Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso Vilma Regina...
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Etiopatogenia das Doenças Priônicas
e identificação genética do agente infeccioso
Vilma Regina Martins, PhD
Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer
I I SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO ESTADO DE SÃO PAULOESTADO DE SÃO PAULO
6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP.
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Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis
Animais
Encefalolia Espongiforme Bovina (BSE) marta
(MTE), cervo (CWD), felinos (FSE), antílopes
(EUE) e primatas (ZPSE)
“Scrapie” ovelhas e carneiros
HumanosKuruDoença de Creutzfeldt-Jakob (CJD)
Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS)Insonia Familiar Fatal
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Kuru
BSE
Scrapie
CJD
Encefalopatias Espongiformes transmissíveis (cérebros)
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Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis
Quem é o agente infeccioso?
Quais são suas características físico-químicas?
Como ocorre sua propagação?
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Cérebro de animais infectados
extrato
Inoculação em um animal sadio
Produção da mesma patologia vista no primeiro animal
Purificação do agente infeccioso
menor inóculo tem maior atividade infecciosa
Caracterização do agente infeccioso
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Susceptibilidade do agente infeccioso à UV
scrapie
(%)
ati
vid
ade
Dose de UV
gene
bactéria
bacteriófago
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Características químicas do agente infeccioso
Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV)
Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol)
Agente infeccioso sem material genético (DNA ou RNA)composto apenas de proteína (PrPsc)
Prions = proteinaceus infectious particle
Stanley Prusiner, 1983
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Identificação do agente infeccioso
agente infeccioso purificado
Imunização de coelhos
Produção de anticorpos contra o agente infeccioso
Reação positivaem cérebro infectado
Reação positivaem cérebro NÃO infectado
???
Cérebro sadio tem uma proteína
semelhante à infecciosaPrion celular
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Como ocorre a geração de novo agente infeccioso na ausência de material
genético?
Proposta:
A proteína infecciosa catalisa a formação de novas proteínas infeccionas a partir da homóloga normalmente produzida pela célula.
Prova:
Importância da proteína prion celular na doença.
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Proteína prion celular
Gene codificadorPRNP
Cromossomo 20 humanoCromossomo 2 camundongo
Deleção de PRNP em camundongos
Animais “knockout” para PrPc
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Camundongo PRNP “knockout”
Büller et al., Cell 73, 1339-47, 1993
A presença da proteína celular é absolutamente necessária para o estabelecimento de infecção por prions!
90 140 190 240 340 390 440
100
60
40
20
0
80
Incubation time (days)
Anim
ais
sem
doença
(%
)
PrP +/+
CD-1PrP 0/0
Tempo de incubação (dias)
0
40
60
80
100
20
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Mecanismo de conversão PrPc- Prion
PrP gene
PrP mRNA
PrPc
Célula normal
PrP gene
PrPc
PrPsc
PrP mRNA
Célula infectada
Adaptado de Weissmann, 1994
Hipótese de “protein only” só proteína
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PrPc Prion
NormalAltamente insolúvel
Deposição em placas
Proteínas com diferenças conformacionais
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Prions“Proteinaceous infection particles”
•Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos
(nucleases e UV)
•Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol)
•Contém uma forma anormal de uma proteína celular, PrPc
•Diferem de PrPc apenas estruturalmente
•Presença de PrPc é absolutamente necessária para a infecção
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Doenças humanas por prions Infecciosas/Iatrogenicas
Transplante de córnea (CJD)Inoculação acidental de tecido cerebral(CJD)Hormônio de Crescimento (cadáver)canibalismo (Kuru)vCJD injestão de carne contaminada com BSE
Genéticas Mutações no gene de Prion celularGSS, FFI, CJD
Esporádicascaso completamente desconhecido 1:2,000,000
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BSE X vCJD
2000 – 79 cases of vCJD (Hilton DA, J. Neuroph. Appl. Neurobiol 26 (5), 405-407)
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Evidências da transmissão do BSE para humanos
Transmissão de BSE para macacos induziu a formação de placas “floridas” similares às presentes na nvCJD.
Prion Biology and Diseases, Stanley Prusiner, 2ª edição, 2003
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Do intestino ao cérebroTranslocação através do epitélio intestinal
Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006
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Neuroinvasão a partir do intestino
Splanchnic nerve
Vagus nerve
Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006
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Gado bovinoEEB - BSE
HumanosnvCJD
Scrapieovelha
Humanos
Cervos Chronic Wasting Disease
CWD
Barreira entre espécies
TransplantesTransfusão sangüínea
?
Barreira entre espécies
Barreira entre espécies
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Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease byblood transfusion
C A Llewelyn, P E Hewitt, R S G Knight, K Amar, S Cousens, J Mackenzie, R G Will
Findings 48 individuals were identified as having received alabile blood component from a total of 15 donors who laterbecame vCJD cases and appeared on the surveillance unit’sregister. One of these recipients was identified as developingsymptoms of vCJD 6·5 years after receiving a transfusion ofred cells donated by an individual 3·5 years before the donordeveloped symptoms of vCJD.
Interpretation Our findings raise the possibility that thisinfection was transfusion transmitted. Infection in therecipient could have been due to past dietary exposure to theBSE agent. However, the age of the patient was well beyondthat of most vCJD cases, and the chance of observing acase of vCJD in a recipient in the absence of transfusiontransmitted infection is about 1 in 15 000 to 1 in 30 000.
THE LANCET • Vol 363 • February 7, 2004
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Forma Fenótipo
Adquirida KuruDoença de Creutzfeldt-Jakob iatrogênica (iDCJ ou iCJD)
Doença de Creutzfeldt-Jakob nova variante(vdcj ou vCJD)
Familial (hereditária)
fDCJ ou fCJD)
Insônia Familiar Fatal (IFF ou FFI)
Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS)
Mista ou indeterminada
Esporádica sDCJ ou sCJD Típica (MM1 MV1)
Aparecimento precoce(VV1)
Longa duração (MM2)
Placas de Kuru (MV2)
Atáxica (VV2)
Insônia Fatal (sIF)
Doenças humanas por prions
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ORF
EXON I INTRON EXON II
ORF
mRNA
5’ An
Prnp
O gene PRNP e a proteína prion celular
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NH2 COOH
102 180
178
198
200
210
217
232
105
145
171117
octa
P
L
A
V
y
STOP
N
S
D
N
V
I
F
S
E
K
V
I
Q
R
M
R
4 ou 5
< 3 ou > 8
P
L
CJD
GSS
Doença Psiquiátrica
CJD ou FFI
Mutações na proteína PrPc associadas a doenças herdadas de padrão autossômico dominante
Martins e cols, in Neuropsiquiatria Geriátrica, 2000
183
T
A
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Sporadic CJ
FFI
GSS New variant CJD
Curvas de mortalidade distribuídas por sexo e idade FFI
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nvCJD X CJD esporádico
idade (anos) 29 60
Duratção (meses) 14 5
Sintomas iniciais•Anormalida
des Psiquiátricas
•Demência•Sintomas sensitivos
Sintomas cerebelares
(% dos pacientes)
100 40
nvCJD esporádico
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Codon 129polimorfismo
M129M37%
M129V52%
V129V11%
Presença de polimorfismos no gene PRNP
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Polimorfismo no codon 129 e susceptibilidade àsdoenças por prions
Doença#
indivíduos
MET/MET %
MET/VAL %
VAL/VAL %
sadios 261 37 52 11
CJDesporádic
o73 78 12 10
CJDIatrogênic
o63 60 11 20
vCJD 24 98 2 -
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Procedimentos de diagnóstico para
doenças por prions
Cérebro, orgãos linfóides e músculo esquelético
Dosagem da proteína 13.3.3Em LCR
Avaliação de polimorfismos/mutaçõesno gene PRNP
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Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP )
Sangue periférico
Separação dos leucócitos
Purificação do DNA
Seqüênciamento direto
DHPLCCromatografia líquida
de alta resolução
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Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP )
Coleta de 5 ml de sangue periférico com anti coagulante (K3 EDTA)
Envio ao Centro de Referência
4ºC – máximo 12 h -20ºC – maior tempo de
armazenamento
Gelo secoGelo reciclável