ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS FOLHAS E CAULES …siaibib01.univali.br/pdf/Karina...
62
KARINA LUIZE DA SILVA MESSIAS ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS FOLHAS E CAULES DA Marlierea tomentosa Camb. ITAJAÍ - 2005
Transcript of ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS FOLHAS E CAULES …siaibib01.univali.br/pdf/Karina...
KARINA LUIZE DA SILVA MESSIAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS FOLHAS E CAULES DA Marlierea tomentosa Camb.
ITAJAÍ - 2005
2
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS
FOLHAS E CAULES DA Marlierea tomentosa Camb.
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí
como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
KARINA LUIZE DA SILVA MESSIAS
Itajaí, Julho de 2005.
3
ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS FOLHAS E CAULES DA Marlierea tomentosa Camb.
Karina Luize da Silva Messias
‘Esta Dissertação foi julgada ........................... para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Avaliação Fitoquímica, de atividade biológica e controle de qualidade de plantas medicinais, e .......................em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Valdir Cechinel Filho, Doutor
Orientador
__________________________________________________________ Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenadora do Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora:
______________________________________ Valdir Cechinel Filho, Doutor
Presidente
______________________________________ Ângela Malheiros, Doutora
______________________________________ Cleuza Conceição da Silva, Doutora
______________________________________ Rivaldo Niero, Doutor
4
Esta dissertação é dedicada aos meus pais, Carlos e Liliane, que com muito amor, souberam me ensinar o verdadeiro valor da luta e da conquista. E ao meu esposo, pelo companheirismo e compreensão.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela proteção e força, permitindo a conquista de mais esta etapa.
Ao meu amigo e orientador Valdir Cechinel Filho, pelo seu dinamismo e segurança, e
principalmente por me apoiar e dar força nos momentos oportunos, enriquecendo este
trabalho com numerosas contribuições. Sua confiança e orientação foram fonte do meu bem-
estar no laboratório e de êxito nesta pesquisa. Muito obrigada.
Aos meus pais, Carlos e Liliane, pela confiança, amor e oportunidade concedida, e
principalmente por ensinarem o verdadeiro valor da luta e da conquista. A eles, o meu amor
eterno.
Ao Walter, meu esposo, que com sua paciência e compreensão me permitiu dedicar
grande parte do tempo que era seu, nesta pesquisa.
A nossa filha, Ana Luiza, tão viva e fundamental quanto uma planta. A você, todo
meu carinho e amor.
A amizade é uma fonte inesgotável de cumplicidade e de verdade humana quando se
pode dividi-la com Vânia F. Noldin. Pela sua consistente contribuição neste trabalho e por sua
coragem contagiosa, muito obrigada. Todo sucesso para você.
A Rosélia, pela atenção a todos dispensada na Secretaria do Mestrado, sendo ela
muitas vezes a nossa “psicóloga”.
Quero agradecer particularmente aos professores Alexandre B. Cruz e Fátima C. Buzzi
e toda sua equipe, pela realização dos testes microbiológicos e farmacológicos
respectivamente, que foram de fundamental importância para complementação deste trabalho.
Obrigada.
A professora Ângela Malheiros, pelo companheirismo, atenção e ajuda, a todos
dispensada no Laboratório de Fitoquímica.
6
Ao professor Franco Delle Monache, da Itália, pela sua constante ajuda na
identificação dos compostos químicos isolados neste trabalho. Obrigada.
Aos professores Clóvis A. Rodrigues, Rivaldo Niero e Maique W. Biavatti e demais
professores do NIQFAR, pelo companheirismo.
A Duas Rodas Industrial, que indiretamente, contribuiu para a realização deste
trabalho.
A todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
Muito obrigada.
7
A natureza está pronta a nos ajudar, desde que façamos a nossa parte.
Max Freedon Long
8
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
ESTUDO FITOQUÍMICO E FARMACOLÓGICO DAS FOLHAS E CAULES DA Marlierea tomentosa Camb.
Karina Luize da Silva Messias
Setembro / 2005 Orientador: Valdir Cechinel Filho, Doutor Co – orientadora: Ângela Malheiros, Doutora Área de Concentração: Avaliação fitoquímica, de atividade biológica e controle de qualidade de plantas medicinais. Palavras-chave: Marlierea tomentosa, atividade antinociceptiva, triterpenos e compostos fenólicos, atividade antimicrobiana Número de Páginas: 62.
Marlierea tomentosa (Myrtaceae) é uma planta nativa do Brasil, tradicionalmente usada
contra várias patologias, incluindo dor e infecções. Porém, a literatura não apresenta nenhum
estudo fitoquímico ou farmacológico sobre a espécie. O presente trabalho descreve o
isolamente de cinco fitoconstituintes das folhas e galhos de M. tomentosa. Das folhas foram
isolados os triterpenos alfa-amirina (7), beta-amirina (8) e os compostos fenólicos quercetrina
(3) e isoquercetrina (9). Dos galhos foi possível isolar o triterpeno ácido arjunólico (10). A
caracterização estrutural dos compostos isolados da planta foi possível através de análise em
técnicas espectroscópicas usuais como IV, RMN-1H e RMN-13C. A atividade antinociceptiva
dos extratos brutos, frações e do ácido arjunólico foi avaliada utilizando o teste das contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético e formalina. Os extratos metanólicos brutos das
folhas e caules de M. tomentosa, assim como as frações de HEX, DCM e AE demonstraram
atividade antinociceptiva promissora frente ao teste de ácido acético, se comparado com
fármacos clássicos usados na clínica. Quando avaliado no teste do ácido acético, o ácido
arjunólico apresentou um percentual de inibição de 81,2%. Por outro lado, quando avaliado
no teste da formalina, inibiu 34,2% a primeira fase da dor (de origem neurogênica) e 38,1% a
segunda fase da dor (de origem inflamatória). As frações de DCM, AE e BuoH das folhas,
assim como a fração de AE dos caules apresentaram atividade antimicrobiana pronunciada
contra o microorganismo S. aureus. Os resultados encontrados são importantes, pois, justifica
em partes, a utilização desta planta em processos dolorosos pela população.
9
Abstract of Dissertation presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Pharmaceutical Science.
PHYTOCHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL STUDY OF THE LEAVES END BRANCHES OF Marlierea tomentosa Camb.
Karina Luize da Silva Messias
September /2005
Advisor: Valdir Cechinel Filho, Phd; Angela Malheiros, Phd. Area of Concentration: Phytochemical evaluation, biological activity and quality control of medicinal plants. Keywords: Marlierea tomentosa, Antinociceptive activity, Antimicrobial activity, Triterpenes and Phenolic compounds Number of Pages: 62. Marlierea tomentosa (Myrtaceae) is a native Brazilian medicinal plant traditionally used
against several disorders, including pain and infections. However, to the best of our
knowledge, no study, neither phytochemical nor pharmacological, has been carried out with
this plant. So, this paper describes the isolation of five phytoconstituents from the leaves and
branches of Marlierea tomentosa. From the leaves of this plant were isolated the triterpenes
α-amyrin (7), β-amyrin (8), and the phenolic compounds quercitrin (3) and isoquercitrin (9).
The branches afforded the triterpene arjunolic acid (10). The structural characterization of
isolated compounds were achieved by IR spectra, 1H and 13C NMR analysis. In addition, the
antinociceptive activity of the crude extracts, fractions and compound 10 were tested using
the writhing and formalin test in mice. The crude extracts from the leaves and branches of M.
tomentosa, as well as hexane, dichloromethane and ethyl acetate fractions showed pronounced
antinociceptive action in the writing test. The triterpene arjunolic acid showed pronounced
antinociceptive action in the writing test (81,2%) and formalin test in mice, inhibiting 34,2%
the first phase of the pain (neurogenic origin) and 38,1% the second phase of the pain
(inflammatory origin). Dichloromethane, ethyl acetate and buthanol fractions from the leaves
and ethyl acetate fraction from the branches also showed a pronounced antimicrobial activity
against S. aureus. These data are important, and, justify at least in part, the popular use of
thus plant for the treatment of dolorous processes.
10
SUMÁRIO
1.0 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 16
2.0 OBJETIVOS......................................................................................................... 18
2.1Objetivo geral ............................................................................................... 18
2.2 Objetivo específico ...................................................................................... 18
3.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 19
3.1 Plantas medicinais – estudos e utilização .................................................. 19
3.2 Produtos naturais – utilização global ........................................................ 20
3.3 Brasil e sua biodiversidade ......................................................................... 21
3.4 O gênero Marlierea e a M. tomentosa ........................................................ 22
3.4.1 Estudos com outras espécies do gênero Marlierea........................... 23
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 25
4.1 Materiais e métodos .................................................................................... 25
4.2 Material vegetal ........................................................................................... 25
4.3 Isolamento e identificação de metabólitos secundários das folhas de
M. tomentosa ......................................................................................................
26
4.4 Isolamento e identificação de metabólitos secundários dos caules de
M. tomentosa ......................................................................................................
26
4.5 Análise farmacológica.................................................................................. 30
4.5.1 Análise da atividade antinociceptiva................................................. 30
4.5.2 Análise da atividade antimicrobiana................................................. 31
5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 32
5.1 Resultados fitoquímicos ............................................................................. 32
5.1.1 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários nas
folhas de M. tomentosa ...........................................................................
32
5.1.1.1 Composto Mt-1 e Mt-2 ............................................................ 32
5.1.1.2 Composto Mt-3 ......................................................................... 37
5.1.1.3 Composto Mt-4 ......................................................................... 43
5.1.2 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários nos
caules de M. tomentosa .............................................................................
45
5.1.2.1 Composto Mt-5 ........................................................................ 45
5.2 Análise da atividade farmacológica ....................................................... 50
5.2.1 Atividade antinociceptiva das folhas de M. tomentosa.................. 50
11
5.2.2 Atividade antinociceptiva dos caules de M. tomentosa ............... 51
5.2.3 Atividade antinociceptiva do ácido arjunólico isolado dos caules
de M. tomentosa ........................................................................................
52
5.3 Análise da atividade microbiológica ...................................................... 55
5.3.1 Atividade antimicrobiana e antifúngica das folhas e caules de
M. tomentosa .............................................................................................
55
6.0 CONCLUSÕES .................................................................................................... 57
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 58
12
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ilustrações da Marlierea tomentosa: folha (A), ramo (B)....................... 23
Figura 2: Procedimento usado durante a preparação e fracionamento dos
extratos das folhas de M. tomentosa ......................................................
28
Figura 3: Procedimento usado durante a preparação e fracionamento dos
extratos dos caules de M. tomentosa ......................................................
29
Figura 4: Espectro no Infra-vermelho dos compostos Mt-1 e Mt2 (pastilha KBr) 33
Figura 5: Espectro de RMN-1H dos compostos Mt-1 e Mt-2 em CDCl3 usando
TMS como padrão interno de referência. ...............................................
35
Figura 6: Espectro de RMN-13C dos compostos Mt-1 e Mt-2 em acetona-d6
usando TMS como padrão interno de referência. ..................................
36
Figura 7: Espectro de IV do composto Mt-3 (pastilha KBr).................................. 36
Figura 8: Espectro de RMN-1H do composto Mt-3 em piridina d5 usando TMS
como padrão interno de referência..........................................................
40
Figura 9: Espectro de RMN-13C (APT) do composto Mt-3 em piridina d5
usando TMS como padrão interno de referência. ..................................
41
Figura 10: Espectro no Infra-vermelho (pastilha KBr) do composto Mt-5.............. 46
Figura 11: Espectro de RMN-1H do composto Mt-5 em CD3OD usando TMS
como padrão interno de referência..........................................................
46
Figura 12: Espectro de RMN-13C ampliado entre 10 e 45 ppm em CD3OD do
composto Mt-5 usando TMS como padrão interno de
referência.................................................................................................
47
Figura 13: Espectro de RMN-13C (APT) em CD3OD do composto Mt-5 usando
TMS como padrão interno de referência................................................
47
Figura 14: Efeito antinociceptivo do extrato e frações obtidas das folhas de M.
tomentosa no modelo de dor induzido pelo ácido acético (10 mg/kg)...
50
Figura 15: Efeito antinociceptivo do extrato e frações obtidas dos caules de M.
tomentosa no modelo de dor induzido pelo ácido acético (10 mg/kg)...
51
Figura 16: Efeito antinociceptivo do ácido arjunólico isolado dos caules de M.
13
tomentosa no modelo de dor induzido pelo ácido acético (10 mg/kg)... 53
Figura 17: Efeito antinociceptivo do ácido arjunólico isolado dos caules de M.
tomentosa no modelo de dor induzido pela formalina (10 mg/kg), Fase
I e Fase II.................................................................................................
54
14
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Valores dos deslocamentos químicos (ppm) de 1H e 13C para o
flavonóide quercitrina conforme valores obtidos para o composto
isolado, em piridina-d5 (300 MHz) e dados da literatura........................
39
Tabela 2: Dados de RMN-1H /CD3OD (300MHz) e RMN-13C (CD3OD)
(300MHz) dos compostos Mt-3 (quercetrina) e Mt-4 ............................
43
Tabela 3: Dados de RMN-1H /CD3OD (300MHz) e RMN-13C (CD3OD)
(300MHz) do ácido arjunólico, comparando com dados da literatura ...
48
Tabela 4: Dados da atividade antinociceptiva comparativa entre extratos brutos
e frações de M. tomentosa com medicamentos utilizadas na clínica......
52
Tabela 5: Dados da atividade antinociceptiva comparativa entre o triterpeno
ácido arjunólico e medicamentos utilizadas na clínica...........................
53
Tabela 6: Dados da atividade antinociceptiva comparativa entre o triterpeno
ácido arjunólico e medicamentos utilizadas na clínica, frente ao teste
da formalina ...........................................................................................
55
Tabela 7: Dados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do
extrato metanólico bruto e frações das folhas de M. tomentosa ............
55
Tabela 8: Dados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do
extrato metanólico bruto e frações dos caules de M. tomentosa ............
56
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AE - Acetato de etila
BuOH - Butanol
C.C - Cromatografia em Coluna
C.C.D - Cromatografia em Camada Delgada
Co- C.C.D – Co – Cromatografia em Camada Delgada
CIM - Concentração Inibitória Mínima
DCM - Diclorometano EMB - Extrato Metanólico Bruto
HEX - Hexano i.p.- intraperitoneal
P.A - Puro para análise
Rf - Fator de Retenção
RMN 1H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN 13C - Ressonância magnética nuclear de carbono
TMS - Tetrametilsilano
**p < 0,01 e *p < 0,05- Diferença estatisticamente significativa
δ - Deslocamento Químico em ppm
J – Constante de acoplamento
16
1.0 INTRODUÇÃO
A utilização das plantas como fonte de medicamento para o tratamento das
enfermidades que acometem a espécie humana, remonta à idade antiga (CALIXTO, 2001;
CANIGUERAL, 2002; KOEHN e CARTER, 2005). Certamente, a terapêutica moderna,
composta por um grande número de medicamentos com ações específicas sobre receptores,
enzimas e canais iônicos, não teria atingido o grau de desenvolvimento atual se não fosse o
auxílio dos produtos naturais, notadamente aqueles derivados das plantas superiores
(CALIXTO, 2001).
Atualmente, cerca de 25% dos fármacos utilizados na terapêutica são de origem
vegetal, enquanto que 50% são de origem sintética, mas relacionados aos princípios isolados
de plantas medicinais (UGAZ, 1994; MARTINS, 2003; OLIVEIRA, 2003). Dentre as
substâncias provenientes das plantas, são amplamente utilizadas na clínica a morfina, a
vincristina, a rutina, o taxol, etc. (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998; KINGHORN, 2002).
Compostos descobertos mais recentemente também podem ser citados, como a lovastatina
que reduz o colesterol, a reserpina que atua como antihipertensivo e sedativo, a artemisinina
ativa em casos de malária, e a galantamina que parece ser ativa no mal de Alzheimer, além
dos compostos camptotecina e trabectidina que originaram compostos semi-sintéticos usados
no tratamento de câncer (BUTLER, 2004; BUTLER, 2005; KOEHN e CARTER , 2005)
No segmento acadêmico, a convicção da importância dos recursos naturais para o
desenvolvimento vem de longa data. Afinal, as plantas fazem parte da vida do homem desde
seus primórdios e sua importância nos diversos estágios de desenvolvimento da sociedade é
inegável.
Nos últimos anos, têm se verificado um grande aumento nos estudos que comprovam
o que se conhece empiricamente, visto que a medicina popular é rica em exemplos de plantas,
utilizadas para diversos fins, que substituem, muitas vezes, a prescrição médica (CECHINEL
FILHO e YUNES, 1998).
É neste contexto, que pode ser citado os trabalhos desenvolvidos pelo Núcleo de
Investigações Químico Farmacêuticas (NIQFAR), do Curso de Farmácia da Univali, os quais
vem contribuindo significativamente na elucidação da composição química e atividade
farmacológica de plantas medicinais, buscando validar o uso popular de algumas destas
plantas, além de procurar descobrir novas moléculas ativas que possam futuramente serem
transformadas em novos fármacos (CECHINEL FILHO, 2000).
17
Com o intuito de pesquisar outras plantas da flora brasileira, o presente estudo visou
investigar os fitoconstituintes presentes nas diferentes partes da planta Marlierea tomentosa,
bem como pesquisar possíveis efeitos farmacológicos, particularmente sua ação analgésica e
antimicrobiana.
Esta espécie pertence à família Myrtaceae, ocorre principalmente em locais mais secos
das florestas de três estados brasileiros, como São Paulo, Paraná e Santa Catarina. É
popularmente conhecida como guaparanga, garapurana ou guapuruva. Na medicina popular,
esta sendo utilizada principalmente para tratamento de processos infecciosos e dolorosos.
Tendo em vista a utilização desta planta com finalidades terapêuticas pela população,
verificou-se que quase nada pode ser encontrado sobre esta espécie em literatura
especializada, tanto no aspecto químico como farmacológico. Por isso a importância deste
estudo, o qual tem por objetivo embasar cientificamente a utilização desta espécie como
recurso terapêutico, visando em especial detectar novas substâncias bioativas na busca de
novos fitofármacos ou fitoterápicos, além de contribuir para a quimiotaxonomia do gênero
Marlierea.
18
2.0 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar a composição química e possíveis efeitos farmacológicos das diferentes
partes como folhas e galhos, da espécie Marlierea tomentosa.
2.2 Objetivos específicos
• Verificar as principais classes de compostos orgânicos presentes nas diferentes
partes da M. tomentosa através de CCD.
• Isolar e identificar os principais constituintes químicos presentes na M.
tomentosa, utilizando técnicas cromatográficas (CC, CCD, Co-CCD) e espectroscópicas
usuais (IV, RMN-1H, RMN-13C).
• Observar e comparar a ação analgésica e antimicrobiana dos extratos brutos,
frações (HEX, DCM, AE e BuOH) e compostos puros das diferentes partes da M. tomentosa.
19
3.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Plantas medicinais – estudos e utilização
Há milhares de décadas que o homem vem buscando nas plantas a cura para as mais
variadas enfermidades (SILVA JÚNIOR e VIZOTTO,1996; YUNES et al., 2001;
CANIGUERAL, 2002), e historicamente as plantas podem ser consideradas a fonte mais
importante de fármacos (STEPP, 2004; TULP et al., 2004).
Produtos derivados de plantas, usados na alimentação ou na forma de preparados, tem
sido usado com sucesso para cura e prevenção de doenças ao longo da história, podendo-se
citar o uso de plantas medicinais pelos sumérios há mais de 5.000 anos (RASKIN, 2002).
As plantas medicinais, ou seja, aquelas que possuem propriedades terapêuticas, são
amplamente utilizadas na medicina popular contra várias patologias. Seu uso vem crescendo
gradativamente ao longo dos últimos anos devido a vários fatores, como o baixo poder
aquisitivo da maioria da população que procura uma medicina alternativa a menores custos
(CECHINEL FILHO et al., 1996; MARTINS, 2003), o que direta ou indiretamente vem
contribuindo para o descobrimento de novos fármacos (TULP, 2002).
Vários profissionais, como médicos, farmacêuticos, biólogos, veterinários e dentistas
se mostram cada vez mais interessados em aprofundar seus conhecimentos sobre os produtos
naturais bem como fazer uso das mais antigas preparações como: tinturas, infusos, extratos,
decoctos, etc (SALANTINO e SALANTINO,1996). Com o intuito de sustentar o uso de
plantas medicinais, têm se verificado nos últimos anos um grande avanço científico
envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas que visam obter novos
compostos com propriedades terapêuticas, onde podemos citar os grandes avanços
conseguidos na área de produtos naturais através de técnicas modernas como cristalografia e
ressonância magnética nuclear (RMN), principalmente nos últimos quinze anos (BUTLER,
2005).
Através do desenvolvimento de novas técnicas espectroscópicas, os químicos
orgânicos têm conseguido elucidar rapidamente estruturas moleculares complexas de
constituintes naturais, até há pouco tempo difíceis de serem elucidadas. A cada momento são
relatadas na literatura novas moléculas, algumas de relevante ação farmacológica, como por
exemplo, o taxol, um poderoso agente anticâncer já disponível no mercado farmacêutico
(CECHINEL FILHO e YUNES, 1998). As plantas têm contribuído, ao longo dos anos, para a
20
obtenção de vários fármacos, sendo até hoje amplamente utilizados na clínica como a
morfina, a rutina, a lovastatina, a reserpina, a artemisinina, e a galantamina (KINGHORN,
2002; BUTLER, 2004; BUTLER, 2005; KOEHN e CARTER , 2005).
No período de 1981 a 2002, foram descobertos 877 novos fármacos sendo que 49%
deste total derivam de produtos naturais, ou são análogos semi-sintéticos e sintéticos de
produtos naturais. A maioria destes novos fármacos derivados da natureza estão sendo
utilizados para hipertensão ou no tratamento de câncer (NEWMAN e CRAGG, 2003;
BUTLER, 2005; KOEHN e CARTER, 2005).
3.2 Produtos naturais – utilização global
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 75% da população mundial
utilizam fitoterápicos ou fitomedicamentos (MARTINS, 2003). Estima-se que no mundo, são
utilizadas 10.000 espécies vegetais com fins medicinais (CANIGUERAL, 2002).
De acordo com CANIGUERAL (2002), a fitoterapia é a terapia de maior crescimento
absoluto nos últimos anos, passando de 2,5% em 1990 para 12,1% em 1997. Somente na
Alemanha, médicos generalistas optam por este tipo de terapia em 8 a 25% das prescrições.
Segundo MARTINS (2003), a indústria de fitoterápicos comercializou US$19,6
bilhões em todo mundo, tendo como principais mercados o americano e europeu. Entre os
medicamentos fitoterápicos mais vendidos na Europa destacam-se o Ginkgo biloba,
Hypericum perforatum, Valeriana officinalis, Panax ginseng, entre outros.
Para o mercado brasileiro de fitoterápicos, dados apontam um crescimento de 15% em
2002 e 2003, movimentando US$ 500 milhões por ano (MARTINS, 2003).
Na última década, aproximadamente 500 novos compostos químicos ativos foram
aprovados por órgãos competentes em todo mundo, sendo a metade destes compostos
oriundos de fonte natural (TULP, 2002).
De acordo com a OMS e fazendo uma revisão de artigos científicos especializados em
produtos naturais, existem 121 compostos químicos oriundos de plantas usados como
medicamentos mundialmente, podendo ser citados a atropina, codeína, colchicina,
pilocarpina, quinina, além de drogas descobertas mais recentemente como a galantamina,
isolada de Galanthus wronowi e de várias outras espécies do gênero Amaryllidaceae, a qual
foi aprovada nos Estados Unidos e em vários países europeus para o tratamento do mal de
Alzheimer, e o paclitaxel, um agente anticâncer (CALIXTO, 2001; CANIGUERAL, 2002;
KINGHORN, 2002; STEPP, 2004). Vale salientar que nas áreas de tratamento de câncer e
21
doenças infecciosas, mais de 60 e 75% dos medicamentos utilizados respectivamente, são
provenientes de fonte natural (CALIXTO, 2001; KINGHORN, 2002; NEWMANN e
CRAGG, 2003; MARTINS, 2003).
De acordo com RASKIN et al. (2002), as plantas provavelmente retornarão como
principal fonte de saúde para os seres humanos e os motivos citados por ele para que isso
ocorra são:
1- A enorme capacidade das plantas em sintetizar misturas de bioativos com estruturas
diferentes e com múltiplas atividades terapêuticas;
2- Baixo custo de plantas e sua capacidade de fornecer metabólitos secundários;
3- Diminuição da utilização de droga única para tratamento e prevenção de doenças;
4- Limitação de custo para síntese química de moléculas complexas bioativas;
5- Percepção de que devido o uso de plantas pela população ao longo da história e a co-
evolução de plantas e humanos, produtos fitoquímicos fornecem um modo mais
seguro para prevenção e tratamento de doenças.
Neste contexto, produtos naturais de origem vegetal constituem uma estratégia para
inovação farmacêutica e competitividade do setor, tendo em vista a singularidade estrutural
das substâncias encontradas em plantas, patenteabilidade e seu papel como protótipos
moleculares para o desenvolvimento de novos fármacos (OLIVEIRA, 2003).
Em países em desenvolvimento, como o Brasil, o uso terapêutico de plantas
medicinais e seus manufaturados ajudam a reduzir a importação de fármacos ou
medicamentos, e ainda incrementa o desenvolvimento econômico. Além disso, medicamentos
derivados de plantas conhecidas tendem a ser mais aceitos pela população, facilitando a
aderência ao tratamento (MORAES et al., 2003).
3.3 Brasil e sua biodiversidade
As florestas tropicais são freqüentemente consideradas as de maior biodiversidade
vegetal, atraindo olhares e a atenção de pesquisadores de todo mundo (STEPP, 2004). É
estimado existirem aproximadamente 250 milhões de espécies vegetais em todo território
terrestre, mas apenas pequena parte delas foi estudada fitoquimicamente e
farmacologicamente (OLIVEIRA, 2003; TULP, 2004).
É preciso ressaltar que a biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão, tal a
sua complexidade. O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal, contando com
mais de 55.000 espécies catalogadas ou 20 a 22% do total mundial (SIMÕES et al., 2001;
22
OLIVEIRA, 2003; MORAES, 2003). Deste total, somente cerca de 5% tem sido estudadas
fitoquimicamente, e uma porcentagem menor avaliada sob aspectos biológicos (CECHINEL
FILHO e YUNES, 1998), sendo que muitas destas espécies são amplamente utilizadas pela
população à nível mundial (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998).
Nas últimas décadas do século XX, intensificaram-se as pesquisas com plantas
medicinais no Brasil com o objetivo de avaliar sua eficácia terapêutica e a segurança de seu
uso. Das plantas brasileiras estudadas fitoquimicamente e farmacologicamente vale citar a
Croton cajucara, conhecida popularmente como sacaca, da qual foram isolados diterpenos
como a desidrocrotonina e cajucarina B. Esta classe de compostos apresentou atividade
antibiótica e antitumoral. Dentre os ativos mais importantes isolados de plantas brasileiras
podemos citar os diterpenos caurânicos como o ácido caurenóico, isolado de plantas como
Wedelia paludosa e Xylopia frutescens, apresentando atividade tripanossomicida,
antibacteriana e antifúngica. E também o lapachol, uma naftoquinona isolada do gênero
Tabebuia, que apresentou atividade antitumoral, antimalárica, tripanossomicida e
antimicrobiana (OLIVEIRA, 2003).
Segundo Prof. Elisaldo Carlini, apud MARTINS (2003), se a fitoterapia tivesse a
devida valorização, a biodiversidade poderia ser a salvação do setor farmacêutico nacional,
citando ainda que a Alemanha é o país líder no consumo de fitomedicamentos e tem cerca de
20 espécies vegetais endêmicas, enquanto que somente a Amazônia possui mais de 20 mil
espécies.
3.4 O gênero Marlierea e a M. tomentosa
O gênero Marlierea pertence à família Myrtaceae. Nesta família podemos encontrar
árvores e arbustos os quais se desenvolvem bem em área tropicais, subtropicais e também
áreas temperadas da Austrália. Esta família compreende em torno de 140 gêneros e 3000
espécies. Na família Myrtaceae é comum ocorrer flavonóis, sendo rara a presença de flavonas
(AMARAL, 2001).
No Brasil, o gênero Marlierea ocorre principalmente da região central ao sul do país,
podendo citar como exemplo a espécie Marlierea tomentosa Cambess, conhecida
popularmente como guaparanga, garapuruna ou guapuruva. A M. tomentosa é uma árvore que
pode alcançar até 12 m de altura, podendo ser encontrada na floresta costeira do Brasil nos
estados do Rio de Janeiro até o Rio Grande do Sul (LIMBERGER, 2004).
23
Vale salientar, sobre esta espécie, que apenas trabalhos sobre a composição do óleo
essencial e composição de elementos inorgânicos das folhas foram encontrado em literaturas
especializadas os quais serão citados abaixo, sendo os estudos propostos neste projeto,
inéditos para a planta.
De acordo com LIMBERGER (2004), o óleo essencial presente nas folhas de M. tomentosa é
composto predominantemente por hidrocarbonetos como o β-cariofileno (22,5%), bi-ciclo-
germancreno (24,9%) e α-bergamoteno (12,1%). As folhas de M. tomentosa também
apresentaram como principais componentes inorgânicos bromo e cobalto (FRANÇA, 2005).
A B
Figura 1: Ilustrações da Marlierea tomentosa: folha (A), ramo (B).
3.4.1 Estudos com outras espécies do gênero Marlierea
A M. eugeniopsoides teve seu óleo volátil analisado frente à atividade antimicrobiana,
apresentando excelente atividade inibitória contra os microorganismos Staphilococcus
epidermidis, Staphilococcus aureus, Micrococcus luteus e Saccharomyces cerevisae. Nesta
espécie foi observada a presença de terpinoleno como componente majoritário, reconhecido
por sua atividade antimicrobiana (LIMBERGER et al., 1998). De acordo com LIMBERGER
(2004), o óleo das folhas de M. eugeniopsoides é rico em monoterpenos (56,1%)
principalmente terpinoleno e ρ-cimeno. Nas folhas de M. silvatica há a predominância de
sesquiterpenos, sendo os principais o β-cariofileno e bi-ciclo-germacreno. Mas as folhas de
24
M. obscura são ricas em sesquiterpenos oxigenados como o espatulenol, óxido de cariofileno
e globulol.
Da fração hexânica das folhas de M. schotti foram isoladas as flavonas tectocrisina (1),
6-metiltectocrisina e 8-metiltectocrisina (AMARAL, 2001).
Ainda em estudos fitoquímicos deste gênero com a fração de acetato de etila das
folhas de M. grandifolia,foi possível isolar os flavonóides quercetina (2), quercetrina (3),
miricetina 3-ramnosídeo (4), e os compostos fenólicos ácido elágico (5) e ácido 3-O-
metilelágico (6) (AMARAL, 2001).
O
O
CH3O
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
OH
(1) (2)
O
O
HO
OH
O
OH
OH
O
OHOH
HO
O
OHOH
HO
O
O
HO
OH
O
OH
OH
OH
(3) (4)
O
O
OH
OH
HO
HO
O
O
O
O
OH
OH
HO
HO
O
O
H3CO
(6) (5)
25
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais e reagentes
Os espectros no infravermelho (IV) foram obtidos em um espectrômetro Perkin-Elmer
FT-16 PC, em pastilha de KBr. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H
e 13C foram realizados em espectrômetro BRUKER AC-200F (1H 300 MHz; 13C 75 MHz)
(Universidade Católica de Sacro Cuore/Roma) tendo como referência interna tetrametilsilano
(TMS) ou o próprio solvente. Todos os solventes utilizados foram solventes deuterados. Os
deslocamentos químicos foram medidos em valores adimensionais (δ ppm).
Para cromatografia em coluna aberta (CC) foi utilizada a sílica gel (0,063 – 0,200
mesh) MERCK como fase estacionária, utilizando-se como fase móvel solventes orgânicos
em ordem crescente de polaridade, de acordo com a afinidade pelo extrato ou fração
submetidos ao processo. As frações foram coletadas, o solvente foi evaporado à temperatura
ambiente e reunidas conforme as semelhanças de Rf observadas por cromatografia em
camada delgada (CCD). Para isolamento dos compostos também foi utilizada cromatografia
“Flash” utilizando coluna e sílica adequada para este tipo de procedimento.
Na cromatografia em camada delgada (CCD) foi utilizada sílica gel 60 GF 254 da
MERCK como fase estacionária e como fase móvel misturas de solventes orgânicos em
diferentes graduações. A revelação dos cromatogramas foi realizada por aspersão de reativos
específicos, como anisaldeído sulfúrico (esteróides e/ou terpenóides), reativos de Dragendorff
(alcalóides) ou cloreto férrico (compostos fenólicos) de acordo com metodologias descritas na
literatura (UGAZ, 1994). O grau de pureza dos compostos isolados foi verificado através de
CCD, RMN de 1H e RMN de 13C. Os pontos de fusão dos compostos isolados foram
determinados em um equipamento Microquímica AP-300.
Os eluentes utilizados para a cromatografia em coluna e camada delgada foram grau
de pureza P.A, ou foram tratados e destilados de maneira usual.
4.2 Material vegetal
Para o isolamento dos compostos foram utilizados as folhas e caules de Marlierea
tomentosa Cambess, família Myrtaceae. As partes da planta foram coletadas em junho de
2003 em Itajaí-SC, na localidade conhecida como Morro do Baú e identificada pelo Prof Dr.
26
Ademir Reis do horto botânico da Universidade Federal de Santa Catarina. Uma exsicata
encontra-se depositada no Herbário Barbosa Rodrigues (HBR) em Itajaí- SC, identificada
como VC Filho 037.
4.3 Isolamento e identificação de metabólitos secundários das folhas de M. tomentosa
As folhas foram secas à temperatura ambiente (800 g), moídas e posteriormente
submetidas à extração com 11 litros de metanol por 7 dias. O solvente foi evaporado sob
pressão reduzida até a secura (evaporação total do metanol). O extrato metanólico bruto
obtido foi dissolvido em metanol/água (1:1) e então particionado sucessivamente com
solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila, butanol) para a
obtenção das frações semi-purificadas. (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998). A figura 2
mostra os procedimentos mencionados.
Após a obtenção das frações, estas foram avaliadas fitoquimicamente. Amostras do
extrato metanólico bruto e das frações foram avaliados em testes farmacológicos.
Devido a semelhança no perfil fitoquímico das frações de hexano (HEX) e
diclorometano (DCM), estas foram agrupadas e cromatografadas em coluna de vidro, sobre
sílica gel 60, utilizando como solvente uma mistura de hexano/acetona com aumento
gradativo da polaridade. Através deste procedimento foi possível o isolamento dos compostos
Mt-1 e Mt-2 (21mg).
A fração de acetato de etila (AE) (2,01 g) foi cromatografada em colunas de vidro
sobre sílica gel 60, utilizando-se como solvente uma mistura de clorofórmio/metanol com
aumento gradativo de polaridade. As frações similares, monitoradas por CCD, foram reunidas
de acordo com suas polaridades e sucessivamente recromatografadas utilizando cromatografia
em coluna fornecendo os compostos Mt-3 (39mg) e Mt-4 (27mg).
4.4 Isolamento e identificação de metabólitos secundários dos caules de M. tomentosa
Os caules foram secos a temperatura ambiente (800 g), moídos e
posteriormente submetidas à extração com 5 litros de metanol por 7 dias. O solvente foi
evaporado sob pressão reduzida até a secura (evaporação total do metanol). O extrato
metanólico bruto obtido foi dissolvido em metanol/água (1:1) e então particionado
sucessivamente com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de
27
etila) para a obtenção das frações semi-purificadas. (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998). A
figura 3 mostra os procedimentos mencionados.
Após a obtenção das frações, estas foram avaliadas fitoquimicamente. Amostras do
extrato metanólico bruto e das frações foram avaliados em testes farmacológicos.
A fração de HEX (953 mg) foi cromatografada em colunas cromatográficas (CC),
sobre sílica gel 60 utilizando como solvente uma mistura de hexano/acetona com aumento
gradativo de polaridade. As frações similares monitoradas por CCD, foram reunidas e
submetidas a nova CC e assim sucessivamente usando o sistema de solvente citado acima,
possibilitando o isolamento do composto Mt-5 (64mg).
A fração de AE foi cromatografada em colunas cromatogáficas (CC), sobre sílica gel
60 utilizando como solvente uma mistura de clorofórmio/metanol com aumento gradativo de
polaridade, porém não foi possível o isolamento de compostos desta fração.
28
Folhas M. tomentosa
800 g Maceração MeOH (7 dias) Evaporação sob pressão reduzida
Extr. Bruto Metanólico
34,1 g Testes
Farmacológicos
Fração HEX
0,15 g Fração DCM
0,58 g Fração AE
3,36 g Fração BuOH
3,48 g
Testes Farmacológicos
Procedimentos Cromatográficos
Procedimentos Cromatográficos
Compostos puros
Compostos puros
Elucidação Estrutural (IV, RMN)
Elucidação Estrutural (IV, RMN)
Composto Mt-1
+ Composto Mt-2
(21 mg)
Composto Mt-3 (39 mg)
Composto Mt-4 (27 mg)
Figura 2: Procedimento usado durante preparação e fracionamento do extrato das
folhas de M. tomentosa.
29
Caules M. tomentosa
800 g
Maceração MeOH (7 dias) Evaporação sob pressão reduzida
Extr. Bruto Metanólico
39,3g Testes
Farmacológicos
Fração HEX 1,03 g
Fração DCM 0,47 g
Fração AE 2,07 g
Testes Farmacológicos
Procedimentos
Cromatográficos
Compostos
puros
Elucidação Estrutural
(IV, UV, RMN)
Composto Mt -5
(64 mg) Figura 3: Procedimento usado durante preparação e fracionamento do extrato dos
caules de M. tomentosa
30
4.5 Análise farmacológica
4.5.1 Análise da atividade antinociceptiva
a) Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
Preliminarmente foi verificado o efeito das frações e/ou compostos no teste das contorções
abdominais. Embora este seja um modelo de nocicepção simples e pouco específico, permite
avaliar em um primeiro momento a atividade analgésica de várias substâncias que atuam tanto ao
nível central quanto periférico. A resposta nociceptiva foi induzida pela injeção intraperitoneal de
ácido acético (0,6%) diluído em solução salina (0,9%). As contorções abdominais consistem
basicamente da contração da musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das patas
posteriores, de acordo com o método descrito anteriormente (COLLIER et al., 1968; SOUZA et al.
1998; BRESCIANI et al. 2003).
Após a injeção do ácido acético os camundongos foram observados em pares e colocados
em funis de vidro individuais. O número de contorções abdominais foi quantificado
cumulativamente durante um período de 20 minutos A atividade analgésica foi determinada,
tomando-se como base a inibição do número das contorções abdominais dos animais pré-tratados
com os extratos brutos, frações ou composto ativo isolado, administrados sistemicamente via
intraperitoneal.
b) Dor induzida pela formalina
Para confirmação do efeito analgésico do composto isolado dos caules de M.tomentosa foi
utilizado o teste de dor, induzida pela injeção intraplantar de formalina. O procedimento utilizado
foi similar ao descrito anteriormente (HUNSKAAR,1987; SOUZA et al., 1998; MENDES et al.,
2000). Os animais receberam 20 μl de formalina a 2,5% (0,92% de formaldeído) ou solução salina
na região intraplantar das patas posterior direita e esquerda, respectivamente.
Logo após a injeção de formalina os animais foram colocados individualmente em funis de
vidro ao lado de um espelho para facilitar a observação. Logo após foi registrado o tempo em que
o animal permanece lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina, sendo esse tempo,
cronometrado (em s) e considerado como indicativo de dor. Esse modelo permite evidenciar duas
fases de sensibilidade dolorosa: a primeira, que ocorre durante os primeiros 5 minutos após a
injeção da formalina (dor de origem neurogênica), e a segunda, que ocorre entre 15 a 30 min após
31
a formalina, representando a resposta tônica à dor, acompanhada por uma resposta inflamatória
relacionada com a liberação de mediadores químicos da inflamação.
4.5.2 Análise da atividade antimicrobiana
a) Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Os extratos e frações obtidos foram avaliados quanto a sua atividade antimicrobiana
através do método da concentração inibitória mínima (CIM) inicialmente, contra bactérias
(Escherichia coli e Staphylococcus aureus) e fungo (Cândida albicans). As bactérias foram
previamente ativadas em caldo de infusão de cérebro e coração e os fungos foram ativados em
agar Sabouraud dextrose.
Os extratos e frações foram dissolvidos em DMSO e adicionados em cinco séries de
cinco frascos de vidros nas concentrações de 200 μg/mL a 1000 μg/mL. A cada frasco foi
adicionado 1 mL de meio de cultura Agar MuellerHinton para as bactérias e Agar Sabourand
para os fungos, seguido de homogeinização. Após a solidificação dos respectivos meios de
cultura, os microorganismos foram incubados nas séries correspondentes, sendo incubados a
37oC por 18 a 24h para E. coli e S. aureus e a 37oC por 24 a 48 horas para C. albicans
(ZACCHINO,2001; PRETTO, 2004).
32
5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Resultados fitoquímicos
5.1.1 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários das folhas de M. tomentosa
Para a análise dos compostos químicos presentes nas folhas de M. tomentosa,
foi preparado o extrato metanólico a partir de 800 g de material vegetal previamente seco e
moído grosseiramente. Após sucessivas partições com solventes de polaridade crescente,
foram obtidas as frações de hexano (HEX), diclorometano (DCM), acetato de etila (AE) e
butanol (BuOH) com rendimentos de 0,0189%, 0,0721%, 0,419% e 0,434%
respectivamente.
Estas frações foram avaliadas primeiramente em cromatografia de camada delgada
(CCD). As frações de HEX e DCM mostraram perfil fitoquímico semelhante, apresentando
uma variedade de compostos quando revelados com anisaldeído sulfúrico (esteróides e
terpenóides). As frações de AE e BuOH apresentaram manchas características quando
revelados com cloreto férrico, indicando a presença de compostos fenólicos. Não foi
verificada a presença de alcalóides pois não revelaram manchas características quando
utilizado o revelador Dragendorff.
5.1.1.1 Composto Mt-1 e Mt-2
Devido a semelhança no perfil fitoquímico das frações de HEX e DCM, estas foram
agrupadas e cromatografadas em coluna de vidro sobre sílica gel 60, utilizando como solvente
uma mistura de hexano/acetona com aumento gradativo da polaridade. Através deste
procedimento foi possível o isolamento de uma mistura de compostos aqui denominados de
Mt-1 e Mt-2 (21 mg), a qual apresentou-se como cristais brancos com ponto de fusão entre
189 –192oC .
Analisando o espectro no Infra vermelho (Figura 4), este mostra absorções na região
de 3200 cm-1 correspondente a deformação axial característica do grupamento OH. Na região
de 2900 cm-1 encontra-se a absorção correspondente a deformação axial do grupamento C-H.
e na região de 1550 cm-1 uma absorção correspondente deformação axial C=C. Em 1036 cm1
podemos observar a absorção da deformação angular do grupamento OH.
33
Figura 4: Espectro no Infra-vermelho dos compostos Mt-1 e Mt-2 (pastilha de KBr)
cm-1
Através do espectro no Infra-vermelho e de análise em Co-CCD utilizando amostra
autêntica como padrão, foi possível sugerir que os compostos anteriormente denominados de
Mt-1 e Mt-2, trata-se da mistura de triterpenos pentacíclicos α-amirina (7) e β-amirina (8),
respectivamente. Esta mistura de compostos é muito comum de ser encontrada em plantas e
de difícil separação por possuírem polaridade muito semelhante.
Neste sentido, o espectro de RMN-1H da mistura de compostos Mt-1 e Mt-2 (Figura
5) apresentou um padrão característico de triterpenóides, confirmado pela presença de vários
singletos na região de δ 0,8 a 1,3. Também apresentou um duplo-dupleto em δ 3,25
característico de H-3 em triterpenóides do tipo 3β-OH e dois tripletos δ 5,15 e 5,20
correspondente aos hidrogênios H-12 e H-13 da olefina.
O espectro de RMN-13C (Figura 6) apresentou sinais em δ 77,5 e 77,8 atribuídos ao
carbono carbinólico C-3. Na região das olefinas foram observados dois pares de sinais mais
intensos, referentes aos constituintes majoritários, dos quais δ 145,0 (C) e δ 122,0 (CH)
34
caracterizam a β-amirina. E δ 139,6 (C) e δ 124,7 (CH), a α-amirina sendo este último o
constituinte principal.
A comparação dos resultados obtidos com os relatados na literatura (JUNIOR, 2005;
CARVALHO, 1998) permitiu identificar os triterpenóides α-amirina e β-amirina, na razão de
5:2, determinada por comparação dos valores da integração dos sinais da região das olefinas
(δ 5,15 e 5,20) e do hidrogênio em carbono carbinólico (δ 3,25), no espectro de RMN-1H.
Considerando-se que foram obtidos após fracionamento cromatográfico 21 mg da mistura de
triterpenos, e considerando a proporção entre eles, contatou-se que 10,5 mg corresponde a α-
amirina e 4,2 mg a β-amirina.
HOHO
Mt-1 (7) Mt-2 (8)
A atividade farmacológica desta mistura de triterpenos já foi muitas vezes estudada e
citada em literaturas especializada. α-amirina e β-amirina foi anteriormente isolada de
diversas plantas, podendo ser citado a Protium kleinii (OTUKI et al., 2005), Protium
heptaphyllum (OLIVEIRA et al., 2004) e Carmona retusa (VILLASENOR et al., 2004).
Estes compostos quando estudados associados apresentaram atividade antinociceptiva
periférica, espinal e supra-espinal em roedores (OTUKI et al., 2005b), atividade gastro-
protetora (OLIVEIRA et al., 2004), atividade hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2004 b) e
atividade antimicrobiana moderada contra Staphylococcus aureus, Cândida albicans, e
Trichophyton mentagrophytes (VILLASENOR et al., 2004). A α-amirina isolada apresentou
atividade similar a dexametasona, sendo uma boa candidata à droga com efeito anti-
inflamatório com boa permeabilidade pela pele (OTUKI et al., 2005).
35
Figura 5: Espectro de RMN-1H (300 Mz) dos compostos Mt-1 e Mt-2 em CDCl3
usando TMS como padrão interno de referência.
36
Figura 6: Espectro de RMN-13C do composto Mt-1 e Mt-2 em acetona-d6 usando TMS como
padrão interno de referência.
37
5.1.1.2 Composto Mt-3
A fração de AE (2,01 g) foi cromatografada em colunas de vidro, sobre sílica gel 60,
utilizando como eluente uma mistura de clorofórmio/metanol com aumento gradativo de
polaridade. As frações similares monitoradas por CCD, foram reunidas e submetidas a
sucessivas cromatografias em coluna aberta, usando o sistema de solvente citado acima,
possibilitando o isolamento de dois compostos denominados de Mt-3 (39mg) e Mt-4 (27mg).
Estes compostos quando revelados com cloreto férrico mostraram manchas características de
compostos fenólicos, possivelmente flavonóides.
A identificação do composto Mt-3 foi realizada através de análises espectrais
comparadas com as citadas em literatura.
Observa-se no espectro no IV (Figura 7) banda de deformação axial de OH em 3400
cm-1, em 1656 cm-1 sinal correspondente à deformação axial C=O e em 1610 cm-1 deformação
axial de C=C, como os principais sinais de absorção de energia no infravermelho (JEONG;
SHIM, 2004).
38
cm-1
Figura 7: Espectro no IV do composto Mt-3 (pastilha KBr).
O espectro de RMN-1H (Figura 8) do composto Mt-3 apresenta sinais característicos
do flavonóide quercitrina conforme descrito em literatura, sendo alguns destes: δ 13,4
referente ao OH ligado ao C-5; δ 8,04 referente ao H-2’e δ 7,7 referente ao H-6’ e δ 7,3
referente ao H-5’. Também sinais em δ 6,7 e 6,6 referentes ao H-6 e H-8 respectivamente. Os
hidrogênios referentes ao açúcar encontram-se na região de δ 6,3-1,5. Os valores de RMN-1H
e 13C encontram-se na tabela 1.
39
Tabela 01: Valores dos deslocamentos químicos (ppm) de 1H e 13C para o flavonóide
quercitrina conforme valores obtidos para o composto isolado, em piridina-d5 (300 MHz) e
dados da literatura.
Carbono δ 13C
CD3OD (100
MHz)a
δ 1H (mult., J=Hz)
DMSO-d6 (600
MHz) a
Composto
Mt-3
δ 13C
Composto Mt-3
δ 1H (mult., J=Hz)
2 158,6 - 157,5 -
3 136,3 - 135,8 -
4 179,7 - 178,9 -
5 163,3 - 162,7 -
6 99,8 6,3 (d J= 2,0) 99,5 6,7 (d J= 2,0)
7 165,9 - 165,6 -
8 94,7 6,4 (s J= 2,0) 94,3 6,6 (d J= 2,0)
9 159,3 - 158,0 -
10 105,9 - 105,2 -
1` 122,9 - 122,1 -
2` 116,9 7,4 (d J= 2,3) 116,3 8,0 (d J= 2,1)
3` 146,4 - 147,1 -
4` 149,8 - 150,3, -
5` 116,4 7,1 (d J= 8,2) 116,9 7,3 (d J= 8,3)
6` 123,0 7,4 (dd J= 8,2; 2,3) 121,9 7,7 (dd J= 8,3; 2,1)
1” 103,6 5,48 (d J= 1,6) 103,8 6,3 (d J= 1,4)
2” 72,1 4,3 (dd J= 1,6; 3,0) 73,1 5,1 (dd J= 1,5; 2,5)
3” 72,1 3,9 (dd J= 3,2; 9,5) 72,3 4,6 (dd J= 3,3; 9,0)
4” 73,3 3,5 (t J= 9,5) 71,9 4,32 (t)
5” 71,9 3,5 (dd J= 9,5; 6,2) 71,8 4,35 (m)
6”
OH
17,7 1,1 (d J= 6,2) 18,2 1,5 (d J= 6,0)
13,4
a XI-ZING et.al., 1997
40
Figura 8: Espectro de RMN-1H (300 Mz) do composto Mt-3 em piridina-d5 usando TMS
como padrão interno de referência.
41
Figura 9: Espectro de RMN-13C (APT) do composto Mt-3 em piridina-d5 usando TMS como
padrão interno de referência.
42
O espectro de RMN-13C apresenta os sinais na região de δ 73,7 a 71,7 referentes aos carbonos
da C-2” e C-5” . Em δ 103,8 sinal referente ao carbono anomérico.
Também apresenta sinais em δ 94,3; 99,5; 105,2; 157,4; 158,0; 162,7; 165,6 e 178,9
referentes aos respectivos carbonos: 8, 6, 10, 2, 9, 5, 7 e 4. Demais sinais correspondem aos
citados em literatura (XI-ZING et al., 1997; MAJINDA et al. 1997; MEYRE SILVA, 2003).
A quercitrina (quercetina-3-O-ramnosídeo) (3) é um flavonóide heterosídico, o qual
foi isolado sob a forma de pó amorfo e cristais de coloração amarela, com ponto de fusão
entre 176-179 ºC, num rendimento total de 39 mg.
O
O
HO
OH
O
OH
OH
O
OHOH
HO
2
345
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
4''5''6''
9
10
Mt-3 (3)
Na literatura especializada podemos encontrar dados sobre a atividade antioxidante e
anti-radicais livres exercida pelos flavonóides (MARTÍNEZ-FLÓREZ, 2002; TRUEBA,
2003).
A quercitrina já foi isolada anteriormente de diversas plantas podendo ser citada a
Marlieria grandifolia (AMARAL, 2001), Bauhinia microstachya (MEYRE-SILVA, 2001;
MEYRE-SILVA, 2003), espécies de Hypericum (DALL’AGNOL et al., 2003), Leea
guineense (OP DE BECK, 2003) e Diodia teres (LEE, 2004). Este composto apresentou
potente atividade analgésica frente ao teste de ácido acético, sendo esta ação dose-dependente
(MEYRE-SILVA, 2001), atividade anti-inflamatória (FERMIN, 1996), atividade hipotensiva
(NOVOA, 1985) e atividade antiviral contra o vírus da herpes (MUSCI, 1992).
43
5.1.1.3 Composto Mt-4
Da mesma forma que a quercitrina, o composto Mt-4 se tratava de um sólido de forma
amorfa e amarelo com ponto de fusão entre 227 – 229 oC . Os espectros de RMN-1H e RMN-13C não estão sendo mostrados neste trabalho por serem muito semelhantes com o da
quercitrina. A diferença entre a quercitrina e o composto Mt-4 consiste somente no açúcar
ligado ao C-3, onde na quercitrina o açúcar é a ramnose e no composto Mt-4 é a glicose. No
espectro de RMN-1H, esta diferença é observada no H anomérico onde para a quercitrina
aparece em δ 6,3 e para Mt-4 em δ 5,4. Ainda podemos observar para a quercitrina um sinal
em δ 1,5 correspondente ao metila em C-6”, e para o composto Mt-4 podemos observar um
multipleto em δ 3,22 correspondente ao metileno em C-6’’. Para o espectro de RMN-13C, a
maior diferença pode ser observada no sinal em δ 60,8 referente a C-6” do composto Mt-4, o
qual é observado em δ 18,2 na quercitrina. Os dados de RMN-1H e RMN-13C podem ser
observados na tabela 2.
Tabela 2: Dados de RMN-1H /CD3OD (300MHz) e RMN-13C (CD3OD) (75MHz) dos
compostos Mt-3 (quercitrina) e Mt-4.
Mt-3 Mt-4 Mt-3 Mt-4 H RMN-1H
δ, (mult) RMN-1H δ,(mult)
C RMN-13C δ
RMN-13C δ
2 157,5 156,3
3 135,8 133,5
4 178,9 177,5
5 162,7 160,1
6 6,7(d) 6,1(d) 6 99,5 98,5
7 165,6 163,7
8 6,6(d) 6,3(d) 8 94,3 93,5
9 158,0 156,4
10 105,2 103,8
1’ 122,1 120,9
2’ 8,0(d) 7,5(d) 2’ 116,3 115,8
3’ 147,1 144,5
4’ 150,3 147,1
5’ 7,3(d) 6,9(d) 5’ 116,9 116,3
44
6’ 7,7(dd) 7,57(dd) 6’ 121,9 121,1
1” 6,3(d) 5,4(d) 1” 103,8 101,2
2” 73,1 74,3
3” 72,3 76,7
4” 71,9 70,4
5” 5” 71,8 77,8
6” 1,5 (d) 3,22 (m) 6” 60,8 18,2
Os dados apresentados para o composto Mt-4 são compatíveis com os resultados
descritos na literatura (LIM, et al., 2000; KIM et al., 2004), nos permitindo concluir que o
composto Mt-4 é o flavonóide isoquercitrina (9) ou quercitina-3-O-glucosideo. Este composto
também foi confirmado através de Co-CCD utilizando amostra autêntica como padrão.
O
O
HO
OH
O
OH
OH
O
OHOH
HO
2
345
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
4''5''6''
9
10 OH
Mt-4 (9)
A isoquercitrina foi anteriormente isolada de plantas como Pterospartum tridentatum
(VITOR, 2004), Phyllanthus sellowianus (HNATYSZYN, 2002), Eucommia ulmoides (KIM,
2004), Conyza filaginoides (CALZADA, 2001), Astragalus corniculatus (KRASTEVA,
2004), Solanum incanum (LIN, 2000), Morus Alba (DOI, 2001) e Ipomoea pes-caprae
(KROGH, 1999). Este composto, assim como a maioria dos flavonóides, demonstrou
atividade antioxidante (VITOR, 2004), atividade contra o protozoário Entamoeba hystolitica
(CALZADA, 2001), atividade anti-diabética (KIM, 2004) e também foi descrita sua atividade
antinociceptiva frente aos testes de ácido acético e formalina (KROGH, 1999; MEYRE-
SILVA, 2003).
45
5.1.2 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários dos caules de M. tomentosa
Para a análise dos compostos químicos presentes nos caules de M. tomentosa, foi
preparado o extrato metanólico a partir de 800 g de caules previamente secos, moídos
grosseiramente e macerados em 5 litros de metanol por 7 dias. Após este período o solvente
foi evaporado utilizando evaporador rotatório a vácuo e o extrato bruto particionado com
solventes de polaridade crescente como: hexano (HEX), diclorometano (DCM) e acetato de
etila (AE) obtendo-se rendimentos de 0,128%, 0,0583 e 0,2587%, respectivamente.
Estas frações foram avaliadas primeiramente em cromatografia de camada delgada
(CCD). As frações de HEX e DCM apresentaram resultados positivos quando reveladas com
anisaldeído sulfúrico indicando a presença de esteróides e terpenóides. Por outro lado, a
fração de AE apresentou perfil fitoquímico típico de compostos fenólicos quando revelado
com cloreto férrico. Não foi verificada a presença de alcalóides pois as frações deram teste
negativo quando utilizado o revelador Dragendorff.
5.1.2.1 Composto Mt-5
A fração de HEX (953 mg) foi cromatografada em coluna (CC), sobre sílica gel 60,
utilizando como eluente uma mistura de hexano/acetona com aumento gradativo de
polaridade. As frações similares monitoradas por CCD, foram reunidas e submetidas a
sucessivas CC usando-se o sistema de solvente citado acima, possibilitando o isolamento de
um composto sólido branco com p.f. 240-247oC e denominado previamente como Mt-5 (64
mg). O espectro no Infra vermelho do composto Mt-5 (Figura 10) mostra absorção (banda
larga) na região de 3600 - 2600cm-1 correspondente a deformação axial da hidroxila do
grupamento ácido e absorções na região de 3600 - 3300cm-1 correspondente a deformação
axial da hidroxilas dos grupamentos álcoois. Na região de 2900 cm-1 encontra-se a absorção
correspondente a deformação axial de C-H. Em 1696 cm-1 uma absorção correspondente a
carbonila e na região de 1500 cm-1 a absorção correspondente a insaturação. Em 1050 cm-1
pode-se observar a absorção correspondente a deformação axial do grupamento C-O.
46
Figura 10: Espectro de Infra-vermelho (pastilha de KBr) do composto Mt-5
O composto Mt-5 apresenta sinais bem característicos de RMN-1H (CD3OD) (Figura
11) e RMN-13C (CD3OD) (Figuras 12 e 13) de triterpenos pentacíclicos os quais são tabelados
a seguir (tabela 3), e comparados com dados da literatura (JUNGES, 2000; LIMA, et al.,
2002; VIEIRA, et al., 2004). Mas vale destacar os sinais em δ 3,70 e 3,35 referentes a H-2 e
H3 respectivamente, sinal em δ 5,3 referente a H-12 referente a olefina.
Figura 11: Espectro de RMN-1H do composto Mt-5 em CD3OD Figura 11: Espectro de RMN-1H do composto Mt-5 em CD3OD
cm-1
CH2OHHO
HOCOOH
12
3
45
6
7
8
9
10
11
1213
14
15
16
17
18
19 2021
22
2324
25 26
27
28
29 30
47
Figura 12: Espectro de RMN-13 C ampliado entre 10 e 45ppm em CD3OD do composto Mt-5
usando TMS como padrão interno de referência
CH2OHHO
HOCOOH
12
3
45
6
7
8
9
10
11
1213
14
15
16
17
18
19 2021
22
2324
25 26
27
28
29 30
Figura 13: Espectro de RMN-13 C (APT) em CD3OD do composto Mt-5 usando TMS como
padrão interno de referência.
Figura 13: Espectro de RMN-13 C (APT) em CD3OD do composto Mt-5 usando TMS como
padrão interno de referência.
48
Tabela 3: Dados de RMN-1H /CD3OD (300MHz) e RMN-13C (CD3OD) (75MHz) do
ácido arjunólico, comparado com dados da literatura.
H Mt-5 RMN-1H /CD3OD δ, (mult)
RMN-1H /CD3OD δ, (mult)
VIEIRA, 2004
C Mt-5 RMN-13C (CD3OD)
δ
RMN-13C (CD3OD)
δ JUNGES, 2000
1 0,90 α (m) 1,90 β (m)
0,89 α (m) 1,90 β (m)
1 47,6
47,6
2 3,70 (ddd) 3,70 (ddd) 2 69,6 68,8 3 3,35 (d) 3,35 (d) 3 78,2 78,1 4 42,7 42,5 5 47,5 48,1 6 19,1 18,4 7 33,3 33,1 8 39,8 39,9 9 47,9 48,1 10 38,2 38,2
11 1,9 (m) 1,89 α (m) 1,93 β (m)
11 24,0 23,7
12 5,3 (dd) 5,25 (t) 12 123,39 123,0 13 145,49 144,8 14 42,7 42,1 15 28,8 28,3
16 2,0 (ddd) 1,59 α (m) 1,96 β (m)
16 24,6 23,8
17 47,6 46,5 18 2,85 (dd) 2,82 (dd) 18 44,12 42,1 19 1,13 α (m)
1,60 β (m) 1,13 α (m) 1,61 β (m)
19 47,6 46,5
20 30,7 30,8 21 33,8 33,2 22 33,5 33,1
23 3,4 α (d) 3,8 β (d)
3,32 α (d) 3,51 β (d)
23 66,4 66,3
24 0,75 (s) 0,75 (s) 24 13,8 14,2 25 1,0 (s) 1,0 (s) 25 19,10 17,4 26 0,80 (s) 0,78 (s) 26 17,52 17,3 27 1,15 (s) 1,14 (s) 27 28,8 27,9 28 180,0 180,3
29 0,90 (s) 0,90 (s) 29 33,3 33,1 30 0,92 (s) 0,92 (s) 30 23,9 23,7
Estes resultados foram confirmados com dados descritos para este composto na literatura
(JUNGES, 2000; LIMA, et al., 2002; VIEIRA, et al., 2004), permitindo concluir que Mt-5
trata-se do triterpeno ácido arjunólico (10) ou ácido 2α,3β-23-triidroxiolean-12-en-28óico.
49
CH2OHHO
HOCOOH
12
3
45
6
7
8
9
10
11
1213
14
15
16
17
18
19 2021
22
2324
25 26
27
28
29 30
Mt-5 (10)
O ácido arjunólico foi isolado anteriormente de plantas como Eugenia florida
(JUNGES, 2000),e Melaleuca alternifólia (VIEIRA, 2004), ambas pertencentes a família
Myrtaceae, Cochlospermum tinctorium (DIALLO, 1989), Cornus capitata (BHAKUNI,
2002), Pourouma guianensis (TORRES-SANTOS, 2004), Miconia trailli (ZHANG, 2003),
Cariniana rubra (LIMA, 2002). Porém, pouco se sabe sobre a atividade farmacológica deste
composto, sendo citado na literatura a atividade inseticida (BHAKUNI, 2002), ação
cardioprotetora (SUMITRA et al., 2001) e a atividade inibitória sobre o crescimento de
tumores de pele (DIALLO, 1989).
Neste sentido, uma análise sobre a ação antinociceptiva foi realizada no intuito de
embasar cientificamente a utilização desta planta como recurso terapêutico pela população.
50
5.2 Análise da atividade farmacológica
5.2.1 Atividade antinociceptiva das folhas de M. tomentosa
A busca do alívio da dor através das diversificadas formas de terapia tem sido
marcante ao longo da história do homem e entre elas, o emprego das plantas medicinais
aparece com destaque (ALMEIDA, 2003).
Os resultados da figura 14 mostram a análise farmacológica do extrato metanólico
bruto (EMB) e das frações obtidas das folhas de M. tomentosa. Como pode ser observado, o
EMB indicou uma inibição do no de contorções abdominais induzida por ácido acético de 43
± 2,78 %. Por outro lado, a fração de DCM foi a de maior ação neste modelo com uma
inibição de 91,1 ± 3,18 %, seguida da fração de BuOH e AE. Estes resultados sugerem que a
atividade analgésica encontrada pode estar relacionada aos triterpenos α-amirina e β-amirina
isolados da fração de DCM e já descritos anteriormente na literatura (OTUKI et al., 2005b).
Da mesma forma, também pode estar associada aos compostos fenólicos presentes nas frações
de AE e BuOH, principalmente dos flavonóides.
Contorções abdominais induzidas pelo ác. acético - via i.p.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle Extr. bruto HEX DCM AE BuOH
Núm
ero
de c
onto
rçõe
s
19,9%
43% ** 44,4%
**71,2%
**91,1% **
Figura 14: Efeito antinociceptivo do extrato e frações obtidas das folhas de M. tomentosa no modelo de dor induzido pelo ácido acético (10 mg/kg). Cada coluna representa a média de seis experimentos. p < 0,05, **p < 0,01.
51
5.2.2 Atividade antinociceptiva dos caules de M. tomentosa
Os resultados da figura 15 mostram a análise farmacológica do extrato metanólico
bruto e das frações obtidas dos caules de M. tomentosa. Como pode ser observado, o EMB
dos caules indicou uma inibição da contração abdominal induzida por ácido acético de 38 ±
6,73% porém, menor se comparada com a inibição causada pelo EMB das folhas.
Por outro lado, a fração de AE foi a de maior ação neste modelo com uma inibição de
70,5 ± 2,31%. Neste aspecto, podemos sugerir que compostos fenólicos presentes nesta fração
(revelado com cloreto férrico) podem ser os responsáveis pelo efeito encontrado. As frações
de HEX e DCM também tiveram ação inibitória, porém com atividade menos relevante. O
próximo passo foi investigar a atividade analgésica do triterpeno ácido arjunólico isolado da
fração de HEX, para o qual, não foi encontrado estudos na literatura sobre esta ação.
Contorções abdominais induzidas por ác. acético - via i.p.
01020304050607080
Controle Extr. bruto HEX DCM AE
Núm
ero
de c
onto
rçõe
s
**P < 0.01
38% ** 39,7%
**42,6% ** 70,5%
**
Figura 15: Efeito antinociceptivo do extrato e frações obtidas dos caules de M. tomentosa no modelo de dor induzido pelo ácido acético (10 mg/kg). Cada coluna representa a média de seis experimentos. p < 0,05, **p < 0,01.
52
Na tabela 4, encontram-se os valores observados para os extratos brutos das folhas e
caules de M. tomentosa e suas respectivas frações, comparada com a ação antinociceptiva de
dois medicamentos de referência utilizadas na clínica, o acetominofem e ácido acetil
salicílico, onde podemos observar que algumas frações das folhas e caules de M. tomentosa
mostraram atividade antinociceptiva mais relevante que estas drogas.
Tabela 4: Dados da atividade antinociceptiva comparativa entre extratos brutos e frações de M. tomentosa com medicamentos utilizadas na clínica.
Tratamento Inibição (%)*
Extrato bruto (folhas) 43,0 ± 2,8**
Hexano (folhas) 19,9 ± 5,1
Diclorometano (folhas) 91,1 ± 3,2**
Acetato de etila (folhas) 44,4 ± 5,9**
Butanol (folhas) 71,2 ± 2,2**
Extrato bruto (caules) 38,0 ± 6,7**
Hexano (caules) 42,6 ± 3,0**
Diclorometano (caules) 39,7 ± 3,8**
Acetato etila (caules) 70,5 ± 2,3** a Acetaminofem 38,0 ± 1,0* a Ac. Acetil Salicílico 35,0 ± 2,0*
* Dose 10 mg/kg; b*P < 0.05; **P < 0.01. Cada grupo representa a media de seis a oito experimentos.
a Dado de Bresciani et al. (2003).
5.2.3 Atividade antinociceptiva do ácido arjunólico isolado dos caules de M. tomentosa
O ácido arjunólico (10) foi isolado da fração hexânica dos caules de M. tomentosa. Por
termos isolado uma significativa quantidade deste composto e também porque na literatura
especializada não foi encontrada nenhuma citação sobre a atividade antinociceptiva do
mesmo, submetemos a avaliação da atividade em dois modelos clássicos de dor: ácido acético
e formalina.
53
0
10
20
30
40
50
60
Controle 10 mg/Kg
Acido Arjunólico - Ácido acético via i.p.
Num
ero
de c
onto
rçõe
s
81,2%**
Ácido arjunólico – Ácido acético via i.p.
Figura 16: Efeito antinociceptivo do ácido arjunólico isolado dos caules de M. tomentosa no modelo de dor induzido pelo ácido acético (10 mg/kg). Cada coluna representa a média de seis experimentos. p < 0,05, **p < 0,01.
Como pode ser observado na figura 16, a análise farmacológica do ácido arjunólico
isolado da fração hexânica dos caules de M. tomentosa (10mg/kg) causou uma inibição
significativa da contração abdominal induzida por ácido acético de 81,2 %. Se compararmos
com a inibição observada para a fração hexânica (42,6%) (Fig.15) podemos sugerir que parte
da ação antinociceptiva observada nesta fração pode estar relacionada com a presença deste
triterpeno.
No mesmo experimento, podemos observar que o ácido arjunólico apresentou
atividade antinociceptiva mais promissora que medicamentos usualmente utilizadas na
clínica como acetominofem e ácido acetil salicílico (Tabela 5).
Tabela 5: Dados da atividade antinociceptiva comparativa entre o triterpeno ácido
arjunólico e medicamentos utilizadas na clínica.
Tratamento Inibição (%)*
81,2%** Ácido arjunólico a Acetaminofem 38,0 * a Ac. Acetil Salicílico 35,0 *
* Dose 10 mg/kg; b*P < 0.05; **P < 0.01. Cada grupo representa a media de seis a oito experimentos.
54
Quando a atividade antinociceptiva do ácido arjunólico foi analisada no teste da
formalina, modelo mais específico, o qual permite avaliar dois tipos distintos de dor: a
primeira fase de origem neurogênica (estimulação direta dos neurônios nociceptivos) e a
segunda fase de origem inflamatória representando a resposta tônica à dor, acompanhada de
uma resposta inflamatória relacionada com a liberação de mediadores químicos da
inflamação, foi possível confirmar a atividade antinociceptiva deste composto, como pode ser
observado na figura 17.
0102030405060708090
100
controle 10 mg/Kg
Formalina Fase I - Ácido Arjunólico
tem
po (s
) 35,4%*
0
50
100
150
200
250
300
controle 10 mg/Kg
Formalina Fase II - Ácido Arjunólico
tem
po (s
) 38,1%**
Fase II– Ácido Arjunólico Fase I – Ácido Arjunólico
Figura 17: Efeito antinociceptivo do ácido arjunólico isolado dos caules de M. tomentosa no modelo de dor induzido pela formalina (10 mg/kg), Fase I e Fase II. Cada coluna representa a média de seis experimentos. p < 0,05, **p < 0,01.
O ácido arjunólico mostrou uma inibição de 35,4 % da primeira fase da dor (de origem
neurogênica). Porém, quando avaliado frente a Fase II da dor (Fig.17), mostrou-se mais ativo
com inibição de 38,1 %.
Se compararmos com a indometacina, medicamento usualmente utilizado na clínica,
ainda no teste da formalina, podemos observar que o ácido arjunólico apresentou atividade
antinociceptiva promissora sendo apenas 2 vezes menos eficaz que este medicamento.
55
Tabela 6: Dados da atividade antinociceptiva comparativa entre o triterpeno ácido arjunólico e medicamento utilizado na clínica, frente ao teste da formalina
Tratamento Fase I – Inibição (%) Fase II - Inibição (%)
Ácido arjunólico 34,2* 38,1%**
Indometacina 10,0 70,0 ** * Dose 10 mg/kg; b*P < 0.05; **P < 0.01. Cada grupo representa a media de seis a oito experimentos.
5.3 Análise da atividade microbiológica
5.3.1 Atividade antimicrobiana e antifúngica das folhas e caules de M. tomentosa
Para a realização dos testes antimicrobianos e antifúngicos através da diluição em
ágar, concentrações de até 1000 μg/mL dos extratos metanólicos brutos e frações das folhas e
caules de M. tomentosa foram incorporados nos meios de crescimento.
Os extratos ou frações com Concentração Inibitória Mínima (CIM) < 1000 μg/mL
contra qualquer espécie bacteriana ou fúngica, foram considerados ativos. Os
microorganismos testados foram a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, a bactéria
Gram-negativa Escherichia coli e a levedura Candida albicans.
Como pode ser observado nas tabelas 6 e 7, nenhum extrato bruto ou fração foi ativo
para as espécies E. coli e C. albicans pois tiveram CIMs > 1000 μg/mL. Por outro lado, as
frações mais polares como DCM, AE e BuOH das folhas e AE dos caules apresentaram
atividade contra a bactéria S. aureus, com valores de CIM de 500, 300, 900 e 600 μg/mL,
respectivamente.
Tabela 7: Dados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato metanólico bruto e frações das folhas de M. tomentosa Extrato/ Fração S. aureus E. coli C. albicans
Extr. bruto MeOH > 1000 > 1000 > 1000
Fração HEX > 1000 > 1000 > 1000
Fração DCM 500 > 1000 > 1000
Fração AE 300 > 1000 > 1000
Fração BuOH 900 > 1000 > 1000
56
Tabela 8: Dados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato
metanólico bruto e frações dos caules de M. tomentosa
Extrato/ Fração S. aureus E. coli C. albicans
Extr. bruto MeOH > 1000 > 1000 > 1000
Fração HEX > 1000 > 1000 > 1000
Fração DCM > 1000 > 1000 > 1000
Fração AE 600 > 1000 > 1000
Através dos dados obtidos, podemos verificar que a fração de AE das folhas de M.
tomentosa apresentou o melhor resultado contra S. aureus com CIM de 300 μg/mL, onde
podemos sugerir que a ação antimicrobiana pode estar relacionada com flavonóides presentes
nesta fração. Dados encontrados na literatura, já descrevem a ação antimicrobiana de
flavonóides (MEYRE-SILVA et al., 2001; CALZADA, 2001; MARTÍNEZ-FLÓRES, 2002;
TRUEBA, 2003).
57
6.0 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que:
• Nas folhas e caules de M. tomentosa há maior concentração de compostos de natureza
fenólica como flavonóides e esteroidal/ terpênica e ausência de alcalóides.
• Das folhas de M. tomentosa foi possível isolar os triterpenos alfa e beta –amirina e os
flavonóides quercitrina e isoquercitrina.
• Dos caules de M. tomentosa foi isolado o triterpeno ácido arjunólico, sendo este,
provavelmente o composto majoritário nesta parte da planta.
• Os extratos brutos metanólicos das folhas e caules de M. tomentosa, assim como as
frações de HEX, DCM e AE, demonstraram atividade antinociceptiva promissora
frente ao teste de ácido acético se comparado com fármacos clássicos usados na
clínica.
• O ácido arjunólico isolado dos caules de M. tomentosa apresentou atividade
antinociceptiva promissora frente ao teste do ácido acético (81,2%) e também
atividade antinociceptiva significativa frente ao teste da formalina, inibindo 34,2% a
primeira fase da dor (de origem neurogênica) e 38,1% a segunda fase da dor (de
origem inflamatória).
• As frações mais polares das folhas (DCM, AE, BuOH) e dos caules (AE)
apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus.
58
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, R.N. Modulacão da dor através do uso de plantas medicinais com atividade central. Arquivos Brasileiros de Fitomedicina Científica, [S.l.], v.1, maio, 2003. AMARAL, A.C.F.; KUSTER, R.M.; BESSA, W.S.; BARNES, R.A., KAPLAN, M.A.C. WESSJOHANN, L.A. Flavonoids and other phenolics from the leaves of two Marlierea species (Myrtaceae). Bioch. Syst. and Ecol. [S.l.], v.29, p.653-654, 2001. BHAKUNI, R.S.; SHUKLA, Y.N.; TRIPATHI, A.K.; PRAJAPATI, V.; KUMAR, S. Insect growth inhibitor activity of arjunolic acid isolated from Cornus capitataI. Phytother. Res. , [S.l.], v.16, supl.1, p.68-70, mar., 2002. BRESCIANI, L.F.V.; PRIEBE, J.P.; YUNES, R.A.; DAL MAGRO, J.; DELLE MONACHE, F.; DE CAMPOS, F., DE SOUZA, M.M., CECHINEL FILHO, V. Pharmacological and phytochemical evaluation of Adiantum cuneatum growing in Brazil. Z. Naturforsch., [S.l.] v.58c, p. 191 – 194, 2003. BUTLER, M.S. The role of natural products chemistry in drug discovery. J. Nat. Prod., [S.l.], v.67, p.2141 – 2153, 2004. BUTLER, M.S. Natural products to drugs: natural product derived compounds in clinical trials. Nat. Prod. Rep., [S.l.], v.22, p.162-195, 2005. CALIXTO, J.B. In Yunes, R.A.; Calixto, J.B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna.Chapecó: Argos, 2001. p. 297-315. CALZADA, F..; CEDILLO-RIVERA, R.; MATA, R. Antiprotozoal activity of the constituents of Conyza filaginoides. J. Nat. Prod. [S.l.], v.65, n.5, p.671 –673, 2001. CANIGUERAL, S. Fitoterapia. Una terapéutica para el tercer milenio? Rev. de Fitoterapia.Barcelona v.2, n.2, p.101-121, 2002. CARVALHO, MG.; VELANDIA, J.R.; OLIVEIRA, L.F.; BEZERRA, F.B. Triterpenos isolados de Eschweilera longipes Miers (Lecythidaceae). Quim. Nova [S.l.], v21, n.6, 1998. CECHINEL FILHO, V.; DALMAGRO, J. e YUNES, R. A. Importância dos estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais brasileiras. Grifos. Florianópolis. n.3, p. 63-70, 1996. CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R.A. Estratégias para obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Quim. Nova, São Paulo. v.21, p. 99 – 105, 1998. CECHINEL FILHO, V. Principais avanços e perspectivas na área de produtos naturais ativos: estudos desenvolvidos no Niqfar/ Univali. Quím. Nova. [S.l.], v.23, n.5, p.680 – 685, 2000. COLLIER, H.D.J.; DINNEN, L.C.; JOHNSON, C.A.; SCHNEIDER, C. The abdominal response and its suppression by analgesic drugs in the mouse. Br. J. Pharmacol. [S.l.] v.32, p. 295-299, 1968 DALL’AGNOL, R.;FERRAZ, A.; BERNARDI, A.P. ALBRING, D.; NOR, C.; SARMENTO, L. L. HASS, M.; VON POSER, G.; SCHAPOVAL, E.E. Antimicrobial activity of some Hypericum species. Phytomedicine, [S.l.], v.10, n.6-7, p.511-516, 2003. DIALLO, B.; VAHNHAELEN-FASTRE, R.; KONOSHIMA, T.; KOZUKA, H. Studies on inhibitors of skin-tumor promotion. Inhibitory effect of triterpenes from Cochlospermum tinctorium on Epstein- Barry activation. J. Nat. Prod., [S.l.], v.52, n.4, p.879-881. jul-ago., 1989. DOI, K.; KOJIMA, T.; MAKINO, M.; KIMURA, Y.; FUJIMOTO, Y. Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L. Chem. Pharm. Bull. [S.l], v.49, n.2, p.151 –153, 2001.
59
FERMIN, S.M..L.H.; GALVEZ, J.; ROMERO, J.A.; ZARNUELO, A.; Effect of quercitrin on acute and chronic experimental. J. Pharm.. Exp. Ther. [S.l.], v.278, p.771-779, 1996. FRANÇA, E.J.; NADAI FERNANDES, E.A.; BACCHI, M.A.; RODRIGUES, R.R.; VERBURG, T.G. Inorganic chemical composition of native trees of the Atlantic Forest. Environ. Monit. And Assessment, [S.l.], v.102, p.349 –357, 2005. HNATYSZYN, O.; MINO, J.; FERRARO, G.; ACEVEDO, C. The hypoglycemic effect of Phyllanthus sellowianus fractions streptozotocin induced diabetic mice. Phytomedicine, [S.l.], v.9, n.6, p.556-559. 2002. HUNSKAAR, S.; HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and non-inflammatory pain. Pain,[S.l.], v.30, p.103-114, 1987. JEONG, C. H.; SHIM, K. H. Tyrosinase inhibitor isolated from the leaves of Zanthoxylum piperitum. Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 68, n. 9, p. 1984-1987, 2004. JUNGES, M.J., FERNANDES, J.B.; VIEIRA, P.C., FERNANDES, M.F.G.S.; FILHO, E.R.; FRUHAUF, M.; BARANANO, A.G. Triterpenos ursânicos e oleânicos isolados do caule de Eugenia florida DC. Rev. Pesquisa e Pós-graduação. Erechim, v.1, p.13-20, 2000. JUNIOR, G.M.V.; SOUZA, C.M.L.; CHAVES, M.H. Resina de Protium heptaphyllum: isolamento, caracterização estrutural e avaliação dos propriedades térmicas. Quim. Nova, [S.l.], v.28, n.2, 2005. KIM, H.Y.; MOON, B.H.; LEE, H.J.; CHOI, D.H. Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulmoides glycation anhibitory activity. J. Ethnopharmacol., [S.l.], v.93, n. 2-3, p. 227-230, 2004. KINGHORN, A .D. The role of pharmacognosy in modern medicine. Expert. Opin.Pharmacother, [S.l.], v.3. n.2, p.77-79, 2002. KOEHN, F.E.; CARTER, G.T. The evolution role of natural products in drug discovery, Nature Reviews, [S.l.], v.4, p. 206-220, 2005. KRASTEVA, I.; NIKOLOVA, I.; DANCHEV, N.; NIKOLOV, S. Phytochemical analysis of ethyl acetate extract from Astragalus corniculatus Bieb. and brain antihypoxic activity. Acta Pharm., [S.l.], v.54, p.151-156, 2004. KROGH, R.; KROTH, R.; BERTI, C.; MADEIRA, A.O.; SOUZA, M.M.; CECHINEL-FILHO, V.; DELLE-MONACHE, F.; YUNES, R.A. Isolation and identification of compounds with antinociceptive action from Ipomoea pes-caprae (L.) R. Br. Pharmazie, [S.l], v.54, n.6, p.464 – 466, 1999. LEE, J.H.; KU, C.H.; BAEK, N.I.; KIM, S.H.; PARK, H.W., KIM, D.K. Phytochemical constituents from Diodia teres. Arch Pharm. Res., [S.l.], v. 27, n.1, p.40-43, jan. 2004. LIMA, E.; SOUSA FILHO, P.T.; BASTIDA, J.; SCHMEDA-HIRSCHMANN, G. Saponins from Cariniana rubra (Lecythidaceae). Bol. Soc. Chil. Quim., Concepción, v.47, n.4, 2002.
LIMBERGER, R.P.; APEL, M.A.; SOBRAL, M.E.; VÉRIN, P.; MENUT, C.; SCHAPOVAL, E.E.S.; HENRIQUES, A.T. Óleo volátil de Marlierea eugeniopsoides e Marlierea obscura (Myrtaceae) – Composição química e atividade antimicrobiana. In: Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 15, Águas de Lindóia. Anais... Águas de Lindóia-SP. p.158. 1998.
LIMBERGER, R.P.; SIMÕES-PIRES, C.; SOBRAL, M.; HENRIQUES, A.T. Essential oils of Marlierea species. J. Essen. Oil Res., [S.l.], set-out, 2004.
LIN, Y.L.; KUO, Y.H.; WANG, W.Y., CHEN, C.F.; Nonsteroidal constituents from Solanum incanum L. J. Chin. Chem. Soc., [S.l.], v.47, n.1, p. 247 – 251, 2000.
MAJINDA, R.R.T.; MOTSWALIDI, M., WAIGHT, R.D.; WATERMAN, P.G. Phenolic and antibacterial constituents of Vahlia capensis. Planta Med., [S.l.], v.63, p.268-270. 1997.
60
MARTÍNEZ-FLÓREZ, S.; GONZÁLEZ-GALLEGO, J.; CULEBRAS, J.M.; TUÑÓN, M.J. Los Flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutr. Hosp., [S.l.], v. 17, n.6, p.271-278, 2002. MARTINS, S. Remédios da Natureza. Anfarmag, [S.l.], n.44, p.34-37, 2003. MENDES, G.I.; SANTOS, A.R.S.; MALHEIROS, A.; CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. CALIXTO, J.B. Assessment mechanism involved in antinociception caused by sesquiterpene polygodial. J. Pharm. Exp. Ther. [S.l.], v. 292, p.164-172, 2000.
MEYRE-SILVA, C.; YUNES, R.A.; DELLE MONACHE, F.; SANTOS, A. R.S.; SCHMELING, L.O.; GADOTTI, V.M.; LIZ, F.; CECHINEL-FILHO, V. Phytochemical and pharmacological analysis of Bauhinia microstachya (Raddi) Macbr. (Leguminosae). Z. Naturforsch, [S.l.], v.56c, p.939-942, 2001. MEYRE SILVA, C. Análise fitoquímica e farmacológica de plantas medicinais selecionadas da flora catarinense: Aleurites moluccana, Bauhinia microstachya, e Marrubium vulgare. Tese de Doutorado, UFSC, Florianópolis-SC, 2003. MORAES, M.O.; BEZERRA, F.A.F.; LOTUFO, L.V.C.; PESSOA, C.; MORAES, M.E.A. Avaliação clínica da eficácia e segurança de fitoterápicos no Brasil. Arquivos Brasileiros de Fitomedicina Científica. São Paulo, v.1, p.30-38, maio, 2003. MUSCI, I.; GYULAI, Z.; BELADI, I.. Combined effects of flavonoids and acyclovir against herpes viruses in cell cultures. Acta Microb. Hung, [S.l.], v.39, p.137 – 147, 1992. NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M.; SNADER, K.M.; Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002. J. Nat. Prod. [S.l.], v. 66, p.1022 – 1037, 2003. NOVOA, B.E.; CÉSPEDES, A.C.; DE GARCIA, L.A.; OLARTE, C.J.E. Quercitrin, a flavonoid with hypotensive activity obtained from Croton glabellus. Rev. Colomb. Cienc. Quim. Farm., [S.l.], v.4, p.4-17, 1985. OLIVEIRA, A.B.; BRAGA, F.C. Produtos naturais bioativos de plantas brasileiras e sua contribuição para o desenvolvimento da química medicinal. Arquivos Brasileiros de Fitomedicina Científica, São Paulo, v.1, p.49-58, maio.2003. OLIVEIRA, F.A.; CHAVES, M.H.; ALMEIDA, F.R.; LIMA, R.C.Jr.; SILVA, R.M.; MAIA, J.L.; BRITO, G.A.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S. Protective effect of alpha- and beta-amyrin, a triterpene mixture from Protium heptaphyllum (Aubl.) March. trunk wood resin, against acetominophen-induced liver injury in mice. J. Ethnopharmacol., [S.l.], v.8, n.98 (1-2), p.703-708, 2005. OLIVEIRA, F.A.; VIEIRA-JUNIOR, G.M., CHAVES, M.H.; ALMEIDA, F.R.; SANTOS, R.A.; MARTINS, F.S.; SILVA, R.M.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S. Gastro protective effect of the mixture of alpha and beta-amyrin from Protium heptaphyllum: role of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. Planta Med., [S.l.], v.70, n.8, p.780-782, 2004. bOLIVEIRA, F.A.; LIMA-JUNIOR, R.C.; CORDEIRO, W.M.; VIEIRA-JUNIOR, G.M., CHAVES, M.H.; ALMEIDA, F.R.; SILVA, R.M.; SANTOS, R.A.; RAO, V.S. Pentacyclics triterpenoids, alpha,beta-amyrins, suppress the stratching behaviour in mouse model of pruritus. Pharmacol. Biochem. Behav., [S.l.], v.78, n.4, p.719-725, 2004. OP DE BECK, P.; CARTIER, G.; DAVID, B.; DIJOUX-FRANCA, M.G.; MARIOTTE, A.M. Antioxidant flavonoids and phenolic acids from leaves of Leea guineense G Don (Leeaceae). Phytother. Res., [S.l.], v.17, n.4, p.345 – 347, abril, 2003. OTUKI, M.F.; VIEIRA-LIMA, F.; MALHEIROS, A.; YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Topical antiinflammatory effects of the ether extract from Protium kleinii and alpha amyrin pentacyclic triterpene. Eur. J. Pharmacol., [S.l.], v.10, n.507 (1-3), p. 253-259, jan. 2005. bOTUKI, M.F.; FERREIRA, J.; LIMA, F.V.; MEYRE-SILVA, C.; MALHEIROS, A.; MULLER, L.A.; CANI, G.S.; SANTOS , A.R.S..; YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Antinociceptive properties of mixture of α-amyrin and
61
β-amyrin triterpenes. Evidence of participation of protein kinase C and protein kinase A pathways. J. Pharmacol. And Experim. Ther., [S.l.], v.313, p.310-318, 2005. PINHEIRO, R.M.; CALIXTO, J.B. Effect of the selective COX-2 inhibitors, celecoxib and rofecoxib in rat acute models of inflammation. Inflamm. Res., [S.l.], v.51, p.603, 2002. PRETTO, J.B.; CECHINEL FILHO, V.; NOLDIN, V.F.; SARTORI, M.R.K.; ISAIAS, D.E.B.; BELLA CRUZ, A. Antimicrobial activity of fractions and compounds from Calophyllum, brasiliense (Clusiaceae/ Guttiferae). Z. Naturforsch. [S.l.], v.59c, p. 657 –662, 2004. SALANTINO, A.; SALANTINO, M.L.F. Plantas medicinais e tóxicas. In: Reunião Anual de SBPC. Resumo do conteúdo do mini-curso, Florianópolis. 1996. RASKIN, I.; RIBNICKI, D.M.; KOMAMYTSKY, S.; ILIC, N.; POLEV, A.; BORISJUK, N. Plants and human health in the twenty-first century. Trends in Biotech., [S.l], v. 20, n.12, p. 522-531, dezembro, 2002. SILVA JÚNIOR, A. A.; VIZOTTO, V.J. Plantas Medicinais Aromáticas e Fitoprotetoras. Agrop. Catarinense. Florianópolis. v. 9, n. 1, p.5-8, 1996. SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3a ed. Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da Universidade UFRGS/ Editora da UFSC, 2001. SOUZA, M.M.; DE JESUS, R.A.P.; CECHINEL FILHO, V.; SCHLEMPER, V. Analgesic profile of hidroalcoholic extract obtained from Marrubium vulgare. Phytomedicine. [S.l.], v. 5, n.2, p. 111-115, 1998. SUMITRA, M.; MANIKANDAN, P.; KUMAR, D.A.; ARUTSELVAN, N.; BALAKRISHNA, K.; MANOHAR, B.M.; PUVANAKRISHNAN, R. Experimental myocardial necrosis in rats: role of arjunolic acid on platelet aggregation, coagulation and antioxidant status. Molec. Cell. Bioch., [S.l.], v.224, p.135-142, 2001. STEPP, J.R. The role of weeds as sources of pharmaceuticals. J. Ethnopharmacol.. [S.l.], v.92, p.163-166, 2004. TORRES-SANTOS, E.C.; LOPES, D.; OLIVEIRA, R.R.; CARAUTA, J.P.; FALCAO, C.A.; ROSSI-BERGMANN, B. Antileishmanial activity of isolated triterpenoids from Pourouma guianensis. Phytomedicine, [S.l.], v.11, n.2-3, p.114-120, fev., 2004. TREVISAN, M.T.S.; MACEDO, F.V.V.; MEENT, M.V.; VERPOORTE, R.; RHEE, K. Seleção de plantas com atividade anticolinasterase para tratamento da doença de Alzheimer. Quim. Nova. [S.l.], v.26, n.3. p.301-304. 2003. TRUEBA, G.P. Los flavonoides: antioxidantes o prooxidantes. Rev. Cubana Invest. Biomed. [S.l.], v.22, n.1, p.38 – 43, 2003. TULP, M.; BOHLIN, L. Functional versus chemical diversity: is biodiversity important for drug discovery? Trends Pharmacol. Scien.. [S.l.], v. 23, n. 5, p. 225-231, maio, 2002. TULP, M.; BOHLIN, L. Unconventional natural sources for future drug discovery. Drugs Discov. Today. [S.l.], v. 9, n. 10, p. 450-458, maio, 2004. VIEIRA, T.R.; BARBOSA, L.C.A.; MALTHA, C.R.A.; PAULA, V.F.; NASCIMENTO, E.A. Constituintes químicos de Melaleuca alternifolia (Myrtaceae). Quim. Nova, São Paulo, v.27, n.4, jul –ago, 2004. VILLASENOR, I.M.; CANLAS, A.P.; FAUSTINO, K.M.; PLANA, K.G. Evaluation of the bioactivity of triterpene mixture isolated from Carmona retusa (Vahl.) Masan leaves. J. Ethnopharmacol., [S.l.], v.92, n.1, p.53 –56, 2004. VITOR, R.F.; MOTA-FILIPE, H.; TEIXEIRA,G.; BORGES, C.; RODRIGUES, A.I., TEIXEIRA, P.A. Flavonoids of an extract of Pterospartum tridentatum showing endothelial protection against oxidative injury. J. Ethnopharmacol., [S.l], v.93, n.2-3, p.363-370, agosto, 2004.
62
UGAZ, O. L. Investigación Fitoquímica. 2ª ed. Lima: Pontificia Universidad Católica del Peru. Fondo Editorial. 1994, 300p. XI-ZING, Z.; OTSUKA, H.; IDE, T.; HIRATA, E.; TAKUSHI, A.; TAKEDA, Y. Three flavonol glycosides leaves of Myrsine seguini. Phytochemistry, v. 46, n. 5, p.943-946, 1997. YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e Fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Quim. Nova, [S.l.], v.24, n.1, p.147 – 152, 2001. ZACCHINO, S. In Yunes, R.A.; Calixto, J.B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna.Chapecó: Argos, 2001. p. 435-479. ZHANG, Z.; ELSOHLY, H.N.; KHAN, S.I.; BROEDEL, S.E.; RAULLI, R.E.; WALKER, L.A.Flavanone glycosides from Miconia trailii. J. Nat. Prod., [S.l.], v.66, n.1, p.39-41, jan., 2003.
