Estudo toxicológico e farmacológico da · 2019-10-25 · A minha família e amigos,...
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Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Estudo toxicológico e farmacológico da
Vernonia brasiliana (L) Druce.
DANIELLI CÂNDIDA DE OLIVEIRA
RECIFE - PE
Fevereiro, 2007
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
DANIELLI CÂNDIDA DE OLIVEIRA
Estudo toxicológico e farmacológico da
Vernonia brasiliana (L) Druce.
RECIFE - PE
Fevereiro, 2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas, do Departamento de Ciências
Farmacêuticas, da Universidade Federal de Pernambuco, como
parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Área de Concentração: Avaliação e Obtenção de Produtos
Bioativos e Naturais.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Oliveira, Danielli Cândida de Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia
brasiliana (L) Druce / Danielli Cândida de Oliveira. – Recife: O Autor, 2007.
viii, 82 folhas : il.,fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007. Inclui bibliografia. Farmacologia – Vernonia brasiliana (L.) Druce. 2.
Vernonia brasiliana (L.) Druce - Toxidade. 3. Vernonia brasiliana (L.) Druce – Estudo farmacológico. I. Título.
615.01 CDU (2.ed.) UFPE 615.1 CDD (22.ed.) C
CCS2007-79
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
REITOR
Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Gilsom Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Jane Sheila Higino
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Samuel Daniel de Souza Filho
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Pedro José Rolim Neto
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Beat Saegesser Santos
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
“Tudo vale a pena
quando a alma não é pequena".
Fernando Pessoa
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Dedico este trabalho aos meus pais, Gelmires C. de
Oliveira (in memoriam) e Laudicéa Mª de Oliveira, a
minha avó Maria Luiza e aos meus queridos mestres.
A todos vocês minha eterna admiração e gratidão!
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
AGRADECIMENTOS
Ao meu maravilhoso Deus, por me suster nessa longa jornada. A Ele
toda a honra e toda a glória!
Aos meus pais, os quais nunca mediram esforços para propiciar
minha maior riqueza: a educação!
A minha família e amigos, principalmente ao meu irmão Demétrio
pela “paciência” e auxílio (por pura e espontânea pressão!) com os
experimentos nos fins de semana e feriados.
A minha orientadora Prof. Ivone de Souza, pela paciência, incentivo,
presença, carinho, amizade e total apoio.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. George Jimenez (DFMA – UFRPE),
pela atenção, conselhos e pelo sacrifício sobre-humano na finalização
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Catão Barbosa (Dept. de Biofísica/UFPE), agradeço a
amizade, apoio e incentivo.
Aos meus amigos de graduação Ísis Amorim (Maga), Wagner Lira
(Mago) e Andreza Barros (Dêza), obrigada pela amizade sincera e por
tantos momentos maravilhosos do nosso quarteto.
As Professoras Fálba Bernadete dos Anjos (Dept. de Histologia e
Embriologia/UFPE), Eugênia Barza (Centro de Ciências Jurídicas/UFPE) e
Rita de Cássia Carvalho (Instituto de Ciências Biológicas/UPE). Agradeço
por tudo, principalmente pelo incentivo nos momentos mais difíceis.
Ao meu querido mestre Prof. Severino do Monte Prazeres “Biu” (in
memoriam) – Dept. de Botânica/UFPE, pela amizade, conselhos e lições de
vida.
Aos funcionários do Dept. de Histologia e Embriologia: Maria de
Fátima do Nascimento, Edna G. da Silva, Marco Antônio F. de Amorim e
Marlene S. do Nascimento. Agradeço pelo carinho, amizade e por todos os
momentos alegres, os quais tanto me ajudaram. Também pela colaboração
técnica (e paciência) de D. Fátima para realização deste trabalho.
Agradeço aos amigos companheiros de laboratório Janilsom Félix,
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Karla Mirella, Evandro Valentim, Isla Bastos, Karina Kanuto, Maria
Gabriela, Cosme Castro, Vanessa Dória, Thiago Araújo e Welingthon
Fontes.
À minha amiga Bete (Elisabete Moreira) e aos “fiéis escudeiros”
Renato Gomes (Pôia) e Sérgio Nóbrega pelo apoio incondicional,
principalmente nos finais de semana e feriados.
Aos novos amigos que adquiri, companheiros da Pós-graduação: Mª
Rita de Kássia C. de Farias, Cecília Castelo Branco, Laurymar, Jackeline
Silva, Ana Pávla, Elisângela Silva, Aldo Passilongo, Rômulo Valente, José
Ferreira, Jovita Braga e José Justino.
Ao Prof. Dr. Parviz Afiatpour e a técnica Rejane Silva do Dept. de
Fisiologia e Farmacologia pelo auxílio, orientação e incentivo.
À grande paciência e apoio do técnico Alex B. da Silveira (Dept. de
Ciências Farmacêuticas/UFPE).
Aos Professores Dr. Roberto José V. de Mello (Dept. de
Patologia/UFPE), Dr. Diógenes L. da Mota (Dept. de Histologia e
Embriologia/UFPE) e a técnica Silvana T. Paz (Dept. de Patologia/UFPE)
pela colaboração na realização deste trabalho.
Ao meu amigo Luiz Henrique G. Dore (mestrado em
Biometria/UFRPE), pelo apoio e esclarecimentos.
As amizades “além do Campus” de Neide e Beto.
Aos professores do programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas.
Gostaria novamente de agradecer aos Mestres: Catão Barbosa,
Severino Prazeres (in memoriam), Ivone Souza, George Jimenez, Parviz
Afiatpour e ao Prof. Dr. Romildo A. Nogueira (DFMA – UFRPE). Foi com a
simplicidade e a paixão que vocês sempre demonstraram pela vida
científica que pude realmente conhecer o significado da palavra “Mestre”!
Muito obrigada a todos vocês!! Que Deus lhes abençoem sempre!!
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................III
LISTA DE FIGURAS ..............................................................................................IV
LISTA DE TABELAS................................................................................................V
RESUMO ..............................................................................................................VI
ABSTRACT...........................................................................................................VII
INTRODUÇÃO .....................................................................................................01
REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................05
ESTUDOS SOBRE A Vernonia brasiliana (L.) Druce............................................06
BOTÂNICO...........................................................................................................06
FITOQUÍMICO......................................................................................................08
FARMACOLÓGICO...............................................................................................09
TOXICOLÓGICO...................................................................................................12
OBJETIVO...........................................................................................................13
GERAL ................................................................................................................14
ESPECÍFICO........................................................................................................14
ARTIGO I: AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DO EXTRATO
HIDROETANÓLICO DA Vernonia brasiliana (L) Druce..........................................15
RESUMO..............................................................................................................16
INTRODUÇÃO.......................................................................................................17
METODOLOGIA....................................................................................................18
RESULTADOS.......................................................................................................19
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.................................................................................21
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................24
ARTIGO II: AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DO
EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Vernonia brasiliana (L.) Druce....................... 30
RESUMO..............................................................................................................31
INTRODUÇÃO......................................................................................................32
METODOLOGIA....................................................................................................34
RESULTADOS......................................................................................................35
DISCUSSÃO.........................................................................................................36
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................39
ARTIGO III: ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DA Vernonia brasiliana (L.) Druce...45
RESUMO..............................................................................................................46
INTRODUÇÃO.......................................................................................................47
METODOLOGIA....................................................................................................48
RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................51
1.
2.
2.1.
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
3.
3.1.1
3.1.2
4.
5.
6.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................56
CONCLUSÃO........................................................................................................66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................68
7.
8.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
LISTA DE ABREVIATURAS
AN
ºC
CD
CG
COBEA
DL50
DS
EHE
g/Kg
GCc
GCs
GPc
GPs
GTc
GTs
HE
I
mg/Kg
ml
O2.l.h-1.Kg-1
%
p/v
S
TXM
TW%
v.i.p.
Área necrótica.
Graus Celsius
Células disformes
Células gigantes
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
Dose letal de 50%
Dilatação da parede sinusoidal
Extrato hidroetanólico
Grama por quilograma
Grupo controle portadores de Carcinoma de Ehrlich
Grupo controle portadores do Sarcoma 180
Grupo Padrão Carcinoma de Ehrlich
Grupo Padrão Sarcoma 180
Grupo portador de Carcinoma tratado com EHE
Grupo portador de Sarcoma 180 tratado com EHE
Hematoxilina-Eosina
Invasão de tecidos
Miligrama por quilograma
Mililitro
Litros de oxigênio por hora
Percentagem
Peso por volume
Sinusóides
Taxa Metabólica Específica
Percentual de inibição tumoral
Via intraperitoneal
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
LISTA DE FIGURAS
Revisão da Literatura Figura 1 Vernonia brasiliana (L.) Druce. .......................................................................... Figura 2 Saponinas triterpênicas isoladas da Vernonia brasiliana..................................... Artigo I Figura 1 Cortes de fígados de camundongos machos (Mus musculus)...............................
Artigo II Gráfico 1 Representação das curvas de variação que descrevem o efeito do EHE das
folhas de V. brasiliana nas dose de 50, 75 e 100mg/kg, via intraperitoneal, no volume do edema de pata induzido por carragenina em ratos Wistar machos adultos..............................................................................................................
Gráfico 2 Representação das curvas de variação que descrevem o efeito dos fármacos padrões indometacina (10mg/Kg), dexametasona (2mg/Kg) e nimesulida (10mg/Kg), via intraperitoneal, no volume do edema de pata induzido por carragenina em ratos Wistar machos adultos.....................................................
Gráfico 3 Relação de equivalência entre as médias dos volumes do edema de pata induzido por carragenina de ratos Wistar machos tratados com 2mg/Kg de dexametasona e 150mg/Kg do EHE das folhas de V. brasiliana.......................... Artigo III
Gráfico 1 Comparação dos Percentuais de Inibição Tumoral (TW%) em camundongos albinos Swiss machos, portadores de Sarcoma 180, tratados com o extrato de V. brasiliana nas dose de 31,25mg/kg (GT1S), 62,5mg/kg (GT2S) e Metotrexato (GPS), por via intraperitoneal. (n=5/grupo).......................................................................................................
Gráfico 2 Comparação dos Percentuais de Inibição Tumoral (TWI%) em camundongos albinos Swiss machos, portadores de Carcinoma de Ehrlich, tratados com o extrato de V. brasiliana nas dose de 31,25mg/kg (GT1C), 62,5mg/kg (GT2C), 100mg/kg (GT3C) e Metotrexato (GPC), por via intraperitoneal. (n=5/grupo).......................................................................................................
Gráfico 3 Razão entre as Taxas Metabólicas Específicas do Sarcoma 180 e a do animal portador (TXMTS /TXMAS) em função das doses do extrato de V. brasiliana..........................................................................................................
Gráfico 4 Razão entre as Taxas Metabólicas Específicas do Carcinoma de Ehrlich e a do animal portador (TXMTC /TXMAC) em função das doses do extrato de V. brasiliana..........................................................................................................
Gráfico 5 Comparação entre as respostas metabólicas dos tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich ao extrato de V. brasiliana...............................................
Figura 1 Fotomicrografias obtidas de Sarcoma 180 de camundongos albinos Swiss (Mus Muculus) dos grupos Controle (A), Padrão (B) e Tratados com o extrato de V. brasiliana nas doses de 31,25mg/Kg (C) e 62,5mg/Kg (D).....................................................................................................................
Figura 2 Fotomicrografias obtidas de Carcinoma de Ehrlich de camundongos albinos Swiss (Mus Muculus) dos grupos Controle (A), Padrão (B) e Tratados com o extrato de V. brasiliana nas doses de 31,25 mg/Kg (C), 62,5 mg/Kg (D e E) e 100 mg/Kg........................................................................................................
07 09 29 43 43 44 61 62 62 63 63 64 65
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
LISTA DE TABELAS
Artigo I Tabela 1 Sinais clínicos de toxicidade observada em camundongos albinos Swiss (Mus
musculus) tratados com o extrato hidroetanólico de Vernonia brasiliana, v.i.p, com doses que não ocasionaram óbitos...........................................................
Tabela 2 Sinais clínicos de toxicidade observada em camundongos albinos Swiss (Mus musculus) tratados com o extrato hidroetanólico de Vernonia brasiliana, v.i.p, com doses que ocasionaram óbitos..................................................................
Artigo II Tabela I Volumes dos edemas induzido por injeção subplantar de carragenina nas
patas de ratos Wistar machos......................................................................... Tabela II Comparação dos tempos de efeito máximo (Tmax) da resposta antiinflamatória
dos tratamentos com o EHE de V. brasiliana, indometacina, dexametasona e nimesulida no modelo do edema de pata induzido por carragenina, v.i.p................................................................................................................ Artigo III
Tabela 1 Média e desvio padrão dos pesos dos animais (PAS) (camundongos Mus Musculus albinos Swiss), dos Sarcomas 180 (PTS) e da relação PTS/PAS dos grupos Controle (GCS), Padrão (GPS) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1S e GT2S), todas as drogas administradas intraperitonialmente.......................................................................................
Tabela 2 Média e desvio padrão dos pesos dos animais (PAC) (camundongos Mus Musculus albinos Swiss), dos Carcinomas de Ehrlich (PTC) e da relação PTC/PAC dos grupos Controle (GCC), Padrão (GPC) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1C, GT2S e GT3C), todas as drogas administradas intraperitonialmente.......................................................................................
Tabela 3 Média e desvio padrão das Taxas Metabólicas Específicas dos animais (TXMAS), dos tumores Sarcoma 180 (TXMTS) e da razão entre TXMTS/TXMAS dos grupos Controle (GCS), Padrão (GPS) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1S e GT2S)...................................................................................
Tabela 4 Média e desvio padrão das Taxas Metabólicas Específicas dos animais (TXMAC), dos tumores Carcinoma de Ehrlich (TXMTC) e da razão entre TXMTC/TXMAC dos grupos Controle (GCC), Padrão (GPC) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1C, GT2C e GT3C).....................................................
Tabela 5 Valores obtidos da razão entre a Taxa Metabólica Específica do tumor e a do animal (TXMT/TXMA) para as linhagens tumorais sarcoma e carcinoma, em função do tratamento com o extrato hidroetanólico (EHE) das folhas da V. brasiliana........................................................................................................
27 28 42 42 60 60 60 61 61
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
RESUMO
Vernonia brasiliana é um arbusto perene que varia entre 0,5 e 2,5m de altura – conhecida popularmente por assa-peixe, hervea-préa ou tramanhém – utilizada principalmente no tratamento de doenças do sistema respiratório e digestivo. Estudos científicos já comprovaram atividades antimalárica e antimicrobiana deste vegetal. O nosso trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda e as atividades farmacológicas (antiinflamatória e antineoplásica em roedores) das folhas da V. brasiliana. Foram realizados ensaios de toxicidade aguda, por via intraperitoneal, com notificação das alterações comportamentais resultantes da administração de cada dose. Os animais tratados apresentaram reações tóxicas, sendo as reações comportamentais excitatórias e estimulantes os efeitos mais pronunciados. Verificamos também efeitos depressores e a taxa de mortalidade cresceu progressivamente com o aumento da dose. Os dados histológicos demonstraram que todos os animais que receberam o EHE de V. brasiliana apresentaram fígado com algum grau de congestão vascular. O aparecimento de novos efeitos adversos após 24h da administração e a permanência de vários sintomas (72h) demonstraram que a droga possui reações cumulativas. De acordo com a DL50 obtida, o extrato de V. brasiliana pode ser considerado moderadamente tóxico quando administrado por via intraperitoneal. Na avaliação da atividade antiinflamatória utilizou-se o modelo de edema de pata induzido por carragenina em ratos, com administração do extrato por via intraperitoneal. Os resultados encontrados apresentaram indicativos de combate ao processo inflamatório numa ação tardia, que foi conferido a partir da 5ª hora após administração da maior dose estudada (150mg/Kg). Em relação a atividade antineoplásica frente as linhagens Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich, o extrato produziu significativa redução dos tumores, com 93,88% de inibição tumoral para os animais portadores do Sarcoma 180 (31,25mg/kg) e 86,70% para os portadores do Carcinoma de Ehrlich (62,5 mg/Kg). A análise histopatológica demonstrou que o extrato ocasionou um maior número de áreas necróticas, em ambas as linhagens. Ao analisarmos a especificidade tumor-hospedeiro de cada linhagem em relação às diferentes doses de V. brasiliana, observamos que o extrato apresentou efeito mais significante frente ao Sarcoma 180 do que sobre o Carcinoma de Ehrlich. Palavras-chave: Vernonia brasiliana (L.) Druce; Asteraceae; Toxicidade Aguda; DL50; Hepatotoxicidade; Atividade Antiinflamatória; Câncer; Sarcoma; Carcinoma.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
ABSTRACT Vernonia brasiliana is a perennial shrub that varies between 0,5 and 2,5m of height - known popularly by assa-peixe, hervea-préa or tramanhém - used mainly in the treatment of illnesses of the respiratory and digestive system. Scientific studies already proved antimalarial and antimicrobial activities of this plant. The objective of this work was to evaluate the acute toxicity and the pharmacological activities (anti-inflammatory and antineoplasic in rodents) of leaves of the V. brasiliana. Acute toxicity assays were accomplished, by intraperitoneal administration, with notification of the alterations in the behavior's reactions that were resulting of the administration of each dose. The treated animals presented toxic reactions, and the behavior's reactions excitatory and stimulants were the most pronounced effects. We also verified depressors effects and the mortality rate grew progressively with the increase of the dose. The histologics data demonstrated that all the animals that received EHE of V. brasiliana presented liver with some degree of vascular congestion. The appearance of new adverse effect after 24h of the administration and the permanence of some symptoms (72h) demonstrated that the drug possess cumulative reactions. In accordance with the gotten DL50, the extract of V. brasiliana can be considered moderately toxic when administered intraperitoneally. In the evaluation of the anti-inflammatory activity was used a carrageenan-induced by rat paw model, with intraperitoneal administration of the extract. The found results presented indicative of combat to the inflammatory process in a later action, beginning in the 5th hour after administration of the biggest studied dose (150mg/Kg). In relation to antineoplasic activity in the tumor cell lines Sarcoma 180 and Ehrlich´s Carcinoma, the extract presented significant reduction of the tumors, with 93,88% of tumoral inhibition percentage for the bearers animals of the Sarcoma 180 (31,25mg/kg) and 86,70% for the bearers of the Ehrlich´s Carcinoma (62,5 mg/Kg). The histopathologic analysis demonstrated that there were a great number of necrotic areas in both lines. When analyzing the tumor-host specificity of each line in relation to the different doses of V. brasiliana, it was observed that the extract presented effect more significant front to the Sarcoma 180 than on the Ehrlich's Carcinoma. Keywords: Vernonia brasiliana (L.) Druce; Asteraceae; Acute Toxicity; DL50; Hepatotoxicity; Anti-inflammatory Activity; Cancer; Sarcoma; Carcinoma.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais para tratamento, cura e
prevenção de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal
da humanidade. Em todas as fases do desenvolvimento de várias
civilizações pode-se observar que sempre prevaleceu uma estreita relação
entre o homem e as plantas (David & David 2002, Veiga Junior & Pinto
2005).
O primeiro relato de estudo sistemático de plantas medicinais
ocorreu no império de Shennung, realizado em cerca de 2700 a.C. Dentre
as 365 drogas mencionadas no Inventário de Shennung, várias
substâncias são conhecidas e utilizadas atualmente para os mesmos
propósitos, como exemplos temos a morfina (Papaver somniferum)
utilizada para analgesia, a efedrina (encontradas em espécies tais como
Ephedra) no tratamento de asma e o óleo de rícino (Ricinus communis)
como purgativo (David & David 2002).
O Papiro Médico Egípcio de Smith, datado de aproximadamente
1600 a.C. também é um importante registro sobre o uso específico de
drogas vegetais. Já o Papiro de Ebers (1550 a.C.) lista algo como 700
remédios, suas preparações e aplicabilidade, onde essas preparações
variavam desde místico (osso da coxa de um homem enforcado) a drogas
bastante familiares, como o ópio e o óleo de rícino (Sutter & Walker 1999).
A cultura grega antiga muito contribuiu para o desenvolvimento da
farmácia e das drogas. A influência de Galeno (130-201 d.C.) na medicina
persistiu até os anos de 1500 e ainda pode ser sentida hoje com o
emprego de misturas herbáticas. Já os romanos organizaram e
regularizaram a prática médica, incluindo o uso de drogas. Teofrastos
(372-287 a.C.) relacionou tudo que era conhecido sobre plantas
medicinais e Dioscorides (57 d.C.), o cirurgião de Nero, utilizou esta lista
como base para o compêndio de substâncias utilizadas como
medicamento que descreveu aproximadamente 500 plantas e como
preparar remédios a partir delas (Sutter & Walker 1999).
Há evidencias de que o homem ainda na idade Antiga reconheceu a
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
relação dose-efeito das plantas, principalmente devido à utilização destas
com fins medicinais, de rituais de magia e em envenenamento como
exemplos da Mandragora officinarum (mandrágora), Atropa belladona
(beladona) e Hyoscyamus niger (meimendro), conhecidas fontes de
atropina e escopolamina (David & David 2002, Sutter & Walker 1999).
Muitos fármacos atuais derivaram direta ou indiretamente de
substâncias produzidas por plantas superiores. É evidente o
ressurgimento do interesse do segmento industrial por produtos naturais
como fonte de modelos de fármacos e como matéria-prima para
desenvolvimento de fitoterápicos (Shu 1998, Harvey 2000, David & David
2002, Schenkel et al. 2001). A grande quantidade e o progresso de
pesquisas clínicas, principalmente na área dos agentes anticancerígenos
(taxol, podofilotoxina e camptotecinas) e dos antimaláricos (artemisinina)
reforçam a importância do estudo de produtos naturais, principalmente
utilizando-se os conhecimentos etnobotânicos (Sutter & Walker 1999).
O Brasil é o país com maior diversidade genética e vegetal, com mais
de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350-550.000
(Dias 1996). O mercado para terapias à base de plantas medicinais
movimenta em nosso país cerca de US$ 500 milhões, que é relativamente
pequeno ao se comparar com os valores publicados para a Europa e
Estados Unidos no ano de 2000: US$ 8,5 e 6,3 bilhões, respectivamente
(Simões & Schenkel 2002).
Nos países em desenvolvimento, bem como nos mais desenvolvidos,
os apelos da mídia para o consumo de produtos à base de fontes naturais
aumentam diariamente, prometendo saúde e vida longa, com base no
argumento de que plantas usadas há milênios são seguras para a
população (Veiga Junior & Pinto 2005).
O uso popular, e mesmo o tradicional são insuficientes para validar
eticamente as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros,
onde a autorização do seu uso não difere de qualquer outro xenobiótico
sintético e sua preconização, ou autorização oficial de uso medicamentoso,
devem ser fundamentados em evidências experimentais comprobatórias
de que o risco que se expõem àqueles que a utilizam é suplantado pelos
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
benefícios que possam advir (Brasil 1995).
As plantas medicinais da flora nativa brasileira são consumidas com
pouca ou nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas,
propagadas por usuários ou comerciantes (Veiga Junior & Pinto 2005).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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www.ib.unicamp.br/plant-aq-SP/familias/Asteraceae.html
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Estudos sobre a Vernonia brasiliana (L.) Druce
2.1.1. Botânico
A família Asteraceae é cosmopolita, sendo a maior dentre as
angiospermas (Bremer 1994) com cerca de 1535 gêneros e,
aproximadamente, 23000 espécies (Bremer 1996). Esta família encontra-
se melhor representada nas regiões temperadas e subtropicais do mundo
(Ritter & Baptista 2005), com grande importância no estrato herbáceo e
arbustivo dos cerrados brasileiros (Ratter et al. 1997, Batalha &
Mantovani 2001).
No Brasil são relatados cerca de 180 gêneros da família Asteraceae
(Barroso et al. 1991) e das 557 espécies pertencentes a esta família
registradas no nordeste brasileiro no inventário realizado por Matos
(2005b), 75 pertencem ao gênero Vernonia.
O gênero Vernonia possui aproximadamente 900 espécies (Cronquist
1988) que se encontram amplamente distribuídas em toda a região norte e
nordeste como ervas, arbustos e rastejantes (Leitão Filho 1972).
Dentre inúmeros espécimes da família Asteraceae utilizados na
medicina caseira está a Vernonia brasiliana, conhecida popularmente
como assa-peixe, hervea-préa, pau de múquem, manjericão de cavalo,
matias e tramanhém. Em alguns casos encontrar-se identificada
equivocadamente como Vernonia scabra (Barroso 1991, Matos 2005a).
Este vegetal é utilizado no tratamento de cólicas hepáticas, hemorragias
(cama de sangue), corizas fortes e hematomas (César 1956).
A primeira citação da V. brasiliana no Estado de Pernambuco foi
realizada pelos naturalistas Guilherme Piso e Jorge Marcgrave na cidade
do Recife, ente os anos de 1637 e 1638 (Pickel 1949).
Trata-se de um arbusto perene que varia entre 0,5 e 2,5 m de
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
altura, com caule muito ramificado de ramos de contorno circular (verdes
a amarronzados) e tricomas abundantes. Possue folhas alternas, simples e
pecioladas com estípulas persistentes. O pecíolo se apresenta achatado,
inserido marginalmente, biconvexo e com base arredondada. Possui
lâmina lanceolada, membranácea, delgada, com margem lisa e nervação
peninérvea. O limbo é de consistência membranácea, contudo, algumas
espécies apresentam ápice agudo, geralmente truncado, base arredondada
e bordo liso. Suas flores são reunidas em inflorescências do tipo capítulo,
racemiformes e congestas, de coloração violácea-pálida (figura 1) (Filizola
et al. 2003).
Figura 1. Vernonia brasiliana (L.) Druce. A. ramo vegetativo; B. ramo florífero;
C. inflorescência capítulo; D. estilopódio; E. brácteas involucrais pilosas; F.
receptáculo; G. cipsela (Filizola et al. 2003).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Na cidade do Recife e Região Metropolitana além da V. brasiliana (L.)
Druce, destacam-se ainda as espécies V. cinerea Less, V. condensata
Baker e V. scorpioides Pers (Filizola et al. 2003).
2.1.2. Fitoquímico
A composição química e atividade biológica de muitos espécimes da
família Asteraceae vêm sendo extensivamente estudadas, resultando no
desenvolvimento de novos fármacos, inseticidas, entre outros (Zomlefer
1994).
Estudos demonstram que o gênero Vernonia certamente abriga um
vasto perfil fitoquímico, com representantes de todos os grupos de
metabólitos secundários conhecidos, com predomínio dos triterpenos,
esteróides, sesquiterpenos e flavonóides (Alves et al. 1997, Filizola 2003).
Inúmeros trabalhos científicos realizados com espécies desta família
resultaram em isolamentos de vários metabólitos secundários (tabela 1),
destacando-se os flavonóides, os quais são apontados como importantes
marcadores quimiotaxonômicos (Emerenciano et al. 2005), além de sua
reconhecida importância no campo médico no tratamento e prevenção de
várias doenças (Zuanazzi & Montanha 2004, Harborne et al. 2005).
Alves e cols (1997) isolaram das folhas de V. brasiliana os
triterpenos lupeol, β-amirina (oleanos) e gemanicol (figura 2). O Screening
cromatográfico do extrato metanólico de suas folhas realizado por Filizola
(2003) demonstrou ainda a presença de metabólitos terpênicos
(triterpenos, sesquiterpenos, monoterpenos, incluindo dois iridóides),
polifenólicos (glicosídeos de flavonóides, esteróides, derivados cinâmicos e
agliconas) e açúcares redutores. Este trabalho também resultou na
identificação de duas moléculas: um flavonol (5,8,4’-trihidroxi-3,6,7-
trimetiléter flavonol) e uma flavona (5-hidroxi-7,4’-dimetiléter flavona).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Os sesquiterpenos e monoterpenos lactônicos (iridóides) (Filizola
2003) são considerados os compostos terpênicos mais freqüentes
encontrados nos óleos voláteis (Simões & Spitzer, 2004), sendo os
iridóides indicados como importantes marcadores quimiotaxonômico
(Sampaio-Santos & Kaplan 2001, Reis et al. 2004).
2.1.3. Farmacológico
A Vernonia brasiliana (L.) Druce tem sido utilizada ao longo dos
anos com várias indicações, incluindo hemorragias gastrintestinais,
corizas fortes, cólicas hepáticas e hematomas (César 1956). Entretanto,
estudos científicos sobre V. brasiliana ainda são escassos, destacando-se
os de atividade antimalárica (Carvalho & Krettli 1991, Carvalho et al.
1991, Alves et al. 1997).
A atividade antimalárica da V. brasiliana foi atribuída ao triterpeno
lupeol (Alves et al. 1997), entretanto, Ziegle e cols (2002) demonstraram
que esta substância atua promovendo alterações na morfologia de
eritrócitos, tornando estas células inviáveis como hospedeiras do
Plasmodium falciparum.
Lupeol
β-amirina
Germanicol
Figura 2 – Saponinas triterpênicas isoladas da Vernonia brasiliana.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
A literatura científica relata que triterpenos pentacíclicos (lupeol, β-
amirina e gemanicol), em geral, exibem uma larga escala de atividades
farmacológicas que incluem atividade antiinflamatória, antioxidante, anti-
alérgica, antitumoral, antibacteriana, efeitos gastroprotetores e
hepatoprotetores (Oliveira et al. 2004).
Extratos de V. brasiliana apresentaram atividade antimicrobiana
(D’Albuquerque et al. 1961, Filizola 2003) e moluscicida (Cunha et al.
2000). Contudo, os ensaios realizados com o extrato bruto metanólico das
folhas de V. brasiliana não apresentaram atividades antiinflamatória nem
antiálgica, por via oral e intraperitoneal, respectivamente (Filizola 2003).
Apesar de serem poucos os trabalhos científicos sobre a V.
brasiliana, a composição química e atividade biológica de muitos
espécimes do gênero Vernonia vêm sendo alvo de importantes estudos
(tabela 1).
Tabela 1 – Estudos realizados com representantes do gênero Vernonia.
ATIVIDADE ESPÉCIE REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
Antitumoral V. scorpioides Pagno et al. 2006.
V. anthelmintica Lambertini et al. 2004.
V. cinerea Kuo et al. 2003.
V. condensata Ferreira 2006.
V. lasiopus Koul et al. 2003.
V. hymenolepis Kupchan et al. 1968, Kupchan et al. 1969.
V. chinensis Chen et al. 2005.
V. pachyclada Williams et al. 2005.
V. amygdalina Kupchan et al. 1969, Jisaka et al. 1993,
Obaseiki-Ebor et al. 1993, Izevbigie 2003,
Izevbigie et al. 2004.
Antimicrobiana V. amygdalina Taiwo et al. 1999, Erasto et al.2006.
V. colorata Kelmanson et al. 2000, Rabe et al. 2002, Stafford
et al. 2005.
V. brasiliana D’Albuquerque et al.1961, Filizola 2003.
V. cinerea Gupta et al. 2003.
V. arborea Krishna Kumari et al. 2003.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Antiparasitária/
Inseticida/ Larvicida/
V. amygdalina Jisaka et al.1992, Tadesse et al. 1993, Alawa
2003, Huffman 2003.
Moluscicida V. anthelmintica Hordegen et al. 2003.
V. brasiliana Rojas et al. 1995.
V. ammophila Macedo et al. 1997.
V. subuligera Freiburghaus et al.1996.
V. salzmanni Consoli et al. 1988.
V. brasiliana Cunha et al. 2000
Antimalárica V. colorata Kraft et al. 2003, Benoit et al. 1996.
V. cinerea Chea et al. 2006.
V. guineensis Tchinda et al. 2002.
V. lasiopus Muregi et al. 2003.
V. brachycalyx Oketch-Rabah et al. 1998.
V. amygdalina Abosi & Raseroka 2003, Masaba et al. 2000,
Tona et al. 2004, Krief et al. 2004.
V. brasiliana Alves et al. 1997, Carvalho & Krettli 1991,
Carvalho et al. 1991.
Toxicidade V. condensata Monteiro et al. 2001, Ferreira 2005.
V. rubricaulis Tokarnia & Döbereiner 1982, Brum et al. 2002.
V. nudiflora Döbereiner & Tokarnia 1984, Miolo 1996.
V. squarrosa Tokarnia & Döbereiner 1983.
V. mollissima Döbereiner et al. 1976, Tokarnia et al. 1986,
Gava et al. 1987, Stolf et al. 1987.
Analgésica/
Antipirética/
V. cinerea Latha et al. 1998, Gupta et al. 2003, Iwalewa et
al. 2003, Mazumder et al. 2003.
Antiinflamatória V. colorata Cioffi et al. 2004.
V. condensata Frutuoso et al. 1994, Valverde et al. 2001.
Isolamento de compostos V. patula Liang & Min 2003.
V. anthelmintica Tian et al. 2004.
V. guineensis Tchinda et al. 2003.
V. saligna Huang et al. 2003.
V. galamensis Fahlstadius & Hamberg 1989.
V. cinerascens Abdel-Sattar et al. 2000.
V. herbacea Dias-Tagliacozzo et al. 1996.
V. fastigiataled Vogler et al.1998.
V. fasciculata Narain et al.1977.
V. flexuosa Kisiel. 1975 (Part I), Kisiel. 1975 (Part II).
V. altissima Rowe et al.1955.
V. travancorica Seetharaman & Petrus 2004.
V. fruticulosa Barbosa et al. 2004.
V. triflosculosa Kos et al. 2006.
Modulação gênica V. amygdalina Howard et al. 2003.
Anti-agregante plaquetária V. amygdalina Laekeman et al. 1983, Laekeman et al. 1985.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Anti-oxidante V. amygdalina Oboh & Akindahunsi.2004.
Hepatoprotetora V. amygdalina Babalola et al. 2001.
Imunomoduladora V. kotschyana Nergard et al. 2004, Nergard et al. 2005.
Cicatrizante V. scorpioides Leite et al. 2002.
Vasoativa V. polyanthes Romanezi da Silveira et al. 2003.
V. liatroides Campos et al. 2003.
Hipoglicemiante V. colorata Sy et al. 2004, Sy et al. 2005
2.1.4. Toxicológico
A toxicidade de plantas medicinais é um problema sério de saúde
pública, entretanto, muitas dessas plantas têm o seu potencial tóxico
completamente desconhecido (Schenkel et al. 2004, Veiga Junior & Pinto
2005).
Casos de toxicidade de plantas medicinais recentemente divulgados
alerta para o uso indiscriminado de Croton cajucara e Copaifera sp, duas
plantas medicinais amplamente utilizadas na Região Amazônica (Veiga
Junior & Pinto 2005).
Algumas espécies do gênero Vernonia são apontadas como
responsáveis por mortes de bovinos, ovinos e caprinos (Döbereiner et al.
1976, Tokarnia & Döbereiner 1982, Gava et al. 1987, Stolf et al. 1987,
Brum et al. 2002).
Segundo Filizola (2003), resíduos de extratos brutos metanólicos
(20%) das folhas de V. brasiliana (0,25 a 2,0g/Kg), via intraperitoneal, não
apresentou toxicidade aguda.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
3333.... OOOObbbbjjjjeeeettttiiiivvvvoooossss
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
3. OBJETIVO
3.1. Geral
Este projeto teve o objetivo contribuir para o estudo toxicológico e
farmacológico da espécie Vernonia brasiliana (L) Druce.
3.2 Específicos
• Identificação botânica do vegetal;
• Estimar o valor de DL50 do extrato hidroetanólico em
camundongos albinos Swiss (Mus musculus), por via
intraperitoneal;
• Realizar o estudo histológico do fígado de camundongos
submetidos ao tratamento agudo do extrato hidroetanólico das
folhas da V. brasiliana;
• Averiguar a atividade antiinflamatória do extrato da Vernonia
brasiliana;
• Avaliar a atividade antineoplásica do extrato da V. brasiliana em
camundongos, através de análise quantitativa e histopatológica
em Carcinoma de Ehrlich e Sarcoma 180.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
4444.... AAAArrrrttttiiiiggggoooo I Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Avaliação da toxicidade aguda do extrato hidroetanólico da Vernonia
brasiliana (L) Druce.
Danielli Cândida de Oliveira1, Maria Rita de Kássia Costa de Farias1, Diógenes
Luís da Mota2, Fálba Bernadete Ramos dos Anjos2, Ivone Antônia de Souza3*.
1Dept. de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco; 2Dept. de Histologia e
Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco; 3*Dept. de Antibióticos, Universidade Federal de
Pernambuco, Recife-PE, Brasil.
Resumo
A Vernonia brasiliana é bastante utilizada por populares principalmente no tratamento de
doenças do sistema respiratório e digestivo, entretanto, são poucas as pesquisas científicas
sobre este vegetal. O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade aguda, as reações
comportamentais e a histologia do fígado de camundongos tratados com o extrato
hidroetanólico (EHE) das folhas da V. brasiliana, administrado por via intraperitoneal. Os
animais tratados apresentaram inúmeros sinais clínicos de intoxicação, sendo as reações
comportamentais excitatórias e estimulantes os efeitos mais pronunciados. Entretanto,
também apresentaram comportamentos depressores e a taxa de mortalidade cresceu
progressivamente com o aumento da dose. Os dados histológicos demonstraram que todos
os animais que receberam o EHE de V. brasiliana apresentaram fígado com algum grau de
congestão vascular. O aparecimento de novos efeitos adversos após 24h da administração e
a permanência dos sintomas até o término do período de observação (72h) demonstraram
que a droga possui reações cumulativas. De acordo com a DL50 obtida, o extrato de V.
brasiliana pode ser considerado moderadamente tóxico quando administrado por via
intraperitoneal.
Unitermos: Vernonia brasiliana; Asteraceae; Toxicidade Aguda; DL50; Hepatotoxicidade.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças é
uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. As plantas medicinais
da flora nativa brasileira são consumidas com pouca ou nenhuma comprovação de suas
propriedades farmacológicas, propagadas por usuários ou comerciantes. A toxicidade de
plantas medicinais é um problema sério de saúde pública, entretanto, muitas dessas plantas
têm o seu potencial tóxico completamente desconhecido. (Schenkel et al., 2004; Veiga
Junior & Pinto, 2005).
Diferentes espécies do gênero Vernonia (Asteraceae) têm sido utilizadas na
medicina popular no tratamento de processos inflamatórios e distúrbios gastrintestinais,
além do uso como antipirético, antimalárico, dentre outros (Benoit et al., 1996; Latha et al.,
1998; Masaba, 2000; Monteiro et al., 2001; Iwalewa et al., 2003; Cioffi et al., 2004;
Nergard et al., 2004).
Particularmente, a Vernonia brasiliana (L.) Druce é bastante utilizada
principalmente no tratamento de distúrbios do sistema respiratório e digestivo (César,
1956). Contudo, são poucos os estudos científicos sobre V. brasiliana, destacando-se os de
atividade antimalárica (Carvalho & Krettli, 1991; Carvalho et al., 1991; Alves et al.,
1997).
De acordo com Filizola (2003), camundongos albinos Swiss (machos e fêmeas)
tratados com resíduos de extratos brutos metanólicos (20%) das folhas de V. brasiliana
(0,25 a 2,0g/Kg), por via intraperitoneal, não apresentaram sintomas de toxicidade aguda.
Apesar da importância, estudos sobre os efeitos tóxicos deste gênero são escassos.
Monteiro e cols (2001) demonstraram que o extrato aquoso da V. condensata apresentava
baixa toxicidade aguda e não possuía riscos teratogênicos nem mutagênicos. A V.
condensata (‘assa-peixe’, ‘falso alcachofra’ ou ‘alumã’) é um vegetal bastante utilizado
por populares (Rizzo et al., 1985) e com algumas atividades farmacológicas comprovadas
(Frutuoso et al., 1994; Valverde et al., 2001).
De acordo com Ferreira (2005), o extrato hexânico de V. condensata (1000 a
3000mg/Kg) administrado por via intraperitoneal em camundongos demonstrou sinais
clínicos de intoxicação. Contudo, não houve óbito de nenhum animal dentro de um período
de observação de 48h.
Entretanto, a V. molissima, a V. squarrosa e a V. rubricaulis são hepatotóxicas e
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
produzem quadro clínico-patológico caracterizado por necrose hepática (Tokarnia &
Döbereiner, 1983), sendo responsáveis por mortes de bovinos, ovinos e caprinos
(Döbereiner et al., 1976; Tokarnia & Döbereiner, 1982; Gava et al., 1987; Stolf et al.,
1987; Brum et al., 2002).
A administração única, por via oral, do pó dos brotos de V. molissima, (0.25–6.0
g/kg) em coelhos ocasionou nefrotoxicidade, além da alta hepatotoxidade, e óbito da
maioria dos organismos (Tokarnia et al., 1986). Respostas tóxicas também foram obtidas
experimentalmente em caprinos (Stolf et al. 1987), em bovinos e ovinos (Gava et al. 1987).
Estudos demonstraram que a V. nudiflora, apresentou reação tóxica moderada sobre
o sistema digestivo (Dobereiner & Tokarnia, 1984; Miolo, 1996).
Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda, as reações
comportamentais e a histologia do fígado de camundongos tratados com o extrato
hidroetanólico (EHE) das folhas da Vernonia brasiliana, por via intraperitoneal.
2. METODOLOGIA
2.1. Material Botânico
As folhas de Vernonia brasiliana (L.) Druce foram coletadas no município de
Vicência, Pernambuco - Brasil, no período de setembro a novembro de 2004. Uma
exsicata do vegetal foi identificada pela botânica Drª. Marlene Barbosa e depositada no
herbário Geraldo Mariz da Universidade Federal de Pernambuco, sob número 36.772.
2.2. Obtenção do Extrato
Após a secagem das folhas, estas foram trituradas em moinho mecânico e o pó
misturado à solução hidroetanólica (1:1), agitado em temperatura ambiente durante 8
horas, repetindo-se o procedimento por três vezes. Em seguida o material foi filtrado,
concentrado em rotaevaporador sob pressão reduzida e liofilizado. O rendimento médio
foi calculado de acordo com Anjos (1995).
2.3. Animais
Nos experimentos foram utilizados camundongos machos albinos Swiss (Mus
Musculus) adultos provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos da
Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram divididos em grupos (n=6) e
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
mantidos em gaiolas de polietileno com água e ração ad libitum, em ambiente climatizado
(22 ± 2ºC) e ciclo circadiano de 12 horas. O protocolo experimental utilizado está de
acordo com os princípios éticos da experimentação animal elaborado pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
2.4. Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50
Os animais foram privados de ração por 08 horas antes da realização dos ensaios e
receberam água ad libitum. Em seguida, o extrato hidroetanólico (EHE) das folhas de V.
brasiliana foi solubilizado em soro fisiológico (0,9%) e administrado, por via
intraperitoneal (v.i.p.), nas doses de 100 a 2000 mg/Kg. O grupo controle recebeu solução
fisiológica (0,9%), v.i.p. Após administração das respectivas doses, os animais confinados
e dispostos em uma superfície plana foram observados durante 120 minutos.
Posteriormente foram realizadas observações em intervalos regulares, durante 72 horas. As
alterações comportamentais foram notificadas segundo os critérios propostos por Malone
(1977). O número de óbitos foi notificado para cada grupo e a determinação da toxicidade
aguda foi realizada segundo o método preconizado por Karber & Behrens (1964).
2.5. Avaliação Histológica dos Fígados de Camundongos Tratados com EHE de V.
brasiliana
Baseando-se nos ensaios toxicológicos, foram estabelecidas as doses: 62,5; 250;
500 e 1000mg/Kg para o estudo histológico de fígados de camundongos machos albinos
Swiss, submetidos a doses agudas do EHE de V. brasiliana (v.i.p). O grupo controle
recebeu solução fisiológica 0,9% (v.i.p). Dois animais, por dose, foram sacrificados por
deslocamento cervical uma hora após a administração e os respectivos fígados retirados e
fixados em solução de Bouim. Após a fixação foram lavados e processados para inclusão
em parafina líquida. Foram efetuados cortes de 5 µm de espessura, corados pela técnica de
Hematoxilina-Eosina e observados em microscopia óptica (Beçak & Paulete, 1976).
3.0. RESULTADOS
3.1. Toxicidade Aguda e Determinação da DL50
O extrato hidroetanólico das folhas de V. brasiliana apresentou um rendimento
médio de 14,17%. O tratamento por via intraperitoneal com o EHE produziu vários sinais
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
clínicos de intoxicação nos prineiros 120 minutos de observação, como demonstrados nas
tabelas 01 e 02. De acordo com os dados destas tabelas observou-se que os efeitos mais
pronunciados foram reações comportamentais excitatórias e estimulantes, tais como
piloereção, exoftalmia, movimentos circulares, reação de fuga, movimentos estereotipados,
ereção de cauda, movimento de vibrissas, postura de ataque, dentre outros.
Além dos sinais referidos, os animais também apresentaram comportamentos
depressores, tais como diminuição da freqüência respiratória, dispnéia, alteração na
marcha, abaixamento de trem posterior e prostração.
Outros sinais também foram detectados como marcha lateralizada (500, 750 e
850mg/Kg), postura estática, hiperemia e cianose (1500 e 2000mg/Kg). Os animais
alternaram entre o estado de depressão e agitação. Alterações visuais, tais como irritação
na conjuntiva, fotofobia e exoftalmia unilateral também foram observadas.
Observou-se que os animais apresentaram irritação do globo ocular com severa
fotofobia, respiração visceral, edema de focinho, cianose e intensa piloereção 24h após a
administração das doses superiores a 750mg/Kg do EHE. A permanência destes sintomas
foi observada até o encerramento dos ensaios (72h após a administração).
A taxa de mortalidade do EHE cresceu progressivamente com o aumento da dose
(tabela 02). A menor dose capaz de produzir a maioria dos efeitos adversos sem ocasionar
óbito (D1) foi a de 500mg/Kg, já com 2000mg/kg todos os animais morreram (D2).
Baseando-se nos achados, foi calculada a DL50 do EHE de V. brasiliana, v.i.p., que
foi de 1208,33mg/Kg de peso do animal.
3.2. Avaliação Histológica dos Fígados de Camundongos
Dois animais, um que recebeu a dose de 62,5 e outro 1000mg/Kg apresentaram
veias centrolobulares e sublobulares congestas, onde se encontravam hemácias em grande
quantidade na luz destes vasos. O parênquima de ambos os animais apresentou aspecto
semelhante aos dos animais controle, salvo análise mais profunda e quantificação para
morfometria.
Os animais tratados, quando comparados com os do grupo controle, apresentaram
áreas extensas com sinusóides com luz aumentada em seu diâmetro e dilatação da parede
sinusoidal (Figura 1).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
4.0. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Segundo Brum e cols (2002), os principais sinais clínicos de bovinos intoxicados
por V. rubricaulis foram agressividade, numa primeira fase, e posteriormente depressão,
salivação, gemidos, incoordenação, retração de abdômen, fezes ressecadas com muco e
hemólise. Outros sinais como piloereção, tremores musculares, fraqueza, olhar fixo,
bradipnéia, bradicardia, lacrimejamento, retração de globo ocular e marcha lenta também
foram observados. A evolução clínica da doença variou entre 12 e 48 horas. A principal
alteração histológica foi observada no fígado, com severa necrose de coagulação
hepatocelular, predominantemente centrolobular associada à congestão e hemorragias
acentuadas.
Como pode ser observado nas tabelas 01 e 02, muito dos sinais apresentados por
intoxicação com V. rubricaulis foram verificados na administração do EHE da espécie V.
brasiliana, v.i.p.
Os autores atribuíram o quadro clínico patológico observado pela intoxicação com
V. rubricaulis com o de insuficiência hepática aguda. Segundo Kelly (1993) e Radostits e
cols (2000) afecções hepáticas difusas são, normalmente, acompanhadas de manifestações
neurológicas variadas e não específicas, como hiperexcitabilidade, convulsões, coma,
tremores musculares, fraqueza, abatimento, dificuldade de responder a sinais, movimentos
estereotipados e alienação ao ambiente.
Nos nossos ensaios, os dados histológicos demonstraram que todos os animais que
receberam o EHE de V. brasiliana apresentaram algum grau de congestão vascular. De
acordo com Engelman e colaboradores (2001), este quadro provavelmente se deve a
congestão hepática por insuficiência cardíaca congestiva, que provavelmente levaria à
dilatação das veias centro-lobulares e dos sinusóides hepáticos.
Alves e cols (1997) isolaram das folhas de V. brasiliana os triterpenóides lupeol, β-
amirina e gemanicol. Estudos fitoquímicos realizados por Filizola (2003) demonstraram a
presença predominante de metabólitos polifenólicos (flavonóides) e terpênicos nas folhas
deste vegetal. Visto que o EHE de V. brasiliana trata-se de um composto contendo várias
substâncias, provavelmente as observações notificadas nas tabelas 01 e 02 venha ser
devido à predominância de um destes compostos, ou mesmo da interação de dois a mais
destes, possivelmente por diferentes mecanismos farmacológicos.
A permanência de alguns sintomas e o aparecimento de novos efeitos adversos,
observados num período de 72h, demonstraram que a droga possui reações cumulativas.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Segundo os ensaios de toxicidade aguda realizados por Filizola (2003), os animais
submetidos aos resíduos dos extratos brutos metanólicos de V. brasiliana não revelaram
qualquer alteração que os diferenciassem dos animais controle durante o período de
observação (07 dias).
De acordo com a DL50 obtida em nossos ensaios, o EHE das folhas de V. brasiliana
pode ser considerado moderadamente tóxico quando administrado por v.i.p. (Schuartsman,
1980).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
AGRADECIMENTOS
Aos moradores do município de Vicência Sr. Luís e Sr. Zino, pelo auxílio na
obtenção do material botânico. Aos técnicos de histologia Mª de Fátima do Nascimento,
Alex B. da Silveira e Silvana T. Paz, da Universidade Federal de Pernambuco.
*Autor para correspondência:
Profª. Drª. Ivone A. de Souza
Departamento de Antibióticos
Universidade Federal de Pernambuco
50670-901– Recife – PE
E-mail: [email protected]
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Dose (mg/Kg) Parâmetros 100 500 Estimulantes
↑ Freqüência respiratória ++ +++ Piloereção +++ +++ Exoftalmia - - Movimentos estereotipados - +++ Tremores finos/grosseiros - +++ Ereção de cauda - +++ Movimentos circulares - +++ Movimentos de vibrissas + +++ Agitação +++ +++ Fasciculações na cauda - - Convulsão tônico - - Postura de ataque - ++ Saltos - - Levantamento de trem posterior +++ -
Depressores ↓ Freqüência respiratória + +++ Dispnéia - + Prostração - + Alteração de marcha - +++ Abaixamento de trem posterior - +
Outros Espasmos ++ +++ Hiperemia +++ +++ Excreção fecal - ++ Diarréia - + Diurese +++ ++ Contorções abdominais +++ ++ Distensão abdominal - ++ Refluxo - - Comportamento exploratório - + Reação de fuga ++ +++ Agressividade - ++ Não responde a estímulos externos +++ ++ Fotofobia + - Lacrimejamento - - Irritação da conjuntiva - - Exoftalmia unilateral - + Convulsão focal do sist. óculo-motor - - Marcha lateralizada - + Palidez + ++ Cianose - - Edema de focinho - - Petéquias - - Respiração visceral - - Hipertrofia testicular - - Alternância: Depressão x Agitação +++ +++ Óbitos 0 0
- = sem efeito + = efeito leve ++ = efeito moderado +++ = efeito acentuado
* Adaptada de Malone, 1977.
TABELA 01 - Sinais clínicos de toxicidade observados em camundongos
albinos Swiss (Mus musculus) tratados com o extrato hidroetanólico de V.
brasiliana, v.i.p, com doses que não ocasionaram óbitos. Dados obtidos
durante 120 minutos após a administração do extrato.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Dose (mg/Kg) Parâmetros 750 850 1000 1500 1900 2000(D2)
Estimulantes ↑ Freqüência respiratória +++ ++ ++ ++ +++ +++ Piloereção ++ +++ +++ + ++ +++ Exoftalmia +++ ++ ++ +++ +++ + Movimentos estereotipados ++ +++ +++ + +++ +++ Tremores finos/grosseiros + +++ + ++ +++ ++ Ereção de cauda ++ + +++ ++ - +++ Movimentos circulares - ++ + ++ +++ +++ Movimentos de vibrissas +++ ++ + ++ + +++ Agitação + + ++ ++ ++ + Fasciculações na cauda - + ++ + - + Convulsão tônico - ++ - - - - Postura de ataque ++ + +++ +++ + +++ Saltos + + + +++ - - Levantamento de trem posterior ++ + ++ - ++ -
Depressores
↓ Freqüência respiratória +++ ++ +++ ++ +++ +++ Dispnéia + +++ ++ +++ +++ +++ Prostração + + +++ +++ +++ +++ Alteração de marcha - + ++ - + + Abaixamento de trem posterior + + ++ ++ - +++
Outros
Espasmos - - - - +++ ++ Hiperemia +++ ++ +++ + ++ ++ Excreção fecal ++ + + ++ - + Diarréia - - + ++ - ++ Diurese ++ - ++ + + + Contorções abdominais ++ + ++ ++ ++ ++ Distensão abdominal + ++ - - - - Refluxo + +++ - - - ++ Comportamento exploratório + + ++ + - - Reação de fuga +++ +++ +++ ++ ++ ++ Agressividade +++ + +++ +++ + +++ Não responde a estímulos externos + + ++ - - ++ Fotofobia - - - - + ++ Lacrimejamento - ++ - - + - Irritação da conjuntiva - +++ ++ +++ +++ +++ Exoftalmia unilateral ++ ++ - - - - Convulsão focal do sist. óculo-motor - + - - + + Marcha lateralizada + + - - - - Palidez +++ +++ +++ ++ +++ +++ Cianose - - - +++ - +++ Edema de focinho - - - - - ++ Petéquias - - - - - +++ Respiração visceral + - - + - - Hipertrofia testicular - +++ - +++ - - Alternância: Depressão x Agitação + + ++ ++ ++ ++ Óbitos 01 02 03 04 05 06
- = sem efeito + = efeito leve ++ = efeito moderado +++ = efeito acentuado
* Adaptada de Malone, 1977.
TABELA 02 - Sinais clínicos de toxicidade observados em camundongos albinos Swiss (Mus musculus) tratados com
o extrato hidroetanólico de V. brasiliana, v.i.p, com doses que ocasionaram óbitos. Dados obtidos durante 120 minutos
após a administração do extrato.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Figura 1 – Cortes de fígados de camundongos machos (Mus musculus). As figuras A e B são de animais controles (S = sinusóides), nas objetivas de 20x e 40x, respectivamente. Visualização das áreas com sinusóides com luz aumentada em seu diâmetro e dilatação da parede sinusoidal (DS) em animais tratados com o extrato de V. brasiliana nas doses: 62,5mg/Kg (C e D), 250mg/Kg (E e F), 500mg/Kg (G e H) e 1000mg/Kg (I e J). (C, E, G, I = HE 20x) (D, F, H, J = HE 40x).
A B
C D
DS DS
F
DS
DS
E
DS
H G DS
DS
DS
J I
S S
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
5555.... AAAArrrrttttiiiiggggoooo II
Artigo a ser submetido à revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Avaliação preliminar da atividade antiinflamatória do
extrato hidroetanólico de Vernonia brasiliana (L.) Druce.
Danielli Cândida de Oliveira, George Chaves Jimenez, Aldo César Passilongo da
Silva, Elisangela Christhianne Barbosa da Silva, Elisabete de Jesus Moreira,
Ivone Antônia de Souza*.
*Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco – UFPE. Av. Prof. Moraes Rego, 1235 - Cidade Universitária, Recife, PE, Brasil.
Resumo
Este trabalho teve como objetivo descrever os resultados da atividade
antiinflamatória do extrato hidroetanólico (1:1) das folhas de Vernonia
brasiliana (L.) Druce, utilizando o modelo de edema de pata induzido por
carragenina em ratos Wistar machos. A análise de regressão revelou que o
ponto de efeito máximo e o ponto de corte da curva de variação do edema
no grupo controle dos animais tratados com 150mg/Kg do extrato de V.
brasiliana foram similares aos dos animais tratados com 2mg/Kg de
dexametasona. Os dados sugerem que, possivelmente, os efeitos
antiinflamatórios observados possam ter ocorrido pelas mesmas vias
farmacológicas da dexametasona, ou seja, por inibição da fosfolipase A2,
enzima responsável pelo início das opções da cascata do ácido
araquidônico.
Palavras-chave: Vernonia brasiliana (L.) Druce; Atividade Antiinflamatória; Asteraceae; Lupeol.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
1. INTRODUÇÃO
Diferentes espécies do gênero Vernonia (Asteraceae) têm sido
utilizadas na medicina popular em problemas gastrintestinais,
cicatrizantes, antipiréticos, antiinflamatórios, dentre outros (Latha et al.
1998, Monteiro et al. 2001, Iwalewa et al. 2003, Cioffi et al. 2004, Nergard
et al. 2004).
Estudos demonstram que este gênero abriga um vasto perfil
fitoquímico, com representantes de todos os grupos de metabólitos
secundários conhecidos, com predomínio dos triterpenos, esteróides,
sesquiterpenos e flavonóides (Filizola 2003).
Especificamente, a Vernonia brasiliana (L.) Druce (conhecida como
assa-peixe ou hervea-préa) tem sido utilizada ao longo dos anos com
várias indicações, incluindo hemorragias gastrintestinais, corizas fortes,
cólicas hepáticas e hematomas (César 1956). Entretanto, estudos
científicos sobre V. brasiliana ainda são escassos, destacando-se os de
atividade antimalárica (Carvalho & Krettli 1991, Carvalho et al. 1991,
Alves et al. 1997).
Ensaios realizados com resíduos de extratos brutos metanólicos
(20%) das folhas de V. brasiliana nas doses de 500 e 1000 mg/kg não
apresentaram atividades antiinflamatória nem antiálgica, por via oral e
intraperitoneal, respectivamente (Filizola 2003).
Alves e cols (1997) isolaram das folhas de V. brasiliana os
triterpenóides pentacíclicos lupeol, β-amirina e gemanicol. Triterpenos
pentacíclicos, em geral, exibem uma larga escala de atividades
farmacológicas que incluem atividade antiinflamatória, antioxidante,
antialérgica, antitumoral, antibacteriana, efeitos gastroprotetores e
hepatoprotetores (Oliveira et al. 2004).
A atividade antimalárica da V. brasiliana foi atribuída ao lupeol
(Alves et al. 1997). Ziegle e cols (2002) demonstraram que esta substância
atua promovendo alterações na morfologia de eritrócitos, tornando estas
células inviáveis como hospedeiras do Plasmodium falciparum.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Agarwal & Rangari (2003) constataram atividade antiinflamatória
dose-dependente do lupeol, possivelmente devido ao mesmo impedir a
produção de alguns mediadores pró-inflamatórios (Fernandez et al. 2001).
Estudos fitoquímicos realizados por Filizola (2003) demonstraram a
presença predominante de metabólitos polifenólicos (flavonóides) e
terpênicos nas folhas deste vegetal.
Vários efeitos biológicos têm sido atribuídos aos flavonóides, tais
como inibição da peroxidação de lipídeos e da agregação de plaquetas,
alterações de sistemas enzimáticos, incluindo a inibição de
ciclooxigenases, lipoxigenases e da fosfolipase A2 (Landolfi et al. 1984,
Brody 1994, Tsuda et al. 1994, Silva et al. 2002, Zuanazzi & Montanha
2004).
Dentre os terpenóides, as lactonas sesquiterpênicas constitui-se
um grupo de grande ocorrência no gênero Vernonia (Lopes 1991). Estudos
demonstraram que o Verolepin, uma lactona sesquiterpênica isolada de
V. amygdalina, apresentou antagonismo competitivo com a histamina,
atividade desagregante plaquetária, inibiu a produção do fator de necrose
tumoral (TNF-α), interferiu na liberação de ATP e inibiu a agregação de
plaquetas induzidas por ácido araquidônico, ADP e colágeno (Laekeman
et al. 1985, Noldin et al. 2003).
Vários trabalhos têm sido realizados na tentativa de descobrir
novos fármacos antiinflamatórios mais potentes, seletivos e seguros
(Lages et al. 1998, Reitz et al. 1994). Espécimes de Vernonia têm sido alvo
de diversos estudos por apresentarem atividades analgésica, antipirética,
antiinflamatória e imunomoduladora (Frutuoso et al. 1994, Latha et al.
1998, Valverde et al. 2001, Gupta et al. 2003, Iwalewa et al. 2003,
Mazumder et al. 2003, Cioffi et al. 2004, Nergard et al. 2005).
A V. cinérea demonstrou significante atividade antiinflamatória
aguda e crônica e, assim como a V. brasiliana, este vegetal possui
flavonóides e terpenos como os seus maiores constituintes (Latha et al.
1998, Iwalewa et al. 2003, Mazumder et al. 2003).
Visto a importância etnofarmacológica da V. brasiliana e seu grande
potencial fitoquímico, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
ação do extrato hidroetanólico (EHE) das folhas de V. brasiliana na
reversão da fase aguda do processo inflamatório do edema de pata
induzido por carragenina.
2. METODOLOGIA
2.1 Coleta do Material e Obtenção do Extrato
As folhas de Vernonia brasiliana (L.) Druce foram coletadas no
município de Vicência, Pernambuco - Brasil, no período de setembro a
novembro de 2004. A exsicata da espécie vegetal foi identificada pela
botânica Drª. Marlene Barbosa, e depositada no herbário Geraldo Mariz
da Universidade Federal de Pernambuco, sob número 36.772. Depois de
secas, as folhas foram trituradas em moinho mecânico e o pó misturado à
solução hidroetanólica (1:1), agitado em temperatura ambiente durante 8
horas, repetindo-se o procedimento por três vezes. Em seguida o material
foi filtrado, concentrado em rotaevaporador sob pressão reduzida e
liofilizado.
2.2 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos (Rattus norvegicus) com três
meses de idade, provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos
da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram mantidos em
caixas de polietileno (n=6), em ambiente climatizado (22 ± 2ºC) com ciclo
circadiano de 12 horas. Todos receberam água ad libtum, permanecendo
em jejum por 12 horas antes do ensaio. O protocolo experimental foi de
acordo com os princípios éticos da experimentação animal do Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
2.3 Edema de Pata Induzido por Carragenina
O ensaio foi realizado de acordo com a metodologia de Ugo Basile
Itália 7150 e Winter e cols (1962) que se baseia na medida do volume das
patas traseiras dos animais usando pletismômetro em intervalos de tempo
pré-determinado. A indução da inflamação aguda foi obtida através da
administração subplantar de 0,1ml de solução de carragenina (0,1% p/v)
na pata posterior esquerda.
As drogas foram administradas por via intraperitoneal (v.i.p), dose
única, trinta minutos após a indução do edema. O grupo controle recebeu
solução fisiológica (0,9%). Aos padrões foram administradas as seguintes
substâncias: indometacina (10mg/kg) e dexametasona (2mg/kg). Os
grupos de animais tratados receberam o extrato hidroetanólico (EHE) das
folhas de V. brasiliana, em solução fisiológica (0,9%), nas doses: 50; 75 e
150mg/Kg, as quais foram estabelecidas baseando-se na DL50 do extrato.
O volume da pata de cada animal foi medido após administração
das drogas, em intervalos constantes de 60 minutos, por um período de
seis horas.
2.5. Análise Estatística
Os valores foram expressos como média ± desvio padrão e as
respectivas variações do edema mediante os diferentes tipos de
tratamentos foram avaliados por análise de regressão, segundo planilha
estatística do programa Excel® da Microsoft®, versão 2003.
3.0. RESULTADOS
Na tabela 1 estão notificadas os volumes de edema de pata induzido
por carragenina com as doses administradas. No gráfico 1 verifica-se as
curvas dose/resposta do edema mediado por diferentes doses de V.
brasiliana quando comparados com os animais do grupo controle. Neste
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
gráfico foi observado que nos tempos iniciais todos os extratos
administrados provocaram edemas maiores do que o do grupo controle. O
extrato de V. brasiliana na dose de 150mg/Kg, além de ter produzido um
edema menor do que as outras doses do extrato, aproximadamente a
partir da 5ªh provocou uma redução de edema muito mais rapidamente
em relação ao grupo controle.
No gráfico 2 pode ser observada a variação de volume de edemas ao
longo do tempo mediante o tratamento com indometacina e dexametasona
em relação ao grupo controle.
Com as funções de variação de edema ao longo do tempo,
visualizadas nos gráficos 1 e 2, após a derivação, procurou-se determinar
o tempo de efeito máximo (Tmax) de cada tratamento (tabela 2).
Observando a tabela 2 verificou-se que os tempos de resposta
máxima produzidos pelo extrato nas concentrações de 50 e 150mg/Kg
foram praticamente os mesmos encontrados quando da administração de
dexametasona na concentração de 2mg/Kg.
Mesmo considerando que a dexametasona pode reduzir o edema de
forma mais significativa após 4h de administração e o extrato de V.
brasiliana a 150mg/Kg possa fazer esta mesma redução a partir da 5ª
hora, procurou-se estabelecer uma relação de equivalência entre ambos
(gráfico 3). Mediante a equação obtida y = 0,6424x + 0,3613 no gráfico 3,
para um coeficiente de determinação (R2) de 0,7069, verificou-se que
150mg/Kg de V. brasiliana equivale a 96,72mg/Kg de dexametasona.
4.0. DISCUSSÃO
A princípio, parece ser mais vantajoso a escolha da dexametasona
em relação à 150mg/Kg do extrato de V. brasiliana, uma vez que o
fármaco padrão reduziu em cerca de uma hora mais rapidamente o edema
em relação o extrato vegetal com uma dose de 2mg/Kg. Mas,
considerando-se os efeitos adversos dos corticoesteróides sobre o
organismo, bem como a amplitude de impacto dos mesmos sobre
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
diferentes aspectos do metabolismo animal (Macedo & Oliveira 2002), em
administração crônica observou-se que a V. brasiliana pode ser uma
opção interessante, embora essa reciprocidade possa ser explicada pela
relação linear obtida em 71%.
Também é importante destacar que considerando o ponto de efeito
máximo e o ponto de corte da curva de variação do edema do grupo
controle como similares é possível admitir que os efeitos antiinflamatórios
observados possam ser sugestivos pelas mesmas ações farmacológicas, ou
seja, por inibição da fosfolipase A2, enzima esta responsável pelo início das
opções da cascata do ácido araquidônico (Macedo & Oliveira 2002).
Atividade antiinflamatória semelhante foi observada por Geetha e
Varalakhmi (2001) com o triterpeno lupeol, um dos constituintes da V.
brasiliana (Alves et al. 1997). Visto que o EHE de V. brasiliana se trata de
um vegetal com várias substâncias, possivelmente o lupeol é um dos
componentes responsável pela atividade antiinflamatória observada em
nossos estudos.
Os resultados que foram encontrados na espécie V. brasiliana
apresentaram indicativos de combate ao processo inflamatório numa ação
tardia, que foi conferido a partir da 5ª hora após administração.
Segundo a literatura, os antiinflamatórios não hormonais não
alteram a hiperalgesia e a dor causada pela ação direta das
prostaglandinas, o que é compatível com o conceito de que os efeitos
analgésicos desses medicamentos são devidos à inibição da síntese das
prostaglandinas. Diante das ações verificadas em nossos estudos, a
espécie V. brasiliana simula atividade a prazo mais prolongado que vai de
encontro aos antiinflamatórios de ação curta. A ação tardia da espécie V.
brasiliana abre perspectivas às novas investigações pela resposta
antinociceptiva central e possivelmente periférica, imbricado no
mecanismo da inflamação.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
AGRADECIMENTOS
Aos moradores do município de Vicência Sr. Luís e Sr. Zino, pelo
auxílio na obtenção do material botânico. A pesquisadora Jovita Mª de
Farias Braga e ao graduando em Ciências Biomédicas Renato Sá Barreto
O. Gomes.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
MÉDIA +P (ml)
TRATAMENTO
DOSE (mg/kg) 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Controle
-
0,633 +0,172
0,833 +0,189
0,775 +0,214
0,842 +0,231
0,808 +0,248
0,792 +0,211
0,733 +0,218
EHE
50
0,525 +0,140
1,017 +0,202
1,000 +0,207
1,008 +0,203
1,000 +0,164
0,867 +0,117
0,758 +0,136
EHE
75
0,483 +0,133
1,025 +0,160
1,058 +0,153
1,083 +0,218
1,017 +0,144
0,917 +0,209
0,825 +0,270
EHE
150
0,542 +0,196
0,975 +0,262
0,942 +0,235
0,850 +0,184
0,892 +0,237
0,725 +0,178
0,650 +0,257
Indometacina
10
0,567 +0,137
1,033 +0,211
0,958 +0,132
0,942 +0,159
0,775 +0,209
0,658 +0,111
0,633 +0,137
Dexametasona
02
0,242 +0,102
0,858 +0,120
0,883 +0,175
0,725 +0,133
0,658 +0,116
0,692 +0,092
0,683 +0,087
TRATAMENTO
DOSE
(mg/kg)
Tmax (h)
Controle - 5,091
EHE 50 2,301
EHE 75 2,180
EHE 150 2,273
Indometacina 10 3,863
Dexametasona 02 2,300
Tabela I – Volumes dos edemas induzido por injeção subplantar de carragenina nas patas de ratos Wistar machos. Médias, e os respectivos desvios padrões, dos tratamentos com indometacina (10 mg/kg), dexametasona (2mg/kg) e o EHE de V. brasiliana nas doses de 50, 75 e 100mg/kg, via intraperitoneal. O grupo Controle recebeu solução salina 0,9%. (n=6/grupo).
Tabela II – Comparação dos tempos de efeito máximo (Tmax) da resposta antiinflamatória dos tratamentos com o EHE de V. brasiliana, indometacina e dexametasona no modelo do edema de pata induzido por carragenina, v.i.p. O grupo Controle recebeu solução fisioloógica (0,9%) (n=6/grupo).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
y = 0,003x3 - 0,0424x2 + 0,1608x + 0,6525
R2 = 0,7669
y = 0,0113x3 - 0,1371x2 + 0,4289x + 0,5774
R2 = 0,8481
y = 0,0137x3 - 0,1707x2 + 0,5874x + 0,5123
R2 = 0,9533
y = 0,0106x3 - 0,1389x2 + 0,4856x + 0,5601
R2 = 0,90720
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Vo
lum
e d
o e
de
ma
(m
l)
Polinômio (Controle)
Polinômio (150mg/Kg)
Polinômio (75 mg/Kg)
Polinômio (50 mg/Kg)
y = 0,003x3 - 0,0424x2 + 0,1608x + 0,6525
R2 = 0,7669
y = 0,0231x3 - 0,2428x2 + 0,6974x + 0,2838
R2 = 0,8842
y = 0,0174x3 - 0,1915x2 + 0,5329x + 0,5931
R2 = 0,93450
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (horas)
Vo
lum
e d
o e
dem
a (
ml)
Polinômio (Controle)
Polinômio (Dexametasona)
Polinômio (Indometacina)
Gráfico 2 – Representação das curvas de variação que descrevem o
efeito dos fármacos padrões indometacina (10mg/Kg) e dexametasona
(2mg/Kg), via intraperitoneal, no volume do edema de pata induzido por
carragenina em ratos Wistar machos adultos. O grupo Controle recebeu
solução salina 0,9%. (n=6/grupo).
Gráfico 1 – Representação das curvas de variação que descrevem o efeito
do EHE das folhas de V. brasiliana nas doses de 50, 75 e 100mg/kg, via
intraperitoneal, no volume do edema de pata induzido por carragenina
em ratos Wistar machos adultos. O grupo Controle recebeu solução
salina 0,9%. (n=6/grupo).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
y = 0,6424x + 0,3613
R2 = 0,7069
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
150mg/Kg de V. brasiliana
Dexam
eta
so
na
Gráfico 3 – Relação de equivalência entre as médias dos volumes do
edema de pata induzido por carragenina de ratos Wistar machos
tratados com 2mg/Kg de dexametasona e 150mg/Kg do EHE das folhas
de V. brasiliana, via intraperitoneal (n=6/grupo).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
6666.... AAAArrrrttttiiiiggggoooo IIIIIIIIIIII
Artigo a ser submetido à revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Atividade antineoplásica da Vernonia brasiliana (L.) Druce
Danielli Cândida de Oliveira, Elisabete de Jesus Moreira, George Chaves
Jimenez, Fálba Bernadete Ramos dos Anjos, Roberto José Vieira de Mello,
Ivone Antônia de Souza*.
*Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco – UFPE. Av. Prof. Moraes Rego, 1235 - Cidade Universitária, Recife, PE,
Brasil.
Resumo
Vernonia brasiliana é uma planta de uso popular, utilizada nas
doenças do sistema respiratório e digestivo. Estudos científicos
demonstraram notável ação antimalárica e antimicrobiana deste vegetal.
Neste trabalho, investigamos a atividade antineoplásica do extrato
hidroetanólico de suas folhas nas linhagens Sarcoma 180 e Carcinoma de
Ehrlich. A análise da razão das taxas metabólicas específicas do animal e
a do tumor demonstrou que em ambas as linhagens houve variação de
acordo com a dose do extrato empregada. Entretanto, esta variação
apresentou um ponto crítico, que assinalou o efeito máximo,
aproximadamente associado à dose 30mg/Kg para o Sarcoma e 60mg/Kg
no Carcinoma. A partir destes pontos, a razão decaiu com o aumento da
dose. Estes resultados estão de acordo com o maior percentual de inibição
tumoral obtido, nos quais os animais induzidos com o tumor sarcomatoso
apresentou 93,88% de inibição tumoral com a dose 31,25mg/kg e o
carcinomatoso 86,70% com a dose 62,5mg/Kg. A avaliação histopatológica
demonstrou que houve um maior número de áreas necróticas nos dois
tumores. Quanto à especificidade tumor/hospedeiro de cada linhagem em
relação às diferentes doses de V. brasiliana, observou-se que o extrato
apresentou melhor efeito sobre o Sarcoma 180 do que sobre o Carcinoma
de Ehrlich.
Palavras chave: Vernonia brasiliana, Asteraceae, Câncer, Sarcoma, Carcinoma.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma doença sombria e devastadora que afeta a
humanidade. Do número total de óbitos, um em cada cinco é causado
pela doença; tem havido avanços, mas na maior parte ainda se perde
muito na guerra contra o câncer. Um dos principais motivos é que a
medicina convencional há muito tem ignorado a maior capacidade
restauradora dos produtos simples encontrados na natureza (Murray et al.
2005)
Após a descoberta do triterpeno paclitaxel, composto natural capaz
de inibir a divisão celular pela despolimerização dos microtúbulos,
diferentes grupos de pesquisadores voltaram à atenção para a busca de
novos produtos naturais, visando uma nova perspectiva para obtenção de
potentes agentes quimioterápicos (Souza 2003).
A composição química e a atividade biológica de muitos espécimes
da família Asteraceae vêm sendo extensivamente estudadas, resultando
no desenvolvimento de novos fármacos, inseticidas, entre outros (Zomlefer
1994). Dentre estes, espécimes do gênero Vernonia têm sido alvo de
importantes estudos in vitro de atividades imunomoduladora,
antimicrobiana e antitumoral (Kupchan et al. 1969(b), Taiwo et al. 1999,
Kelmanson et al. 2000, Rabe et al. 2002, Gupta et al. 2003, Krishna
Kumari et al. 2003, Lambertini et al. 2004, Nergard et al. 2004, Stafford et
al. 2005, Williams et al. 2005, Chen et al. 2005, Erasto et al. 2006).
O gênero Vernonia abriga um vasto perfil fitoquímico, com
representantes de todos os grupos de metabólicos secundários
conhecidos, com predomínio dos triterpenos, esteróides, sesquiterpenos e
flavonóides (Almeida et al. 1997, Filizola 2003).
Particularmente, a Vernonia brasiliana é um importante vegetal
utilizado na medicina popular para o tratamento de distúrbios digestivos e
respiratórios (César 1956) e com significante atividade antimalárica
(Carvalho & Krettli 1991, Carvalho et al. 1991, Alves et al. 1997). Trata-se
de uma planta arbustiva, conhecida como herva-préa, matias ou
tramanhém, que, em alguns casos, encontra-se identificada
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
equivocadamente como Vernonia scabra (Barroso 1991, Matos 2005).
A V. brasiliana apresentou notável atividade antimicrobiana
(D’Albuquerque et al. 1961, Filizola 2003) e o Screening cromatográfico do
extrato metanólico de suas folhas demonstrou a presença de metabólitos
terpênicos (monoterpenos, triterpenos, sesquiterpenos), polifenólicos
(glicosídeos de flavonóides, esteróides, derivados cinâmicos e agliconas) e
açúcares redutores (Filizola 2003).
A comprovação da atividade antineoplásica in vitro de diversos
compostos deste gênero (Kupchan et al. 1968, Kupchan et al. 1969(a),
Jisaka et al. 1993, Obaseiki-Ebor et al. 1993, Izevbigie 2003, Koul et al.
2003, Kuo et al. 2003, Liang & Min 2003, Izevbigie et al. 2004) e o
potencial fitoquímico da V. brasiliana nos levaram a investigar a atividade
antitumoral do extrato hidroetanólico das folhas deste vegetal nas
linhagens de tumores sólidos Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich
implantados em camundongos albinos Swiss (Mus musculus).
2. METODOLOGIA
2.1 Coleta do Material e Obtenção do Extrato
As folhas de Vernonia brasiliana (L.) Druce foram coletadas no
município de Vicência, Pernambuco - Brasil, no período de setembro a
novembro de 2004. A identificação botânica foi realizada pela Drª.
Marlene Barbosa e depositada no herbário Geraldo Mariz da Universidade
Federal de Pernambuco, sob número 36.772.
Após secagem, o material botânico foi triturado em moinho
mecânico e o pó misturado à solução hidroetanólica (1:1), agitado em
temperatura ambiente durante 8 horas. O material concentrado foi
acondicionado em rotaevaporador sob pressão reduzida e liofilizado.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
2.2 Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss adultos (Mus Musculus)
machos com faixa etária de 60 dias e peso entre 25-35g, provenientes do
Biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de
Pernambuco. Os animais foram mantidos em caixas de polietileno (n=5),
em ambiente climatizado (22 ± 2ºC), ciclo circadiano de 12 horas e
receberam água ad libitum. O protocolo experimental foi de acordo com os
princípios éticos da experimentação animal elaborado pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
2.3 Implantação dos Tumores
O procedimento do transplante (Sarcoma 180 e Carcinoma de
Ehrlich) foi utilizado em animal doador para retirada da massa tumoral,
de acordo com preconizado por Stock e cols (1955) e Komiyama &
Funayama (1992).
2.4 Tratamento (Inibição Tumoral)
O ensaio com os animais transplantados foi dividido em 03 grupos
(n=5/grupo): Controle, Padrão e Teste respectivamente com solução
fisiológica, Metotrexato e o extrato de V. brasiliana. No caso do sarcoma
foram usadas doses de 31,25; 62,5 e 125mg/Kg. Para o Carcinoma de
Ehrlich as doses foram de: 31,25; 62,5 e 100mg/Kg de peso do animal,
administradas diariamente, por via intraperitoneal, por 09 e 08 dias,
respectivamente. O tratamento teve início 48 horas após o transplante dos
tumores. Após o tratamento os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical e os tumores retirados, pesados e calculados de
acordo com a fórmula:
TW% = C – T/C x 100
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Onde: TW% = % de inibição tumoral; C= média dos pesos dos tumores do
grupo controle; T = média dos pesos dos tumores do grupo tratado.
2.4 Análise da Taxa Metabólica Específica (TXM)
As taxas metabólicas dos animais e dos tumores foram
determinadas de acordo com a fórmula (Taylor et al. 1970):
Onde: TXM = Taxa Metabólica Específica; m = peso (animal ou tumor) em Kg.
*Resultados expressos em litros de O2.h-1.Kg-1.
Para análise foi aplicada à razão entre a TXM do tumor e a do animal
(TXMT /TXMA) como resposta ao tratamento com a V. brasiliana.
2.6 Avaliação Histopatológica
Após a realização dos cálculos foram separados 03 tumores de cada
grupo que foram fixados em formalina a 10%, lavados e processados para
inclusão em parafina. Os cortes 5 µm de espessura foram corados pela
técnica de Hematoxilina-Eosina e as observações em microscopia óptica
(Beçak & Paulete 1976).
2.7. Análise Estatística
A média e o desvio padrão foram avaliados por análise de variância
(ANOVA) mediante o teste de Tukey, considerando-se significativo os
valores para um valor de p< 0,01 (Christman 1985). A variação da razão
entre as taxas metabólicas em função da dose foi avaliadda por análise de
regressão do programa Excel®, versão 2003, da Microsoft®.
TXM = 0,676 x m-0,25
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
3.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Percentuais de Inibição Tumoral (TW%)
Nas tabelas 1 e 2 estão representadas as médias e os desvios
padrões do peso dos animais (PA) e dos tumores (PT). A razão entre PT/PA
foi obtida para os grupos experimentais. O teste estatístico (p<0,01)
demonstrou que as razões obtidas nos grupos tratados e padrão
apresentaram diferença significativa frente ao grupo controle.
Nos gráficos 1 e 2 estão demonstrados os valores dos percentuais de
inibição tumoral (TW%) com os respectivos tumores nos grupos tratados e
padrão. De acordo com o gráfico 1 o maior percentual de inibição para o
Sarcoma 180 foi de 93,88% com a dose de 31,25mg/kg, quando
comparado ao grupo controle. A dose de 62,5mg/Kg apresentou TW% de
75,69%, enquanto que o grupo padrão foi capaz de inibir
significativamente, em 83,36%, o crescimento do tumor. Apenas 01
animal tratado com 125mg/Kg resistiu até o término do tratamento.
Como observado no gráfico 2, a inibição mais expressiva (86,70%)
do Carcinoma de Ehrlich foi observada com a dose de 62,5mg/Kg do
extrato de V. brasiliana. Nas demais doses de 31,25mg/Kg e 100mg/Kg
verificou-se TW% de 75,77% e 74,25%, respectivamente. O fármaco
padrão foi capaz de inibir 91,29% do crescimento tumoral.
3.2 Análise das Taxas Metabólicas Específicas (TXM)
Na tabela 3 foram observados os valores referentes à média e desvio
padrão da taxa metabólica específica (TXM), em O2.l.h-1.Kg-1, tanto do
tumor (TXMTS) como do tecido do animal (TXMAS) dos grupos portadores
de Sarcoma 180. Uma razão entre as taxas metabólicas do tumor e a do
animal também foi obtida (TXMTS/TXMAS). Observou-se que, num primeiro
plano, a TXM da massa tumoral dos grupos tratados e padrão foi maior do
que no grupo controle, o que sugere consumo de O2 das células tumorais
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
mais elevado nestes grupos.
Vale salientar que a estimativa da TXM do animal foi aproximada,
uma vez que dentro das condições experimentais empregadas não havia
condições de se saber quantas células no tumor estariam realmente em
fase de divisão celular. Mas, em comparação com os diferentes
tratamentos empregados, verificou-se que ocorriam alterações importantes
no Sarcoma 180 à medida que as doses de V. brasiliana foram
aumentadas (tabela 3).
A razão entre as Taxas Metabólicas Específicas do Tumor e a do
Animal (TXMTS/TXMAS) em função da dose foi descrita por uma equação
do segundo grau do tipo y = 0,0015x2 + 0,1059x + 1,8937, para um
coeficiente de determinação (R2) = 1. Onde x = extrato de V. brasiliana e y
= TXMTS/TXMAS (gráfico 3).
Segundo a expressão acima, pode ser observada que a razão entre
as TXMTS/TXMAS variou de acordo com a dose do extrato administrada,
mas que esta variação apresentou um ponto crítico associado à dose de
30mg/Kg, que assinalou o efeito máximo, sendo que a partir deste ponto a
razão decai conforme o aumento da dose.
Foi reduzida a quantidade de pontos obtidos experimentalmente, o
que pode ter influenciado no formato da função obtida. Para ser aferida a
TXM relacionada ao tumor seria necessária uma metodologia mais
sofisticada, condição esta não disponível para realização deste trabalho,
daí a necessidade de se estimar a TXM da massa tumoral pelas equações
de Taylor (1970).
Na tabela 4 pode ser observado os valores médios e os respectivos
desvios padrões da TXM, em O2.l.h-1.Kg-1, tanto do tumor Carcinoma de
Ehrlich (TXMTC) como do tecido do animal portador (TXMAC). Nesta tabela
foi verificado que a razão entre as taxas metabólicas específicas do tumor
e a do animal (TXMTC/TXMAC) obtida para o grupo controle foi diferente
significativamente em relação aos demais.
Para o nível de significância estabelecido neste trabalho não foi
possível aceitar como significativos às diferenças observadas para a razão
TXMTC/TXMAC em relação ao tratamento com as diferentes dosagens de V.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
brasiliana, embora com a dose de 62,5mg/Kg pode ser observado o efeito
máximo (tabela 4).
Mesmo considerando que estas diferenças entre as dosagens de V.
brasiliana frente o Carcinoma de Ehrlich não foram significantes,
verificou-se que a razão TXMTC/TXMAC podia ser descrita por uma função
do tipo y = 0,0003x2 + 0,0352x + 1,9481, para R2 = 0,99. Onde x = extrato
de V. brasiliana e y = TXMTC/TXMAC (gráfico 4).
Uma vez obtidas as funções que descreveram a variação da razão
TXMT/TXMA tanto para Carcinoma de Ehrlich como para Sarcoma 180 em
relação à dose do extrato empregada, foram encontradas as derivadas
dessas funções (tabela 5) que representam, respectivamente, a taxa de
variação infinitesimal dessas razões acima assinaladas (uma relação
específica da relação tumor-hospedeiro) e construímos o gráfico 5.
No gráfico comparativo da variação infinitesimal da razão
TXMT/TXMA de ambos os tumores, verificou-se que a função obtida foi do
tipo linear, embora com o coeficiente angular de 0,2, significou que as
alterações observadas quanto ao Carcinoma de Ehrlich corresponderam a
aproximadamente 20% das observações visualizadas quanto ao Sarcoma
180, ou seja, V. brasiliana têm efeito mais significativo sobre o
Sarcoma180 do que sobre o Carcinoma de Ehrlich.
3.3 Análise Histopatológica
A análise histopatológica para o Sarcoma 180 revelou que os
tumores do grupo controle (GCS) apresentaram alto poder invasivo, com
hipercelularidade, núcleos grandes (disformes, acidófilos e com aspecto
vesiculoso), grande quantidade de figuras mitóticas e várias áreas
necróticas (figura 1A).
Observou-se também que nos grupos GT1S e GT2S o poder invasivo
das células tumorais persistiram, conservando as características das
células do GCS. Entretanto, demonstrou-se que estes grupos
apresentaram uma maior proporção de células necróticas, principalmente
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
o GT1S (figuras 1C e 1D).
Os tumores tratados com a substância padrão (GPS) apresentaram
alterações morfológicas, tais como retrações nucleares e aumento no
número de aberrações nucleares (dismorfismo, hipermorfismo).
A análise dos tumores Carcinoma revelou que no grupo controle
(GCC) e em todos os grupos tratados (GT1C, GT2C e GT3C) os tumores
apresentaram alto poder invasivo, hipercelularidade, células gigantes
multinucleares (com núcleos disformes e acidófilos) e áreas necróticas
(figura 2).
Os tumores tratados com o metotrexato (GPC) apresentaram um
maior número de células gigantes multinucleadas, contudo, ainda
apresentaram poder invasivo.
Todas as doses administradas com o extrato e a do metotrexato nos
tumores Carcinoma produziram um maior número de áreas necróticas em
relação ao grupo controle, entretanto, não diferiram entre si quanto ao
padrão morfológico.
As analises dos tumores sarcomatosos foram de acordo com Affolter
& Moore (2002) e dos carcinomatosos com McCluggage e cols (2002).
As linhagens tumorais aplicadas nesta investigação foram
empregadas para avaliação de agentes quimioterápicos, para tumores de
crescimento rápido e de comportamento agressivo (Oettel & Wilhelm 1955,
Stock et al. 1955, Levi-Montalcini 1986, Ajith & Janardhanan 2003). Nada
havia sido relatado sobre os efeitos antineoplásico da Vernonia brasiliana
frente aos tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich.
De acordo com Ferreira (2006), 50mg/Kg do extrato hexânico da V.
condensata, por via intraperitoneal, foi capaz de inibir 76,25% do
desenvolvimento do Carcinoma de Ehrlich.
Em nossos estudos, os dados obtidos referentes às análises das
taxas metabólicas específicas do animal (TXMA) e a do tumor (TXMT),
verificou-se que a razão TXMT/TXMA variou de acordo com a dose do
extrato. Entretanto, esta variação apresentou um ponto crítico, o qual
assinalou o efeito máximo, para dose de 30mg/Kg para Sarcoma 180 e
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
60mg/Kg para Carcinoma de Ehrlich. Foi observado que esta razão a
partir destes pontos decaiu com o aumento da dose.
A análise histopatológica demonstrou que todas as doses testadas
do extrato, nas duas linhagens tumorais, produziram um maior número
de áreas necróticas em relação ao grupo controle. Entretanto, os grupos
de animais com Carcinoma tratados com várias doses do extrato não
diferiram entre si.
Vale salientar que, embora o tratamento tenha sido mais prolongado
nos animais portadores do Sarcoma 180, quando analisada a relação
específica tumor-hospedeiro de cada linhagem tumoral de acordo com a
dose do extrato de V. brasiliana, através das funções que descrevem a
variação da razão TXMT/TXMA, observou-se que o extrato apresentou
efeito mais significante sobre o Sarcoma 180 do que sobre o Carcinoma de
Ehrlich.
As diferenças demonstradas acima ocorreram não só relaçionadas
às variedades de cada tipo de tumor em relação ao hospedeiro, mas
principalmente à presença de substâncias específicas (Filizola 2003). O
extrato de V. brasiliana demonstrou que houve diferenças sobre o
organismo hospedeiro, com perspectivas futuras para conferir se os
componentes terpênicos e/ou fenólicos seriam os verdadeiros
responsáveis pelas alterações observadas.
AGRADECIMENTOS
Aos graduandos Sérgio Nóbrega, Renato Gomes e Isla Bastos. As alunas de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas Ana Pavla D. Gurgel e Jackeline G. da Silva. Aos
técnicos de histologia Mª de Fátima do Nascimento, Alex B. da Silveira e Silvana T. Paz,
da UFPE.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
TRATAMENTO
DOSE (mg/kg)
PAS (g)
PTS (mg)
PTS/PAS
GCS - 45,60 ±0,57 3,29 ±0,58 7,22 ±1,29
GT1S 31,25 39,46 ±6,66 0,20 ±0,08* 0,52 ±0,22*
GT2S 62,5 39,84 ±7,40 0,80 ±0,28* 2,05 ±0,90*
GPS 05 32,16 ±4,34 0,55 ±0,38* 1,70 ±0,94*
*diferença estatística significativa para p < 0.01 (ANOVA). (n=5/grupo).
TRATAMENTO
DOSE (mg/kg)
PAC (g)
PTC (mg)
PTC/PAC
GCC - 40,98 ±2,60 2,73 ±0,49 6,69±1,30
GT1C 31,25 38,30 ±5,85 0,66 ±0,41* 1,78±1,199*
GT2C 62,5 39,44 ±3,38 0,36 ±0,12* 0,93 ±0,32*
GT3C 100 37,76 ±3,27 0,70 ±0,38* 1,95 ±1,13*
GPC 05 29,72 ±4,55 0,24 ±0,12* 0,81 ±0,38*
*diferença estatística significativa para p < 0.01 (ANOVA). (n=5/grupo)
TRATAMENTO
DOSE (mg/kg)
TXMAS
(O2.l.h-1
.Kg-1)
TXMTS
(O2.l.h-1
.Kg-1)
TXMTS /TXMAS
GCS - 1,49 ±0,01 2,82 ±0,14 1,89 ±0,11
GT1S 31,25 1,52 ±0,06 5,67 ±0,56* 3,74 ±0,44*
GT2S 62,5 1,52 ±0,07 4,02 ±0,43* 2,64 ±0,27**
GPS 05 1,60 ±0,05 4,42 ±0,61* 2,76 ±0,36*
*diferença estatística significativa para p < 0.01 em relação ao controle. ** diferença estatística significativa para p < 0.01 em relação ao Padrão (ANOVA) (n=5/grupo)
Tabela 2 – Média e desvio padrão dos pesos dos animais (PAC) (camundongos Mus Musculus albinos Swiss), dos Carcinomas de Ehrlich (PTC) e da relação PTC/PAC dos grupos Controle (GCC), Padrão (GPC) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1C, GT2S e GT3C), todas as drogas administradas intraperitonialmente.
Tabela 1 – Média e desvio padrão dos pesos dos animais (PAS) (camundongos Mus Musculus albinos Swiss), dos Sarcomas 180 (PTS) e da relação PTS/PAS dos grupos Controle (GCS), Padrão (GPS) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1S e GT2S), todas as drogas administradas intraperitonialmente.
Tabela 3 – Média e desvio padrão das Taxas Metabólicas Específicas dos animais (TXMAS), dos tumores Sarcoma 180 (TXMTS) e da razão entre TXMTS/TXMAS dos grupos Controle (GCS), Padrão (GPS) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1S e GT2S).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
*diferença estatística significativa para p < 0.01 em relação ao controle (ANOVA). (n=5/grupo)
EHE
(mg/Kg)
SARCOMA 180
CARCINOMA DE EHRLICH
0 0,1059 0,0352 20 0,0459 0,0232 40 -0,0141 0,0112 60 -0,0741 -0,0008 80 -0,1341 -0,0128 100 -0,1941 -0,0248
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TW
I%
GT1S GT2S GPS
GRUPO
TRATAMENTO
DOSE (mg/kg)
TXMAC
(O2.l.h-1
.Kg-1)
TXMTC
(O2.l.h-1
.Kg-1)
TXMTC /TXMAC
GCC - 1,53 ±0,03 2,96 ±0,13 1,93 ±0,09
GT1C 31,25 1,53 ±0,06 4,21 ±0,76 2,74 ±0,47*
GT2C 62,5 1,52 ±0,03 4,90 ±0,57 3,22 ±0,41*
GT3C 100 1,54±0,03 4,15 ±0,55 2,69 ±0,38*
GPC 05 1,63±0,06 5,44 ±0,73 3,34 ±0,50*
Tabela 5 – Valores obtidos da razão entre a Taxa Metabólica Específica do tumor e a do animal (TXMT/TXMA) para as linhagens tumorais sarcoma e carcinoma, em função do tratamento com o extrato hidroetanólico (EHE) das folhas da V. brasiliana.
Gráfico 1 – Comparação dos Percentuais de Inibição Tumoral (TW%) em camundongos albinos Swiss machos, portadores de Sarcoma 180, tratados com o extrato de V. brasiliana nas dose de 31,25mg/kg (GT1S), 62,5mg/kg (GT2S) e Metotrexato (GPS), por via intraperitoneal. (n=5/grupo).
Tabela 4 – Média e desvio padrão das Taxas Metabólicas Específicas dos animais (TXMAC), dos tumores Carcinoma de Ehrlich (TXMTC) e da razão entre TXMTC/TXMAC dos grupos Controle (GCC), Padrão (GPC) e Tratados com o extrato de V. brasiliana (GT1C, GT2C e GT3C).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TW
I%
GT1C GT2C GT3C GPC
GRUPO
y = -0,0015x2 + 0,1059x + 1,8937
R2 = 1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 10 20 30 40 50 60 70
DOSE (mg/Kg)
TX
MT
S /
TX
MA
S
Gráfico 3 – Razão entre as Taxas Metabólicas Específicas do Sarcoma 180 e a do animal portador (TXMTS /TXMAS) em função das doses do extrato de V. brasiliana.
Gráfico 2 – Comparação dos Percentuais de Inibição Tumoral (TWI%) em camundongos albinos Swiss machos, portadores de Carcinoma de Ehrlich, tratados com o extrato de V. brasiliana nas dose de 31,25mg/kg (GT1C), 62,5mg/kg (GT2C), 100mg/kg (GT3C) e Metotrexato (GPC), por via intraperitoneal. (n=5/grupo).
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
y = -0,0003x2 + 0,0352x + 1,9481
R2 = 0,9922
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 20 40 60 80 100 120
DOSE (mg/Kg)
TX
MT
C /
TX
MA
C
y = 0,2x + 0,014
R2 = 1-0,03
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
0,04
-0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2
Sarcoma 180
Carc
ino
ma d
e E
hli
ch
Gráfico 5 – Comparação entre as respostas metabólicas dos tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich ao extrato de V. brasiliana.
Gráfico 4 – Razão entre as Taxas Metabólicas Específicas do Carcinoma de Ehrlich e a do animal portador (TXMTC /TXMAC) em função das doses do extrato de V. brasiliana.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Figura 1 – Fotomicrografias obtidas de Sarcoma 180 de camundongos albinos Swiss (Mus Muculus) dos grupos Controle (A), Padrão (B) e Tratados com o extrato de V. brasiliana nas doses de 31,25mg/Kg (C) e 62,5mg/Kg (D). * CD = células disformes; CG = células gigantes; I = invasão de tecidos; AN = área necrótica. (A,B e C = HE 40x) (D = HE 20x).
A B
CD
CD
CG
AN
CD C D
AN I
I
AN
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
Figura 2 – Fotomicrografias obtidas de Carcinoma de Ehrlich de camundongos albinos Swiss (Mus Muculus) dos grupos Controle (A), Padrão (B) e Tratados com o extrato de V. brasiliana nas doses de 31,25 mg/Kg (C), 62,5 mg/Kg (D e E) e 100 mg/Kg (F). * CD = células disformes; CG = células gigantes; I = invasão de tecidos; AN = área necrótica. (A,B, C e F = HE 40x) (E = HE 20x).
C
E
D
F
CD
CD
CD
I
I
I
CD
CG
CG
A B
CD
CD
AN
AN
I
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
De acordo com os resultados obtidos, concluímos que:
� De acordo com a DL50, o EHE de V. brasiliana pode ser considerado
moderadamente tóxico quando administrado por via intraperitoneal.
� O aparecimento de novos efeitos adversos após 24h da
administração e a permanência de vários sintomas (72h)
demonstraram que a droga possui reações cumulativas.
� Os dados histológicos demonstraram que todos os animais que
receberam o EHE de V. brasiliana apresentaram fígado com algum
grau de congestão vascular.
� A avaliação das propriedades antiinflamatórias do EHE apresentou
indicativos de combate ao processo inflamatório numa ação tardia,
que foi conferido a partir da 5ª hora após administração, por via
intraperitoneal.
� O EHE de V. brasiliana apresentou significante atividade
antineoplásica frente às linhagens tumorais estudadas, sendo mais
ativo contra o Sarcoma 180.
� A análise histopatológica demonstrou aumento das áreas necróticas
em ambas as linhagens tumorais tratadas com o EHE.
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
8888.... RRRReeeeffffeeeerrrrêêêênnnncccciiiiaaaassss BBBBiiiibbbblllliiiiooooggggrrrrááááffffiiiiccccaaaassss
Oliveira, D.C. Estudo toxicológico e farmacológico da Vernonia brasiliana (L) Druce.
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