Etiologia e epidemiologia associadas à mortalidade da ...

ESCOLA DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA RURAL

Etiologia e epidemiologia associadas à

mortalidade da amendoeira em pomares super-

intensivos no Alentejo

Cláudio Miguel Parrano dos Santos

Orientação:

Doutor Patrick Materatski

Professora Doutora Maria do Rosário Fernandes Félix

Mestrado em Engenharia Agronómica

Dissertação

Évora, 2018

Esta dissertação foi cofinanciada por:

GAFAPROTECT - ALT20-03-0145-FEDER-028263

TOMVIRPROTECT - ALT20-03-0145-FEDER-028266

i

Agradecimentos

Por toda a paciência, por toda a motivação que me foram dando ao longo destes meses, por todo

o conhecimento que me transmitiram e por toda a disponibilidade que tiveram para me ouvir e

me ajudar sempre, gostava de começar por agradecer aos meus orientadores, o Doutor Patrick

Materatski e a Professora Doutora Maria do Rosário Fernandes Félix. Foram sem dúvida as

melhores pessoas para me ajudar a chegar ao objetivo final com sucesso.

Queria também agradecer os meus pais, Mário e Silvina, à minha namorada Francisca, à minha

filha Maria Margarida

A todos os que partilharam comigo o laboratório durante estes meses pela ajuda que me deram

quando mais precisei, e que me ajudaram a passar o tempo de forma mais tranquila e alegre.

Ao Miguel Madeira e ao Eng. José Maria Falcão pela disponibilidade que tiveram para me

ajudar durante a recolha das amostras e a fornecerem-me sempre os dados que precisei durante

este trabalho.

Ao Jorge Saragoça e ao Rui Queirós que passaram um dia comigo ao sol a recolher amostras

sem parar e sem pedir nada em troca.

Ao Francisco Mendoça pelas horas de estudo e sofrimento, mas também de alegria que partilhou

comigo e com quem tive a alegria que começar esta espetacular etapa da minha vida e a todos

os meus amigos que me ajudaram durante estes 2 anos.

Este trabalho foi financiado pelo projeto “Controle da antracnose da oliveira através de

silenciamento e expressão de genes utilizando um vírus de planta como vector” com a referência

ALT20-03-0145-FEDER-028263 e pelo projeto “Desenvolvimento de um vetor para proteção de

plantas de tomate contra TSWV” com a referência ALT20-03-0145-FEDER-028266,

cofinanciados pela União Europeia através do Fundo de Desenvolvimento Regional Europeu,

ALENTEJO2020 (Programa Regional Operacional do Alentejo), ALGARVE2020 (Programa

Regional Operacional do Algarve) e através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, na sua

componente nacional.

ii

Resumo

Neste trabalho foram analisadas jovens plantas de amendoeira das cultivares

Lauranne Avijor e Soleta, com sintomas de doença e assintomáticas, situadas em dois

locais da Região do Alentejo, em modo de exploração super-intensivo. Todas as árvores

foram testadas em três órgãos vegetativos distintos, raízes, tronco e folhas, bem como os

solos em que estavam plantas e a água utilizada na rega. Os fungos fitopatogénicos mais

encontrados nas amostras de planta foram os pertencentes aos géneros Fusarium e

Alternaria e ainda a espécie Macrophomina faseolina. Fungos do género Fusarium foram

também encontrados tanto no solo como na água de rega, podendo dar uma indicação

quanto à fonte de inóculo das plantas. Verificou-se ainda que as mesmas cultivares de

planta, com a mesma proveniência, apresentam diferentes microbiomas de acordo com

os locais onde estão instaladas e que estes podem contribuir decisivamente para a

manifestação ou não de sintomas de doença.

PALAVRAS-CHAVE: Amendoeira; Gomose; Amendoal super-intensivo; Soleta;

Lauranne Avijor

iii

Abstract – Etiology and epidemiology causing mortality in super-

intensive almond trees orchards in Alentejo region

In this work, young almond plants of the cultivars Lauranne Avijor and Soleta

with disease symptoms and asymptomatic, located in two Alentejo regions, under a super-

intensive mode management, were analyzed for the presence of fungi. Three distinct

vegetative organs, roots, trunk and leaves of trees, as well as the soils on which plants

were installed and water used for irrigation were tested. The phytopathogenic fungi most

found in the plant samples belonged to genera Fusarium and Alternaria and also to the

species Macrophomina faseolina. Fusarium spp. were also found in both soil and

irrigation water which may give an indication of the source of inoculum. It was also

verified that the same plant cultivars, with the same provenance, present a different

microbiome according to the places where they are installed which can contribute

decisively for the manifestation of symptoms of disease.

KEYWORDS: Almond tree, Gummosis, Super-intensive almond tree orchard, Soleta,

Lauranne Avijor

iv

Abreviaturas °C - Grau centígrado

% - Percentagem

μL - Microlitros

μM - Micromolar

BLAST - Basic Local Alignment Search Tools

CASS - California Agricultural Statistics Service

Cm – Centímetros

CTAB - Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA - Ácido Desoxirribonucleico

dNTPs - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados

EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra Acético

ESRI - Environmental Systems Research Institute

FAOSTAT - Food and Agriculture Organization of the United Nations Statistic Division

h – Hora(s)

ha - Hectares

ITS - Internal Transcribed Spacer

km - Quilómetros

kPa - Kilopascal

L - Litros

m – Metros

min – Minuto(s)

mL - Mililitro

mm - Milímetros

mM - Milimolar

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OTUs – Operational Taxonomic Unit

PCR - Polymerase Chain Reaction

PDA - Potato dextrose agar

PVP – Polivinilpirrolidona

rpm - Rotações por minute

spp. - Espécies

Ton - Toneladas

v

U – Unidades

v/v - Volume/Volume

Bases nucleótidas

A - Adenina

C - Citosina

G - Guanina

T - Timina

vi

Índice Geral

Agradecimentos ........................................................................................................................... i

Resumo ....................................................................................................................................... ii

Abstract – Etiology and epidemiology causing mortality in super-intensive almond trees

orchards in Alentejo region .......................................................................................................... iii

Abreviaturas ............................................................................................................................... iv

Índice Geral ............................................................................................................................... vi

Índice de Figuras ..................................................................................................................... viii

Índice de Quadros ..................................................................................................................... xii

1. Introdução ........................................................................................................................ 1

1.1. Apresentação e Relevância do Estudo ....................................................................... 2

1.2. Problema e Questões do Estudo ................................................................................. 2

1.3. Objetivo e hipóteses ..................................................................................................... 3

1.4. Organização do Trabalho ........................................................................................... 3

2. Revisão Bibliográfica ...................................................................................................... 5

2.1. A Amendoeira .............................................................................................................. 6

2.1.1. Classificação Taxonómica ................................................................................... 6

2.1.2. Características botânicas .................................................................................... 7

2.1.3. Ciclo Não Produtivo ............................................................................................ 7

2.1.4. Ciclo Produtivo .................................................................................................... 8

2.1.5. Condições de Crescimento .................................................................................. 9

2.2. Importância económica e comércio da amêndoa a nível Mundial ........................ 10

2.3. A cultura da amendoeira no mundo e em Portugal ............................................... 12

2.4. Principais doenças das Prunóideas .......................................................................... 17

2.4.1. As principais doenças da amendoeira ............................................................. 17

2.5. Fungos Endofíticos .................................................................................................... 32

3. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 36

3.1. Apresentação e caracterização das parcelas em estudo ......................................... 37

3.1.1. Localização dos locais de amostragem ............................................................ 37

3.1.2. Condições edafo-climáticas de Portalegre e de Évora .................................... 38

3.1.3. Sistemas de rega nos locais utilizados nos locais A e B .................................. 44

3.2. Descrição do Problema e seleção do material vegetal ............................................ 46

3.3. Recolha de material vegetal ...................................................................................... 47

vii

3.4. Recolha de material edáfico ..................................................................................... 48

3.5. Recolha de água de rega ........................................................................................... 49

3.6. Isolamento de microrganismos provenientes do material vegetal ........................ 49

3.7. Isolamento de microrganismos provenientes do material edáfico ........................ 51

3.8. Isolamento de microrganismos presentes na água de rega .................................... 52

3.9. Identificação molecular dos microrganismos isolados no material vegetal, edáfico

e água de rega ........................................................................................................................ 52

3.10. Análise estatística .................................................................................................. 55

4. Resultados ...................................................................................................................... 57

4.1. Isolamento e identificação de isolados de fungos obtidos no material vegetal ..... 58

4.2. Isolamento e identificação de Fusarium spp. no material edáfico ........................ 59

4.3. Isolamento e identificação de Fusarium spp. na água de rega .............................. 63

4.4. Diversidade de fungos endofíticos encontrada nas plantas ................................... 64

4.5. Análise da abundância de fungos endofíticos encontrada nas plantas ................. 70

5. Discussão de Resultados ................................................................................................ 75

6. Conclusão e Perspetivas Futuras ................................................................................. 82

7. Referências ..................................................................................................................... 85

8. Anexos ............................................................................................................................ 96

viii

Índice de Figuras

Figura 1 - Produção total da quantidade de amêndoa com casca a nível mundial (Fonte:

FAOSTAT, 2018).

Figura 2 - Top 10 de países na produção de amêndoa com casca (Fonte: FAOSTAT,

2018).

Figura 3 - Produção de amêndoa com casca por continente (Fonte: FAOSTAT, 2018).

Figura 4 - Produção total da quantidade de amêndoa com casca em Portugal (Fonte:

FAOSTAT, 2018).

Figura 5 - Superfície e produção de amêndoa em Portugal (Adaptado de Estatísticas

Agrícolas, 2016).

Figura 6 - Produção de amêndoa em Portugal de 2012 a 2016 e média de produção

durante o mesmo período (Fonte: INE I.P., Estatística de Produção Vegetal).

Figura 7 - Superfície plantada e produções para amêndoa nas diferentes regiões do país,

para o ano de 2016 (Fonte: Adaptado de Estatísticas Agrícolas, 2016).

Figura 8 - Triângulo da doença com os três fatores que em conjuntos provocam o

aparecimento da doença (Fonte: Agrios, 2005).

Figura 9 - Folhas (A) e frutos (B) de prunóideas com sintomas de crivado (A - Fonte:

https://www.flickr.com/photos/hermesalmond/5355220118; B – Fonte:

https://www.flickr.com/photos/hermesalmond/5354603207).

Figura 10 - Ciclo da doença de Crivado causado por Stigmina carpophila (Adaptado de

http://mevazor.uz/en/diseases/type/3/item/2/).

Figura 11 - Botões florais (A), frutos (B) e frutos mumificados (C) afetados por

Moniliose (A e C - Fonte: Agrios, 2005; B - Fonte:

https://plantvillage.psu.edu/topics/almond/infos).

Figura 12 - Ciclo da doença de Moniliose causado por Monilinia fructicola, Monilinia

laxa ou Monilinia fructigena (Adaptado de Agrios, 2005).

Figura 13 - Folhas (A e B) e frutos (A) afetados por Lepra (Fonte:

https://www.shutterstock.com/search/taphrina).

Figura 14 - Ciclo da doença de Lepra causado por Taphrina deformans (Adaptado de

Agrios, 2005).

Figura 15 - Frutos (A) e folhas (B) com sintomas de Oídio (Powdery Mildew) (Fonte:

https://agrobaseapp.com/united-states/disease/powdery-mildew-of-almonds).

ix

Figura 16 - Aparecimento de esporos em zona com necrose (Fonte: Marek et al., 2013).

Figura 17 - Ciclo da doença de Fusariose causado por Fusarium Fusarium avenaceum,

Fusarium acuminatum e Fusarium solani (Adaptado de Agrios, 2005).

Figura 18 - Sintomas de doenças do lenho em amendoeiras (Fonte:

https://flotrouillas.faculty.ucdavis.edu/research-projects/).

Figura 19 - Hipótese explicativa para o estabelecimento de relações mutualista ou

parasitas entre um fungo endofítico e uma planta hospedeira (Adaptado de Schulz et al.,

2006).

Figura 20 - Parcela em estudo no local A.

Figura 21 - Parcela em estudo no local B.

Figura 22 - Gráfico termopluviométrico de Portalegre (Fonte: https://pt.climate-

data.org/location/138/).

Figura 23 - Gráfico termopluviométrico de Évora (Fonte: https://pt.climate-

data.org/location/135/).

Figura 24 - Classificação Portuguesa dos Sistema de Rega (Fonte: Raposo, 1997).

Figura 25 - Exemplo de rega gota-a-gota com uma fita de emissores no local B.

Figura 26 - Valores indicativos das eficiências de aplicação para sistemas de rega bem

projetados e bem mantidos (Fonte: Pereira, 2004).

Figura 27 - Exemplo das sintomatologias encontrada em amendoeiras jovens presentes

nos locais A e B e nas cultivares Lauranne Avijor e Soleta.

Figura 28 - Esquema da recolha de amostras de material vegetativo no local A.

Figura 29 - Ciclo de desinfeção do material vegetal.

Figura 30 - Fracionamento do material edáfico.

Figura 31 - Placa de Petri de 90 mm identificada e após o crescimento de

microrganismos.

Figura 32 - Amostras de material edáfico em suspensão.

Figura 33 - Utilização de azoto líquido para a maceração dos microorganismos.

Figura 34 - Colocação de um microrganismo macerado num microtubo de 2 mL.

Figura 35 - Região de rDNA com a localização dos primers ITS1 e ITS4 (Fonte:

https://www.researchgate.net/figure/Location-of-Internal-Transcribed-Spacer-sequence-

1-2-a-and-the-position-of-primers_fig1_270564947).

Figura 36 - Análise electroforética em gel de agarose 1% em que se observam os produtos

x

de amplificação da região ITS, tendo-se utilizado os primers universais ITS1 e ITS4,

usando DNA extraído (1 a 14) de fungos isolados de amostras de material vegetal; - -

controlo negativo; M – marcador GeneRuler 1 Kpb plus DNA Ladder; resultante num

produto com o tamanho esperado entre 500 e 700 pb.


de amplificação de uma porção do gene da β-Tubulina, usando DNA extraído (1 a 7) de

fungos isolados de amostras de material vegetal; - - controlo negativo; M – marcador

GeneRuler 1 Kpb plus DNA Ladder; resultante num produto com o tamanho esperado de

1500 pb.

Figura 38 - Número total de isolados e espécies de Fusarium presentes no material

edáfico no local A e no local B.

Figura 39 - Número de isolados e espécies de Fusarium obtidos, por cultivar, presentes

no material edáfico no local A.

Figura 40 - Número de isolados e espécies de Fusarium obtidos por cultivar, presentes

no material edáfico no local B.

Figura 41 - Número de isolados e espécies de Fusarium, por cultivar sintomática e não

sintomática, presentes no material edáfico no local A.


sintomática, presentes no material edáfico no local B.

Figura 43 - Ausência (0) e presença (1) das diferentes espécies de Fusarium na água

utilizada para a rega das plantas do local A e do local B.

Figura 44 - Isolados encontrados no material vegetal e obtidos em cultura pura; A -

Epicoccum; B - Trichoderma; C - Trichothecium; D - Purpureocillium; E - Fusarium; F

- Alternaria; G - Curvularia; H - Aspergillus; I – Aureobasidium; J – Botrytis; L –

Cladosporium; M - Penicillium.


Phoma; B - Rhizopus; C - Boeremia; D - Bjerkandera; E - Truncatella; F - Talaromyces;

G - Preussia; H - Byssochamys; I – Pseudogymnoascus; J – Diaporthe; L –

Macrophomina; M - Umbelopsis.


Ilyonectria; B - Chaetomium; C – Não identificado.

Figura 47 - Número de isolados de cada espécie após o BLAST.

xi

Figura 48 - Média de abundância de fungos encontrados nas plantas do local A e

respetivo erro padrão.

Figura 49 - Média de abundância de fungos encontrados nas plantas do local B e

respetivo erro padrão.

xii

Índice de Quadros

Quadro 1 - Enquadramento taxonómico da família das Rosáceas (Fonte: Almeida, 2013).

Quadro 2 - Principais países exportadores de amêndoa (sem e com casca) em toneladas

(Fonte: Adaptado de http://www.cif-businessintelligence.com/).

Quadro 3 - Principais países/regiões produtores de amêndoa entre 2010/11 e 2015/16,

em toneladas (Fonte: Adaptado de http://www.cif-businessintelligence.com/).

Quadro 4 - Principais países/regiões consumidores de amêndoa entre 2010/11 e 2015/16,

em toneladas (Fonte: Adaptado de http://www.cif-businessintelligence.com/).

Quadro 5 - Dados relativos à temperatura do ar e à precipitação na estação meteorológica

de Portalegre entre os anos de 1971 e 2000 (Fonte: Instituto Português do Mar e da

Atmosfera).


de Évora entre os anos de 1971 e 2000 (Fonte: Instituto Português do Mar e da

Atmosfera).

Quadro 7 - Identificação dos isolados de Fusarium por local (A e B), por cultivar

(Lauranne e Soleta) e por sintomatologia (Sintomáticas e assintomáticas).

Quadro 8 - Ausência (0) e presença (1) dos diferentes isolados de Fusarium na água

utilizada para a rega nos locais A e B.

Quadro 9 - Diversidade de fungos identificados após a análise BLAST N das sequências

nucleóticas e número total de isolados de fungos por órgão vegetativo.

1

1. Introdução

2

1.1. Apresentação e Relevância do Estudo

Nos dias de hoje, a sociedade está cada vez mais preocupada com o bem-estar

físico, e com aquilo que deve ou não comer. Para isso, cada vez mais a mentalidade no

que diz respeito à alimentação tem sido alterada pela população mundial, que cada vez

mais se concentra num estilo de vida e alimentação mais saudáveis, deixando de consumir

ou reduzindo o consumo de alguns alimentos como por exemplo o sal, o açúcar e as carnes

gordas.

Devido a este tipo de alterações, também os agricultores alteraram o seu método

e mudaram o seu foco de produção para os produtos ditos mais saudáveis, como por

exemplo os legumes frescos, as hortaliças, os vegetais e os frutos secos.

Uma das culturas que está, ano após ano, a ganhar mais importância nesta nova

forma de alimentação é a amêndoa, que pertence à família Rosaceae e à sub-família

Amygdaloideae, devido às suas propriedades nutricionais, como por exemplo o facto de

contribuir para a redução do colesterol e de ser anticancerígena

(https://www.medicalnewstoday.com). A cultura da amêndoa tem tido um aumento

significativo na Europa (Itália e Espanha) e mais recentemente em Portugal. De facto,

Portugal apresenta nos últimos anos um aumento no número de hectares plantados

(Estatísticas Agrícolas, 2016), este grande investimento na cultura, tem como exemplo a

criação de uma unidade de transformação no Alentejo.

1.2. Problema e Questões do Estudo

Em abril do ano de 2016 foram instalados, em dois distritos de Portugal (Distrito

de Portalegre e Distrito de Évora) ambos na região do Alentejo, dois amendoais em modo

de exploração super-intensivo. No entanto, no ano de 2017 começaram a aparecer os

primeiros problemas fitossanitários nas amendoeiras das cultivares Lauranne Avijor e a

Soleta, ambas cultivares europeias, tendo a primeira origem francesa e a segunda origem

espanhola. Estas sintomatologias, nas diversas árvores foram, num primeiro momento,

típicas de carência hídrica, em que as árvores apresentavam folhas e ramos secos.

Observou-se mais tarde que, os sintomas começaram por manifestar-se nos ramos

superiores das árvores afetadas, iniciando-se com uma clorose, seguida de necrose e

queda das folhas. Cortes transversais nos ramos superiores revelaram anéis necróticos no

interior do lenho. Os sintomas passavam também para o tronco, com o aparecimento de

3

várias gomoses, levando à morte generalizada das árvores jovens. O problema em estudo

neste trabalho, está relacionado com a identificação dos organismos endofíticos e dos

possíveis agentes fitopatogénicos que possam estar associados ao declínio das

amendoeiras jovens.

Sendo assim as principais questões científicas em estudo são:

1. Quais serão os agentes fitopatogénicos associados ao declínio das amendoeiras

jovens?

2. Quais serão os organismos endofíticos associados às amendoeiras jovens?

3. Quais os fatores ambientais que poderão ter influência no aparecimento destas

doenças?

1.3. Objetivo e hipóteses

O objetivo deste trabalho foi investigar os organismos patogénicos e endofíticos

associados ao declínio de plantas de amendoeira (Prunus dulcis), e qual a sua etiologia e

epidemiologia, através da análise de: i) dois locais, um no distrito de Portalegre e outro

no distrito de Évora (local A e B, respetivamente); ii) duas cultivares (Lauranne Avijor e

Soleta); iii) em cada cultivar plantas sintomáticas e assintomáticas; iiii) e nos diferentes

órgãos das plantas (raiz, tronco e folhas). Foram testadas as seguintes hipóteses de

trabalho: i) haverá diferenças entre a abundância e a diversidade dos organismos

fitopatogénicos e endofíticos entre os locais (A e B); ii) haverá diferenças entre a

abundância e a diversidade dos organismos fitopatogénicos e endofíticos entre as duas

cultivares (Lauranne Avijor e Soleta); iii) haverá diferenças entre a abundância e a

diversidade dos organismos fitopatogénicos e endofíticos entre as plantas sintomáticas e

assintomáticas; iv) e haverá diferenças entre a abundância e a diversidade dos organismos

fitopatogénicos e endofíticos nos diferentes órgãos das plantas (raiz, tronco e folhas).

1.4. Organização do Trabalho

Este trabalho encontra-se divido em cinco capítulos, sendo que estes capítulos são

antecedidos pelo resumo do trabalho nas línguas inglesa e portuguesa, o índice geral do

trabalho, o índice de figuras e o índice de quadros.

O primeiro capítulo é a introdução, que está divida em quatro partes: a

4

apresentação e relevância do estudo, em que se explicam as razões da escolha do tema, o

objetivo do estudo e as questões que orientaram o mesmo, e por fim a organização do

trabalho.

O segundo capítulo é a revisão bibliográfica, onde se descreve a cultura da

amendoeira a nível mundial e ibérico, onde se faz uma breve caraterização da cultura e

da sua importância económica, a apresentação e descrição das principais doenças

causadas por fungos nas prunoideas e uma descrição da comunidade de fungos

endofiticos presentes nestas plantas.

O terceiro capítulo são os materiais e métodos, onde se descrevem os

procedimentos que foram realizados durante o estudo.

O quarto capítulo são os resultados, onde se apresentam os resultados obtidos após

o trabalho.

O quinto capítulo, a discussão, é dedicado à explanação dos resultados obtidos e

à discussão dos mesmos.

O sexto capítulo são as conclusões e as prespetivas futuras, em que se retiram as

conclusões do trabalho e se apresentam ideias para trabalhos futuros.

As referências bibliográficas e os anexos são apresentados no final.

5

2. Revisão Bibliográfica

6

2.1. A Amendoeira

2.1.1. Classificação Taxonómica

A amendoeira pertence à família Rosaceae, pertencente à ordem Rosales, incluída

na subclasse Rosidae de Cronquist (Quadro 1). A família das Rosaceae é considerada

monofilética, apesar de existir uma grande diversidade morfológica e anatómica nestes

taxa. Esta família é composta aproximadamente por 85 géneros e 3000 espécies,

distribuídas principalmente pelas regiões temperadas do Hemisfério Norte e nela estão

incluídas várias espécies com interesse agronómico e económico, como as fruteiras de

climas temperados. Apesar de existirem algumas espécies herbáceas, a família é

maioritariamente constituída por espécies lenhosas (Almeida, 2014).

Quadro 1 - Enquadramento taxonómico da família das Rosáceas (Fonte: Almeida, 2013).

Reino Plantae

Sub-Reino Tracheobionta (Plantas vasculares)

Superdivisão Spermatophyta (Plantas com semente)

Divisão Magnoliophyta (Angiospérmicas)

Classe Magnoliopsida (Dicotiledóneas)

Subclasse Rosidae

Ordem Rosales

Família Rosaceae

Segundo Schulze-Menz (1964) e Almeida (2014), tendo por base a anatomia dos

frutos, é possível dividir as rosáceas por quatro subfamílias:

1. Maloideae (sin. Pomoideae), que inclui as espécies com pseudofrutos carnudos,

designados por pomos, em que o hipanto se encontra fundido com a parede do

ovário. Nesta subfamília incluem-se as fruteiras Malus domestica (macieiras), Py-

rus communis (pereira) e Cydonia oblonga (marmeleiro).

2. Amygdaloideae (sin. Prunoideae), que inclui todas as rosáceas cujos frutos são

drupas, de entre as quais se destacam as fruteiras do género Prunus: P. persica

(pessegueiro), P. domestica (ameixeira europeia), P. dulcis (amendoeira), P. ar-

meniaca (damasco), P. avium (cerejeira) e P. cerasus (ginjeira).

7

3. Rosoideae, ao contrário das subfamílias anteriores, em que existe uniformidade

no tipo de fruto, os frutos das espécies de Rosoideae podem ser aquénios ou plu-

ridrupas. Incluem-se nesta subfamília os géneros Fragaria (morango), Rosa (ro-

seiras) e Rubus (amoras e framboesas).

4. Spiraeoideae. Agrupamento não monofilético onde tradicionalmente se incluem

as rosáceas cujo fruto é um folículo ou cápsula, como, por exemplo, as plantas

ornamentais do género Spiraea.

2.1.2. Características botânicas

Na família das rosáceas, e mais precisamente na sub-família das Amygdaloideae

é onde estão incluídos os frutos secos, como é o caso da amendoeira (Prunus dulcis (Mill.)

D.A. Webb), sin. Prunus amygdalus ou Amygdalus communis) (Kester et al., 1991 e

Verma, 2014).

Segundo Verma (2014) a amendoeira, é uma árvore de folha caduca, que pode

crescer entre os 4 e os 10 m de altura, onde o tronco pode atingir os 30 cm de diâmetro.

Os lançamentos do ano são verdes ao início, ficando arroxeados após a exposição à luz

solar, e adquirindo a cor castanha após o seu segundo ano. As folhas são lanceoladas, com

4 a 13 cm de comprimento e 1,2 a 4 cm de largura, as folhas são serradas na margem e

têm um pecíolo com cerca de 2,5 cm. As flores são de cor branca ou rosa claras, com 3 a

5 cm de diâmetro e 5 pétalas, produzidas de forma singular ou em pares antes das folhas

no início da Primavera. O fruto é uma drupa com 3,5 a 6 cm de comprimento, com uma

casca exterior suave. O exocarpo é uma casca endurecida de cor verde acastanhada, que

contém lá dentro a amêndoa, geralmente uma e ocasionalmente duas.

2.1.3. Ciclo Não Produtivo

Para que haja uma produção ótima é essencial que as árvores sejam saudáveis e

bem implantadas, para tal acontecer, um dos fatores principais é a preparação da zona

onde o pomar vai ser instalado de modo a evitar a habitual crise de transplantação que

ocorre nas plantas. As novas árvores necessitam de cuidados com a rega, condução e

controlo de doenças durante os anos não produtivos, e durante toda a sua vida produtiva

(Flint, 2002).

As amendoeiras são classificadas, pela California Agricultural Statistics Service

8

(CASS), como não produtivas até à quarta época de crescimento, ou 3 anos após a

plantação, apesar de em alguns pomares a colheita começar na terceira época de

crescimento. É durante os anos não produtivos que acontece o período de maior

crescimento radicular e que se desenvolvem as estruturas básicas da árvore. Durante o

primeiro ano, situações de ‘stress’ causadas por doenças, nemátodes, infestantes ou rega

insuficiente, vão comprometer o desenvolvimento radicular e atrasar o crescimento

vegetativo. Após os primeiros anos, as árvores tornam-se mais tolerantes a este tipo de

‘stress’ (Flint, 2002).

As árvores passam por dois a três fluxos de crescimento durante o seu primeiro

ano no pomar, esses fluxos ocorrem durante a Primavera e o Verão, sendo que o

crescimento diminui no final do Verão. Esses fluxos, vão sendo cada vez menores nas

épocas de crescimento seguintes (Flint, 2002).

Após a primeira época de crescimento, a árvore é despontada e podada, para

selecionar a estrutura que vai formar a copa, normalmente são selecionados três ramos

para este objetivo. Na segunda época de crescimento os ramos primários são mantidos e

a estrutura secundária da árvore é selecionada, ficando assim formada a estrutura básica

da árvore (Flint, 2002).

Se não houver limitações na rega nem em outros fatores de crescimento, os botões

florais começam a aparecer em julho, tal como rebentos longos, durante a segunda ou

terceira época de crescimento. O desenvolvimento dentro do botão floral começa a

acontecer no final do Verão e o Outono. Esses botões florais florescem na época seguinte,

e as estruturas de frutificação começam a desenvolver-se a partir dos lançamentos laterais

(Flint, 2002).

2.1.4. Ciclo Produtivo

Em novembro, a amendoeira entra em repouso vegetativo, sendo que esse período

dura até dezembro. Durante este tempo, a árvore mantém um nível mínimo de transporte

de água e de consumo de amido. No Inverno, a desagregação de amido aumenta a

concentração de açúcar na seiva, impedindo assim que esta congele. Para produzir amido

suficiente para este processo a árvore deve ser suficientemente regada durante o Outono

(Flint, 2002).

A floração ocorre entre fevereiro e março e a polinização das flores acontece

9

quando os grãos de pólen são transferidos das anteras da flor de uma cultivar para o

estigma da flor de outra cultivar, e são necessários 50 a 60 grãos de pólen para que a

fertilização tenha sucesso. A polinização da amendoeira está maioritariamente

dependente de insetos.

Durante abril, a energia de árvore é repartida em dois processos, no crescimento

dos ramos e no crescimento do fruto. Em seguida dá-se um rápido período de crescimento

das cascas externa e interna, que continua até maio. No final de abril o fruto atinge o

tamanho final, nesse momento a camada interna da casca começa a endurecer, enquanto

a camada exterior se mantém macia. Este período é crítico, pois se existir algum ‘stress’

na árvore a camada interna pode rachar ou partir e causar o aborto do embrião levando à

perda da amêndoa (Flint, 2002).

O embrião começa a alargar no início de maio, num processo que vai até ao início

de junho, e que acaba com a formação da amêndoa. Depois disto, a camada exterior da

casca vai começar a rachar e a separar-se da camada interior, o que indica que o fruto está

completamente maduro. A camada exterior da casca acaba de endurecer entre junho e

julho. Em agosto, e apesar das variações de zona para zona e de ano para ano, começa a

colheita, que deve ser iniciada quando 95 a 100% das camadas exteriores da casca se

separaram (Flint, 2002).

2.1.5. Condições de Crescimento

Segundo Flint (2002) e Verma (2014) as amendoeiras crescem melhor em solos

profundos, bem drenados, não estratificados e com uma textura mais grosseira. Com as

condições ideais de solo as raízes podem crescem até 2,7 m de profundidade. As

condições físico-químicas do solo que limitem o crescimento das raízes ou afetem a sua

sanidade, têm influência direta no tamanho, no vigor e potencial produtivo das árvores.

Os solos mais arenosos e argilo-arenosos podem requerer a aplicação mais frequente de

azoto e zinco, quer no solo, quer nas folhas.

Quanto às árvores crescem melhor com temperaturas altas, apesar de precisarem

de um certo número de horas de frio para a uniformização das flores e para a produção de

folhas durante a Primavera. As amendoeiras são suscetíveis às temperaturas extremas,

que podem causar queimaduras nas flores e nas amêndoas jovens na Primavera. Para além

disso as temperaturas também influenciam a polinização, uma vez que as abelhas não

10

estão ativas com temperaturas abaixo dos 13°C, com chuvas ou quando a velocidade do

vento é superior a 19,3 km/h (Flint, 2002).

2.2. Importância económica e comércio da amêndoa a nível Mundial

A crescente procura pelos frutos secos, onde se inclui a amêndoa, caracteriza-se

sobretudo pelos novos estilos de vida e pela crescente procura de uma alimentação

saudável. Este aumento vai causar um impacto significativo na melhoria das condições

de produção, de colheita, na tecnologia de pós-colheita e embalagem e no marketing e

logística. Como tal, é de esperar um aumento da produção nos próximos anos, tendo como

referência, que a melhoria de rentabilidade da cultura na década passada resultou num

aumento da superfície mundial plantada (Valenciano, et al., 2016).

Segundo Valenciano et al. (2016), em 2014, a exportação mundial de amêndoa

sem casca foi dominada pelos Estados Unidos da América (68,5%), seguido de longe pela

Espanha (10,3%) e pela Austrália (6%), na amêndoa com casca os Estados Unidos da

América voltaram a apresentar-se com os líderes ao nível da exportação com 62,2%,

seguidos pelo Benim (14,7%), Hong Kong (10,9%) e pela Austrália (6,8%) (Quadro 2).

11

Quadro 2 - Principais países exportadores de amêndoa (sem e com casca) em toneladas

(Fonte: Adaptado de http://www.cif-businessintelligence.com/).

Nos últimos anos registaram-se poucas alterações na estrutura comercial

internacional, aparecendo sempre os Estados Unidos da América como líder mundial e

sempre com larga margem, com a Espanha como segundo principal exportador. Do total

do comércio mundial, 71% correspondeu a amêndoas sem casca (654.814 ton) e 29% a

amêndoas com casca (270.151 ton), sendo que em conjunto ambos os produtos

representaram 46% da produção anual. Importa ainda referir que alguns países que se

apresentam como exportadores são na realidade brokers comerciais, ou seja, importam

para exportar, como é o caso da Alemanha, de Hong Kong, da Holanda e da Bélgica

(Valenciano, et al., 2016).

Os principais países vinculados com o comércio internacional entre 2010/11 e

2015/16 (Quadro 3), representam 54% do volume mundial de produção e 70% do

comércio mundial, segundo os dados da FAOSTAT (Food and Agriculture Organization

of the United Nations Statistic Division). Os países que apresentaram um maior

crescimento nos últimos anos, no que à produção diz respeito foram os Estados Unidos

da América, a Austrália, o Chile e a China. A União Europeia é o principal consumidor

de amêndoa, seguida dos Estados Unidos da América, da Índia, da China e dos Emirados

Países 2014 Participação Países 2014 Participação

EUA 448.367 68,50% EUA 168.058 62,20%

Espanha 67.254 10,30% Benim 39.662 14,70%

Austrália 19.535 6,00% Hong Kong 29.460 10,90%

Alemanha 14.242 2,20% Austrália 18.275 6,80%

Hong Kong 13.286 2,00% Gambia 2.339 0,90%

Holanda 13.179 2,00% Afeganistão 2.284 0,80%

Itália 9.866 1,50% Espanha 1.513 0,60%

Bélgica 8.040 1,20% Tunísia 1.432 0,50%

Turquia 6.233 1,00% Bélgica 1.394 0,50%

Reino Unido 4.429 0,70% Síria 1.292 0,50%

Chile 3.969 0,60% Alemanha 751 0,30%

Moçambique 3.112 0,50% Portugal 710 0,30%

Afeganistão 2.484 0,40% Itália 465 0,20%

Irão 1.908 0,30% Líbano 349 0,10%

Benim 890 0,10% Irão 347 0,10%

Outros 18.020 2,80% Outros 1.820 0,70%

Amêndoa sem casca Amêndoa com casca

12

Árabes Unidos (Quadro 4) (Valenciano, et al., 2016).

Quadro 3 - Principais países/regiões produtores de amêndoa entre 2010/11 e 2015/16, em

toneladas (Fonte: Adaptado de http://www.cif-businessintelligence.com/).

Quadro 4 - Principais países/regiões consumidores de amêndoa entre 2010/11 e 2015/16, em

toneladas (Fonte: Adaptado de http://www.cif-businessintelligence.com/).

2.3. A cultura da amendoeira no mundo e em Portugal

Na família dos frutos secos, existem diversas culturas que começam a ganhar cada

vez mais destaque a nível mundial, devido à sua aptidão para fazerem parte da

alimentação moderna, e devido ao facto de serem cada vez mais procuradas pela

população mundial, como é o caso da amendoeira (Kester et al., 1991).

Região/País 2010/11 2011/12 2012/13 2013/14 2014/15 2015/16

EUA 743,891 920,793 857,29 911,72 848,22 816,47

União Europeia 93 83,1 83 58,8 79,7 85

Austrália 37,6 49,6 73,4 65,1 75 82

Turquia 14 16 17 18 13 14

Chile 9 9,1 8,3 3,9 11 12

China 2,5 4 5 7 9,5 10

Índia 1,2 1,1 1,2 1,1 1,2 1,1

Região/País 2010/11 2011/12 2012/13 2013/14 2014/15 2015/16

União Europeia 305,8 300,1 299,3 323,8 308,3 310

EUA 239,156 275,201 302,234 305,624 275,059 290

Índia 54,2 47,1 60,7 53,4 61,5 80,2

China 48,2 96,7 93,1 67,7 57,8 75

Emiratos Árabes Unidos 42,6 55,3 43,6 54,9 61,3 65

Canadá 27,6 28,4 31,2 33,7 35 36

Turquia 27,6 36,6 29,3 33,2 30,8 29

Japão 14,2 20,3 21,3 25,8 25,9 27

Australia 16,3 23,4 24,7 20,8 21 23

Hong Kong 20,3 11,7 12,9 15,2 17,4 19

México 7,9 7,5 10 9,4 11,7 11

Rússia 4,3 5 4,8 5,8 5,2 6

Chile 2,7 3,4 5,1 4,3 4 5

Taiwan 10,8 10,8 0 8,3 5,2 4,5

Malásia 2,8 2,9 2,8 3,5 2,7 3

Argélia 6,6 7,5 6,7 4,3 2,7 2,5

13

Ainda segundo os mesmos autores, a amendoeira é cultivada como semente

comestível desde a antiguidade. Foi disseminada a partir do seu centro de origem, a Ásia

Central, para todas as civilizações antigas, Ásia, Europa e África do Norte. A amendoeira

foi inicialmente introduzida na Califórnia durante o período das missões espanholas nesta

região. Entre 1850 a 1900, foi introduzida na região oeste da Austrália, na África do Sul

e nas zonas da América do Sul (particularmente o Chile e a Argentina) com climas

semelhantes à Califórnia. Durante os anos 60 a região do Mediterrâneo, particularmente

Itália, Espanha, França e Portugal foram os principais fornecedores de amêndoa para os

países do Norte da Europa e para algumas regiões do Estado Unidos da América.

Abdallah et al. (1998) referem o facto da amêndoa ter uma quantidade de ácidos

gordos saturados muito baixa, uma quantidade de ácidos gordos monoinsaturados alta e

uma quantidade de ácidos gordos polinsaturados alta, o que faz da amêndoa um fruto seco

com uma alta concentração de energia, fornecendo uma elevada quantidade de gordura,

proteína e fibra. Com este conjunto de propriedades nutricionais, juntamente com a

importância económica que lhe é reconhecida fez com que o cultivo de amendoeiras

aumentasse nos últimos a nível mundial, tanto na área plantada como nas toneladas

produzidas (Figura 1), segundo os dados da FAOSTAT.

Em grande parte, devido à influência desta cultura na Califórnia, os Estados

Unidos da América são o principal país produtor de amêndoas no mundo com uma

enorme distância para o resto dos países produtores (Figura 2). Segundo Sumner, et al.

(2014) na Califórnia a cultura da amêndoa é tão importante que se trata da cultura agrícola

mais importante e mais dinâmica, e é uma enorme contribuição para a economia da

Figura 1 - Produção total da quantidade de amêndoa com casca a nível mundial (Fonte:

FAOSTAT, 2018).

14

região, sendo responsável por 25% das exportações relacionadas com a agricultura.

Em relação à produção a nível continental (Figura 3), a América é o continente

com mais de metade da produção mundial, devido à ação dos Estados Unidos da América,

na América Central e do Chile e da Argentina na América do Sul, seguida do seu centro

de origem, a Ásia, com o Irão e a Síria a apresentarem-se com os principais produtores, e

por fim da Europa, que tem como principal produtor a Espanha, seguida da Itália.

Segundo os dados da FAOSTAT (Figura 4) e do Instituto Nacional de Estatística

– Estatísticas Agrícolas 2016 (Figuras 5 e 6), no caso específico de Portugal, o número

de hectares plantados tem vindo a aumentar nos últimos anos, tal como a produção. No

ano de 2016 registou-se uma diminuição de 13,6% face ao que havia sido registado no

ano anterior, isto deve-se ao facto de nesse ano ter havido um forte ataque de antracnose

e das condições ambientais terem sido bastante desfavoráveis. Acresce a estes fatores a

condição da maioria dos amendoais, bastante decrépitos e raramente sujeitos a

Figura 2 - Top 10 de países na produção de amêndoa com casca (Fonte: FAOSTAT, 2018).

Figura 3 - Produção de amêndoa com casca por continente (Fonte: FAOSTAT, 2018).

15

intervenções culturais. No entanto, é previsível que esta situação venha a ser mitigada a

curto prazo com a entrada em produção de muitos pomares modernos instalados nos

últimos anos, em particular no Alentejo (Estatísticas Agrícolas, 2016).

Dentro de Portugal em 2016, a região com maior importância e aquela que maior

produtividade apresenta é o Norte, seguido pelo Alentejo e pelo Algarve. O Alentejo

Figura 4 - Produção total da quantidade de amêndoa com casca em Portugal (Fonte:

FAOSTAT, 2018).

Figura 5 - Superfície e produção de amêndoa em Portugal (Adaptado de Estatísticas

Agrícolas, 2016).

Figura 6 - Produção de amêndoa em Portugal de 2012 a 2016 e média de produção durante

o mesmo período (Fonte: INE I.P., Estatística de Produção Vegetal).

16

apesar de ter menos hectares plantados que o Algarve apresentou melhores produções,

isto deveu-se sobretudo ao excelente clima da região para a produção de amêndoa, o que

resultou em maiores produções com um menor número de hectares plantados (Figura 7).

Figura 7 - Superfície plantada e produções para amêndoa nas diferentes regiões do

país, para o ano de 2016 (Fonte: Adaptado de Estatísticas Agrícolas, 2016).

17

2.4. Principais doenças das Prunóideas

Segundo Agrios (2005), uma planta está doente quando não é capaz de produzir

ao máximo que lhe é permitido pelo seu potencial genético. Na maioria dos casos, esta

situação pode ocorrer quando a planta é infetada por um agente biótico ou apresenta um

stress abiótico. Assim sendo, e para o primeiro caso, para uma doença biótica ocorrer, é

que necessário que, planta e agente patogénico, entrem em contacto e interajam e que as

condições climatéricas adequadas se manifestem. A conjugação destes três fatores

originam o Triângulo da doença (Figura 8).

2.4.1. As principais doenças da amendoeira

2.4.1.1. CRIVADO

i. Sintomas

Segundo Bubici et al., (2010) as espécies causadoras de crivado aparecem

principalmente nas folhas, sendo que por vezes também podem aparecer nos frutos, e com

menor expressão nos ramos (no caso do pessegueiro) e nos botões florais dormentes (no

caso da amendoeira). Nas folhas, começam por aparecer pontuações vermelhas circulares,

com uma margem clorótica ao seu redor, e um diâmetro de 1 a 2 mm. Estas pontuações

Figura 8 - Triângulo da doença com os três fatores que em conjuntos provocam o

aparecimento da doença (Fonte: Agrios, 2005).

18

vão-se desenvolver em manchas circulares com o centro necrótico e cor-de-laranja

acastanhada, com contorno violáceo e 3 mm de diâmetro. Por fim, o centro de necrose

destaca-se do resto da folha saudável, dando à folha o aspeto tradicional do crivado

(Figura 9A). As folhas infetadas caem das árvores num curto período de tempo. Nos

ramos os sintomas começam com o aparecimento de pequenas manchas pretas, que

aumentam depois de tamanho, essas manchas tem um centro pálido e afundado e rachas

longitudinais na periderme do tronco, das quais saem as gomoses. Manchas semelhantes

podem aparecer também nos frutos (Figura 9B) que podem também mumificar, nos

botões dormentes e cálices florais.

ii. Agente causal e ciclo da doença

O crivado é uma doença causada pelo fungo Stigmina carpophila (sin.

Wilsonomyces carpophilus) (Bubici et al., 2010; Yousefi et al., 2014 e Mitre Jr. et al.,

2015).

As estruturas do fungo hibernam principalmente nos gomos dormentes e nas

lesões dos ramos, no entanto também se podem encontrar nas folhas caídas do ano

anterior. Com humidade elevada (chuvas abundantes na Primavera) e temperaturas

amenas (acima de 14 - 15ºC) os esporos são produzidos abundantemente. A temperatura

ótima para o desenvolvimento de micélio é de 19°C. Na presença de humidade elevada,

os esporos podem germinar até com temperaturas muito baixas, entre os 2 e os 4ºC. Os

ramos e gomos podem ser infetados durante o tempo chuvoso, ou em qualquer momento

desde o Outono até à Primavera. As infeções nos ramos requerem pelo menos 24 h de

Figura 9 - Folhas (A) e frutos (B) de prunóideas com sintomas de crivado (A - Fonte:

https://www.flickr.com/photos/hermesalmond/5355220118; B – Fonte:

https://www.flickr.com/photos/hermesalmond/5354603207).

A B

https://www.flickr.com/photos/hermesalmond/5355220118

19

humidade contínua e podem ocorrer com temperaturas baixas. Com o aumento da

temperatura no Verão, há uma longa paragem do ciclo da doença, mas os esporos podem

sobreviver por vários meses durante o tempo seco. Pomares mal arejados, resultantes de

espaço insuficiente entre as árvores ou por poda mal conduzida, são muito mais

suscetíveis ao aparecimento da doença (Shaw et al., 1990; Grove 2002 e Bubici et al.,

2010).

Durante a Primavera, as primeiras chuvas promovem as condições necessárias

para ocorrer a infeção primária nas folhas e flores. A infeção em folhas jovens e nos

pecíolos pode causar a queda das folhas, enquanto a infeções mais severas podem levar à

morte do lançamento terminal. As infeções secundárias podem ocorrer ao longo do

crescimento da árvore, como resultado de chuvas adicionais ou da rega por aspersão.

Contudo, as infeções dos frutos durante o Verão não resultam na queda do fruto ou na

redução do seu tamanho. Durante a época das chuvas, o S. carpophila infeta e forma

lesões nas folhas. Os conídios resultantes dessas lesões podem passar o Inverno na árvore,

em botões saudáveis, e funcionar com inóculo primário para as infeções da Primavera

(Figura 10) (Shaw et al., 1990).

Figura 10 - Ciclo da doença de Crivado causado por Stigmina carpophila (Adaptado de

http://mevazor.uz/en/diseases/type/3/item/2/).

20

iii. Controlo da doença

Segundo Agrios (2005) uma poda sanitária eficaz pode remover os ramos e gomos

afetados, mas muitas vezes é impraticável. Manter o pomar bem arejado, por meio de

uma poda adequada é uma boa prática cultural. Para além do uso dos fungicidas

adequados.

2.4.1.2. MONILIOSE

i. Sintomas

Segundo Agrios (2005) e Cimen et al. (2007) os primeiros sintomas aparecem nas

flores, e podem aparecem na flor inteira e no pedúnculo. Com o clima húmido os órgãos

infetados, ficam cobertos por conídios de cor castanha-acinzentada, sendo que acabam

depois por murchar e secar, estes órgãos apodrecidos ficam agarrados à árvore durante

algum tempo. Na base das flores infetadas crescem pequenos cancros que se vão

desenvolvendo, e acabam por causar por vezes a morte do ramo (Figura 11A). Com a

presença de humidade elevada, aparecem também gomoses e tufos de conídios com uma

coloração acinzentada na casca das árvores.

Os sintomas nos frutos aparecem quando o fruto começa a atingir a maturação, e

revelam-se através de pontuações castanhas e circulares que se espalham rapidamente em

todas as direções. Nas áreas infetadas da superfície do fruto começam depois a aparecer

aglomerados de conídios cinzentos. Uma grande ou várias pequenas áreas infetadas

começam a estar presentes no fruto, que finalmente fica completamente apodrecido e seca

(Figura 11B), ficando mumificado no chão ou na árvore (Figura 11C). Por vezes,

pequenos cancros também se desenvolvem em ramos ou em ramos com frutos infetados

(Agrios, 2005).

21


As espécies responsáveis pela moniliose são a Monilinia fructicola, a Monilinia

laxa e a Monilinia fructigena (Byrde et al., 1977 e Agrios 2005).

Byrde et al., (1977) refere que a amendoeira é um dos principais hospedeiros para

as três espécies responsáveis pela moniliose.

O micélio do fungo produz cadeias elípticas de conídios, para além disso produz

microconídios, que apesar de não germinarem estão envolvidos na fertilização do fungo

(Agrios, 2005).

O agente patogénico passa o período do Inverno em frutos mumificados na árvore

e em cancros presente em regiões afetadas dos ramos, ou em estruturas mumificadas no

solo. Na Primavera, o micélio que se encontra presente nos frutos mumificados na árvore

e nos cancros produz novos conídios, enquanto os frutos mumificados no solo produzem

apotécios, que irão formar ascósporos. Tanto os conídios como os ascósporos vão iniciar

infeções nas flores, a sua disseminação é feita através do ar, de insetos ou da água da

chuva (Byrde et al., 1977 e Agrios 2005).

O micélio, especialmente em condições de humidade elevada e com uma

temperatura entre os 16°C e os 18°C, produz um elevado número de conídios nas partes

afetadas da flor, que são depois libertados. Entretanto, o micélio vai avançando nas

pétalas da flor, e pelos ramos onde se começam a formar, com uma cor vermelho-

B A

C

Figura 11 - Botões florais (A), frutos (B) e frutos mumificados (C) afetados por

Moniliose (A e C - Fonte: Agrios, 2005; B - Fonte:

https://plantvillage.psu.edu/topics/almond/infos).

22

acastanhada e em forma de escudo, os cancros. Esses cancros vão se desenvolver à volta

do ramo, acabando por levar à sua morte. A superfície desses cancros vai ficar

rapidamente coberta de conídios, que vão servir de inóculo para a infeção dos frutos

quando estes começarem a amadurecer (Agrios, 2005).

Os conídios normalmente entram no fruto através de feridas feitas por insetos,

ramos ou pelo granizo, mas em alguns casos entram pelos estomas ou diretamente pela

cutícula. Os fungos começam por crescer de forma intercelular e produzem uma enzima

que vai causar maceração e vai escurecer os tecidos infetados, para além disto o fungo

vai também dar origem à produção de mais conídios no fruto. Em poucos dias o fruto

pode ficar completamente infetado e apresentar podridão, ficando pendurado na árvore

ou caído no solo. Os frutos que caem no solo são normalmente desintegrados por ação de

bactérias ou de fungos saprófitas, já os frutos que ficam nas árvores acabam por secar e

mumificar, estes, constituem um dos principais reservatórios da doença (Figura 12)

(Byrde et al., 1977 e Agrios 2005).

A infeção dos frutos pode também acontecer após a colheita, em armazenamento

ou durante o transporte. Os frutos infetados ficam necrosados após a colheita, e o micélio

formado esporula e pode atacar diretamente frutos saudáveis que estejam em contato com

os frutos infetados (Agrios, 2005).

Figura 12 - Ciclo da doença de Moniliose causado por Monilinia fructicola, Monilinia laxa

ou Monilinia fructigena (Adaptado de Agrios, 2005).

23


Segundo Agrios (2005) a melhor forma de controlar a moniliose, é na fase de

floração, para tal o que se deve fazer é aplicar duas a quatro vezes um fungicida, de

preferência cúprico, eficaz desde o momento em que os botões florais ficam cor-de-rosa

até à altura da queda das pétalas.

Os ramos que tenham flores infetadas ou cancros, devem ser removidos o mais

cedo possível, de modo a reduzir o inóculo disponível para infeções de frutos ou para

reduzir as zonas onde os conídios possam passar o Inverno (Batra, 1991 e Agrios, 2005).

Os fungicidas devem ser aplicados nas árvores umas semanas antes da colheita, e

as aplicações devem continuar semanalmente ou de duas em duas semanas até à data da

colheita. Uma forma preventiva de controlar a doença passa por controlar os insetos, visto

que muitas das infeções que acontecem em frutos maduros e em quase todos os frutos

imaturos, são devido às feridas feitas por insetos. Para prevenir infeções na colheita e

durante o armazenamento, os frutos devem ser colhidos e manuseados com cuidado, de

modo a evitar feridas que possam facilitar a entrada do fungo. Todas os frutos já

contaminados devem ser descartados. O aparecimento de moniliose em pós-colheita pode

ser reduzida mergulhando o fruto numa solução fungicida após o armazenamento e

através do arrefecimento dos frutos, antes da refrigeração a uma temperatura de 0°C a

3°C (Agrios, 2005).

2.4.1.3. LEPRA

i. Sintomas

Segundo Giosuè et al., (2000) e Agrios (2005) as folhas das árvores afetadas ficam

distorcidas, engrossam e ficam curvadas para baixo e para dentro (Figura 13 A e B). As

folhas afetadas começam por ficar com uma coloração avermelhada ou arroxeada, mas

mais tarde, quando o fungo começa a produzir esporos nas áreas afetadas, estas ficam

com uma coloração amarela-avermelhada, seguida de amarela e castanha, e por fim

acabam por cair. Apesar de ser com menor frequência, as flores, os frutos jovens e os

ramos do ano também podem ser afetados. As flores e os frutos infetados acabam por cair

cedo no ciclo de produção, já os ramos começam a atrofiar e acabam por morrer durante

o Verão.

24

A incidência da doença depende da suscetibilidade da espécie, da densidade do

inóculo presente no pomar e das condições meteorológicas. (Giosuè et al., 2000).


A lepra é causa pelo fungo Taphrina deformans, e é uma doença que está

disseminada por todo o mundo, afetando o potencial de crescimento e a longevidade das

árvores, e tendo como principal hospedeiro os pomares de pessegueiros, no entanto afeta

também com grande severidade a amendoeira (Giosuè et al., 2000; Tavares et al., 2004;

Agrios 2005).

Agrios (2005) afirma que as células de micélio do fungo têm dois núcleos, podem

transformar-se em ascos, que normalmente contém 8 ascósporos com um núcleo. As

estruturas assexuadas do fungo são os conídios.

Mix (1949), Syrop et al., (1976) e Agrios (2005) afirmam que aparentemente o

fungo passa o Inverno na árvore, sob a forma de ascósporos ou de conídios com uma

parede celular espessa. Na Primavera, esses esporos são disseminados pela água de rega

ou por ação do vento para os tecidos mais jovens, onde vão germinar e penetrar, através

das cutículas ou dos estomas, nas folhas em desenvolvimento ou noutros órgãos. O

micélio que cresce entre as células e invade os tecidos de forma severa, vai causar o

alargamento e a divisão das células, que vai provocar o alargamento e distorção dos

órgãos da planta. Mais tarde, numerosas hifas crescem entre a cutícula e a epiderme.

Nessa zona as células separam-se e cada uma delas produz um asco, esse asco vai alargar

e exercer pressão na cutícula do hospedeiro, e eventualmente rompê-la, de modo a criar

A B

Figura 13 - Folhas (A e B) e frutos (A) afetados por Lepra (Fonte:

https://www.shutterstock.com/search/taphrina).

25

uma camada compacta de ascos. Os ascósporos são libertados, e com a ação do vento vão

para novos tecidos formando posteriormente os conídios (Figura 14).

As condições ambientais que favorecem a doença na Primavera não são

completamente conhecidas, contudo largos períodos de chuva podem favorecer o

aparecimento de surtos graves num pomar. O fungo pode começar a crescer um teor de

humidade relativa muito alto, cerca de 95%, e com temperaturas baixas, que vão desde o

6°C até aos 26°C, tendo, no entanto, uma temperatura ótima de crescimento entre os 18°C

e os 20°C. O risco de aparecimento de lepra aumenta quando as condições ideais se

prolongam durante o desenvolvimento dos botões florais. Mais tarde no ciclo as

condições climáticas vão-se tornando cada vez menos favoráveis ao aparecimento da

doença, as temperaturas altas inibem completamente o aparecimento da doença. A

suscetibilidade do hospedeiro é menor com o avançar da idade das folhas, sendo que

quando estas se desenvolvem completamente a doença deixa de apresentar um risco

económico, embora não seja completamente removida (Giosuè et al., 2000).

Figura 14 - Ciclo da doença de Lepra causado por Taphrina deformans (Adaptado de Agrios,

2005).

26


Segundo Giosuè et al., (2000) a lepra é controlada principalmente com recurso à

aplicação de fungicidas, no entanto deve também ter -se em conta as adequadas práticas

culturais e sanitárias.

A aplicação de fungicidas é feita preferencialmente no final do Outono, depois da

queda das folhas ou no início da Primavera antes dos botões foliares incharem (Agrios,

2005).

2.4.1.4. OÍDIO

i. Sintomas

Os sintomas que indicam a presença desta doença começam com o aparecimento

de pequenas lesões superficiais, em forma de estrela, evoluindo depois para uma

coloração amarela a castanha. A página superior das folhas e a epiderme dos frutos torna-

se pulverulenta devido ao crescimento do micélio de cor branca (Figura 15 A e B). Com

a evolução da doença, aparecem pontuações pretas, que correspondem às cleistotecas que

se podem apresentar isoladamente ou em grupos. Os sintomas descritos apesar de serem

mais comuns na página superior das folhas, podem também ser visíveis na página inferior,

nos estádios de desenvolvimento mais tardios da doença e em outros órgãos da planta

(Agrios, 2005).

A B

Figura 15 - Frutos (A) e folhas (B) com sintomas de Oídio (Powdery Mildew) (Fonte:

https://agrobaseapp.com/united-states/disease/powdery-mildew-of-almonds).

27

ii. Agente causal e ciclo de vida

Penrose (1990) refere que o oídio da amendoeira é causado pelo fungo

Podosphaera tridactyla, este fungo produz micélio branco que cresce na superfície dos

tecidos das plantas, enviando haustórios para as células da epiderme. O micélio vai formar

hifas reprodutivas na superfície, algumas das quais se vão desenvolver e formar pequenos

conidióforos eretos. Na ponta de cada conidióforo são produzidos 5 a 10 conídios em

forma de ovo. Com a chegada das temperaturas mais baixas, a produção de conídios

termina e forma-se a estrutura de resistência, a cleistoteca. Esta é constituída por várias

hifas resultantes das células do cleistotécio. Os ascósporos, formados dentro de ascos, no

interior da cleistoteca, continuam a desenvolver-se durante o Outono, e na Primavera eles

estão maduros e prontos para a disseminação. Na Primavera, a cleistoteca absorve água e

acaba por rebentar. A ponta de cada asco em cada cleistotécio sobressai, rebenta e liberta

8 ascósporos maduros.

Os tecidos epidérmicos jovens, quando estão na presença de inóculo, ascósporos

ou conídios, vão ser infetados pela germinação destes, e as suas células são exploradas

pela emissão de haustórios. Através deles o fungo obtém nutrientes da planta enviando-

os para os seus constituintes. Cada conidióforo produz cadeias de conídios e estes são

transportados pela ação do vento. Quando a temperatura e a humidade relativa estão

suficientemente altas, os esporos germinam e infetam novos tecidos, provocando uma

infeção secundária. A fotossíntese nas áreas afetadas é muito reduzida e a infeção dos

tecidos jovens provoca crescimento irregular das células afetadas e das circundantes,

resultando em áreas ligeiramente distorcidas e possivelmente na morte da área afetada se

a infeção for severa (Agrios, 2005).

O desenvolvimento da doença é favorecido por uma humidade relativa elevada e

por temperatura moderadas, entre os 15°C e os 20°C (Penrose, 1990).


O oídio é controlado recorrendo à utilização de produtos à base de enxofre ou

através de aplicações de fungicidas de síntese química preventivos ou curativos, sendo

que em Portugal ainda não existem produtos homologados para a cultura da amendoeira.

Sob a maior parte das condições, uma aplicação semanal é suficiente, mas quando existe

um rápido desenvolvimento da doença ou chuvas frequentes podem ser necessárias mais

28

aplicações. Alguns fungos foram usados experimentalmente como parasitas ou

antagonistas do oídio, contudo o controlo biológico ainda não foi desenvolvido o

suficiente, apesar de ser promissor (Agrios, 2005).

2.4.1.5. FUSARIOSE

i. Sintomas

O primeiro sintoma a aparecer é uma ligeira descoloração nas nervuras das folhas

mais exteriores e jovens. Posteriormente as folhas mais velhas começam a apresentar

epinastia causada pela queda dos pecíolos. Contudo, é mais comum nas plantas mais

velhas, que apresentam descoloração das nervuras e epinastia nas folhas, estes sintomas

são seguidos por um crescimento atrasado das plantas, pelo amarelecimento das folhas,

formação ocasional de raízes adventícias, murchidão nas folhas, desfoliação, necrose na

margem das folhas restantes, e finalmente a morte da planta. Os frutos também podem

ser infetados, mas acabam por cair antes da infeção ser detetada. As raízes são infetadas,

após um período inicial de crescimento retardado, as pequenas raízes laterais acabam por

apodrecer (Agrios, 2005).

Marek et al., (2013), afirma que o sintoma predominante são necroses na casca

interior e no cambio (Figura 16). Os sintomas muitas vezes ocorrem na zona do enxerto,

com as áreas necróticas a aparecerem no enxerto, sendo que algumas vezes também

aparecem no porta-enxerto. Na ausência de sintomas externos, as necroses internas não

são evidentes em muitas árvores, cujo o tronco tenha uma coloração castanha escura,

Figura 16 - Aparecimento de esporos em zona com necrose (Fonte: Marek et al., 2013).

29

contudo essas lesões são mais visíveis em troncos de cor castanha clara ou verde.


As espécies de fungos descritas como responsáveis pela fusariose da amendoeira

são o Fusarium avenaceum e o Fusarium acuminatum (Marek et al., 2013). Afifi (1977)

refere Fusarium solani também como espécie responsável pela fusariose da amendoeira.

Agrios (2005) afirma que a maioria das espécies de Fusarium podem ser responsáveis

pela fusariose e têm um ciclo da doença e desenvolvimento similares.

Quanto a características deste agente patogénico, Agrios (2005) refere que o

micélio é incolor ao início, mas com a idade torna-se creme, amarelo pálido, rosa pálido

ou arroxeado, consoante as espécies. O fungo produz três tipos de esporos assexuados, os

microconídios, os macroconídios e os clamidósporos. Os microconídios têm uma ou duas

células, são os esporos mais frequentemente e abundantemente produzidos em todas as

condições, mesmo dentro dos vasos de plantas infetadas. Os macroconídios têm três a

cinco células e aparecem em grupos na superfície das plantas mortas pelo agente

patogénico. Os clamídosporos têm uma ou duas células, parede espessa e são

arredondados, são produzidos dentro ou na parte terminal do micélio mais evoluido ou

nos macroconídios. Os três tipos de esporos são produzidos no solo, embora somente os

clamidósporos possam sobreviver no solo por muito tempo.

Este fungo sobrevive no solo, mas entre culturas também pode sobreviver em

restos de plantas afetadas sob a forma de micélio ou dos três tipos de esporos, mas

principalmente sob a forma de clamidósporos. Espalha-se em distâncias curtas através da

água e equipamentos contaminados e em distâncias longas através de plantas

transplantadas com a infeção e no solo que essas plantas levem com elas. Normalmente,

quando uma área fica infetada com Fusarium spp., permanece assim durante tempo

indeterminado (Agrios, 2005). Quando as plantas saudáveis crescem em solo

contaminado, o tubo germinativo dos esporos ou o micélio, vai penetrar diretamente nas

extremidades das raízes ou através de feridas nelas existentes. O micélio avança

intercelularmente pelo córtex da raiz, atingindo então os vasos do xilema. O micélio fica

depois exclusivamente nos vasos e circula através deles, principalmente de baixo para

cima e em direção à corola da planta. Nos vasos xilémicos, o micélio vai produzir

microconidios, que vão ser separados e levados para cima nos vasos. O micélio também

avança lateralmente, em direção aos vasos adjacentes. A combinação destes processos

30

chama-se entupimento dos vasos, e é responsável pelo ‘stress’ hídrico na planta infetada.

Quando a folha transpira mais água do aquela que as raízes e o caule podem repor, os

estomas vão fechar e a folha vai murchar e morrer, levando assim à morte do resto da

planta. O fungo vai invadir os tecidos da planta morta e esporular, os esporos resultantes

vão ser disseminados para novas plantas através do ar ou da água (Figura 17) (Agrios,

2005).


Segundo Agrios (2005), a fusariose é uma doença difícil de controlar, sem recorrer

a cultivares resistentes ou tolerantes, contudo, existem algumas opções que, embora não

sejam totalmente eficazes sozinhas, podem ajudar a diminuir a dispersão da doença, tais

como; a utilização de plântulas e sementes livres de doenças; plantas com resistência

genética; solarização do solo; realização de mobilizações no solo; rotação com culturas

não-suscetiveis; boa drenagem no solo; fertilização azotada correta.

2.4.1.6. DOENÇAS DO LENHO

i. Sintomas

Figura 17 - Ciclo da doença de Fusariose causado por Fusarium avenaceum, Fusarium

acuminatum e Fusarium solani (Adaptado de Agrios, 2005).

31

Os fungos do lenho estão distribuídos mundialmente, e afetam uma ampla gama

de plantas monocotiledóneas, dicotiledóneas e gimnospérmicas (Gure et al., 2005).

Segundo Sessa et al. 2016 as doenças do lenho podem apresentar sintomas severos

em prunóideas, as árvores afetadas apresentam sintomas como cancros nos ramos, galhos

e no tronco principal, cancro na raiz, declínio e em alguns casos a morte completa da

árvore. Pode afetar os troncos, os ramos e também os frutos. O córtex externo do cancro

fica cor-de-laranja ou castanho e apresenta uma textura papirácea.

Os sintomas da doença estão associados com lenticelas, e incluem lesões

necróticas na casca da árvore e formação de goma no tronco e nos limbos. As gomoses

ocorrem frequentemente em pessegueiros, damasqueiros, ameixeiras, cerejeiras e

amendoeiras, e reduzem o crescimento e a produtividade da árvore, especialmente em

cultivares suscetíveis (Wang et al., 2011). A doença é caraterizada por depósitos de gomas

que foi exsudada pela casca dos troncos, limbos e ramos (Weaver, 1974) (Figura 18).

Outros sintomas que se verificam incluem lesões necróticas profundas (1 a 2 centímetros

de diâmetro) na casca em volta das lenticelas e gomoses nas lenticelas doentes. Em ramos

jovens as lenticelas infetadas tornam-se inchadas, mas a gomose geralmente não acontece

(Weaver, 1979).

ii. Agentes Causais e Ciclo da Doença

Dois dos fungos responsáveis pelas doenças do lenho no amendoal são

Botryosphaeria spp. e Cylindrocarpon spp. (Agrios, 2005).

Figura 18 - Sintomas de doenças do lenho em amendoeiras (Fonte:

https://flotrouillas.faculty.ucdavis.edu/research-projects/).

32

A Botryosphaeria produz conídios em picnídios e ascósporos nas peritecas, nos

cancros, nos frutos mumificados e na casca da madeira morta. O fungo passa o Inverno

sob a forma de micélio, ascósporos e conídios na árvore. Na Primavera e durante a época

de crescimento, os conídios e os ascósporos são libertados durante as chuvas, sendo

depois levados para as folhas, para os frutos e para a madeira onde iniciam novas infeções

(Agrios, 2005).

O Cylindrocarpon por vezes produz microconídios unicelulares, e de forma mais

comum macroconídios cilíndricos com duas a quatro células. Os microconídios tem uma

cor branca, amarelada ou laranja e são produzidos na epiderme das zonas infectadas

(Agrios, 2005).

Segundo Agrios (2005) os conídios são produzidos durante o Verão e no início do

Outono. A sua disseminação é feita através da chuva, do vento, dos insetos e do material

de poda. As peritecas aparecem no final do Verão e no Outono nos cancros formados pela

doença.

iii. Controlo

Agrios (2005), diz que a melhor maneira de efetuar o controlo das doenças do

lenho passa por remover as zonas infetadas através da poda e queimar todas as zonas

removidas e aplicar os fungicidas apropriados na árvore.

2.5. Fungos Endofíticos

A simbiose pode ser definida como uma associação a longo prazo entre dois

organismos de espécies diferentes, seja essa relação benéfica para ambos os indivíduos

envolvidos ou não. A maioria dos organismos vivos tem relações simbióticas com

microrganismos, sendo um exemplo destas relações o que acontece entre fungos

endofíticos e plantas (Rodriguez et al., 2008).

Os fungos endofíticos são microrganismos que residem, durante todo, ou pelo

menos um período do seu ciclo de vida no interior de uma planta hospedeira e que têm a

capacidade de ocupar e colonizar os tecidos saudáveis e órgãos destas, e desenvolvem-se

tanto inter com intracelularmente, sem causar nenhum sintoma negativo visível,

estabelecendo assim uma interação simbiótica com a planta. Este fenómeno acontece

praticamente em todas as plantas estudadas até então. Os endofíticos habitam, de um

33

modo geral, as partes aéreas das plantas, como folhas e caules (Rodriguez et al., 2008;

Pimenta et al., 2012; Patel et al., 2013 e Torres et al., 2015).

Os endofíticos podem ser transmitidos de geração em geração, verticalmente, do

parente para a descendência, ou horizontalmente, de um individuo para ou outro individuo

não relacionado. Os fungos endofíticos transmitidos verticalmente são assexuados, e

transmitidos através de uma hifa que penetra nas sementes do hospedeiro. Como a sua

reprodução está ligada com o hospedeiro, estes endofíticos são muitas vezes mutualistas.

Por outro lado, se forem transmitidos horizontalmente, os fungos endofíticos são

sexuados e transmitidos via esporos, que são disseminados pelo ar ou por insetos vetores.

(Selosse et al., 2004).

Apesar de na maior parte das vezes a relação simbiótica entre o fungo endofítico

e a planta ser mutualista, esta relação pode por vezes tornar-se parasita, originando assim

doença na planta. Esta interação flexível é determinada pelas necessidades nutricionais

do endófito, pela envolvente ambiental, bem como por pequenas diferenças na expressão

genética do fungo. Quando o equilíbrio estabelecido na interação for perturbado, os

fungos endofíticos podem tornar-se fungos patogénicos e provocar sintomas de doença

na planta ou levar à exclusão do fungo pelos mecanismos de defesa da planta (Figura 19)

(Schulz et al., 2006).

Figura 19 - Hipótese explicativa para o estabelecimento de relações mutualismo ou

parasitismo entre um fungo endofítico e uma planta hospedeira (Adaptado de Schulz et

al., 2006).

34

Os fungos endofíticos podem existir em tecido vegetais saudáveis ou doentes,

destacando assim a incerteza entre os limites que separam os fungos endofíticos, dos

agentes patogénicos facultativos, e dos agentes patogénicos latentes. Os fungos

patogénicos capazes de não deixar sintomas de ocupação nos seus hospedeiros, em parte

do seu ciclo podem ser considerados endofíticos (Schardl et al., 1993).

Neda et al., 2011 afirma que a associação planta-endofítico tem uma natureza

dinâmica, na qual muitos fatores afetam a estrutura e a composição das espécies das

comunidades microbianas que colonizam as raízes, ramos e folhas. A diversidade de

endofíticos depende de fatores ambientais e da interação com outros endofíticos ou com

organismos patogénicos.

Uma das caraterísticas dos fungos descritos como endofíticos é a de exibirem um

largo e impercetível período no qual o crescimento e a colonização cessam

temporariamente, retomando a sua atividade depois uma alteração física ou de maturação

no hospedeiro (Stepniewska et al., 2013 e Zuccaro et al., 2014). Este crescimento

episódico distingue os fungos endofíticos dos restantes, quer sejam considerados

saprófitas comensais, patogénicos latentes ou mutualistas protetores (Saikkonen et al.,

2004).

Neda et al. 2011, Patel et al. 2013 e Torres et al. 2015 afirmam que os fungos

endofíticos foram inicialmente descritos como assintomáticos e muitos dos endofíticos

isolados até ao momento não têm qualquer efeito nos hospedeiros, são muitos os que já

demonstraram ter uma função concreta na planta, como aumento da tolerância a agentes

patogénicos, herbívoros, pragas, aumento do crescimento e a produção de biomassa,

ajudam na reprodução e podem ser um auxílio importante ao ‘stress’ provocado por

fatores abióticos. Estes agentes endofíticos podem ainda produzir toxinas, antibióticos ou

outros fármacos, fatores de crescimento e muitos outros produtos de interesse

farmacêutico (Pimenta et al., 2012 e Lu et al., 2012).

O potencial dos microrganismos endofíticos como fonte de metabolitos bioativos

com possíveis aplicações na medicina e na agricultura tem suscitado muito interesse e

originado muitos estudos sobre estes organismos e sobre o seu uso, no controlo biológico

das doenças das plantas como alternativa aos pesticidas químicos (Aly et al., 2011).

Na prunoídeas também existem estudos que provam que os fungos endofíticos

podem ter influência na árvore. Pimenta et al. (2012) descobriu que o fungo endofítico

35

Phaeosphaeria nodorum, produzia componentes voláteis que desempenham um papel

significativo na redução da expansão de Monilinia fructicola nos tecidos de ameixa.

Também Neda et al. (2011) afirma que, no caso da cereja existem fungos endofíticos que

são omnipotentes e que provavelmente aumentam a aptidão da planta, ao melhorarem a

sua tolerância a metais pesados e à seca, reduzirem o ataque de herbívoros e de agentes

fitopagotenicos e promovem o seu crescimento.

36

3. Materiais e Métodos

37

3.1. Apresentação e caracterização das parcelas em estudo

O estudo dos problemas fitossanitários da amendoeira em modo de exploração

super-intensivo realizou-se em dois distritos diferentes de Portugal, um no Distrito de

Portalegre e outro no Distrito de Évora, sendo que ambas as parcelas pertencem à região

do Alentejo. Nas duas parcelas em estudo a cultura do amendoal foi instalada em abril de

2016. As cultivares escolhidas foram a Lauranne Avijor e a Soleta, ambas são cultivares

europeias, tendo a primeira origem francesa e a segunda origem espanhola. O porta-

enxerto utilizado em ambos os sítios foi o RP-20. Foram escolhidas esta cultivares por

estarem presentes nos dois locais em estudo e por serem as cultivares mais utilizadas em

Portugal em modo super-intensivo.

3.1.1. Localização dos locais de amostragem

O local A situa-se no Concelho de Monforte, no distrito de Portalegre (Figura

20) e a área de amendoal usada para estudo foi 21,836 ha.

O local B fica situado na freguesia de Torre de Coelheiros, no distrito de Évora

(Figura 21) e a área de amendoal usada neste estudo foi de 25,967 ha.

Figura 20 – Parcela em estudo no local A.

Figura 21 - Parcela em estudo no local B.

38

3.1.2. Condições edafo-climáticas de Portalegre e de Évora

3.1.2.1. Clima

Os dados climáticos apresentados para o distrito de Portalegre (Quadro 5) e para

o distrito de Évora (Quadro 6) foram retirados dos dados publicados pelo Instituto

Português do Mar e da Atmosfera, para uma normal climatológica de 30 anos (1971 a

2000).


de Portalegre entre os anos de 1971 e 2000 (Fonte: Instituto Português do Mar e da

Atmosfera).

Informação sobre a Estação Meteorológica de Portalegre entre 1971 e 2000

Mês

Temperatura mensal do ar (°C) Precipitação mensal (mm)

Média Média

Máxima

Média

Mínima

Valor

máximo

Valor

mínimo

Média

quantidade

total

Quantidade

máxima

diária

Janeiro 8,5 11,4 5,7 20,4 -4,5 109,6 61,2

Fevereiro 9,4 12,6 6,2 22,5 -3,7 95,5 63,9

Março 11,5 15,4 7,6 25,5 -2,8 63,3 47,9

Abril 12,3 16,5 8,2 29,6 -0,2 78,4 52,3

Maio 15,3 20,0 10,6 32,3 2,1 67,5 48,0

Junho 19,9 25,4 14,4 39,4 5,0 31,6 40,8

Julho 23,5 29,8 17,3 40,4 8,2 7,5 28,7

Agosto 23,5 29,7 17,2 39,1 8,6 8,5 20,5

Setembro 21,2 26,2 16,1 39,5 6,0 42,1 54,3

Outubro 16,2 19,9 12,5 31,0 3,5 97,5 75,5

Novembro 12,1 15,0 9,1 25,7 1,0 114,9 66,6

Dezembro 9,5 12,2 6,8 23,2 -1,1 136,0 67,5

As temperaturas registadas pela estação meteorológica de Portalegre (Quadro 5)

mostram que, durante os 30 anos da normal climatológica, os valores de temperatura

média mensal estiveram compreendidos entre os 8,5°C e os 23,5°C, sendo o mês mais

frio janeiro e os meses mais quentes julho e agosto.

Os valores médios de temperatura foram de 29,8°C em julho (máximos) e de

5,7°C em janeiro (mínimos). A temperatura máxima registada foi durante o mês de julho

com 40,4°C e a temperatura mínima foi observada durante o mês de janeiro com -4,5°C.

No que diz respeito à precipitação, o mês com maior valor foi o mês de janeiro e

aquele que registou um menor valor foi julho, com 109,6 mm e 7,5 mm, respetivamente.

Em relação ao valor de precipitação máxima diária, o mais elevado foi no mês de outubro

39

com 75,5 mm e os valores mínimos de precipitação diários registaram-se no mês de

agosto com 20,4 mm.

Ao agrupar a temperatura e a precipitação num só gráfico obteve-se o gráfico

termopluviométrico para o distrito de Portalegre (Figura 22).


de Évora entre os anos de 1971 e 2000 (Fonte: Instituto Português do Mar e da

Atmosfera).

Informação sobre a Estação Meteorológica de Évora entre 1971 e 2000

Mês

Temperatura mensal do ar (°C) Precipitação mensal (mm)

Média Média

Máxima

Média

Mínima

Valor

máximo

Valor

mínimo

Média

quantidade

total

Quantidade

máxima

diária

Janeiro 9,3 12,8 5,8 21,0 -2,9 78,5 62,7

Fevereiro 10,4 14,0 6,7 24,2 -1,4 67,0 46,2

Março 12,4 16,8 8,0 27,4 -1,8 41,9 36,0

Abril 13,5 18,0 9,0 30,5 2,0 58,1 47,3

Maio 16,2 21,2 11,1 34,2 4,9 49,9 51,5

Junho 20,2 26,3 14,0 41,0 6,7 20,4 37,2

Julho 23,2 30,2 16,3 42,0 9,8 8,6 69,8

Agosto 23,2 30,2 16,5 39,6 11,0 6,6 48,9

Setembro 21,4 27,2 15,6 39,7 7,6 29,8 55,3

Outubro 17,0 21,5 12,6 32,4 4,0 69,8 56,0

Novembro 13,0 16,7 9,3 26,6 1,4 76,1 53,2

Dezembro 10,4 13,6 7,2 21,5 -1,5 102,7 67,2

Figura 22 - Gráfico termopluviométrico de Portalegre

(Fonte: https://pt.climate-data.org/location)

40

No caso do distrito de Évora (Quadro 6), pode-se observar que o mês com a média

mais alta e os meses com a média mais baixa foram julho/agosto e janeiro com 23,2°C e

9,3°C, respetivamente.

Os valores médios de temperatura foram de 23,2°C em julho (máximos) e de

5,8°C. em janeiro (mínimos). A maior temperatura registada foi durante o mês de julho

com 42°C e a menor temperatura foi observada durante o mês de janeiro com -2,9°C.

Relativamente à precipitação, o mês com a maior média foi dezembro e o mês

com a menor média foi agosto, com valor de 102,7 mm e 6,6 mm, respetivamente. O mês

que registou a maior precipitação diária foi julho com 69,8 mm, em ponto oposto, o mês

em que se registou a menor precipitação foi março com 36,0 mm.

Ao agrupar a temperatura e a precipitação num só gráfico vai-se obter o gráfico

termopluviométrico para o distrito de Évora (Figura 23).

3.1.2.2. Solos

Para a identificação e caracterização dos solos presentes em cada uma das parcelas

utilizaram-se as cartas de solos associadas às zonas onde estas estão localizadas. As cartas

de solo foram tratadas com recurso ao programa ArcGis (ESRI 2011) (Anexo I e Anexo

II).

Figura 23 - Gráfico termopluviométrico de Évora (Fonte:

https://pt.climate-data.org/location/135/).

41

I. Local A

Para identificar os solos presentes na parcela situada no local A utilizou-se o

programa ArcGis (ESRI 2011) em conjunto com a Carta de Solos de Portugal nº 32 – D

com uma escala de 1:25000 (Anexo I). Os solos encontrados foram o Pmn (d.p.) e o Bp.

Segundo a DGADR (Direção Geral de Agricultura e Desenvolvimento Rural), o solo Pmn

pertence à família dos Solos Argiluviados Pouco Insaturados - Solos Mediterrâneos,

Pardos, de Materiais Não Calcários, Normais, de rochas cristalofílicas. A descrição do

perfil a que corresponde este solo é a seguinte:

Solos Argiluviados Pouco Insaturados - Solos Mediterrâneos, Pardos, de Materiais

Não Calcários, Normais, de rochas cristalofílicas

Horizonte A1 – 15 a 30 cm; pardo-amarelado-escuro ou pardo-acinzentado-

escuro; franco-arenoso ou areno-franco, por vezes franco, normalmente com saibro e

cascalho subangulosos de quartzo; estrutura granulosa média ou grosseira fraca; muito

friável ou solta.

Transição nítida para

Horizonte B1 – 10 a 15 cm; pardo ou pardo-amarelado-escuro; franco ou franco-

argilo-arenoso, normalmente com saibro e cascalho subangulosos de quartzo; estrutura

anisoforme grosseira e média, moderada a fraca; friável.


Horizonte B2 – 15 a 30 cm; pardo-oliváveo, por vezes com algumas ou bastantes

manchas pardo-amareladas e pardo-acinzentadas escuras; franco-argiloso a argiloso, por

vezes franco-argilo-arenoso, normalmente com saibro e cascalho subangulosos de

quartzo e de rocha-mãe; estrutura anisoforme angulosa muito grosseira forte, por vezes

tendente para prismática média moderada; com agregados de películas de argilas; firme;

com algumas concreções ferruginosas.

Transição gradual para

Horizonte C – Material proveniente da meteorização de rochas cristalofílicas,

nomeadamente xistos e gneisses.

O outro solo existente no local A é o Bp. Cardoso (1965), diz que o solo Bp esta

inserido na família dos Barros Pretos Não Calcários de dioritos ou gabros. Segue-se a

descrição do perfil correspondente ao solo Bp.

42

Barros Preto Não Calcários de dioritos ou gabros

Horizonte Ap – 20 a 40 cm; pardo-acinzentado muito escuro ou castanho

(tonalidades compreendidas entre 10 YR e 7,5 YR); argiloso, por vezes franco-argiloso;

estrutura anisoforme angulosa média a grosseira forte composta de granulosa média

moderada; firme e rijo ou extremamente rijo; fendilha quando seca; efervescência nula

ou ClH; pH 6,5 a 7,5.


Horizonte B – 10 a 60 cm; idêntico ao anterior mas de estrutura prismática média

ou grosseira forte apresentando películas de argilas nas faces dos agregados; com

superfícies polidas («slickensides»); pH 6,5 a 8,0.


Horizonte BC – 10 a 15 cm; mistura de material idêntico ao das camadas

anteriores com saibro ou fragmentos prismáticos provenientes da desagregação da rocha-

mãe; pH 6,5 a 7,5.


Horizonte C – Material originário: saibro e/ou fragmentos prismáticos

provenientes da meteorização de dioritos ou gabros ou rochas cristalofílicas básicas.

II. Local B

Tal como para o local A, também para o local B recorreu-se ao programa ArcGis

juntamente com a Carta de Solos de Portugal nº 40 – A com uma escala de 1:25000

(Anexo II) para identificar os solos presentes nesta parcela. Os solos encontrados foram

o Pmg, o Ca, o Pmg + Pmg (p) e o Pgm + Pgm (d). Numa das misturas de solos presentes

no solo da parcela, um dos Pmg encontra-se em fase pedregosa, o que pode indicar que o

solo poderá ter precisado de algumas operações de desprega. Na outra mistura de solos,

um dos Pgm esta em fase delgada, o que indica um solo com uma profundidade baixa no

total dos seus horizontes.

Segundo Cardoso (1965) Pgm refere que o este solo pertence à família dos Solos

Argiluviados Pouco Insaturados - Solos Mediterrâneos, Pardos, de Materiais Não

Calcários, Normais, de quartzodioritos.

43

Solos Argiluviados Pouco Insaturados - Solos Mediterrâneos, Pardos, de Materiais

Não Calcários, Normais, de quartzodioritos

Horizonte A1 – 15 a 35 cm; pardo ou castanho; franco-arenoso a arenoso;

estrutura granulosa fina fraca ou sem agregados; não aderente, não plástico, muito friável

ou solto, fofo ou solto; pH 5,5 a 6,5.

Transição nítida ou abrupta para

Horizonte B – 20 a 50 cm; pardo ou castanho com pontuações esbranquiçadas de

feldspatos; franco-argilo-arenoso, franco-argiloso, argilo-arenoso ou argiloso; estrutura

prismática média ou grosseira moderada ou fraca; há películas de argila nas faces dos

agregados; aderente, plástico, muito firme ou firme, muito rijo ou rijo; pH 6,5 a 7,5.

Transição nítida ou gradual para

Horizonte C – Material originário proveniente da desagregação de

quartzodioritos, notando-se nele, além de feldspatos, partículas de quartzo e de micas.

Na parcela esta presente também o solo Ca, que segundo Cardoso (1965), são

Solos Hidromórficos, Sem Horizonte Eluvial, Para-Aluviossolos, de aluviões ou coluviais

de textura mediana. Em seguida apresenta-se a sua descrição.

Solos Hidromórficos, Sem Horizonte Eluvial, Para-Aluviossolos, de aluviões ou

coluviais de textura mediana

Horizonte A1 – 20 a 30 cm; pardo-acinzentado, pardo-acinzentado-escuro ou

cinzento-escuro; textura mediana; com estrutura granulosa média e fina moderada;

aderente ou pouco aderente, plástico ou pouco plástico; friável, pouco rijo; pH 6,0 a 8,0.

Transição abrupta ou nítida para

Horizonte Bg – 30 a 90 cm; cinzento muito escuro ou preto; franco-argiloso, por

vezes argiloso; com estrutura prismática ou anisoforme angulosa média moderada;

aderente, plástico, friável ou firme, rijo ou muito rijo; pH 5,5 a 6,5.


Horizonte Cg – Material originário de origem aluvionar ou coluvionar de

constituição algo variável mas em geral de cor menos escura, de textura mais ligeira e de

menor grau de estrutura que o horizonte superior.

Por fim, o último solo presente na parcela é o Pgm, Cardoso (1965) afirma que

44

este solo pertence à família dos Solos Litólicos, Não Húmicos, Normais, de rochas

eruptivas de composição mineralógica entre o granito e o quartzodiorito.

Solos Litólicos, Não Húmicos, Normais, de rochas eruptivas de composição

mineralógica entre o granito e o quartzodiorito

Horizonte Ap – 15 a 25 cm; pardo ou pardo-amarelado; arenoso; sem agregados;

solto; pH 5,5 a 6,5.


Horizonte B – 15 a 20 cm; pardo ou pardo-amarelado; franco-arenoso ou franco;

estrutura anisoforme subangulosa grosseira fraca; pH 6,0 a 7,0.


Horizonte C – Material originário proveniente da desagregação de rochas

eruptivas de composição mineralógica entre granito e quartzodiorito, principalmente

quartzomonzoritos e granodioritos, o qual é de textura mais fina do que o dos solos (Pg).

3.1.3. Sistemas de rega nos locais utilizados nos locais A e B

Em ambos locais o sistema de rega utilizado é a rega localizada, mais

precisamente a rega gota-a-gota (Figuras 24 e 25).

Figura 24 - Classificação Portuguesa dos Sistema de Rega (Fonte: Raposo, 1997).

45

Segundo Oliveira (2011), a rega localizada, tem por objetivo aplicar água numa

fração da superfície ocupada pelo próprio sistema de rega, ou seja, humedecer apenas

uma área parcial. Dentro da classificação de rega localizada encontra-se a rega gota-a-

gota, assim chamada por se tratar de um método que aplica água de uma forma lenta e

pontual, localizada sob a forma de gotas, em locais previamente fixados e por intermédio

de emissores (gotejadores), uniformemente distribuídos ao longo dos ramais laterais.

O mesmo autor refere que água é aplicada ao solo por intermédio de emissores

funcionando a baixa pressão, da ordem dos 20 a 200 kPa, e dimensionados para pequenos

caudais, entre 2 a 12 L/h. Os emissores podem estar inseridos diretamente nas laterais dos

ramais, ou em pequenos ramais derivados deste, e estão colocados sobre a superfície do

solo, ou suspenso a uma pequena altura do solo.

A água que sai do emissor vai ser distribuída no solo à volta deste, de acordo com

um determinado padrão de humedecimento, que depende das caraterísticas hidráulicas do

solo em questão. Assim, se o afastamento entre os emissores for grande a zona

humedecida é apenas pontual, mas se esse afastamento for menor, a zona humedecida

pode tomar a forma do ramal lateral onde está o emissor. Nestas condições, conhecer a

profundidade do solo e a distribuição das raízes ajudarão a definir qual o espaçamento

entre emissores, ou no caso de pomares, a necessidade de um maior número de emissores

por árvores, a fim de que a zona explorada pelas raízes possa ser maior e possa estar

distribuída por todo o volume de solo.

Segundo Pereira (2004), a rega gota-a-gota tem como principais vantagens a

elevada eficiência de aplicação (Figura 26) e a economia de água, por sua vez a sua

principal desvantagem é o facto de ter um custo inicial muito elevado.

Figura 25 - Exemplo de rega gota-a-gota com uma

fita de emissores no local B

46

3.2. Descrição do Problema e seleção do material vegetal

Identificaram-se diversas árvores com sintomatologia típica de stress hídrico, em

que as árvores apresentavam folhas e ramos secos. Observações mais pormenorizadas

revelaram que os sintomas começaram por manifestar-se nos ramos superiores das

árvores afetadas, iniciando-se com clorose (Figura 27 A), seguida de necrose dos tecidos

das folhas (Figura 27 B). Após a queda das folhas necróticas (Figura 27 C), os ramos

superiores acabavam por também secar, sendo que após um corte transversal eram

visíveis anéis necróticos no interior do lenho dos ramos (Figura 27 D e E). Dos ramos, os

sintomas passavam para o tronco e raízes, e também para as árvores mais próximas,

levando à morte generalizada das árvores jovens. Foi também visível o aparecimento de

várias gomoses (Figura 27 F) de grandes dimensões em grande parte das plantas que

apresentavam sintomas da doença (Figura 27 G e H).

Figura 26 - Valores indicativos das eficiências de aplicação para sistemas de rega bem

projetados e bem mantidos (Fonte: Pereira, 2004)

47

3.3. Recolha de material vegetal

Em cada um dos locais (A e B) foram recolhidas amostras de duas cultivares,

Lauranne Avijor e Soleta, em três partes distintas das árvores marcadas para este estudo,

ou seja, folhas, raízes e troncos. Também em cada cultivar foram amostradas plantas com

sintomas sugestivos de doença e plantas assintomáticas, sendo que no total foram

amostradas 54 plantas em cada local, fazendo um total de 108 plantas. Para facilitar a

recolha das amostras as plantas selecionadas para a amostragem foram agrupadas em

D

G H

C B A

E

F

Figura 27 - Exemplo das sintomatologias encontrada em amendoeiras jovens presentes

nos locais A e B e nas cultivares Lauranne Avijor e Soleta. A – Cloroses; B – Necroses

dos tecidos das folhas; C – Queda das folhas necroticas; D e E – Anéis necroticos no

interior do lenho; F – Gomoses; G e H – Morte das plantas.

48

blocos. A figura 28 mostra esquematicamente como foram agrupados os blocos para o

local A e B. Cada bloco apresenta cinco árvores associadas na mesma linha de plantação,

exceto os blocos 7, 8 e 9 que apresentam apenas três árvores associadas na mesma linha

de plantação, isto deve-se ao facto de ter existido dificuldade em encontrar árvores da

cultivar Soleta que apresentassem sintomas típicos de doença.

As amostras foram recolhidas durante os meses de novembro de 2017 a janeiro de

2018. A tesoura de poda e a pá usadas para a recolha das amostras foram devidamente

desinfetadas entre cada recolha para evitar contaminações. Depois de selecionadas as

amostras foram identificadas e colocadas em sacos, tendo a sua conservação sido efetuada

a 4°C até à data do seu processamento.

Figura 28 - Esquema da recolha de amostras de material vegetativo no local A e B.

3.4. Recolha de material edáfico

De cada um dos blocos onde foram recolhidas as amostras de material vegetativo,

foram também recolhidas amostras de solo, da linha e de entrelinha de plantação onde

estão situados os respetivos blocos, ou seja, duas amostras por cada bloco, 24 amostras

por local e 48 amostras no total, de modo a identificar quais os microrganismos

fitopatogénicos presentes nesses solos. A amostragem dos solos foi realizada

simultaneamente à recolha do material vegetal, com recurso a uma sonda, que permitiu

retirar o material edáfico correspondente aos primeiros 50 cm de solo. Entre as recolhas

das amostras de cada bloco, a sonda foi devidamente lavada para evitar contaminações

de um solo para outro. Após identificadas e colocadas em sacos as amostras foram

guardadas no frigorífico a uma temperatura de 4°C até serem processadas.

49

3.5. Recolha de água de rega

Durante o mês de janeiro de 2018, foram recolhidas as amostras de água de rega

dos locais A e B, uma amostra por cada local, para assim ser possível avaliar o estado

sanitário deste elemento fundamental para as plantas. As amostras foram recolhidas

diretamente das barragens que fornecem água aos diferentes locais, colocadas em garrafas

previamente desinfetadas (cerca de 1 L de água por local) e identificadas. Após a recolha

as amostras foram guardadas no frio, a cerca de 4°C, até à altura da sua análise em

laboratório.

3.6. Isolamento de microrganismos provenientes do material vegetal

As operações realizadas no laboratório para o isolamento e purificação dos

microrganismos foram todas executadas em bancadas, que foram previamente

desinfetadas com álcool a 96% e junto à área de influência da chama do bico de Bunsen,

com objetivo de cumprir as condições de assepsia e diminuição do risco de contaminação

das amostras com outros microrganismos não desejados.

Todo o material usado neste trabalho foi sujeito a um ciclo de esterilização em

autoclave (Uniclave 88, A.J. Costa), a uma temperatura de 120°C e a uma pressão de 1

atmosfera durante vinte minutos.

O material vegetal que havia sido guardado a uma temperatura de 4°C, foi sujeito

a um ciclo de desinfeções, segundo o protocolo utilizado por Varanda et al. (2016).

Começando por uma lavagem durante três minutos numa solução de álcool a 96% (v/v),

seguida de uma lavagem em hipoclorito de sódio a 3% (v/v), durante mais três minutos,

e por fim mais uma lavagem em álcool a 70% (v/v), por mais três minutos. Após ter sido

desinfetado, o material vegetal foi lavado em três copos diferentes com água ultrapura,

ficando o material vegetal um minuto em cada copo. Esta lavagem final tem o objetivo

de remover o excesso de desinfetante que poderia ter ficado das desinfeções anteriores

(Figura 29). No final do ciclo de lavagens as amostras foram secas com papel de filtro e

fracionadas em 5 partes (Figura 30).

50

O material vegetal depois de ser fracionado foi colocado em placas de Petri de 90 mm

com o meio de cultura PDA (Potato dextrose agar), preparado segundo as instruções do

fabricante. Todas a placas foram previamente identificadas e colocadas a incubar à

temperatura 24°C, durante os dias necessários para ocorrer o crescimento dos

microrganismos presentes naquela amostra.

Após o crescimento dos microrganismos nas placas de Petri, procedeu-se à sua

repicagem para cultura pura para placas de Petri de 60 mm, contendo igualmente meio de

cultura de PDA (Figura 31). Estas, foram também incubadas a 24°C até ao completo

preenchimento da superfície da placa pelo microorganismo isolado, tendo sido

posteriormente agrupadas, segundo as características morfológicas destes.

Figura 30 - Fracionamento do material vegetal.

Figura 29 - Ciclo de desinfeção do material vegetal.

51

3.7. Isolamento de microrganismos provenientes do material edáfico

Para isolar e identificar os fungos, principalmente os fitopatogénicos, presentes

nas amostras de solo recolhidas, realizou-se uma suspensão das amostras de cada um dos

solos em tinas com água destilada, sendo a proporção de 2 kg de solo para 3 L de água

(Figura 32). Para

libertarem os possíveis

microrganismos que

estivessem presentes nos

agregados do solo, as

suspensões foram

homogeneizadas de vinte em vinte minutos, durante duas horas, com recurso a uma vareta

de vidro. Seguidamente as suspensões de solo foram deixadas em repouso durante trinta

minutos, para que ocorresse a sedimentação, e a maioria das partículas de solo fossem

depositadas no fundo, ficando assim os possíveis microorganismos presentes em

suspensão. Após estes trinta minutos, e com uma pipeta Pasteur, foram retirados de cada

uma das suspensões 4 mL de sobrenadante, que foi repartido em quatro placas de Petri de

90 mm com meio de cultura de PDA (1mL de sobrenadante por cada placa). As placas de

Petri foram deixadas a incubar a 24°C durante os dias necessários para haver crescimento

visível dos microrganismos.

Após crescerem, os microrganismos obtidos foram repicados para cultura pura em

Figura 31- Placa de Petri de 90 mm identificada e após o crescimento de microrganismos.

Figura 32 - Amostras de material edáfico em suspensão.

52

placas de Petri de 60 mm com meio de cultura PDA. Tal como feito com as placas do

material vegetal, também as placas de Petri de 60 mm contendo os isolados do solo foram

agrupadas segundo as características morfológicas dos mesmos.

3.8. Isolamento de microrganismos presentes na água de rega

Para o isolamento dos microrganismos presentes na água, as amostras recolhidas

nos locais de produção (local A e B) foram divididas em quatro copos de centrifugação

para cada local, todos com o mesmo volume de água e centrifugados durante 15 minutos,

a uma velocidade de 7000 rpm, utilizando a centrifuga (Sorvall LYNX 4000, Thermo

Scientific). O objetivo desta centrifugação foi o de fazer com que ocorresse a precipitação

e concentração de microrganismos presentes na água, no fundo dos copos de

centrifugação. No final da primeira centrifugação o sobrenadante foi praticamente todo

descartado dos quatro copos de centrifugação e o resto desse sobrenadante foi misturado,

juntamente com o precipitado correspondente, em dois copos de centrifugação diferentes.

Esses dois copos de centrifugação foram novamente centrifugados, nas mesmas

condições da centrifugação anterior. No final desta segunda centrifugação, o conteúdo

presente nos dois copos de centrifugação misturou-se num só copo de centrifugação, e

voltou-se a verter praticamente todo o sobrenadante. O copo de centrifugação contendo o

precipitado com uma pequena quantidade de água foi agitado, para voltar a suspender o

precipitado, e foram retirados 4mL, com uma pipeta Pasteur, que foram distribuídos em

quatro placas de Petri de 90 mm diferentes (1mL por cada placa) com meio de cultura de

PDA, essas placas foram deixadas à temperatura de 24°C para incubação e crescimento

dos possíveis microorganismos. Tal como para as amostras de material vegetal e material

edáfico, também os crescimentos de microorganismos das amostras de água de rega foram

repicadas para cultura pura, em placas de Petri de 60 mm. Estas foram agrupadas segundo

as características morfológicas dos isolados obtidos.

3.9. Identificação molecular dos microrganismos isolados no material

vegetal, edáfico e água de rega

A partir das culturas puras obtidas do material vegetal, edáfico e de rega, foram

selecionados os que apresentavam um aspeto semelhante a fungos, tendo sido

selecionados para identificação molecular. De cada um destes microrganismos procedeu-

53

se à extração do DNA total. Para isso, uma porção de micélio foi retirado com a ajuda de

um bisturi desinfetado (álcool a 70% e à chama do bico de Bunsen), e colocado num

almofariz de porcelana estéril, onde foi macerado na presença de azoto líquido (Figura

33). A amostra resultante é rapidamente guardada em microtubos de 2 mL, previamente

identificado com o número da amostra, e congelada a -20°C até à sua posterior utilização

(Figura 34).

A extração do DNA total das culturas foi feita segundo o método CTAB (Brometo

de hexadeciltrimetilamonio), descrito por Doyle & Doyle (1987), com algumas

alterações. A cerca de 100 mg de cada fungo macerado e congelado a -20°C adicionou-

se 600 μL de tampão de extração CTAB 2% (20 mM EDTA, 0,1 M Tris HCl pH8,0, 1,4

M NaCl, 2% de CTAB, 4% de PVP, 0,1% de β-mercaptoetanol adicionados

imediatamente antes da sua utilização e 0,5% de Proteinase K). A suspensão foi depois

incubada durante 90 minutos a 55°C, e misturada por inversão a cada 15 minutos. Após

esta incubação estar terminada, foram adicionados a cada tubo 600 μL de clorofórmio-

Figura 33 - Utilização de azoto líquido para a maceração dos microorganismos.

Figura 32 - Colocação de um microrganismo macerado num microtubo de 2 mL.

54

álcool isoamílico (24:1) e os microtubos foram novamente agitados durante cerca de 8 a

10 min. Após serem agitados, os microtubos foram centrifugados a 12000 rpm

(Centrifuga 5415R, Eppendorf) durante 10 minutos e o sobrenadante foi recuperado para

novos microtubos, tendo-se adicionado depois 2,5 volume de etanol absoluto frio (800

μL). As amostras foram suavemente homogeneizadas por inversão e novamente

centrifugadas a 13000 rpm (Centrifuga 5415R, Eppendorf) durante 20 min. O

sobrenadante foi descartado e o ‘pellet’ lavado com 500 μL de etanol a 70% de modo a

eliminar os resíduos de sais aderentes ao DNA. Seguiu-se nova centrifugação a 13000

rpm (Centrifuga 5415R, Eppendorf) durante 15 minutos tendo o sobrenadante sido

descartado. O ‘pellet’ resultante vai a secar a 55°C até os restos de etanol evaporarem, na

centrifuga ‘speed vacum’ (CentriVap micro IR, Labconco). Por fim, ao ‘pellet’ seco

foram adicionados 30 μL de água ultrapura e o DNA total conservado a -20°C até à sua

posterior utilização.

O DNA total obtido anteriormente foi sujeito a PCR (‘Polymerase Chain

Reaction’ – Reação da polimerase em cadeia), para amplificação da região ITS (‘Internal

Transcribed Spacer’) (Figura 35) a partir do DNA genómico usando os ‘primers’

universais ITS1 (5’ TCC GTA GGT GAA CC TGC GG 3’) e ‘primer’ ITS4 (5’ TCC

TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) (White et al., 1990).

Para a identificação dos fungos dos géneros Fusarium, utilizaram-se para além dos

‘primers’ ITS 1 e ITS4 outros que amplificavam uma região do gene da β-tubulina T1

(5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3’) e T22 (5’-

TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3’) (’Donnell and Cigelnik et al., 1997).

As reações de PCR consistiram na adição de 30 a 80 mg de DNA genómico dos

fungos, 10 mM Tris-HCl (pH 8,6), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs

(Thermo), 1 μM de cada ‘primer’ e 2,5 U de Dream Taq DNA polimerase (Thermo) num

total de 50 μL de reação total. A amplificação foi feita utilizando um termociclador

Figura 35 - Região de rDNA com a localização dos primers ITS1 e ITS4 (Fonte:

https://www.researchgate.net/figure/Location-of-Internal-Transcribed-Spacer-sequence-1-

2-a-and-the-position-of-primers_fig1_270564947).

55

MyCycler (Bio-Rad) a 95°C durante 3 min, seguidos de 39 ciclos de 95°C durante 30 seg,

55°C durante 45 seg e 72°C durante 2 min e a extensão final a 72°C durante 10 min. Para

a amplificação do gene da β-tubulina, houve necessidade de ajustar a temperatura de

hibridação dos ‘primers’ para 60°C em vez dos 55°C (Laurence et al, 2013).

Os produtos resultantes da amplificação por PCR foram analisados através da

electroforese em gel de agarose a 1% em tampão TBE (0,5X: 1,1M Tris; 900mM Borate;

25mM EDTA; pH 8,3) com uma voltagem constante de 80V, durante aproximadamente

1 hora, como referência utilizou-se o marcador 1 kb DNA Ladder (Thermo).

Os produtos do PCR depois de analisados foram purificados, utilizando o kit DNA

Clean & Concentrator (Zymo Research), seguindo as instruções do fabricante e

seguidamente enviadas para sequenciação na empresa Macrogen (Holanda). Todas as

amostras foram sequenciadas em ambas as direções.

Os resultados da sequenciação foram analisados com o programa “BioEdit

Sequence Alignment Editor v.7.2.3” (Hall, 1999). A procura por sequências homólogas

foi feita usando a base de dados “Basic Local Alignment Search Tools” (BLAST N) do

“National Center for Biotechnology Information” (NCBI). Sempre que possível as

sequências foram identificadas até à espécie e com um grau de semelhança o mais

próximo possível dos 100% (entre os 97% e os 100%).

3.10. Análise estatística

Para a análise estatística foram realizadas as análises univariada e multivariada

para detectar as diferenças significativas na abundância total das OTUs da comunidade

endofítica em grupos de 5 amendoeiras nos locais; “A e B”, cultivares; “Lauranne Avijor

e Soleta”, sintomatologia; “sintomáticas e assintomáticas” e órgãos das plantas; "raiz,

tronco e folhas". As análises estatísticas dos dados foram realizadas utilizando o software

PRIMER v6 (Clarke e Warwick, 2001) com o software complementar PERMANOVA

(Anderson et al., 2008). O número total de OTUs em cada agrupamento de 5 amendoeiras

foi calculado usando o conjunto de dados dos dois locais nas três cultivares (doentes e

não doentes) e nos três tipos de órgãos das plantas. Uma análise permutacional de

variância de quatro vias (PERMANOVA) foi aplicada para testar a hipótese de existirem

diferenças significativas no número total de fungos endofíticos por grupos de 5

amendoeiras entre os locais e entre as três cultivares (sintomáticas e assintomáticas) e

56

entre os três tipos de órgãos das plantas. A análise PERMANOVA foi realizada seguindo

o modelo de quatro fatores: locais; “A e B”, cultivares (2 níveis, fixos); “Lauranne Avijor

e Soleta” (2 níveis aleatórios), sintomatologia; “Sintomáticas e assintomáticas” (2 níveis

aleatórios) e órgãos das plantas; "raiz, tronco e folhas" (3 níveis aleatórios). Os dados

totais foram transformados utilizando a raiz quadrada, a fim de reduzir a importância das

réplicas altamente abundantes e, portanto, aumentar a importância das menos abundantes

na análise de similaridade. A análise PERMANOVA foi conduzida em uma matriz de

similaridade de Bray-Curtis (Clarke e Green, 1988). A hipótese nula foi rejeitada a um

nível de significância <0,05 (se o número de permutações fosse menor que 150, uma

permutação de Monte Carlo p foi usada). Sempre que foram detetadas interações

significativas nos efeitos dos fatores, estas foram examinadas usando comparações a

posteriori, usando 9999 permutações sob um modelo reduzido.

57

4. Resultados

58

4.1. Isolamento e identificação de isolados de fungos obtidos no

material vegetal

Neste trabalho foram recolhidas e analisadas 324 amostras obtidas de 108 árvores,

pertencentes aos locais A e B. Em cada local foram amostradas duas cultivares de

amendoeiras (Lauranne Avijor e Soleta) e em cada cultivar as amostragens foram

divididas em árvores sintomáticas e não sintomáticas. Ainda, em cada árvore, foram

recolhidas amostradas de três zonas diferentes (folhas, raízes e tronco). Nestas 324

amostras foram encontrados um total de 1409 fungos, destes, 99,93% foram identificados

com sucesso através da amplificação e sequenciação da região ITS. O tamanho dos

produtos amplificados variou entre 500 a 700 pb (Figura 36). Para o caso específico dos

fungos do género Fusarium, foi necessário amplificar e sequenciar uma região de cerca

de 1500 pb do gene da β-tubulina (Figura 37).

Figura 36 - Análise electroforética em gel de agarose 1% em que se observam os produtos de

amplificação da região ITS, tendo-se utilizado os primers universais ITS1 e ITS4, usando DNA

extraído (1 a 14) de fungos isolados de amostras de material vegetal; - - controlo negativo; M –

marcador GeneRuler 1 Kpb DNA Ladder; resultante num produto com o tamanho esperado

entre 500 e 700 pb.

500 pb

700 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 -

59

4.2. Isolamento e identificação de Fusarium spp. no material edáfico

No material edáfico amostrado optou-se por isolar e purificar apenas fungos da

espécie Fusarium. As características observadas foram as cores das colónias, desde o cor-

de-rosa ao roxo e a forma dos esporos que após observação ao microscópio ótico,

mostraram ser do tipo conídeos, micro e macroconideos. Assim, isolou-se um total de 35

isolados de Fusarium spp., de onde se identificaram três espécies diferentes. No local A

obtiveram-se 16 isolados, destes 14 isolados foram identificados ao nível do género

Fusarium spp., e os outros dois islolados identificados ao nível da espécie, uma como

Fusarium oxysporum e outra como Fusarium equiseti. No local B foram obtidos 19

isolados, 10 isolados foram identificados ao nível do género Fusarium spp., e os outros 9

isolados foram identificados ao nível da espécie; 3 como Fusarium chlamydosporum, 4

como Fusarium oxysporum e 2 como Fusarium equiseti (Figura 38).


de amplificação de uma porção do gene da β-Tubulina , usando DNA extraído (1 a 7) de

fungos isolados de amostras de material vegetal; - - controlo negativo; M – marcador

GeneRuler 1 Kpb DNA Ladder; resultante num produto com o tamanho esperado de 1500

pb.

60

Ao relacionar o total de isolados de Fusarium obtidos no material edáfico com as

cultivares em cada local verificou-se que: No local A, no solo da cultivar Lauranne foram

encontrados 8 isolados de Fusarium, sendo que 7 foram identificados ao nível do género

e somente 1 isolado ao nível da espécie, como Fusarium oxysporum. No solo da cultivar

Soleta encontraram-se 8 isolados de Fusarium, destes, 7 foram identificados ao nível do

género e somente 1 isolado ao nível da espécie, como Fusarium equiseti (Figura 39). No

local B, no solo da cultivar Lauranne encontraram-se 11 isolados de Fusarium, sendo que

7 isolados foram identificados ao nível do género, 2 como pertencentes à espécie

Fusarium chlamydosporum e 2 de Fusarium oxysporum. No solo da cultivar Soleta

encontraram-se 8 isolados de Fusarium, sendo que destes, 3 foram identificados ao nível

do género, 1 pertencente à espécie Fusarium chlamydosporum, 2 à espécie Fusarium

oxysporum e 2 à espécie Fusarium equiseti (Figura 40).

Figura 38 - Número total de isolados e espécies de Fusarium presentes no material edáfico

no local A e no local B.

Figura 39 - Número de isolados e espécies de Fusarium obtidos, por cultivar, presentes no

material edáfico no local A.

61

Ao relacionar os isolados de Fusarium obtidos no material edáfico com facto das

plantas estarem sintomáticas ou assintomáticas em cada local e cultivar, observou-se que:

No local A, a cultivar Lauranne, apresentou 2 isolados de Fusarium no solo de plantas

sintomaticas, que foram só identificados ao nível do género. Seis isolados de Fusarium

no solo onde se encontravam as plantas assintomáticas, destes, 5 isolados foram

identificados também ao nível do género e 1 pertencente à espécie Fusarium oxysporum

(Figura 41). Ainda no local A, mas na cultivar Soleta, foram encontrados 4 isolados de

Fusarium, obtidos no solo de plantas sintomáticas, e todos identificados até ao nível do

género (Figura 41). No solo das plantas assintomáticas da cultivar Soleta, foram

encontrados 4 isolados de Fusarium, sendo que 3 foram identificados ao nível do género

e 1 identificado como pertencente à espécie Fusarium equiseti (Figura 41).

Figura 40 - Número de isolados e espécies de Fusarium obtidos por cultivar, presentes no

material edáfico no local B.


sintomática, presentes no material edáfico no local A.

62

No local B, o solo da cultivar Lauranne sintomática, apresentou 8 isolados de

Fusarium, destes, 5 foram identificados ao nível do género, 2 identificados com

pertencentes à espécie Fusarium chlamydosporum e 1 como sendo da espécie Fusarium

oxysporum (Figura 42). O solo da cultivar Lauranne com plantas assintomáticas

apresentou 3 isolados de Fusarium, sendo que 2 forma identificados ao nível do género

Fusarium e 1 foi identificado como pertencendo a espécie Fusarium oxysporum (Figura

42). Já o solo da cultivar Soleta sintomática apresentou 1 isolado de Fusarium que foi

identificado como pertencendo a espécie Fusarium oxysporum. O solo da cultivar Soleta

assintomática apresentou 7 isolados de Fusarium, sendo que 5 foram identificados ao

nível do género, 1 identificado com pertencendo a espécie Fusarium chlamydosporum, 1

como Fusarium oxysporum e 2 como Fusarium equiseti (Figura 42).

Dos resultados obtidos podemos verificar que a espécie mais prevalente nos solos

analisados foi o Fusarium oxysporum (Quadro 7).


sintomática, presentes no material edáfico no local B.

63

4.3. Isolamento e identificação de Fusarium spp. na água de rega

Tal como para o material edáfico, também para a água de rega se optou por isolar

e identificar apenas os fungos isolados com características do género Fusarium. No local

A, foram identificados 3 isolados de Fusarium sendo que 1 foi identificado ao nível do

género, 1 identificado como pertencendo a espécie Fusarium verticillioides e 1 como

Fusarium oxysporum. No local B, foram identificados 2 isolados de Fusarium sendo que

1 foi identificado ao nível do género e 1 identificado como pertencendo a espécie

Fusarium chlamydosporum (Quadro 8) e (Figura 43).

Quadro 7 - Identificação dos isolados de Fusarium por local (A e B), por cultivar (Lauranne

e Soleta) e por sintomatologia (Sintomáticas e assintomáticas).

Locais Variedade Sintomatologia Identificação da espécie

Sintomática Fusarium spp.

Fusarium spp.

Fusarium oxysporum

Sintomática Fusarium spp.

Fusarium spp.

Fusarium equiseti

Fusarium spp.

Fusarium chlamydosporum

Fusarium oxysporum

Fusarium spp.

Fusarium oxysporum

Sintomática Fusarium oxysporum

Fusarium spp.


Fusarium oxysporum

Fusarium equiseti

Local B

Assintomática

Assintomática

Lauranne

Soleta

Local A

Sintomática

Assintomática

Assintomática

Lauranne

Soleta

Identificação dos isolados Local A Local B

Fusarium spp. 1 1

Fusarium verticillioides 1 0

Fusarium chlamydosporum 0 1

Fusarium oxysporum 1 0

Quadro 8 - Ausência (0) e presença (1) dos diferentes isolados de Fusarium na água

utilizada para a rega nos locais A e B.

64

4.4. Diversidade de fungos endofíticos encontrada nas plantas

De forma geral, os 1409 isolados de fungos foram identificados como pertencendo

a 42 OTU’s representando 27 géneros. A maioria dos isolados pertencem à Divisão

Ascomycota (90,48%), que está representada por cinco classes, com a classe

Sordariomycetes a ser a mais representada (44,74%), seguida das classes

Dothideomycetes (36,48%), Eurotiomycetes (13,16%), e for fim as classes Leotiomycetes

e Ascomycetes (ambas com 2,63%). As restantes Divisões estão representados apenas por

uma OTU cada. A Divisão Zygomycota (2,38%) está representada pela classe

Zygomycetes. Por sua vez, a Divisão Mucoromycota (2,38%) e a Divisão Basidiomycota

(2,38%) estão representadas pelas classes Umbelopsidomycetes e Agaricomycetes,

respetivamente. Houve ainda um fungo que não foi identificado (2,38%). Os isolados

obtidos distribuem-se essencialmente por nove géneros (Figuras 44, 45 e 46): Alternaria

(24,91%), Fusarium (18,67%), Cladosporium (11,76%), Epicoccum (10,93%),

Penicillium (9,98%), Rhizopus (6,32%), Purpureocillium (3,41%), Botrytis (2,56%) e

Aureobasidium (2,53%), juntos compreendem um total de 91,07% da totalidade de fungos

isolados. Quanto às espécies encontradas foram cinco, o que representa 56,23%; sendo,

Alternaria spp. (14,45%), Cladosporium cladosporioides (11,62%), Epicoccum nigrum

(10,93%), Penicillium spp. (9,91%) Fusarium spp. (9,32%).

Figura 43 - Ausência (0) e presença (1) das diferentes espécies de Fusarium na água

utilizada para a rega das plantas do local A e do local B.

65


Epicoccum; B - Trichoderma; C - Trichothecium; D - Purpureocillium; E - Fusarium; F -

Alternaria; G - Curvularia; H - Aspergillus; I – Aureobasidium; J – Botrytis; L –

Cladosporium; M - Penicillium

66


Ilyonectria; B - Chaetomium; C – Não identificado.

Figura 42 - Isolados encontrados no material vegetal e obtidos em cultura pura; A - Phoma;

B - Rhizopus; C - Boeremia; D - Bjerkandera; E - Truncatella; F - Talaromyces; G -

Preussia; H - Byssochamys; I – Pseudogymnoascus; J – Diaporthe; L – Macrophomina; M

- Umbelopsis.

Figura 45 - Isolados encontrados no material vegetal e obtidos em cultura pura; A - Phoma;

B - Rhizopus; C - Boeremia; D - Bjerkandera; E - Truncatella; F - Talaromyces; G -

Preussia; H - Byssochamys; I – Pseudogymnoascus; J – Diaporthe; L – Macrophomina; M

- Umbelopsis.

67

Após a obtenção das culturas puras, foi extraído o DNA total dos isolados obtidos

e procedeu-se à identificação molecular de cada um desses isolados de modo a ser

possível conhecer quais as espécies que se encontravam associadas às sintomatologias

apresentadas nas plantas e também as espécies endófiticas presentes.

Deste modo, dos 1409 fungos encontrados, encontram-se 67 que apresentavam

características morfológicas diferentes entre si (Quadro 9), 42 OTU’s correspondendo a

47 fungos diferentes foram isolados no local A e 20 no local B.

Quadro 9 - Diversidade de fungos identificados após a análise BLAST N das sequências

nucleóticas e número total de isolados de fungos por órgão vegetativo.

Locais Cultivar Sintomatologia Orgão

Vegetativo Identificação dos fungos

Nº total de fungos por

orgão vegetativo

Local A Lauranne

Sintomática

Folhas

Epicoccum nigrum

10

Bjerkandera adusta

Curvularia spicifera

Alternaria alternata

Cladosporium cladosporioides

Alternaria tenuissima

Alternaria spp.

Cladosporium ramotenellum

Rhizopus

Preussia africana

Raiz

Fusarium oxysporum

4 Penicillium spp.

Fusarium spp.

Macrophomina phaseolina

Tronco Epicoccum nigrum

2 Curvularia spicifera

Assintomática

Folhas

Talaromyces amestolkiae

6

Alternaria alternata

Purpureocillium lilacinum

Epicoccum nigrum

Alternaria spp.

Alternaria infectoria

Raiz

Fusarium oxysporum

5

Fusarium spp.

Fusarium equiseti

Diaporthe endophytica

Epicoccum nigrum

Tronco

Chaetomium aureum

6

Epicoccum nigrum

Trichothecium roseum

Fusarium oxysporum

Aureobasidium pullulans

Alternaria spp.

68

Soleta

Sintomática

Folhas X 0

Raiz Fusarium oxysporum

2 Fusarium spp.

Tronco Fusarium oxysporum 1

Assintomática

Folhas X 0

Raiz

Truncatella angustata

7


Aspergillus europaeus

Fusarium spp.

Fusarium oxysporum

Diaporthe leucospermi

Fusarium equiseti

Tronco

Boeremia exigua

4 Epicoccum nigrum

Fusarium spp.

Alternaria infectoria

TOTAL 47

Local B

Lauranne

Sintomática

Folhas

Phoma

5

Preussia africana

Fusarium avenaceum

Fusarium flocciferum

Preussia spp.

Raiz

Penicillium spp.

4 Fusarium chlamydosporum

Ilyonectria spp.

Não indentificado

Tronco Diaporthe foeniculina 1

Assintomática

Folhas Alternaria infectoria 1

Raiz Macrophomina phaseolina

2 Botrytis cinerea

Tronco Alternaria alternata 1

Soleta

Sintomática

Folhas Epicoccum nigrum 1

Raiz Byssochlamys spectabilis 1

Tronco Rhizopus 1

Assintomática

Folhas Pseudogymnoascus pannorum

2 Epicoccum nigrum

Raiz Umbelopsis vinacea 1

Tronco X 0

TOTAL 20

Na Figura 47, pode observar-se que de todos os isolados analisados o que foi mais

comumente encontrado foi o Epicoccum nigrum, com 8 isolados, estando presente nos

dois locais e nas plantas sintomáticas e assintomáticas. Para além deste também se

encontrou frequentemente fungos do género Fusarium, 17 isolados, em que 5 deles foram

identificados como sendo Fusarium oxysporum.

69

Quando se analisou a diversidade endofítica encontrada em cada um dos locais,

verificou-se que, no local A foram encontrados 718 fungos na totalidade, o que

corresponde a um total de 32 OTU’s (76,19% das 42 OTU’s encontradas). A maioria dos

isolados correspondem à Divisão Ascomycota (93,75%), que está aqui dividida em quatro

classes, sendo a classe Sordariomycetes aquela que aparece mais representada (46,67%),

seguida das classes Dothideomycetes (40%), Eurotiomycetes (10%), e for fim a classe

Leotiomycetes (3,33%). As restantes Divisões estão representados por uma OTU cada um

e estão repartidos da seguinte forma: Zygomycota (3,13%) e Basidiomycota (3,13%), as

classes em estão inseridos os fungos encontrados são a classe Zygomycetes e a classe

Agaricomycetes, respetivamente. Agrupando os fungos obtidos por géneros, verificou-se

que estes se agrupam essencialmente em nove géneros diferentes que são os seguintes

(Figuras 44, 45 e 46): Alternaria (20,47%), Fusarium (19,36%), Epicoccum (12,16%),

Cladosporium (12,16%), Penicillium (7,06%), Rhizopus (7,01%), Purpureocillium

Figura 47 - Número de isolados de cada espécie após o BLAST.

70

(5,20%), Aureobasidium (3,25%) e Curvularia (3,20%), fazendo um total de 89,87% da

totalidade dos fungos isolados. Após a utilização do protocolo para identificação das

espécies, as mais encontradas foram as seguintes: Epicoccum nigrum (12,16%),

Alternaria spp. (12,02%), Fusarium spp. (11,98%), Cladosporium cladosporioides

(11,88%) e Penicillium spp. (7,06%), que juntos fazem um total de 55,10% do total das

espécies isoladas no local A.

No local B foram encontrados um total de 691 fungos, o que corresponde a um

total de 27 OTU’s (64,29% do total de OTU’s encontradas em todo o estudo). A maioria

dos fungos isolados correspondem à Divisão Ascomycota (88,89%), que está representado

por cinco classes, as classes Sordariomycetes e Dothideomycetes a serem as classes mais

representadas (41,67%), Eurotiomycetes (8,33%), e for fim as classes Leotiomycetes e

Ascomycetes (ambas com 4,17%). As restantes Divisões estão representados por uma

OTU cada uma. A Divisão Zygomycota (3,70%) está representada pela classe

Zygomycetes, a Divisão Mucoromycota (3,70%) está representada pela classe

Umbelopsidomycetes. Houve ainda um fungo que não foi identificado (3,70%), como tal

não foi possível chegar à sua classificação taxonómica. De todos os isolados, os setes

géneros mais representados foram: Alternaria (29,52%), Fusarium (17,95%), Penicillium

(13,02%), Cladosporium (11,34%), Epicoccum (9,65%), Rhizopus (5,60%) e Diaporthe

(3,28%), correspondendo a 90,36% do total de géneros encontrados. As cinco espécies

mais encontradas no local B foram: Alternaria spp. (16,98%), Penicillium spp. (12,88%),

Alternaria alternata (12,40%), Cladosporium cladosporioides (11,34%) e Epicoccum

nigrum (9,65%), juntos fazem um total de 63,25% do total das espécies isoladas, no local

B.

4.5. Análise da abundância de fungos endofíticos encontrada nas

plantas

No local A, a média das abundâncias dos fungos ± o erro padrão foi de 20.0 ± 0.78

(Figura 48). Na cultivar Lauranne Avijor a média das abundâncias dos fungos endofíticos

± o erro padrão foi, de 22.06 ± 0.73, e na cultivar Soleta foi de 17.83 ± 1.21. A análise

PERMANOVA não revelou diferenças significativas entre as cultivares Lauranne Avijor

e Soleta (p > 0.05).

71

Nas plantas sintomáticas da cultivar Lauranne Avijor a média da abundância de

fungos endofíticos ± o erro padrão foi de 23.22 ± 0.71 e nas plantas assintomáticas foi de

20.89 ± 0.67. A análise PERMANOVA não revelou diferenças significativas (p > 0.05)

para a abundância de fungos endofíticos entre as plantas sintomáticas e não

assintomáticas da cultivar Lauranne Avijor. Nas plantas sintomáticas da cultivar Soleta a

média da abundância de fungos endofíticos ± o erro foi de 17.18 ± 0.83 e nas plantas

assintomáticas de 17.89 ± 1.56. A análise PERMANOVA não revelou diferenças

significativas (p > 0.05) para a abundância de fungos endofíticos entre as plantas

sintomáticas e assintomáticas da cultivar Soleta.

Nos órgãos vegetativos das plantas sintomáticas da cultivar Lauranne Avijor a

média da abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 25.67 ±

1.45 nas raízes de 22.33 ± 2.03 e nos troncos de 21.5 ± 1.20. As comparações individuais

emparelhadas da análise PERMANOVA revelaram diferenças significativas para a

abundância de fungos endofíticos nos órgãos vegetativos das plantas sintomáticas entre

as folhas e as raízes (p < 0.0057), entre as folhas e os troncos (p < 0.002), e entre as raízes

e os troncos (p < 0.0458). Nos órgãos vegetativos das plantas assintomáticas a média da

abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 19 ± 0.58, nas

raízes de 22.33 ± 0.88 e nos troncos de 21.33 ± 2.60. As comparações individuais

Figura 48 - Média de abundância de fungos encontrados nas plantas do local A e respetivo

erro padrão.

72

emparelhadas da análise PERMANOVA não revelaram diferenças significativas (p >

0.05) para a abundância de fungos endofíticos entre nenhum dos órgãos vegetativos das

plantas não doentes.

Nos órgãos vegetativos das plantas sintomáticas da cultivar Soleta, a média da

abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 13.89 ± 0.55, nas


emparelhadas da análise PERMANOVA não revelaram diferenças significativas (p >

0.05) para a abundância de fungos endofíticos entre nenhum dos órgãos vegetativos das

plantas sintomáticas. Nos órgãos vegetativos das plantas assintomáticas da cultivar Soleta

a média da abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 11 ±

1.15, nas raízes de 23.67 ± 3.38 e nos troncos de 19 ± 2.08. As comparações individuais


abundância de fungos endofíticos nos órgãos vegetativos das plantas assintomáticas entre

as folhas e as raízes (p < 0.0097), entre as folhas e os troncos (p < 0.0064), e entre as

raízes e os troncos (p < 0.0242).

No local B, a média de abundância de fungos ± o erro padrão foi de 19.5 ± 0.95

no local B (Figura 49). Na cultivar Lauranne Avijor a média da abundância de fungos

endofíticos ± o erro padrão foi de 18.33 ± 1.45, e na cultivar Soleta foi de 20.05 ± 1.23.

A análise PERMANOVA não revelou diferenças significativas entre as cultivares

Lauranne Avijor e Soleta (p > 0.05).

Figura 49 - Média de abundância de fungos encontrados nas plantas do local B e respetivo

erro padrão.

73

Nas plantas sintomáticas da cultivar Lauranne Avijor a média da abundância de

fungos endofíticos ± o erro padrão foi de 21.11 ± 1.48 e nas plantas assintomáticas de

15.56 ± 1.15. A análise PERMANOVA não revelou diferenças significativas (p > 0.05)

para a abundância de fungos endofíticos entre as plantas sintomáticas e assintomáticas da

cultivar Lauranne Avijor. Nas plantas sintomáticas da cultivar Soleta a média da

abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foi de 21.67 ± 1.32 e nas plantas

assintomáticas foi de 18.44 ± 1.07. A análise PERMANOVA não revelou diferenças

significativas (p > 0.05) para a abundância de fungos endofíticos entre as plantas

sintomáticas da cultivar Soleta.

Nos órgãos vegetativos das plantas sintomáticas da cultivar Lauranne Avijor a

média da abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 19 ± 0.58,

nas raizes de 27 ± 4.16 e nos troncos de 17.33 ± 2.84. As comparações individuais



as folhas e as raizes (p < 0.0481), entre as folhas e os troncos (p < 0.0324), e entre as

raizes e os troncos (p < 0.0338). E nas plantas assintomáticas a média da abundância de

fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 10.33 ± 1.67, nas raízes de 20 ±

1.73 e nos troncos de 16.33 ± 1.45. As comparações individuais emparelhadas da análise

PERMANOVA revelaram diferenças significativas para a abundância de fungos

endofíticos nos órgãos vegetativos das plantas assintomáticas entre as folhas e as raizes

(p < 0.0267), entre as folhas e os troncos (p < 0.0479), e entre as raizes e os troncos (p <

0.0053).

Nos órgãos vegetativos das plantas sintomáticas da cultivar Soleta, a média da

abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas folhas de 16.11 ± 2.00, nas




as folhas e as raízes (p < 0.0632), entre as folhas e os troncos (p < 0.0428), e nenhuma

diferença foi encontrada entre as raízes e os troncos (p > 0.2438). E nas plantas

assintomáticas a média da abundância de fungos endofíticos ± o erro padrão foram nas

folhas de 13 ± 1.53, nas raízes de 21.33 ± 1.33 e nos troncos de 21 ± 1. As comparações

individuais emparelhadas da análise PERMANOVA revelaram diferenças significativas

74

para a abundância de fungos endofíticos nos órgãos vegetativos das plantas

assintomáticas entre as folhas e as raízes (p < 0.0115), entre as folhas e os troncos (p <

0.0253), e entre as raízes e os troncos (p < 0.023).

75

5. Discussão de Resultados

76

No ano de 2017 amendoeiras das cultivares Lauranne Avijor e a Soleta, instaladas

num modo de exploração super-intensivo, começaram a apresentar evidentes sintomas de

stress hídrico e a presença de gomoses nos troncos, sintomatologia esta normalmente as-

sociada a um bloqueio dos feixes vasculares por fungos fitopatogénicos (Damm et al.,

2007; Gramaje et al., 2012). Este processo criou uma oportunidade única de investigar

quais os principais fungos fitopatogénicos associados à sintomatologia apresentada nas

jovens plantas de amendoeira. Paralelamente foram também analisadas plantas assinto-

máticas das mesmas cultivares localizadas nas mesmas parcelas, com o objetivo de com-

parar os microorganismos isolados e compreender se as plantas assintomáticas apresen-

tariam algum tipo de bioproteção que pudesse ser originada por fungos antagonistas dos

fungos fitopatogénicos. Estes bioantagonistas funcionam impedindo a proliferação dos

microorganismos nocivos por competição pelos locais de colonização, por nutrientes ou

produzindo compostos tóxicos, que impedem a invasão da planta e a manifestação de

sintomas (Pimenta et al., 2012). Para além das plantas também foram analisados os solos

e a água utilizada para a rega das plantas, para se poder perceber a possível origem dos

microorganismos encontrados.

Das diferentes partes das plantas amostradas, raízes, troncos e folhas, foram iso-

lados 1409 organismos com características morfológicas semelhantes a fungos, ou seja,

com micélio pulverulento ou algodonoso. Aos morfologicamente diferentes fez a extra-

ção do DNA genómico e se procedeu à amplificação da região ITS, tendo-se obtido em

todos os isolados o produto de amplificação esperado de 500 a 700 pb, típico de fungos,

exceto num dos isolados em que não houve amplificação. Este facto pode ter sido devido

à degradação do DNA ou à não hibridação dos ‘primers’ por falta de especificidade, o

que implicaria tratar-se de outro organismo, por exemplo de uma levedura. Após a se-

quenciação da região ITS, verificou-se que 18,67% dos fungos isolados pertenciam ao

género Fusarium. Os fungos deste género têm uma elevada homologia na região ITS, não

se conseguindo identificar a espécie apenas com base nesta região. Assim, optou-se por

amplificar uma porção do gene da β-tubulina, com cerca de 1500 pb. Esta região do DNA

genómico dos fungos apresenta elevada especificidade por organismo podendo assim per-

mitir conhecer a/as espécie/s presentes nas amendoeiras testadas. Várias espécies do gé-

nero Fusarium estão associadas a doenças radiculares e/ou vasculares da maioria das

plantas, das quais as prunoídeas não são exceção, estes fungos boqueiam os vasos do

77

xilema impedindo a passagem de água e de nutrientes para a parte aérea das plantas infe-

tadas (Marek et al., 2013; Úrbez-Torres et al., 2016). Assim, as amostras de solo foram

testadas apenas para avaliação dos fungos habitantes de solo nelas presentes, tendo-se

encontrado, no local A as seguintes espécies pertencentes ao género Fusarium: F. oxyspo-

rum, F. equiseti e F. chlamydosporum. Houve, no entanto, alguns isolados de Fusarium

em que não se conseguiu chegar à identificação da espécie, revelando-se nestes casos a

amplificação da região ITS e do gene da β-tubulina insuficientes em especificidade para

caracterizar estes microrganismos (Raja et al., 2017).

Na água de rega estes agentes patogénicos também foram encontrados, no entanto,

as espécies identificadas foram F. verticillioides e F. chlamydosporum, não se tendo

detetado a presença de F. equiseti. A presença destes fungos patogénicos quer na água de

rega, quer no solo pode ter originado a sua presença nas plantas, uma vez que estas

espécies foram encontradas nos tecidos vegetais, principalmente na raiz e em alguns casos

já a colonizar o tronco, como foi o caso de plantas de ambas as cultivares, sintomáticas e

assintomáticas do local A.

No local B, apesar destes fungos estarem presentes no solo, não se verificou a sua

presença na cultivar Soleta. O facto de não terem sido detetados estes fungos nos tecidos

vegetais pode estar relacionado com; a sua não deteção por se encontrarem em baixa

concentração, ou porque nestes tecidos, principalmente na raiz, detetou-se a presença de

outros fungos com grande capacidade de antagonismo biológico, como é o caso de

Byssochlamys spectabilis (Rodrigo et al., 2017) e Epicoccum nigrum (Madrigal et al.,

1991; Moreira et al., 2008). Na cultivar Lauranne Avijor apenas foi identificado o F.

chlamidosporum nos tecidos da raiz de plantas sintomáticas. Para além desta espécie que

se encontrava presente no solo foram ainda detetadas nas folhas as espécies F.

avenaceum, que foi descrita como causadora da morte de amendoeiras, cujo a doença

apresenta sintomas como; necroses nas raízes e ramos, descoloração dos feixes do floema

e dessecação (Chehri et al., 2010) e a espécie F. flocciferum, que foi descrita como

provocando sintomas de podridão radicular e declínio da árvore em lenhosas perenes por

Miao et al. (2015).

No local A, na cultivar Lauranne Avijor foi identificado o Fusarium oxysporum,

no entanto esta espécie de fungo também foi encontrada em tecidos de raiz e de tronco de

plantas que não apresentavam qualquer sintomatologia de doença. O facto de um fungo

78

da mesma espécie estar a colonizar plantas sintomáticas e assintomáticas pode ser

justificado de duas formas; 1) ou estamos em presença de duas estirpes diferentes da

mesma espécie, uma com características patogénicas, no caso da presente nas plantas

infetadas, e de uma estirpe da mesma espécie sem características de patogenicidade, a

presente nas plantas assintomáticas, uma vez que, segundo Validov et al. (2011) ambas

as estirpes são capazes de colonizar as raízes das plantas; 2) ou estamos perante uma

associação de fungos que em consórcio ou separadamente têm uma ação antagonista e

impedem a manifestação de patogenicidade por parte da estirpe que se encontra a

colonizar plantas assintomáticas (Thakkar e Saraf, 2015). Para além desta espécie que se

encontrava presente no solo foram ainda detetadas nas folhas as espécies F. avenaceum,

que foi descrito como causador de necroses nas raízes e ramos, descoloração dos feixes

do floema e dessecação e morte de amendoeiras (Chehri et al., 2010) e F. flocciferum,

que foi referido como provocando sintomas de podridão radicular e declínio da árvore em

lenhosas perenes por Miao et al. (2015).

Para além dos fungos patogénicos do género Fusarium, os tecidos vegetais

testados das plantas do local A encontravam-se claramente mais colonizados por fungos

do que os do local B. No local A, observou-se que tanto a quantidade como a diversidade

de fungos, 718 isolados pertencentes a 47 espécies diferentes, era maior que a encontrada

no local B, 691 isolados pertencentes a 20 espécies diferentes. Tendo em conta que as

plantas instaladas num e noutro local tinham a mesma idade e tiveram origem no mesmo

viveiro em que são utilizadas as mesmas plantas mãe, os mesmos porta-enxertos e

provavelmente também o mesmo substrato, pode-se sugerir que a diversidade de

microrganismos presentes pode ter origem no solo em que foram instaladas. Os solos das

duas parcelas não diferem muito em termos da sua constituição, uma vez que ambos são

Pgm, no entanto o solo do local B esta em fase delgada, o que indica um solo com uma

profundidade baixa no total dos seus horizontes (Cardoso 1965), tendo uma espessura

mais fina e, portanto, uma menor camada arável que os solos do local A.

Os fungos isolados das plantas de ambas as parcelas foram agrupados por géneros,

tendo-se verificado que os géneros que apareciam em maior percentagem nas plantas de

cada local eram exatamente os mesmos embora com percentagens ligeiramente

diferentes, esses géneros foram; Alternaria, Fusarium, Epicoccum, Cladosporium,

Penicillium e Rhizopus. Sabe-se que existe uma elevada especificidade entre a planta

79

hospedeira e o microbioma, patogénico ou saprófita, que a coloniza, esta relação

hospedeiro/fungo é modulada por duas vias; uma que está relacionada com as proteínas

secretadas pelos fungos e que são reconhecidas pelo hospedeiro, e outra via, que está

relacionada com a expressão génica típica da planta hospedeira (Aguilar-Trigueros e

Rillig, 2016; Borah et al., 2018).

A deteção do fungo fitopatogénico Macrophomina faseolina, tanto em raízes de

plantas sintomáticas da cultivar Lauranne Avijor, no local A como em raízes

assintomáticas da mesma cultivar no local B, pode sugerir que este fungo poderia

encontrar-se no substrato dessa cultivar ou no solo onde foram instaladas essas plantas.

Este fungo pertencente à família Botryosphaeriaceae é um importante fungo

fitopatogénico presente no solo e com uma larga gama de hospedeiros. Este fungo começa

por colonizar as raízes das plantas que infeta, estendendo-se posteriormente ao caule e

causando doenças do lenho numa grande variedade de plantas, sendo uma das

sintomatologias descritas a presença de gomoses (Sarr et al., 2014). A presença deste

fungo pode estar relacionada com alguns dos sintomas detetados nas plantas doentes, pois

ele causa bloqueio da passagem de água e nutrientes e consequentes sintomas de cloroses

e murchidão das folhas das plantas afetadas. A não existência de sintomas visíveis nas

plantas da mesma cultivar em que o fungo também estava presente pode ter a ver com a

quantidade de inóculo presente ser menor, o fungo ainda estar pouco desenvolvido na

planta hospedeira ou o microbioma dessa planta a estar a proteger.

A identificação de três espécies do género Alternaria, como A. alternata, A.

infectoria, A. tenuissima nos tecidos vegetais, veio confirmar que as mesmas espécies

podem ter características de patogénico ou saprófita consoante o estado sanitário em que

a planta hospedeira se encontra (Bart, 2003). Até ao momento, não são conhecidas

referências que atribuam a Alternaria spp. sintomatologia sugestiva de doença em

amendoeira. No entanto, com este trabalho, pode-se afirmar que se isolou Alternaria spp.

de folhas de plantas que apresentavam sintomatologia idêntica à causada por Alternaria

alternata em folhas de pessegueiro (Inoue e Nasu, 2000).

Pela análise estatística efetuada a cada uma das cultivares em estudo, e em cada

um dos locais, A e B, relativamente à abundância de fungos isolados de plantas

sintomáticas e assintomáticas, não se observaram diferenças significativas, o que pode

significar que as plantas sintomáticas poderão apresentar, apesar de um idêntico número

80

de fungos, uma maior quantidade de inoculo do fungo causador da sintomatologia

observada no campo que as assintomáticas. Esta carga de inóculo é preponderante para a

manifestação de sintomas e expressão das doenças em plantas. Na verdade, sabe-se que

o intervalo de tempo entre a infeção e o aparecimento dos sintomas visíveis nas plantas

pode estar dependente de vários fatores tais como; condições ambientais, estado da planta

e progresso da produção de inóculo por parte do agente patogénico (APS 2018).

As diferenças relativamente à abundância de fungos endofíticos obtidos dos

diferentes órgãos vegetativos, da cultivar Lauranne Avijor sintomática, no local A,

revelaram-se significativas entre o número de fungos obtidos nas raízes, troncos e folhas,

mostrando-se nestas últimas bastante maior que nas raízes e troncos. Isto vem corroborar

a sintomatologia observada no campo, em que a parte aérea destas plantas se encontravam

completamente morta. Estes tecidos mortos são muitas vezes colonizados por fungos

saprófitas que existem no meio ambiente, indo assim aumentar o número de isolados

presentes no material testado. Para além disto, sabe-se que as plantas quando infetadas

expressam uma redução das suas defesas químicas nas folhas para se auto-protegerem do

ataque dos agentes patogénicos, permitindo a entrada de saprófitas (González-Teuber et

al., 2014). As plantas assintomáticas da mesma cultivar não apresentaram diferenças

significativas entre o número de isolados dos diferentes órgãos vegetais, mostrando as

folhas como tendo menor incidência de fungos endofíticos, o que se justifica pelo estado

ainda verde e aparentemente saudável da parte aérea. No local A, as amendoeiras da

cultivar Soleta com sintomas de doença não apresentaram diferenças significativas entre

a abundância de fungos isolados dos vários órgãos vegetais testados, o que é indicativo

da igual dispersão homogenia de fungos e, portanto, o aparecimento de sintomas

associados a sua presença. As plantas assintomáticas, apresentaram diferenças

significativas na abundância de fungos entre as raízes, troncos e folhas, sendo que as

primeiras com um número maior de fungos que a parte aérea. Os valores obtidos podem

significar que as plantas assintomáticas, a curto prazo, poderão mostrar sintomas de

doença, devido à quantidade de fungos que se encontra já presente no seu sistema

radicular. Este sistema, como já foi referido, é a zona de entrada de muitos fungos do

solo, que após se instalarem nas raízes, começam a desenvolver-se e a colonizar a parte

aérea da planta.

As plantas sintomáticas e assintomáticas do local B, tanto da cultivar Lauranne

81

Avijor como da cultivar Soleta, quando analisadas estatisticamente em termos de

abundância de fungos endofíticos nos seus vários órgãos, mostraram diferenças

significativas entre a colonização das diferentes partes vegetativas testadas. No caso da

cultivar Lauranne Avijor sintomáticas e assintomáticas a colonização das raízes foi

sempre superior à apresentada na parte aérea, sendo que as plantas sintomáticas

apresentavam uma maior quantidade de isolados por órgão vegetal. As plantas da cultivar

Soleta sintomáticas, mostraram um valor ligeiramente superior de fungos endofíticos

isolados do tronco em comparação com as raízes, e ambos superiores aos valores

encontrados para as folhas. Nas plantas assintomáticas desta cultivar os valores de

colonização são aproximados nas raízes e no tronco, mas superiores às das folhas.

Estes resultados estão de acordo com os resultados obtidos por Aguilar-Trigueros e Rillig

(2016), que referem que cada planta responde diferencialmente à infeção, resultando em

diferentes padrões da comunidade microbiota apresentada nos seus tecidos.

82

6. Conclusão e Perspetivas Futuras

83

Com o presente trabalho, verificou-se que existia um problema fitossanitário

grave nas jovens plantas de amendoeira, pois foram identificados vários fungos fitopato-

génicos nos diferentes órgãos testados, raízes, troncos e folhas. Esses agentes causadores

de doença, agruparam-se sobretudo nos géneros Fusarium e Alternaria. Dentro do género

Fusarium as espécies mais prevalentes foram: F. oxysporum, F. equiseti e F. chlamydos-

porum, espécies estas também detetadas no solo e na água de rega, levando a pensar que

as fontes de inóculo poderiam estar nestes dois fatores de produção. Foram ainda deteta-

das nas plantas, outras espécies de Fusarium, como F. avenaceum e F. flocciferum, po-

dendo a sua origem estar no material de viveiro. Dentro do género Alternaria, foram

identificadas as espécies A. alternata, A. infectoria e A. tenuissima, todas estas espécies

de Alternaria têm características de patogenicidade ou de saprófitas consoante as condi-

ções da planta hospedeira. No entanto, foram descritos sintomas semelhantes aos encon-

trados nas amendoeiras testadas neste trabalho, aos quais foi atribuído infeção por estas

espécies, sendo, portanto, de considerar a possibilidade de estarem associadas aos sinto-

mas nas plantas de amendoeira. Para além das espécies de Alternaria e Fusarium referi-

das, foi ainda encontrada a espécie fitopatogénica Macrophomina faseolina, esta espécie

poderá estar entre as espécies causadoras da sintomatologia observada, uma vez que está

descrita como causadora de doenças no lenho de espécies arbóreas e arbustivas, que

quando infetadas apresentam sintomatologia idêntica à observada nas amendoeiras em

estudo neste trabalho.

Para além das espécies fitopatogénicas mais preponderantemente encontradas, fo-

ram detetadas várias espécies de fungos com características de antagonistas biológicos,

como foi o caso de Byssochlamys spectabilis e Epicoccum nigrum. Devido à jovem idade

das amendoeiras testadas e ao elevado número de espécies diferentes de fungos presentes

nos seus órgãos vegetativos, não se conseguiu concluir se estes antagonistas poderiam ou

não ter um papel protetor nas plantas. Concluiu-se então que cada planta responde com

um bioma diferente às condições a que é sujeita, seja a condições ambientais ou sanitárias.

84

Este trabalho veio trazer nova informação acerca das doenças do amendoal e dos

principais fungos que colonizam estas plantas, o que se revelou de extrema importância

para a abordagem agronómica desta nova cultura que está a ocupar uma área crescente,

não só em Portugal como também noutros países do mundo. No entanto, deixa em aberto

várias questões que seguramente abrem novas linhas de estudo, tais como:

- A realização de ensaios in vivo, com jovens plantas de amendoeira isentas de

doença, para realizar os Postulados de Koch e confirmar se alguns dos fungos fitopatogé-

nicos isolados neste estudo estão relacionados com os sintomas observados;

- Realização de testes laboratoriais para testar a capacidade antagonista de alguns

dos fungos obtidos e que já foram descritos anteriormente como tendo essas propriedades;

- Desenvolvimento de testes baseados em PCR quantitativo, para os principais

organismos fitopatogénicos encontrados, de modo a conhecer a quantidade de inoculo nas

plantas testadas, o que pode ter grande importância na definição da ocorrência da doença;

- Desenvolvimento de um teste de diagnóstico molecular para os principais fungos

fitopatogénicos encontrados e que pudesse ser posteriormente disponibilizado aos vivei-

ristas, de modo a que a produção de planta fosse cada vez mais isenta de doenças que

possam vir a comprometer o seu desempenho agronómico no campo.

85

7. Referências

86

Abdallah, A., Ahumada, M. H., & Gradziel, T. M. (1998). Oil content and fatty acid

composition of almond kernels from different genotypes and California production

regions. Journal of American Society Horticulture Science, 123, 1029–1033. Retrieved

from http://journal.ashspublications.org/content/123/6/1029.short

Afifi, A. F. (1977). Fusarium wilt of Prunus armeniaca seedlings. Zentralblatt Für

Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten Und Hygiene. Zweite

Naturwissenschaftliche Abt.: Allgemeine, Landwirtschaftliche Und Technische

Mikrobiologie, 132(2), 184–188. https://doi.org/10.1016/S0044-4057(77)80061-0

Agrios, G. N. (2005). Plant Pathology, fifth edition (Fifth Edit, Vol. 1). Dana Dreibelbis.

https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004

Aguilar-Trigueros, C. A., & Rillig, M. C. (2016). Effect of different root endophytic fungi

on plant community structure in experimental microcosms. Ecology and Evolution, 6(22),

8149–8158. https://doi.org/10.1002/ece3.2416

Aly, A. H., Debbab, A., & Proksch, P. (2011). Fungal endophytes: Unique plant

inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology, 90(6), 1829–

1845. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3270-y

Anderson, M.J., Gorley, R.N., Clarke, K.R., 2008. PERMANOVA Aþ for PRIMER:

Guide to Software and Statistical Methods. PRIMER-E, Plymouth, UK.

Borah, N., Albarouki, E., & Schirawski, J. (2018). Comparative methods for molecular

determination of host-specificity factors in plant-pathogenic fungi. International Journal

of Molecular Sciences, 19(3). https://doi.org/10.3390/ijms19030863

Bubici, G., D’Amico, M., & Cirulli, M. (2010). Field reactions of plum cultivars to the

shot-hole disease in southern Italy. Crop Protection, 29(12), 1396–1400.

https://doi.org/10.1016/j.cropro.2010.07.021

Chehri, K., Salleh, B., Soleimani, M. J., Reddy, K. R. N., & Zakaria, L. (2010).

Occurrence of Fusarium spp. associated with root tissues and rhizosphere soils of forest

trees and assessment of their pathogenicity on Prunus amygdalus seedlings. Australian

Journal of Botany, 58(8), 679–686. https://doi.org/10.1071/BT10140

87

Clarke, K., Green, R., 1988. Statistical design and analysis for a biological effects study.

Marine Ecology Progress Series 46, 213-226.

Clarke, K.R., Warwick, R.M., 2001. Changes in Marine Communities: An Approach to

Statistical Analysis and Interpretation, Second edition ed.

Climate-Data. (2018). Clima em Portalegre - Tempo, Dados climatológicos e

Temperatura Portalegre. Retrieved July 10, 2018, from

file:///C:/Users/Cláudio/Desktop/Clima em Portalegre_ Tempo, Dados climatológicos e

Temperatura Portalegre - Climate-Data.org.html

Climate-Data. (2018). Clima em Évora- Tempo, Dados climatológicos e Temperatura

Évora. Retrieved July 10, 2018, from file:///C:/Users/Cláudio/Desktop/Clima em Évora_

Tempo, Dados climatológicos e Temperatura Évora - Climate-Data.org.html

Costa, A. C. L. (2012). Influência De Dois Tipos De Cobertura Do Solo Na Produtividade

E Na Fitossanidade Do Morangueiro. Instituto Superior de Agronomia, Universidade

Técnica de Lisboa. Retrieved from

http://www.cothn.pt/publicfiles/zcqhzzudtayacj6eaz2ij5aezxp6kvu7dddea4rn.pdf

Damm, U., Crous, P. W., & Fourie, P. H. (2007). Botryosphaeriaceae as potential

pathogens of Prunus species in South Africa, with descriptions of Diplodia africana and

Lasiodiplodia plurivora sp. nov. Mycologia, 99(5), 664–680.

https://doi.org/10.3852/mycologia.99.5.664

DGADR. (2018). Nota explicativa da carta dos solos de Portugal e da carta de capacidade

de uso do solo. Retrieved July 10, 2018, from file:///C:/Users/Cláudio/Desktop/Nota

Explicativa da Carta dos Solos de Portugal e da Carta de Capacidade de Uso do Solo.html

Domingos, A. (2006). Manual de culturas, Hortícolas, volume I (3a edição). Lisboa:

Editorial Presença.

Doyle J, 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.

Phytochemical Bulletin 19: 11e15.

ESRI 2011. ArcGIS Desktop: Release 10. Redlands, CA: Environmental Systems

88

Research Institute.

Giosuè, S., Spada, G., Rossi, V., Carli, G., & Ponti, I. (2000). Forecasting infections of

the leaf curl disease on peaches caused by Taphrina deformans. European Journal of Plant

Pathology, 106(6), 563–571. https://doi.org/10.1023/A:1008778814623

Gramaje, D., Agustí-Brisach, C., Pérez-Sierra, A., Moralejo, E., Olmo, D., Mostert, L.,

… Armengol, J. (2012). Fungal trunk pathogens associated with wood decay of almond

trees on Mallorca (Spain). Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, 28,

1–13. https://doi.org/10.3767/003158512X626155

Grove, G. G. (2002). Influence of temperature and wetness period on infection of cherry

and peach foliage by Wilsonomyces carpophilus. Canadian Journal of Plant Pathology,

24(1), 40–45. https://doi.org/10.1080/07060660109506969

Gure, A., Slippers, B., & Stenlid, J. (2005). Seed-borne Botryosphaeria spp. from native

Prunus and Podocarpus trees in Ethiopia, with a description of the anamorph Diplodia

rosulata sp. nov. Mycological Research, 109(9), 1005–1014.

https://doi.org/10.1017/S0953756205003266

Hartill, W. F. T., & Broadhurst, P. G. (1989). Fusarium avenaceum as a pathogen of

stonefruit in New Zealand. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science,

17(3), 293–295. https://doi.org/10.1080/01140671.1989.10428046

INOUE, K., & NASU, H. (2000). Black Spot of Peach Caused by Alternaria alternata

(Fr.). Journal of General Plant Pathology, 66, 18–22.

Instituto Nacional de Estatística, I. P. (2016). Estatísticas Agrícolas 2016. (I. P. Instituto

Nacional de Estatística, Ed.). Lisboa, Portugal.

Instituto Português do Mar e da Atmosfera. (2018). Normais Climatológicas - 1971-2000

- Évora. Retrieved July 10, 2018, from file:///C:/Users/Cláudio/Desktop/IPMA - 007.html

Instituto Português do Mar e da Atmosfera. (2018). Normais Climatológicas - 1971-2000

- Portalegre. Retrieved July 10, 2018, from file:///C:/Users/Cláudio/Desktop/IPMA -

015.html

89

Kester, Dale E.; Gradziel, Thomas M.; Grassely, C. (1991). Almonds (prunus).pdf. In J.

R. Eds, Moore; J.N. and Ballington (Ed.), Genetic Resources f Temperate Fruit and Nut

Crops 2 (pp. 701–758). Wagemning, The Netherlands: International Society for

Horticultural Science.

Lu, Y., Chen, C., Chen, H., Zhang, J., & Chen, W. (2012). Isolation and identification of

endophytic fungi from Actinidia macrosperma and investigation of their bioactivities.

Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012.

https://doi.org/10.1155/2012/382742

M.K, V. (2015). Almond Production Technology. In A. S. SK Singh, AD Munshi, KV

Prasad (Ed.), Training manual on teaching of post-graduate courses in horticulture (Fruit

Science) (1st ed., pp. 274–280). Post Graduate School, Indian Agricultural Research

Institute, New Delhi.

Madrigal, C., Tadeo, J. L., & Melgarejo, P. (1991). Relationship between flavipin

production by Epicoccum nigrum and antagonism against Monilinia laxa. Mycological

Research, 95(12), 1375–1381. Retrieved from https://doi.org/10.1016/S0953-

7562(09)80388-2

Marek, S. M., Yaghmour, M. A., & Bostock, R. M. (2013). Fusarium spp.,

Cylindrocarpon spp., and Environmental Stress in the Etiology of a Canker Disease of

Cold-Stored Fruit and Nut Tree Seedlings in California. Plant Disease, 97(2), 259–270.

https://doi.org/10.1094/PDIS-04-12-0355-RE

Mcmichael, A. P., Robinson, S., & Services, H. (n.d.). All About Almonds Fact Sheet 07

– Almond Bud Initiation and Development, 1–10.

Miao, C.-P., Qiao, X.-G., Zheng, Y.-K., Chen, Y.-W., & Xu, L.-H. (2015). First Report

of Fusarium flocciferum Causing Root Rot of Sanqi (Panax notoginseng) in Yunnan,

China. Plant DISEASE, 99(11), 1650. Retrieved from 10.1094/PDIS-11-14-1168-PDN

Micke, W. C. (1996). Almond Production Manual. (U. of C. Division of Agricuture and

Natural Resources, Ed.). Publication 3364. Retrieved from

https://books.google.pt/books?id=3dN5Yw_y8UEC&pg=PP3&lpg=PP1&focus=viewpo

90

rt&hl=pt-PT&output=html_text

MITRE jr., I., TRIPON, A., MITRE, I., & MITRE, V. (2015). The Response of Several

Plum Cultivars to Natural Infection with <i>Monilinia laxa, Polystigma rubrum

</i>and<i> Stigmina carpophila</i> Notulae Scientia Biologicae, 7(1),

136–139. https://doi.org/10.15835/nsb.7.1.9555

Moreira, L. M., May-De Mio, L. L., & Valdebenito-Sanhueza, R. M. (2008). Fungos

antagonistas e efeito de produtos químicos no controle da podridão parda em pomar de

pessegueiro. Summa Phytopathologica, 34(3), 272–276. https://doi.org/10.1590/S0100-

54052008000300016

Neda, H., Halász, K., Pósa, T., Péter, G., Hrotkó, K., Gáspár, L., & Lukács, N. (2011).

Diversity of endophytic fungi isolated from cherry ( Prunus avium ), 15(2), 1–6.

O’Donnell, K., & Cigelnik, E. (1997). Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types

within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous. Molecular

Phylogenetics and Evolution, 7(1), 103–116. https://doi.org/10.1006/mpev.1996.0376

Oliveira, I. (2011). Sobre – Cursos Técnicas de Regadio (2a edição). Lisboa.

Patel, C., Yadav, S., Rahi, S., & Dave, A. (2013). Studies on Biodiversity of Fungal

Endophytes of Indigenous Monocotaceous and Dicotaceous Plants and Evaluation of

their Enzymatic Potentialities. International Journal of Scientific and Reserch

Publication, 3(7), 1–5.

Penrose, L. J. (1990). Podosphaera tridactyla : cleistothecial state of plum powdery

mildew found in New South Wales. Australasian Plant Pathology, 19(3), 68–70.

https://doi.org/10.1071/APP9900068

Pereira, L. S. (2004). Necessidades de Àgua e Métodos de Rega. Euroagro. Lisboa:

Publicações Europa-América.

PIMENTA, R. S., MOREIRA da SILVA, J. F., BUYER, J. S., & JANISIEWICZ, W. J.

(2012). Endophytic Fungi from Plums (Prunus domestica) and Their Antifungal Activity

against Monilinia fructicola. Journal of Food Protection, 75(10), 1883–1889.

91

https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-12-156

Pimenta, R., Silva, J. da, Buyer, J., & Janisiewicz, W. (2012). Endophytic fungi from

plums (Prunus domestica) and their antifungal activity against Monilinia fructicola.

Journal of Food Protection, 75(10), 1883–1889. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-

12-156

Potter, D., Eriksson, T., Evans, R. C., Oh, S., Smedmark, J. E. E., Morgan, D. R., …

Campbell, C. S. (2007). Phylogeny and classification of Rosaceae. Plant Systematics and

Evolution, 266(1–2), 5–43. https://doi.org/10.1007/s00606-007-0539-9

Raja, H. A., Miller, A. N., Pearce, C. J., & Oberlies, N. H. (2017). Fungal Identification

Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community. Journal

of Natural Products, 80(3), 756–770. Retrieved from

https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/20013002738

Rodrigo, S., Santamaria, O., Halecker, S., Lledó, S., & Stadler, M. (2017). Antagonism

between Byssochlamys spectabilis (anamorph Paecilomyces variotii) and plant

pathogens: Involvement of the bioactive compounds produced by the endophyte. Annals

of Applied Biology, 171(3). https://doi.org/10.1111/aab.12388

Rodriguez, R., & Redman, R. (2008). More than 400 million years of evolution and some

plants still can’t make it on their own: Plant stress tolerance via fungal symbiosis. Journal

of Experimental Botany, 59(5), 1109–1114. https://doi.org/10.1093/jxb/erm342

Saikkonen, K., Wäli, P., Helander, M., & Faeth, S. H. (2004). Evolution of endophyte-

plant symbioses. Trends in Plant Science, 9(6), 275–280.

https://doi.org/10.1016/j.tplants.2004.04.005

SARR, M. P., NDIAYE, M., GROENEWALD, J. Z., & CROUS, P. W. (2014). Genetic

diversity in Macrophomina phaseolina, the causal agent of charcoal rot. Phytopathologia

Mediterranea, 53(2), 250–268. https://doi.org/10.14601/Phytopathol

Schardl, C., & An, Z. (1993). Molecular Biology and Genetics of Protective Fungal

Endophytes of Grasses. In J. K. Setlow (Ed.), Genetic Engineering (Vol. 15, pp. 191–

212). Springer, Boston, MA. https://doi.org/10.1007/978-1-4899-1666-2_9

92

Schulz, B., & Boyle, C. (2006). What are Endophytes? In Microbial Root Endophytes

(Vol. 9). https://doi.org/10.1007/3-540-33526-9

Schulze-Menz G. K. (1964) Rosaceae. In: Melchior H. (ed.) Engler’s Syllabus der

Pflanzenfamilien II. 12th ed. Gebru¨ der Borntraeger, Berlin, pp.209–218

SEIDLE, A. J. (2013). Etiology, Epidemiology, and Management of Fusarium spp.

Causing Cryptic Cankers in Cold-stored, Bare-Root Propagated Almond Trees in

California Nurseries. University of California.

Selosse, M. A., Baudoin, E., & Vandenkoornhuyse, P. (2004). Symbiotic

microorganisms, a key for ecological success and protection ofplants. Comptes Rendus -

Biologies, 327(7), 639–648. https://doi.org/10.1016/j.crvi.2003.12.008

Sessa, L., Abreo, E., Bettucci, L., & Lupo, S. (2016). Botryosphaeriaceae species

associated with wood diseases of stone and pome fruits trees: symptoms and virulence

across different hosts in Uruguay. European Journal of Plant Pathology, 146(3), 519–530.

https://doi.org/10.1007/s10658-016-0936-4

Shaw, A. D., Adaskaveg, J. E., & Ogawa, J. M. (1990). Influence of Wetness Period and

Temperature on Infection and Development of Shot-Hole Disease of Almond Caused by

Wilsonomyces carpophilus. Phytopathology (USA), 80(8), 749–756.

Stȩpniewska, Z., & Kuåniar, A. (2013). Endophytic microorganisms - Promising

applications in bioremediation of greenhouse gases. Applied Microbiology and

Biotechnology, 97(22), 9589–9596. https://doi.org/10.1007/s00253-013-5235-9

STRAND, L., & OHLENDORF, B. (2002). Integrated Pest Management for Almonds

(2nd ed.). Division of Agriculture and Natural Resources University of California.

Sumner, D. A., Matthews, W. A., Medellín-Azuara, J., & Bradley, A. (2014). The

Economic Impacts of the California Almond Industry A Report Prepared for the Almond

Board of California. The Economic Impacts of the California Almond Industry A Report

Prepared for the Almond Board of California Daniel (Vol. 1). Retrieved from

http://aic.ucdavis.edu/almonds/Economic Impacts of California Almond Industry_Full

Report_FinalPDF_v2.pdf

https://doi.org/10.1007/3-540-33526-9

93

Syrop, M., & BECKET, A. (1976). Leaf curl disease of almond caused by Taphrina

deformans . III. Ultrastructural cytology of the pathogen. Canadian Journal of Botany,

54(3–4), 293–305. Retrieved from 10.1139/b76-027

Tavares, S., Inácio, J., Fonseca, A., & Oliveira, C. (2004). Direct detection of Taphrina

deformans on peach trees using molecular methods. European Journal of Plant Pathology,

110, 973–982.

Thakkar, A., & Saraf, M. (2015). Development of microbial consortia as a biocontrol

agent for effective management of fungal diseases in Glycine max L. Archives of

Phytopathology and Plant Protection, 48(6), 459–474.

https://doi.org/10.1080/03235408.2014.893638

The American Phytopathological Society. (2018). Plant Disease Epidemiology:

Temporal Aspects. Retrieved September 29, 2018, from

https://www.apsnet.org/edcenter/advanced/topics/EpidemiologyTemporal/Pages/Mathe

maticalModels.aspx

Thomma, B. P. H. J. (2003). Alternaria spp.: from general saprophyte to specific parasite.

Molecular Plant Pathology, 4(4), 225–236.

Torres, J.M.O.; dela Cruz, T. E. . (2015). Antibacterial activities of fungal endophytes

associated with the Philippine endemic tree, Canarium ovatum. Mycosphere, 6(3), 266–

273. https://doi.org/10.5943/mycosphere/6/3/4

Traquair, J. A., & White, G. P. (1992). Cylindrocarpon rot of fruit trees in cold storage.

Canadian Journal of Plant Pathology, 14(4), 310–314.

https://doi.org/10.1080/07060669209500869

Úrbez-Torres, J. R., Boulé, J., Haag, P., Hampson, C., & O’Gorman, D. T. (2016). First

Report of Root and Crown Rot Caused by Fusarium oxysporum on Sweet Cherry (Prunus

avium) in British Columbia. Plant Disease, 100(4), 855. https://doi.org/10.1094/PDIS-

08-15-0932-PDN

Validov, S. Z., Kamilova, F. D., & Lugtenberg, B. J. J. (2011). Monitoring of pathogenic

and non-pathogenic Fusarium oxysporum strains during tomato plant infection. Microbial

94

Biotechnology, 4(1), 82–88. https://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00214.x

van Niekerk, J. M., Fourie, P. H., Halleen, F., & Crous, P. W. (2006). Botryosphaeria spp.

as grapevine trunk disease pathogens. Phytopathologia Mediterranea, 45(SUPPL. 1), 43–

54. https://doi.org/10.1094/PDIS.2000.84.9.1031

Varanda, C. M. R., Oliveira, M., Materatski, P., Landum, M., Clara, M. I. E., & Félix, M.

do R. (2016). Fungal endophytic communities associated to the phyllosphere of grapevine

cultivars under different types of management. Fungal Biology, 120(12), 1525–1536.

https://doi.org/10.1016/j.funbio.2016.08.002

Wang, F., Zhao, L., Li, G., Huang, J., & Hsiang, T. (2011). Identification and

Characterization of Botryosphaeria spp. Causing Gummosis of Peach Trees in Hubei

Province, Central China. Plant Disease, 95(11), 1378–1384.

https://doi.org/10.1094/PDIS-12-10-0893

Weaver, D. J. (1979). Role of conidia of Botryosphaeria dothidea in the natural spread of

peach tree gummosis. Phytopathology, 69(4), 330–334. https://doi.org/10.1094/Phyto-

69-330

Weaver, D. J. (1974). A Gummosis Disease of Peach Trees Caused by Botryosphaeria

dothidea. In Phytopathology (Vol. 64, pp. 1429–1432). https://doi.org/10.1094/Phyto-64-

1429

White T, Bruns T, Lee S, Taylor J, 1990. Amplification and direct sequencing of fungal

ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White

TJ (eds), PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, Inc, New

York, pp. 315e322.

Yousefi, A., & Shahri, M. H. (2014). Shot hole disease , survival and pathogenicity of the

causal agent on stone fruit trees in Northeast Iran. Journal of Crop Protection, 3(4), 563–

571.

Zuccaro, A., Lahrmann, U., & Langen, G. (2014). Broad compatibility in fungal root

symbioses. Current Opinion in Plant Biology, 20, 135–145.

https://doi.org/10.1016/j.pbi.2014.05.013

https://doi.org/10.1016/j.pbi.2014.05.013

96

8. Anexos

97

Anexo I – Carta da Solos do Local A

98

Anexo II – Carta de Solos do Local B

Etiologia e epidemiologia associadas à mortalidade da ...

Documents

Transcript of Etiologia e epidemiologia associadas à mortalidade da ...