de

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un tratamiento con altas presiones. (De Vuyst y Leroy, 2007). Si bien aún el modo de acción de todas las bacteriocinas no está elucidado, se puede establecer una función común de acuerdo a su clasificación (Cotter et al., 2005).

Figura 5: Modo de acción de las bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas (BALs)

Adaptado de Cotter et al., 2005.

Los lántibioticos pueden inhibir la división celular e inducir la muerte uniéndose al lípido II, el principal transportador de peptidoglicanos desde el citoplasma a la pared celular, previniendo la correcta síntesis de la pared celular. Además, algunos pueden usar el lípido II como una molécula de acoplamiento para iniciar un proceso de inserción de membrana y formación de poros, alterando la permeabilidad de membrana, lo que lleva a la disipación del potencial de membrana y la fuga de iones, ATP y otras moléculas vitales para las bacterias diana. La Nisina presenta ambos mecanismos inhibitorios (Cotter et al., 2005; De Vuyst y Leroy, 2007; Chikindas et al., 2018) [Figura 5].

En general, las bacteriocinas clase II tienen una estructura helicoidal anfifílica, lo que les permite insertarse en la membrana celular de la bacteria diana y formar poros, induciendo las mismas consecuencias que los lantibióticos (Cotter et al., 2005; De Vuyst y Leroy, 2007) [Figura 5].

Las bacteriolisinas interactúan directamente en la pared celular, lo que lleva a la muerte y lisis de la célula diana (Cotter et al., 2005) [Figura 5].

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3.2.- Requisitos para seleccionar BALs como biopreservante

Para que una BAL sea considerada como potencial bio-preservante de la carne de ave, debe sobrevivir y poseer capacidad antagónica frente a bacterias patógenas y/o alterantes bajo temperaturas de refrigeración, pero además deben ser inocuas, no poseer resistencia a antibióticos y alterar mínimamente las características organolépticas en la carne cuando se ha almacenado bajo las recomendaciones del productor (Amézquita y Brashears, 2002; Maragkoudakis et al., 2009; Sakaridis et al., 2014).

3.3.- Evidencia in vitro e in situ de BALs con actividad antimicrobiana sobre diferentes bacterias patógenas y alterantes.

La evidencia científica in vitro que demuestra el antagonismo entre cepas lácticas y bacterias patógenas y alterantes de la carne de pollo es amplia. Estos evidencian que el antagonismo microbiano depende tanto del género y cepa del microorganismo potencial bio-preservante, como de la cepa bacteriana desafiada.

La evidencia in situ en alimentos demuestra que las BALs han sido extensamente utilizadas para bio-preservar subproductos cárnicos fermentados y cocidos; una variedad de cepas han sido efectivas antagonistas con patógenos y alterantes en estos productos. También la bio-preservación ha demostrado ser útil en carnes rojas envasadas al vacío, aumentando su vida útil. Sin embargo, la investigación in situ en carne fresca roja es bastante limitada, e incluso más escasa en carne de ave fresca envasada al vacío.

3.3.1.- Estudios in vitro

Jones et al. (2008) estudiaron el potencial antimicrobiano de 75 BALs aisladas de productos cárnicos refrigerados frente a 3 cepas de Listeria monocytogenes, 2 cepas de Campylobacter jejuni, una cepa de Brochothrix thermosfacta y una de Clostridium estertheticum, identificando sólo 6 cepas antagonistas de una o más bacterias patógenas. 3 BALs fueron identificadas como Lactobacillus sakei; L. sakei 27 sólo antagonizó a las cepas de L. monocytogenes, L sakei 44 sólo a las cepas de C. jejuni, mientras que L sakei 63 inhibió la multiplicación de ambas bacterias patógenas. Las otras BALs aisladas fueron Lactococcus garvieae 69, Lactococcus lactis 75 y Leuconostoc carnosum 15 quienes antagonizan a L. monocytogenes, C jejuni y L. monocytogenes y Clostridium estertheticum respectivamente.

Maragkoudakis et al. (2009) evaluaron la actividad antimicrobiana in vitro de 635 bacterias ácido lácticas aisladas de diferentes alimentos, de las cuales sólo 35 cepas antagonizaban a Listeria monocytogenes, 4 cepas a Brochothrix thermosfacta, 14 a Lactobacillus plantarum, 19 a Clostridium perfringens y ninguna a bacterias Gram negativas.

Santini et al. (2010) investigaron la actividad antimicrobiana in vitro de 28 cepas de Lactobacillus spp. y Enterococcus spp. sobre 3 cepas de Campylobacter jejuni, identificando 9 cepas con actividad frente a las 3 cepas patógenas, 1 sin

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capacidad antagonista y el resto inhibiendo al menos a una de las tres cepas de Campylobacter estudiadas.

Hatew et al. (2011) evaluaron la actividad antimicrobiana de 200 cepas presuntivas de Lactobacillus spp. aisladas desde contenido intestinal de pollo frente a Pseudomonas aeruginosa, encontrando sólo 1 cepa con actividad antagonista, identificada como Lactobacillus plantarum vN. Además reportaron que el

compuesto antimicrobiano producido por esta BAL no ha sido descrito anteriormente, fue designada como vN-1, caracterizada por un bajo peso molecular (<1kD), resistencia a proteasas y catalasas, estable a diferentes pH (2,0-8,0) y alta temperatura.

Tirloni et al. (2014) evaluaron la actividad antimicrobiana de Lactobacillus animalis SB310, L. paracasei subsp paracasei SB137 y su interacción sobre bacterias alterantes de la carne como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida y bacterias patógenas, determinando que cada BAL por sí sola presenta

actividad antagonista y que en la mayoría de los casos la interacción de las mismas produce mayores halos de inhibición que los Lactobacillus por si solos. También concluyeron que la actividad antimicrobiana se debió a la producción de ácidos orgánicos producidos por las BALs y no a otros bio-compuestos inhibidores. Destacan la necesidad de realizar estudios in vivo para evaluar el potencial biopreservante de estas cepas.

En la Unidad de Investigación realizada por mí en el Laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA (2014, no publicado) pude evaluar la capacidad antimicrobiana de 32 cepas de Lactobacillus spp, aislados desde contenido intestinal aviar, frente a S. enteritidis, L. monocytogenes y E. coli, identificándose que el 78% (25/32) tiene actividad antagónica, sobre a S. enteritidis, E. coli, y/o L. monocytogenes. La acción antibacteriana estaba ligada a la presencia de

compuestos con actividad diferentes a los ácidos orgánicos. La mayoría de estas cepas presentaron actividad simultánea frente a las 3 bacterias patógenas desafiadas (24/25), mientras que una cepa presentó actividad antagónica sólo sobre las bacterias Gram negativas (S. enteritidis y E. coli).

3.3.2.- Estudios in situ realizados en cecinas

Amézquita y Brashears (2002) inocularon vienesas de cerdo envasadas al vacío con Pediococcus acidilactici, productor de bacteriocina, Lactobacillus casei y Lactobacillus paracasei no bacteriocinogénicos en conjunto con L. monocytogenes, demostrando que las 3 BALs tienen un efecto batericida sobre la bacteria patógena desafiada al realizar el recuento bacteriano posterior a 28 días de almacenamiento a 5 ºC. A los 56 días de almacenamiento a 5 ºC tampoco se detectó cambios significativos en las características organolépticas de las vienesas, concluyendo la viabilidad del uso de estas bacterias para el control de L. monocytogenes.

Katla et al. (2002), evidenciaron que tanto un L. sakei productor de sakacina P como uno no bacteriocinogénico, tienen igual potencial bio-controlador con L. monocytogenes en fiambre de pollo (20,9% proteína, 1,5% grasa, NaCl 2,3%) irradiado envasado al vacío y almacenado a 10 ºC. Además evidenciaron que los

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tratamientos lácticos no inducían cambios organolépticos en los fiambres al día 28 de incubación.

Vermeiren et al. (2006) demostraron que Lactobacillus sakei subsp. carnosus (10A) no productor de bacteriocinas es capaz de extender la vida útil del jamón cocido envasado al vacío y almacenado a 7 ºC, retrasando la multiplicación de las bacterias alterantes Brochothrix thermosphacta y Leuconostoc mesenteroides. No obstante, también demostraron que una cepa de Lactobacillus sakei 148 productora de la bacteriocina lactocina S no ejerce el mismo efecto.

Casaburi et al. (2016) utilizaron al Lactobacillus curvatus productor de sakacina X, T y P como cepa iniciador en cecinas fermentadas y evaluaron su potencial bio-preservante durante la fermentación. Ellos demostraron que la cepa produce bacteriocinas in situ en la cecina y que además controla la multiplicación de L. monocytgenes, enterobacterias, levaduras y hongos, pero no S. aureus, manteniendo las características tecnológicas de la cecina y, modificando levemente las organolépticas. El producto final fue percibido como menos dulce y menos picante pero con un mayor sabor a maduración.

3.3.3.-Estudios in situ realizados en carne de vacuno y ave cruda

Brashears et al. (1998) inocularon carne de ave con Lactobacillus lactis productor de peróxido de hidrógeno y un pool de 3 cepas de E. coli O157:H7 y la almacenaron en bolsas plásticas permeables al oxígeno durante 7 días a 5º C. Los resultados demostraron el efecto bactericida de la cepa de Lactobacillus,

disminuyendo alrededor de 1 log (90%) el recuento de la bacteria patógena al tercer día. Adicionalmente reportaron que la carne de ave sin inocular con la bacteria láctica se deterioró al quinto día, no obstante las muestras inoculadas no presentaron signos de deterioro al séptimo día, sugiriendo que la cepa también podría antagonizar a las bacterias alterantes, extendiendo la vida útil del producto.

Katikou et al. (2005) inocularon carne de vacuno con Lactobacillus sakei CTEC 4808 y L. curvatus CETC 904, ambas productoras de bacteriocinas, y la almacenaron al vacío a 4 ± 1 ºC durante 28 días. Demostraron que ambas cepas eran capaces de retardar la multiplicación de microorganismos alterantes (Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, hongos y levaduras), pero el mayor efecto se observó con L. sakei. Además reportaron que ambas retardaban el deterioro de la carne (evaluado por cambios sensoriales), determinando que la aceptabilidad de la carne se limita a los 21 días en la carne control, 24 días en la carne inoculada con L. curvatus y en 26 días en la inoculada con L. sakei.

Dortu et al. (2008) evaluaron la capacidad antagónica de Lactobacillus sakei CWBI-B1365 productor de sakacina G y de L. curvatus CWBI-B28, productor de sakacina P, frente a Listeria monocytogenes artificialmente inoculada en carne de vacuno y de pollo almacenadas a 5ºC, determinaron que ambas BALs por separado tenían efecto bactericida sobre la bacteria patógena en carnes de vacuno, pero no en la carne de ave, donde el efecto bactericida sólo se observaba al emplear un mix con ambas cepas de Lactobacillus.

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Maragkoudis et al. (2009) inocularon carne de ave tanto con Enterococcus faecium PCD71 y L. monocytogenes, como con Lactobacillus fermentum ACA-DC179 y las probaron en su capacidad para inhibir a Salmonella Enteritidis. Los resultados demostraron que ambas BALs retrasaban la multiplicación de las bacterias patógenas, sin producir los cambios bioquímicos asociados al deterioro de la carne de ave almacenada en refrigeración (8-10ºC) durante 7 días.

Castellano et al. (2010) evaluaron la capacidad biopreservante de Lactobacillus curvatus CRL705, productora de lactocina 705 y lactocina AL705, sobre carne de vacuno envasada al vacío. Ellos demostraron que luego del almacenamiento durante 60 días a 2ºC, este microorganismo se vuelve el predominante y controló la multiplicación de Brochothrix thermosphacta y de otras bacterias lácticas alterantes naturalmente presentes en la carne, sin afectar las características sensoriales y estructurales de la carne.

Sakaridis et al. (2014) evaluaron la actividad antagonista de un Lactobacillus salivarius, aislado a partir de una carcasa de pollo, sobre Salmonella spp. y L. monocytogenes inoculados en piel y carne de pollo tratados con radiación UV, además de estimar su efecto sobre las características organolépticas de la carne. Como resultado, la bacteria láctica retrasó la multiplicación de los patógenos en ambas matrices, en conjunto con disminuir el limo sobre la carne, mejorando su apariencia general al día 7 de incubación a 7 ºC.

Goodarzi et al. (2016a) evaluaron la capacidad antagónica de diferentes concentraciones de un L. acidophilus frente a E. coli O157H7 en carne de vacuno

no estéril, co-inoculada con ambas cepas bacterianas, envasada al vacío y almacenada a 4 ºC. Ellos demostraron que la magnitud del antagonismo depende de la concentración inicial de la bacteria láctica. Además evidenciaron que el antagonismo se produce aun cuando el Lactobacillus no se multiplica en la carne y

debido, principalmente, a la producción de H2O2. Posteriormente, el mismo grupo de investigadores manipuló genéticamente a la bacteria láctica para aumentar su capacidad de producción de peróxido de hidrógeno, logrando una mayor la vida útil de la carne que la BAL inicial (Goodarzi et al., 2016b).

Da Costa et al. (2018), evidenciaron que BALs aisladas partir de fruta, antagonistas in vitro con Salmonella enteritidis, S. typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Listeria monocytogenes son capaces de antagonizar con S. enteritidis in situ en carne de pollo estéril almacenada a 4 ºC, de

una manera dependiente de la producción de ácidos orgánicos.

Martínez et al. (2018) publicaron una patente comercial de un bio-preservante multibacteriano que incluye: Lactobacillus paracasei tolerans, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus pentosus plantarum Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus allimentarius y Lactobacillus plantarum. Este bio-preservante es vendido en polvo y se utilizaría al momento del marinado de la canal. Ellos indican que el consorcio bacteriano es capaz de multiplicarse desde los 4 ºC en la superficie de la carne y retarda el deterioro del pollo en 4 días, considerando una vida útil sin biopreservante de 7 días, en comparación con 11 días con el biopreservante.

La evidencia científica demuestra la viabilidad de uso de BALs como cultivos protectores frente a bacterias patógenas y/o alterantes en productos cárnicos. No

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obstante, también se demuestra que el éxito de esta estrategia depende tanto de la BAL seleccionada, como de la bacteria desafiada y la matriz alimentaria utilizada.

Para retardar el deterioro de la carne de ave nacional envasada en aerobiosis es fundamental limitar la multiplicación de las bacterias alterantes primarias, como Pseudomonas. Es por esto que para acercarnos a la fabricación de un potencial bio-preservante y aumentar la estabilidad microbiológica de la carne de pollo, primero se describió la diversidad de especies y cepas de Pseudomonas presentes en la matriz y, posteriormente, se evaluó su sensibilidad frente a las BALs potenciales biopreservantes.

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HIPOTESIS

Si Pseudomonas alterantes de carne de pollo son sensibles in vitro frente a

cepas de Lactobacillus spp. a 8 ºC, entonces, estos últimos, se podrán usar como

bio-preservantes que extenderán la vida útil de la carne de pollo refrigerada.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la sensibilidad in vitro e in situ de Pseudomonas alterantes de carne

de pollo frente a cepas de Lactobacillus spp. potenciales bio-preservantes.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Evaluar la carga y diversidad de Pseudomonas alterantes en filetes de

pechuga de pollo deteriorados a 4 ºC de una empresa exportadora nacional.

2. Evaluar y seleccionar cepas de Lactobacillus spp. con actividad antagonista

in vitro frente a Pseudomonas spp. alterantes provenientes de filetes de

pechugas de pollo nacionales.

3. Evaluar in situ la sensibilidad de Pseudomonas presentes en filetes de

pechugas de pollo frente a cepas de Lactobacillus spp. potenciales bio-

preservantes.

4. Evaluar la estabilidad microbiológica de la carne de pollo, como indicador

de vida útil, luego de su contacto con cepas de Lactobacillus spp.

seleccionados.

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MATERIALES Y MÉTODOS

1.- Diseño experimental

La ejecución del proyecto se dividió en 3 etapas experimentales que se realizaron en el Laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA. En la Figura 6 se presenta de manera gráfica el diseño experimental utilizado para evaluar la sensibilidad in vitro e in situ de Pseudomonas alterantes de pollo frente a cepas de Lactobacillus spp. potenciales bio-preservantes.

Figura 6: Diseño experimental de la investigación “Evaluación de la biodiversidad de Pseudomonas alterantes de pollos refrigerados y su sensibilidad frente a Lactobacillus, potenciales bio-preservantes de la carne de ave”. *Ps= Pseudomonas; L= Lactobacillus; PCR= Reacción de la polimerasa en cadena; RAPD= Amplificación aleatoria del ADN polimórfico; Mult= Multiplicación; AB= Antibiótico; CECT= Colección española de cultivos tipo; PFGE= Electroforésis de campo pulsado.

2.- ETAPA 1: Prevalencia, aislamiento, identificación y caracterización de Pseudomonas spp. alterantes

En esta fase se evaluó la prevalencia, diversidad fenotípica y genética de Pseudomonas alterantes de filetes de pechuga de pollo sin piel deteriorados envasados en film permeable al oxígeno de una empresa nacional exportadora.

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2.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado.

Se evaluaron los recuentos de Pseudomonas spp. y de aerobios psicrótrofos

en 12 bandejas de filetes de pechugas de pollo marinado (15%) con diferente número de lote y fecha de vencimiento, de la principal empresa avícola nacional. El marinado contiene agua, polifosfatos de sodio, sal, carragenina, goma guar y maltodextrina.

Cada bandeja fue adquirida en supermercados locales, el primer día en que fue puesta a la venta al público. Luego, fue transportada al laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA, manteniendo la cadena de frío (<4 ºC), donde fue almacenada (deteriorada) a 4 ± 2 ºC en un refrigerador (CFL 633, Haier, China) hasta 2 días después de completar la vida útil señalada en cada envase. Se registró el número de lote, las fechas de compra, de vencimiento y de proceso para análisis microbiológico y el tiempo total de almacenamiento de cada muestra [Tabla 4]

Tabla 4: Información de las muestras (bandejas de filetes de pechuga de pollo marinado al 15%) utilizadas para evaluar la carga total de Pseudomonas spp. y RAP.

Muestreo Nº

Número Lote Fecha

compra Fecha

vencimiento Fecha

proceso

Tiempo almacenamiento

(días) a 4ºC

1 14141000 10-oct 18-oct 20-oct 10

2 14146000 14-oct 22-oct 24-oct 10

3 14241000 16-oct 25-oct 27-oct 11

4 14244000 20-oct 28-oct 30-oct 10

5 14245000 21-oct 29-oct 31-oct 10

6 14341000 22-oct 01-nov 03-nov 12

7 14343000 24-oct 03-nov 05-nov 12

8 14346000 28-oct 06-nov 08-nov 11

9 14441000 30-oct 08-nov 10-nov 11

10 14443000 03-nov 10-nov 12-nov 9

11 14641000 05-nov 15-nov 17-nov 12

12 14643000 07-nov 17-nov 19-nov 12

*RAP= recuento de aerobios psicrófilos

Los análisis microbiológicos fueron realizados utilizando la técnica del lavado. Brevemente, la carne de cada bandeja fue depositada en una bolsa estéril y pesada. En cada bolsa se agregaron 200 mL de agua peptonada (0,1%) y se procedió a un lavado manual energético de los filetes por 2 minutos (Zhang et al.,

2012). Asépticamente se tomaron 25 mL de agua de lavado y se depositaron en 225 mL del mismo diluyente anterior. Se realizaron diluciones seriadas 1:10 utilizando el mismo diluyente (Troncoso, 2012). Luego 100 uL de cada dilución se sembró en superficie en duplicado en diferentes medios. Para el RAP se utilizó agar PCA (Plate Count Agar: Merck, Alemania) (72 horas a 20± 2ºC) y para el de Pseudomonas spp., agar selectivo CFC (Cefalotina, Fusidina y Cetrimida agar;

26

Oxoid, Reino Unido) (72-120 horas a 20 ± 2ºC) (Arnaut-Rollier et al., 1999). Los resultados fueron reportados como Log10 unidades formadoras de colonias por gramo (log UFC/g).

2.2- Selección e identificación molecular de las especies de Pseudomonas dominantes.

Se realizó un recuento diferencial de colonias a partir de cada muestra sembrada en agar CFC y se seleccionaron, al menos, 4 colonias dominantes diferentes macroscópicamente. Éstas fueron aisladas y replicadas en AN (Oxoid, Reino Unido; 24-48 horas a 20 ± 2 °C).

Cada aislado se confirmó como Pseudomonas spp. mediante pruebas fenotípicas (tinción Gram, la prueba oxidación/fermentación [O/F] de la glucosa y oxidasa) (Kiska et al., 2003). Luego las colonias Gram negativas, no fermentadoras y oxidasa positivas fueron sometidas a dos pruebas de identificación molecular como se describe a continuación.

Inicialmente se utilizó una reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR Múltiple) que diferencia simultáneamente a Pseudomonas fragi, P. lundensis y P. putida (Ercolini et al., 2007). Aquellos aislados que resultan negativos en esta prueba, fueron sometidas a una PCR específica para P. fluorescens como lo propone Scarpellini et al. (2004).

Brevemente, el DNA de las Pseudomonas spp. aisladas se obtuvo suspendiéndolas en 100 uL de agua de PCR estéril y ajustando a una DO600 de 0,15 en un espectrofotómetro (modelo WPA Biowave II Biochrom, Reino Unido). Las muestras se hirvieron a 100 ºC por 15 minutos.

Para la PCR Múltiple se utilizó una mezcla de reacción de 20 uL, consistente en 1 uL de ADN crudo, 1x de GoTaq Green Master mix (Promega, EEUU), 0.2 uM de cada partidor hacia adelante (forward primer: CarAfraF, CarAputF, CarAlunF) y 0.6 uM del partidor reverso (reverse primer: CarAR). En la Tabla 5 se especifican las secuencias de los partidores y el tamaño del amplicón esperado según forward primer.

Tabla 5. Secuencias específicas de oligonucleótidos usados como partidores en PCR múltiple para la identificación molecular de Pseudomonas putida, fragi y lundensis (Ercolini et al., 2007).

Nombre Secuencia Tamaño amplicón

esperado

CarAputF 5`-ATG CTG GTT GCY CGT GGC-3` 230 pb

CarAfraF 5`-CGT CAG CAC CGA AAA AGC C-3` 370 pb CarAlunF , 5`-TGT GGC GAT TGC AGG CAT T-3` 530 pb CarAR , 5`-TGA TGR CCS AGG CAG ATR CC-3` -

Para la PCR específica de P fluorescens, también se utilizó una mezcla de

reacción de 20 uL, consistente en 1 uL de ADN crudo, 1x de GoTaq Green Master

27

mix (Promega, EEUU) y 0.5 uM de cada partidor. En la Tabla 6 se especifican las secuencias de los partidores y el tamaño del amplicón esperado para la reacción.

Tabla 6: Secuencias específicas de oligonucleótidos usados como partidores en PCR específica para la identificación molecular de Pseudomonas fluorescens (Scarpellini et al., 2004)

Nombre Secuencia Tamaño amplicón

esperado

16SPfluF 5`-TGC ATT CAA AAC TGA CTG-3` 850 pb 16SPR 5`-AAT CAC ACC GTG GTA ACC G-3` -

Ambas PCR fueron corridas en un termociclador (MultiGene™ OptiMax, Labnet international Inc., EEUU) utilizando las condiciones establecidas en la Tabla 7.

Tabla 7: Condiciones de PCR múltiple y específica utilizados para la identificación de especies de Pseudomonas. (Scarpellini et al., 2004; Ercolini et al., 2007).

Los productos de PCR obtenidos con los ensayos anteriores, fueron

separados mediante electroforesis usando geles con 2% agarosa (150 Volts por 45 minutos; cámara de electroforesis MGU-202T, C.B.S. Scientific, EEUU; fuente de poder PowerPac 1000, Bio-Rad, EEUU). Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (AccuRuler 100 bp DNA RTU Ladder, Maestrogen, USA).

2.3- Caracterización genotípica de Pseudomonas

Las Pseudomonas aisladas se caracterizaron usando la la técnica de RAPD (amplificación aleatoria de ADN polimórfico). Luego de ensayos preliminares con dos partidores de distinto tamaño, M13 (5´-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´; 20 mer; Michiels et al., 1997) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`; 10 mer; Aslam y Service, 2008) y diferentes condiciones que se muestran en la Tabla 8, se seleccionó el ensayo con mayor poder de discriminación entre aislados bacterianos, basándose en el número de bandas de los perfiles electroforéticos resultantes. Finalmente, se utilizó el siguiente protocolo: brevemente, se preparó ADN crudo a partir de aislados suspendidos en 100 uL de agua de PCR estéril y hervidos a 100 ºC durante 15 min. Se utilizó una mezcla de reacción de 20 uL, compuesta por 1 uL de ADN crudo, 1x de GoTaq Green Master mix (Promega, EEUU) y 0.5 uM del

Etapa Temperatura (ºC) Tiempo (segundos) Número Ciclos

Denaturación inicial 94 60 1 Denaturación 94 30 Alineamiento: PCR múltiple PCR P. fluorescens

60 56

30

30

Extensión 72 60 Extensión final 72 7 1 Enfriado final 4 Indefinido

28

oligonucleótido (Oligo). Se usó agua estéril y ADN de P. fluorescens ATCC 13525 como controles negativo y positivo respectivamente.

La amplificación fue realizada en termociclador (MultiGene™ OptiMax, Labnet international Inc., USA) bajo las condiciones establecidas en la Tabla 9 en triplicado.

Tabla 8: Condiciones ensayadas en la estandarización de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), para caracterizar genéticamente a Pseudomonas alterantes de carne de pollo, utilizando 2 partidores: M13 (5´-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´; Michiels et al., 1997) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`; Aslam y Service, 2008).

Partidor M13 Oligo

Mezcla de reacción ADN* 1 y 2 uL Concentración partidor 0,5, 1, 1,5, y 2 uM 0,5 y 1 uM Reacción RAPD Temperatura alineamiento Gradiente 36-42 ºC Gradiente 36-40 ºC Electroforesis Agarosa 1,2, 1,8 y 2% Voltaje 70 y 100 V Tiempo 45, 60 y 90 min. Volumen de carga 5 y 10 uL

*ADN obtenido por hervido.

Tabla 9: Condiciones de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`; Aslam y Service, 2008), establecidas para caracterizar genéticamente a los aislados de Pseudomonas alterantes de carne de pollo.

Los fragmentos amplificados fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% (70 Volts por 1,5 horas; cámara de electroforesis MGU-202T, C.B.S. Scientific, EEUU; fuente de poder PowerPac 1000, Bio-Rad, EEUU). Se utilizó un marcador de peso molecular de ADN de 80- 10.000 pb (MassRuler DNA ladder mix, Thermo Fisher Scientific Inc, EEUU).

Los perfiles electroforéticos fueron comparados con el programa BioNumerics (Applied Maths, Bélgica), basándose en la posición de las bandas. Se

Etapa Temperatura (ºC) Tiempo (minutos) Número Ciclos

Denaturación 94 5 Alineamiento 40 5 1 Extensión 72 5 Denaturación 94 2 Alineamiento 36 1 30 Extensión 72 2 Denaturación 94 5 Alineamiento 50 1 1 Extensión 72 2 Extensión final 72 7 7 Enfriado final 4 Indefinido

29

utilizó el coeficiente Dice (% similitud Dice) para establecer la semejanza genética entre los patrones de ADN. A partir de estos valores se construyó el dendograma de asociación mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages). Pseudomonas con un coeficiente de Dice mayor al 85% fueron considerados similares genéticamente y agrupadas en un grupo RAPD común, denominado como tipo RAPD (Aslam y Service, 2008).

2.4- Caracterización fenotípica de Pseudomonas.

Para caracterizar fenotípicamente a las Pseudomonas spp. aisladas se realizaron las siguientes pruebas:

1. Evaluación de la producción de biosurfactante mediante el método de colapso de gota (Bodour y Miller-Maier, 1998; Youssef et al., 2004)

2. Capacidad de producción de proteasas mediante hidrólisis de la caseína (AN suplementado con 10% de leche descremada, Colún, Chile; 20 ± 2 °C por 24-48 horas) (Arnaut-Rollier et al., 1999);

3. Capacidad de producción de lipasas (agar peptona suplementado con 1% de tween 80, 20 ± 2 °C por 24-48 horas) (Arnaut-Rollier et al., 1999);

4. Capacidad de producción de lecitinasa (AN suplementado con 5% de yema de huevo, Liofilchem s.r.l., Italy, 20 ± 2 °C por 24-48 horas) (Franzetti y Scarpellini, 2007).

5. Habilidad de multiplicación a 37ºC por 48 horas sobre AN. 6. Sensibilidad a antibióticos (ciprofloxacino, tetraciclina, polimixina B y

sulfametoxazol-trimetoprim) mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar (20 ± 2 °C por 24 horas). Esta prueba sólo se realizó a cepas diferentes según RAPD (n=27). Se utilizó el criterio de interpretación de la prueba para no enterobacterias según CLSI (2012) [Tabla 10].

Tabla 10: Criterios de interpretación de la sensibilidad a antibióticos mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar para no enterobacterias (CLSI, 2012).

Criterio interpretación CIM

(ug/mL)

Sensible Intermedia Resistente

Ciprofloxacino ≤1 2 ≥4

Tetraciclina ≤4 8 ≥16

Polimixina B ≤2 4 ≥8

Sulfametoxazol-Trimetoprim ≤38/2 - ≥76/4

Los perfiles fenotípicos obtenidos considerando los resultados de las pruebas 1 a la 5 fueron comparados con el programa Infostat® (Universidad Nacional de Córdoba, Argentina), basándose en la presencia/ausencia de cada variable estudiada. Se utilizó el coeficiente Simple Matching (% similitud SM) para establecer la semejanza fenotípica entre los aislados bacterianos. A partir de estos valores se construyó el dendograma de asociación mediante el análisis de promedio ponderado (WAG, Weighted average linkage).

30

3.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro

En la segunda etapa se evaluó y seleccionó cepas de Lactobacillus spp con actividad antagonista in vitro frente a Pseudomonas spp. alterantes provenientes de los filetes de pechuga de pollo aislados en la etapa previa, mediante la prueba de inhibición en agar spot en doble capa y prueba de antagonismo competitivo en caldo nutritivo a 8ºC.

Previamente se caracterizó genéticamente y pre-seleccionó cepas no clonales de Lactobacillus disponibles en el Laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA. Y además se incorporó al estudio una cepa láctica con capacidad de multiplicación en frio (8 ºC) aislada desde el pollo deteriorado y a L. sakei CECT 4808 como control positivo en los ensayos realizados bajo refrigeración.

Luego las potenciales cepas bio-preservantes seleccionadas se identificaron molecularmente y se evaluó su inocuidad, midiendo su capacidad hemolítica y la posible presencia de resistencia a antibióticos. 3.1.- Caracterización molecular Lactobacillus ssp y selección de cepas no clonales.

Se seleccionaron 54 cepas de Lactobacillus spp con actividad antibacteriana in vitro comprobada frente a S. enteritidis ATCC 2190 y L. monocytogenes ATCC 19114 a partir de la colección disponible en el Laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA. Las bacterias fueron recuperadas en agar MRS (De Man, Rogosa, Sharpe; Oxoid, Reino Unido) incubándolas durante 48 horas a 37 ºC en anaerobiosis.

Luego se caracterizaron genéticamente, para seleccionar aquellas cepas no clonales, mediante RAPD utilizando 2 partidores de diferente tamaño: M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`; 15 mer; Rossetti y Giraffa, 2005) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`; 10 mer; Aslam y Service, 2008). La reacción para M13F fue optimizada evaluando diferentes condiciones; para partidor oligo se ensayó el mismo protocolo utilizado con las Pseudomonas (ver etapa 1) [Tabla 11].

Tabla 11: Condiciones ensayadas en la estandarización de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) y su electroforesis, para caracterizar genéticamente a Lactobacillus spp. potenciales bio-preservantes, utilizando el partidor M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`; 15 mer; Rossetti y Giraffa, 2005) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`; Aslam y Service, 2008).

Partidor M13F Oligo

Mezcla de reacción ADN* 50, 500 y 1000 ng 500 ng Concentración partidor 0,5 y 1 uM 0,5 uM

Reacción RAPD Temperatura alineamiento Gradiente 36-50 ºC 36 ºC

Electroforesis Agarosa 1.5, 1.8 y 2% 1,8% Voltaje 80 V 70 V Tiempo 60, 90 y 120 min 90 min. Volumen de carga 3, 5 y 10 uL 5 uL

31

Finalmente, para partidor M13F se utilizó el siguiente protocolo: brevemente, se preparó ADN crudo mediante protocolo fenol-cloroformo [Anexo 5]. Se utilizó

una mezcla de reacción de 20 uL, compuesta por 1000 ng de ADN crudo, 1x de GoTaq Green Master mix (Promega, EEUU) y 1 uM del partidor. Se usó agua estéril como control negativo.

La amplificación fue realizada en termociclador (MultiGene™ OptiMax, Labnet international Inc., USA). Para M13 se utilizaron las condiciones establecidas en la Tabla 12 y para oligo en la Tabla 9 (ver etapa 1).

Tabla 12: Condiciones de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`; Rossetti y Giraffa, 2005), establecidas para caracterizar genéticamente a Lactobacillus spp. potenciales bio-preservantes

Adaptado de Rossetti y Giraffa, 2005)

Los fragmentos amplificados con el partidor Oligo fueron separados mediante electroforesis bajo las mismas condiciones que Pseudomonas y los

generados por M13F en gel de agarosa al 2% (80 Volts por 2 horas; cámara de electroforesis MGU-202T, C.B.S. Scientific, EEUU; fuente de poder PowerPac 1000, Bio-Rad, EEUU). Se utilizó un marcador de peso molecular de ADN de 80- 10.000 pb (MassRuler DNA ladder mix, Thermo Fisher Scientific Inc, EEUU).

Los perfiles electroforéticos fueron comparados con el programa BioNumerics (Applied Maths, Bélgica), basándose en la posición de las bandas. Se utilizó el coeficiente Dice (% similitud Dice) para establecer la semejanza genética entre los patrones de ADN. A partir de estos valores se construyó el dendograma de asociación mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA del inglés, Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages). Los Lactobacillus con un coeficiente de Dice mayor al 85% fueron considerados similares genéticamente y agrupadas en un grupo clonal RAPD común.

3.2.- Prueba de inhibición selectiva “spot en doble capa” (SDC).

Se utilizó esta prueba para pre-seleccionar Lactobacillus spp. capaces de antagonizar in vitro con Pseudomonas alterantes en condiciones ideales de multiplicación para ambas especies bacterianas.

3.2.1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

3.2.1.1. Lactobacillus spp.: se seleccionaron 27 cepas considerando diferente perfil RAPD según partidor oligo, diferentes además, subjetivamente, con el partidor M13F y antagonistas con Salmonella enteritidis y Listeria

Etapa Temperatura (ºC) Tiempo (segundos) Número Ciclos

Denaturación inicial 94 120 1 Denaturación 94 60 Alineamiento 46 20 40 Extensión 72 120 Extensión final 72 600 1 Enfriado final 4 Indefinido

32

monocytogenes, evidenciable por un halo mayor a 4 mm según registros de prueba de “spot en doble capa” realizada en el laboratorio previamente [Figura 15].

Los Lactobacillus fueron cultivados en agar MRS e incubados a 37 ºC en anaerobiosis.

3.2.1.2.- Pseudomonas spp.: Considerando la variabilidad biológica inter e intra especies encontradas en la etapa 1, se incluyó en el ensayo al 20% (n=9) de las Pseudomonas aisladas según especie (5 P. fragi, 3 P. fluorescens y 1 P. lundensis). Se consideraron como criterios de selección pertenecer a un grupo RAPD con similitud mayor al 60% y presentar mayor capacidad enzimática según las pruebas fenotípicas de la etapa 1. Además se usó la cepa Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 como control.

Las Pseudomonas fueron cultivados en AN o TSA (Tripticasa Soya agar; BD, Alemania) e incubadas a 22 ºC en aerobiosis.

3.2.2.- Preparación de los inóculos.

Previo al ensayo, cada cultivo mono-microbiano se ajustó a una concentración de 107 UFC/mL en caldo MRS (Oxoid, Reino Unido) o TSB (Tripticasa Soya broth; BD, Alemania) utilizando una densidad óptica equivalente a 600 nm.

3.2.3. Prueba “spot en doble capa” (SDC).

Se utilizó el protocolo establecido por Tejero-Sariñena et al. (2012) con modificaciones. Brevemente, se prepararon placas con 15 mL (5 mm de altura) de agar MRS y MRS-bicarbonato al 2% modificados, sin sustancias inhibidoras para Gram negativos (MRSm y MRS-BICm; fórmula [Anexo 6]). Se inocularon 2 spots de 5 uL de la cepa desafiante de Lactobacillus spp. distanciadas entre sí y se incubaron a 37 ºC durante 48 horas en anaerobiosis. Posteriormente las placas fueron expuestas a vapores de cloroformo durante 30 minutos (papel filtro 3x3 cm embebido con 1 mL cloroformo por placa) y aireadas durante 20 minutos. Luego las placas fueron cubiertas por una segunda capa de 7 mL de agar blando MH (0,7% agar, Müller Hinton; BD, Alemania) inoculados con 100 uL de Pseudomonas spp. Las placas fueron incubadas a 22ºC en aerobiosis (Tirloni et al., 2014). La prueba fue realizada en duplicado

Los halos de inhibición fueron medidos a las 24 horas y reportados como promedios ± DE.

3.2.4. Análisis estadístico

Se realizó un análisis descriptivo de los resultados.

Para evaluar si el halo de inhibición depende sólo del efecto de los Lactobacillus y/o sensibilidad de Pseudomonas o a una interacción entre ambos factores, se utilizó un modelo lineal general y mixto (MLGM, Infostat®) con estructura factorial, bloque, covariable y modelamiento de la varianza considerando el siguiente modelo matemático:

Yijk= + Ai + B

j + (AB)

ij+ Bl

k + Covijk + e

ijk

33

Donde:

Yijk= Halo MRS-BICm observado bajo el i-ésimo nivel del factor Lactobacillus, j-ésimo nivel del factor Pseudomonas y el k-ésimo nivel del

efecto bloque.

= media general del halo MRS-BICm

Ai = Efecto del i-ésimo nivel del factor Lactobacillus, con 27 niveles.

Bj = Efecto del j-ésimo nivel del factor Pseudomonas, con 10 niveles.

ABij = Efecto interacción del i-ésimo nivel del factor Lactobacillus y el del j-ésimo nivel del factor Pseudomonas.

Blk = Efecto bloque del k-ésimo nivel del factor aleatorio número de ensayo, con 11 niveles.

Covijk = Covariable, tamaño de spot asociado al ijk-ésimo Halo MRS-BICm.

eijk = Término del error aleatorio asociado al ijk-ésimo Halo MRS-BICm.

3.3.- Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC.

Esta prueba se realizó para evaluar in vitro si Lactobacillus son capaces de antagonizar con Pseudomonas alterantes en ambiente refrigerado, acercándonos a

las condiciones de almacenamiento de la carne de pollo.

3.3.1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.

3.2.1.1. Lactobacillus spp.: en base a los resultados de la prueba de SDC, se seleccionó a los Lactobacillus que presentaron mayor y menor halo de inhibición promedio frente a las Pseudomonas (L.B y L 252 respectivamente) [Figura 19]. Además se utilizó a L.63, aislada de carne de pollo nacional deteriorada, con capacidad de multiplicación en frío [Anexo 9] y a Lactobacillus sakei CECT 4808, de origen español, como control positivo de la prueba (Katikou et al., 2005).

Lactobacillus fueron cultivados en agar MRS e incubados a 37 ºC en anaerobiosis o a 30 ºC en aerobiosis (L. 63 y L. sakei CECT 4808).

3.3.1.2.- Pseudomonas spp.: se seleccionó a Pseudomonas fragi 1.1, por representar a la especie predominante en las muestras de pollo analizadas en la etapa 1 (prevalencia del 57%) y por ser la P. fragi con mayor sensibilidad en la prueba de SDS [Figura 20].

P. fragi fue cultivada en AN o TSA e incubadas a 22 ºC en aerobiosis.

3.3.2. Diseño de los desafíos.

La Pseudomonas fue desafiada por 10 tratamientos con cepas lácticas. Estos tratamientos usaron 2 concentraciones y cultivos tanto mono-microbianos como di-microbianos para evaluar si existe sinergismo entre 2 cepas lácticas [Tabla 13].

La concentración de Pseudomonas fue seleccionada conforme la carga de Pseudomonas spp. frecuentemente detectada en carne fresca de pollo nacional [Anexo 7].

34

3.3.3.- Preparación de los inóculos.

Un día previo al ensayo las bacterias lácticas se ajustaron a una DO600nm 0,01 en caldo MRS y se incubaron a 37 ºC en anaerobiosis (LB, L252) o a 30 ºC en aerobiosis (L.63 y L. sakei CECT 4808) por 24 horas para alcanzar una concentración ≈109 UFC/mL. Luego fueron centrifugadas y reconstituidas a la misma concentración en caldo MRSm (caldo MRS modificado sin acetato de sodio ni citrato de amonio; fórmula completa en Anexo 6). Además cuando fue necesario, se realizaron diluciones seriadas para alcanzar ≈107 UFC/mL usando el mismo diluyente.

Tabla 13: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 en la prueba de inhibición en caldo TSBYE a 8 ± 2 ºC durante 4 días.

Tratamiento Bacteria láctica

Desafiante Bacteria alterante

Desafiada

T0 -

P. fragi 1,1 103 UFC/mL

T1 L. B

106 UFC/mL T2 L. 252 T3 L. B+252 T4 L. 63 T5 L. sakei CECT 4808*

T6 L. B

108 UFC/mL T7 L. 252 T8 L. B+252 T9 L. 63

T10 L. sakei CECT 4808*

*Cepa utilizada como control positivo. TSBYE: caldo Tripticasa Soya con extracto de levadura 0,6% (Oxoid, Reino Unido)

Paralelamente, el día del ensayo, P. fragi fue ajustada a una concentración

de 107 UFC/mL en caldo TSBYE (caldo Tripticasa Soya con extracto de levadura 0,6%; Oxoid, Reino Unido) y luego diluida 1/10 usando el mismo caldo hasta alcanzar ≈104 UFC/mL.

Todos los medios utilizados fueron ajustados a pH 5,7-5,9, por representar al grado de acidez de la carne de pollo (pechuga) fresca (Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).

3.3.4. Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC.

Se utilizó el protocolo establecido por Doyle y Zhao (2009) con modificaciones. Brevemente, en 80 mL de TSBYE (pH 5.7-5.9) se agregó 10 mL de Pseudomonas (≈104 UFC/mL) y 10 mL de cultivo mono o di-láctico (≈107 o 109 UFC/mL) o caldo MRSm como control negativo de la prueba. Luego los tratamientos fueron alicuotados en tubos de 8 mL y se incubaron a 8 ± 2 ºC en aerobiosis sin agitación durante 6 días.

Los días 0, 4, 5 y 6 se hicieron recuentos de Pseudomonas en agar CFC (22 ºC, 48 hrs, aerobiosis) y Lactobacillus en MRS (37 o 30 ºC, 48 hrs, anaerobiosis o aerobiosis para LB y L252 o L63 y L. sakei CECT 4808 respectivamente).

35

La prueba fue realizada en duplicado

3.3.5. Análisis estadístico

Los recuentos de Pseudomonas y de Lactobacillus fueron reportados como medias ± desviación estándar.

Se evaluó si Lactobacillus retrasan la multiplicación de Pseudomonas mediante un MLGM (Infostat®) utilizando estructura factorial en bloque y parcela anidada para modelar la covarianza entre los tiempos evaluados y modelamiento de la varianza considerando el siguiente modelo matemático:

Donde: • Yijkl: recuento bacteriano observado en la l-ésima parcela del k-enésimo

bloque, en el j-enésimo tiempo e i-ésimo tratamiento.

• : media general de los recuentos de bacterianos. • Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. • Aj: Efecto del j-ésimo tiempo; j = 0, 4, 5, 6. • (TA)ij: Efecto de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y j-ésimo tiempo. • Blk: Efecto del k-ésimo bloque (ensayos en 6 tiempos diferentes); l = 1, 2, 3,

4, 5, 6. • Pkl: Efecto de la l-ésima parcela en el k-enésimo bloque; m = 1, 2, 3,..., 49,

50. • eijkl= Efecto del error experimental del ijkl-ésimo recuento bacteriano.

Para comparar los tratamientos dentro de cada tiempo, se usó la prueba post-hoc LSD de Fisher con un p valor corregido por Bonferroni para minimizar el error debido al alto número de comparaciones múltiples.

3.4.- Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio.

Las bacterias lácticas con capacidad antagonista (L.B y L.63) se identificaron mediante secuenciación del gen 16S rRNA, utilizando los partidores universales 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) y 1492R (5’-ATT TGC TAA AGC GGG AAT CT-3’). El PCR fue ejecutado en 25 μl de volumen final, utilizando 1 ug de ADN extraído con protocolo fenol-cloroformo [Anexo 5], 1x of GoTaq Green Master mix, 0,4 uM de cada partidor.

La amplificación fue realizada en termociclador (MultiGene™ OptiMax, Labnet international Inc., USA), bajo las condiciones establecidas en la Tabla 14.

El amplicón esperado de 1500 pb fue evidenciado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (90 Volts por 45 min; cámara de electroforesis MGU-202T, C.B.S. Scientific, EEUU; fuente de poder PowerPac 1000, Bio-Rad, EEUU). Se utilizó un marcador de peso molecular de ADN de 80-10.000 pb (MassRuler DNA ladder mix, Thermo Fisher Scientific Inc, EEUU).

Yijkl

= + Ti + A

j + ()

ij+ Bl

k + P

kl + e

ijkl

36

Los productos de las PCR se enviaron a secuenciar a Macrogen. A partir de la secuenciación forward y reverse obtenidas, se creó la secuencia consenso (contig) utilizando las herramientas Reverse Complement (bioinformatics.org) y Contig Assembly Program (CAPs - BioEdit 7.2.5). Posteriormente estas últimas secuencias fueron procesadas mediante la herramienta BLAST de NCBI y Sequence Match de Ribosomal Database Project (RDP).

Tabla 14: Condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) utilizadas para la amplificación del gen 16S rRNA de los Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio, y su posterior identificación molecular

Adaptado de Rossetti y Giraffa, 2005.

3.5.- Aproximación a la inocuidad de las cepas de Lactobacillus spp.

Se evaluó la inocuidad de las cepas L.B y L.63 mediante la prueba de hemólisis y susceptibilidad a antibióticos.

3.5.1.- Prueba de hemólisis

Las bacterias lácticas fueron inoculadas en un spot de 5 uL de sobre agar Columbia suplementado con sangre de cordero (5%). La placa fue incubada durante 48 horas a 30ºC en aerobiosis (Tejero-Sariñena et al., 2012).

3.5.2.- Prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar:

Se evaluó la sensibilidad de LB y L63 a Ampicilina (10 ug), Ciprofloxacino (5 ug), Tetraciclina (30 ug), Vancomicina (30 ug), Cloranfenicol (30 ug), Eritromicina (15 ug), Gentamicina (10 ug), Clindamicina (2 ug) mediante prueba de difusión en agar establecida por Charteris et al. (1998).

Brevemente, placas de 9 cm diámetro con 15 mL de agar MRS, fue recubierto con 4 mL de agar blando MRS (0,7% agar) inoculado con la bacteria láctica (107 UFC/mL). Posterior a la solidificación de la segunda capa, se depositaron en la superficie, los discos de antibióticos (5 o 6 discos por placa). Las placas fueron incubadas en anaerobiosis a 37 ºC (LB) o en aerobiosis a 30 ºC (L63). Como cepas control se utilizaron a L. rhamnosus LGG y L. sakei CECT 4808

Etapa Temperatura (ºC) Tiempo Número Ciclos

Denaturación 1 95 3 min Alineamiento 1 58 6 min 1 Extensión 1 72 1 min 30 seg Alineamiento 2 95 1 min 30 seg Extensión 2 58 3 min 1 Alineamiento 2 72 1 min 30 seg Denaturación 3 95 1 min 30 seg Alineamiento 3 58 1 min 30 seg 27 Extensión 3 72 1 min 30 seg Denaturación 4 95 1 min 30 seg Alineamiento 4 58 1 min 30 seg 1 Extensión 4 72 10 min Enfriado final 4 Indefinido

37

utilizando las mismas condiciones que LB y L63 respectivamente. La prueba fue hecha en duplicado.

Los halos de inhibición se midieron a las 24 horas y se compararon con los parámetros de sensibilidad establecidos por Charteris et al. (1998) [Anexo 8].

4.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión de vida útil de la carne de pollo.

En la tercera y última etapa se evaluó la sensibilidad de Pseudomonas in situ en carne de pollo frente a las cepas de Lactobacillus spp. potenciales bio-controladores según los resultados de los ensayos in vitro. Las cepas lácticas seleccionadas (L. rhamnosus B y L. sakei 63) se inocularon artificialmente en filetes de pechuga de pollo estériles inoculados con P. fragi, y aquella con mayor potencial bio-controlador, se inoculó en carne de pollo fresca con microbiota nativa.

La extensión de la vida útil microbiológica de la carne de pollo fresca, inoculada con el potencial bio-preservante, se evaluó mediante modelamiento matemático en línea, utilizando la herramienta Dmfit (Combase, 2018).

Luego, se demostró que el L. sakei 63 es una cepa diferente a la cepa control, L sakei CECT 4808, mediante PFGE (electroforesis de campo pulsado).

4.1.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC.

Esta prueba se realizó para evaluar in situ, en carne de pollo, la sensibilidad de P.fragi 1.1 frente a los Lactobacillus bio-controladores in vitro con la misma cepa

alterante. Esta prueba, disminuye el error experimental debido a la eventual interacción (sinergismo, antagonismo o competencia) de los tratamientos con otras especies bacterianas presentes en la microbiota intrínseca del pollo.

Se utilizó el protocolo de Katikou et al. (2005) con modificaciones.

4.1.1.- Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.

4.1.1.1. Lactobacillus spp.: en base a los resultados in vitro de la prueba de inhibición en caldo a 8ºC, se seleccionó a los Lactobacillus rhamnosus B y a L. sakei 63 [Figura 21]. Además se utilizó a L. sakei CECT 4808 como control positivo de la

prueba.

Lactobacillus fueron cultivados en caldo MRS e incubados a 37 ºC en anaerobiosis (L. rhamnosus B) o a 30 ºC en aerobiosis (L. sakei 63 y CECT 4808).

4,1.1.2. Pseudomonas spp.: al igual que en el ensayo de antagonismo in vitro, se seleccionó a Pseudomonas fragi 1.1, por representar a la especie predominante en las muestras de pollo analizadas en la etapa 1 (prevalencia del 57%) y por ser la P. fragi con mayor sensibilidad en la prueba in vitro SDC [Figura 20].

P. fragi fue cultivada en AN o TSA e incubadas a 22 ºC en aerobiosis.

38

4.1.2.- Preparación de los inóculos.

Un día previo al ensayo 100 mL de bacterias lácticas se ajustaron a una DO600nm 0,01 en caldo MRS y se incubaron a 37 ºC en anaerobiosis (LB, L252) o a 30 ºC en aerobiosis (L.63 y L. sakei CECT 4808) por 20 horas para alcanzar una concentración ≈109 UFC/mL. Luego fueron centrifugadas a 7.700 RPM por 10 minutos a 4ºC. El pellet de células fue lavado 2 veces con suero fisiológico y reconstituido en 1 mL de mismo diluyente, para alcanzar una concentración ≈1011

UFC/mL. Además cuando fue necesario, se realizaron diluciones seriadas para alcanzar ≈109 UFC/mL.

Paralelamente, el día del ensayo, P. fragi fue ajustada a una concentración

de 107 UFC/mL en caldo nutritivo y luego diluida 1/10 usando el mismo medio hasta alcanzar ≈106 UFC/mL.

Justo en el momento previo de la inoculación experimental de la carne, se juntaron en un tubo eppendorf 10 uL del inóculo láctico y 10 uL de Pseudomonas.

Todos los medios utilizados fueron ajustados a pH 5,7-5,9, para no alterar la acidez de la carne de pollo (pechuga) fresca (Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).

4.1.3.- Preparación de la carne estéril.

Se adquirieron bandejas de pechugas de pollo sin marinar de la principal empresa avícola del país, en supermercados locales. Luego, fueron transportadas al laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA, manteniendo la cadena de frío (<4 ºC).

La carne fue cortada manualmente en condiciones asépticas, logrando trozos de 3x3x1 cm, con una superficie de 9 cm2 disponibles para la inoculación experimental. Luego las muestras fueron congeladas en bolsas de polietileno (Ziploc® para congelar) a -18 ºC.

La carne congelada fue esterilizada por radiación gamma (25 kGy durante 12 horas) en la Comisión Chilena de Energía Nuclear (CCHEN). Se compararon las características organolépticas de la carne esterilizada con las de una no irradiada visualmente. La esterilización de las muestras fue corroborada mediante RAM el día 0 y 7 post almacenamiento a 8±2 ºC.

4.1.4.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC.

Los trozos de pechugas de pollo, sin marinar, esterilizados (n=60), se descongelaron a 8 ± 2 ºC. 10 trozos fueron asignados aleatoriamente a cada uno de los tratamientos detallados en la Tabla 15. Una de las superficies del pollo, de 9

cm2, fue contaminada experimentalmente inmediatamente después de la preparación del inóculo bacteriano.

Luego los tratamientos fueron incubados a 8 ± 2 ºC en aerobiosis sin agitación durante 4 días. Cada día se hicieron recuentos de Pseudomonas en agar CFC (22 ºC, 48 hrs, aerobiosis) y Lactobacillus en MRS (37 o 30 ºC, 48 hrs, anaerobiosis o aerobiosis para LB o L63 y L. sakei CECT 4808 respectivamente). El ensayo fue realizado en duplicado.

39

Tabla 15: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 en la prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ± 2 ºC durante 4 días.

Tratamiento Bacteria láctica

Desafiante Bacteria alterante

Desafiada

T0 SF

P. fragi 1,1 103 UFC/cm2

T1 L. 63 106 UFC/cm2

T2 L. sakei CECT 4808*

T3 L. B 108 UFC/cm2 T4 L. 63

T5 L. sakei CECT 4808*

*Cepa utilizada como control positivo. SF=suero fisiológico

4.1.5.- Análisis estadístico

Los recuentos de Pseudomonas y de Lactobacillus fueron reportados como medias ± desviación estándar.

Se evaluó si Lactobacillus retrasan la multiplicación de Pseudomonas

mediante un MLGM (Infostat®) utilizando estructura factorial con parcela anidada para modelar la covarianza entre los tiempos evaluados considerando el siguiente modelo matemático:

Donde: • Yijk: recuento bacteriano observado en la k-ésima parcela, en el j-ésimo tiempo

e i-ésimo tratamiento.

• : media general de los recuentos de bacterianos. • Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3, 4, 5.

• Aj: Efecto del j-ésimo tiempo; j = 0, 1, 2, 3, 4 • (TA)ij: Efecto de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y j-ésimo tiempo. • Pk: Efecto de la k-ésima parcela (correlación entre los tiempos) k= 1, 2,.., 12. • eijk= Efecto del error experimental del ijk-ésimo recuento bacteriano.

Para comparar los recuentos bacterianos dentro de cada tiempo, se usó la prueba post-hoc LSD de Fisher con un p valor corregido por Bonferroni para minimizar el error debido al alto número de comparaciones múltiples.

4.2.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC.

Esta prueba se realizó para evaluar in situ, la sensibilidad de Pseudomonas spp. intrínsecas en la carne de pollo, frente a Lactobacillus potenciales bio-controladores. Esta prueba considera el error experimental debido a la eventual interacción (sinergismo, antagonismo o competencia) de las bacterias desafiadas y desafiantes con otras especies bacterianas presentes en la microbiota del pollo.

Yijk

= + Ti + A

j + ()

ij+ P

k + e

ijk

40

4.2.1.- Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.

Lactobacillus spp.: en base a los resultados de la prueba de antagonismo in situ en carne estéril, se seleccionó sólo a L. sakei 63 nacional por presentar alguna capacidad antagonista en algunos tiempos de la prueba [Figura 24]. Además se utilizó a L. sakei CECT 4808 (español) como control positivo de la prueba y se incorporó a L252 como control negativo, por no poseer actividad antagónica frente a P. fragi 1.1 en caldo refrigerado [Figura 21].

Lactobacillus fueron cultivados en caldo MRS e incubados a 30 ºC en aerobiosis.

4.2.2.- Preparación de los inóculos.

Un día previo al ensayo 100 mL de bacterias lácticas se ajustaron a una DO600nm 0,01 en caldo MRS y se incubaron a 30 ºC en aerobiosis (L63 y L sakei CECT 4808) o microaerofilia (L252) por 20 horas para alcanzar una concentración ≈109 UFC/mL. Luego fueron centrifugadas a 7.700 RPM por 10 minutos a 4ºC. El pellet de células fue lavado 2 veces con suero fisiológico y reconstituido en 10 mL de mismo diluyente, para alcanzar una concentración ≈1010 UFC/mL.

4.2.3.- Preparación de la carne

Se adquirieron bandejas de pechugas de pollo sin marinar de la principal empresa avícola del país, en supermercados locales. Luego, fueron transportadas al laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA, manteniendo la cadena de frío (<4 ºC).

La carne fue cortada manualmente en condiciones asépticas, logrando trozos de 1 cm3, con una superficie de 6 cm2 disponibles para la inoculación experimental.

4.2.4.- Prueba de antagonismo in situ en carne fresca a 8 ºC.

Los cubos de pechugas de pollo, sin marinar (n=400), fueron asignados aleatoriamente a los 4 tratamientos detallados en la Tabla 16.

Tabla 16: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes en la prueba de antagonismo in situ en carne fresca de pollo a 8 ± 2 ºC durante 4 días.

Tratamiento Bacteria láctica

Desafiante

T0 SF

T1 L.63 108 UFC/cm2 T2 L.252*

T3 L. sakei CECT 4808**

*Cepa utilizada como control negativo. ** Cepa utilizada como positivo. SF=suero fisiológico

La inoculación experimental se llevó a cabo en una bolsa de polietileno contenedora de los 100 cubos de carne de pollo que se contaminaron con 10 mL del tratamiento preparado previamente con una pipeta. Los cubos fueron

41

homogenizados manualmente para asegurar que el tratamiento cubriera todas las superficies, logrando una carga experimental ≈108 UFC/cm2 [Figura 7].

Luego 10 cubos de carne de pollo de cada tratamiento fueron repartidos en placas Petri e incubados a 8±2 ºC en aerobiosis sin agitación durante 4 días [Figura 7]. Los días 0, 2, y 4 se hicieron recuentos de Pseudomonas en agar CFC (22 ºC, 48 hrs, aerobiosis), enterobacterias en agar VRBG (Agar Bilis Glucosa con cristal violeta y rojo neutro, Oxoid, UK; 37ºC, 24 hrs, aerobiosis) y Lactobacillus en MRS (30 ºC, 48 hrs, aerobiosis o microaerofilia para L.63 y L. sakei CECT 4808 o L.252 respectivamente).

El ensayo fue realizado en duplicado.

Figura 7: Preparación de la prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC. a) Bolsa de polietileno con 100 cubos (≈1 cm3) de pechugas de pollo, sin marinar, inoculados con 10 mL de tratamiento láctico (≈108 UFC/cm2). b) 10 cubos de carne de pollo, pre-inoculados con el tratamiento láctico (≈108 UFC/cm2), en placas petri que fueron incubadas a 8 ± 2ºC durante 4 días.

4.2.5.- Análisis estadístico

Los recuentos de Pseudomonas, enterobacterias y de Lactobacillus fueron reportados como medias ± desviación estándar en escala logarítmica.

Se evaluó si Lactobacillus retrasan la multiplicación de Pseudomonas o enterobacterias mediante un MLGM (Infostat®) utilizando estructura factorial con

a) b)

42

Bloque y parcela anidada para modelar la covarianza entre los tiempos evaluados y modelación de la varianza, considerando el siguiente modelo matemático:

Donde: • Yijkl: recuento bacteriano observado en la l-ésima parcela del k-ésimo

bloque, en el j-enésimo tiempo e i-ésimo tratamiento.

• : media general de los recuentos de bacterianos. • Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3, 4, 5. • Aj: Efecto del j-ésimo tiempo; j = 0, 1, 2, 3. • (TA)ij: Efecto de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y j-ésimo tiempo. • Blk : Efecto del k-ésimo bloque (nº de ensayo); k = 1, 2. • Pkl: Efecto de la lk-ésima parcela (correlación entre los tiempos) k = 1,

2,…,16. • eijkl= Efecto del error experimental del ijkl-ésimo recuento bacteriano.

Para comparar los recuentos bacterianos dentro de cada tiempo, se usó la prueba post-hoc LSD de Fisher con un p valor corregido por Bonferroni para minimizar el error debido al alto número de comparaciones múltiples.

4.3.- Determinación de la estabilidad microbiológica de la carne fresca inoculada con el potencial bio-preservante L sakei 63.

Considerando que el deterioro de la carne de pollo coincide con el tiempo en que demoran las Pseudomonas en alcanzar a una carga ≈7,5 log UFC/cm2 (Bruckner et al., 2012a; Ghollasi-Mood et al., 2016), se calculó la estabilidad microbiológica, como indicador de la vida útil de la carne de pollo, a través de la siguiente ecuación:

Donde: t (7,5): Estabilidad microbiológica calculada (horas). N(t): Recuento de Pseudomonas spp. al final de la estabilidad microbiológica

(7,5 log UFC/cm2). N0: Recuento inicial de Pseudomonas spp. (log UFC/cm2).

Duración de la fase de latencia de Pseudomonas spp. (horas).

máx: Tasa máxima de multiplicación de Pseudomonas spp. (horas)

Los datos máx y fueron estimados ajustando el modelo de Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) con la herramienta en línea Dmfit (Combase, 2018) a los recuentos de Pseudomonas obtenidos en el ensayo de antagonismo in situ en carne fresca.

Se reportó la estabilidad microbiológica, como indicador de vida útil, de cada tratamiento y ensayo por separado, considerando la variabilidad de las microbiotas

Yijkl

= + Ti + A

j + ()

ij+ Bl

k + P

kl + e

ijkl

t (7,5) = N(t) - N0 +

máx

43

intrínsecas a la carne de pollo y además se reportaron como medias de los ensayos ± desviación estándar.

La efectividad del potencial bio-preservante se evaluó comparando la estabilidad microbiológica (horas) de la carne de pollo inoculada con los diferentes tratamientos mediante un MLGM (Infostat®) utilizando estructura factorial y bloqueando por el número de ensayo, considerando el siguiente modelo matemático:

Donde: • Yij: Estabilidad microbiológica observada en el i-ésimo tratamiento del j-

ésimo bloque.

• : media general de vida útil. • Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3. • Blj : Efecto del j-ésimo bloque (nº de ensayo); k = 1, 2. • eij= Efecto del error experimental de la ij-ésima vida útil

4.4.- Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808

L. sakei nacional y español fueron diferenciados mediante RAPD y PFGE

(electroforesis de campo pulsado).

4.4.1.- RAPD

Para caracterizar a ambos L. sakei se siguió el mismo protocolo de la prueba RAPD utilizada para caracterizar a los Lactobacillus en el punto 3.1.

La prueba fue realizada en duplicado con ADN extraído con kit comercial (Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega, USA) y utilizando el protocolo fenol-cloroformo.

4.4.2.- PFGE

Para realizar el PFGE se implementó un protocolo modificando la metodología recomendada para Listeria monocytogenes en la PulseNet (www.cdc.gov/pulsenet/index.html). Brevemente, los aislados fueron multiplicados en agar MRS por 24 horas a 30 ºC en aerobiosis, luego el inóculo fue ajustado a McFarland 10 en tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). 400 uL de la suspensión fue incubada con 100 uL de lisozima (20 mg/ml) durante 1 hora a 37 ºC. Posteriormente, 500 uL de la suspensión bacteriana se mezcló con 400 uL de una solución con sarcosyl (0,5%) y agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% en tampón TE. Cada molde de agarosa fue incubado en 5 mL de tampón de lisis (50 mM EDTA, 50 mM Tris, 1% sarcosyl, pH 8,0) y 25 uL de proteinasa K (20 mg/ml en Tris 50mM, 1% CaCl2) durante 18 horas a 50°C con agitación. Luego, los moldes fueron lavados 2 veces con agua ultra pura y 4 veces con tampón TE durante el 10 minutos a 50ºC. El molde de agarosa fue pre-incubado en el tampón de restricción (1X buffer J, 0,1 mg/ml BSA) durante 15 minutos y luego digerido en 200 uL del tampón con 50 U de enzima SmaI durante 18 horas a 30 ºC.

La electroforesis de campo pulsado se desarrolló en el equipo CHEF DR III (BioRad) en agarosa al 1% (calidad PFGE) y solución 0,5 X TBE (4,5 mM Tris-HCL,

Yij = + T

i + Bl

j + e

ij

44

4,5 mM ácido bórico, 0,125 mM EDTA, pH 8). Las condiciones de la electroforesis fueron: pulsos iniciales de 1 s; pulsos finales de 12 s; voltaje 6 V/cm, ángulo 120° y duración 15 horas a 14°C.

Los patrones de digestión PFGE fueron comparados con el programa Gel ComparII (Bionumerics© 2011, Applied Maths NV), utilizando el coeficiente de Dice basado en la posición de las bandas y método de agrupamiento UPGMA.

Ambas pruebas utilizaron a L. sakei ATCC 15521 como control.

45

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1.- ETAPA 1: Prevalencia, aislamiento, identificación y caracterización de Pseudomonas spp. alterantes.

1.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado.

El recuento de Pseudomonas spp. y de aerobios psicrótrofos en los filetes de pechugas de pollo marinado (15%) sin piel, después de 11 días, en promedio, de almacenamiento a 4ºC, fue de 8,32 ± 0,15 log UFC/g y 8,67 ± 0,10 log UFC/g respectivamente. Estos resultados demuestran que Pseudomonas spp. se

encuentra entre los principales microorganismos alterantes de los filetes de pollo comprados en supermercados a nivel nacional. Esto era esperable, ya que a nivel internacional, la mayoría de los estudios indican que este género bacteriano es el alterante primario de la carne de ave almacenada aeróbicamente en refrigeración (Russell et al., 1996; Mead, 2004; Ercolini et al., 2006; Oakley et al., 2013).

1.2- Selección e identificación molecular de las especies de Pseudomonas dominantes.

A partir de las muestras sembradas en agar CFC, se aisló 4 o 5 colonias prevalentes. En total se acumularon 46 aislados, de los cuales 42 (91%) fueron identificados como Pseudomonas spp. (mediante pruebas fenotípicas) y los 4 (9%) restantes fueron bacilos Gram negativos, pero oxidasa negativos y fermentadores de la glucosa. Frecuencias similares presentan Arnaut-Rollier et al. (1999), quienes señalan que el 98% de las colonias aisladas en agar CFC, a partir de muestras de pollo deteriorado, son Pseudomonas spp. y el 2% restante fueron bacterias Gram negativas pero oxidasa negativas. Estos altos porcentajes de recuperación de Pseudomonas spp. a partir del agar CFC era esperado dado la selectividad del medio.

La identificación molecular de los 42 aislados de Pseudomonas mediante las PCR múltiple y específica, determinó que 24 eran P. fragi, 14 P. fluorescens, 3 P. lundensis y 1 aislado no fue reconocido por los partidores utilizados [Figura 8]. Estos resultados concuerdan con las especies de Pseudomonas que encuentran Arnaut-Rollier et al. (1999) en pollo deteriorado de 3 u 8 días, pero no con Bruckner et al. (2012a), quienes informan que alrededor del 90% de las Pseudomonas spp. aisladas de pollo fresco o deteriorado de 1 o 6 días eran P. putida.

Liang et al. (2012) indican que la diversidad bacteriana y la microbiota asociada al deterioro de los productos avícolas frescos almacenados en condiciones aeróbicas a 4 ºC varía según el origen. De ahí la importancia de que cada industria trace las especies de Pseudomonas prevalentes en sus instalaciones. Además Arnaut-Rollier et al. (1999) indica una mayor diversidad de

46

especies en el pollo fresco en comparación con las del pollo deteriorado, demostrando una presión de selección entre las bacterias alterantes dominantes.

Figura 8: Especies de Pseudomonas dominantes en filetes de pechuga de pollo

marinados sin piel deteriorados a 4 ºC durante 11 días en promedio (n=42).

*No id: Cepas no identificadas por PCR múltiple ni específico utilizados.

La disparidad de especies reportadas en la literatura, puede explicarse porque, en general, las Pseudomonas psicrótrofas presentes en la carne de ave tienen un origen ambiental. Ellas pueden introducirse en los mataderos y plantas faenadoras en los pollos vivos (patas y plumas), a través de vectores y/o personal manipulador. Además, algunas especies pueden persistir por largos periodos de tiempo en las superficies de la industria como biofilms (Liang et al., 2012).

El uso de marinado, o inyección de salmuera, en la carne de pollo también puede explicar la variabilidad de la microbiota alterante. Las muestras de esta investigación fueron inyectadas con salmuera (agua, polifosfato de sodio, sal, carragenina, goma guar, goma xantan y maltodextrina), en contraste a las muestras usadas por Arnaut-Rollier et al. (1999) y Bruckner et al. (2012a). El marinado en la industria avícola es usado para resaltar el sabor, jugosidad, terneza y la vida útil de los productos (Alvarado y Mckee, 2007), pero simultáneamente, aumenta el contenido de agua libre, que promueve la multiplicación de los microorganismos, y

la carga bacteriana de la carne (Bohaychuk y Greer, 2003). Cerveny et al. (2009) indican que los sistemas de enfriamiento de carne con salmuera son importantes fuentes de contaminación con microorganismos que causan el deterioro.

1.3- Caracterización genotípica de Pseudomonas.

La prueba RAPD con mayor capacidad de discriminación y mejor resolución electroforética se obtuvo utilizando el partidor Oligo con una concentración de 0,5

57% P. fragi

33%P. fluorescens

7%P. lundensis

2%No id*

47

uM y 1 uL de ADN extraído por hervido en la mezcla de reacción; temperatura de alineamiento a 36 ºC en la PCR; un gel 1,8% agarosa; y una electroforesis a 70 volts durante 90 minutos con un volumen de carga de 5 uL. No se logra optimizar la RAPD con el partidor M13F; se obtienen electroforesis con bandas tenues y algunas veces difíciles de identificar. La mejor reacción se obtiene utilizando concentración de partidor 1,5 uM y 1 uL de ADN; un gel 1,8% agarosa; y una electroforesis a 70 volts durante 90 minutos con un volumen de carga de 10 uL [Figura 9].

Figura 9: Bandas de los perfiles electroforéticos de diferentes aislados de Pseudomonas predominantes aislados en filetes de pollo marinados deteriorados a 4ºC, en geles de agarosa al 1,8%, obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con 2 partidores diferentes: a) M13 (5´-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´) y Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

Se caracterizaron genéticamente 24 P. fragi, 14 P. fluorescens, 3 P. lundendis y 1 especie no identificada prevalentes en las 11 muestras de pollo en estudio utilizando la prueba RAPD con partidor Oligo [Figura 10].

Los 24 aislados de la especie P.fragi agruparon en 13 tipos RAPD (≥ 85% similitud) [Figura 10a], de los cuales 8 (61%) contienen aislados bacterianos

obtenidos de muestras de distintos lotes y tiempos de muestreo, mientras que los otros 5 tipos contienen sólo un aislado bacteriano.

Los 14 aislados de P. fluorescens generaron 12 tipos RAPD; la mayoría de los aislados (n=10; 71%) eran únicos genéticamente, 2 (14%) aislados de la misma muestra fueron similares genéticamente y sólo 2 (14%) aislados de diferentes lotes o muestras de pollo pertenecieron al mismo grupo clonal [Figura 10b]. Esto demuestra una mayor variabilidad genética de las P. fluorescens en comparación con las P. fragi.

En cuanto a la especie P. lundensis, los 3 aislados obtenidos en diferentes tiempos de muestreo o lotes de pollo, fueron agrupados en 2 tipos RAPD [Figura 10c].

La mayor cantidad de tipos RAPD en relación al número de cepas evaluadas de P. fluorescens (12/14) en comparación con P. fragi (13/24), revela una mayor diversidad genética de la primera especie en la carne de pollo muestreada. El bajo

48

número de aislados de P. lundensis (n=3), no permite comparar la diversidad genética relativa con las otras 2 especies dominantes.

Figura 10: Dendogramas de similitud genética de Pseudomonas predominantes aisladas a partir de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie, obtenidos mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, del inglés Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages) a partir del coeficiente de Dice, calculado según la posición de las bandas de los perfiles electroforéticos obtenidos por Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3). a) 24 P. fragi; b) 14 P. fluorescens; c) 3 P. lundensis; d) 1 Pseudomonas spp. *Id: señala identificación del aislado, representando, el primer dígito, al nº de muestreo y, el segundo, a la identificación del aislado dentro de la muestra. T: número de tipo o grupo clonal RAPD considerando un coeficiente de similitud de Dice de un 85% (Línea punteada).

Geornaras et al. (1999) establecieron una gran diversidad genética de P. fluorescens, aislados de muestras de pollo fresco recién faenado. Similar resultado

se evidenció en este estudio en pollo deteriorado. Una alta diversidad genética de Pseudomonas en la carne sugiere múltiples sitios o fuentes de contaminación durante la faena, procesamiento y envasado de la carne (Aslam y Service, 2008). Handley et al. (2018) sugieren incorporar a Pseudomonas spp. como indicadores

de contaminación microbiana por aislarse durante toda la línea de faena.

Este estudio evidencia la capacidad de P. fragi, P. fluorescens y P. lundensis de formar biopelículas y persistir en el tiempo en la planta faenadora o procesadora del pollo debido a la prevalencia de las mismas cepas (aislados con tipo RAPD común) en tiempos de muestreo distantes [Figura 10a,b,c].

a) P. fragi b) P. fluorescens

c) P. lundensis

d) Pseudomonas spp.

49

Las biopelículas son comunidades estructuradas de microorganismos que están encapsulados por sustancias poliméricas extracelulares o exopolímeros (EPS), compuestos principalmente de polisacáridos, proteínas, ADN extracelular y lípidos (Liu et al., 2015). En las superficies de las plantas faenadoras y procesadoras de pollos se depositan gran cantidad de residuos ricos en proteína, lípidos y agua, lo que favorece la formación de las biopelículas (Rossi et al., 2017).

Las biopelículas presentan mayor resistencia a los biocidas usados en la industria alimentaria, entre ellos desinfectantes, antibióticos, detergentes, agentes quelantes o una combinación de ellos, entre otros (Scher et al., 2005, Masák et al., 2014). Donlan y Costerton (2002) reportan que los desinfectantes disminuyen su efectividad principalmente, porque la matriz de EPS de la biopelícula enlentece la penetración del agente antimicrobiano hasta las células (entre otros). Además, Kumar y Anand (1998) indican que, después de un tratamiento con biocida, las células bacterianas pueden incrementar la producción de exopolímeros, como respuesta de defensa, dejando sin efectividad al producto.

En la literatura se describe que cepas de P. fragi, P. fluorescens y P. lundensis, pueden producir exopolímeros que les confiere la capacidad primaria de formar biofilms (Sasahara y Zottola, 1993; Allison et al., 1998, Liu et al., 2015). Pero además se describe que P. fluorescens produce proteína LapA, una adhesina que participa en el anclamiento de las células a la superficie donde se formará el biofilm (Masák et al., 2014), moléculas de comunicación entre células o de “quorum-sensing” (acil-homoserin lactonas, acyl-HSLs), necesarias para una estructura del biofilm tridimensional más estable y resistente (Watnick y Kolter, 2000) y también exopolisacaridasas, necesarias para la separación y dispersión de las células del biofilm (Allison et al., 1998).

En general, las biopelículas son comunidades microbianas multi-especies, por lo tanto, pueden co-existir alterantes de la carne como Pseudomonas spp. y patógenos como Salmonella spp., Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes

(Chasseignaux et al.¸2001, Watnick y Kolter, 2000, Rossi et al., 2017), de ahí la importancia de identificarlos, controlarlos y erradicarlos de la industria avícola.

1.4- Caracterización fenotípica de Pseudomonas.

Las Pseudomonas dominantes aisladas en el estudio se caracterizaron

fenotípicamente por capacidad de producción de biosurfactante, proteasas, lipasas, lecitinasas y habilidad de multiplicación a 37 ºC. Los perfiles fenotípicos de los aislados bacterianos según especie, se observan en la Figura 11. Las frecuencias absolutas y relativas de las variables analizadas según especie se detallan en el anexo 2.

Ninguna de las 42 Pseudomonas aisladas, presenta actividad biosurfactante detectada por la prueba de colapso de gota usando Pennzoil® o aceite mineral, ni cuando se incubaron en medio de sales minerales o en medio mínimo E con agitación a 25 ºC hasta 14 días como lo proponen Bodour y Miller-Maier (1998) o Youssef et al. (2004). Esto difiere de los datos reportados por Mellor et al. (2011), quienes reportaron que el 72% de las Pseudomonas spp. aisladas de trutro de pollo con cuero, producen biosurfactante. Esta disparidad puede deberse a las diferentes muestras de pollo utilizados. Los filetes de pechuga de pollo sin piel son

50

reconocidas por tener poca grasa, en contraste con los trutros de pollo con piel usadas por Mellor et al. (2011). Cases et al. (2003) indican que los microrganismos

responden a la presión selectiva del medio ambiente produciendo las enzimas adecuadas para maximizar la obtención de nutrientes.

Figura 11: Dendogramas de similitud fenotípica de Pseudomonas predominantes aisladas a partir de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie, obtenido mediante el análisis de promedio ponderado (WAG, del inglés Weighted average linkage) a partir del coeficiente Simple Matching (Distancia SM) calculado en base a la presencia/ausencia de las variables: capacidad biosurfactante, proteolítica, lipolítica, lecitinasa y de replicación a 37 ºC. a) 24 P. fragi; b) 14 P. fluorescens; c) 3 P. lundensis; d) 1 Pseudomonas spp.

*Id: señala identificación del aislado, representando, el primer dígito, al nº de muestreo y, el segundo, a la identificación del aislado dentro de la muestra. GF: número asignado al grupo fenotípico. Bios: capacidad de producción de biosurfactante. Prot: capacidad proteolítica. Lip: capacidad lipolítica. Lec: capacidad lecitinasa. 37 ºC: capacidad de replicación a 37 ºC por 48 hrs.

Según el dendograma de asociación las 24 P. fragi agrupan en 4 perfiles fenotípicos [Figura 11a]. Más de la mitad de los aislados fueron proteolíticos (66,6%), no lipolíticos (100%), no lecitinasa positivos (91,7%) y tenían una capacidad débil de replicación a 37 ºC (100%) [Anexo 2].

51

Estos resultados difieren de los esperados. Dado que el deterioro de la carne lo provocan directamente las enzimas liberadas al medio por parte de las Pseudomonas (Casaburi et al., 2015; Mellor et al., 2011; Nychas et al., 2008), se especulaba que la especie dominante en la carne de pollo sería capaz de producir todo el perfil enzimático testeado, similar a lo reportado por Franzetti y Scarpellini (2007). Ellos determinan que la mayoría de las P. fragi aisladas de diferentes

alimentos de origen animal, tienen actividad proteolítica y lipolítica y, alrededor de la mitad, lecitinasa, haciendo énfasis en que el perfil enzimático que producen las Pseudomonas es dependiente del alimento de origen. Caldera et al. (2016) establecen que la mayoría de las P. fragi aisladas de lácteos y hamburguesas no

deteriorados no son proteolíticas, ni lipolíticas ni lecitinasa positivas. Esta disparidad observada concuerda la variabilidad intrínseca que existe dentro de una especie (Lianou y Koutsoumanis, 2011).

Ercolini, et al. (2010) demostraron que la capacidad deteriorante de las P. fragi, determinada por su capacidad de liberar moléculas volátiles a partir de la carne, es independiente de las capacidades proteolíticas y lipolíticas que presentan in vitro. Esto se explica porque las bacterias en la superficie de los alimentos forman biopelículas, y en este estado, cambian su expresión enzimática en comparación con cultivos planctónicos. Liu et al. (2015) evidenciaron que la actividad proteolítica en los biofilms es mayor que en el correspondiente cultivo bacteriano in vitro.

En el dendograma también se evidenció que 14 P. fluorescens agruparon en 4 perfiles fenotípicos al igual que P.fragi [Figura 11b]. Pero in vitro, la primera

especie parece ser más versátil enzimáticamente, ya que todos los aislados fueron proteolíticos, productores de lecitinasa y la mayoría, lipolíticos (71,4%). Además el 71,6% tuvo una débil capacidad de multiplicación a 37 ºC sugiriendo que se trata de cepas adaptadas al frio [Anexo 2].

El perfil enzimático de la mayoría de las P. fluorescens fue el esperado para bacterias alterantes de carne. Estos resultados concuerdan, en parte, con Franzetti y Scarpellini (2007) cuando reportan que P. fluorescens son lecitinasa positivos, pero no cuando indican que la mayoría de los aislados tienen actividad proteolítica variable y poca o capacidad lipolítica. Al igual que con P. fragi, esta disparidad puede ser explicada por la variabilidad intrínseca existente dentro de una especie bacteriana (Lianou & Koutsoumanis, 2011).

En la Figura 11c se observa también que las 3 P. lundensis aisladas

presentaron diferente perfil fenotípico. Dos de ellas fueron proteolíticas y todas lipasas y lecitinasas negativas, similar a la mayoría de las P. fragi de este estudio. No obstante, a diferencia de P. fragi y P. fluorescens, 2 de las 3 P. lundensis presentaron una evidente capacidad de multiplicación a 37 ºC.

Está descrito que las Pseudomonas ambientales tienen un rango de multiplicación óptimo de 25 a 30 ºC y que no son virulentas para el humano. Sin embargo, se ha observado ciertas P. fluorescens con rango de replicación más permisivo, sobre 37 ºC, virulentas en células humanas (Scales et al., 2014). Considerando que 2 P. lundensis aisladas en este trabajo se replican a 37 ºC, se deben hacer estudios conducentes a evaluar si estas cepas presentan algún potencial patógeno no reportado.

52

En la Figura 11d también se observa el perfil fenotípico de la Pseudomonas spp. Ella produce todas las enzimas testeadas y tiene débil capacidad de multiplicación a 37 ºC, similar a la mayoría de las P. fluorescens de esta investigación.

La variabilidad enzimática observada, tanto entre especies como intra especie, confirma que el deterioro organoléptico de la carne no se debe sólo a una bacteria en particular, si no a un consorcio bacteriano que actúa sinérgicamente. Éste no sólo está formado por diferente especies de Pseudomonas, sino también por otras con menor habilidad deteriorante (menor tasa de replicación a bajas temperaturas y menor producción de volátiles aromáticos), pero capaces de sobrevivir en refrigeración y producir enzimas exógenas que degradan la carne de igual forma. La descomposición de la carne es un evento complejo, donde la producción de compuestos volátiles que marcan el rechazo del consumidor, es el primer evento perceptible de la cadena (Casaburi et al., 2015; Mellor et al., 2011; Nychas et al., 2008).

Como parte de la caracterización fenotípica de las Pseudomonas aisladas en el estudio, se evaluó, a 28 cepas representantes de cada tipo RAPD (P. fragi n=13, P fluorescens n=12, P. lundensis n=1, Pseudomonas spp. n=1) la sensibilidad

a ciprofloxacino, tetraciclina, polimixina B y sulfametoxazol-trimetoprim. Estos antibióticos fueron seleccionados por ser los representantes de las familias de antibióticos que más marcas comerciales tiene el SAG autorizadas para su uso en aves, que inhiben a bacterias Gram negativas [Anexo 3].

Las sensibilidades o resistencias a los antibióticos encontradas según especie de Pseudomonas se encuentran en la Figura 12 [Anexo 4]. Se observó una alta tasa de resistencia a sulfametoxazol-trimetroprim (23/28) y a polimixina B (2/28 intermedia y 11/28 resistente), menor a ciprofloxacino (2/28 intermedia) y nula a tetraciclina. Se observó multi-resistencia a 3 antibióticos en una cepa de P. fluorescens y a 2 antibióticos en 11 cepas, 9 P. fragi, 2 P. fluorescens y 1 Pseudomonas spp. Además se observaron 7 perfiles diferentes de sensibilidad a antibióticos [Figura 13], lo que evidencia la alta diversidad de Pseudomonas

alterantes presentes en el pollo.

Poca información existe en la literatura relacionada con la resistencia antibacteriana de Pseudomonas asociadas a alimentos. Demoliner et al. (2015), determinaron que todas las Pseudomonas aisladas de carne de pollo (n=50) y

búfalo (n=50) fueron resistentes al menos a 1 antibiótico comúnmente usado contra P. aeruginosa y que más del 90% poseía multi-resistencia; no obstante, ninguna cepa presentó resistencia a Sulfametoxazol-Trimetoprima o Ciprofloxacino. Lerma et al. (2014) indican que Pseudomonas aisladas de plantas faenadoras de corderos

son resistentes a Sulfametoxazol, Trimetoprima, Polimixina E y Tetraciclina (entre otros antibióticos), pero no a Ciprofloxacino. Similar resistencia a Sulfametoxazol-Trimetoprima y sensibilidad a Ciprofloxacino encontraron Arslan et al. (2011) en quesos.

Por otra parte, es importante destacar la multi-resistencia de P. fluorescens aisladas de muestras clínicas o de heces de pollos citada en la literatura (Adeleke y Omafuvbe, 2011; Trivedi et al., 2015), coincidiendo con que la única cepa, en el presente estudio, multi-resistente a 3 antibióticos perteneció a la misma especie.

53

Figura 12: Susceptibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol-Trimetoprim, Polimixina B, Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas alterantes dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie y en total, mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar. *S-T= Sulfametoxazol-Trimetoprim; Pol B= Polimixina B; Cip= Ciprofloxacino; Tet = tetraciclina.

Figura 13: Perfiles de sensibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol-Trimetoprim, Polimixina B, Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas alterantes dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.

*Rojo: resistente; Amarillo: Intermedia; Blanco: sensible. S-T: Sulfametoxazol-Trimetoprim; Pol B: Polimixina B; Cip: Ciprofloxacino; Tet = tetraciclina. P. fra: P. fragi; P. flu: P. fluorescens; P. lun: P. lundensis; s/id: Pseudomona spp.

Las altas tasas de resistencia a antibióticos encontradas en este estudio cobran importancia ya que otros autores sugieren que es más probable la

54

transmisión horizontal de genes de resistencia entre bacterias comensales y patógenas del mismo ecosistema, que la transferencia directa entre patógenos (Wang et al., 2006); más aún cuando en la carne de pollo conviven Pseudomonas y patógenos Gram negativos, como Campylobacter jejuni o Salmonella enteritidis. Es importante continuar con la investigación para evaluar si la resistencia detectada es transmisible o no.

1.5.- Comentario final de la etapa 1.

En esta etapa de tesis, se conocieron las especies prevalentes de Pseudomonas asociadas con el deterioro a 4 ºC de muestras de filetes de pechuga

de pollo marinados sin piel con diferente fecha de producción y se caracterizó y comparó su diversidad genotípica y fenotípica, tanto intra como inter especies.

La literatura disponible describe la diversidad de Pseudomonas en carne fresca de ave, no en productos deteriorados. A nivel nacional, en cambio, se desconoce la composición de la microbiota de la carne de ave tanto fresca, como deteriorada y, por lo tanto, se especuló que el tiempo de almacenamiento hasta el deterioro, seleccionaría alguna especie en particular y unas pocas cepas. Al contrario, el estudio demostró, que en nuestro medio, las especies alterantes más frecuentes son Pseudomonas fragi, P. fluorescens y P lundesis al final de la vida útil (10-12 días) y reveló una evidente variabilidad fenotípica y genotípica entre y dentro de las especies prevalentes. Varios estudios (Nauta, 2002; Aguirre et al., 2009; Lianou y Koutsoumanis, 2011) sugieren que los desafíos antibacterianos, las evaluaciones de riesgos microbiológicos, plan HACCP y modelos matemáticos de sobrevida y/o multiplicación bacterianos deben incluir a la variabilidad biológica para alcanzar el objetivo de inocuidad y reducir las pérdidas debidas al deterioro de los alimentos.

Los resultados de esta tesis revelan la importancia de conocer a las Pseudomonas alterantes prevalentes en cada planta faenadora y/o procesadora, y si ellas persisten a corto y largo plazo. Sugerimos que, dada la variabilidad fenotípica encontrada, las cepas de Pseudomonas pueden tener diferentes

cinéticas microbianas y variable resistencia a los sanitizantes. Se deben considerar futuras investigaciones en estos tópicos.

1.6.- Publicaciones derivadas de la etapa 1.

Los resultados obtenidos en esta etapa fueron presentados en:

XXIV Congreso Latinoamericano de Avicultura, 2015: póster “Resistencia

antibacteriana de Pseudomonas alterantes de pollo”. [Anexo 18]

Revista LWT – Food Science and Technology, 2016: publicación

“Phenotypic and genotypic characterization of Pseudomonas spp. present

in spoiled poultry fillets sold in retail settings”. [Anexo 19].

XXXIX Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2017: póster

“Genotypification of spoilage poultry Pseudomonas by RAPD as a simple

tool to identify indirectly biofilms in the processing line” [Anexo 20].

55

2.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro.

2.1.- Selección y caracterización molecular Lactobacillus ssp.

Se caracterizaron 54 Lactobacillus spp. mediante RAPD, tanto con partidor Oligo (10 mer), como con M13F (15 mer). El partidor con mayor poder de discriminación y resolución electroforética fue el Oligo [Figura 14], ya que genera

mayor número de bandas en mayor cantidad de cepas en comparación con M13F. Esto era esperado debido al tamaño de los partidores; es conocido que partidores más pequeños tendrán mayor probabilidad de alinearse con el ADN que uno de mayor tamaño (Hadrys et al., 1992).

A) B)

Figura 14: Bandas de los perfiles electroforéticos de Lactobacillus spp., obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con 2 partidores diferentes: A) M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`) y B) Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`).

Se determinó que 32/54 Lactobacillus spp. analizados eran diferentes según el partidor Oligo (≥85% similitud) [Figura 15]. Además, con el partidor M13 se

detectó diferencias entre cepas en 2 grupos clonales, estableciendo un total de 35 cepas diferentes.

Finalmente se seleccionaron 27 Lactobacillus spp. para la siguiente prueba, ya que no se consideraron aquellas cepas con halo de inhibición menor a 4 mm frente a Salmonella enteritidis o Listeria monocytogenes (n=5) y tampoco a las cepas de referencia (n=3).

2.2.- Prueba de inhibición selectiva “spot en doble capa” (SDC).

Con esta prueba se determinó el antagonismo entre 9 cepas de Pseudomonas (5 P. fragi, 3 P fluorescens, 1 P. lundensis) y 27 Lactobacillus spp. previamente seleccionados, utilizando un agar base MRS modificado (MRSm) que no inhibe a Gram negativas como el tradicional [Anexo 6].

56

S. ente

ritidis

HI (m

m)

L. m

on

ocyto

ge

nes

HI (m

m)

Origen

W 13 11 Leche

X 13 10 Deposición

T 18 9 Deposición

V 6 11 Queso

J 16 12 L. plantarumCR

Q 15 11 Leche

G 14 11 Queso

F 13 13 Queso

Y 4 4 Queso

E 16 10 Deposición

U 4 3 Verdura

G 13 10 Leche

N 10 1 Deposición

R 15 9 Deposición

P 5 5 L. johnsoniiCR

A` 12 7 Queso

B` 15 12 Queso

D` 9 3 Queso

S 13 7 Deposición

B 10 11 Deposición

A 1 10 Deposición

I 12 12 L rhamnosusCR

H 13 9 Deposición

C` 12 11 Queso

C 8 7 Deposición

D 8 9 Deposición

O 11 8 Deposición

K 13 7 Deposición

M 15 9 Deposición

L 14 9 Deposición

S. ente

ritidis

HI (m

m)

L. m

on

ocyto

ge

nes

HI (m

m)

P522a 7.5 5

P622 5.5 8.5

P612 7.5 5.5

P611 6.15 6

P542 6 5

P651 6.5 10

P151 7 4

P221 7.5 6

P222 6.5 6

P223 9 6.5

P341a 6 9

P342 5.75 10

P121 8.5 10

P252 7 4

P33 7.5 6

P341 5.5 4

P252 6.5 4

P33a 4 3.5

P632 5.5 9.5

P241 3.5 6

P431 5 4

P432 6.5 4.5

P522b 3.5 4

P532 6.5 2

94.1

94.1

88.2

71.2

57.8

75.0

31.3

50.0

35.6

27.6

87.5

84.7

38.6

22.1

57.9

94.7

86.0

88.9

81.1

44.4

87.5

31.6

19.6

RAPD Lacto

100

80

60

40

20

RAPD Lacto

.

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W

X

T

V

J

Q

G`

F

Y

E

U

G

N

R

P

A`

B`

D`

S

B

A

i

H

C`

C

D

O

K

M

L

Leche

Deposición

Deposición

Queso

Ref L plantarum

Leche

Queso

Queso

Queso

Deposición

Verdura

Leche

Deposición

Deposición

Ref L johnsonii

Queso

Queso

Queso

Deposición

Deposición

Deposición

Ref L rhamno.

Deposición

Queso

Deposición

Deposición

Deposición

Deposición

Deposición

Deposición

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A)

95.2

91.8

88.9

62.5

94.1

49.3

45.8

93.3

77.5

37.2

30.7

87.5

27.5

57.1

50.2

31.8

22.6

19.3

15.2

RAPD Lacto

100

80

60

40

20

RAPD Lacto

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P522`a

P622

P612

P611

P542

P651

P151

P221

P222

P223

P341`

P342

P121

P251

P33

P341

P252

P33`

P632

P241

P431

P432

P522``

P532

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

Pollo

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Figura 15: Dendograma de asociación de 54 Lactobacillus spp. obtenido mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages) a partir del coeficiente de Dice calculado según la posición de las bandas de los perfiles electroforéticos obtenidos por Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3) y tamaño de halo de inhibición (HI) frente a Salmonella enteritidis ATCC 2190 y Listeria monocytogenes ATCC 19114 utilizando prueba de spot con doble capa en agar MRS con bicarbonato al 2%, modificado, sin sustancias inhibidoras de Gram negativos (acetato de sodio, citrato de amonio). *CR: Cepas de referencia. Línea punteada: indica límite de similitud genética de Dice al 85%. En Rojo: cepas seleccionadas para ensayo de antagonismo in vitro de spot con doble capa.

B) Lactobacillus spp. de origen aviar Lactobacillus spp. otros orígenes

57

En el agar MRSm no tamponado, todos los Lactobacillus antagonizan a todas las Pseudomonas con amplios halos de inhibición. Esto era esperado ya que es conocida la sensibilidad de las Pseudomonas a los ácidos orgánicos. (Gordon y Dilts, 1995; Ouattara et al., 1997)

Al comparar los halos de inhibición generados en el agar MRSm con los del MRSm bicarbonato, se observa una disminución general en sus tamaños [Figura 16, 17, 18], e incluso el efecto antagonista se pierde en el agar tamponado. 5 cepas de Lactobacillus spp. no antagonizan a 1 o más cepas de Pseudomonas, sugiriendo que la actividad antagonista se debe a la producción de ácidos orgánicos y/o cambio de pH, en conjunto con otras sustancias.

Figura 16: Halos de inhibición ejercidos por 2 cepas de Lactobacillus spp., X e Y, sobre Pseudomonas lundensis 12.1 en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (izquierda) y con bicarbonato al 2% (derecha).

En la Figura 17 y 18 se evidencian los tamaños promedios de halos de inhibición en agar MRSm o MRSm+bic según Lactobacillus o Pseudomonas.

Figura 17: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 Lactobacillus sobre 10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de pollo, en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2% (MRSm+bic; azul).

MRSm MRSm+bic

Lactobacillus

58

Figura 18: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas antagonizadas por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2% (MRSm+bic; azul).

PF: P. fluorescens usado como control en la prueba.

El modelo matemático propuesto evidenció que el antagonismo entre las bacterias desafiadas se debió tanto al efecto de los tratamientos lácticos, como a la sensibilidad de las Pseudomonas spp., sin existir interacción entre ambos factores, tanto en agar MRSm, como en MRSm+bic (p>0,01). En las Figuras 19 y 20 se observan las diferencias de los halos medios generados por Lactobacillus o Pseudomonas en MRSm tamponado. El análisis estadístico no consideró a las cepas que no antagonizaron a una o más Pseudomonas (121, 342, 432, 532, 651 e Y).

Figura 19: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 Lactobacillus sobre 10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de pollo, en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) con bicarbonato al 2%.

*Letras distintas indican diferencias con significancia estadística (p<0,05).

MRSm MRSm+bic

Pseudomonas

Lactobacillus

59

Figura 20: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas antagonizadas por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) con bicarbonato al 2%. *Letras distintas indican diferencias con significancia estadística (p<0,05). PF: P. fluorescens usado como control en la prueba.

2.3.- Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC.

Al comparar los recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada con los

tratamientos en el tiempo, se evidenciaron diferencias dependientes de la interacción entre el tratamiento aplicado y el tiempo (p<0,0001) [Figura 21, Anexo 10]. Esto demuestra la sensibilidad de la cepa frente a algunas bacterias lácticas.

La cepa nacional, aislada a partir de carne de pollo, Lactobacillus 63 (L63),

a una concentración inicial ≈8 log10 UFC/mL, ejerció el mayor efecto antagonista sobre P. fragi 1.1, similar a la cepa control Lactobacillus CECT 4808. En el día 4 se observó una diferencia ≈5 log10 UFC/mL entre los recuentos medios de Pseudomonas en T0 y los tratamientos Lactobacillus 63 o CECT4808. Este efecto bio-controlador se mantiene en el tiempo, llegando a recuentos de Pseudomonas cercanos a 0 en los días 5 y 6 de ensayo. [Figura 21, Anexo 10].

La cepa L.63 también antagonizó a P. fragi a una concentración inicial ≈6 log10 UFC/mL, pero el efecto fue de menor magnitud que a una concentración más alta y a partir del día 5. Similar comportamiento presentaron Lactobacillus B y el set Lactobacillus 252 + Lactobacillus B, a concentración inicial ≈8 log UFC/mL, pero no a una concentración menor, [Figura 21, Anexo 10].

Los resultados anteriores concuerdan con lo publicado por Goodarzi et al.

(2016a), quienes demostraron que la magnitud del antagonismo depende de la concentración inicial de la bacteria láctica.

Al medir el pH del medio en los diferentes tratamientos y tiempos, se observó que disminuyó hasta ≈4.4 en la mayoría de los tratamientos al día 4 de ensayo, excepto con el Lactobacillus 252, que lo hizo hasta ≈5,0 el mismo día. Esto demuestra que la magnitud de la producción de ácidos orgánicos por parte de las bacterias lácticas es diferente.

Pseudomonas

60

Figura 21: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 5 tratamientos lácticos, inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8 log UFC/mL) durante 6 días, en prueba de inhibición competitiva en caldo TSBYE a 8 ºC.

*T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias. TSBYE: Caldo tripticasa soya, 0,6% extracto de levadura. Línea punteada: tratamiento bacteriano ajustado a concentración inicial ≈6 log UFC/mL. Línea sólida: Tratamiento bacteriano ajustado a concentración ≈8 log UFC/mL; Letras distintas indican medias diferentes con significancia estadística dentro de cada tiempo (p<0,0001).

Especulamos que la cepa nacional L.63, al igual que L. sakei CECT 4808,

pudieran producir alguna sustancia antagonista distinta, concomitante a los ácidos orgánicos, que actuaría en forma sinérgica a la caída del pH. Esto porque ambas cepas retrasan en mayor magnitud la multiplicación de las Pseudomonas que Lactobacillus B, aun cuando las 3 cepas disminuyen el pH del medio a un nivel

similar.

Por otra parte, al comparar los recuentos medios de Lactobacillus en el tiempo mediante MLGM, también se observa una diferencia con significancia estadística dependiente de la interacción entre el tiempo y tratamiento aplicado (p<0,0001) [Figura 22, Anexo 11].

Dentro de la mayoría de los tratamientos, excepto en ambas concentraciones de Lactobacillus 252, se observa diferencias con significancia estadística al comparar los recuentos medios de Lactobacillus entre los diferentes tiempos, sin embargo, sólo en 5 tratamientos (Lactobacillus 63 y CECT 4808 a una concentración inicial ≈6 log UFC/mL y Lactobacillus B, 252+B, y 63 a una concentración inicial ≈8 log UFC/mL) se muestran diferencias entre los tiempos 0 y 6 mayores a 1 log, demostrando una evidente capacidad de multiplicación en frio

a

b

c

c

a

b

a

b

c

61

[Figura 22, Anexo 11]. Es importante mencionar que las cepas con mayor capacidad de replicación a bajas temperaturas, coinciden con las cepas con el mayor efecto antagonista frente a P. fragi 1.1, con excepción del tratamiento TCECT4808.8 que no evidencia una clara diferencia entre el recuento al día 0 y al día 6.

Figura 22: Recuentos medios de Lactobacillus desafiantes de P. fragi 1.1, inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8 log UFC/mL, en prueba de inhibición competitiva en caldo TSBYE a 8 ºC durante 6 días. * TSBYE: Caldo tripticasa soya, 0,6% extracto de levadura. Línea punteada: tratamiento bacteriano ajustado a concentración inicial ≈6 log UFC/mL. Línea sólida: Tratamiento bacteriano ajustado a concentración ≈8 log UFC/mL.

Este resultado concuerda con Doyle y Zhao (2009), quienes señalan que las bacterias lácticas bio-controladoras de L. monocytogenes aumentan su recuento

para antagonizar, desde 6 log UFC/mL hasta ≈ 9 log UFC/ml entre el día 1 y 7 de ensayo a 8ºC en TSBYE; pero no con Amézquita y Brashears (2002), quienes indican que las BALs pueden ejercer su antagonismo en refrigeración, incluso sin multiplicarse, cuando se adicionan en un medio a altas concentraciones (>107 UFC/mL). Ellos evidenciaron que un consorcio de bacterias lácticas antagonizan a L. monocytogenes en caldo MRS aumentando menos de 1 log UFC/mL en 28 días a 5 ºC.

Considerando los resultados, se seleccionó a Lactobacillus 63 y B para los desafíos de Pseudomonas spp. in situ en carne de ave fresca.

62

2.4. Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio.

Al comparar la secuencia del gen ribosomal 16S de Lactobacillus 63 y B, potenciales bio-preservantes, con las bases de datos GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) y Ribosomal Database Project (https://rdp.cme.msu.edu/), se concluye que se identifican como L. sakei y L. rhamnosus respectivamente, ambas especies son consideradas como seguras para el consumo humano según la EFSA (2017).

2.5.- Aproximación a la inocuidad de las cepas de Lactobacillus.

2.5.1.- Prueba de hemólisis

Ambas cepas presentaron hemólisis α o incompleta, no evidenciando peligro para el consumo humano [Figura 23].

Figura 23: Hemólisis α o incompleta de L. rhmanosus B, L. sakei 63 y CECT 4808 (E) usado como control, en agar Columbia 5% sangre de cordero.

En varios estudios se utiliza esta prueba para determinar, en parte, la inocuidad de las cepas lácticas, considerando como peligrosas sólo a aquellas bacterias con potencial hemolítico (Maragkoudakis et al., 2009). En la hemolisis incompleta, a diferencia de la hemólisis completa, el estroma de los eritrocitos permanece intacto; el color verdoso se debe a que la oxihemoglobina es degradada y convertida a metahemoglobina induciendo el tono (Bauer et al., 1968).

2.5.2.- Prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar:

La sensibilidad a antibióticos de los potenciales bio-preservantes seleccionados, en conjunto con las respectivas especies de referencia, se detallan en la Tabla 17. Los patrones de resistencia observados son similares entre las

B 63

E

63

cepas nacionales y las de referencia, diferenciándose en 4 de 8 antibióticos evaluados (Gentamicina, Ciprofloxacino, Eritromicina y Clindamicina). Llama la atención que las cepas de referencia son resistentes a mayor número de antibióticos que las cepas nacionales.

Todas las cepas evaluadas fueron resistentes a Vancomicina, Metronidazol, Sulfametoxazol y Cotrimoxazol. Las 2 cepas nacionales (Lactobacillus 63 y B) y el L. sakei español fueron resistentes a Gentamicina. L. sakei nacional, L.63, es medianamente sensible al Ciprofloxacino, mientras que el español es resistente. Y por último la cepa de referencia LGG, es además resistente a Eritromicina y Clindamicina [Tabla 17].

Tabla 17: Perfil de resistencia a antibióticos de Lactobacillus 63 y B, potenciales bio-preservantes, y cepas de referencias L. sakei CECT 4808 y L. rhamnosus LGG obtenidos mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.

Antibiótico Potencial Bio-preservante Cepas referencia

L. sakei 63 L. rhamnosus B L. sakei CECT

4808 LGG

(L. rhamnosus) Ampicilina 10 ug S S S S

Ciprofloxacino 5 ug MS S R S

Tetraciclina 30 ug S S S S

Vancomicina 30 ug R R R R

Rifampicina 5 ug S S S S

Cloranfenicol 30 ug S S S S

Eritromicina 15 ug S S S R

Gentamicina 10 ug R R R S

Clindamicina 2 ug S S S R

*S: Sensible; MS: Medianamente Sensible; R: Resistente.

Para que las cepas bacterianas sean consideradas como seguras o QPS según EFSA, y puedan ser incorporadas como aditivos en alimentos, se debe comprobar, a través de pruebas moleculares o mediante revisión de la literatura, que la resistencia es intrínseca a su especie bacteriana y/o no transmisible y/o que la resistencia observada no se transporta en genes de resistencia presentes en alguna bacteria de la microbiota intestinal (EFSA, 2017; EFSA, 2018).

Especulamos que las cepas nacionales son seguras, ya que se han reportado Lactobacillus spp. resistentes intrínsecamente a la Vancomicina, aminoglucósidos, entre ellos la Gentamicina y Ciprofloxacino (Goldstein et al., 2015; Campedelli et al., 2019).

La Vancomicina inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a los terminales D-alanina de las unidades precursoras de la pared celular. Los Lactobacillus resistentes tienen D-lactato o D-serina reemplazando al aminoácido esencial, previniendo la unión del antibiótico (Goldstein et al., 2015). Es una de las resistencias más comunes entre Lactobacillus (Campedelli et al., 2019).

64

La resistencia intrínseca a los aminoglucósidos se debe a diversos mecanismos, pero principalmente a que los Lactobacillus, al ser anaeróbicos,

carecen de citocromos y, por lo tanto, no generan la cadena transportadora de electrones necesaria para la captación del antibiótico (Abriouel et al., 2015; Mella et al., 2004). No obstante lo anterior, se ha descrito que algunas cepas diferentes de L. sakei o rhamnosus pueden transportar esta resistencia en genes (aac(6’)-aph(2”),

ant(6), y aph(3’)-IIIa) que codifican enzimas modificantes de aminoglucósidos (EMA). Estas proteínas catalizan la modificación covalente de grupos aminos e hidroxilos de la molécula, generando modificaciones químicas que llevan al aminoglucósido a unirse débilmente a los ribosomas bacterianos. (Mella et al., 2004; Gueimonde et al., 2013; Abriouel et al., 2015).

Se describe la resistencia intrínseca de algunos Lactobacillus al Ciprofloxacino, sin embargo, el mecanismo aún es desconocido. (Abriouel et al., 2015). Hummel et al., (2007) no encontraron determinantes genéticos que pudieran

explicar este proceso, pero especulan que podría ser por factores como la estructura de la pared celular, permeabilidad o a algún mecanismo de eflujo. Petronio (2012) demostró in silico que una cepa de L. fermentum posee genes muy similares a otros presentes en S. aureus o L. lactis que codifican a bombas de eflujo

de quinolonas.

Si bien la mayoría de los Lactobacillus son sensibles a Eritromicina y Clindamicina, se ha observado que algunas cepas pueden poseer una resistencia adquirida a estos antibióticos a nivel cromosomal, y que por tanto, es de difícil transferencia horizontal (Campedelli et al., 2019). Más aún, Flórez et al., (2007) describieron una mutación puntual del gen 23S rRNA en una cepa de L. rhamnosus que disminuye la afinidad que requiere la Eritromicina y la Clindamicina por el ribosoma para ejercer su inhibición. Especulamos que los sucesivos pasajes del LGG en el laboratorio, podrían haber inducido una mutación espontánea similar a lo reportado por Flórez et al. (2007), ya que la cepa LGG es reconocida por su sensibilidad a estos antibióticos (Zhou et al., 2005; Flórez et al. 2007; Gotteland et al., 2014). Drago et al. (2011), demostraron que LGG puede aumentar su resistencia

a la Eritromicina con una exposición prolongada al antibiótico, sin embargo, no pudieron explicar este cambio a genes de resistencia ni a mutaciones genéticas.

Es importante mencionar que la selección de los antibióticos para esta prueba consideró al menos a 1 antibiótico de cada familia recomendada por la EFSA para Lactobacillus (Ampicilina, Vancomicina, Gentamicina, Eritromicina, Clindamicina y Cloranfenicol) (EFSA, 2012) y al Ciprofloxacino por ser uno de antibióticos de elección en salmonelosis severa y Campylobacter AMR (EFSA, 2017).

2.6.- Presentaciones derivadas de la etapa 2.

Algunos de los resultados obtenidos en esta etapa fueron presentados en:

XXXVIII Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2016: póster

“Actividad antibacteriana de Lactobacillus contra Pseudomonas

alterantes aisladas de pollo” [Anexo 21].

65

XL Congreso Latinoamericano de Microbiología - SOMICH, 2018:

póster “Bacteria láctica chilena antagoniza con Pseudomonas

alterantes de pollo in vitro e in situ, pero no logra extender

significativamente la vida útil de la carne para su uso industrial”

[Anexo 22].

66

3.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión de vida útil de la carne de pollo.

3.1. Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC.

Al comparar los recuentos medios de P. fragi 1.1 entre los tratamientos en el tiempo se evidencian diferencias con significancia estadística dependientes de la interacción entre el tratamiento aplicado y el tiempo (p=0,0004) [Figura 24, Anexo 10].

No obstante lo anterior, las diferencias observadas son de muy baja magnitud e incluso algunas no tienen sentido microbiológico real ya que son menores a 0,5 log UFC/cm2 [Figura 24, Anexo 10].

Figura 24: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 3 tratamientos lácticos, co-inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes concentraciones iniciales, almacenados a 8 ºC durante 4 días. *T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias; Lactobacillus CECT4808: control (+). Línea punteada: tratamiento bacteriano ajustado a concentración inicial ≈6 log UFC/cm2. Línea sólida: Tratamiento bacteriano ajustado a concentración ≈8 log UFC/cm2. */ +: Indican diferencias con significancia estadística con respecto al grupo control negativo dentro de cada tiempo (p<0,05); *: Indica diferencia <0,5 log UFC/cm 2; +: Indica diferencia >0,5 log UFC/cm 2.

El único efecto antagónico evidente se observó con la cepa nacional Lactobacillus 6.3 a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, que en los día 2 y 3, disminuyó el recuento de P. fragi en 0,72 y 0,73 log UFC/cm2 respectivamente, con respecto al control negativo. [Figura 24, Anexo 12]. Este efecto lo logra

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aumentando en ≈1 log UFC/cm2 el 1º día de prueba y manteniéndose constante hasta el día 4 [Figura 25, Anexo 13].

Figura 25: Recuentos medios de Lactobacillus desafiantes de P. fragi 1.1, co-inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes concentraciones iniciales, almacenados a 8 ºC durante 4 días. *Línea punteada: tratamiento bacteriano ajustado a concentración inicial ≈6 log UFC/cm2. Línea sólida: Tratamiento bacteriano ajustado a concentración ≈8 log UFC/cm2.

La baja capacidad bio-preservante de las cepas testeadas, difiere de lo demostrado en la prueba de antagonismo in vitro en medio líquido a 8 ºC, donde las cepas nacionales, Lactobacillus B y 63, y la española, Lactobacillus sakei CECT4808, antagonizaron con la cepa alterante desafiada [Figura 21, Anexo 10]. También llama la atención que L. sakei CECT 4808, que antagonizó con Pseudomonas spp. en carne de vacuno envasada al vacío (Katikou et al., 2005), tampoco ejerció el efecto bio-preservante esperado en el pollo irradiado. Lo anterior

podría explicarse por las diferentes matrices utilizadas: TSBYE, carne de pollo o de

vacuno.

Por una parte, P. fragi 1.1 fue aislada a partir de carne de pollo, por lo tanto, es una cepa totalmente adaptada para multiplicarse en este medio y, no en TSBYE. Cases et al. (2003) indican que el entorno que rodea a un microorganismo contribuye a la expresión génica y a su adaptación al medio.

Además la tasa de producción de sustancias antibacterianas por parte de las bacterias lácticas, es dependiente de los nutrientes o de su disponibilidad en el medio, donde se incuba la cepa productora (Moretro et al., 2000; Aasen et al., 2000).

La concentración de glucosa libre en el medio es un factor crítico para la fermentación y producción de ácidos orgánicos; a mayor disponibilidad del carbohidrato en el medio, mayor será la producción de ácidos orgánicos y más rápido descenderá el pH, logrando el efecto antagonista esperado (Lücke, 1994;

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Shiraia et al., 2001). El medio TSBYE contiene glucosa en forma de dextrosa (D-glucosa) (BD, 2008), por lo tanto, es fácilmente utilizable por las bacterias presentes en el medio, en cambio la carne contiene muy poca glucosa, gran parte en forma de glucógeno dentro de las células musculares, siendo poco disponible y de difícil metabolización (Lücke, 1994; Lawrie, 1998).

Aasen et al., (2000) evidenciaron que la producción de bacteriocina de un L. sakei aumenta directamente proporcional a la concentración de extracto de levadura y triptona que contiene el medio. Ambos factores se encuentran en el TSBYE y no en la carne.

El estado de agregación de las matrices utilizadas en los ensayos (TSBYE-líquido v/s carne-sólido) afecta la tasa de difusión y dispersión tanto de las sustancias antibacterianas liberadas al medio, como de las bacterias. En el líquido la dispersión de las bacterias y metabolitos es mayor, por lo tanto, la probabilidad de encuentro, con la bacteria desafiada, será mayor, independiente de su naturaleza. Incluso Blom et al. (1997) comprobaron in vitro en agar que la difusión de Nisina y Pediocina se afecta, de manera diferente, dependiendo de la cantidad de grasa, pH y NaCl del medio, entre otros factores. Además en el medio sólido, las bacterias crecen en micro-colonias, y eventualmente, podrían hasta formar biofilms, protegiéndose de la acción de cualquier sustancia antibacteriana. Está descrito que P. fragi es iniciador de biofilms (Sasahara y Zottola, 1993)

Además, la estabilidad de las bacteriocinas se afecta en la carne. La grasa puede adsorber a los péptidos, no dejándolos disponibles para ejercer su efecto antagonista. Además durante el trozado de la carne cruda, se liberan proteasas intracelulares a la superficie de corte, por la disrupción de las fibras musculares, y por lo tanto, a mayor proceso de la carne (picado o molido) menor es la estabilidad o vida útil de las bacteriocinas (Aasen, et al., 2003; Favaro y Todorov, 2017). Más específicamente, Katla et al. (2002) señalan que la estabilidad y capacidad antagonista de la sakacina P sobre L monocytogenes, varía dependiendo de la matriz cárnica usada, demostrando que la estabilidad es menor en el pescado en contraste con el pollo.

Considerando todo lo anterior, se determinó que el menor efecto antagonista observado en esta prueba, no es concluyente para descartar el potencial bio-preservante de las cepas nacionales en pollo fresco.

Además como P. fragi 1.1 demostró ser algo sensible en pollo irradiado frente a la cepa nacional Lactobacillus 63, al menos, en 2 de los 4 días evaluados, se decidió inocularla en pollo fresco para evaluar si antagoniza con la diversidad de Pseudomonas, naturalmente presente en la microbiota alterante, y si esto se trasunta en una mayor vida útil del producto.

3.2. Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC.

Al comparar los recuentos medios de Pseudomonas spp. entre los tratamientos en el tiempo, se evidenciaron diferencias dependientes de la interacción entre el tratamiento aplicado y el tiempo (p<0,0001) [Figura 26, Anexo 10].

69

El efecto bio-controlador del Lactobacillus sakei nacional L.63 fue evidente. Retrasó la multiplicación de Pseudomonas spp. en la misma magnitud que la cepa española, usada como control positivo, y mejor que Lactobacillus spp. 252, usado como control negativo [Figura 26, Anexo 14]. El mismo efecto se observa sobre las enterobacterias [Figura 27, Anexo 15], aun cuando ninguna de las bacterias lácticas se multiplicó en el tiempo [Figura 28, Anexo 16].

El antagonismo de todos los tratamientos se observó a partir del día 2 y se mantuvo en día 4, cuando el deterioro microbiológico de la carne control (T0) fue evidente por el recuento de Pseudomonas spp. (>7,5 log UFC/cm2), pero también por las características organolépticas (olor principalmente).

Es importante mencionar que el pollo tratado con L. sakei 63, presentó un aroma más ácido, similar a la mantequilla, en conjunto con limo superficial, pero que no es rechazable por personal no entrenado (opinión personal 5 técnicos del laboratorio presentes a la hora del análisis) y, por lo tanto, especulamos que podría no ser un problema para el consumidor habitual. Castellano et al. (2010) informan un olor similar en carne de vacuno bio-preservada con bacterias lácticas, pero que no es rechazable para un panel de expertos. Se describe que las BALs en carne fresca producen un proceso de fermentación suave que no produce variaciones organolépticas evidentes, debido al bajo contenido de carbohidratos y fuerte capacidad de tamponamiento de la carne (Favaro y Todorov, 2017). El tratamiento con la cepa 252 no presentó dicho aroma, pero tampoco se encontró evidentemente rancio al día 4.

Además el efecto bio-preservante quedó evidenciado bajo la luz UV, donde el pollo inoculado con L. sakei nacional y español disminuyen la fluorescencia atribuible a algunas especies de Pseudomonas, probablemente P. fluorescens y P. putida (Palleroni, 2007), en comparación con ambos controles negativos (Lactobacillus 252 y el no inoculado) [Figura 29].

El mayor potencial bio-preservante evidenciado en esta prueba, en comparación con la prueba realizada sobre pollo esteríl, pudo deberse a múltiples factores que se discuten a continuación.

En la microbiota de la carne fresca conviven microorganismos que interactúan entre sí; la competencia por nutrientes esenciales, cambios en el pH por la producción de ácidos orgánicos o la producción de sustancias antimicrobianas, por parte de algunas cepas, afectan negativamente la supervivencia o la multiplicación de otros microorganismos (Huis in't Veld, 1996; Nychas et al., 2008). En la carne estéril no existe tal factor estresante basal; P. fragi no tiene competencia que limite su multiplicación, aparte del efecto del tratamiento aplicado externamente, en cambio, en el pollo fresco, el efecto de la microbiota concomitante y el efecto de la bacteria láctica, actúan de forma sinérgica para retrasar a Pseudomonas spp. Esto quedó en evidencia cuando comparamos la velocidad de multiplicación de la bacteria alterante en el grupo control (sin inocular) de ambos experimentos; P. fragi en pollo estéril mostró una tasa de multiplicación máxima

mayor (µmax= 0,08), en conjunto con un con un tiempo de generación menor (t= 3,76 horas) que Pseudomonas spp. en el pollo fresco (µmax= 0,06; t= 5,01 horas respectivamente).

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Figura 26: Recuentos medios de Pseudomonas spp. en carne de pollo fresca inoculada con 3 tratamientos lácticos diferentes, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

*T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias; Lactobacillus CECT4808: control (+); Lactobacillus 252: control (-). Letras distintas indican diferencias con significancia estadística dentro de cada tiempo (p<0,05).

Figura 27: Recuentos medios de Enterobacterias en carne de pollo fresca inoculada con 3 tratamientos lácticos diferentes, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días. *T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias; Lactobacillus CECT4808: control (+); Lactobacillus 252: control (-). Letras distintas indican diferencias con significancia estadística dentro de cada tiempo (p<0,05).

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Figura 28: Recuentos medios de Lactobacillus, potenciales bio-preservantes, inoculados en carne de pollo fresca, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

*T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias; Lactobacillus CECT4808: control (+); Lactobacillus 252: control (-).

Figura 29: Fluorescencia emitida por Pseudomonas fluorescens y/o putida en carne de pollo bio-preservada con diferentes Lactobacillus, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, posterior a 4 días de almacenamiento a 8 ºC, observada bajo luz UV. *T0= control (-),inoculado con suero fisiológico; 252= control (-), inoculado con Lactobacillus 252; CECT= control (+), inoculado con L. sakei CECT 4808; 63= inoculado con L. sakei nacional 63. UV: ultravioleta.

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Además en la etapa 2 de esta tesis se demostró in vitro que la actividad antagonista dependía tanto de la cepa láctica desafiante, como de la sensibilidad de la Pseudomona desafiada [Figuras 20 y 21]. En la carne fresca conviven varias especies e incluso varias cepas de Pseudomonas. En la etapa 1 de esta tesis, demostramos la gran variabilidad, tanto genética como fenotípica, de Pseudomonas presentes al final de la vida útil [Figuras 10 y 11]; especulamos que esta variablidad podría ser mayor en pollo fresco. Además la variabilidad de las Pseudomonas aisladas de pollo también fue demostrado al hacer curvas de crecimiento en TSBYE a 25 ºC sin agitación, donde P. fragi 1.1 resultó ser una de las más rápida entre 10 cepas seleccionadas [Anexo 17].

P. fragi 1.1 demostró ser una de las más sensibles frente a las bacterias lácticas en la prueba de spot en doble capa [Figura 20], sin embargo, es probable que no haya sido la más sensible en las pruebas in situ. La cepa láctica nacional L.63 seguramente antagonizó con mayor magnitud a otras Pseudomonas de la microbiota alterante, reflejandose en el recuento total de Pseudomonas spp. y, por lo tanto, evidenció de mejor manera su potencial bio-preservante, en comparación con el ensayo en carne estéril.

Lactobacillus sakei es una bacteria psicrotrófica láctica anaeróbica

aerotolerante, heterofermentadora facultativa, que se diferencia del resto de las bacterias lácticas porque tiene capacidades metabólicas especiales codificadas a nivel genómico, que reflejan su adaptación evolutiva para persistir en carnes y pescados (Chaillou et al., 2005; Hammes y Hertel, 2007; Nyquist et al., 2011). L. sakei metaboliza ribosa, además de nucleosidos y/o arginina como fuente energética alternativa, cuando se agota la glucosa en el medio (Chaillou et al., 2005; Rimaux et al., 2012).

L. sakei ha sido tradicionalmente utilizado en productos cárnicos

fermentados como el salame; durante las útimas décadas se ha estudiado su actividad antagonista sobre patógenos, principalmente L. monocytogenes, y más recientemente se discute su rol como bio-preservante de productos no fermentados. (Chaillou et al., 2005). En general se considera de uso seguro en alimentos (GRAS

o QPS) por su historial de inocuidad en productos fermentados, además de haber sido aislado a partir de heces humana, e incluso, se describe que algunas cepas producen sustancias beneficiosas para las personas, como los D-aminoácidos (Chaillou et al., 2005; Kato y Oikawa, 2017)

El efecto antibacteriano evidenciado por múltiples cepas de L. sakei en productos cárnicos, como cecinas fermentadas, fiambre de pollo, carne de pollo cocida y carne de vacuno envasados al vacío (Bredholt et al., 2001; Katla, et al., 2002; Castellano et al., 2010), y probablemente por la utilizada en la presente tesis, L.63, se puede explicar por la producción de ácidos orgánicos y también por otras sustancias como diacetilo, acetoína, etanol, peróxido de hidrógeno y/o bacteriocinas, que actúan sinérgicamente para ejercer el antagonismo (Chaillou et al., 2005) [Anexo 16].

L sakei, como todas las bacterias lácticas, producen ácido orgánicos. A partir de la homofermentación de la glucosa (glicógeno en carne), produce ácido láctico, mientras que a partir de la heterofermentación de la ribosa produce cantidades equimolares de láctico y acético y menor cantidad de ácido fórmico (Chaillou et al.,

73

2005; McLeod, 2010) [Figura 30]. Montanari et al. (2018) demostraron que cuando no hay carbohidratos en el medio, la producción de ácido láctico es irrelevante, en cambio aumentan el acético y el fórmico. La cantidad de ácidos producidos por las diferentes cepas es variable. Esto puede ser relevante en la selección de cepas bio-controladoras cuando los diferentes ácidos orgánicos tienen diferente capacidad biocida, dependiendo de su constante de disociación (pKa); el ácido acético tiene mayor potencial bio-controlador que el fórmico y que el láctico (pKa 4.75, 3.75 y 3.08 respectivamente) (Hauka et al., 2014).

Cuando existen carbohidratos limitados o nulos en el medio L. sakei metaboliza aminoácidos y nucleósidos para obtener energía, aumentando el piruvato en el medio por la depleción de las NADH reductasas (necesarias para la formación de lactato). La bactería desvía su ruta metabólica hacia la producción de acetato y ácido fórmico, pero también al diacetilo, acetoína y 2-3 butanodiol, así produce ATP y regenera NAD [Figura 30]. La o las rutas metabólicas preferidas es variable entre cepas de L. sakei, por lo tanto, las concentraciones de los respectivos antimicrobianos liberadas al medio también (Chaillou et al., 2005; McLeod, 2010; Montanari et al., 2018). Más aún Montanari et al. (2018) evidenciaron que algunas cepas producen diacetilo y acetoína sólo en presencia de ribosa y que ninguna de las 6 cepas estudiadas utilizó la ruta del etanol.

La producción de peróxido de hidrógeno es otra ruta que utiliza L sakei para disipar el exceso de piruvato en la célula en condiciones aeróbicas, donde el oxígeno activa a la piruvato-oxidasa formando H2O2, CO2 y acetil fosfato. A partir de este último, la bacteria puede obtener energía formando ácido acético [Figura 30] (McLeod, 2010).

La producción de bacteriocinas es deseable en las cepas bio-preservantes. No obstante, aun cuando fuera producida constantemente en la carne fresca, sus niveles suelen ser mucho más bajos que los alcanzados durante las fermentaciones in vitro en condiciones ambientales óptimas (Favaro y Todorov, 2017).

McLeod (2010) señala que todas las cepas aisladas a partir de carne estudiadas (n=19) presentan en su genoma residuos u operones completos de bacteriocinas, aun cuando no las expresan fenotípicamente. Esto significa que los genes asociados son, o han sido, importantes en la evolución de la especie, pudiendo otorgar a las cepas una ventaja competitiva en su entorno.

Woraprayote et al., (2016) señalaron que hasta el 2015 habían 9

bacteriocinas reportadas que podían ser utilizadas en productos cárnicos. La mayoría tienen espectro de acción sobre bacterias Gram positivas y se recomienda su uso para bio-controlar a Listeria monocytogenes. En la literatura destacan, además, algunas activas frente a Gram negativas, como sakacina C2, antagonista con E. coli ATCC 25922, Salmonella tiphymurium CMCC 47729 y Shigella flexneri CMCC 51606 (Gao et al., 2010) y sakacina LSJ618 que inhibe a Proteus spp. y E. coli ECX4 (Jiang et al., 2012).

Aún no se describe alguna cepa de L. sakei que produzca una bacteriocina con amplio espectro de acción, que abarque la diversidad de Pseudomonas spp. Sin embargo, es conocido que el espectro de acción de las bacteriocinas aumenta al aplicar concomitantemente otras sustancias injuriantes de la membrana celular (De Vuyst y Leroy, 2007).

74

Figura 30: Rutas metabólicas de Lactobacillus sakei para la producción de metabolitos antibacterianos.

*Enzimas: (1) Adenosina deaminasa, (2) inosina hidrolasas, (3) nucleósido fosforilasas, (4) fosfopentomutasa, (5) ribokinasas, (6) ribosa-5-fosfato isomerasa, (7) fructosa-1,6-bisfosfatasa, (8) piruvato fosfodikinasa, (9) metilglioxal sintasa, (10) oxidoreductasa, (11), aldehído deshidrogenasa, (12) arginina/peptidil-arginina deaminasas, (13) ornitina transcarbamilasas, (14) carbamato kinasas, (15) lactato deshidrogenasa, (16) piruvato-formato liasa, (17) piruvato deshidrogenasas, (18) Acetolactato sintasa, (19) piruvato oxidasa, (20) fosfotransacetilasa, (21) alcohol deshidrogenasa, (22) acetato kinasa. (Adaptado de McLeod, 2010).

75

La revisión de la literatura dejó en claro los mecanismos que tiene L. sakei para producir los metabolitos antibacterianos, sin embargo, desconocemos la cantidad exacta de cada uno, que produce la cepa nacional L.63. No obstante, es indudable que produce ácidos orgánicos por el descenso de pH en el caldo TSBYE de la prueba de antagonismo in vitro y diacetilo/acetoína/2-3 butanodiol por el olor ácido o a mantequilla que presentó la carne tratada al final del ensayo in situ en

carne fresca.

3.3. Determinación de la estabilidad microbiológica de la carne fresca inoculada con el potencial bio-preservante L sakei 63.

La estabilidad microbiológica, como indicador de vida útil, de la carne de pollo expuesta a los diferentes tratamientos (no inoculado con BAL, inoculado con Lactobacillus 252 o L. sakei nacional L.63 o español) en la prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca almacenada a 8 ºC, se grafican en la Figura 31.

La estabilidad microbiológica de la carne de pollo fresca, sin inocular con BAL (T0), se mantuvo estable en ambas réplicas experimentales y fue de 88 horas. Lactobacillus sakei nacional 63, y español (CECT4808, cepa control positivo) extendieron la vida útil del producto entre 33 y 92 horas y entre 51 y 82 horas respectivamente y no la cepa control negativo, Lactobacillus 252 (p= 0,08).

Estos resultados demuestran que la cepa nacional seleccionada, L. sakei 63, tiene gran potencial como biopreservante de la carne de pollo envasada en aerobiosis. Sin embargo, se debe continuar con los estudios para establecer los factores determinantes de la variabilidad de la vida útil observada en ambas réplicas experimentales o si sólo se debe a la variabilidad intrínseca de la cepa.

Figura 31: Horas de estabilidad microbiológica, en promedio (rojo) y en cada réplica (amarillo y azul), de la carne de pollo inoculada con diferentes tratamientos lácticos, potenciales bio-preservantes, a una concentración inicial ≈8 log UFC/cm2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.

*T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias; Lactobacillus CECT4808: control (+); Lactobacillus 252: control (-). Letras distintas indican diferencias entre la estabilidad microbiológica promedio con significancia estadística (p<0,05).

0 50 100 150 200 250

T0

63

CECT 4808

252

Horas

Tra

tam

ien

to

Promedio Replica 2 Replica 1

ab

a

a

b

76

3.4. Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808

3.4.1. RAPD

La RAPD demostró que L. sakei nacional fue diferente al español, sólo en una de las réplicas realizadas [Figura 32]. Además el partidor utilizado sólo amplificó 1 o 2 bandas evidentes a partir del ADN completo de cada cepa, lo que genera dudas razonable sobre la confiabilidad de los resultados.

Estos resultados evidencian la baja reproducibilidad de la técnica y que los resultados son dependientes de los sustratos empleados (Penner et al., 1993). Probablemente, las diferencias se deben a que el ADN utilizado en las diferentes réplicas se obtuvo con el mismo kit comercial, pero de diferente número de lote. También pudo ser porque el ADN de la réplica B se mantuvo congelado por un tiempo antes de ser utilizado. Williams et al. (1993), evidencian que al utilizar muestras de ADN antiguo, almacenados previamente en congelación, se pierden las bandas de mayor peso y sólo se observan las de menor tamaño en el gel.

Por estas razones se decidió realizar un PFGE que permitiera diferenciar las cepas.

Figura 32: Bandas de los perfiles electroforéticos de Lactobacillus sakei nacional 63 y español, CECT 4808, en geles de agarosa al 1,8%, obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con partidor aleatorio Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`). *Carriles 1 y 4 = L. sakei 63; Carriles 2 y 5 = L. sakei CECT 4808; Carriles 3 y 6 = L. sakei ATCC 15521 (control). Carriles 1-3 = réplica A; Carriles 4-6 =réplica B. PM: Peso molecular de ADN de 80-10.000 pb; (-): control negativo, agua libre de nucleasas.

PM 1 2 3 (-) PM 4 5 6 (-) PM

77

3.4.2. PFGE

El PFGE demostró que las 3 cepas son diferentes a nivel genético, considerando un nivel de similitud < al 90% [Figura 33].

Figura 33: Dendograma de asociación de perfiles electroforéticos de Lactobacillus sakei 63, CECT 4808 y ATCC 15521, obtenidos por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE, Pulsed-field gel electrophoresis), digeridos por la enzima SmaI. *Análisis realizado con programa Bionumerics 7.1, utilizando el coeficiente de similitud de Dice basado en la posición de las bandas y análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted Pair Group Method using Arithmetical averages).

Björkroth et al. (1996) fueron los primeros en caracterizar genéticamente a diferentes cepas de L. sakei aisladas de carne. Ellos demostraron que tanto el RAPD y PFGE son útiles. Destacaron la rapidez y facilidad de la primera técnica, sin embargo, indican fue menos discriminante al comparar las cepas y de baja reproducibilidad. En cambio, PFGE discriminó a la mayoría de las cepas y diferentes enzimas, SmaI y AvrII, agrupan a las cepas de manera diferente.

3.5. Publicaciones derivadas de la etapa 3.

Algunos resultados obtenidos en esta etapa fueron presentados en:

XL Congreso Latinoamericano de Microbiología - SOMICH, 2018:

póster: “Bacteria láctica chilena antagoniza con Pseudomonas

alterantes de pollo in vitro e in situ, pero no logra extender

significativamente la vida útil de la carne para su uso industrial”

[Anexo 22].

Publicación 2019: “Comparison of in vitro and in situ antagonism

assays as tools for the selection of lactic acid bacteria as bio-

preservatives in poultry meat” (Enviado) [Anexo 23].

46.2

39.3

L sakei PFGE

100

80

60

40

L sakei PFGE

63

15521

E

2019-01-09 11:01:36

2019-01-09 11:01:34

2019-01-09 11:01:37

EM 1 2 3 EM

63

ATCC 15521

CECT 4808

% similitud Dice

78

CONCLUSIONES

Existe una alta carga y diversidad, tanto intra como inter especies, de

Pseudomonas alterantes en filetes de pechuga de pollo deteriorados a 4 ºC de una

empresa nacional, predominando P. fragi, P. fluorescens y P. lundensis.

La sensibilidad in vitro de las Pseudomonas alterantes de carne de pollo

frente a diferentes BALs es variable, por lo tanto, es de vital importancia utilizar

herramientas que sustenten la selección de las cepas desafiadas para incluir esta

variabilidad en los ensayos de antagonismo.

La sensibilidad individual de P. fragi 1.1 frente a diferentes BALs, en la

prueba in situ en carne de pollo irradiada, no representa la sensibilidad colectiva

mostrada por el género inmerso dentro de una microbiota formada por múltiples

especies y cepas en el pollo fresco. La microbiota concomitante y la matriz

alimentaria influyen en la efectividad antagonista de la bacteria láctica.

Se demostró que aun cuando Pseudomonas no sea sensible in vitro frente

a una BAL, esta última puede poseer actividad bio-preservante en la carne de pollo.

No obstante, se destaca que aquellas cepas que antagonizan en medios nutritivos,

tienen actividad bio-preservante in situ mayor.

El potencial bio-preservante, L sakei nacional L.63 (aislado en esta tesis),

retardó la multiplicación de las Pseudomonas spp. en carne de pollo fresca,

aumentando evidentemente la vida útil microbiológica de la matriz cárnica. Sin

embargo, existió una alta variabilidad de resultados entre réplicas experimentales.

79

PROYECCIÓN FUTURA

Esta tesis demostró la sensibilidad de Pseudomonas spp. frente a diferentes

BALs, destacando la utilidad de estas últimas como potenciales biopreservantes de

la carne de pollo envasada en aerobiosis. Con esta información se abren líneas de

investigación en las que es posible continuar trabajando que se detallan a

continuación:

1.- Evaluación de la vida útil de la carne de pollo tras su inoculación con

BALs, considerando características organolépticas y fisico químicas concomitantes

a los recuentos bacterianos. Si bien la literatura establece la carga de Pseudomonas

spp. que se correlaciona con el fin de la vida útil del producto, se debe comprobar

que el retraso de la multiplicación de éstas bacterias coincide con una extensión de

la vida útil considerando la microbiota nacional.

2.- Formulación de un producto bio-preservante en base a BALs

tecnológicamente efectivo y comercial, esto es, con un efecto antagonista más

estable (menor variabilidad) sobre las Pseudomonas ssp. alterantes de carne de

pollo. Considerando la experiencia obtenida en esta tesis doctoral, se propone

continuar con la investigación de las BALs, aislando nuevas cepas de Lactobacillus

a partir de carne de pollo u otros alimentos refrigerados e investigando su potencial

bio-preservante in vitro sobre múltiples cepas y especies bacterianas alterantes. Así

se optimizará la selección sobre aquellas con mayor espectro antagonista,

esperando una menor variabilidad entre réplicas experimentales al ser inoculados

in situ en la carne de ave. Además, esta línea de investigación debe incorporar el

estudio del efecto de la interacción entre BALs (sinergismo, antagonismo o

neutralismo) sobre las bacterias alterantes y su efecto en la vida útil de la carne de

pollo. Se espera que un producto bio-preservante multi-especies/cepas tenga un

mayor espectro antibacteriano, disminuyendo la variabilidad de su efecto bio-

preservante.

3.- Caracterización y aislamiento de las sustancias antibacterianas

producidas por los potenciales bio-preservantes seleccionados, con el fin de crear

concentrados de metabolitos antibacterianos bio-preservantes aplicables a la

industria alimentaria que desplacen a los sintéticos.

4.- Extender el uso de la bio-preservación a otros alimentos cárneos y/o

perescibles. Considerando que la microbiota alterante de los alimentos varía entre

ellos, es importante evaluar la viabilidad de su uso en diferentes matrices

alimentarias.

80

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97

ANEXOS

Anexo 1: Datos productivos de la industria avícola. 99

Anexo 2: Frecuencias absolutas y relativas (%) de características fenotípicas de Pseudomonas prevalentes en filetes de pechuga de pollo

marinado sin piel, deteriorados a 4 ºC, según especies.

101

Anexo 3: Número de marcas comerciales de antibióticos usados en la avicultura, autorizados por el SAG, agrupados por familia.

102

Anexo 4: Susceptibilidad a antibióticos de Pseudomonas alterantes

dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4ºC, frente a diferentes antimicrobianos según especie y total, mediante CIM en agar.

103

Anexo 5: Protocolo de extracción DNA Lactobacillus spp. 104

Anexo 6: Fórmula de agar MRS®, MRS modificado, agar MRS

bicarbonato 2% modificado y caldo MRS modificado y modificado B. 105

Anexo 7: Recuento de Pseudomonas spp. en cubos de pechuga de pollo fresco comprados en supermercados.

106

Anexo 8: Diámetros de halos de inhibición asociados a la sensibilidad de

antibióticos como parámetros para la interpretación de la prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar con disco.

107

Anexo 9: Aislamiento y selección de Lactobacillus, a partir de filetes de pechuga deteriorados a 4 ºC, con capacidad de multiplicación en caldo MRS a 8 ºC.

108

Anexo 10: Comparación múltiple de recuentos medios de P. fragi 1.1 y su error estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de antagonismo in vitro en TSBYE a 8 ºC.

110

Anexo 11: Comparación múltiple de recuentos medios de Lactobacillus y su error estándar en el tiempo dependiente de cada tratamiento en prueba de antagonismo in vitro en TSBYE a 8 ºC.

111

Anexo 12: Comparación múltiple de recuentos medios de P. fragi 1.1 y su

error estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de antagonismo in situ en pollo estéril a 8ºC

112

Anexo 13: Comparación múltiple de recuentos medios Lactobacillus y su error estándar en el tiempo en prueba de antagonismo in situ en pollo estéril a 8ºC

113

Anexo 14: Comparación múltiple de recuentos medios de Pseudomonas y su error estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de antagonismo in situ en pollo fresco a 8ºC

114

Anexo 15: Comparación múltiple de recuentos medios de enterobacterias

y su error estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de antagonismo in situ en pollo fresco a 8ºC

115

98

Anexo 16: Prueba de antagonismo difusión en pocillo con sobrenadantes libre de células (SLC)

116

Anexo 17: Curva de crecimientos de diferentes Pseudomonas aisladas de pollo deteriorado en TSBYE a 25 ± 2 ºC sin agitación.

118

Anexo 18: Resumen “Resistencia antibacteriana de Pseudomonas alterantes de pollo”. XXIV Congreso Latinoamericano de Avicultura, 2015 (póster).

119

Anexo 19: “Phenotypic and genotypic characterization of Pseudomonas spp. present in spoiled poultry fillets sold in retail settings”. Revista LWT – Food Science and Technology, 2016 (publicación).

121

Anexo 20: Resumen “Genotypification of spoilage poultry Pseudomonas by RAPD as a simple tool to identify indirectly biofilms in the processing line”. XXXIX Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2017 (póster).

127

Anexo 21: Resumen “Actividad antibacteriana de Lactobacillus contra Pseudomonas alterantes aisladas de pollo”. XXXVIII Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2016 (póster).

128

Anexo 22: Resumen “Bacteria láctica chilena antagoniza con Pseudomonas alterantes de pollo in vitro e in situ, pero no logra extender

significativamente la vida útil de la carne para su uso industrial” XL Congreso Latinoamericano de Microbiología - SOMICH, 2018 (póster).

129

Anexo 23: “Comparison of in vitro and in situ antagonism assays as tools for the selection of lactic acid bacteria as bio-preservatives in poultry meat”. Revista LWT – Food Science and Technology, 2019 (publicación enviada).

130

99

Anexo 1

Datos productivos de la industria avícola.

Producción de carne de ave por especie y región (toneladas) 2017.

Región Pollos Gallinas Pavos Otras aves *

Total %

Arica y Parinacota, Coquimbo y Valparaíso

26.516 513 60.402 8 87.440 12,3%

Región Metropolitana de Santiago

198.761 953 12.004 22 211.740 29,7%

Región del Libertador Bernardo O'Higgins

407.208 3.718 2.215 0 413.140 58,0%

Biobío y La Araucanía 28 0 0 5 33 0,0%

Total país 632.485 5.184 74.621 30 712.353 100,0%

* Incluye patos, gansos, avestruces y otros (ODEPA, 2018)

Producción de carne de ave por especie (toneladas) 2008-2017.

Año Pollos Pavos Gallinas Otras aves* TOTAL

2008 503.905,9 101.908,7 5.627,1 69,0 611.511

2009 507.518,6 90.600,2 5.846,5 82,5 604.048

2010 498.772,2 89.954,4 4.996,3 114,4 593.837

2011 556.018,8 94.952,9 5.754,7 317,1 657.043

2012 565.552,1 103.086,7 5.681,9 76,8 674.397

2013 577.502,7 98.093,7 4.946,9 28,1 680.571

2014 567.004,3 96.801,6 5.228,7 19,7 669.054

2015 598.816,4 103.581,2 5.549,5 12,7 707.960

2016 621.905,9 112.767,7 5.786,9 49,4 740.510

2017 632.512,8 74.621,4 5.183,8 35,0 712.353

Var 08/17 26% -27% -8% -49% 16%

* Incluye patos, gansos, avestruces y otros (ODEPA, 2018)

100

Exportación de carne de ave no procesada 2009-2017

Año Broilers valor

(millones US$)

Pavos valor

(millones US$)

Total valor

(millones US$)

2009 165,2 35,8 201,1

2010 162,3 39,1 201,4

2011 192,7 53,7 246,6

2012 196,8 54,9 251,8

2013 207,5 46,0 253,6

2014 217,1 67,1 284,2

2015 246,1 148,4 394,6

2016 240,1 138,5 378,7

2017 233,6 40,4 274,1

Var 09/17 (%) 41,4 12,8 36,3

* No se exportan Gallinas ni patos, gansos, avestruces u otros (Servicio Nacional

de Aduana 2018, INE 2013)

101

Anexo 2

Frecuencias absolutas y relativas (%) de características fenotípicas de Pseudomonas prevalentes en filetes de pechuga de pollo marinado sin piel,

deteriorados a 4 ºC, según especies.

a) P. fragi (n=24) b) P. Fluorescens (n=14)

(+) (+/-) (-) (+) (+/-) (-) Capacidad biosurfactante

24

(100%)

Capacidad biosurfactante

14

(100%) Capacidad proteolítica

16 (66,6%)

8

(34,4%)

Capacidad proteolítica

14 (100%)

Capacidad lipolítica

24

(100%)

Capacidad lipolítica

10 (71,4%)

4

(26,6%) Capacidad lecitinasa

2 (8,3%)

22

(91,7%)

Capacidad lecitinasa

14 (100%)

Habilidad mult. 37 ºC

23

(95,8%) 1

(4,2%)

Habilidad mult. 37 ºC

11

(78,6%) 3

(21,4%)

c) P. lundensis (n=3) d) Pseudomonas spp. (n=1)

(+) (+/-) - (+) (+/-) (-) Capacidad biosurfactante

3

(100%)

Capacidad biosurfactante

1

(100%) Capacidad proteolítica

2 (66,7%)

1

(33,3%)

Capacidad proteolítica

1 (100%)

Capacidad lipolítica

3

(100%)

Capacidad lipolítica

1 (100%)

Capacidad lecitinasa

3

(100%)

Capacidad lecitinasa

1 (100%)

Habilidad mult. 37 ºC

2 (66,7%)

1 (33,3%)

Habilidad mult. 37 ºC

1

(100%)

102

Anexo 3

Número de marcas comerciales de antibióticos usados en la avicultura, autorizados por el SAG, agrupados por familia (SAG, 2015).

Identificación Nº marcas comerciales

autorizadas SAG Familia

Total autorizadas SAG

Enrofloxacino 7

Fluoroquinolonas 10 Flumequina 2

Norfloxacino 1

Oxitetraciclina 4 Tetraciclinas 5

Clortetraciclina 1

Sulfaguanidina (con Neomicina)

1

Sulfonamidas con o sin Trimetoprima

4 Sulfaclorpiridazina (con Trimetroprima)

1

Sulfametazina (con o sin Trimetroprima)

2

Colicistina o Polimixina E

4 Polimixinas 4

Neomicina (con Sulfaguanidina)

1 Aminoglucósidos 2

Estreptomicina 1

Ceftiofur 2 Cefalosporinas 2

Florfenicol 2 Amfenicoles 2

103

Anexo 4

Susceptibilidad a antibióticos de Pseudomonas alterantes dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4ºC, frente a diferentes

antimicrobianos según especie y total, mediante CIM en agar.

Sulfametoxazol-Trimetoprima

Polimixina B Ciprofloxacino Tetraciclina

S I R S I R S I R S I R

P. fragi 2

15,4%

0 0%

11 84,6%

3 23,1%

2 15,4%

8 61,5%

13 100%

0 0%

0 0%

13 100%

0 0%

0 0%

P. fluorescens 2

16,7%

0 0%

10 83,3%

9 75%

0 0%

3 25,0%

11 91,7%

1 8,3%

0 0%

12 100%

0 0%

0 0%

P. lundensis 1 50%

0 0%

1 50%

2 100%

0 0%

0 0%

2 100%

0 0%

0 0%

2 100%

0 0%

0 0%

Pseudomonas spp.

0 0%

0 0%

1 100%

1 100%

0 0%

0 0%

0 0%

1 100%

0 0%

1 100%

0 0%

0 0%

Total

Pseudomonas

5 17,9%

0 0%

23 82,1%

15 53,6%

2 7,1%

11 39,3%

26 92,9%

2 7,1%

0 0%

28 100%

0 0%

0 0%

104

Anexo 5

Protocolo de extracción DNA Lactobacillus spp.

*Cultivar Lactobacillus 48 horas en 5 mL caldo MRS

1. Peletear 1-1,5 mL de cultivo dependiendo de la turbidez (13.000 x 5 min) y retirar

sobrenadante.

2. Lavar con 1 mL de PBS, centrifugar (13.000 x 5 min) y retirar sobrenadante.

3. Resuspender en 600 uL de buffer TE + 17 uL Lisozima /tubo

*Lisozima: 120 mg/mL (60 mg/500 uL agua PCR).

4. Incubar 30 min a 37 ºC (c/ 10 min agitar con dedo).

5. Agregar a cada tubo 4 uL de Proteinasa K

* Proteinasa K: 20 mg/mL (20 mg/1000 uL agua PCR)

6. Incubar 30 min a 37 ºC (agitar c/ 10 min).

7. Agregar 40 uL SDS 10%

* SDS polvo: 1 gr/10 mL agua PCR o 0,5 gr/5 mL agua PCR

8. Homogenizar (manualmente) e incubar 60 min a 37ºC (estufa).

9. Agregar 600 uL/tubo de mezcla fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (1º extracción)

Mezclar con vortex intentso 30 seg 10. Centrifugar (13.000 rpm x 10 min)

11. Retirar ≈500 uL de sobrenadante con cuidado a otro tubo eppendorf

12. Volver a agregar ≈ 500 uL mezcla Fenol-cloroformo-AIA (Relación 1:1) y vortexear

30 seg

13. Centrifugar 13.000 rpm x 10 min.

14. Retirar sobrenadante ≈450 uL y agregar ≈450 uL /tubo de mezcla cloroformo-

alcohol isoamílico (Relación 1:1) (2º extracción)

No deben quedar restos de Fenol.

15. Centrifugar (13.000 rpm x 10 min)

16. Retirar 300 uL sobrenadante y agregar 700 uL isopropanol normal. O recalcular

relación 2:1).

Dejar a -20 ºC ≈ 1hrs u ON

17. Mezclar y centrifugar (10.000 rpm x 10 min) para precipitar DNA y eliminar

sobrenadante (con jeringa insulina)

18. Lavar pellet con etanol PA al 70% frio (Agregar 1 mL etanol), centrifugar (13.000

rpm x 10 min) y eliminar sobrenadante (con jeringa insulina).

19. Dejar secar pellet a temperatura ambiente ± 60 min

20. Resuspender en 50 uL agua PCR y cuantificar DNA

Se puede dejar a -20ºC

* Fenol básico 50 % v/v 25 mL 12,5 mL * Cloroformo 48% v/v 24 mL 12 mL * Alcohol Isoam. 2% v/v 1 mL 0,5 mL

* Cloroformo (R 115) 24 mL 12 mL * Alcohol Isoam. (R 199) 1 mL 0,5 mL

105

Anexo 6

Fórmula de agar MRS®, MRS modificado, agar MRS bicarbonato 2%

modificado y caldo MRS modificado y modificado B (gramos o mililitros por

litro; modificado de BritaniaLab, 2014).

Ingredientes MRS® MRSm MRS-BICm Caldo MRSm Caldo MRSmB

Peptona (g/L) 10 10 10 10 10

Extracto de carne (g/L) 10 10 10 10 10

Extracto de levadura (g/L) 5 5 5 5 5

Dextrosa (g/L) 20 20 20 20 20

Polisorbato (Tween) 80 (mL/L) 1 1 1 1 1

Sulfato de magnesio (g/L) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Sulfato de manganeso (g/L) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

Fosfato dipotásico (g/L) 2 2 2 2 2

Citrato de amonio (g/L) 2 - - - 2

Acetato de sodio (g/L) 5 - - - -

Agar (g/L) 15 15 15 - -

Bicarbonato (g/L) - - 20 - -

*pH 6,5 ± 0,2

El agar MRS® debió ser re-formulado, porque en la prueba de antagonismo in vitro “spot en doble capa”, quedó en evidencia que no permite el crecimiento de las Pseudomonas aisladas de pollo. Esto se debe a que el citrato de amonio y acetato inhiben a bacterias Gram negativas, otorgándole, entre otros ingredientes, la capacidad selectiva que tiene este medio para las bacterias lácticas.

Todos los ensayos posteriores que utilizaban MRS fueron modificados, para descartar el efecto antagonista del medio.

106

Anexo 7

Recuento de Pseudomonas spp. en cubos de pechuga de pollo fresco

comprados en supermercados.

Diseño experimental

Se evaluó la carga de Pseudomonas spp. en bandejas de cubos de pechuga de pollo fresco marinados sin piel, de la principal empresa productora de pollo nacional, adquiridas el primer día que salieron a la venta.

Las muestras fueron transportadas en frío al Laboratorio de Microbiología y Probióticos y procesadas dentro de la siguiente hora.

Análisis microbiológico

Los recuentos se realizaron mediante cultivo tradicional. Brevemente, 100 gr de cubitos de filetes de pollo fueron stomacheados o lavados con 180 mL de agua peptonada (0,1%). Se realizaron diluciones seriadas 1:10 utilizando suero fisiológico y se sembró 100 uL en superficie de agar CFC, hasta la dilución -3. Las placas se incubaron por 48 horas a 20 ± 2ºC. Los ensayos fueron realizados en duplicado.

Resultados

La carga inicial de Pseudomonas spp en las muestras de cubos de pechuga de pollo de una empresa nacional fue de 3,67 ± 0,3 log UFC/g. Esta carga inicial es similar a la reportada en otros países como Alemania (4.1 log10 UFC/g; Bruckner y cols., 2010), China (3,01 UFC/cm2; Zhang y cols., 2012), Portugal (3,5 UFC/g aproximadamente; Vasconcelos y cols., 2014), Grecia (4,5 UFC/g; Balamatsia y cols, 2006).

107

Anexo 8

Diámetros de halos de inhibición asociados a la sensibilidad de antibióticos

como parámetros para la interpretación de la prueba de susceptibilidad a

antibióticos por difusión en agar con disco (adaptado de Charteris et al.,

1998).

Antibiótico Diámetro de interpretación (mm)

S I R

Ampicilina (10 ug) <12 13-15 >16

Ciprofloxacino (5 ug) <13 14-18 >19

Tetraciclina (30 ug) <14 15-18 >19

Vancomicina (30 ug) <14 15-16 >17

Rifampicina (5 ug) <14 15-17 >18

Cloranfenicol (30 ug) <13 14-17 >18

Sulfametoxazol (250 ug) <12 13-16 >17

Metronidazol (50 ug) <14 15-17 18

Eritromicina (15 ug) <13 14-17 >18

Gentamicina (10 ug) <12 - >13

Clindamicina (2 ug) <8 9-11 >12

Cotrimoxazol (25 ug) <10 11-15 >16

*S= sensible; I= sensibilidad intermedia; R= resistencia.

108

Anexo 9

Aislamiento y selección de Lactobacillus, a partir de filetes de pechuga

deteriorados a 4 ºC, con capacidad de multiplicación en caldo MRS a 8 ºC.

Diseño experimental

Con el fin de incorporar bacterias lácticas, con capacidad de multiplicación en frio, en las pruebas de inhibición selectiva en caldo a 8 ºC, se recuperaron Lactobacillus spp. a partir de las muestras de pollo deterioradas en la etapa 1 de

tesis.

Análisis microbiológico

Se sembró por agotamiento, en agar MRS, las diluciones -3 a la -6 del agua de lavado de las 12 muestras de carne de pollo deteriorado utilizadas en la etapa 1. Las placas fueron incubadas a 25 ºC por 72 horas. Se seleccionaron las colonias macroscópicas diferentes de cada placa y fueron replicadas en agar MRS. Cada aislado fue confirmado como Lactobacillus spp. al presentarse como un bacilo en

empalizada, Gram (+) y catalasa y oxidasa negativo. Los aislados fueron congelados en leche a -18 ºC hasta su uso (Oct-Nov 2014).

Luego (Jul-2017) las muestras fueron recuperadas en agar MRS a 22 ºC por 48 hrs. Aquellas placas con colonias macroscópicas se les realizó una curva de crecimiento en caldo MRS a 8 ± 2 ºC, en aerobiosis, sin agitación monitoreados con lecturas de densidad óptica (DO) a 600 nm. Se utilizó como control a L. sakei CECT 4808.

Las bacterias con capacidad de multiplicación similar a la cepa control, se caracterizaron genéticamente mediante RAPD, utilizando ADN extraído con protocolo fenol-cloroformo, partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`) y temperatura de alineamiento 36ºC. Los perfiles electroforéticos obtenidos fueron evidenciados en gel de agarosa al 1,8% y electroforesis a 70 V por 90 minutos.

Resultados y discusión

Se aislaron 27 Lactobacillus spp. a partir de las muestras de filetes de pollo deteriorados a 4 ºC. De ellas sólo 7 fueron recuperadas viables posterior a su congelación.

Al monitorear la capacidad de crecimiento de los aislados a 8 ± 2 ºC, se observó que 2 (L.63 y 74) tienen capacidad de multiplicación en frio, con un comportamiento similar al L. sakei CECT 4808 utilizado como control [figura a].

No obstante lo anterior, mediante RAPD se evidenció que hay altas probabilidades de que ambos aislados nacionales sean la misma cepa ya que presentan el mismo perfil electroforético [figura b]. Esto significa que probablemente

109

ambos aislados tienen un origen de contaminación común en la planta procesadora de pollos, evidenciando biofilms indirectamente. Ibarreche y et al. (2014), han evidenciado experimentalmente la capacidad de ciertos Lactobacillus a autoagregarse y formar bio-películas en superficies abióticas.

Figura a: Curvas de crecimiento a 8 ± 2 ºC, aerobiosis, sin agitación de

Lactobacillus 6.3 y 7.4 y L. sakei CECT 4808,.

Figura b: Caracterización genética de aislados de

Lactobacillus spp. utilizando RAPD. Carril 2: Lactobacillus spp B (control (+)); Carril 3: Lactobacillus spp. L.63, Carril 4: Lactobacillus L.74, Carril 5: control (-); Carril 1 y 6: Peso molecular 80-10.000.

0

1

2

3

4

5

6

0 24 48 72 96

DO

(6

00

nm

)

Horas

6.3 7.4 CECT 4808

110

Anexo 10

Comparación múltiple de recuentos medios de P. fragi 1.1 y su error

estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de

antagonismo in vitro en TSBYE a 8ºC

Método LSD de Fisher, con procedimiento de corrección de p-valores

Bonferroni. Letras distintas indican medias diferentes con significancia estadística

(p<0,05).

Tratamiento Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL

D.E. Tratamiento

Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL D.E.

B.8 0 3,78 0,04 a T0 4 7,4 0,19 a 252.B.8 0 3,76 0,09 a 252.B.6 4 7,35 0,06 a CECT4808.8 0 3,75 0,25 a B.6 4 7,31 0,12 a CECT4808.6 0 3,72 0,21 a 252.6 4 7,29 0,01 a 252.B.6 0 3,6 0,06 a 252.8 4 7,08 0,07 a 252.8 0 3,59 0,26 a 63.6 4 7,05 0,23 a b T0 0 3,57 0,15 a CECT4808.6 4 6,97 0,44 a b 63.8 0 3,56 0,05 a 252.B.8 4 6,23 0,32 b B.6 0 3,54 0,11 a B.8 4 6,21 0,21 b 63.6 0 3,5 0,07 a 63.8 4 2,4 0,43 c 252.6 0 3,42 0,05 a CECT4808.8 4 2,21 1,13 c

Tratamiento Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL

D.E. Tratamiento

Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL D.E.

B.6 5 7,58 0,16 a 252.B.6 6 7,71 0,23 a T0 5 7,53 0,15 a T0 6 7,66 0,27 a 252.6 5 7,41 0,25 a B.6 6 7,64 0,22 a 252.B.6 5 7,36 0,03 a 252.6 6 7,63 0,20 a 252.8 5 7,36 0,02 a 252.8 6 7,61 0,11 a CECT4808.6 5 6,29 0,59 b B.8 6 5,15 0,95 b 252.B.8 5 5,85 0,72 b CECT4808.6 6 4,86 0,23 b 63.6 5 5,74 0,49 b 252.B.8 6 4,6 0,55 b B.8 5 5,5 0,57 b 63.6 6 4,38 1,30 b CECT4808.8 5 1,28 1,71 c CECT4808.8 6 0,51 0,58 c 63.8 5 0,42 0,85 c 63.8 6 0,24 0,50 c

111

Anexo 11

Comparación múltiple de recuentos medios de Lactobacillus y su error

estándar en el tiempo dependiente de cada tratamiento en prueba de

antagonismo in vitro en TSBYE a 8ºC

Método LSD de Fisher, con procedimiento de corrección de p-valores

Bonferroni. Letras distintas indican medias diferentes con significancia estadística

(p<0,05).

Tratamiento Tiempo (días)

Medias Log10 UFC/mL

D.E. Tratamiento Tiempo (días)

Medias

Log10 UFC/mL

D.E.

B.6 0 6,05 0,16 a B.8 0 8,56 0,11 a

B.6 4 6,13 0,10 a b B.8 4 8,94 0,50 a

B.6 5 6,19 0,11 b c B.8 5 8,76 0,71 a

B.6 6 6,27 0,13 c B.8 6 9,7 0,71 b

252.6 0 6,07 0,16 a 252.8 0 8,06 0,05 a

252.6 4 6,2 0,05 b 252.8 4 8,11 0,17 a

252.6 5 5,95 0,07 a 252.8 5 8,12 0,07 a

252.6 6 6,02 0,03 a 252.8 6 8,5 0,22 a

252.B.6 0 6,27 0,03 a 252.B.8 0 8,89 0,40 a

252.B.6 4 6,33 0,03 a b 252.B.8 4 9,57 1,06 b

252.B.6 5 6,38 0,00 a b 252.B.8 5 9,72 1,14 b

252.B.6 6 6,43 0,03 b 252.B.8 6 9,92 1,23 b

CECT4808.6 0 5,51 0,01 a CECT4808.8 0 7,84 0,28 a

CECT4808.6 4 8,78 0,32 b CECT4808.8 4 8,67 0,27 b

CECT4808.6 5 8,59 0,14 b CECT4808.8 5 8,36 0,19 b

CECT4808.6 6 8,66 0,06 b CECT4808.8 6 8,46 0,28 b

63.6 0 5,93 0,03 a 63.8 0 7,99 0,04 a

63.6 4 9,3 0,21 b 63.8 4 10,39 0,39 b

63.6 5 9,34 0,54 b 63.8 5 10,86 0,42 b

63.6 6 9,49 0,59 b 63.8 6 10,89 0,52 b

112

Anexo 12

Comparación múltiple de recuentos medios de P. fragi 1.1 y su error

estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de

antagonismo in situ en pollo estéril a 8ºC

Método LSD de Fisher. Letras distintas indican medias diferentes con

significancia estadística (p<0,05).

Tratamiento Tiempo

(días) Medias Log10

UFC/mL

D.E. Tratamiento

Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL D.E.

CECT4808.8 0 2,63 0,05 a CECT4808.8 1 3,78 0,13 a B.8 0 2,6 0,09 a CECT4808.6 1 3,61 0,10 a b 63.8 0 2,53 0,08 a B.8 1 3,52 0,06 a b CECT4808.6 0 2,47 0,04 a b 63.8 1 3,4 0,02 a b T0 0 2,41 0,20 a b T0 1 3,29 0,02 b 63.6 0 2,08 0,04 b 63.6 1 3,26 0,05 b

CECT4808.8 2 5,41 0,10 a 63.6 3 7,23 0,09 a T0 2 5,11 0,12 a b T0 3 7,18 0,15 a 63.6 2 4,9 0,02 b CECT4808.6 3 7,11 0,15 a b B.8 2 4,9 0,28 b B.8 3 6,97 0,02 a b CECT4808.6 2 4,89 0,13 b CECT4808.8 3 6,71 0,09 b c 63.8 2 4,39 0,10 c 63.8 3 6,45 0,29 c

CECT4808.6 4 9,4 0,01 a B.8 4 9,19 0,10 a b 63.6 4 9,02 0,13 a b T0 4 8,91 0,05 b c CECT4808.8 4 8,83 0,42 b c 63.8 4 8,52 0,08 c

113

Anexo 13

Comparación múltiple de recuentos medios Lactobacillus y su error

estándar en el tiempo en prueba de antagonismo in situ en pollo estéril a 8ºC

Método LSD de Fisher. Letras distintas indican medias diferentes con

significancia estadística (p<0,05).

Tratamiento Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL

D.E. Tratamiento

Tiempo (días)

Medias Log10

UFC/mL D.E.

63.6

0 5,74 0,03 a

CECT4808.6

0 5,86 0,08 a 1 5,84 0,01 a 1 5,97 0,06 a 2 5,92 0,09 a 2 6,42 0,04 a 3 6,98 0,07 b 3 7,27 0,03 b 4 7,92 0,06 c 4 7,81 0,10 b

63.8

0 8,07 0,04 a

CECT4808.8

0 8 0,00 a 1 9,13 0,06 b 1 8,48 0,60 a b 2 9,06 0,05 b 2 8,47 0,03 a b 3 9,27 0,10 b 3 9,14 0,04 c 4 8,87 0,69 b 4 8,63 0,43 b c

B.8

0 9,08 0,05 a 1 9,58 0,21 a 2 9,03 0,40 a 3 9,19 0,19 a 4 10,4 0,22 b

114

Anexo 14

Comparación múltiple de recuentos medios de Pseudomonas y su error

estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de

antagonismo in situ en pollo fresco a 8ºC

Método LSD de Fisher. Letras distintas indican medias diferentes con

significancia estadística (p<0,05).

Tratamiento Tiempo

(días) Medias Log10

UFC/mL

D.E.

T0 0 1,83 0,20 a 63.8 0 1,8 0,17 a CECT4808.8 0 1,64 0,20 a 252.8 0 1,6 0,14 a

T0 2 4,35 0,05 a 252.8 2 3,65 0,44 b CECT4808.8 2 2,95 0,73 c 63.8 2 2,79 0,91 c

T0 4 7,77 0,01 a 252.8 4 6,6 0,34 b 63.8 4 5,05 1,76 c CECT4808.8 4 4,82 0,50 c

115

Anexo 15

Comparación múltiple de recuentos medios de enterobacterias y su error

estándar según tratamiento dependiente del tiempo en prueba de

antagonismo in situ en pollo fresco a 8ºC

Método LSD de Fisher. Letras distintas indican medias diferentes con

significancia estadística (p<0,05).

Tratamiento Tiempo

(días) Medias Log10

UFC/cm2

D.E.

T0 0 1 0,41 a 63.8 0 0,77 0,55 a CECT4808.8 0 0,74 0,64 a 252.8 0 0,72 0,49 a

T0 2 2,64 0,24 a 252.8 2 2,02 0,03 b CECT4808.8 2 1,33 0,61 c 63.8 2 1,2 0,86 c

T0 4 4,4 0,94 a 252.8 4 2,81 0,00 b 63.8 4 1,79 1,25 c CECT4808.8 4 1,38 0,71 c

116

Anexo 16

Prueba de antagonismo difusión en pocillo con sobrenadantes libre de células (SLC)

Para evaluar si el efecto antagonista del L. sakei 63 se debió al descenso del pH derivado de la producción de ácidos orgánicos, o a otras sustancias de naturaleza proteica, se realizó la prueba de difusión en pocillo con sobrenadantes libre de células (SLC), concentrado (deshidratado al 10%), no ajustado o ajustado a pH 6.5 y tratado con proteasas.

Se utilizó el protocolo establecido por Jiang et al. (2012) con modificaciones. Brevemente, L. sakei 63 fue ajustado a DO600nm 0,1 en 25 mL de caldo MRSm y TSBYE e incubado a 30 ºC por 18 hrs en aerobiosis, sin agitación. Posteriormente el cultivo fue sedimentado por centrifugación (7.700 rpm, 15 min, 4 ºC) y el SLC esterilizado por filtración (filtro jeringa 0,22 um). Luego parte del SLC fue sometido a los diferentes tratamientos detallados en la tabla a.

Tabla a: Resumen de tratamientos efectuados a SLC evaluados en ensayo de difusión en pocillo.

SLC Concentración al

10% pH

Ensayo proteólisis SF Trip PK 100ºC

SLC - ≈4,2 - SLCc x ≈4,2 - SLCa - ≈6,5 -

SLCca x ≈6,5 - SLCcb x ≈4,2 x - - -

SLCcb100 x ≈4,2 x - - x SLCcT100 x ≈4,2 - x - x SLCcK100 x ≈4,2 - x x

SLCcT x ≈4,2 - x - - SLCcK x ≈4,2 - - x -

*SF: suero fisiológico; Trip: Tripsina; PK: Proteinasa K.

La prueba de difusión en pocillo se realizó utilizando 15 mL de agar MH (5 mm altura), sembrado con 106 UFC/placa de P. fragi 1.1 en superficie con tórula de algodón. Se formaron pocillos de 5 mm de diámetro donde se depositó 45 uL de cada SLC. Las placas fueron incubadas a 20 ± 2 ºC y los halos de inhibición evaluados a las 24 hrs. Como control del ensayo se usó SLC de L. sakei CECT 4808, ATCC 15521 y caldo MRSm/TSBYE, sometidos a los mismos tratamientos mencionados anteriormente.

Los resultados evidenciaron que sólo los SLC concentrados con pH ≈4,2, obtenidos en TSBYE o cMRSm, presentan actividad antagonista con la Pseudomonas desafiada y no el sobrenadante ajustado a pH, ni el fresco con pH ácido ni neutro (Tabla b). Además no existió efecto de las proteasas en el ensayo.

Observación adicional: Al observar los halos de inhibición a las 96 horas de incubación, se evidenció que los halos de inhibición ejercidos por L. sakei 63 y CECT 4808 se mantienen en el tiempo y no el de ATCC 15521 (Imagen a). Esto sugiere que los primeros podrían estar produciendo alguna sustancia antagonista

117

adicional que tiene un efecto menos volátil en el tiempo. Se debe continuar con los estudios para identificar la sustancia en cuestión.

Tabla b: Halos de inhibición promedios (mm) medidos a las 24 horas de incubación (20 ± 2

ºC) en prueba de difusión en pocillo con sobrenadantes libre de células (SLC), concentrado

o fresco y no ajustado (pH ≈4,2) o ajustado a pH 6.5.

Medio de cultivo

Tratamiento SLC Concentrado SLC Fresco

pH 4,2 pH 6,5 pH 4,2 pH 6,5

TSBYE

CECT 4808 12 0 0 0

63 13 0 0 0

ATCC 15521 12 0 0 0

Control (-) 9 0 0 0

MRS

CECT 4808 18 0 0 0

63 17 0 0 0

ATCC 15521 14 0 0 0

Control (-) 10 0 0 0

Imagen a: Halos de inhibición de P. fragi 1.1 incubado a 20 ± 2 ºC por 96 hrs, en prueba de antagonismo en pocillo con SLC de diferentes L. sakei con pH 4,2 y concentrado al

10%.

118

Anexo 17

Curva de crecimientos de diferentes Pseudomonas aisladas de pollo

deteriorado en TSBYE a 25 ± 2 ºC sin agitación.

*PF: Pseudomonas fluorescens ATCC 15521.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

DO

60

0

Tiempo

1.1

5.4

8.4

11.5

12.1

PF

4.2

7.2

9.1

11.1

119

Anexo 18

“Resistencia antibacteriana de Pseudomonas alterantes de pollo”.

XXIV Congreso Latinoamericano de Avicultura, 2015: póster

Pabla Morales, Miriam Troncoso, Guillermo Figueroa Laboratorio de Microbiología y Probióticos, INTA, Universidad de Chile.

Introducción:

La rápida aparición de patógenos con resistencia a antibióticos (RA) es una amenaza importante para salud pública. Tradicionalmente la principal vía de propagación de RA fue la transferencia horizontal de genes RA entre los patógenos en un ambiente hospitalario. Sin embargo, estudios sugieren que es más probable la transmisión horizontal de estos genes entre bacterias comensales y patógenas en diferentes ecosistemas, que la transferencia directa de un patógeno a patógeno.

Pseudomonas spp son bacterias psicrotrofas alterantes que limitan la vida útil del pollo refrigerado envasado en aerobiosis. No obstante, por ser conocidas como inocuas para el humano no se incluyen en el programa HACCP. Usualmente, la carga inicial de Pseudomonas spp en pollo fresco es baja, sin embargo al final de su vida útil se incrementa hasta concentraciones de 7-8 log UFC/g.

Se han descrito Pseudomonas spp con genes de resistencia a tetraciclina y

eritromicina en subproductos de cerdo, vacuno y pavo, pero no se encuentran trabajos relacionados con carne de pollo. Objetivo:

Evaluar el perfil fenotípico de resistencia antibacteriana de Pseudomonas spp alterantes aisladas de pollo frente a antibióticos de uso humano. Materiales y métodos:

Se analizó mediante técnicas microbiológicas tradicionales muestras de 11 bandejas de filetes de pollo vencidos a 4ºC. A partir de agar Pseudomonas CFC, se aislaron colonias de Pseudomonas predominantes (Gram negativas predominantes, no fermentadoras y oxidasa positivas).

A diferentes cepas se les evaluó la sensibilidad a ciprofloxacino (Cip; S=≤1ug/mL;I=2 ug/mL ;R=≥4 ug/mL), tetraciclina (Tet; S=≤4 ug/mL; I=8 ug/mL; R=≥16 ug/mL), polimixina B (Pol B; S=≤2ug/mL; I=4 ug/mL; R=≥8 ug/mL) y sulfametoxazol-trimetoprim (S-T; S=≤38/2 ug/mL; R=≥76/4 ug/mL) mediante Concentración Inhibitoria Mínima en agar. Resultados

De cada muestra se seleccionaron entre 2 y 4 cepas de Pseudomonas spp predominantes (n=28).

No se observaron cepas resistentes a Tet. Sólo 2/28 cepas presentaron resistencia intermedia a Cip y 13 cepas se clasificaron como intermedias (n=2) o resistentes (n=11) frente a Pol B. La mayor resistencia se observó frente a S-T,

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donde 23/28 cepas fueron resistentes. Se observó multiresistencia a 3 antibióticos (Cip, Pol B, S-T) en 1/28 cepas y en 11/28 cepas a 2 antibióticos (Pol B y S-T). Conclusiones:

Existe una alta tasa de multiresistencia en las cepas de Pseudomonas

alterantes aisladas a partir de pollo.

Existen 7 perfiles diferentes de resistencia a antibióticos, lo que evidencia la gran diversidad de Pseudomonas alterantes presentes en el pollo.

El uso de antibióticos en producción aviar debe sopesarse frente a los graves riesgos potenciales para la salud humana que plantea la resistencia a antibióticos.

Referencias bibliográficas CLSI. 2012. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. CLSI document M100-S22. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087, USA. Wang H., et al. 2006. Food commensal microbes as a potentially important avenue in transmitting antibiotic resistance genes. FEMS Microbiol Lett 254:226-231. Financiamiento:

Beca Conicyt folio número 21120298

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Anexo 19

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Anexo 20

“Genotypification of spoilage poultry Pseudomonas by RAPD as a simple tool to identify indirectly biofilms in the processing line”

XXXIX Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2017: póster.

Pabla Morales, Miriam Troncoso, Guillermo Figueroa Laboratorio de Microbiología y Probióticos, INTA, Universidad de Chile.

Background: Biofilms in poultry industry can be associated to pathogenic and/or spoilage bacteria, among them Salmonella, Campylobacter or Pseudomonas. These bacteria are a major source of enteric diseases or major spoilage agents that reduce safety and shelf life of poultry products. The globalization of Chilean poultry exportations require lower bacterial loads. To evaluate the presence of Pseudomonas biofilms we can use a simple molecular methodology like Random amplification of polymorphic DNA (RAPD). DNA fingerprinting allow us to identify biofilms showing a similar pattern in bacteria from different poultry samples. The aim of this work was to characterize Pseudomonas isolates from poultry samples with different production dates by RAPD, and compare the resulting DNA fingerprint as an indicator of bacterial biofilms in the processing line. Methods: 24 isolates of P. fragi and 14 P. fluorescens from 11 poultry samples were obtained from a single industry, during different production dates and sampling time. Isolates were characterized through RAPD using a 10 mer primer (5`-AGCGGGCCAA-3`) and an annealing temperature of 36 ºC. All Pseudomonas isolates were grouped

into RAPD types which were considered similar (≥85% Dice similarity) based on DNA patterns. Results: 24 P. fragi isolates were grouped into 13 RAPD types, from which 8 included two or

more isolates obtained in different sampling times. 14 P. fluorescens isolates generated 12 RAPD types and only 2 isolates from different poultry samples had the same RAPD types. Conclusion: The presence of Pseudomonas isolates with similar RAPD types from different sampling times, evidences the presence of persistent biofilms in one or more steps during the poultry processing line. The results suggest that P. fragi has greater ability than P. fluorescens to persist in

biofilms. Each enterprises require more research to locate the biofilms and to apply a BPM solution. CONYCIT - PhD scholarship Number 21120298

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Anexo 21

“Actividad antibacteriana de Lactobacillus contra Pseudomonas alterantes aisladas de pollo”

XXXVIII Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2016: póster.

Pabla Morales, Miriam Troncoso, Guillermo Figueroa

Laboratorio de Microbiología y Probióticos, INTA, Universidad de Chile.

Estudios revelan el potencial biocontrolador de cepas de Lactobacillus sobre patógenos de pollo. Sin embargo, poco se conoce de su antagonismo con bacterias alterantes. Pseudomonas sp. son las principales bacterias alterantes psicrotrofas del pollo envasado en aerobiosis. Nuestro objetivo fue evaluar si cepas de Lactobacillus antagonizan con Pseudomonas alterantes de pollo en refrigeración, y así formular un potencial biopreservante. Se evaluó el antagonismo de Lactobacillus (n=27) sobre Pseudomonas alterantes de pollo (n=9), mediante el método de spot en agar con doble capa (MSADC) utilizando MRS modificado sin citrato de amonio ni acetato de sodio y bicarbonato al 0,2% y MH 0,7% agar. Se evaluó si el tamaño del halo se debe al efecto inhibidor de Lactobacillus y/o a la sensibilidad de Pseudomonas o a una interacción entre ambos factores, mediante modelo lineal general y mixto (MLGM, Infostat®). Se formaron 2 inóculos (pool A y B) con 5 cepas de Lactobacillus antagonistas cada uno (106 UFC/mL) que se co-cultivaron con un set de 9 Pseudomonas (103 UFC/mL) en TSBYE e incubaron a 8ºC. Se hicieron recuentos diarios de Pseudomonas entre los días 0 y 5. Se evaluó si Lactobacillus retrasan la multiplicación de Pseudomonas mediante MLGM (Infostat®). En el MSADC, 21/27 Lactobacillus inhiben Pseudomonas generando halos de inhibición mayores a 10 mm, 1/27 producen halos de inhibición menores a 4 mm y 5/27 Lactobacillus no inhibieron a 1 o más Pseudomonas. Se comprueba que el halo de inhibición depende de Lactobacillus y Pseudomonas por separado (p≥0,05). En co-cultivo a 8ºC, se detecta que pool B de Lactobacillus retrasa la multiplicación de Pseudomonas al quinto día de incubación (p≥0,05); en T0 (Pseudomonas sin Lactobacillus) el recuento de Pseudomonas alcanza 8,44±0,22 UFC/mL, T1 A (Pseudomonas con pool A de Lactobacillus) 8,06±0,23 UFC/mL y T1 B (Pseudomonas con pool B de Lactobacillus) 7,53±0,13 UFC/mL. Se concluye que cepas seleccionadas de Lactobacillus tienen actividad antagonista in vitro con Pseudomonas alterantes a 8ºC, y por lo tanto, podrían tener un potencial biopreservante en pollo refrigerado envasado en aerobiosis. Se requiere confirmar esta aseveración con estudio in situ en pollo.

Beca CONICYT, folio número 21120298.

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Anexo 22

“Bacteria láctica chilena antagoniza con Pseudomonas alterantes de pollo in vitro e in situ, pero no logra extender significativamente la vida útil de la

carne para su uso industrial”

XL Congreso Latinoamericano de Microbiología - SOMICH, 2018: póster.

Pabla Morales, Miriam Troncoso, Guillermo Figueroa Laboratorio de Microbiología y Probióticos, INTA, Universidad de Chile.

Un método innovador para controlar patógenos y extender la vida útil de la carne bovina, es el uso de bacterias lácticas. Sin embargo, poco se conoce sobre su efecto en el pollo, y menos sobre bacterias alterantes. A nivel nacional, las principales alterantes del pollo envasado en aerobiosis son Pseudomonas sp. y principalmente P. fragi. Nuestro objetivo fue evaluar si cepas lácticas tienen potencial bio-controlador con Pseudomonas y evaluar si este antagonismo se trasunta en una mayor vida útil de la carne de pollo. Se enfrentó una P. fragi prevalente en carne de pollo nacional (≈103 UFC/mL o cm2), frente a 3 bacterias lácticas (≈106 y 108 UFC/mL o cm2) en TSBYE pH 5,7-5,9 y pollo irradiado. Posteriormente se inoculó carne de pollo cruda con la cepa láctica (108 UFC/cm2) antagonista en la fase anterior. Los ensayos se incubaron a 8ºC, incluyeron recuentos de Pseudomonas en el tiempo utilizando agar selectivo CFC y utilizaron como control (T0) a Lactobacillus sakei CECT4808 por antagonizar a Pseudomonas sp. en carne bovina al vacío. Se evaluó si las cepas lácticas antagonizan con Pseudomonas en el tiempo

mediante modelo lineal general y mixto (MLGM, Infostat®). Para evaluar la vida útil de la carne cruda se predijo el tiempo en que Pseudomonas alcanza los 107UFC/cm2 (límite de deterioro) mediante DMFit. En TSBYE 2/3 cepas tienen potencial bio-controlador a 108 UFC/mL y 1/3 a 106 UFC/mL, observándose hasta 5 log de diferencia en el recuento de Pseudomonas en el día 4 al comparar con T0. Esta diferencia se mantiene en el tiempo. En carne irradiada el efecto bio-controlador es menor, sólo 1 cepa a 108 UFC/cm2 genera diferencias <1 log con respecto a T0 los días 2 y 3, pero no en el 4. En carne cruda la cepa potencial bio-preservante retrasa la multiplicación de Pseudomonas en el tiempo, aumentando la vida útil del pollo en ≈13 hrs. En conclusión, una cepa láctica chilena antagoniza con Pseudomonas en TSBYE y en carne de pollo crudo a 8ºC, y aunque este efecto extiende su vida útil, la magnitud de la extensión no es suficiente para la industria. Beca CONICYT, folio número 21120298.

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ANEXO 23:

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