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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTREO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PATOLOGIA ORAL

ESTUDO IN VITRO DOS EFEITOS DA BMP-2 E DO SEU

ANTAGONISTA NOGGIN SOBRE A PROLIFERAÇÃO E

MIGRAÇÃO CELULARES EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE

DE LÍNGUA

NATAL/RN

2014

CYNTIA HELENA PEREIRA DE CARVALHO

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2014

ESTUDO IN VITRO DOS EFEITOS DA BMP-2 E DO SEU

ANTAGONISTA NOGGIN SOBRE A PROLIFERAÇÃO E

MIGRAÇÃO CELULARES EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE

LÍNGUA

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de

Pós-graduação em Patologia Oral do

Departamento de Odontologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como parte do

requisitos para a obtenção de Título do Doutor em

Patologia Oral

DOUTORANDA: Cyntia Helena Pereira de Carvalho

ORIENTADOR: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto

NATAL/RN

2014

CYNTIA HELENA PEREIRA DE CARVALHO

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Carvalho, Cyntia Helena Pereira de Carvalho. Estudo in vitro dos efeitos da BMP-2 e do seu antagonista Noggin sobre a proliferação

e migração celulares em carcinoma epidermóide de língua/ Cyntia Helena Pereira de

Carvalho. – Natal, RN, 2010. 90 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto.

Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-

Graduação em Patologia Oral.

1. Carcinoma epidermóide oral – Tese. 2. Proteínas morfogenética óssea -2 –

Tese. 3. Proliferação celular – Tese. 4. Metástase – Tese. 5. Noggin – Tese.

I. Pinto, Leão Pereira, II. Título.

RN/UF/BSO Black D65

RN/UF/BSO Black D74

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

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“Ao Deus Pai, que aos cansados Ele dá novas forças e enche de energia os fracos. No sofrimento eu fui consolada,

porque a sua promessa me deu forças. Pois, o Eterno é bom; o seu amor dura para sempre e sua felicidade não tem

fim.” (Is 40.29; Sl 119.50; Sl 100.5)

DEDICATÓRIA

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Dedico com amor aos amado...

Ao meu querido pai, Tarcísio Amorim de Carvalho (in memoriam), que estaria com os olhos brilhando ao ver sua filha se tornar doutora. “-Painho, você não está de corpo presente, mas meu coração sente sua força a cada minuto dedicado nessa carreira e sei que o senhor foi mais um anjo que me protege lá de cima. Essa vitória é fruto da sua dedicação à educação dada a mim e a meus irmãos. Obrigada pelo apoio incondicional a toda a minha formação!”

A minha Mãe amada, Ilma Helena Pereira de Carvalho, mulher forte e de fibra que me dá exemplo de perseverança todos os dias. Sempre me ensinou que devemos batalhar muito para termos sucesso. Obrigada por todo o cuidado que teve e tem comigo. Você foi fundamental nessa minha caminhada.

Aos meus irmãos, Cynara Helena/Geovanni e José Inácio/Jocyelli, pelo amor, proteção e companheirismo. Obrigada por sempre me socorrerem até no mínimos detalhes da minha vida.

Aos meus pequeninos sobrinhos lindos, Clarinha, Geovanninho, Joãozinho, Tarcila e Julinha, que tanto amo e que me dão forças e alegrias. Os dias com vocês são muito mais legais!!!!

Ao meu amor, Marcelo Nogueira de Carvalho Kokubum, que há tão pouco tempo entrou em minha vida e já a transformou em um mar de possibilidades e sonhos. Obrigada pela força e companheirismo. Seu exemplo de dedicação e amor ao trabalho me inspiram.

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“Cada pessoa que passa em nossa vida, passa sozinha, pois cada pessoa é única e nenhuma substitui a outra... Há os

que levam muito mas não há os que não levam nada; há os que deixam muito, mas não há os que não deixam nada.

Essa é a maior e mais bela responsabilidade de nossa vida e a prova de que duas almas não se encontram por acaso.”

(Charlie Chaplin)

AGRADECIMENTOS

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Era início de semestre de 2003.1, quando tive a primeira aula da disciplina de patologia geral no Departamento de Odontologia da UFRN. No primeiro dia de aula, entram na sala seis professores (-Sim, apenas 6 professores, pois as professoras Marcia e Éricka ainda eram alunas), que se apresentaram e explicaram como a disciplina iria funcionar. Foram apenas 10 minutinhos... Dez minutos que entraram para a minha história... Pela primeira vez, depois de um ano de curso, eu via a apresentação da disciplina com todos os professores... Aaah que Professores!!! Via-se nos olhos, o carinho e a dedicação que àqueles professores, até então desconhecidos, tinham com a disciplina e o curso ao qual eu estava inserida. Nunca vou esquecer da aula de Biópsia do professor Leão, da aula de noções neoplasias, a qual o professor Costa, ao falar de oncogenes levou a capa da revista americana Times falando da descoberta da p53. Da aula de neoplasias de glândulas salivares, da professora Lélia, que passava cada slide com entusiasmo. Vi profissionais que hoje são respeitados na nossa classe e experientes ainda alunos de pós-graduação. Lembro-me da aula de cisto dentígero do Professor Gustavo Godoy, da aula de Cárie da Professora Marcia e da Aula de cisto radicular da Professora Éricka (ainda tenho o artigo que foi debatido sobre a origem do cisto que ela passou). Ao ver esses exemplos decidi: “-Pronto! É isso!... Tô no lugar certo...” Bastou o convite do Professor Dr. Leão Pereira Pinto para conhecer o Programa de Iniciação Científica da Base de Pesquisa em Patologia Oral que não pensei duas vezes: “-Eu vou!” e fui... Confesso que as primeiras reuniões não entendia muito dos assuntos dos projetos, quando um belo dia o Professor Leão olha para mim e diz: “- Você será a debatedora do próximo encontro.” Era uma mistura de felicidade, pelo reconhecimento do professor, com apreensão. “-O que era fibronectina?!!” A partir daí me tornei bolsista voluntária do Professor Leão e bolsista de Extensão do Professor Costa. Em seguida fui bolsista de iniciação científica do Professor Costa pelos dois últimos anos de graduação. Primeiro ano bolsista pela UFRN e o segundo ano pela Liga Norte Riograndense Contra o câncer, a qual falo com orgulho que fui a primeira bolsista de iniciação científica da Liga na área de odontologia. Vieram o Mestrado e o Doutorado...Muitos estudos, muitas lâminas, muitos seminários, muitas aulas, muitas noites acordadas, muitos choros e muitas e muitas alegrias... São quase 12 anos de convívio com a Patologia Oral da UFRN e confesso que muitas vezes passei mais tempo nela do que na minha própria casa. Aqui na Patologia Oral, para os íntimos Patox, construí amizades científicas e de vida. Tenho uma família que posso contar aonde esteja e me orgulho dela. Os conhecimentos adquiridos irão para onde eu for e com orgulho falo que sou filha desta casa. Hoje participo de outra casa (instituição), mas nelas as sementes aqui colhidas são plantadas com orgulho. Serei eternamente grata por tudo que passei aqui... A todos os alunos, funcionários e Professores um ciclo em minha vida se fecha, mas os laços aqui feitos nunca desatarão...

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Aqui, sinceramente gostaria de agradecer a todos que direta ou indiretamente puderam contribuir não só com o desenvolvimento deste trabalho, como, principalmente, com o meu amadurecimento pessoal e profissional. Ao meu orientador Professor Dr.Leão Pereira Pinto, que me possibilitou a honra de ser sua orientanda. Minha gratidão será eterna ao senhor pela imensa dedicação dispensada a minha pessoa. O seu exemplo de vida me faz acreditar no melhor sempre e me dá forças na carreira que pretendi seguir. O conhecimento, o cuidado, o amor e a generosidade que o senhor tem, me faz considerá-lo como um segundo pai. Um pai na minha vida científica e também um pai para vida toda. Professor, tenha aqui uma filha que estará sempre ao seu dispor, aonde eu estiver. À Professora Dra. Lélia Batista de Souza, que sempre abriu as portas para mim. Sinto orgulho de dizer que a senhora foi também minha orientadora durante essa trajetória e que, me permita dizer, se tenho um pai na ciência, a senhora é a minha mãe científica. Exemplo de mulher e pesquisadora, tem minha admiração e terá sempre minha gratidão por toda atenção dispensada a minha pessoa. Ao Professor Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa, que me deu a primeira bolsa de iniciação científica e que possibilitou muitos caminhos a serem trilhados durante minha graduação. Meus sinceros agradecimentos e saiba que me identifico bastante com seus ideais. À Professora Roseana de Aldeida Freitas, por todos os ensinamentos sempre muito embasados em pura ciência. Muito Obrigada pelo carinho e respeito, seu exemplo de harmonia com o trabalho deve ser seguido. À Professora Hébel Cavalcanti Galvão, por toda simpatia, carinho e gentileza sempre que precisei da senhora. Muito Obrigada! À Professora Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, por todo conhecimento transmitido e demonstrar todo esforço tem recompensa e que vale a pena acreditar nos sonhos. À Professora Dra. Ana Myriam Costa de Medeiros, pela retidão dos seus conceitos, pela simplicidade e profissionalismo. Muito Obrigada!

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À Professora Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, por toda gentileza dedicado a minha pessoa e pelo exemplo de convivência pacífica que transmite. À Professora Dra. Marcia Cristina da Costa Miguel, por me ensinar a argumentar diante de pesquisas, despertar a curiosidade e a paixão pela imunologia, graças a essa paixão hoje sou professora. Ao Professor Dr. Carlos Augusto Galvão Barbosa, do Departamento de Morfologia da UFRN, pela disponibilidade dispensada a minha pessoa desde o primeiro contato que fiz para a realização deste projeto, ainda antes da seleção do doutorado. Obrigada pela confiança e pela oportunidade de aprendizado na minha vida profissional. Ao Professor Dr. Cassiano Francisco Weege Nonaka que sempre me ajudou nos meus trabalhos com muita gentileza, exemplo de um profissional competente. Ao Professor Dr Adriano da Rocha Germano, por todos os ensinamentos passados durante a vida acadêmica e de pós-graduação. Tenho orgulho de dizer que fui sua aluna. Muito obrigada por tudo! Ao Professor Dr Hugo Alexandre de Oliveira Rocha e a todos os alunos e técnica do laboratório de Biopolímeros da UFRN, em especial a Ruth, Rafael, Raniere e a Ana Katarina, por terem me recebido de forma tão gentil e por toda ajuda nos conhecimentos em bioquímica e culturas de células cedidos, além de todos os reagentes que eu não possuía e que foram cedidos e feitos para proporcionar os experimentos da presente pesquisa. À Fernanda Ginani, um anjo, pela ajuda imensurável no desenvolvimento laboratorial desta tese. Fernanda, sem você não teria feito essa caminhada. Você me ensinou e trabalhou junto comigo. Sempre agradecerei a você pela sua disponibilidade e paciência pelas tantas vezes que te “aperriei.” Você é um exemplo de que o conhecimento de verdade deve ser partilhado. Muito Obrigada! Aos meus queridos amigos da minha turma de doutorado, Emeline Lima, Keila Martha, Joabe Pereira, Felipe Matos, Maiara de Moraes. Queridos irmãos que Deus me deu nessa vida científica e que nunca

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mediram nenhum esforço para me ajudar quando precisei. Terão minha ajuda e meu reconhecimento aonde for! Obrigada por tudo doutores!!! À querida Professora Dra. Águida Cristina Herriques Leitão que tanto me ajudou com sua amizade e sua contribuição no protocolo desta pesquisa foi essencial para o desenvolvimento deste trabalho. Você é uma profissional admirável! À amiga e agora Professora Dra. Ana Rafaela Luz de Aquino, pela sua cumplicidade desde a graduação, na pós-graduação e agora na docência. Te admiro desde sempre e agradeço a Deus você em minha vida. Aos amigos e colegas de doutorado, Stefânia Jerônimo, Clarissa Demeda, Denise Hélen de Olibeira, Bárbara Monteiro, Natália Barbosa, Ana Luiza Leite, Roseane Vasconcelos, Edilmar Moura, Conceição Aparecida, Emília Beatriz, Adriana Costa, José Nazareno, Melka Sá, Rodrigo Gadelha e Jamile Moura. Cada um contribuiu de alguma forma com meu aperfeiçoamento no Programa de Pós- graduação. Em especial a Clarissa Demeda pela ajuda junto aos trabalhos do Professor e à Denise Hélen de Oliveira por ajudar com um sorriso no rosto, digna de pessoas gentis e boas. À querida Idel, que sempre me ajudou com muita disposição e competência. Sua educação e simpatia são admiráveis. Muito obrigada por tudo! À Graça Galvão, nossa querida Gracinha, por toda dedicação em nos ajudar. Obrigada pela paciência e por sempre resolver meus problemas. À Sandovânia Oliveira, nossa querida Sandrinha, pela disponibilidade de fazer nossas lâminas sempre com competência. Serei grata por cada trabalho meu a qual você trabalhou com tanta dedicação. À Hévio Lucena, pela dedicação a nossos trabalhos e pela competência na imunoistoquímica. Obrigada! À Ricardo Silva pela sua demonstração de responsabilidade no trabalho. Obrigada! À Lourdes Maciel, nossa querida Lurdinha, pela as alegria em nos receber, sua simplicidade e generosidade são admiráveis.

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À minha querida e imensa família, avós, tios, tias, primos e agregados, pela força e exemplo de união. O pilar embasado na família nunca cai! Ao querido Sidharta Augusto, pela amizade abençoada por Deus. Sua ajuda sempre foi presente em minha vida durante toda essa caminhada. Você sabe que o que você precisar não medirei esforços para te ajudar. Às minhas queridas amigas do Marista, o quinteto fantástico, Débora, Taissa, Isabella e Ana Claúdia, pela amizade duradoura e verdadeira. Às minhas amigos de Faculdade, Chrystiane Guedes, Alessadra Barreto, Leila Massud, Iane Damasceno, Rosaverena Costa, Patrícia Matsuno e Ana Patrícia Fernandes pelas conversas e amizade que sempre deixam a vida melhor e mais leve de ser vivida. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, através do Programa de Pós-Graduação em Patologia oral, por ter possibilitado a concretização de um sonho. Hoje sou uma docente e chego ao final do doutorado graças a todo investimento e confiança depositado em meus trabalhos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio financeiros que possibilitaram a realização deste trabalho. Aos meus queridos amigos de profissão da UFCG, Ana Carolinna Albuquerque, George Nascimento, Luciana Gominho, Pedro Paulo dos Santos, Solange Kerpel pela honra de trabalhar ao lados de pessoas tão amigas e éticas. Obrigada por todo aprendizado que vocês me proporcionam. À Universidade Federal de Campina Grande, a qual sou docente e que me liberou para concluir minhas atividades do doutorado e que tanto me apoia. À todos aqueles que torceram e torcem por mim. Que Deus abençoe a vida de todos!

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RESUMO

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RESUMO

O carcinoma epidermóide oral (CEO) representa a neoplasia maligna mais prevalente na

cavidade oral e por atingir um grande número de indivíduos, acaba se tornado um relevante

problema de saúde pública. Muitos estudos demonstram alterações nos componentes da via

BMP em vários tipos de tumores, como os de próstata, cólon, mama, gástricos e CEOs. É do

conhecimento atual que essas proteínas podem exercer efeito pró-tumoral em estágios mais

avançados do desenvolvimento neoplásico vindo a favorecer a progressão e invasão tumoral.

A inibição da via de sinalização da BMP-2, através dos seus antagonistas, tem mostrado

resultados positivos de ação antitumoral e que assim, o uso do Noggin pode ser um novo alvo

terapêutico contra o câncer. Diante destas evidências e dos escassos trabalhos com BMP-2,

Noggin e CEO, o objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito da BMP-2 e seu antagonista

Noggin sobre a proliferação e migração celulares em culturas de células de carcinoma

epidermóide de língua humana (SCC25). Foi feita a divisão em três grupos de estudo, um grupo

controle, onde as células SCC25 não sofriam tratamento com substância alguma, um grupo

BMP-2, no qual as células eram tratadas com 100ng/ml de BMP-2 e um grupo de células que

eram tratadas com 100ng/ml de Noggin. Para o ensaio de proliferação e ciclo celular foram

estabelecidos três intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas). A atividade proliferativa foi

investigada por azul de tripan e a análise do ciclo celular através da marcação por iodeto de

propídio em Citometria de fluxo. O potencial de migração/invasão das células SCC25 foi

avaliado através da realização de um ensaio de invasão celular utilizando o matrigel em um

intervalo de 48 horas. A curva de proliferação revelou maior crescimento celular nas células

tratadas com BMP-2 no intervalo de 72 horas (p<0.05) e menor crecimento e viabilidade celular

no grupo Noggin. As proteínas recombinantes favoreceram a maior porcentagem das células na

fase do ciclo celular Go/G1 com diferença estatisticamente significativa no intervalo de 24

horas (p<0,05). A BMP-2 promoveu uma maior invasão das células estudadas, assim como o

seu antagonista Noggin inibiu a invasão das células estudadas (p<0,05). Dessa forma, os

resultados indicam que a BMP-2 favorece o fenótipo maligno, pois estimula a proliferação e

invasão das células SCC25 e seu antagonista Noggin pode ser uma alternativa terapêutica pois

inibiu essas características pró-tumorais.

Palavras-chave: Carcinoma epidermóide oral, proliferação celular, metástase, proteína óssea

morfogenética-2, Noggin.

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ABSTRACT

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ABSTRACT

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most prevalent malignancy in the oral cavity and

reach a large number of individuals, has become an important public health problem. Studies

have demonstrated changes in pathway components BMP in various types of cancers as

prostate, colon, breast, gastric and OSCCs. Is the current knowledge that these proteins may

exert pro-tumor effect in more advanced stages of neoplastic development coming to favor

progression and invasion tumor. The inhibition of the signaling pathway BMP-2 through its

antagonists, have shown positive results of antitumor activity and use of Noggin may be a novel

therapeutic target for cancer. Given this evidence and the few studies with BMP-2, Noggin and

OSCC, the objective of this research was to evaluate the effect of BMP-2 and its antagonist

Noggin on proliferation and migration cell in line of cell cultures of human tongue squamous

cell carcinoma (SCC25). The study was divided in three groups, a control group, where SCC25

cells suffered no treatment, a BMP-2 group, in which cells were treated with 100ng/ml of BMP-

2 and a group of cells that were treated with 100ng/ml of Noggin. For the proliferation assay

and cell cycle were established three time intervals (24, 48 and 72 hours). Proliferative activity

was investigated by trypan blue and cell cycle analysis by staining with propidium iodide flow

cytometry. The potential for migration / invasion of SCC25 cells was performing by a cell

invasion assay using Matrigel in a 48-hour interval. The proliferation curve showed a higher

proliferation in cells treated with BMP-2 in 72 hours (p < 0.05), and lower overgrowth and cell

viability in Noggin group. Recombinant proteins favored a greater percentage of cells in cell

cycle phase Go/G1 with a statistically significant difference in the interval of 24 hours (p <

0.05). BMP- 2 produced a greater invasion of cells studied as well as its antagonist Noggin

inhibits invasion of cells (p < 0.05). Thus, these results indicate that BMP-2 promotes malignant

phenotype, dues stimulates proliferation and invasion of SCC25 cells and, its antagonist Noggin

may be an alternative treatment, due to inhibit the tumor progression.

Keywords: Squamous cell carcinoma, cell proliferation, metastasis, bone morphogenic protein

– 2, Noggin.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1 Sinalização Canônica da via BMP: (1) Fosforilação da R-Smad; (2)

Ligação com a Co-Smad transporte do sinal para núcleo; (3) e (4) inibição

da via por fatores intracelulares (I-Smads e Smufs) .....................................

37

Figura 2 Sinalização canônica da BMP através da Smad; B: Oligomerização do

receptor tipo I e posterior ligação com o receptor tipo II induzindo a via

p38.............................................................................................................

38

Figura 3 Modelo do plaqueamento celular utilizado no estudo para cada ensaio em

placas de 24 poços.........................................................................................

54

Figura 4 Em (A) observa-se a solução do matrigel sobre o filtro na câmara de

invasão (Transwell). (B) Aspecto microscópico dos múltiplos poros da

membrana de polietileno. (C) Disposição dos Transwells nos poços da

placa para o ensaio de invasão ...................................................................

57

Figura 5 Modelo para contagem das células que invadiram a membrana de

polietileno no ensaio de invasão.................................................................

59

Figura 6 Aspecto das membranas escaneadas, sob o aumento de 5000µm. É

possível ver toda a membrana e evidenciar uma maior área de coloração

azul no grupo BMP-2 (B) seguida pelo controle (A) e com menor

intensidade a membrana do grupo Noggin(C)..............................................

67

Gráfico 1 Curva de crescimento das células SCC25 durante 72 horas de experimento

para os diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014..................................

62

Gráfico 2 Quantidade de células SCC25 invasoras expressas em mediana referente

as 4 replicadas, em cada grupo estudado, durante 48 horas.......................

67

19

LISTA DE TABELAS

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LISTA DE TABELAS

Páginas

Tabela 1 - Porcentagem (mediana) das células SCC25 viáveis nos diferentes grupos

durante 72 horas de experimento. Natal-RN, 2014.................................

61

Tabela 2 - Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para

o crescimento das células SCC25, em cada intervalo de tempo, nos

diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014............................................

63

Tabela 3 - Análise pareada do crescimento das células SCC25, em cada intervalo de

tempo, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014..........................

63

Tabela 4 - Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para

a porcentagem de células SCC25, nas fases do ciclo celular no intervalo

de T24, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014.........................

64

Tabela 5 - Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para

a porcentagem de células SCC25, nas fases do ciclo celular no intervalo

de T48, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN,

2014...........................................................................................................

65

Tabela 6 - Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para

a porcentagem de células SCC25, nas fases do ciclo celular no intervalo

de T72, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN,

2014...........................................................................................................

65

Tabela 7 - Medianas da porcentagem de células SCC25 em cada fase do ciclo

celular, nos diferentes grupos estudados, em cada intervalo de tempo.

Natal-RN, 2014..........................................................................................

66

Tabela 8 - Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para

potencial de invasão das células SCC25, durante 48 horas, nos diferentes

grupos estudados. Natal-RN, 2014.............................................................

68

Tabela 9 - Análise pareada das medianas do potencial de invasão das células

SCC25, durante 48 horas, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN,

2014...........................................................................................................

68

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AKT – São proteínas membro da família proteína quinase e desempenha importante

papel na sinalização celular de mamíferos.

BAMBI – Inibido de membrana ligada a activina da proteína morfognética óssea.

BAX - Gene ou proteína pró-apoptótica.

Bcl-2 – Gene ou proteína anti-apoptótica.

BMP – Do inglês, Body Morphogenetic Proteins (Proteína Morfogenética do Osso)

BMPR - Do inglês, Body Morphogenetic Proteins Receptor (Receptor de Proteína

Morfogenética do Osso).

CD 31 - Do inglês, Cluster designation ou Cluster of differentiation (Grupo de

designação ou Grupo de diferenciação).

CEO - Carcinoma epidermóide oral.

C-fos – Do inglês, Finkel & Osteogenic Sarcoma (Finkel e sarcoma osteogênico),

oncogene fos (c-fos) codifica uma proteina nuclear que está envolvida no controle

transcricional relacionado com o crescimento.

C-jun – Do Japonês, jun é a sigla de “JU-Nana" para 17 (vírus do sarcoma aviário 17).

Oncogene jun (c-jun) codifica uma proteína nuclear que está envolvida no controle

transcricional relacionado com o crescimento.

Dan – Do inglês differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma

(seleção de genes aberrante do neublastoma).

EGF – Do inglês Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidérmico).

ERK – Do inglês Extracellular Signal-Regulated Protein Kinases , Sinal celular

regulado por quinase.

FDA – Do inglês Food and Drug Administration é o órgão governamental dos Estados

Unidos da América responsável pelo controle dos alimentos (tanto humano como

animal), suplementos alimentares, medicamentos (humano e animal), cosméticos,

equipamentos médicos, materiais biológicos e produtos derivados do sangue humano.

FvW- Fator de von Willebrand.

HPV - Do inglês Human papilomavirus, Papiloma vírus humano.

IL-8 – Interleucina 8.

INCA - Instituto Nacional do Câncer.

MAPK-p38 – Proteína quinase ativada por mitógeno

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MMP - Metaloproteinases da matriz extracelular.

MTT -

OMS – Organização Mundial da Saúde.

P13K- Do inglês phosphatidylinositol 3-kinase, Fosfatidilinositol 3-quinase. Inibidor

com potencial da atividade neoplásica.

P21 – Proteína reguladora da transição da fase G1 para S no ciclo celular.

PCR - Do inglês Polimerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase).

RAS – Oncogene trandutor de sinal extra celular.

RNAm - Do inglês menseger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro).

RT-PCR - Do inglês Reverse transcription polimerase chain reaction (Reação em

cadeia da polimerase com transcrição reversa).

SMAD - proteínas que modulam a atividade do TGF-β, são homólogas a proteínas

drosófilas, mothers against decapentaplegic (MAD) e Caenorhabditis elegans (SMA).

O nome é uma combinação dos dois.

SMURF – De inglês Smad ubiquitination regulatory factors (Fator regulatório de

ubiquinização de Smad).

TGF - Do inglês Transforming growth factor (Fator transformante de crescimento).

Tsg – Do inglês twisted gastrulation (Gastrulação tocida)

VEGF - Do inglês Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento endotelial

vascular).

Wnt – Do inglês vem a combinação Wg (wingless) and Int (INT gene). Via de

sinalização que está envolvida na embriogênese e câncer.

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SUMÁRIO

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S U M Á R I O

Página

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 27

2 REVISÃO DA LITERATURA......................................................................... 30

2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL............................................................. 31

2.2 BMPS: ESTRUTURA, FUNÇÃO E SINALIZAÇÃO........................................ 33

2.3 NOGGIN: CONSIDERAÇÕES GERAIS........................................................... 39

2.4 A INFLUÊNCIA DOS COMPONENTES DA SINALIZAÇÃO DAS BMPS NO

DESENVOLVIMENTO DO CÂNCER...................................................................

41

2.4.1 Componentes da sinalização da BMP e o CEO.................................................... 47

3 PROPOSIÇÃO...................................................................................................... 50

4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 52

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO.................................................................. 53

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................................... 53

4.3 CULTIVO CELULAR......................................................................................... 53

4.3.1 Plaqueamento celular......................................................................................... 54

4.4 ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR....................................................... 55

4.4.1 Curva de proliferação e viabilidade celular (ensaio azul de tripan).............. 55

4.4.2 Avaliação do ciclo celular em citometria de fluxo............................................ 56

4.5 INVASÃO CELULAR.......................................................................................... 57

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................................... 59

5 RESULTADOS...................................................................................................... 60

5.1 PROLIFERAÇÃO CELULAR............................................................................... 61

26

5.1.1 Viabilidade celular e Curva de proliferação ..................................................... 61

5.1.2 Ciclo Celular ...................................................................................................... 64

5.2 INVASÃO CELULAR........................................................................................ 66

6 DISCUSSÃO........................................................................................................... 69

7 CONCLUSÕES.................................................................................................. 78

REFERÊNCIAS................................................................................................. 80

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INTRODUÇÃO

“Ensina-me o bom senso e o conhecimento, pois confio em Teus mandamentos.”

(Salmos 116:66)

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1 INTRODUÇÃO

O câncer é a principal causa de morbidade em todo o mundo e é uma das principais

causas de morte em toda a sociedade (SHENOI et al., 2012). O carcinoma epidermóide (CE) é

a neoplasia maligna mais comum da boca, representando cerca de 90% de todas as neoplasias

malignas que acometem as estruturas orais. A sua ocorrência corresponde a sexta dentre todas

as neoplasias malignas que afetam o ser humano (CHOI et al., 2006; LIANG et al., 2008).

O carcinoma epidermóide oral (CEO), devido ao grande número de indivíduos que

acometem, acaba se tornado um relevante problema de saúde pública. Numerosos são os

estudos que visam compreender sua etiologia e patogênese, identificando genes e proteínas que

estão envolvidos nesses processos (HARDISSON, 2003; NAGPAL; DAS, 2003;

THIAGARAJAN et al., 2014; CHENG; REES; WRIGHT, 2014). Acredita-se que esses estudos

sejam importantes para o estabelecimento de novas e específicas estratégias de diagnóstico,

prognóstico e tratamento dessas neoplasias (BAGAN; SCULLY,2009; SCULLY; BAGAN,

2009).

As proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) são citocinas pleiotrópicas pertencentes

à superfamília do fator de crescimento transformador-β (TGF-β) (BALEMANS; VAN HUL,

2002). A literatura contemporânea acredita que as BMPs tenham efetiva participação no

crescimento de neoplasias malignas. Muitos estudos demonstram alterações nos componentes

da via BMP em vários tipos de tumores, como os de próstata, cólon, mama, cérebro, gástricos

e epidermóides orais (DERYNCK; AKHURST; BALMAIN, 2001; LEVY; HILL, 2006;

BLANCO CALVO et al., 2009; KANG et al., 2010; DE CARVALHO et al., 2011).

A via de sinalização das BMPs é mediada por receptores, co-receptores e antagonistas

(BLANCO CALVO et al. 2009). A sinalização intracelular da BMP-2 forma complexos que se

translocam para o núcleo e regulam a transcrição de genes alvos, tais como ciclina D1, p21,

BAX, Bcl-2, VEGF e MMPs que irão ativar mecanismos relacionados à proliferação, apoptose,

angiogênese e remodelação tecidual (VON BUBNOFF; CHO, 2001; HARDWICK et al., 2004;

HARDWICK et al., 2008).

A inibição da via de sinalização da BMP vem sendo estudada em alguns carcinomas

como próstata, esôfago e mama, sendo um fator que diminui a proliferação das células malignas

(FEELEY et al., 2006; YUEN et al., 2012; OWEN et al., 2013), dentre esses inibidores da

sinalização das BMPs, destaca-se o Noggin, inibidor com mais especificidade para a BMP-2

(SONG et al., 2010). A expressão do Noggin em muitos cânceres é baixa (LAURILA et al.,

29

2013) e administração da proteína recombinante Noggin em células de carcinoma de próstata

diminuiu o potencial de proliferação e invasão dessas células (FEELEY et al. 2006).

Considerando-se que as células malignas são mais susceptíveis a estímulos

proliferativos por apresentarem cascatas de sinalização alteradas de várias proteínas e, desta

forma, promoverem a expressão aberrante de BMP-2, este trabalho tem por objetivo avaliar, a

proliferação e o potencial de invasão em culturas de células de carcinoma epidermóide de língua

humana (SCC25), quando tratadas com proteínas recombinantes BMP-2 e Noggin e, assim

contribuir para um melhor entendimento do mecanismo da BMP-2 e do Noggin sobre processos

celulares determinantes à carcinogênese, já que são escassos os trabalhos envolvendo essas

proteínas em CEO.

30

REVISÃO DE LITERATURA

“Dedique à disciplina o seu coração, e os seus ouvidos às palavras que dão conhecimento”.

(Provérbios 23:12)

31

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL

O CE, também denominado de carcinoma de células escamosas ou carcinoma

espinocelular, define-se como uma neoplasia maligna com origem no epitélio pavimentoso

estratificado (KADEMANI, 2007).

Histologicamente, o CE se apresenta como uma proliferação de células da camada

espinhosa, que se dispõe em grupos celulares, formando cordões e ninhos ou, isoladamente,

invadindo o conjuntivo. As células neoplásicas exibem hipercromatismo nuclear, pleomorfismo

celular, mitoses atípicas, dentre outras anormalidades (JOHNSON et al., 2005; NEVILLE et

al., 2009; BATISTA et al., 2010).

Conforme definição da Organização Mundial de Saúde (OMS), o CEO se caracteriza

por ser uma neoplasia epitelial invasiva com variados graus de diferenciação escamosa e uma

propensão à metástases linfonodais precoces (JOHNSON et al., 2005). No Brasil, este câncer é

o quinto mais incidente em homens e o décimo primeiro em mulheres. Quanto a estimativa para

CEO em 2012/2013 esta é de 9.990 novos casos por 100.000 homens, e de 4.180 por 100.000

mulheres. Para o estado do Rio Grande do Norte, a incidência prevista é de 5 a 7% de todas as

neoplasias malignas (INCA, 2014).

Os CEs podem acometer qualquer parte da cavidade oral, desde os lábios até o arco

palatoglosso. Os sítios mais comuns variam geograficamente, refletindo diferentes fatores de

risco (SHENOI et al., 2012). Este fato pode ser observado no Brasil, uma vez que a incidência

de CEO varia nas diferentes regiões, possivelmente, devido às diferenças locais na prevalência

dos fatores de risco (COSTA; ARAÚJO; RAMOS, 2005; LOSI-GUEMBAROVSKI et al.,

2009; FANG et al., 2013).

Os sítios anatômicos mais acometidos pelo CEO refletem os diferentes fatores a que

uma determinada população está exposta. Desta forma, a língua tem sido o principal sítio de

acometimento na Inglaterra, Estados Unidos e Coréia, provavelmente pelo consumo de tabaco

e álcool (OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996; SASAKI et al., 2005; CHOI et al., 2006; FANG

et al., 2013). Na Ásia, países como Tailândia e Taiwan demonstram ser a mucosa jugal a

localização mais comum, devido ao hábito de mascar betel (FRITZ et al., 2000; IAMAROON

et al., 2004; THIAGARAJAN et al., 2014). Em países tropicais como Brasil e Austrália, a alta

incidência de CE de lábio inferior se deve, principalmente, à intensa exposição solar a que essa

população está submetida (COSTA e al., 2002; RENA et al., 2014).

32

Muitos fatores estão envolvidos com a etiologia do CEO. Entre esses se destacam os

fatores extrínsecos como o uso de tabaco, álcool, infecção pelo papilomavírus humano (HPV)

e a radiação solar ultravioleta que representa o principal fator etiológico dos carcinomas de

lábio inferior (LOURENÇO et al., 2007; SOARES et al., 2008; SCULLY; BAGAN, 2009). Já

entre os fatores intrínsecos se incluem alterações genéticas, hábitos alimentares, estado

imunológico e saúde oral geral (MCDOWELL, 2006; AMTHA et al., 2009; SCULLY;

BAGAN, 2009). Contudo, para o seu desenvolvimento, torna-se necessário uma associação

destes fatores, tendo em vista ser o CEO uma doença de etiologia multifatorial (CURADO;

HASHIBE, 2009).

Pacientes acima de 40 anos são os mais acometidos, apresentando maior incidência com

o decorrer da idade, sendo mais no sexo masculino que no feminino (3:1) (NEVILLE et al.,

2009). No entanto, a incidência dessa neoplasia em adultos jovens e mulheres vêm crescendo,

segundo levantamentos feitos na última década. Isto é atribuído principalmente pela mudança

de hábitos das mulheres, como o aumento no consumo de álcool e tabaco, na expectativa de

vida e o da infecção pelo HPV (SOARES et al., 2008; CURADO; HASHIBE, 2009; PATEL,

2011; MAJCHRZAK et al., 2014;THIAGARAJAN et al., 2014).

O potencial de agressividade está relacionado com diversos fatores, entre os quais se

tem como mais significativos o grau histológico de malignidade, tamanho da lesão, grau de

comprometimento dos tecidos vizinhos, presença de metástase no momento do diagnóstico e

localização anatômica do tumor (CHOI et al., 2006), muito embora, esses fatores não permitam,

realmente, prever o comportamento e o prognóstico dos casos (COSTA et al. 2002). Nesse

contexto, marcadores moleculares têm sido extensamente procurados e estudados, porém ainda

não foram totalmente esclarecidos.

O caráter genético do CEO é algo já bem estabelecido, onde se observam alterações

estruturais envolvendo cromossomos 3, 7, 8, 9 e 11 (BAGAN; SCULLY, 2009), múltiplas

alterações envolvendo oncogenes, genes supressores de tumor e os genes que são responsáveis

pelo reparo do DNA. Os fatores ambientais, quando associados a esses fatores acarretam um

mau funcionamento, com conseqüente perda de controle das funções celulares como divisão,

diferenciação, senescência e apoptose, atribuindo à neoplasia suas características (SCULLY;

BAGAN, 2009).

Os genes supressores de tumor geralmente são envolvidos na oncogênese, e mutações

e/ou deleções podem provocar perda de sua função. Como esses genes normalmente impedem

uma proliferação celular desenfreada, sua desregulação pode levar a aumento de proliferação,

33

perda de coesão, invasão local e metástases. Além desses genes, podemos observar que

oncogenes, genes reguladores da apoptose e genes do reparo de DNA também estão envolvidos

com a carcinogênese. Os produtos desses genes são utilizados como marcadores em cânceres,

sendo os mais observados, o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), erbB2,

erbB3, genes membros da família ras (H-ras, K-ras, N-ras), c-fos, c-jun, marcadores da

apoptose Bax e Bcl-3, genes supressores de tumor p53 e p16 e marcadores de proliferação Ki-

67 (HARDISSON, 2003; BAGAN; SCULLY, 2009).

Muitos eventos moleculares cercam o processo de carcinogênese. Baseados nisso

pesquisas tentam relacionar os aspectos clínico-patológicos com biomarcadores envolvidos

com este complexo processo, para que ao final se possa correlacionar com o prognóstico, bem

como encontrar alternativas terapêuticas que proporcionem uma sobrevida maior para os

pacientes acometidos pelo câncer. Dentre estes, se destacam as BMPs.

2.2 BMPS: ESTRUTURA, FUNÇÃO E SINALIZAÇÃO

As BMPs são fatores de crescimento multifuncionais pertencentes à superfamília do

fator de crescimento transformador β (TGF- β) e foi primeiramente identificada pelo Dr.

Marshal Urist, em 1965. Entretanto, essas proteínas responsáveis pela indução de osso

permaneceram desconhecidas até a purificação e a seqüência de BMP bovina-3 (osteogenina)

e clonagem das BMP-2 e -4 de humanos, no final de 1980 (CHEN; ZHAO; MUNDY, 2004;

XIAO; XIANG; SHAO, 2007). Cerca de vinte membros de BMPs têm sido identificados em

uma ampla variedade de organismos, desde insetos a mamíferos (HSU et al., 2005; KIM; KIM,

2006; STEINERT et al., 2008).

A família BMP é composta pelas seguintes moléculas: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-

5, BMP-6, BMP-7, BMP-8A, BMP-8B, Gdf2 (também chamada de BMP-9), BMP-10, Gdf11

(BMP-11), Gdf7 (BMP-12), Gdf6 (BMP-13), Gdf5 (BMP-14), BMP-15. Apenas a BMP-1, não

pertence à família do TGF- β, embora nomeado BMP, não possui a sequência C-terminal que

caracteriza a estrutura molecular deste grupo de citocinas, sendo identificada como uma

proteinase C pró-colágeno e Chordin, um antagonista da ação das BMPs. (CANALIS;

ECONOMIDES; GAZERRO, 2003; GRANJEIRO et al., 2005).

Todos os membros da superfamília TGF-β são caracterizados pela presença de sete

cisteínas que participam na dobra das estruturas protéicas terciárias e quaternárias. As BMPs

podem ser distinguidas do TGF-β através da sexta cisteína que constrói um nó de cisteína e, da

34

sétima que é usada para a dimerização com um segundo monômero e, essa dimerização é pré-

requisito para sua ação biológica (NOHE et al., 2004; WAN; CAO, 2005).

As BMPs são glicoproteínas de peso molecular baixo, de estrutura dímera, composta

por duas cadeias polipeptídicas, unidas por pontes de dissufelto, podendo ser homodímeras

(duas cadeias idênticas) ou moléculas heterodímeras (duas cadeias diferentes) (GRANJEIRO

et al., 2005). Ao sofrerem dimerização, suas moléculas são clivadas proteoliticamente na região

carboxi-terminal durante sua secreção. Uma vez secretadas, ligantes diméricos maduros com

peso de 21-25 KDa ligam-se a receptores de membrana plasmática em diferentes tipos celulares,

com efeitos autócrinos e parácrinos (BALEMANS; VAN HUL, 2002; KIM; KIM, 2006).

Com o avanço das pesquisas, observou-se o relevante potencial biológico da sinalização

das BMPs, participando da morfogênese, desenvolvimento e homeostase de diversos órgãos

como o coração, rim, cérebro, olhos, pulmão, pele, dente, etc. Diante desses achados, foi

proposto que as BMPs não fossem tão somente consideradas proteínas relacionadas com o

tecido ósseo e sim denominadas proteínas morfogenéticas do corpo (que no inglês é Body, desta

forma, não alterando a sigla), pois se tem demonstrado um amplo espectro de atividades

biológicas relativas a essas proteínas sobre diversos tipos celulares, incluindo monócitos,

células epiteliais, células mesenquimais e células neurais (BALEMANS; VAN HUL, 2002;

REDDI, 2005).

Estudos demonstraram que ratos mutantes para BMP-2 morrem ao apresentarem

defeitos no desenvolvimento cardíaco e nos tecidos periembrionários. Mutações na BMP-4

também causam morte por falta de diferenciação mesodérmica. Além disso, ratos com mutações

no gene da BMP-7 acarretam a não formação de olhos e falta de desenvolvimento glomerular,

o que leva a insuficiência renal e morte logo após o nascimento, bem como, defeitos na BMP-

8 provocam infertilidade devido a defeitos na espermatogênese (VARGA; WRANDA, 2005).

Xiao, Xiang e Shao (2007) afirmaram que as BMPs são capazes de controlar diferentes

medidas de diferenciação e de especificação de vários tipos de células embrionárias para

originarem componentes distintos do sistema nervoso dos vertebrados. Da mesma forma, no

desenvolvimento embrionário, as BMPs têm um papel fundamental na apoptose, um processo

necessário para remover as células que não serão mais úteis no desenvolvimento.

Estudando a imunolocalização da BMP-2, em embrião humano, observou-se sua

presença nos germes dos dentes, principalmente na lâmina dentária e retículo estrelado, nos

osteoblastos ao redor da matriz do osso dos maxilares, nas fibras musculares estriadas imaturas

35

da língua e no epitélio pavimentoso estratificado da boca e esôfago, sugerindo que essa proteína

está envolvida na morfogênese dos tecidos maxilofaciais (SUZUKI et al., 2001).

Partindo do princípio de que as células da epiderme sofrem continuadamente um

processo de auto-renovação e que suas células têm a capacidade de sair do ciclo celular e sofrer

diferenciação terminal através da adição da BMP-6, foi que Gosselet et al. (2007) realizaram

estudos utilizando culturas de células com três tipos de ceratinócitos epidérmicos interfolicular

primários e BMP-2 e -6. Verificaram os autores, que o tratamento com essas BMPs resultou

numa transição de colônias proliferativas para colônias abortivas, sugerindo que essas proteínas

inibem a proliferação celular e fazendo com que essas células saiam do ciclo. Concluíram que

as BMPs-2 e -6 inibem a proliferação celular dos ceratinócitos, fazendo com que

consecutivamente estes sofram diferenciação terminal.

A sinalização das BMPs é mediada por receptores transmembrana do tipo

treonina/serina quinase, onde três tipos de receptores I têm mostrado ligarem-se as BMPs:

receptor activina tipo IA (ActRIA ou Alk 2), tipo IA (BMPR-IA ou Alk3) e IB (BMPR-IB ou

Alk6) e também três tipos de receptores II, consistindo em receptor tipo II BMP (BMPR-II),

tipo IIA (ActR-IIA) e o tipo IIB (ActR-IIB). Os domínios quinase treonina/serina dos receptores

tipo II são constitutivamente ativos e fosforilam os domínios Gly-Ser (GS) nos receptores tipo

I após a interação com a BMP ligante, resultando assim na ativação das quinases dos receptores

tipo I (BLANCO CALVO et al., 2009).

A especificidade de sinalização da BMP é largamente mediada por receptores tipo I.

Estudos in vitro têm mostrado que todos os membros das BMPs ligam-se a receptores BMPR-

II em combinação com BMPR-IA, embora exista uma combinação preferencial entre ligantes

e receptores (HSU et al., 2005; KIM; KIM, 2006).

Respostas distintas da via BMP dependem da natureza do complexo ligante – receptor

formado. Se o complexo de receptores tipo I e II forem heterodímeros, a via da BMP sinaliza a

ativação de mensageiros Smads intracelular (via canônica). Entretanto, se o complexo é

homodímero ocorre a ativação mitógena da via de proteínas Quinases (MAPRK) (WAN; CAO,

2005).

O complexo BMPR-I/BMPR-II se auto fosforila e adquire habilidade para fosforilar

proteínas Smads, que constituem uma família de transdutores de sinal da superfamília TGF-β.

Estas proteínas são classificadas dependendo de suas funções em três distintos grupos: Smads

receptor-reguladas (R-Smads), Smads mediadores comuns (Co-Smads) e Smads Inibidores (I-

Smads). São identificadas oito proteínas Smads, dentre elas, as Smads 1, 5 e 8 são R-Smads,

36

que são ativadas pelos receptores tipo I. A Co-Smad é representada apenas pela Smad-4 e as

Smads 6 e 7 funcionam como I-Smads. As Smads 2 e 3 somente transmitem sinais para o TGF-

β, Nodal ou ligantes de Activina (smads reguladores de Activina ou RA-Smads). As Smads têm

um amplo espectro de atuação e regulam desde a ativação de receptores, bem como a exportação

e a importação nuclear de Smads até a atividade transcricional (HARRISSON, 2004; ROSS;

HIL, 2008).

A sinalização via BMP é bem específica e controlada pelos receptores tipo I; por

exemplo, as BMPs-2 e -4 ligam-se a ambos os receptores Alk3 e Alk6, os quais sinalizam

através das três conhecidas R-Smads. A BMP-7 tem elevada afinidade pelo Alk2, mas pode se

ligar tanto ao Alk3 como ao Alk6. A BMP-6 liga-se exclusivamente ao Alk-2 e sinaliza através

das Smads 1 e 5 (VON BUBNOFF; CHO, 2001).

Uma vez ativados, os receptores tipo I fosforilam as R-Smads e estas por sua vez,

formam complexos com Co-Smads, que se translocam para o núcleo e regulam a transcrição de

vários genes alvos, através da interação com fatores de transcrição ou com co-ativadores ou co-

repressores transcricionais (MIYAZONO; MAEDA; IMAMURA, 2005). Para Wan e Cao

(2005), esta via de sinalização tem como produto final o estímulo da expressão gênica no

núcleo, alterando então a atividade celular, incluindo crescimento, diferenciação e síntese de

matriz extracelular (Figura 1).

37

Fonte: Adaptado de Blanco Calvo et al. (2009)

Figura 1. Sinalização Canônica da via BMP: (1) Fosforilação da R-Smad; (2) Ligação com a

Co-Smad transporte do sinal para núcleo; (3) e (4) inibição da via por fatores intracelulares (I-

Smads e Smufs).

Outra via de sinalização que vem sendo discutida na literatura é a MAPK-p38, que pode

ser Smad-independente e é induzida pela oligomerização dos receptores através da BMP-2. A

BMP-2 pode inicialmente mediar a homodimerização do receptor I e posteriormente recrutar o

receptor II (que não está na forma homodímera). Esta ativação deste complexo resulta na

indução da via MAPK-p38. Cada diferente receptor oligômero pode estar associado a diferentes

proteínas citoplasmáticas, que podem regular vias de sinalização distintas (Figura 2) (NOHE et

al., 2001).

38

Fonte: Adaptado de Nohe et al. 2001

Figura 2. A: Sinalização canônica da BMP através da Smad; B: Oligomerização do receptor

tipo I e posterior ligação com o receptor tipo II induzindo a via p38.

A cascata de sinalização via BMPs é controlada em diversos níveis por fatores

intracelulares e extracelulares, incluindo inibição da interação do receptor BMPR-BMP por

proteínas extracelulares que se ligam à BMP; presença de pseudorreceptores de membrana;

bloqueio da sinalização da BMP pela ligação intracelular das Smads; ubiquitinização e

degradação proteossomal das moléculas de sinalização das BMPs (BALEMANS; VAN HUL,

2002; GAZZERRO; CANALIS, 2006).

Na superfície celular existe outro nível de regulação, o pseudorreceptor de BMP

(BAMBI - BMP and Activin membrane-bound inhibitor), que é uma glicoproteína

transmembrana com domínio extracelular semelhante aos receptores da BMP. Este

pseudorreceptor neutraliza os receptores tipos II, sem contato direto com as BMPs (NOHE et

al, 2004).

No citoplasma, a I-Smads é responsável pela regulação da via de sinalização da BMP.

Estas Smads (6 e 7) se ligam a receptores tipo I, interferindo com a fosforilação da Smad 1/5/8

e heterodimerização com Smad 4. Adicionalmente I-Smad impede a formação do complexo R-

Smad/Co-Smad. A expressão das Smads 6 e 7 é induzida por múltiplos estímulos, incluindo

BMP-7 e EGF, além de condições patológicas. Pode-se ainda encontrar dois fatores de

ubiquinização de Smads, isto é, Smuf 1 e 2, que são mediadores da etapa final de ubiquinização

das proteínas alvo. Essas Smufs contem domínio catalítico HECT, que modula a sinalização do

Sinalização

Sinalização

Genes alvos

Genes alvos NÚCL

A B

39

TGF-β por selecionar, como alvo, o receptor tipo I e as proteínas Smads (BALEMANS; VAN

HUL, 2002; GAZERRO; CANLIS, 2006).

Em nível extracelular, o controle é feito por proteínas que se ligam seletivamente às

BMPs, impedindo a interação destas com os seus receptores treonina/serina quinase afins. Estes

antagonistas possuem em sua estrutura grupamentos cisteína, assim como os membros do TGF-

β, inclusive as BMPs, e são classificados em três subfamílias, baseando-se no tamanho dos

grupos cisteína: a família DAN, a Tsg (Twisted gastrulation) e a Chordin e Noggin

(HARRISON et al., 2004; YANAGITA, 2005). Esses antagonistas ligam-se às BMPs com a

mesma afinidade de seus receptores específicos, bloqueando a transdução de sinal e

diminuindo, então, a sua atividade biológica, que pode ser, por exemplo, a da formação óssea.

Quando há superexpressão das BMPs em condições patológicas, como a formação excessiva

de osso, estes antagonistas podem representar uma proposta terapêutica bastante eficaz

(GROPPE et al., 2002).

2.3 NOGGIN: CONSIDERAÇÕES GERAIS

O Noggin foi primeiramente isolado de Xenopus laevis em estudos sobre o

desenvolvimento dorsal em embriões por tratamento de Ultravioleta e demonstrou ser expresso

em estágios precoces da gastrulação, participando da morfogênese do tecido muscular e

nervoso. É secretado como uma proteína glicosilada, sendo um homodímero ligado

covalentemente, pesando aproximadamente 64 KDa. Sua estrutura primária consiste de uma

região amino-terminal e outra carboxi-terminal contendo um grupamento cisteína. Ao centro

segmentos ligantes de heparina básica mantêm o Noggin na superfície celular, o qual se liga

com vários graus de afinidade as BMPs, tendo como papel fisiológico, primário, antagonizar a

ação direta das BMPs (ZIMMERMAN; DE JESÚS-ESCOBAR; HARLAND, 1996;

BALEMANS; VAN HUL, 2002; GROPPE et al., 2002). Em experiências in vitro esta proteína

inibe de forma efetiva as BMP-2 , -4 , -5 , -7 , -13 e -14 e de forma menos efetiva BMPs -3 , -6

, -9 , -10 e -15 (GAMER et al, 2005; SEEMANN et al, 2009; SONG et al , 2010).

As superfícies dos ligantes de BMP têm duas placas proeminentes hidrofóbicas, uma

convexa cuja interface liga-se ao receptor tipo II e a outra côncava, que se liga ao receptor tipo

I. A superposição da estrutura do Noggin e da BMP-7 dentro do modelo do complexo de

sinalização, mostra que o Noggin se liga efetivamente aos pares de epítopos ligantes,

confirmando a habilidade de tal antagonista em inibir a ligação aos tipos de receptores

40

(ZIMMERMAN; DE JESÚS-ESCOBAR; HARLAND, 1996; GROPPE et al., 2002; KRAUSE;

GUZMAN; KNAUS, 2011).

Hsu et al (1998) observaram que o Noggin compete com membros da família do

antagonista DAN para ligar-se à BMP-2, sugerindo que a interação entre BMP-2 e estes

antagonistas ocorram através do domínio BMP similar.

A presença de Noggin é essencial no desenvolvimento de estruturas derivados do

ectoderma, tais como o tubo neural, dentes, folículos pilosos e olhos (MCMAHON et al., 1998).

Embora a indução do tubo neural ocorra na ausência de Noggin, foi mostrado ser crucial para

a neurogênese (MCMAHON et al., 1998; LIM et al., 2000). Noggin é expresso na notocorda e

é aumentada mediante exposição de noradrenalina em tecidos derivados do ectoderma

(MCMAHON et al., 1998). A superexpressão de Noggin neutraliza a atividade de BMP-4 em

células precursoras neurais causando alta proliferação do tecido neural (BONAGUIDI et al.,

2008).

Noggin também é expresso na papila dérmica e no tecido conjuntivo do folículo piloso,

onde ele neutraliza a BMP-4 parando a indução folículo piloso em culturas de órgãos

embrionários da pele (BOTCHKAREV et al., 1999). Curiosamente, a aplicação ectópica de

Noggin e subsequente inibição da BMP-4 conduz alterações no fenótipo do dente, levando a

molares e incisivos defeituosos (TUCKER; MATTHEWS; SHARPE, 1998).

No desenvolvimento embrionário da papila gustativa fungiforme, as BMPs -2, -4 e -7

e o Noggin apresentam distribuições distintas e desenvolvem diferentes papéis por vias opostas,

seja inibindo ou induzindo a proliferação celular, de acordo com os estágios de formação de tal

estrutura (ZHOU; LIU, MISTRETTA, 2006).

O Noggin é fundamental para condrogênese embrionária, osteogênese e formação de

articulação (GONG et al., 1999; TYLZANOWSKI et al., 2006). Expressão desta proteína em

osteoblastos é aumentada na presença de BMP-2, -4, -5, -6, -7 (GAZZERRO; GRANGJI;

CANALIS, 1998;. SONG et al., 2010). Camundongos transgênicos com superexpressão de

Noggin revelaram uma diminuição drástica na densidade mineral óssea e taxa de formação

óssea, devido ao recrutamento e função de osteoblastos estarem prejudicados (WU et al., 2003).

Gazzerro, Gangji e Canalis (1998) estudando a expressão das BMPs e do Noggin em

cultura de osteoblastos de ratos, observaram que a BMP-2 estimulou o aumento da síntese de

Noggin por mecanismos transcricionais, ao mesmo tempo que este último diminuiu os efeitos

biológicos das BMP-2, -4 e -6 relacionado com a função osteoclástica, indicando, assim, um

possível papel do Noggin em limitar as ações das BMPs em células do tecido ósseo.

41

Experimentos tem demonstrado que o Noggin em combinação com um fator de

crescimento de fibroblastos básico (bFGF) é suficiente para manter o crescimento prolongado

de células tronco embrionárias humanas (hES) in vitro (WANG et al., 2005). Além disto, esta

protéina também antagoniza a sinalização da BMP para regular o nicho de células-tronco

durante a neurogênese (LIM et al., 2000).

Um novo papel de Noggin em células de câncer de próstata osteolítica tem sido

indentificado. Verificou-se uma baixa expressão de Noggin em células deste tipo de neoplasia

e isto induz metástases ósseas (SCHWANINGER et al.,2007; KRAUSE; GUZMAN; KNAUS,

2011).

As BMPs são proteínas envolvidas na manutenção de um estado de quiescência de

células-tronco em seus nichos e, mais tarde, em sua diferenciação em células maduras nos

tecidos normais. Deste modo, alteração nos componentes da via de sinalização da BMP pode

levar a atividade proliferativa descontrolada das células-tronco normais, quebrando o

equilíbrio. Sendo o câncer um processo multifásico, resultante da proliferação clonal de células

alteradas que escapam dos mecanismos de controle, é evidente que as alterações na via da BMP

podem ser um importante marco na genética e nos eventos moleculares que conduzem ao

desenvolvimento do câncer (BLANCO CALVO et al., 2009).

2.4 A INFLUÊNCIA DOS COMPONENTES DA SINALIZAÇÃO DAS BMPS NO

DESENVOLVIMENTO DO CÂNCER

Pesquisas nas áreas de embriologia, genética e carcinogênese evidenciam que alterações

na via de sinalização das BMPs contribuem para o desenvolvimento de neoplasias, sendo que

os primeiros indícios surgiram a partir de estudos genéticos de síndromes de câncer familial,

como a polipose juvenil familial, onde mutações do Smad-4 e do BMPR-IA estão implicadas

na origem da doença. Mutações no BMPR-IA foram identificadas em portadores da síndrome

de Cowden, que é uma síndrome de câncer de mama hereditário. Adicionalmente, a via de

sinalização das BMPs encontra-se alterada em cânceres humanos esporádicos (próstata, cólon,

mama, cérebro, rim, bexiga, pulmão) e a atuação destas proteínas em carcinogênese é complexa,

pois envolve tanto efeitos pró-tumorais, como anti-tumorais (HSU et al, 2005).

Hatakeyama et al. (1997) estudaram a expressão do RNAm das BMPs (-1, -2, -3, -4, -5,

-6, -7) em células epiteliais neoplásicas originárias do estômago, reto, bexiga, tireóide, glândula

salivar, língua e gengiva. Verificaram que todas as linhagens celulares expressaram, em vários

graus, os subtipos de BMPs. As células do carcinoma epidermóide de língua, gengiva e gástrico

42

expressaram apenas as BMP-1 e BMP-2. O adenocarcinoma expressou fracamente as BMPs (-

1, -2, -6, -3 e -7). A marcação imunoistoquímica da BMP-2 no citoplasma das células do

carcinoma de língua, confirmou sua presença nessa neoplasia, sugerindo, assim, que as células

epiteliais neoplásicas possuem um alto potencial para expressar o RNAm das BMPs.

As BMPs podem atuar como oncogene e como supressor tumoral, a depender do estágio

da doença e da sua concentração na matriz tumoral. Além disso, como os efeitos das BMPs são

célula-específico e, por isto, podem variar entre os diversos tipos tumorais, inclusive naqueles

de mesma origem celular (HSU et al., 2005). Langenfeld et al. (2005) ainda mencionam que as

condições de cultura, em estudos in vitro, bem como a concentração de antagonistas intra e

extracelular interferem na atividade biológica das BMPs.

Segundo Kim e Kim (2006), o efeito preciso das BMPs em células malignas deve ser

interpretado no contexto do tipo celular e condições experimentais, pois realizando uma revisão

da atuação dessas proteínas em diversos tipos de câncer, observou-se que dependendo do tipo

de câncer estudado elas poderiam estar super ou subexpressas, como por exemplo, no

carcinoma de células transicionais da bexiga, verificou-se uma subexpressão, enquanto que no

câncer colorretal e de mama uma superexpressão.

Em uma revisão de literatura de Hsu et al. (2005) sobre BMPs e melanomas, esses

autores afirmaram que a BMP-7 pode ter uma função antitumoral e pró-tumoral. A

superexpressão da BMP-7 ocorre durante a transformação melanocítica, que atua de forma

autócrina inibindo o crescimento no estágio inicial de desenvolvimento do melanoma. Como o

tumor tende a progredir em direção a um fenótipo mais agressivo, as células do melanoma

produzem constantemente altos níveis de BMP-7 e, por conseguinte, duas situações podem

ocorrer, uma que se caracteriza pelo desenvolvimento de resistência ao efeito antitumoral da

mesma, através da concorrente superexpressão dos inibidores das BMPs, como o Noggin,

enquanto que, a outra, mostra que altos níveis de BMP-7, nos estágios mais avançados da

doença, promove metástase, estimulando a angiogênese e a remodelação da matriz tumoral

(efeito pró-tumoral). Afirmaram, ainda, que este efeito duplo também se aplica às demais BMPs

e a toda superfamília TGF-β.

Rothhammer et al. (2005) analisaram a expressão da BMPs-2, -4 e -7 em melanoma

humano através da RT-PCR. Primeiramente observaram a expressão dessas proteínas em

linhagem de células de melanoma através da RT-PCR. A expressão de BMP-2 só foi detectada

em duas das linhas de células analisadas, SK Mel 28 e Ei Mel, enquanto BMP-4 foi expressa

em todas as linhagens celulares e BMP-7 em quase todas, menos em uma (HTZ19D) não foi

43

detectada. Estes resultados confirmaram uma expressão forte de BMP-4 e uma expressão

moderada de BMP-7 nas linhagens de células de melanoma. Além disto, foi feita a marcação

imunoistoquímica dessas lesões, utilizando o nevus como controle negativo. A marcação

continuou forte para BMP-4 e BMP-9, tanto em tumor primário como em metástases e negativa

para o nevus. Sugeriram assim, que as BMPs têm uma importante participação em melanomas

humanos, facilitando a invasão celular e a migração.

Para ocorrer o crescimento tumoral é necessário sustentação e alimentação das células

neoplásicas, neste sentido Langenfeld e Langenfeld (2004), estudaram o papel da BMP-2 na

angiogênese e, verificaram que a mesma aumenta a neovascularização no desenvolvimento de

tumores, fato este confirmado pela utilização de uma BMP-2 recombinante que estimulou a

formação de vasos sanguíneos numa linhagem celular (A549) de câncer pulmonar. Sua

propriedade em ativar as células endoteliais foi demonstrada pela habilidade de fosforilar a

Smad 1/5/8 e ERK-1/2 e, aumentar a expressão do id1, com consequente proliferação e

formação do vaso. Concluíram assim que a expressão da BMP-2 em tumores de pulmão tem

um importante papel no processo da tumorigênese.

Raida et al. (2005) investigaram o possível papel da BMP-2 sobre células endoteliais da

microcirculação da derme humana (CEMDH) e uma possível atividade angiogênica, através da

implantação subcutânea de uma esponja estéril no dorso de ratos, sendo inoculada com rhBMP-

2 (recombinante) e rhVEGF (recombinante), ou combinação de ambos, diariamente, durante 7

dias (prova da esponja). Além disso, implantaram-se, em ratos, células de câncer de mama da

linhagem MCF-7 transfectadas com BMP-2, para avaliar o efeito da superexpressão desta

citocina sobre a vascularização tumoral. Após a prova, as esponjas removidas foram

imunomarcadas com anticorpos anti-FvW e anti-CD31, revelando aumento da atividade

angiogênica com significativo incremento da vascularização no grupo de tratamento

combinado. Nos ratos transfectados com MCF-7/BMP-2, observou-se o desenvolvimento de

tumores com diâmetro de 1-1,5 cm2, já aqueles transfectados com MCF-7 sem BMP-2 não

desenvolveram tumores. Concluiu-se que a BMP-2, em câncer de mama, estimula a

angiogênese, sugerindo que a inibição desta via de sinalização pode ter importante valor

terapêutico.

No ano seguinte, o mesmo grupo de pesquisadores supracitados (RAIDA et al. 2006),

em uma pesquisa com células progenitoras epiteliais, células troncos mesenquimais e BMP-2

recombinante, concluíram que a secreção da BMP-2 associada ao tumor, pode promover a

angiogênese tumoral por efeitos quimiotáticos nas células progenitoras endoteliais circulantes

44

do sangue periférico. Além disso, a presença de BMP-2 aumenta a secreção parácrina de fatores

de crescimento angiogênico, como o fator de crescimento placentário (PIGF) e o fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF), em células tronco mesenquimais, no estroma tumoral.

Bieniasz et al. (2009), tentando esclarecer o papel da BMP no desenvolvimento do

câncer de pulmão e estabelecer uma provável relação entre essa proteína e fatores de

crescimento vasculares na promoção da angiogênese tumoral, estudaram a relação entre a BMP-

2 e o VEGF em carcinomas de pulmão. Observaram através da PCR em tempo real uma

correlação positiva entre a expressão do RNAm do VEGF e BMP-2 nos tecidos com câncer de

pulmão, quando comparados com tecidos de pulmão normal. Concluíram que a BMP-2 pode

colaborar com o VEGF na promoção do crescimento do tumor ou invasão, estimulando a

angiogênese.

Metástases ósseas são fontes significativas de morbidade e mortalidade entre pacientes

com câncer de próstata. Feeley et al. (2005) tentaram determinar o papel das BMPs na formação

de lesões metastáticas osteoblásticas no câncer de próstata. Aplicaram BMPs-2, -4 e -7 exógena

em linhagem de células de câncer de próstata LAPC-4 e LAPC-9, e utilizaram Western blot e

RT-PCR para avaliar os efeitos dessas proteínas na migração, invasão e proliferação celular.

Observaram que todas as BMPs foram expressas nas linhagens de células e que as BMP-2 e -7

estimularam a migração celular e invasão de células do câncer de próstata em uma forma dose

dependente, mas a BMP-4 não teve efeito. Concluíram, dessa forma, que as BMPs são

fundamentais na formação das lesões metastáticas associadas ao câncer de próstata, e

estratégias de tratamento futuro, que iniba a atividade das BMPs local pode reduzir a formação

e progressão dessas lesões.

Existem poucos estudos que mostram xenoenxerto de rato a um nível funcional, que os

antagonistas de BMP podem promover ou inibir propriedades malignas. Em modelos de câncer

de pulmão, o Noggin mostrou suprimir o crescimento tumoral, bem como, mestástase óssea

(FEELEY et al., 2006 A).

Estudando o papel das BMPs -2, -4 e -7, receptores de BMPs-IA, IB e II e o Noggin

em uma linhagem de células de adenocarcinoma de próstata metastático, observou-se que a

BMP-2 e, em menor extensão a BMP-4, estimularam a proliferação, migração celular, sendo a

invasão celular estimulada apenas pela BMP-2, enquanto a BMP-7 não apresentou nenhum

destes efeitos. Os três receptores foram encontrados nessas células, sugerindo a participação

dos mesmos nos efeitos exercidos pelas BMPs. A superexpressão do Noggin inibiu todos esses

efeitos supracitados in vitro, como também exerceu sua função inibitória sobre o crescimento e

45

osteólise tumoral in vivo, sugerindo que a inibição local das atividades das BMPs no câncer de

próstata pode permitir novas modalidades terapêuticas, diminuindo a morbidade e mortalidade

associadas à doença metastática (FEELEY et al., 2006B).

Abordando a importância de se estudar inibidores da via de sinalização das BMPs,

Laurila et al. (2013) realizaram uma pesquisa onde avaliaram a expressão de Gremlin e Noggin,

através de imunoistoquímica, em vários tecidos normais e amostras de diferentes neoplasias

malígnas. Na maioria das amostras normais e tumorais, a expressão dos inibidores foi negativa

ou fraca. No painel dos tumores, o padrão de expressão foi mais variável, mas uma elevada

expressão dos antagonistas de BMPs foi detectada, pela primeira vez, em alguns casos, tais

como para o tumor de células granulares renal e carcinoma papilar da tireóide, para o Noggin.

Apesar de Gremlin 1 e Noggin não serem amplamente expressos em tecidos adultos, de um

subconjunto de órgãos, o padrão de expressão indicou que estes inibidores podem ter um

potencial papel no tecido normal, mantendo a homeostase, bem como, alterados em

malignidades.

Partindo do princípio de que a BMP-2 é uma citocina com várias funções que influencia

na diferenciação de muitos tipos celulares e, embora seu efeito esteja limitado ao tempo de

exposição e à concentração, está claro seu envolvimento em eventos da tumorigênese como

angiogênese, apoptose, crescimento e migração. Steinert et al. (2008) investigaram a influência

da BMP-2 em linhagens de células de câncer de mama (MCF-7) expostas a uma única aplicação

de BMP-2, comparando com contínuas aplicações de altos níveis de BMP-2. Os dados mais

relevantes encontrados foram que, em um curto período de exposição verificou-se que 15 genes

associados à apoptose estavam alterados, enquanto que, em período mais prolongado, foram

detectados mais oito genes. Observou-se também a participação da BMP-2 no processo de

migração das células tumorais independente do tempo de exposição através de teste de

migração celular com Matrigel.

Kim et al. (2004) investigaram o papel dos receptores de BMPs tipo IA, IB e II em 30

espécimes de Carcinoma de Células Intermediárias (CCI) da bexiga urinária. Verificaram que

a expressão destes receptores está preferencialmente localizada no epitélio de transição com

significante associação entre a perda de expressão do BMPR-II e o grau de diferenciação do

tumor. Seqüencialmente, foi analisada a sensibilidade a BMP-4 e a expressão dos referidos

receptores em três linhagens celulares de câncer de bexiga humana (TCC-Sup, RT4 e TSU-

Pr1). Demonstraram que esta última (TSU-Pr1), exibiu uma diminuição nos níveis de expressão

do BMPR-II, resistente ao efeito inibitório do crescimento pela BMP-4. Esta foi transfectada

46

com um vetor contendo o BMPR-II e a restituição do mesmo não só restaurou a responsividade

à BMP-4, como reduziu a tumorigenicidade in vitro. Portanto, os autores concluíram que a

superexpressão do BMPR-II conduz a uma restauração da sinalização da BMP por ser um

potente supressor de crescimento tumoral, na linhagem celular, TSU-Pr1, de CCI de bexiga

humana.

A transição do epitélio/mesenquima é ponto fundamental para a migração de neoplasias

originadas de epitélio. Tentando entender esse processo através da via da BMP, Gordon et al.

(2009) estudaram a relação da BMP-2 em linhagens de células de carcinoma pancreático (Pan-

1). Observaram que a indução da BMP-2 nessas células aumentou a expressão e atividade de

MMP-2 e este processo foi mediado pela Smad-1. Sugeriram que a sinalização da BMP, através

da ativação da Smad-1 regula a expressão da MMP-2 e esta informação pode auxiliar como

alvo terapêutico no tratamento dessa doença.

Rothhammer, Braig e Bosserhoff (2008) analisaram em linhagem de células de

melanoma a influência das BMPs com fatores dos processos de migração e invasão celular. Em

um grupo de clones das células neoplásicas foi feito a redução da atividade da BMP com um

antisenso de BMP-4 e em outro grupo foi feito a inibição com o antagonista chordin. Em ambos

observaram a redução da expressão das MMP-1, -2, -3 e -9. Além disso, observaram o efeito

das BMPs nos fibroblastos estromais com o tratamento dessas células com BMP-2 e -4, onde

tiveram um aumento na expressão das MMPs. Desta forma, concluíram que as BMPs têm um

importante papel na disseminação das células tumorais, com a capacidade de degradar a matriz

extracelular induzindo à expressão de metaloproteinases tanto em células neoplásicas como em

células estromais.

Em culturas de células de condrossarcoma, Hou et al. (2009) estudaram o papel da BMP-

2 na motilidade dessas células, pela ativação da MMP-13, através de ensaios de migração com

Matrigel, quantificação de proteínas ativas com zimografia, Western blot e PCR em tempo real.

Observaram que com a indução de BMP-2 exógena estimulou o processo de migração,

aumentando a expressão e ativação de MMP-13, bem como a inibição da BMP-2 diminuía

significantemente a migração celular e a expressão da MMP. Concluíram que o mecanismo da

BMP-2 de promover a migração de células do condrossarcoma está ligado com a

superexpressão da MMP-13.

Em tumores de origem mesenquimal, as BMPs podem estar associadas à formação

patológica de osso, massas calcificadas e tecido condróide no interior do tumor ou em sítios

ectópicos (JIN et al., 2001). O papel das BMPs no desenvolvimento de tumores epiteliais ainda

47

é incerto, tendo sido implicadas no desencadeamento de alterações fenotípicas em células

epiteliais, tornando-as mais semelhantes às células mesenquimais (STRNAD et al., 2010).

Durante o desenvolvimento neoplásico, este processo permite às células malignas a migrarem

para microambientes diferentes. Este processo, chamado de transição epitélio-mesenquima, é

responsável por alterações, tais como, facilitar a migração celular e invasão, ajudando, desta

forma, ao desenvolvimento tumoral e aumento do potencial metastático (THAWANI et al.,

2010).

Strnad et al. (2010), estudando a influência dos fatores de crescimento produzidos por

fibroblastos do estroma de CEs de cabeça e pescoço, afirmam que a BMP-4 é um fator de

crescimento que estimula a transformação do epitélio normal. Ao induzirem BMP-4, em

ceratinócitos normais, observaram que essas células adquiriram fenótipo diferente, ficando

semelhantes aos ceratinócitos do carcinoma. Estes autores concluíram que a secreção parácrina

da BMP por fibroblastos estromais pode levar a alterações na interação epitélio-mesênquima e,

desta forma, contribuir para o desenvolvimento de neoplasia epitelial.

Yuen e colaboradores (2012) correlacionaram os níveis de expressão de proteína e

mRNA de BMP-6 e Noggin, sozinhos ou em combinação com a sobrevida de pacientes em

vários tipos de neoplasias malígnas. No CE de esôfago encontraram que a alta expressão de

BMP-6 juntamente com a baixa expressão de Noggin foram significativamente associadas com

menor sobrevida desses pacientes. Os resultados sugerem fortemente que BMP-6 e o Noggin

poderiam ser utilizados em combinação como um pro-indicador diagnóstico na progressão do

câncer.

2.4.1 Componentes da sinalização da BMP e o CEO

Jin et al. (2001), procurando estabelecer uma correlação entre a expressão

imunoistoquímica das BMPs-2/4 e -5 e seu receptor BMPR-IA e, a carcinogênese do epitélio

oral, observaram que a intensidade e proporção de células marcadas positivamente estavam

aumentadas nos casos de CEO, quando comparadas às do grupo controle (lesões benignas).

Porém, no grupo do epitélio adjacente ao carcinoma, estes indicadores apresentaram índices

similares aos dos casos de CEO. Analisando a marcação das células metastáticas nos nódulos

linfáticos, observou-se uma intensidade maior em relação às do tumor primário, fato não

observado para BMPR-IA nestes, concluindo assim que, as BMPs-2/4 e -5, mas não o seu

receptor, podem estar implicadas na metástase do CEO.

48

Gao et al. (2009) realizaram um estudo in vitro com células de carcinoma epidermóide

oral (UMSCC-1 e UMSCC-74A) e observaram o efeito da BMP-2 na proliferação e

angiogênese desta lesão. Após tratarem as células com BMP-2rh, verificarem a secreção de IL-

8 e VEGF, não encontraram diferença significativa entre as células estudadas e o grupo

controle. Esses autores, concluíram que a exposição de células de CEO à BMP-2 não estimula

a proliferação ou angiogênese nesta lesão.

Analisando a expressão da BMP2/4 e de seu receptor BMPR-IA, em 23 espécimes de

carcinoma epidermóide oral e 10 espécimes de hiperplasia fibro-epitelial da mucosa oral,

utilizados como grupo controle, Soares et al. (2010) observaram uma fraca expressão de ambos

os marcadores em células normais, uma forte marcação da BMP2/4 e fraca marcação da BMPR-

IA na maioria dos casos do grupo experimental com metástase, podendo, assim, esses resultados

ter implicações prognósticas.

De Carvalho et al. (2011) estudaram a imunoexpressão da BMP-2 e seus receptores (IA

e II) em CE de lábio inferior com metástase e sem metástase. Observaram que houve uma

superexpressão da BMP-2 em ambos os grupos, com e sem metástase. Apenas a BMPR-IA

apresentou diferença significativa quanto à presença de metástase. Concluíram, dessa forma,

que distúrbios na via se sinalização da BMP-2 podem estar envolvidos no desenvolvimento do

CE de lábio inferior e que a BMPR-IA pode ser indicativo no desenvolvimento de metástase.

Avaliando o efeito do tratamento da BMP-2rh em linhagens de células de CEO,

Kokorina et al.(2011) estudaram dois tipos de linhagens de células de carcinoma epidermóide

oral diferentes, a UMSCC-74A (expressão positiva para o gene BMP-2) e a UMSCC-1

(expressão negativa para o gene BMP-2). Estes autores verificaram, através de ensaio de

invasão por matrigel, que a invasividade das células tratadas com BMP-2rh foi

significativamente maior na linhagem UMSCC-74A. Utilizaram ainda um PCR específico (The

Human Tumor Metastasis PCR Array) para identificar 84 genes que podem estar envolvidos

no perfil metastático das células tumorais. Este PCR identificou que as células BMP-2 positivas

possuíam uma maior expressão de genes caracterizando um genótipo mais agressivo.

Kokorina et al. (2012) estudaram a expressão dos genes da BMP-2 e seus componentes

da sinalização em 30 linhagens de células de CEO usando RT-PCR. Estes autores analisaram,

também, o efeito em vivo (xenoenxertos) das linhagens tratadas ou não com BMP-2rh. O gene

da BMP-2 foi expresso em 90% das 30 linhagens de células testadas e a expressão gênica de

todos os componentes da via de sinalização de BMP-2 também foi positva. Xenoenxertos de

células de tumor tratadas com BMP-2rh mostraram mais rápido crescimento local, o que

49

resultou na pior sobrevivência dos animais, assim como, os aspectos histológcos, mostraram-

se pobremente diferenciados, em comparação com o grupo de controle (xenoenxertos com

células não tratadas). Observaram também que mudanças nas proteína-quinases sugere

interações da sinalização da BMP-2 com a sinalização de Wnt-β-catenina, Janus quinase /

transdutores de sinais e ativadores das vias de transcrições (JAK / STAT).

Sand et al. (2014) correlacionaram a expressão himunoistoquímica de BMP-2 em 149

pacientes portadores de CE de cabeça e pescoço com características clinicopatológicas.

Observaram que 146 (98%) dos pacientes apresentava expressão da BMP-2 e que a alta

expressão desta proteína estava associado a recorrência local. Afirmaram assim, que estes dados

têm implicações importantes para a utilização de BMP-2rh em reconstruções faciais de

pacientes afetados com câncer, pois esta proteína pode ser um fator a favorece a recorência

local.

O potencial papel das BMPs na transformação maligna e progressão do câncer

permanece mal compreendida. Tem sido vista, investigações nesta área variadas, tanto estudos

in vitro e in vivo , o que revelam discordância nos resultados, principalmente baseados no tipo

de tumor e BMP estudados. Estes dados sugerem que mais estudos sobre o possível papel

oncológico de BMP- 2 em CEO seja justificável.

50

PROPOSIÇÃO

“Aprendi com as primaveras a me deixar cortar para poder voltar inteira.”

(Cecília Meirelles)

51

3 PROPOSIÇÃO

Com este estudo se pretendeu investigar, em culturas de células de carcinoma epidermóide de

língua humana (SCC25), o efeito da proteína recombinante BMP-2 e seu antagonista Noggin sobre a

proliferação e migração celulares. Espera-se contribuir com mais esclarecimentos a respeito da ação

da BMP-2 sobre o CEO e se a inibição desta proteína, bem como, de outras vias de sinalização, com

o Noggin, diminui a proliferação e migração destas células malignas. Assim, fornecer novos

conhecimentos que possam auxiliar novas alternativas terapêutica para esta lesão.

52

“As pessoas duvidarão no que dizes, mas acreditarão no que fazes”.

(Lewis Cass)

MATERIAL E MÉTODOS

53

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

Este estudo caracterizou-se por uma investigação experimental in vitro, onde foi

observado o efeito da proteína recombinante BMP-2 e seu antagonista Noggin em células

SCC25 oriundas de CEO humano.

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

O presente projeto não necessitou de submissão ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)

ou Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA). Foram utilizados uma linhagem celular

imortalizada e produtos comercialmente disponíveis. Todos os procedimentos de biossegurança

foram adotados nas diversas etapas experimentais do projeto, garantindo a integridade física

dos pesquisadores envolvidos.

Os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório de Cultura de Células

do Departamento de Bioquímica da UFRN e nos Laboratórios do Programa de Pós-Graduação

em Patologia Oral da UFRN. As etapas serão descritas a seguir.

4.3 CULTIVO CELULAR

Utilizou-se neste estudo a linhagem de célula SCC25, derivada do carcinoma

epidermóide de língua humano, cedida pelo Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia

– FOP-UNICAMP e cultivadas como recomendado pelo fornecedor “American Type Culture

Collection” (ATCC, Manassas, VA, EUA).

A SCC25 foi estabelecida a partir de um paciente do sexo masculino com 70 anos de

idade, o qual não foi submetido a nenhum tratamento prévio à biópsia (RHEINWALD

EBECKET, 1981).

As células foram descongeladas e mantidas em frascos de cultivo celular de 75 cm2 (BD

Biosciences, San Jose, CA, USA), com meio Eagle modificado por Dulbecco F12 (DMEM/F-

12; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab

Ltda., Campinas, SP, Brasil), 400ng/ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO,

USA) e 1% de solução antibiótico-antimicótico (GIBCO, USA). As células foram mantidas em

estufa a 37ºC, em atmosfera contendo 5% de CO2.

Todos os procedimentos de cultivo realizou-se em fluxo laminar seguindo os protocolos

para a manutenção da esterilidade dos materiais, suplementos e meio de cultura adotado pelo

54

Laboratório de Cultura Células do Departamento de Bioquímica do Centro de Ciociências da

UFRN. O crescimento celular foi monitorado diariamente em microscópio invertido de fase

(NIKON – CFI60, Spectrum – Bioengenharia médica hospitalar LTDA, São Paulo, Brasil) e o

meio de cultura trocado a cada 48 horas.

Após ocuparem 70% a 90% do frasco, o que se denomina subconfluência, as células

foram subcultivadas. O meio de cultura foi removido do frasco e a monocamada celular lavada

com solução fosfato-alcalina, sem cálcio e magnésio (PBS), pH 7,2. Em seguida as células

foram separadas com 1 ml de solução de tripsina EDTA a 0,25% (1:250) (Invitrogen) durante

5 minutos, a 37ºC.

A tripsina foi inativada pela adição de novo meio de cultura e as células em suspensão

foram transferidas para um tubo de fundo cônico de 15 ml e centrifugadas a 1200rpm por 5

minutos, à temperatura ambiente. Em seguida foi aspirado o sobrenadante e o precipitado de

células ressuspendido em 1 ml de meio de cultura. Alíquotas desta suspensão foram distribuídas

em frascos de cultivo de 75cm2 contendo 8 ml de meio de cultura e novamente levadas de volta

à estufa, onde cada procedimento deste deu origem a uma nova passagem de linhagem celular.

Quando se conseguia a quantidade de células esperada para cada ensaio (proliferação,

ciclo celular e invasão), o plaqueamento celular foi realizado vinte e quatro horas antes da

aplicação das proteínas recombinantes. As células foram divididas em três grupos e submetidas

aos diferentes tratamentos descritos a seguir:

1) Grupo Controle – Não houve a aplicação de nenhuma substância nas células deste

grupo, não obstante passarem por todos os processos pelos quais os grupos

experimentais passaram;

2) Grupo BMP-2 – As células foram tratadas com 100ng/ml de BMP-2 recombinante

humano (BMP-2rh) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) (KANG et al., 2010).

3) Grupo Noggin – As células foram tratadas com 100ng/ml de Noggin recombinante

(Noggin-rh) (R&D Systems. Minneapolis, MN, USA) (KANG et al., 2010).

4.3.1 Plaqueamento celular

Para estabelecer os grupos experimentais, foi repetido o processo de tripsinização

descrito anteriormente. Foi feita a contagem prévia do número de células cultivadas, utilizando

a câmara de Neubauer, acrescidas de 10µl da solução de azul de tripan. Após o cálculo padrão

foi possível conhecer o número aproximado de células em 1 ml e, dessa forma, foi calculado o

55

volume da suspensão celular que foi colocado em cada poço para que este contenha uma

densidade de 2 × 104 célula/poço em placas de 24 poços (ensaio de proliferação com Tripan) e

2×105 em placas de 6 poços (ensaio de ciclo celular e invasão).

Todo este procedimento foi realizado vinte e quatro horas antes do tratamento com a

BMP-2 rh e Noggin rh. Para cada teste feito foi utilizada uma placa, onde os grupos descritos

anteriormente serão preparados (Figura 3).

Figura 3. Modelo do plaqueamento celular utilizado no estudo para cada ensaio em placa de

24 poços.

Legenda: Grupo tratado com BMP-2 rh

Grupo tratado com Noggin rh

Grupo controle

4.4 ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR

Para comparar o potencial proliferativo das células tratadas e não tratadas foram

realizados ensaios de curva de proliferação e avaliação do ciclo celular pela marcação de iodeto

de propílico verificado em citometria de fluxo.

4.4.1 Curva de proliferação e viabilidade celular (ensaio azul de tripan)

Para auxiliar na determinação do potencial proliferativo realizou-se curvas de

crescimento durante 72 horas de cultivo celular, onde os intervalos de 24, 48 e 72h foram

determinados para a contagem do número de células. Foram utilizadas 3 placas de 24 poços,

referentes a cada intervalo de tempo, plaqueadas com 2x104 células/poço para cada grupo, como

ilustra a figura 3.

MATERIAL E MÉTODOS

56

Nos intervalos de avaliação anteriormente propostos, realizou-se a contagem do número

de células em cada poço utilizando-se o azul de tripan e a câmara de Neubauer. Após o cálculo

padrão, foi obtido o número de células existentes em cada poço, calculada a mediana para cada

grupo e construídas as curvas de proliferação utilizando-se o programa Excel (Microsoft, EUA),

sendo então observado se houve crescimento celular no decorrer do tempo. As curvas de

proliferação dos grupos em tratamento com as proteínas recombinantes foram comparadas entre

si e com o controle, com a finalidade de verificar se estas proteínas exerceram influência na

proliferação celular.

A viabilidade foi realizada por dois observadores previamente calibrados através da

observação das células coradas e das não coradas de azul, pois a solução de tripan penetra nas

células não viáveis deixando-as coradas, enquanto as íntegras permanecem sem coloração.

Através disto, foi estabelecido a viabilidade celular calculando-se o número de células através

da equação:

Viabilidade = nº de células vivas × 100/ nºde células vivas +nº de células mortas.

4.4.2 Avaliação do ciclo celular em citometria de fluxo

A porcentagem de células em cada fase do ciclo celular (G0/G1 - células quiescentes; S

– síntese de material genético; G2/M – células com alta capacidade proliferativa) foi

determinada através da marcação por iodeto de propídio em citômetro de fluxo (FACSCANTOII,

Becton Dickinson, San Jose, USA). Foram utilizadas microplacas de 6 poços, cada placa

correspondendo a um intervalo proposto (24, 48 e 72h).

Para tomar as células em suspensão, procedeu-se a tripsinização, centrifugação a

1200rpm por 5 min, lavagem com PBS gelado, nova centrifugação e fixação com

paraformaldeído a 2% por 30 min a temperatura ambiente. Após este período acrescentado PBS,

centrifugação novamente e assim, o sobrenadante foi descartado e os pellets ressuspendidos em

200µl de uma solução contendo saponina 0,01% e RNAse (0.2mg/mL) e incubados a 37% por

60 minutos. Este procedimento torna a membrana plasmática permeável para o iodeto de

propídio que penetra na célula e se liga ao DNA. O Iodeto de propídio foi adicionado a uma

concentração de 50µg/mL em PBS e as amostras seguiram para a incubação por 15 minutos

sob abrigo de luz a 4ºC. Este composto foi transferido para tubos FACS, onde realizou a leitura

de 30000 eventos em cada amostra no citômetro de fluxo, com o auxílio do programa FlowJo

(Tree Star) foi observada a distribuição das células no ciclo celular, onde foram feitas as

medianas de cada grupo no seus intervalos de tempo.

57

4.5 INVASÃO CELULAR

Para a realização dos ensaios de invasão foram utilizadas câmaras bipartite do tipo

Transwell utilizando filtros com poros de 8µm de diâmetro em placas de 6 poços (BD

Biosciences, San Jose, CA, USA). Estas câmaras são compostas por dois compartimentos

distintos, separados entre si por um filtro de policarbonato. Este sistema cria dois ambientes

diferentes que permitem as passagens voluntárias das células de um lado para o outro do filtro.

Os filtros de Transwell foram cobertos com uma fina camada de Matrigel (BD

Bioscience, San Jose, CA, USA), uma membrana basal reconstituída composta por laminina,

colágeno IV, proteoglicano, heparan sulfato, entactina e nidigênio, além de fatores de

crescimento como TGF-β e fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento semelhante

à insulina, fator de crescimento fibroblástico e ativador do plasminogênio tecidual. O Matrigel

obstrui os poros da membrana e bloqueia as células não-invasivas de migrarem através da

mesma. Por outro lado, as células com maior capacidade de invasão, que secretam proteases,

degradam enzimaticamente o Matrigel, o que permite a invasão das células através dos poros

da membrana (Figura 4). A concentração final de Matrigel foi de 1 µg/µl em DMEM sem soro.

Para isto, a solução estoque de Matrigel foi descongelada overnight no refrigerador, à

temperatura de 4ºC, para evitar sua geleificação prematura. Em seguida, essa solução estoque

foi diluída em DMEM sem soro na proporção de 1:1 e então 250µl foram dispostos sobre cada

filtro, de modo a formar uma fina camada. As câmaras contendo os filtros foram então

colocadas na estufa a 37ºC por 2 horas para total geleificação do Matrigel.

Figura 4. Em (A) observa-se a solução do matrigel sobre o filtro na câmara de invasão

(Transwell). (B) Aspecto microscópico dos múltiplos poros da membrana de polietileno. (C)

Disposição dos Transwells nos poços da placa para o ensaio de invasão.

58

As células da linhagem SCC25 previamente carenciadas por 24 horas foram contadas e

um total de 2 x 105 células/ml foi dispensado na câmara superior do Transwell. Foi acrescido,

no compartimento superior, 1,5mL de meio DMEM sem soro. Vinte e quatro horas depois foi

trocado o meio DMEM sem soro por 1,5mL de meio enriquecido de BMP-rh ou Noggin-rh, nos

grupos experimentais, e nenhuma substância no grupo controle. No compartimento inferior da

câmara fo icolocado 2,0mL de meio DMEM com soro (quimioatrativo para as células). Após

48 horas, as células com maior capacidade de invasão atravessaram o Matrigel e ficaram na

camada inferior do Transwell, as células do compartimento inferior foram fixadas com formol

a 10% e coradas com azul de toluidina a 1% (Kokorina et al., 2011).

Para avaliar os grupos experimentais quanto ao seu potencial celular de invasão, as

lâminas de polietileno coradas foram removidas das câmaras de invasão e montadas em lâminas

de vidro com lamínula e resina (Permount). Após a obtenção das lâminas com as membranas,

estas foram escaneadas pelo Scanner de lâminas (Panoramic Mid, 3DHISTOTECH, Budaest,

Hungria), onde campos de 500µm de aumento foram capturados para a contagem do número

de todas as células invasoras. Esta estapa de contagem foi feita pelo programa Image J 1.33u

(NHI/Software, USA) (Figura 5). Ao final da contagem, foram obtidas as medianas das

membranas pertencentes a cada grupo.

59

Figura 5. Modelo para contagem das células que invadiram a membrana de polietileno no

ensaio de invasão.

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2010®) e,

posteriormente, exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão

19.0; for Windows XP, Chicago Illinois USA) onde foram feitas as análises. Os resultados

obtidos foram expressos em medianas referentes aos valores das replicatas. A significância

estatística dos resultados foi verificada através dos testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e

Mann-Whitney. O nível de significância estatística adotada foi de 5% (p<0,05).

60

RESULTADOS

“Pois o Senhor é quem dá sabedoria; de sua boca procedem o conhecimento e discernimento”.

(Provérbios 2:6)

61

5 RESULTADOS

5.1 PROLIFERAÇÃO CELULAR

O potencial proliferativo da linhagem SCC25 após tratamento com as proteínas

recombinantes BMP-2 e Noggin foi estimado pela contagem de células e construção de curvas

de proliferação, utilizando o azul de tripan e pela análise da distribuição do ciclo celular no

citômetro de fluxo, após marcação do DNA com iodeto de propídio.

5.1.1 Viabilidade celular e Curva de proliferação

Após a contagem das células vivas e mortas utilizando o azul de tripan, na câmara de

Neubauer, foi possível determinar a quantidade de células que proliferaram, bem como, a

porcentagem de células viáveis.

A mediana da porcentagem das células viáveis nos diferentes grupos estudados durante

72 horas de experimento pode ser evidenciada na tabela 1. Em todos os grupos, principalmente

após 48 horas, foi possível encontrar células mortas. No entanto, no grupo Noggin quando

comparada a viabilidade dos intervalos de tempo estudados, houve uma redução significativa

na viabilidade celular deste grupo (p = 0,042).

Tabela 1: Porcentagem (mediana) das células SCC25 viáveis (viabilidade) nos diferentes

grupos durante 72 horas de experimento. Natal-RN, 2014.

GRUPO VIABILIDADE

T24 T48 T72 P(1)

Controle 100 93,3 100 0.119

BMP-2 89,6 92,1 78,3 0.299

Noggin 100 93,1 84,7 0.042*

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Kruskal-Wallis.

Quanto a proliferação celular, é possível evidenciar, através da curva de proliferação no

Gráfico 1, que todos os grupos apresentaram um aumento no número de células com o decorrer

do tempo, chamando a atenção o grupo da BMP-2 que exibiu maior índice proliferativo quando

comparado aos demais, principalmente no final de 72 horas.

62

Gráfico 1. Curva de crescimento das células SCC25 durante 72 horas de experimento para os

diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014.

Comparando as medianas dos grupos que receberam o tratamento das proteínas

recombinantes e o grupo controle (Tabela 2), nas primeiras 24 horas, não foi possível observar

diferença na proliferação celular entre esses grupos, os quais praticamente mantiveram a mesma

mediana, não apresentando diferença estatística. Em 48 horas de experimento, o grupo Noggin

não apresentou diferença na sua proliferação, enquanto que o grupo controle e BMP-2

proliferaram. Observou-se uma diferença estatística (p=0,02) nos grupos estudados neste

intervalo de tempo, principalmente em relação ao grupo Noggin, no qual apresentou uma

proliferação inferior aos demais grupos. No intervalo de tempo de 72 horas também houve

crescimento celular, chamando a atenção para o grupo da BMP-2, considerando que comparado

aos demais grupos apresentou uma maior proliferação estatisticamente significativa (p<0,001).

Pareando os grupos estudados, através do teste não-paramétrico de Mann-Whitney,

em cada intervalo de tempo (Tabela 3), é possível evidenciar que o grupo Noggin no intervalo

de tempo de 48 e 72 horas apresentou uma pequena proliferação comparado a todos os grupos.

Desta forma, a ação do Noggin de diminuir a proliferação sobre as células do SCC25, pode ser

evidenciada após 24 horas. Já grupo BMP-2, no intervalo de tempo de 72 horas, apresentou

uma alta proliferação, estatisticamente significativa, quando comparada aos demais grupos

estudados. Este resultado demonstra que a ação da BMP-2 nas células estudadas pode iniciar-

se após 48 horas.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

T2 4 T4 8 T7 2

NÚ

ME

RO

DE

CÉ

LU

LA

S (

10

4)

CURVA DE CRESCIMENTO

Controle

BMP

Noggin

63

Tabela 2: Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para o

crescimento das células SCC25, em cada intervalo de tempo, nos diferentes grupos estudados.

Natal-RN, 2014.

Intervalo Grupo Mediana

(×104)

Q25-Q75

(×104)

Média dos

postos

P(1)

T24

Controle 2.5 2.0 -2.5 11.8

0.296 BMP-2 2.0 2.0 -2.5 9.17

Noggin 2.0 1.5-2.5 7.5

T48

Controle 4.5 3.5-4.5 13.5

BMP-2 4.0 3.5-4.5 11.5 0.02*

Noggin 2 2.0-2.0 7.5

T72

Controle 5.5 5-5.5 9.5

<0.001* BMP-2 7.0 6-7.5 15.5

Noggin 3.5 3-4 3.5

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Kruskal-Wallis.

Tabela 3: Análise pareada do crescimento das células SCC25, em cada intervalo de tempo, nos

diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014.

Controle BMP-2 Noggin P(1)

Intervalo Mediana

(×104)

Mediana

(×104)

Mediana

(×104)

C vs. BMP-2 C vs. Ng BMP vs. Ng

T24 2.5 2.0 2.0 0.269 0.162 0.317

T48 4.5 4.0 2.0 0.317 0.003* 0.003*

T72 5.5 7.0 3.5 0.003* 0.003* 0.003*

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Mann-Whitney.

64

5.1.2 Ciclo celular

É possível analisar as medianas das porcentagens das células SCC25 em cada etapa do

ciclo após os tratamentos com as proteínas recombinantes nos diferentes intervalos de tempo

nas tabelas 4, 5, 6 e 7.

Observou-se que no intervalo de 24 horas houve uma concentração maior das células

em G0/G1 no grupo BMP-2, comparado com o grupo controle e Noggin (p=0.006). Em

contrapartida, na fase G2/M, o grupo BMP-2 apresentou uma menor quantidade de células

comparadas com os outros grupos (p=0.021). A porcentagem de células foi menor na fase S

com destaque para o grupo Noggin que apresentou uma menor quantidade de células

relacionada aos demais grupos (p=0.015).

Tabela 4: Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a

porcentagem de células SCC25, nas fases do ciclo celular no intervalo de T24, nos diferentes

grupos estudados. Natal-RN, 2014.

Fases do

ciclo

Grupo Mediana

(%)

Q25-Q75

(%)

Média dos

postos

P

G0/G1

Controle 47.3 46.7 -48.0 2.5

0.006 BMP-2 57.7 55.7 -59.7 10.5

Noggin 49.0 - 6.5

S

Controle 15.2 14.6-15.9 9.5

BMP-2 13.0 10.8-15.2 7.5 0.015*

Noggin 9.7 - 2.5

G2/M

Controle 37.4 - 8.5

0.021* BMP-2 29.3 29.1-29.5 2.5

Noggin 35.3 30.1-41.3 8.5

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Kruskal-Wallis.

Nos intervalos de 48 e 72 horas não foram observadas nenhuma diferença estatística

entre a distribuição das células e os grupos estudados. Desta forma, pode-se afirmar que a

BMP-2rh nas primeiras 24 horas de experimento inibiu as células do SCC25 a iniciarem o ciclo

celular.

65

Tabela 5: Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a

porcentagem de células SCC25, nas fases do ciclo celular no intervalo de T48, nos diferentes

grupos estudados. Natal-RN, 2014.

Fases do

ciclo

Grupo Mediana

(%)

Q25-Q75

(%)

Média dos

postos

P(1)

G0/G1

Controle 58.3 56.8 -59.8 4.5

0.390 BMP-2 63.5 59.2 -67.9 10.5

Noggin 49.0 58.1-70.4 6.5

S

Controle 13.4 11.2-15.6 8.5

BMP-2 11.9 9.4-14.5 5.5 0.390

Noggin 10.7 9.9-11.5 5.5

G2/M

Controle 28.3 24.6-32 5.5

0.390 BMP-2 24.5 22.7-26.0 5.5

Noggin 29.3 29.1-29.5 5.5

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(1): Teste de Kruskal-Wallis.

Tabela 6: Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a

porcentagem de células SCC25, nas fases do ciclo celular no intervalo de T72, nos diferentes

grupos estudados. Natal-RN, 2014.

Fases do

ciclo

Grupo Mediana

(%)

Q25-Q75

(%)

Média dos

postos

P(1)

G0/G1

Controle 63.7 61.0-66.5 4.5

0.349 BMP-2 67.6 66.5-70.1 7.0

Noggin 69.0 65.2-72.8 8.0

S

Controle 12.7 11.4-14.1 6.5

BMP-2 13.4 12.0-14.9 8.5 0.284

Noggin 11.6 10.6-12.7 4.5

G2/M

Controle 23.5 22.1-24.9 9.5

0.111 BMP-2 18.9 17.9-19.9 4.5

Noggin 19.3 14.5-24.2 5.5

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(1): Teste de Kruskal-Wallis.

66

Tabela 7: Análise pareada das medianas da porcentagem de células SCC25 em cada fase do

ciclo celular, nos diferentes grupos estudados, em cada intervalo de tempo. Natal-RN, 2014.

Controle BMP-2 Noggin P(1)

Fases do ciclo Mediana

(%)

Mediana

(%)

Mediana

(%)

C vs. BMP-2 C vs. Ng BMP vs. Ng

T24

Go/G1 47.3 57.7 49.0 0.018* 0.013* 0.013*

S 15.2 13.0 9.7 0.237 0.013 0.013*

G2/M 37.4 29.7 35.7 0.013* 1 0.018*

T48

Go/G1 58.3 63.5 64.2 0.237 0.237 1

S 13.4 11.9 10.7 0.237 0.237 1

G2/M 28.3 24,5 25.2 0.237 0.237 1

T72

Go/G1 63.7 67.6 69.0 0.237 0.237 0.533

S 12.7 13.4 11.6 0.237 0.237 0.237

G2/M 23.5 18.9 19.3 0.018 0.327 1

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Mann-Whitney

5.2 INVASÃO CELULAR

Após 48 horas, as células com maior capacidade de invasão atravessaram o Matrigel e

ficaram aderidas na camada inferior do Transwell. A figura 6 mostra as membranas montadas

em lâminas e escaneadas. Sob este aumento de 5000µm é possível ver toda a membrana e pode-

se evidenciar uma maior área de coloração azul no grupo BMP-2 seguida pelo controle e com

menor intensidade a membrana do grupo Noggin.

Após a contagem de todas as células SCC25 invasoras, foi obtida a mediana para cada

grupo estudado. O gráfico 2 ilustra a quantidade de células que invadiram o grupo controle,

BMP-2 e Noggin.

A análise do potencial de invasão da linhagem SCC25 após tratamento com as proteínas

recombinantes estudadas revelou que as células do grupo BMP-2 tiveram o maior potencial de

invasão quando comparada ao grupo controle e Noggin (p=0.007) (Tabela 8). Enfatiza-se

também que as células do grupo Noggin tiveram menor potencial de invasão e este resultado

foi estatisticamente significativo (Tabela 9).

67

Figura 6. Aspecto das membranas escaneadas, sob o aumento de 5000µm. É possível ver toda

a membrana e evidenciar uma maior área de coloração azul no grupo BMP-2 (B) seguida pelo

controle (A) e com menor intensidade a membrana do grupo Noggin (C).

Gráfico 2: Quantidade de células SCC25 invasoras expressas em mediana referente as 4

replicadas, em cada grupo estudado, durante 48 horas.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

Med

iana

do n

úm

ero d

e cé

lula

s

Controle BMP Noggin

68

Tabela 8: Mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para potencial

de invasão das células SCC25, durante 48 horas, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN,

2014.

Grupo Mediana Q25-Q75 Média dos postos P(1)

Controle 6621.0 6120.0-7122.0 6.5

0.007* BMP-2 15079.0 12963.0-17196.0 10.5

Noggin 2698.5 2063.0-3334.0 2.5

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Kruskal-Wallis.

Tabela 9: Análise pareada das medianas do potencial de invasão das células SCC25, durante

48 horas, nos diferentes grupos estudados. Natal-RN, 2014.

Intervalo Grupo Mediana Q25-Q75 Média dos postos P(1)

T48

Controle 6621.0 6120.0-7122.o 6.5 0.018*

BMP-2 15079.0 12963.0-17196.0 10.5

Controle 6621.0 6120.0-7122.0 6.5 0.018*

Noggin 2698.5 2063.0-3334.0 2.5

BMP-2 15079.0 12963.0-17196.0 10.5 0.018*

Noggin 2698.5 2063.0-3334.0 2.5 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

(*): Diferença estatística significativa a 5,0%.

(1): Teste de Mann-Whitney.

69

“A perseverança não é uma longa corrida, são muitas corridas curtas, uma depois da outra”.

(Walter Elliot)

DISCUSSÃO

70

DISCUSSÃO

O CEO é a neoplasia maligna mais comum encontrada na boca e é resultados do

acúmulo de alterações genéticas oncogênicas nas células do revestimento epitelial da mucosa

oral, em geral de natureza não-hereditária, decorrentes da interação do indivíduo com fatores

exógenos ambientais provenientes do consumo de produtos derivados do tabaco, álcool etílico

e betel, além de condições como má-nutrição, imunossupressão e infecções diversas

(NAGPAL; DAS, 2003, NEVILLE et al 2009; BAGAN; SCULLY, 2009; SCULLY; BAGAN,

2009).

A alta incidência do CEO somada ao seu curso clínico desfavorável motivam inúmeras

pesquisas relacionadas à sua patogênese. A heterogeneidade de eventos celulares e moleculares

constitui grande desafio ao estabelecimento de terapias efetivas.

A BMP faz parte de uma grande família de fatores de crescimento multifuncional com

diversos efeitos na atividade celular tanto no desenvolvimento quanto na regeneração. Vários

estudos tem investigado o efeito biológico das BMPs em células do câncer. A BMP-2 tem

mostrado estimular linhagens celulares de câncer de próstata, pulmão, gástrico e melanoma

(FEELEY et al., 2006 A; LANGENFELD et al., 2005; KANG et al., 2010; ROTHHAMMER

et al., 2004).

Os efeitos das BMPs em células de câncer oral in vitro ou in vivo são pobremente

entendidos. Gao et al. (2009) não encontraram relação do tratamento com BMP-2 em células

de CEO no tocante a proliferação e a angiogênese. Entretanto, estudos mostram a alta expressão

da BMP-2, por imunoistoquímica, em CEOs humanos quando comparados a outros tecidos

orais (JIN et al., 2001; SOARES et al., 2010; DE CARVALHO et al., 2011). Kokorina et al.

(2012) mostraram um grande número de linhagens de CEOs expressando o gene da BMP-2 e

componentes da sua sinalização. Além disto, demonstraram que a ação da BMP-2 em ratos

transfectados com células tratadas com BMP-2rh tiveram pior prognóstico. Por estes achados,

a FDA contraindica o uso da BMP-2 em reconstruções ósseas em pacientes com câncer oral

porque o efeito da estimulação da sinalização da BMP-2 nas células desse câncer é incerto.

No presente estudo, foi observado a ação da BMP-2rh em uma linhagem de célula de

CE de língua. Após 72 horas de experimento, as células haviam praticamente triplicado sua

quantidade quando comparado a contagem de células no início do experimento e, quase

duplicado, em relação ao grupo controle. De fato pode-se observar estatisticamente que a BMP-

2 estimulou a proliferação das células malignas, principalmente depois de 48 horas. A

71

viabilidade celular durante as 72 horas de experimento não foi afetada, mostrando de fato que

a BMP-2 pode estimular a proliferação das células estudadas no tempo previsto.

Experimentos realizados em vários tumores têm mostrado que uma via de sinalização

de BMP, ativa nas células tumorais, é uma indicação importante na progressão do tumor, uma

vez que interfere através de mecanismos autócrinos e parácrinos para o desenvolvimento do

tumor (ROTHHAMMER et al., 2005; ROTHHAMMER et al., 2008; GORDON et al., 2009;

LANGENFEILD, 2003). Langenfeld et al. (2004 e 2005) relataram que a BMP-2 é altamente

superexpressa em células de câncer de pulmão humano e estimula o crescimento do tumor e

motilidade nessas células .

Ainda corroborando os resultados da presente pesquisa, Kokorina et al. (2012) relataram

em seu estudo que, os ratos transfectados com uma linhagem de células de CEO tratados com

BMP-2 tiveram um maior crescimento tumoral quando comparado aos ratos com as linhagens

não submetidas ao tratamento com BMP-2, o que confirma que a BMP-2 estimulou a

proliferação deste tipo celular.

Existem alguns estudos que não encontraram relação significativa das células tratadas

com BMP-2rh, com o grau de proliferação das células tumorais (KANG et al., 2010; GAO et

al., 2009). Gao et al. (2009) estudaram em duas linhagens de células de CEO tratadas com

BMP-2rh e não encontraram resultados favoráveis à sua proliferação. A avaliação da

proliferação desses autores foi através do MTT e isto pode justificar a diferença dos nossos

resultados.

Outro fator interessante a ser discutido é o de que a ação proliferativa da BMP-2rh, foi

mais efetiva após 48 horas de tratamento, isto é no intervalo de 72 horas. Feeley et al. (2005)

não acharam influencia na proliferação celular de lesões metastáticas de câncer de próstata

quando avaliados no intervalo de apenas 48 horas. A administração prolongada de BMP-2,

comparada com uma única administração em células de câncer de mama, mostrou muito mais

alterações em genes relacionados à carcinogênese como genes da apoptose e de proliferação

(STEINERT et al., 2008). Na presente pesquisa observou-se que a ação da BMP-2rh sobre as

células neoplásicas foi mais tardia, caracterizando, assim, uma atuação pro-tumoral mais eficaz

desta proteína quando em maior contato com as células SCC25.

Considerando os vários papéis desempenhados nos diversos processos biológicos, a

sinalização da BMP pode ter impacto em muitos genes alvos simultaneamente. Junto com a

cascata de sinalização iniciada pela ativação da via Smad, respostas celulares da ativação da via

da BMP podem ser ampliadas através da ativação de outras vias, como a Wnt, MAPK-p38, Erk-

72

MAPK, fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), cálcio/calmodulina e as vias JAK-STAT (VON

BUBNOFF; CHO, 2001; NOHE et al., 2004; BLANCO CALVO et al., 2009; THAWANI et

al., 2010). Todas estas vias estão relacionadas com a proliferação celular. Logo, pode-se supor

que no presente estudo, ao estimularmos as células com BMP-2, a presença exagerada desta

proteína no microambiente celular, ocasionou mais ativação nessas outras vias, causando assim,

o desequilíbrio celular e, por conseguinte, o desenvolvimento e proliferação tumoral.

A sinalização intracelular feita pelas proteínas TAK1-TAB1 na via p38, leva à

ativação da apoptose. A BMP-2 medeia a apoptose através dessa via, e a expressão de TAK1

defeituosa, assim como da BMP-2, pode levar à inibição da apoptose e, assim, ao

desenvolvimento desenfreado de células mutantes. Além disto, a BMP-2 é capaz de ativar a

sinalização ERK-RAS que é importante na regulação de fibronectina e osteopontina, proteínas

da membrana extracelular que estão envolvidas no processo de adesão celular (NOHE et al.,

2004).

Apesar de poucos estudos com os antagonistas da BMP, alguns destes tem mostrado seu

potencial inibitório de proliferação em células malignas (FEELEY et al., 2006B; BLISH et al.,

2008). Antagonistas da sinalização BMP tem sido encontrado em baixas concentrações em

células de adenocarcinoma de células claras renais quando comparadas a células do túbulo

proximal normal, assim como, ao se administrar um supressor da BMP nessas células, ocorre

uma diminuição na proliferação celular neste tipo de câncer (BLISH et al., 2008).

Haudenschild et al. (2004) sugerem em pesquisa, por eles realizada, que o Noggin possa

ser indicativo de uma estratégia terapêutica para câncer de próstata com metástase osteolítica,

uma vez que esta proteína inibiu a função da BMP-6.

A expressão imunoistoquímica do Noggin tem se mostrado variada para alguns tecidos.

Na pele normal e em carcinomas basocelular, esta proteína esteve presente moderadamente

(Laurila et al. 2013). Até abril de 2014, a presente pesquisa, pela primeira vez analisa a

proliferação das células SCC25 após a administração de Noggin-rh em células de CEO. Foi

observado que ocorreu uma ação inibitória bastante significativa nas células estudadas, tanto

comparada as células do grupo controle quanto as células do grupo BMP-2. As células tratadas

com Noggin tiveram a viabilidade comprometida, pois foi observado que esta viabilidade

diminuiu com o passar do tempo, nos intervalos estabelecidos, sendo esta diferença

significativa.

Embora se saiba que a principal função do Noggin é antagonizar a BMP, poucos estudos

relatam o mecanismo de ação do Noggin. Bayromov et al. (2011) descreveram em sua pesquisa

73

que uma das funções do Noggin era a inibição da sinalização da Wnt. Em condições normais,

a BMP modula a diferenciação e proliferação de células intestinais através da ativação da

sinalização Wnt. Esta sinalização, por sua vez, tem um papel chave na proliferação celular e é

controlada por vários fatores inibitórios, dentre eles, destacam-se o antagonista da BMP,

Noggin (KRAUSOVA; KORINEK, 2014). Diante deste fato, podemos sugerir, na presente

pesquisa, que ao tratar as células SCC25 com BMP-2, ocorreu uma ativação maior da via Wnt,

justificando assim, o grande aumento na proliferação dessas células. Em contrapartida, a

exposição ao Noggin proporcionou a inativação desta via, justificando a acentuada diminuição

na proliferação destas células.

Quanto a análise do ciclo celular, observou-se que houve significância nas primeiras 24

horas, onde o grupo com BMP-2 apresentou uma porcentagem de células maior na fase G0/G1

do ciclo celular, consequentemente menor porcentagem de células em G2/M comparado ao

grupo controle e Noggin. O tratamento de ceratinócitos epidérmicos interfolicular primários

com BMP-2rh resultou numa transição de colônias proliferativas para colônias abortivas,

sugerindo assim, que essas proteínas inibem a proliferação do ciclo celular, razão maior de

abortarem ao referido ciclo (GOSSELET et al. 2007).

Alguns estudos mostraram que as BMPs exercem duplo papel na progressão da lesão e

metástase tumoral. Durante estágios precoces da carcinogênese essas proteínas agem como

supressoras da proliferação celular e, em estágios avançados, induzem interação epitélio

mesenquima e aumentam a motilidade e invasividade das células, resultando em metástase

(DERYNCK; AKHURST; BALMAIN, 2001; BLANCO CALVO et al., 2009). Diante disto,

podemos supor que a ação da BMP-2 nas células estudadas inicialmente pode funcionar como

uma ação antitumoral, mas com o passar do tempo as células começam a responder a BMP-2

de forma pro-tumoral, graças a um fenótipo mais agressivo que essas células vão adquirindo

com o passar do tempo da doença.

A análise da sinalização celular para a metástase de células cancerígenas é crucial para

o desenvolvimento de novas abordagens no tratamento do câncer. Estudos anteriores mostraram

que a BMP está relacionada com a migração e invasão celular no câncer. Le-Page et al. (2009)

observaram que a BMP-2 estimulou a migração de linhagem de células de carcinoma de ovário,

estimulando o processo de metástase. Estes autores relacionaram ainda a alta expressão da

BMP-2, por imunoistoquímica, com o pior prognóstico de pacientes acometidos por esta

doença.

74

O CEO surge como um crescimento desordenado de células próximas à membrana basal

que se expande em todas as direções, substituindo o epitélio normal (NAGPAL; DAS, 2003;

ZIOBER; FALLS; ZIOBER, 2006; SCULLY; BAGAN, 2009). Assim, para o estabelecimento

da invasão e metástase do CEO, inicialmente, as células tumorais devem degradar as proteínas

da membrana basal e da matriz extracelular e, em seguida, alterar seu padrão de adesão e

migração (CURRAN; MURRAY, 2000; LIM et al., 2004; BAKER et al., 2006).

No presente estudo observou-se que as células SCC25 tratadas com BMP-2rh invadiram

mais o matrigel quando comparada ao grupo controle, resultado contrário achado com as células

tratadas com o Noggin-rh, onde houve poucas células invasoras após 48 horas de experimento.

Afirma-se desta forma, que a BMP-2 aumentou a motilidade e caráter invasivo dessas células

e que o Noggin exerceu o papel inibitório destas características. Esses achados demonstram que

a presença da BMP-2, bem como, o controle da sua sinalização através do Noggin participa no

processo de migração/invasão e metástase das células estudadas.

Apesar de ainda serem poucos os estudos com Noggin em neoplasias malignas, alguns

estudos afirmam que o Noggin pode ser um novo alvo terapêutico para este tipo de lesão

(FEELEY et al, 2006 A e B). Além disso, outros estudos tem mostrado a função antitumoral do

Noggin, onde a baixa expressão de Noggin em CE de esôfago mostrou relação com a menor

taxa de sobrevida desses pacientes (YUEN et al., 2012). Os resultados da presente pesquisa

corroboram esses estudos, pois o Noggin funcionou como inibidor da invasão nas células

estudadas.

Estudo anterior com células de CEO tratadas com BMP-2rh também mostraram maior

invasividade em matrigel e um perfil metastático de natureza genética verificado com maior

intensidade nas células tratadas com a BMP-2rh, isto comparativamente as células neoplásicas

que não receberam esse tratamento. Dentre os genes mais expressos que aumentam o caráter

metastático das células, a MMP-2 e MMP-9 foram detectados (KOKORINA et al., 2011).

Recentemente, Owens et al. (2013) estudaram o efeito do tratamento com BMP-4 em

células de carcinoma mamário e no microambiente tumoral em fibroblastos mamários.

Observaram que os fibroblastos estimulados secretavam um maior número de citocinas pró-

inflamatórias e metaloproteinases da matriz (MMP). Segundo os autores estes fibroblastos

estimularam a invasão das células do carcinoma mamário no matrigel. Além disto, estes efeitos

eram inibidos por antagonistas do receptor quinase da BMP. Desta forma, concluíram que o

tratamento com BMP-4 nas células estudadas elevavam a secreção de fatores pro-tumorais

75

como IL-6 e MMP-3. Estes experimentos demonstram que a BMP-4 estimula a progressão

tumoral direta e indiretamente através do microambiente tumoral.

As BMPs modulam a migração celular e invasão em vários tipos de câncer, através da

ativação de metaloproteinases da matriz (MMP) (ROTHHAMMER et al., 2005; HOU et al.,

2009; ROTHHAMMER et al., 2008). A BMP-2 aumenta a capacidade de invasão e migração

das células tumorais de condrossarcomas aumentando a expressão de MMP-13, através da via

da transdução de sinal das proteínas PI3K, Akt, c-fos/c-Jun e AP-1 (HOU et al., 2009).

Além da ativação de MMPs, Kang et al. (2010) observaram, em estudo, por eles

realizados, que células de câncer gástrico tratadas com BMP-2 diminuíam a expressão de E-

caderina através da ativação da via de sinalização PI3K-Akt e, desta forma, alteravam seu

fenótipo epitelial levando ao aumento da motilidade e invasão das células cancerígenas. Esses

autores identificaram, ainda, a associação entre o alto nível de BMP-2 no soro de pacientes com

câncer gástrico que tinham metástase óssea, que se tornaram visíveis quando comparado aos

pacientes dos grupos controle e de carcinomas sem metástase.

Yan e Boyd (2007) afirmam que as regiões promotoras da maioria das MMPs contém

sítios AP-1 e PEA4 e assim, interagem com elementos da via mitogênica MAPK. Esta via

inicia-se, dentre outras formas, quando ocorre a perda do contato célula-célula e/ou

célula/matriz, levando à sinalização intracelular por meio de moléculas de adesão, tais como as

integrinas.

Recentemente, Kang et al. (2011) avaliaram o papel das vias de sinalização PI3K/AKT,

MAPK e NF-κB na indução de MMP-9 em células de câncer gástrico tratadas com BMP-2.

Eles verificaram que a estimulação das células com a BMP-2 aumentava a ativação das vias

anteriormente descritas e que ao usarem inibidores dessas vias, ocorria uma diminuição na

expressão de MMP-9, com consequente diminuição a invasividade das células neoplásicas.

Além disto, ao analisarem 178 biópsias de tumor gástrico, os autores observaram que as

expressões de BMP-2 e MMP-9 apresentavam correlação positiva com a metástase linfonodal

e o pior prognóstico. Concluíram assim, que a via da BMP-2 aumenta a metástase do câncer

gástrico pela ativação seqüencial da PI3K/AKT ou MAPK seguido pela indução da atividade

da MMP-9, indicando que a inibição da sinalização da BMP-2 poderia constituir um alvo

terapêutico.

Conforme estudos de Nohe et al. (2002), Blanco Calvo et al. (2009), além da via

canônica de sinalização da BMP-2, existe uma via chamada de via de sinalização “não-

canônica”, a MAPK-p38, que é ativada pela ligação homodímera dos receptores I na superfície

76

da membrana celular e que, dessa forma, ligam-se a um receptor II para iniciar a sinalização

intracelular da BMP.

A via MAPK-p38 é ativada por estresses ambientais e genotóxicos e tem um papel-

chave na inflamação, bem como na homeostase tecidual, sendo responsável pelo controle da

proliferação celular, diferenciação, sobrevivência e migração celular. Esta via pode estar

desregulada em cânceres, muito embora, suas funções no desenvolvimento de tumores

malignos sejam complexas. Células normais utilizam essa via de sinalização para antagonizar

a proliferação celular e transformação neoplásica, enquanto que as células cancerosas podem

subverter estes caminhos para facilitar a proliferação, sobrevivência e invasão (WAGNER;

NEBREDA, 2009).

A p38 ativa, pode agir diretamente na invasão e angiogênese tumoral,

independentemente do seu papel na inflamação. Por exemplo, ela pode induzir a expressão de

metaloproteinases de matriz (MMP-1, MMP-3 e MMP-13), que regulam a remodelação da

matriz extracelular, auxiliando o processo metastático de células cancerosas, bem como, induzir

a expressão de VEGF (DOLADO; NEBREDA, 2008). Experimentos utilizando linhagem de

células cancerígenas e testes de invasão corroboram o papel da p38 no processo de metástase

(WAGNER; NEBREDA, 2009).

Xu, Chen e Bergan (2006) estudaram o processo de invasão em câncer de próstata

humano e observaram que a expressão da MMP-2 nas células neoplásicas aumentava após a

aplicação da MAPKAPK 2 (proteína quinase ativada por mitógeno-proteina quinase ativada 2),

um ativador da via MAPK-p38, sendo o processo inverso recíproco, ou seja, quando adicionado

nas células do câncer de próstata um inibidor da via MAPK-p38 (SB203580), ocorria a

diminuição de expressão da MMP-2 e consequentemente, diminuindo a capacidade de

invasividade celular.

Analisando a função da p38 no crescimento e invasão celular em CE de cabeça e

pescoço, Junttila et al. (2007) observaram que em ceratinócitos humanos primários

epidérmicos, a ativação da via MAPK-p38 inativa a via ERK 1, 2 pela desfosforilação da

proteína MEK 1, 2. Já nas células do carcinoma, não ocorria essa inativação da via ERK 1, 2.

Além disso, a inibição da p38 endógena, por um adenovirus de domínio negativo da p38, causou

uma redução na sobrevivência das células do CE, bem como uma diminuição na expressão de

MMP-13 e MMP-1, suprimindo, assim, a invasão das células neoplásicas. Com esse estudo, os

autores sugeriram que a p38 promove o fenótipo maligno de células do CE por regular a

77

sobrevivência, proliferação e invasão celular, sugerindo que essa via seja um alvo terapêutico

potencial para CEs de cabeça e pescoço.

Embora ainda ocorra muita divergência quanto a ação da BMP na neoplasia maligna,

esta proteína representa um novo caminho de moléculas sinalizadoras que pode ser alvo para a

intervenção terapêutica de muitos tipos de canceres. Estudos mostram que o tratamento com

BMP no estroma e parênquima podem estimular fatores pró-tumorais (OWENS et al., 2013).

Com base nos resultados desta pesquisa pode-se observar que componentes da sinalização da

BMP-2 influenciam no comportamento mais agressivo das células SCC25, pois a BMP-2

estimulou a proliferação e a migração das células do CE de língua estudadas, bem como, o

Noggin agiu de forma inibitória nesses parâmetros. Por este estudo ser o primeiro com

visibilidade sobre a ação do Noggin nas células de CE de língua, são necessários estudos

adicionais para que haja uma melhor compreensão do mecanismo de ação dessas proteínas

nestas lesões, objeto deste estudo.

78

“No porto de antes, apreensivo, eu tentava imaginar as dificuldades e lutas futuras. No de agora, dono do tempo

que eu conquistara, simplesmente admirava o que estava ao meu redor e desfrutava do que estava feito. Não era a

sensação de uma batalha ganha, de uma luta em que os obstáculos foram vencidos. Muito mais do que isso, era o

prazer interior de ter realizado algo que tanto desejei, de ter feito e visto o que fiz e vi."

(Amyr Klink)

CONCLUSÕES

79

7 CONCLUSÕES

Frente aos nossos resultados, podemos concluir que:

1) A alta taxa de proliferação de células de CE de língua (SCC25) após a administração

da proteína BMP-2rh, depois 72 horas de experimento, sugere que esta proteína

estimula vias de sinalização que promovem a proliferação desta neoplasia;

2) A baixa taxa de proliferação em células de CE de língua (SCC25) e sua viabilidade

diminuída após a administração da proteína Noggin-rh, depois de 72 horas de

experimento, sugere que esta proteína inibe vias de sinalização que promovem a

proliferação desta neoplasia;

3) Frente a grande quantidade de células da linhagem SCC25 que invadiram o matrigel,

após o tratamento com a proteína BMP-2rh, sugere que a esta proteína estimule o

processo de invasão tumoral no CE de língua e desta forma, seja um fator favorável

a promoção da metástase;

4) A pequena quantidade de células da linhagem SCC25 que invadiram o matrigel após

o tratamento com proteína Noggin-rh, sugere que esta proteína inibe o processo de

invasão tumoral do CE de língua e assim, o Noggin pode constituir um alvo

terapêutico para esta neoplasia.

80

REFERÊNCIAS

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