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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E INOVAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
MARIA ALICE MIRANDA BEZERRA MEDEIROS
ESTUDO FARMACOLÓGICO DE OXIMAS NOS SISTEMAS
CARDIOVASCULAR E RESPIRATÓRIO
PETROLINA
2016
Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros
ESTUDO FARMACOLÓGICO DE OXIMAS NOS SISTEMAS
CARDIOVASCULAR E RESPIRATÓRIO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Recursos Naturais do Semiárido da
Universidade Federal do Vale do São Francisco, para
obtenção do Título de MESTRE EM RECURSOS
NATURAIS DO SEMIÁRIDO. Área de Concentração:
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo
Ribeiro
PETROLINA
2016
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF.
Bibliotecário: Fabio Oliveira Lima - CRB-4/2092.
Medeiros, Maria Alice Miranda Bezerra.
M488e Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e respiratório/ Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros.-- Petrolina, 2016. XIX; 136f ; il. ; 29cm.
Dissertação (Mestrado em Recurso Naturais do Semi-Árido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina,
Petrolina-PE, 2016. Orientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro. 1. Oximas. 2. Relaxamento de músculo liso. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 615.3
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCOO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros
ESTUDO FARMACOLÓGICO DE OXIMAS NOS SISTEMAS
CARDIOVASCULAR E RESPIRATÓRIO
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em Recursos
Naturais do Semiárido, pela Universidade Federal
do Vale do São Francisco.
Aprovado em
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro
Orientador
___________________________________________
Prof. Dr. Fabrício Souza Silva
Examinador Interno
__________________________________________
Prof. Dr. Tiago Ferreira da Silva Araújo
Examinador Externo
DEDICATÓRIAS
Dedico este trabalho, primeiramente, a Deus, pelo dom da vida, por
me proporcionar tantas bençãos. A meus pais (Nilzinha e Naudo), pelo
apoio incondicional em todos os momentos, por acreditarem mais em mim
do que eu mesma. A meus irmãos, avós, tios, primos e namorado
(Alexandre) pelo incentivo. A todos os meus amigos, em especial Ayla,
Inaiara, Joana e Iza pelo apoio. Ao professor Luciano, por ter sido meu pai
científico durante esses dois anos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, ao professor Luciano, que foi quem abriu as portas da
UNIVASF para mim, serei eternamente grata pela oportunidade, ensinamentos, apoio,
paciência e compreensão durante esses dois anos.
A UNIVASF, por toda estrutura disponibilizada para realização deste estudo.
A Capes, pelo apoio financeiro.
A todos do laboratório de farmacologia experimental (LAFEX), por terem me
acolhido tão bem e pela ajuda tanto experimental quanto teórica durante esse período.
Especialmente a Ayla (que me ensinou todos os protocolos), por todo tempo dedicado
a me ajudar, experimentos compartilhados e apoio incondicional durante a escrita desta
dissertação.
A professora Cleônia Roberta, professor Arlan, Maíra e Vitória, pela síntese e
disponibilidade das oximas.
Aos colaboradores da UFBA, professora Darízy, pelo imenso apoio,
ensinamentos, disponibilização do laboratório para realização dos testes com
mesentérica. A Jamile, William e Rafael, que me ensinaram e ajudaram na realização
destes. Jamais esquecerei o que fizeram por mim.
Ao professor Raimundo Palheta, pela enorme contribuição neste trabalho, pois foi
o principal responsável pela realização dos experimentos in vivo, além da paciência,
disponibilidade, ensinamentos e ajuda no tratamento dos dados e na redação do texto.
A Jaknea, pelo apoio na realização das cirurgias. Serei eternamente grata por tudo que
fizeram para enriquecer esta pesquisa.
A Gabriela, pela disponibilidade dos animais.
Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Fabrício e Prof. Dr. Tiago, pelas
correções e sugestões que contribuíram para melhoria do trabalho.
Muitíssimo obrigada!!
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... 10
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... 13
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 14
RESUMO....................................................................................................................... 16
ABSTRACT ................................................................................................................... 17
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 19
2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 22
2.1 Sistema cardiovascular ........................................................................................... 22
2.2 Doenças cardiovasculares ...................................................................................... 24
2.3 Sistema respiratório ................................................................................................ 27
2.4 Doenças respiratórias ............................................................................................. 28
2.5 Contração e relaxamento de músculo liso............................................................... 30
2.6 Óxido nítrico ............................................................................................................ 32
2.7 Oximas ................................................................................................................... .34
3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 38
3.1 Geral........................................................................................................................ 38
3.2 Específicos .............................................................................................................. 38
4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 40
4.1 Material.................................................................................................................... 40
4.1.1 Material sintético .................................................................................................. 40
4.1.2 Animais ................................................................................................................. 41
4.1.3 Aspectos éticos .................................................................................................... 42
4.1.4 Substâncias e sais ............................................................................................... 43
4.1.5 Soluções nutritivas ............................................................................................... 44
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
4.1.6 Aparelhos ............................................................................................................. 44
4.2 Métodos ................................................................................................................... 45
4.2.1 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima
ativada e oxima substituída em aorta isoladada de rato ............................................... 45
4.2.1.1 Preparação de anéis de aorta isolada de rato ................................................... 45
4.2.2 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima
ativada e oxima substituída em mesentérica superior isoladada de rato ...................... 47
4.2.2.1 Preparação de anéis de mesentérica isolada de rato ....................................... 47
4.2.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a pressão arterial ...................... 48
4.2.4 Estudo da atividade relaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima
ativada e oxima substituída em traquéia isolada de cobaia .......................................... 50
4.2.4.1 Preparação dos anéis de traquéia isolada de cobaia ........................................ 50
4.3 Análise dos Dados .................................................................................................. 52
5 RESULTADOS ........................................................................................................... 54
5.1 Estudo do efeito da atividade vasorrelaxante das oximas em aorta isolada de rato.
...................................................................................................................................... 54
5.1.1 Escolha do solvente para preparo da solução-estoque ........................................ 54
5.1.2 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na
ausência de endotélio funcional .................................................................................... 55
5.1.3 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e
na ausência de endotélio funcional ............................................................................... 55
5.1.4 Efeito da oxima substituída sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na
ausência de endotélio funcional .................................................................................... 56
5.1.5 Efeito do Prenol acetilado sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na
ausência de endotélio funcional .................................................................................... 56
5.1.6 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de aorta isolada de rato na
presença e na ausência de endotélio funcional............................................................. 58
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
5.2 Estudo do efeito vasorelaxante das oximas em mesentérica superiror isolada de
rato ................................................................................................................................ 61
5.2.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato na
presença e na ausência de endotélio funcional............................................................. 61
5.2.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato
na presença e na ausência de endotélio funcional ........................................................ 61
5.2.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato
na presença e na ausência de endotélio funcional ........................................................ 61
5.2.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato na
presença e na ausência de endotélio funcional............................................................. 62
5.2.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de mesentérica isolada de rato
na presença e na ausência de endotélio funcional ........................................................ 63
5.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a PA ............................................. 65
5.4 Estudo do efeito relaxante das oximas em traquéia isolada de cobaia ................... 71
5.4.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na presença e na
ausência de epitélio funcional ....................................................................................... 71
5.4.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na
presença e na ausência de epitélio funcional ................................................................ 71
5.4.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na
presença e na ausência de epitélio funcional ................................................................ 72
5.4.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na presença
e na ausência de epitélio funcional ............................................................................... 72
5.4.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na
presença e na ausência de epitélio ............................................................................... 74
6 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 78
7 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 84
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 86
APÊNDICES…………………………………………………………………………….……..96
ANEXOS………………………………………………………………………………………134
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Reação se síntese do prenol acetilado a partir do prenol e anidrido acético . 40
Figura 2: Reação se síntese da aceto-oxima a partir do prenol acetilado e pentilnitrito
...................................................................................................................................... 41
Figura 3: Reação se síntese da oxima substituída a partir da aceto-oxima e piridina .. 41
Figura 4: Reação completa da síntese da aceto-oxima e oxima substituída a partir do
prenol ............................................................................................................................ 41
Figura 5: Fotos do Rattus norvegicus e Cavia porcellus .............................................. 42
Figura 6: Fotos da aorta de rato e anel de aorta em haste metálica ............................ 46
Figura 7: Fotos do anel de mesentérica superior de rato, amplificador e anéis no banho
de órgãos ...................................................................................................................... 48
Figura 8: Foto do animal com as cânulas na artéria carótida e veia jugular ................. 49
Figura 9: Foto da cânula na artéria carótida esquerda conectada aos transdutores de
pressão MLT 1050 e MLT 0380 .................................................................................... 49
Figura 10: Fotos da traquéia de cobaia e anéis de traquéia em hastes metálicas ....... 51
Figura 11: Valores de Emax dos veículos DMSO+H2O e DMSO em enéis de aorta, pré-
contraídos com 10-6 M de FEN, na presença e ausência de endotélio..........................54
Figura 12: Valores de Emax do prenol acetilado (Pa), aceto-oxima (AO), aceto-oxima
ativada (AO+) e oxima substituída (OS) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6
M de FEN, na presença e na ausência de endotélio......................................................57
Figura 13: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e oxima
substituída (OS) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença
e na ausência de endotélio.............................................................................................58
Figura 14: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,
prenol acetilado e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na
presença de endotélio....................................................................................................59
Figura 15: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,
prenol acetilado e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na
ausência de endotélio....................................................................................................59
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
Figura 16: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima e
veículo sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença de
endotélio.........................................................................................................................60
Figura 17: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima e
veículo sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na ausência de
endotélio.........................................................................................................................60
Figura 18: Efeito relaxante de aceto-oxima, aceto-oxima ativada, oxima substituída e
prenol acetilado sobre anéis de mesentérica superior, pré-contraídos com 10-6 M de
FEN, na presença e na ausência de endotélio..............................................................63
Figura 19: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,
prenol acetilado e veículo sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de
FEN, na presença de endotélio......................................................................................64
Figura 20: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,
prenol acetilado e veículo sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de
FEN, na ausência de endotélio.......................................................................................64
Figura 21: Efeito da aceto-oxima e do veículo, nas doses de 1 a 100 µg, sobre a
FC...................................................................................................................................66
Figura 22: Efeito da aceto-oxima e do veículo, nas doses de 1 a 100 µg, sobre a
PAS.................................................................................................................................66
Figura 23: Efeito da aceto-oxima e do veículo, nas doses de 1 a 100 µg, sobre a
PAD................................................................................................................................67
Figura 24: Efeito da aceto-oxima e do veículo, nas doses de 1 a 100 µg, sobre a
PAM................................................................................................................................67
Figura 25: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a FC, na presença de
atropina, L-NAME e sildenafil.........................................................................................68
Figura 26: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAS, na presença de
atropina, L-NAME e sildenafil.........................................................................................69
Figura 27: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAD, na presença de
atropina, L-NAME e sildenafil.........................................................................................69
Figura 28: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAM, na presença de
atropina, L-NAME e sildenafil.........................................................................................70
Figura 29: Duração do efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PA, na
presença de atropina, L-NAME e sildenafil....................................................................70
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
Figura 30: Valores de Emax de aceto-oxima, aceto-oxima ativada, oxima substituída e
prenol acetilado sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na
presença e na ausência de epitélio................................................................................73
Figura 31: Efeito relaxante de aceto-oxima, aceto-oxima ativada e prenol acetilado
sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença e na ausência
de epitélio ......................................................................................................................74
Figura 32: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,
prenol acetilado e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na
presença de epitélio........................................................................................................75
Figura 33: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,
prenol acetilado e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na
ausência de epitélio........................................................................................................75
Figura 34: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado e
veículo sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença de
epitélio............................................................................................................................76
Figura 35: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado e
veículo sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na ausência de
epitélio............................................................................................................................76
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respiratório
2016
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Substâncias, sais e seus fornecedores .......................................... 43
Tabela 2. Composição da solução de Krebs .................................................. 44
Tabela 3. Comparação entre os valores de Emax das oximas em aorta e
mesentérica .............................................................................................................. 65
Tabela 4. Comparação entre os valores de pD2 das oximas em aorta e
mesentérica .............................................................................................................. 65
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AA ácido araquidônico
ACh acetilcolina
AMPc 3’,5'-monofosfato cíclico de adenosina
AO aceto-oxima
AO+ aceto-oxima ativada por temperatura (37ºC)
ATP 5’-trifosfato de adenosina
Ca2+ íon cálcio
[Ca2+]i concentração de Ca2+ livre no citosol
CAM calmodulina
CaV canais para cálcio abertos por voltagem
CE50 concentração de uma substância capaz de produzir 50% de seu efeito
máximo possível
CO2 gás carbônico
DAG diacilglicerol
DPOC doença pulmonar obstrutiva crônica
DC débito cardíaco
DMSO dimetilsulfóxido
e.p.m. erro padrão da média
EDRF fator de relaxamento derivado do endotélio
Emax efeito máximo
FEN L(-) -fenilefrina
GMPc 3',5'-monofosfato cíclico de guanosina
GTP 5’-trifosfato de guanosina
Gq proteína Gq
HA hipertensão arterial
IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol
K+ íon potássio
MLC cadeia leve da miosina
MLCK cinase da cadeia leve da miosina
MLCP fosfatase da cadeia leve da miosina
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respiratório
2016
M concentração molar (mols/L)
mM milimolar (10-3 mol/L)
n número de experimentos realizados (tamanho amostral)
nM nanomolar (10-9 mol/L)
NO óxido nítrico
O2 oxigênio
OS oxima substituída
p probabilidade
PA pressão arterial
Pa prenol acetilado
PKA proteína cinase dependente de AMPc
PKG proteína cinase dependente de GMPc
PKC proteína cinase C
PGI2 prostacicilina
PLC fosfolipase C
RyR Receptor de rianodina
RPT resistência periférica total
RS retículo sarcoplasmático
VSM músculo liso vascular
VES volume de ejeção sistólico
vs versus
M micromolar (10-6 mol/L)
OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta
relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
RESUMO
Palavras-chave: Oxima, pressão arterial, vasodilatação dependente de NO.
As doenças cardiovasculares e respiratórias afetam grande parte da
população mundial. Problemas na produção ou liberação de óxido nítrico (NO) estão
envolvidos em diversos processos destas enfermidades. O presente estudo teve
como objetivo avaliar o efeito relaxante, in vitro, de oximas inéditas em aorta,
mesentérica e traquéia, e o efeito do composto com maior atividade (in vitro) sobre a
pressão arterial, in vivo. Nos experimentos in vitro, os animais foram eutanasiados,
os órgãos foram retirados, após remoção de todos os tecidos conectivos, foram
divididos em anéis, que foram suspensos individualmente por hastes de aço
inoxidável, estas foram presas através de fios de algodão a transdutores de força, e
submersas em cubas contendo solução de Krebs, a 37 ºC, sob aeração de mistura
carbogênica em um sistema de banho para órgão isolado, acoplado a um
amplificador de força e conectado a um computador para monitoramento das
contrações. Já nos experimentos in vivo, os animais foram anestesiados, foram
colocadas cânulas na veia jugular e na artéria carótida, esta foi conectada aos
transdutores de pressão, acoplados a um sistema de aquisição de sinais biológicos.
Com isso a pressão arterial (mmHg) foi registrada, e a frequência cardíaca (FC)
(bpm) foi determinada a partir do registro contínuo da pressão arterial sistólica
(PAS). De acordo com os resultados obtidos, a broncodilatação ocasionada pelas
oximas não foi tão intensa quanto à vasodilatação. Deste modo, pode-se observar
que Aceto-Oxima (AO) foi eficaz e mais potente em aorta e mesentérica,
promovendo vasodilatação independente de endotélio, in vitro. AO também reduziu
FC e pressão arterial, in vivo. Seu efeito hipotensor não foi atenuado pela atropina
nem pelo L-NAME, não estando relacionado à ativação dos receptores muscarínicos
e de maneira independente da NOS, respectivamente. Entretanto, a duração da
hipotensão foi aumentada com o sildenafil e consequentemente, seu mecanismo de
ação provavelmente está relacionado à via do NO-GMPc, podendo ser um doador
de NO.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
ABSTRACT
Keywords: Oxime, arterial pressure, NO-dependent vasodilation.
Cardiovascular and respiratory diseases affect much of the world's population.
Problems in the production or release of nitric oxide (NO) are involved in several
cases of these diseases. This study aimed to evaluate the relaxing effect of novel
oximes in aorta, mesenteric and trachea in vitro, and the effect of the compound with
better activity (in vitro) on arterial pressure in vivo. In the in vitro experiments, the
animals were euthanized, the organs were removed, after removal of all connective
tissues were divided into rings which were individually suspended by stainless steel
rods, these are attached through cotton threads to force transducers and submerged
in vats containing Krebs solution at 37 °C under carbogenic mixture aeration in an
isolated bath organ system coupled to a power amplifier and connected to a
computer for monitoring the contractions. For the in vivo experiments, the animals
were anesthetized, a cannulae was placed in the jugular vein and carotid artery and it
was connected to pressure transducers coupled to a biological signal acquisition
system. Hence, arterial pressure (mmHg) was recorded, and heart rate (HR) (bpm)
was determined from the continuous record of systolic arterial pressure (SAP).
According to the results, bronchodilation caused by oximes was not so intense as
vasodilatation. Thus, it can be noted that AO was effective and more potent in aorta
and mesenteric promoting vasodilation independent from endothelium in vitro. It also
reduced HR and arterial pressure in vivo. Its hypotensive effect was not attenuated
by atropine nor by L-NAME, not being related to activation of muscarinic receptors
and not dependent on the NOS, respectively. However, the duration of hypotension
was increased with sildenafil, consequently, its mechanism of action is related to the
NO-cGMP pathway, being a NO donor.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
20
INTRODUÇÃO
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
19
1 INTRODUÇÃO
Os sistemas cardiovascular e respiratório são utilizados como modelos
experimentais de ensaios farmacológicos pré-clínicos para descoberta de novos
fármacos. Alterações na homeostasia destes estão relacionadas ao surgimento de
doenças com grande impacto socioeconômico, como hipertensão arterial (HA),
insuficiência cardíaca congestiva (ICC), aterosclerose, asma e doença pulmonar
obstrutiva crônica (DPOC) (HERNANDEZ et. al., 2014; MENEZES et. al., 2013;
MIRAVITLLES et. al., 2016; VOELTER-MAHLKNECHT, 2016).
Em relação às doenças cardiovasculares, estas são as principais causas de
morbidade e mortalidade no mundo. Além disso, muitas delas prejudicam a
capacidade de levar uma vida normal, resultando em enormes custos de saúde para
a sociedade e prejuízos individuais para o cidadão. Tais patologias são mais
prevalentes que a incidência conjugada de todas as formas de câncer, diabetes e
asma. Vale ressaltar que não há uma única causa para essas doenças, mas vários
fatores de risco, que alargam a possibilidade de sua ocorrência (SILVA, 2014). Nos
últimos anos sucedeu um aumento da incidência de aterosclerose e HA (DAS,
2009).
A HA possui influência multifatorial (genética, fisiologia e características
ambientais). Ultimamente acredita-se que problemas relacionados a produção ou
liberação de óxido nítrico (NO) são primordiais para o desenvolvimento e
manutenção dela (MENDES-JÚNIOR et. al., 2015). HA é considerada a causa
primária para o surgimento de várias patologias associadas ao sistema
cardiovascular. Ela também é responsável por aproximadamente 12,8% de todas as
mortes anuais (WICHA et. al., 2015).
Já sobre as doenças que acometem o sistema respiratório, grande parcela do
adoecimento e morte em adultos e adolescentes tem como causa tais patologias.
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), elas representam 8% do total de
mortes em países desenvolvidos e 5% dos países em desenvolvimento. A asma, por
exemplo, acomete aproximadamente 20% dos brasileiros (MENEZES et. al., 2013).
De acordo com a OMS, tal enfermidade afeta 7 milhões de pessoas (menores de 18
anos), nos Estados Unidos. Esta é caracterizada pela inflamação das vias aéreas
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
20
causando obstrução e limitação do fluxo aéreo (MEIRELES et. al., 2013). O NO está
envolvido em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos do trato respiratório,
pois o subtipo neuronal da sintase do óxido nítrico (nNOS) está presente nos
capilares alveolares, assim ele é produzido e induz broncodilatação (SILVA, 2014).
O NO é um gás lipossolúvel, sintetizado a partir da L-arginina pela família de
sintases do óxido nítrico (NOS). Esse gás é sintetizado abundantemente no
endotélio vascular, sistema nervoso central e periférico (SILVA, 2014). Além de ser o
principal fator relaxante derivado do endotélio (EDRF), possui participação na
manutenção e regulação da pressão arterial (PA). Em músculo liso vascular, ele
promove vasorrelaxamento via NO-GC-PKG, além de poder ativar diretamente
proteínas e canais iônicos. Nitroglicerina e nitroprussiato de sódio são exemplos de
doadores de NO bastante aplicados em doenças cardiovasculares, como angina do
peito, hipertensão pulmonar e isquemia cardíaca. Entretanto, seu uso a longo prazo
pode levar ao desenvolvimento de tolerância, o que prejudica o tratamento da HA
(MENDES-JÚNIOR et. al., 2015).
Portanto, é de extrema importância a síntese de novos doadores de NO.
Algumas oximas já são consideradas novas doadoras de NO em sistemas biológicos
como vasos sanguíneos e regiões de inflamação, sendo comprovada a sua ação
como relaxante de músculo liso e antiinflamatória (ABDEL-AZIZ et al., 2013). O
termo oxima resulta da união entre as palavras oxigênio e imina, descoberta em
meados do século XIX. Elas são compostos orgânicos cuja formula geral é
RR’C=NOH, onde o R é um substituinte orgânico e o R’ pode ser um hidrogênio ou
um outro grupo orgânico (PERES, 2009). Estudos comprovaram que algumas
oximas possuem ação relaxante em artéria mesentérica superior isolada de ratos,
com ação relacionada à via do NO e canais para K+ (VERAS et. al., 2013).
Por conseguinte, o músculo liso é uma ferramenta bastante útil para a
investigação de atividades biológicas de substâncias sintéticas, uma triagem
farmacológica pode ser realizada para determinar se as substâncias sintéticas
apresentam algum efeito relaxante em músculos lisos previamente estimulados com
agentes contracturantes, onde vasoconstrição simula à HA e broncoconstrição à
asma. Dessa forma, esse músculo é indispensável na descoberta de novos
fármacos úteis para o tratamento destas enfermidades (SILVA, 2014).
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REVISÃO DA
LITERATURA
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Sistema Cardiovascular
O sistema cardiovascular tem como função primordial, a distribuição do sangue
para os tecidos, fornecendo oxigênio (O2) e nutrientes essenciais para o
metabolismo das células, hormônios e outros sinais químicos, além de eliminar os
resíduos celulares. Todas as células do corpo humano necessitam de oxigênio para
viver. Nesse contexto, o conjunto formado pelo coração e vasos sanguíneos, é
responsável por distribuir o sangue rico em oxigênio por todo o corpo (COSTANZO,
2014). O gradiente de pressão (P) que existe entre o coração e os vasos
sanguíneos é a força motriz que permite o sangue fluir. Sendo o coração, o sistema
de propulsão, que por meio de contração, impulsiona o sangue pelo sistema
vascular, os quais podem ser veias ou artérias. Entre os vasos do sistema vascular,
as artérias são as mais calibrosas e transportam o sangue oxigenado para ser
distribuído por todos os tecidos do corpo. No decorrer do percurso, os vasos vão se
ramificando com diâmetro cada vez menor, até os capilares. Quanto menor o calibre
dos vasos, maior a resistência e consequentemente, menor a pressão sanguínea
(COSTANZO, 2014; SILVERTHORN, 2010).
O sangue que sai dos capilares contém baixa quantidade de oxigênio e alto
teor de gás carbônico. Ao passar pelos capilares, o sangue segue pelas veias e é
levado ao coração e em seguida aos pulmões, chegando aos capilares pulmonares,
onde o sangue volta a receber oxigênio e a ter o gás carbônico removido (SANTOS,
2013).
Os vasos sanguíneos podem ser divididos anatomicamente em três camadas,
adventícia, média e íntima. A mais externa, camada adventícia, é composta de
tecido conjuntivo denso, e componentes celulares como fibroblastos e macrófagos.
A camada média é a mais espessa e é composta principalmente de tecido muscular,
além de elastina e colágeno. A camada íntima, que fica em contato direto com o
fluxo sanguíneo, é constituída por uma única camada de células, o endotélio
(RODRIGUES, 2010).
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O endotélio apresenta funções importantes na regulação de diferentes eventos
fisiológicos, desde a regulação da permeabilidade vascular, coagulação, reações
inflamatórias, imunológicas e crescimento celular. Alterações de uma ou mais
dessas ações, podem causar disfunção endotelial vascular. As células endoteliais
sintetizam e liberam substâncias vasorelaxantes, em resposta a diferentes estímulos
mecânicos e químicos, que regulam o tônus vascular. Estas substâncias
vasorelaxantes incluem fatores relaxantes derivados do endotélio, como por
exemplo, a prostaglandina E2 (PGE2), e o NO. O endotélio também produz fatores
vasoconstritores, como endotelina e tromboxano, sendo estes fatores fundamentais
para o controle da pressão arterial média (PAM) e consequentemente, para a
homeostasia (WON et. al., 2014; RAMESHRAD et al., 2016).
A aorta, artéria de maior calibre do corpo humano, desempenha várias funções
sobre o sistema cardiovascular. Entre elas, a transmissão e distribuição do sangue
do coração para vasos de menor calibre que abastecem a periferia, além da função
de reservatório expansível, absorvendo o fluxo arterial da contração ventricular
esquerda na sístole, liberando em seguida o sangue durante a diástole (WHITLOCK;
HUNDLEY, 2015).
O controle do sistema cardiovascular se dá, em parte, pelo sistema nervoso
autônomo (SNA). A influência do SNA sobre o coração é dependente de
informações que partem, dentre outras, dos baroceptores, quimioceptores,
receptores atriais, receptores ventriculares, modificações do sistema respiratório,
sistema vasomotor, sistema renina-angiotensina-aldosterona e sistema
termorregulador. A partir do controle neural, as respostas das vias simpáticas e
parassimpáticas são estabelecidas, modulando assim a frequência cardíaca (FC)
(VANDERLEI et al., 2009).
A pressão arterial (PA) é a força que o fluxo sanguíneo exerce sobre as
paredes dos vasos sanguíneos. Para a manutenção da PA dentro do limite
normalmente aceito de 120/80 mmHg (pressão sistólica e diastólica,
respectivamente), são necessários ajustes na FC e no débito cardíaco (DC), além de
constantes reajustes do tônus vascular. O principal mecanismo autonômico
diretamente envolvido nesta resposta é o barorreflexo arterial. Dessa forma, o
aumento da variabilidade da PA relaciona-se com uma perturbação deste
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mecanismo reflexo de controle (OHNO; KANNO; TAKENAKA, 2016; WON et al.,
2014).
Uma maneira de se entender o controle da PA é através da equação “PA = DC
x RVP”, o qual: “PA” representa a pressão arterial média, “DC” é o volume de
sangue bombeado pelo coração em um dado intervalo de tempo, e “RVP” que é a
resistência dos vasos à passagem do sangue em seu interior. Sendo que o “DC”
depende da FC e do volume de sangue ejetado durante cada sístole (VES).
Portanto, a equação também pode ser: “PA = FC x VES x RVP”, onde o crescimento
de qualquer valor leva a um aumento na PA. Deste modo, um aumento anormal da
homeostase nos níveis da FC e/ou do VES e/ou da RVP de um indivíduo é capaz de
gerar um aumento patológico da PA, e culminar no desenvolvimento da hipertensão
arterial sistêmica (HAS) (LATERZA et. al., 2008; SILVA, 2014).
2.2 Doenças Cardiovasculares
As doenças cardiovasculares possuem grande impacto na saúde humana, uma
vez que são as principais responsáveis pelos óbitos em países desenvolvidos e em
desenvolvimento (SU et. al., 2014). Essas patologias podem acometer o coração,
culminando em insuficiência cardíaca congestiva, miocardiopatia ou doença
isquêmica do coração, mas também podem atuar nos vasos sanguíneos, levando ao
surgimento de doença arterial coronariana, aterosclerose e hipertensão (SILVA,
2014).
O crescimento contínuo da incidência de tais doenças ocorre devido à dieta e
estilo de vida inadequados, culminando no aparecimento de diabetes e obesidade.
Grande parte da população utiliza medicamento de forma contínua para algum
problema cardíaco (hipertensão, aterosclerose, diabetes, etc). Embora o uso deles
seja necessário, esse consumo diário pode levar a dependência do paciente ao
fármaco. Além disso, muitas vezes, o medicamento é utilizado para suprir o estilo de
vida inadequado, o que ocorre com vários pacientes apesar da gravidade da
patologia (DAS, 2009).
Outro fato importante é que os fatores de risco para essas doenças podem surgir
devido a distúrbios metabólicos, por conta da grande quantidade de obesos. Sendo
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que nos últimos anos ocorreu um aumento da incidência de aterosclerose e
hipertensão (DAS, 2009).
A HA é o termo aplicado para adultos com pressão sanguínea sistólica superior a
140 mmHg e/ou pressão sanguínea diastólica superior a 90 mmHg (PATEL et. al.,
2015). Ela é crônica, silenciosa, de evolução cadenciada e procedência multifatorial.
Nos Estados Unidos seu índice permaneceu constante nos últimos dez anos (cerca
de 30%). Enquanto que no Brasil variou de 25,2 a 40,1%, e esse número foi
ampliado espantosamente entre os indivíduos acima de 60 anos. A média da
prevalência de HA nas capitais do Brasil em adultos acima de 18 anos, em 2012, foi
de 24,3%, de acordo com os últimos dados do IDB (Indicadores e Dados Básicos)
Brasil, cujos números foram referentes aos casos com diagnóstico médico prévio.
Pacientes entre 40 e 69 anos, que apresentam PA acima de 115x75 mmHg,
possuem risco de mortalidade por complicações cardiovasculares maior do que o
dobro a cada 20 mmHg de aumento na pressão sistólica ou 10 mmHg na diastólica.
Um desafio da saúde pública é o diagnóstico precoce da HA em um maior número
de pessoas (FERRAZZO et. al., 2014). Diante do exposto, a HA é considerada a
causa primária para o surgimento de várias patologias associadas ao sistema
cardiovascular. Além de ser estimada como a causadora de aproximadamente
12,8% de todas as mortes anuais. Por conseguinte, uma maneira de reduzir a
incidência de doenças cardiovasculares é controlar a HA, assim como promover a
melhoria da saúde. Vale ressaltar que o relaxamento e a contração da musculatura
vascular são fatores importantes na regulação da PA (WICHA et. al., 2015).
Em relação ao tratamento da HA, existem dois tipos, o não farmacológico e o
farmacológico. O primeiro é composto por uma alimentação saudável (frutas,
verduras, legumes, peixes, e outros alimentos com pouca gordura), restrição de
sódio, prática de atividade física, redução de peso, não ingestão de bebidas
alcoólicas e não utilização de cigarro. Já o tratamento farmacológico pode ser
realizado com medicamentos pertencentes a sete classes diferentes, classificadas
de acordo com seus locais ou mecanismos de ação. São elas: diuréticos, agentes
simpaticolíticos, bloqueadores de canais de Ca2+, inibidores da enzima conversora
da angiotensina (ECA), antagonistas do receptor de Angiotensina II (Ang II),
inibidores diretos da renina e vasodilatadores (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2012).
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Os diuréticos atuam aumentando a eliminação de sódio e água na urina,
consequentemente ocorre aumento do volume urinário. Essa classe é subdividida
em inibidores da anidrase carbônica (acetazolamida), osmóticos (manitol), de alça
(furosemida), tiazídicos (hidroclorotiazida), inibidores do canal para Na+ (amilorida),
antagonistas da aldosterona (espironolactona), inibidores de canais catiônicos
(nesiritide) e antagonistas do hormônio antidiurético (ADH) (conivapana)
(BRUNTON; LAZO; PARKER, 2012; LONGO; MARTELLI; ZIMMERMANN, 2011).
A segunda classe é composta pelos agentes simpaticolíticos, que dependendo
do tipo pode atuar no DC ou na RVP, eles são subdivididos em: agentes de ação
central (metildopa) (KINTIRAKI et. al., 2015), bloqueadores dos neurônios
adrenérgicos (reserpina) (SHAMON; PEREZ, 2009), antagonistas β-adrenérgicos
(propranolol, labetalol) (HOTTINGER et. al., 2014), antagonistas α-adrenérgicos
(doxazosina) (VAN DER ZEE; BOER, 2014) e antagonistas adrenérgicos mistos
(carvedilol) (HOTTINGER et. al., 2014).
Já os bloqueadores dos canais para cálcio (nifedipino e verapamil) promovem
vasodilatação, cronotropismo e inotropismo negativos. Enquanto que os inibidores
da ECA (captopril) e antagonistas do receptor da Ang II (losartana) possuem o
mesmo efeito, vasodilatação e redução da volemia (LONGO; MARTELLI;
ZIMMERMANN, 2011).
E finalmente, os vasodilatadores que causam uma redução da resistência
vascular, são subclassificados em arteriais (hidralazina) ou arteriais e venosos
(nitroprussiato de sódio). O nitroprussiato foi descoberto em 1849 e seu primeiro
relato de uso na clínica ocorreu em 1922, então foi estabelecida sua segurança e
eficácia hipotensiva, com administração intravenosa. O mesmo já foi utilizado como
hipotensor antes de cirurgias, para reduzir a perda de sangue durante o processo
cirúrgico, além de diminuir a pós-carga na ICC. Ele promove vasodilatação por ser
um doador de NO, este gás em músculo liso vascular, interage com a subunidade β1
da GC, que após ser ativada levará a formação de GMPc, que ativa PKG, e esta
quinase atua em alguns alvos promovendo a redução da concentração de cálcio
intracelular ([Ca2+]i) nas células musculares lisas da vasculatura, provocando
redução da RPT, ajudando na regulação dos níveis pressóricos. Estudos
demosntram que o NO, liberado por esse fármaco, também inibe a agregação
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plaquetária in vitro e in vivo. Entretanto, o nitroprussiato é um complexo que contém
cianeto, este pode ser liberado e induzir citotoxicidade. Mas até hoje é aplicado em
emergências hipertensivas, uma vez que possui ação rápida e provoca uma
vasodilatação generalizada, por isso só pode ser utilizado em ambiente hospitalar
(HOTTINGER et. al., 2014; KANDLER et. al., 2011; LIMA et. al., 2014).
Um dos primeiros doadores de NO descritos foi a nitroglicerina, obtida por
Ascanio Sobrero em 1847. A mesma é uma molécula orgânica, éster de nitrato de
glicerol. Apesar da sua potente vasodilatação e hipotensão, provoca efeitos
colaterais como cefaléia e tolerância, o qual limita seu uso (LIMA et. al., 2014).
Entretanto, este fármaco promove vários benefícios ao sistema cardiovascular, tais
como redução da resistência coronariana, aumento da capacitância venosa, redução
da pré-carga, pode ser usada profilaticamente para impedir isquemia induzida pelo
exercício, e gera hipotensão (BODEN et. al., 2012).
Além farmacoterapia, mudança no estilo de vida acompanhada de dieta saudável
são medidas que podem ser aplicadas preventivamente, isso contribui para o
crescimento da expectativa de vida e redução da mortalidade, além de evitar ou
adiar a necessidade do tratamento farmacológico. Vale ressaltar que o tratamento
não medicamentoso deve ser adotado, e pode contribuir no retardo do aparecimento
da HAS, bem como na redução da PA e possíveis danos associados à doença.
Quando o tratamento não farmacológico não é suficiente para normalizar os índices
pressóricos, inicia-se o uso de medicamentos. Estes levam a redução da PA e,
consequentemente, previnem ou minimizam as complicações cardiovasculares. Para
uma melhor adesão do paciente, o tratamento deve ser simplificado e eficaz
(FERRAZZO et. al., 2014).
2.3 Sistema Respiratório
O sistema respiratório é dividido, anatomicamente, em superior (nariz, faringe
e laringe) e inferior (traquéia, brônquios, bronquíolos, ducto alveolar e alvéolos).
Esse sistema pode também ser separado em duas zonas, a zona condutora (nariz
para bronquíolos) que forma um caminho para a condução dos gases inalados e a
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zona respiratória (ducto alveolar para alvéolos), onde a troca de gases ocorre
(PATWA; SHAH, 2015).
A traquéia é um importante órgão do sistema respiratório. Apresenta formato
tubular, possui comprimento de aproximadamente 11 a 13 cm em indivíduos adultos
e é responsável por transportar gases e secreções brônquicas. A partir da traquéia,
a via aérea respiratória se divide em duas menores, e essa divisão ocorre
sucessivamente até a 23ª geração de ramificação. Essas ramificações formam um
sistema complexo de transporte de gases, conhecido como árvore traqueobrônquica
(PATWA; SHAH, 2015; HEDENSTIERNA; EDMARK, 2015).
Os pulmões se comportam como “balões infláveis”, que se distendem
ativamente por pressão positiva (dentro) e/ou pressão negativa criada no espaço
pleural. Normalmente, a pressão pleural negativa (Ppl) é suficiente para distender os
pulmões durante a fase inspiratória. Essa pressão pode ser chamada de pressão
transpulmonar (Ptp), que é expressa pela equação “Ptp=Paw–Ppl”, onde Ptp =
pressão transpulmonar, Paw = pressão alveolar e Ppl = pressão pleural (ANAESTH;
PATWA; SHAH, 2015). O movimento de gás inspirado e expirado é chamado de
ventilação. O pulmão realiza a ventilação como processo de entrada e saída de ar, e
esse processo é necessário para que as trocas gasosas e a captação de oxigênio
aconteçam (BANJAI et. al., 2009).
2.4 Doenças Respiratórias
As doenças do sistema respiratório podem acometer o pulmão, cavidade
pleural, brônquios, traquéia, vias aéreas superiores, nervos e músculos da
respiração. O músculo liso é um dos alvos para o desenvolvimento dessas
patologias. A hipertensão arterial pulmonar, enfisema pulmonar, doença pulmonar
obstrutiva crônica (DPOC) e asma são alguns exemplos dessas enfermidades.
Dentre estas, a asma e a DPOC (compreendendo bronquite crônica e enfisema) são
as doenças crônicas mais comuns em todo o mundo, e há indícios de que a
prevalência delas deve aumentar nos próximos anos (BRASIL, 2010; SILVA, 2014).
Essas doenças representam um proeminente motivo de adoecimento e morte
em adultos e adolescentes. Segundo a OMS, elas são responsáveis por
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aproximadamente 8% do total de óbitos em países desenvolvidos e 5% em países
em desenvolvimento (MENEZES et. al., 2013). Dentre as doenças crônicas não
transmissíveis, no Brasil, as patologias respiratórias crônicas representam 5% dos
óbitos, e 11,2% das causas de incapacidade (SANTOS et. al., 2015).
A asma faz parte desta estatística, uma vez que é caracterizada pela
inflamação das vias aéreas causando obstrução e limitação do fluxo aéreo
(MEIRELES et. al., 2013) merece destaque por sua prevalência média de 20% no
Brasil, esse índice é um dos maiores do mundo (MENEZES et. al., 2013). Portanto,
este é um problema de saúde pública no mundo que reduz a produtividade dos
pacientes e sua participação na sociedade. Milhões de indivíduos são portadores da
patologia, o que resulta anualmente em dois milhões de atendimentos emergenciais,
quinhentas mil internações hospitalares e cinco mil óbitos. Estudo realizado pelo
Ministério da Saúde em várias cidades do Brasil, aponta que 13,3% das crianças de
6 a 7 anos e de 13 a 14 anos são asmáticas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010;
MEIRELES et. al., 2013).
A depender da gravidade dos sintomas a asma pode ser classificada como
leve, moderada ou grave. De acordo com sua evolução, ela pode ser classificada
como intermitente ou persistente. Primeiramente se faz necessário um diagnóstico
correto, em seguida um tratamento adequado. A classificação da doença é essencial
para que o paciente possua uma terapia adequada (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2010). A asma não pode ser curada, mas os tratamentos modernos permitem o
controle eficiente dela. Os tratamentos são relacionados à prevenção e aos sintomas
das crises, para minimizar os sinais e evitar novas exacerbações agudas
(MEIRELES et. al., 2013).
O tratamento da asma pode ser realizado com fármacos que atuam no
relaxamento da musculatura das vias respiratórias (broncodilatadores) ou na
redução da inflamação (anti-inflamatórios). Novos medicamentos (modificadores dos
leucotrienos) e associação de medicamentos (corticóides inalatórios combinados
com agonistas β-adrenérgicos). Entretanto, alguns desses fármacos podem
acarretar efeitos indesejados, interações medicamentosas ou ser ineficiente para o
tratamento. Por conseguinte, é bastante importante que o paciente siga o tratamento
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medicamentoso corretamente para evitar o aparecimento de novas crises
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010; MEIRELES et. al., 2013).
Atualmente, conhece-se que a obstrução parcial das vias aéreas ocorre devido
à contração do músculo liso. Essa contração ocorre por um estímulo não especifico,
como atividade física, mudanças bruscas na temperatura ambiental, exposição à
alérgenos, que instigam a liberação de acetilcolina, histamina e prostanóides, além
de outros mediadores endógenos que ativam seus respectivos receptores
farmacológicos, dando origem a eventos de sinalização intracelular que culminam
com a contração da musculatura (SILVA, 2014).
2.5 Contração e relaxamento de músculo liso
A musculatura lisa corresponde a apenas 5% da massa muscular total do
organismo humano (AGUIAR, 2009). Entretanto, mesmo com essa pequena
porcentagem, estas células são responsáveis pelo controle e regulação do
funcionamento da maioria dos órgãos do corpo, apresentando-se como uma
ferramenta importantíssima para investigação de atividades farmacológicas de
substâncias. A contração da musculatura lisa é essencial para a manutenção da
pressão sanguínea, controle da respiração e do peristaltismo intestinal, além do que
vários problemas de saúde como HA, coronariopatia, asma, DPOC, cólicas uterinas
e intestinais estão relacionadas a uma regulação anormal da contratilidade dessa
musculatura (SANTOS et. al., 2013).
A ocorrência da contração da musculatura lisa se deve ao aumento da
concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i), através da liberação dos estoques
intracelulares ou pela entrada através dos canais para Ca2+ presentes na membrana
plasmática, esse aumento da [Ca2+]i faz com que este íon, no meio intracelular, se
ligue a calmodulina (CAM) e constitua o complexo 4Ca2+-CAM, este ativa a quinase
da cadeia leve da miosina (MLCK), que fosforila a MLC, e promove o deslizamento
das fibras de actina sobre as de miosina, que culmina na contração da musculatura
lisa (SILVA, 2014).
Os receptores α1 adrenérgicos são responsáveis pela regulação da PA por
estimulação da contração do músculo liso vascular, e pertencem a superfamília de
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receptores metabotrópicos ou acoplados a proteína G (GPCR). A proteína G
acoplada ao receptor citado é a Gq/11, que após ativada a subunidade α-GTP
estimula a fosfolipase C (PLC), que hidroliza o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2)
nos segundos mensageiros, 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). O
IP3 se dissocia da membrana e se liga ao receptor do IP3 (IP3R), localizado no
reticulo sarcoplasmático (RS), com isso ocorre liberação de Ca2+ para o citoplasma
(WEGENER et al, 2013), o DAG ativa a proteína cinase C (PKC), que fosforila Cav
(REIS et. al., 2008), ocorrendo influxo de Ca2+. Esse aumento da [Ca2+]i culmina no
processo de vasoconstricção (WEGENER et al, 2013).
É importante ressaltar que a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares
colabora para o inicio do desenvolvimento da contração, mas sua manutenção
depende diretamente do influxo sustentado de Ca2+ através de canais na membrana
plasmática (SILVA, 2014).
Os canais iônicos sensíveis a voltagem transduzem os sinais através da
mudança no potencial de membrana (despolarização e hiperpolarização). Tais sinais
elétricos culminam em oscilações da [Ca2+]i, controlando várias funções fisiológicas,
como secreção de hormônios, sensações somáticas e a contração muscular. Os
canais para potássio, cálcio e sódio sensíveis a voltagem (Kv, Cav e Nav,
respectivamente), canais abertos por nucleotídeos cíclicos (CNG), canais receptores
de potencial transiente (TRP), canais de potencial transiente (TPC), canais ativados
por hiperpolarização e nucleotídeos cíclicos (HCN), canais para potássio
retificadores de entrada (Kir) e os canais para potássio de dois poros (K2P) são os
responsáveis por parte desse evento (SANTOS et. al., 2013).
A inibição do espasmo ou o relaxamento do músculo liso ocorre com o
impedimento de alguma etapa da via de sinalização da contração ou com o retorno
da [Ca2+]i aos níveis basais pelo processo de hiperpolarização da membrana. A
movimentação dos íons K+ na célula contribui para a regulação da entrada de Ca2+
pelos Cav, uma vez que o aumento da condutância ao K+ promove hiperpolarização
e a redução promove despolarização. No presente momento se conhece quatro
famílias de canais para K+, a dos canais para K+ sensíveis as correntes de Ca2+
(BKCa), Kv, Kir e dos canais para K+ sensíveis a ATP (KATP), entretanto as duas
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primeiras (BKCa e Kv) são as principais responsáveis pela hiperpolarização
(SANTOS et. al., 2013).
Já o mecanismo de transdução celular responsável pelo relaxamento está
relacionado à fosforilação via PKG ou PKA (proteína quinase dependente de GMPC
e de AMPC, respectivamente), que gera: acréscimo na atividade da Ca2+-ATPase do
RS e da membrana plasmática (SERCA e PMCA, respectivamente), e consequente
aumento do armazenamento e expulsão de Ca2+, simultaneamente; inativação do
IP3R, que leva a redução da saída de Ca2+ do RS; inibição da MLCK, que induz
redução da afinidade desta pelo complexo 4Ca2+-CAM, e impede a fosforilação da
MLC e posterior contração; ativação da fosfatase da MLC (MLCP), que retira o
fosfato da MLC, e impede que a contração permaneça; inibição dos Cav, que
induzem redução da [Ca2+]i; além da ativação dos Kv, que culminam em
hiperpolarização e posterior desativação dos Cav. A contratilidade do músculo liso, o
tônus das vias aéreas e a contratilidade rítmica do músculo cardíaco, são alguns dos
procedimentos do nosso organismo que necessitam dessa via (SANTOS et. al.,
2013).
Substâncias espasmolíticas estão envolvidas no tratamento de diversas
fisiopatologias, tais como HA, asma, cólicas uterinas ou intestinais. Portanto, um
fármaco que intervenha em qualquer mecanismo da contração da musculatura lisa,
que leve ao relaxamento, é extremamente útil. Além disso, os modelos
experimentais de músculos lisos são, relativamente, simples para investigação de
mecanismos de ação de drogas anti-espasmolíticas. Portanto, a descoberta de
substâncias capazes de prevenir ou curar tais patologias é de extrema importância,
pois elas atingem uma enorme parcela da população, seja em países pobres, em
desenvolvimento ou desenvolvidos (SANTOS et. al., 2013).
2.6 Óxido Nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, que está envolvida na regulação
de importantes processos fisiológicos, bem como o relaxamento vascular,
proliferação das células musculares lisas, secreção de insulina, tônus das vias
aéreas, peristaltismo, adesão dos leucócitos, agregação plaquetária, angiogênese e
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trombose. Considerado um gás lábil, o NO é capaz de difundir livremente nas
membranas celulares, característica que colabora com sua alta atividade biológica
(BIELLI et al., 2015; DIAS et. al., 2011).
O NO é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina, por uma família de
enzimas, as NOS. Estas são homodímeros compostas de dois domínios, ligados por
meio de uma região de ligação à calmodulina. Três isoformas de NOS foram
identificadas em mamíferos, NOS neuronal (nNOS/1NOS), NOS endotelial
(eNOS/3NOS) e induzível (iNOS/2NOS). A nNOS, inicialmente encontrada no sistema
nervoso, mas também se apresenta constitutivamente em outros tecidos. eNOS é
produzida fisiologicamente em células endoteliais. Enquanto que a iNOS encontra-se
expressa em processos celulares anormais como na insuficiência cardíaca, e
diferentemente da eNOS, ela age independentemente de Ca2+ e é estimulada por
fatores inflamatórios, tais como citocinas e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
(BIELLI et al., 2015; RAMESHRAD et al., 2016; SU, 2015; PEPINE, 2009).
A síntese do NO ocorre em duas etapas de uma reação. A primeira é a
N-hidroxilação de um grupo guanidino da L-arginina, formando N-hidroxi-L-arginina
(L-NOHA). Na segunda etapa da reação, a L-NOHA é metabolizada em L-citrulina e
NO. A síntese da L-NOHA a partir da L-arginina é considerada mais específica da
NOS. No entanto, a clivagem oxidativa da ligação C=NOH da L-NOHA em NO ou
outros óxidos de nitrogênio pode ser catalisada não apenas pela NOS, mas também
por outras hemoproteínas, tais como as ezimas microssomais do citocromo P450 ou
peroxidases (CHALUPSKY et. al., 2004).
Em condições fisiológicas, o NO é produzido a partir de eNOS. A acetilcolina,
bradicinina, trombina e substância P, são os principais fatores estimulantes para
produção desse gás. Em comum, esses fatores atuam aumentando a concentração
de cálcio intracelular nas células endoteliais, o que aumenta a ligação da
calmodulina, ativando eNOS. Dessa forma, a isoforma eNOS é essencial para a
regulação da produção de NO pelas células do endotélio (BIELLI et al., 2015; SU,
2015).
O NO desempenha um papel importante na preservação da homeostase
vascular. Níveis reduzidos de NO tem sido relacionado à patogênese de diferentes
doenças, como hipertensão e aterosclerose (RAMESHRAD et al., 2016). Pepine
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
34
(2009), afirma que a redução da atividade biológica do NO, causada tanto pela
redução na síntese como pelo aumento da degradação por estresse oxidativo, tem
sido identificada como o mecanismo de maior relevância no processo multifatorial da
disfunção endotelial e na participação das principais disfunções cardiovasculares
(SU, 2015; PEPINE, 2009).
O mecanismo do NO como vasodilatador é investigado em todo o mundo.
Apesar da simplicidade estrutural, a bioquímica do NO é complexa, e contém radical
livre com amplas e variadas ações biológicas, sendo uma molécula-chave na
regulação do tônus vascular e consequentemente na pressão arterial tanto em
animais quanto em seres humanos (DANTAS et. al., 2014).
Diferentes estudos experimentais e clínicos demonstraram que alguns
fármacos como os inibidores da enzima conversora de angiotensina, bloqueadores
da angiotensina, estimuladores da eNOS, anti-oxidantes, β-bloqueadores,
bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da fosfodiesterase 5, entre outras,
exercem efeitos protetores sobre o endotélio vascular. Atualmente, têm-se
aumentado o interesse em compostos químicos capazes de liberar NO para os
sistemas biológicos, uma vez que os doadores de NO mais utilizados na clínica
apresentam grandes limitações. Dessa forma, os novos doadores de NO, devem
apresentar características específicas, tais como ser de fácil preparação em uma
forma pura e estável, de preferência um sólido, liberar NO quantitativamente e seus
produtos de degradação não podem ser tóxicos (PAULO, 2011).
A nNOS também está presente nos capilares alveolares. Portanto, o NO está
envolvido em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos no sistema
respiratório (SILVA, 2014).
2.7 As Oximas
O termo oxima é a união entre as palavras oxigênio e imina, descoberta em
meados do século XIX. São compostos orgânicos cuja formula geral é RR’C=NOH,
onde o R é um substituinte orgânico e o R’ pode ser um hidrogênio ou um outro
grupo orgânico (PERES, 2009).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
35
As oximas (pralidoxima e abidoxima) foram originalmente utilizadas no
tratamento de intoxicação por organofosforados, devido a reativação da
acetilcolinesterase inibida (BUCKLEY et al., 2011; VAN HELDEN et al., 1996;
JOKANOVIC, 2012). Entretanto, estudos recentes já comprovam que algumas
oximas possuem ação relaxante em artéria mesentérica superior isolada de ratos,
com mecanismo relacionado à via do NO e canais para K+ (VERAS et. al., 2013).
Outras pesquisas com diferentes oximas demonstraram indução de
vasorrelaxamento por diferentes vias. Experimentos realizados em artérias sem
endotélio sugeriram o envolvimento da via NO-GMPc com o objetivo de avaliar os
efeitos vasculares induzidos por oximas (DANTAS et. al., 2014).
A estrutura química de tais oximas pode ser metabolizada por hemoproteínas,
enzimas do citocromo P450 e catalase, esta biotransformação culmina na liberação
de NO, que leva a vasodilatação independente da NOS (DANTAS et. al., 2014).
Portanto, várias delas já são consideradas novas doadoras de NO em
sistemas biológicos, como vasos sanguíneos e regiões de inflamação, sendo
comprovada sua ação como relaxante de músculo liso e anti-inflamatória (ABDEL-
AZIZ et. al., 2013).
Esta última atividade foi observada em algumas oximas estudadas por Abdel-
Aziz et. al., através do teste de edema de pata induzido por carragenina. Também foi
ressaltada a atividade gastroprotetora, onde uma análise histopatológica indicou que
o NO está envolvido na redução do aparecimento de úlcera gástrica. Além da ação
antiproliferativa, onde algumas oximas poderiam ser aliadas da terapia anticâncer,
com o intuito de exercer um efeito sinérgico, ou até retardar a resistência do fármaco
anticâncer (ABDEL-AZIZ et. al., 2013).
Além do câncer, outras patologias também causam grande impacto na
sociedade, como diabetes, hipercolesterolemia, aterosclerose e hipertensão,
entretanto estas podem ser solucionadas ou reguladas pela produção de NO a partir
de substratos exógenos por vias distintas da NOS. Amidoximas e cetoximas, são
exemplos de substâncias com a capacidade de liberar este gás. Recentemente,
vários derivados de oximas substituídas não-aromáticos foram avaliados como
doadores de NO. E então, formamidoxima, acetaldoxima, acetona oxima e
formaldoxima promoveram vasodilatação em anéis de aorta isolada de rato, na
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
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ausência de endotélio funcional. Além da formamidoxima e formaldoxima, em
experimentações in vivo, na presença de um bloqueador da NOS (L-NAME), terem
permanecido com seu efeito hipotensor (JAROS et. al., 2007).
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OBJETIVOS
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
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3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Contribuir para o estudo farmacológico de oximas em relação ao músculo liso e
aos sistemas cardiovascular e respiratório.
3.2 Específicos
Investigar o efeito de Aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+), oxima
substituída (OS) e prenol acetilado (Pa) sobre a aorta.
Investigar o efeito de AO, AO+, OS e Pa sobre a mesentérica.
Investigar o composto mais eficaz e potente sobre a pressão arterial em ratos
(in vivo).
Investigar o mecanismo de ação do composto mais eficaz e potente.
Investigar o efeito de AO, AO+, OS e Pa sobre a traquéia.
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MATERIAL E
MÉTODOS
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Piridina
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Material sintético
Utilizou-se, como objeto principal de estudo neste trabalho, as etapas da
reação de síntese da oxima substituída (Figura 4). Essa síntese foi composta por
três etapas, primeiramente foi sintetizado o prenol acetilado (etanoato de 3-metil-but-
2-entila) a partir do prenol, anidrido acético e piridina (Figura 1), em seguida o prenol
acetilado reagiu com o pentilnitrito para formação da aceto-oxima (3-cloro-2-oxima-3-
metilbutilacetato) (Figura 2), e finalmente a aceto-oxima sofreu uma substituição com
a anilina, levando a formação da oxima subtituída (3-fenilamino-2-oxima-3-
metilbutilacetato) (Figura 3). O prenol acetilado, aceto-oxima e oxima substituída
foram gentilmente fornecidos pelos nossos colaboradores Profa. Dra. Cleônia
Roberta Melo Araújo e Prof. Dr. Arlan de Assis Gonsalves, do Laboratório de
Química Geral da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF).
As oximas permanecem em equilíbrio taltomérico entre a forma de oxima e de
nitroso. Diante disto, com o intuito de analisar se a temperatura influenciava este
equilíbrio, a aceto-oxima (AO) foi preparada a temperatura ambiente (22 ºC) e na
presença de temperatura (37 ºC), esta última foi denominada aceto-oxima ativada
(AO+).
Figura 1: Reação de síntese do prenol acetilado a partir do prenol e anidrido acético.
Prenol Anidrido acético Prenol acetilado
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Pentilnitrito
Figura 2: Reação de síntese da aceto-oxima a partir do prenol acetilado e pentilnitrito.
Figura 3: Reação de síntese da oxima substituída a partir da aceto-oxima e piridina.
Figura 4: Reação completa da síntese da aceto-oxima e oxima substituída a partir do prenol.
4.1.2 Animais
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus) pesando entre 250 e 350 g e
cobaias (Cavia porcellus) de ambos os sexos pesando entre 300 e 500 g, todos
procedentes do Biotério Central da UNIVASF (Figura 5A e B). Antes dos
experimentos os animais foram mantidos sob rigoroso controle alimentar com uma
dieta balanceada a base de ração tipo “pellets” com livre acesso a água, com
ventilação e temperatura (221C) controladas e constantes, submetidos
Prenol acetilado
Aceto-oxima
Aceto-oxima
Anilina
Oxima substituída
Prenol Prenol acetilado
Aceto-oxima
Oxima substituída
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diariamente a um ciclo claro-escuro de 12 h, sendo o período claro das 06 às 18 h.
Todos os experimentos foram realizados no período de 07 as 20 h.
Figura 5: Fotos de Rattus norvegicus (A) e Cavia porcellus (B).
4.1.3 Aspectos éticos
Todos os experimentos previstos foram executados de acordo com os
princípios éticos de experimentação animal da comissão de ética no uso de animais
(CEUA), pertencente ao comitê de ética e deontologia em estudos e pesquisa
(CEDEP/UNIVASF-Protocolo 0002/180615) e do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA). Para os experimentos, todos os animais foram
eutanasiados de modo rápido e indolor, sempre por profissional treinado em
bioterismo ou pelo próprio médico veterinário responsável pelo biotério, respeitando
a resolução do conselho federal de medicina veterinária (CFMV) nº 1000 do ano
2012 que estabelece normas para a prática didático-científica da eutanásia de
animais. Os ratos foram eutanasiados por deslocamento cervical e as cobaias por
concussão cerebral. Após eutanasiados, os animais foram colocados em recipientes
específicos para a empresa responsável recolher.
As drogas e substâncias utilizadas nos procedimentos experimentais bem
como algum material de consumo e outros materiais (seringas, agulhas, luvas de
látex descartáveis, restos de vísceras de animais, lâminas de bisturi, etc.) receberam
o mesmo tratamento do lixo hospitalar do município de Petrolina-PE, segundo a
Fonte: LAFEX
B
A
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respiratório
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43
RDC 306 de 07 de dezembro de 2004 da ANVISA que dispõe sobre o regulamento
técnico para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde.
4.1.4 Substâncias e Sais
Tabela 1. Substância, sais e seus fornecedores.
Substância Fabricante
Ácido araquidônico (AA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EUA)
Atropina Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EUA)
Bicarbonato de sódio (NaHCO3) Proquimios (RJ, Brasil)
Cloreto de cálcio bi-hidratado
(CaCl2.2H2O),
Isofar (Duque de Caxias, RJ,
Brasil)
Cloreto de sódio (NaCl) Proquimios (RJ, Brasil)
Cloreto de potássio (KCl) Vetec (RJ, Brasil)
Cloridrato de acetilcolina (ACh) Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
EUA)
Cloridrato de L(-)-fenilefrina (FEN) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EUA)
Cloridrato carbamilcolina (CCh) Merck (Darmstadt, Alemanha)
Dimetilsulfóxido (DMSO) Cromato produtos químicos
LTDA.
Fosfato diácido de potássio
monohidratado (KH2PO4.H2O)
Isofar (Duque de Caxias, RJ,
Brasil)
L-NAME Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EUA)
Glicose anidra Proquimios (RJ, Brasil)
Salina (NaCl 0,9%) Farmax (Brasil)
Sildenafil Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
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EUA)
Sulfato de magnésio heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Proquimios (RJ, Brasil)
Twin 80 Merck (SP, Brasil)
Todas as substâncias foram solubilizadas em água pura ou, quando isso não
foi possível, em solventes adequados indicados pelos seus fabricantes, desde que
esses não sejam tóxicos em demasia para os órgãos isolados usados neste estudo.
4.1.5 Soluções Nutritivas
De acordo com os experimentos realizados, foram utilizados solução nutritiva
de Krebs, com seu pH ajustado para 7,4 com HCl (1N) e aerada com mistura
carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2). Sendo que os sais foram solubilizados em
água destilada.
Tabela 2. Composição da solução de Krebs
Substâncias Concentração (mM)
NaCl 118
KCl 4,6
MgSO4.7H2O 5,7
KH2PO4.H2O 1,1
CaCl2.2H2O 2,5
Glicose 11
NaHCO3 25
4.1.6 Aparelhos
Para o registro das contrações isométricas os segmentos dos órgãos isolados
foram suspensos em cubas (10 mL) de um sistema de banho para órgãos isolados
modelo EFF-321 (Insight Instruments, Brasil). As contrações isométricas foram
registradas através de transdutores de força modelo TRO015 (Panlab, S.L.,
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
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45
Espanha) acoplados a um amplificador de força do tipo “bridge system” (Insight
Instruments, Brasil), conectado a um computador, sendo observados e armazenados
os registros de contração e relaxamento através do software DATAQ.
Para aferição do pH das soluções nutritivas foi utilizado um pHmetro digital de
bancada modelo pH250 (Policontrol, Brasil). Todas as substâncias foram pesadas
em balança analítica modelo FA2104N (Celtac, Brasil) ou semi-analítica modelo
MARK300 (Bel, Brasil) e os animais em balança comum modelo 9094C/4 (Toledo,
Brasil).
4.2 Métodos
4.2.1 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-
oxima ativada e oxima substituída em aorta isoladada de rato
4.2.1.1 Preparações de anéis de aorta isolada de ratos
Os ratos foram eutanasiados por deslocamento cervical seguido por secção
dos vasos cervicais. O tórax do animal foi aberto e dissecado, a aorta torácica
(Figura 6A) foi retirada cuidadosamente e anéis aórticos de 3-5 mm (Figura 6B)
foram obtidos livres de tecido conectivo e adiposo. Foram utilizados anéis com e
sem endotélio funcional. Anéis sem endotélio funcional foram obtidos pela remoção
mecânica da camada endotelial, através do atrito provocado pela haste metálica em
contato com a parede interna do vaso. Para obtenção das respostas isométricas, os
anéis foram suspensos individualmente por hastes de aço inoxidável presas através
de fios de algodão a transdutores de força, em cubas de vidro (10 mL) contendo
solução de Krebs a 37 C e aerados com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de
CO2). Os anéis aórticos foram deixados por um período de 60 min em repouso,
durante o qual foram mantidos sob uma tensão inicial de 1 g. Durante esse período,
a solução nutritiva foi renovada a cada 15 min para prevenir a interferência devido
ao acúmulo de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).
Após o período de estabilização, foi induzida uma contração com fenilefrina
(FEN) na concentração de 10-6 M. A integridade do endotélio vascular foi verificada
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
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pela adição de acetilcolina (ACh) (10-6 M) à cuba durante a fase tônica da primeira
contração induzida por FEN (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). A retirada do
endotélio foi confirmada pela ausência ou relaxamento inferior a 10% induzido por
ACh; o mesmo foi considerado íntegro quando os anéis aórticos apresentarem
relaxamento induzido por ACh igual ou superior a 50% (em relação à força máxima
da contração inicial). Os anéis com relaxamento entre 10 e 50% foram excluídos.
Após a verificação da presença, ou não, do endotélio, as soluções de banho foram
trocadas, sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs
durante um período total de 30 min. Decorrido este tempo, uma segunda contração
foi induzida pela adição de 10-6 M de FEN e durante a fase tônica e sustentada
dessa segunda contração, as substâncias foram adicionadas à cuba na
concentração máxima (10-4 M) ou de maneira cumulativa (10-7, 3.10-7, 10-6, 3.10-6,
10-5, 3.10-5 e 10-4 M), sendo avaliado seu efeito relaxante, eficácia e potência
determinadas em anéis de aorta de rato, na ausência e na presença de endotélio
funcional.
Todos os relaxamentos foram expressos como a percentagem reversa da
tensão máxima obtida pela adição da FEN à cuba, onde o relaxamento máximo foi
obtido quando a tensão registrada foi reduzida aos níveis basais iniciais.
Figura 6: Fotos da aorta de rato (A) e anel de aorta em haste metálica (B).
A
B
Fonte: LAFEX
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
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4.2.2 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-
oxima ativada e oxima substituída em mesentérica superior isoladada de rato
4.2.2.1 Preparações de anéis de mesentérica isolada de ratos
Todos os experimentos com mesentérica foram realizados no laboratório de
fisiologia e fermacologia endócrina e cardiovascular (LAFFEC), com a colaboração
da professora Dra Darízy Flávia Silva, na Univarsidade Federal da Bahia (UFBA) em
Salvador-BA.
Os ratos foram eutanasiados por câmara de CO2 seguido por secção dos
vasos cervicais. O abdomen do animal foi aberto e dissecado, a mesentérica
superior foi retirada cuidadosamente e anéis mesentéricos de 3-5 mm (Figura 7A)
foram obtidos livres de tecido conectivo e adiposo. Foram utilizados anéis com e
sem endotélio funcional. Anéis sem endotélio funcional foram obtidos pela remoção
mecânica da camada endotelial, através do atrito provocado pela haste metálica em
contato com a parede interna do vaso. Para obtenção das respostas isométricas, os
anéis foram suspensos individualmente por hastes de aço inoxidável presas através
de fios de algodão a transdutores de força, em cubas de vidro (10 mL) contendo
solução de Krebs a 37 C (Figura 7B) e aerados com mistura carbogênica (95% de
O2 e 5% de CO2). Os anéis mesentéricos foram deixados por um período de 60 min
em repouso, durante o qual foram mantidos sob uma tensão inicial de 1 g. Durante
esse período, a solução nutritiva foi renovada a cada 15 min para prevenir a
interferência devido ao acúmulo de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).
Após o período de estabilização, foi induzida uma contração com FEN na
concentração de 10-6 M. A integridade do endotélio vascular foi verificada pela
adição de ACh (10-6 M) à cuba durante a fase tônica da primeira contração induzida
por FEN (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). A retirada do endotélio foi confirmada
pela ausência ou relaxamento inferior a 10% induzido por ACh, o mesmo foi
considerado íntegro quando os anéis mesentéricos apresentaram relaxamento
induzido por ACh igual ou superior a 90% (em relação à força máxima da contração
inicial). Os anéis com relaxamento entre 10 e 90% foram excluídos. Após a
verificação da presença ou não, do endotélio, as soluções de banho foram trocadas,
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
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sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs durante um
período total de 30 min. Decorrido este tempo, uma segunda contração foi induzida
pela adição de 10-6 M de FEN e durante a fase tônica e sustentada dessa segunda
contração, as substâncias foram adicionadas à cuba de maneira cumulativa (10-7,
3.10-7, 10-6, 3.10-6, 10-5, 3.10-5 e 10-4 M), sendo avaliado seu efeito relaxante, eficácia
e potência determinadas em anéis de mesentérica de rato, na ausência e na
presença de endotélio funcional.
Todos os relaxamentos foram expressos como a percentagem reversa da
tensão máxima obtida pela adição da FEN à cuba, onde o relaxamento máximo foi
obtido quando a tensão registrada foi reduzida aos níveis basais iniciais.
Figura 7: Fotos do anel de mesentérica superior de rato (A), amplificador e anéis no banho de órgãos
(B).
4.2.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a pressão arterial
Os experimentos, in vivo, foram realizados em parceria com o laboratório de
farmacologia e biofísica veterinária da UNIVASF, com a colaboração do professor
Dr. Raimundo Campos Palheta Júnior.
Os animais foram anestesiados com uretana (1.2 g/kg, i.p.), em seguida foi
realizada uma canulação dos vasos cervicais. Uma cânula de polietileno (PE 50),
preenchida com solução salina e heparina (500 U/mL), foi inserida na artéria carótida
esquerda, sendo reservada para o registro da PA. Na veia jugular direita foi
introduzido um cateter (PE 50) reservado a infusão de fármacos (Figura 8).
A B
Fonte: LAFFEC
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
49
Figura 8: Foto do animal com as cânulas na artéria carótida e veia jugular.
A avaliação das condições hemodinâmicas do rato foi realizada mediante
registro contínuo da PA, em mmHg, graças a conexão da cânula da artéria carótida
esquerda aos transdutores de pressão MLT 1050 e MLT 0380 (Figura 9), por sua
vez acoplados a um sistema de aquisição de sinais biológicos (PowerLab/8sp,
ADInstruments). Já a freqüência cardíaca (FC, em bpm) foi determinada a partir do
registro contínuo da pressão arterial sistólica (PAS).
Figura 9: Foto da cânula da artéria carótida esquerda conectada aos transdutores de pressão MLT
1050 e MLT 0380.
O procedimento foi realizado da seguinte maneira, a aceto-oxima foi
administrada, através da cânula da jugular, nas doses de 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 250
µg, aplicadas num intervalo de cinco minutos, para a avaliação do efeito dependente
Fonte: LAFEX
Fonte: LAFEX
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
50
da dose. O mesmo procedimento foi realizado com o veículo, composto por DMSO
(12%), Twin 80 (3%), água destilada (12%) e salina (73%). Em seguida, a atropina
(0,5 mg/Kg) foi administrada, após o período de dez minutos, e então 20 µg de
aceto-oxima foi injetado. Depois o L-NAME (3 mg/Kg) foi aplicado, também foi
aguardado dez minutos para a adição da aceto-oxima (20 µg). E finalmente, foi
administrado sildenafil (0,5 mg/Kg), após dez minutos, 20 µg de aceto-oxima foi
adicionado ao catéter. E então os efeitos dos bloqueadores sobre a oxima foram
observados.
4.2.4 Estudo da atividade relaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima
ativada e oxima substituída em traquéia isolada de cobaia
4.2.4.1 Preparações dos anéis de traquéia isolada de cobaia
As cobaias foram sacrificadas por concussão cerebral seguida por secção dos
vasos cervicais. O tórax da cobaia foi aberto e dissecado, a traquéia (Figura 10A) foi
retirada e limpa de todo o tecido conectivo e adiposo. O órgão foi dividido em
segmentos, contendo 3-4 anéis de cartilagem cada (Figura 10B). Foram utilizados
anéis com e sem epitélio funcional. Anéis de traqueia sem epitélio foram obtidos
através da retirada do mesmo por atrito do lúmen do órgão com uma haste envolta
em algodão e embebida com solução de Krebs. Esses segmentos foram suspensos
individualmente por hastes de aço inoxidável e fios de algodão em cubas de vidro
(10 mL) contendo solução nutritiva de Krebs e conectados a transdutores de força,
estando sob uma tensão repouso de 1 g. Estes tecidos foram mantidos a uma
temperatura de 37C, aerados com carbogênio, e permaneceram em repouso
durante 60 min, sendo a solução trocada a cada 15 min. Após o período de
estabilização, uma primeira contração foi induzida pela adição de 10-6 M de carbacol
(CCh) à cuba.
A integridade do epitélio da traquéia foi verificada pela adição de ácido
araquidônico (AA) a cuba na concentração de 10-4 M (TSCHIRHART et al., 1987)
durante a fase tônica da primeira resposta induzida por CCh, onde anéis que
obtiveram relaxamentos superiores a 50% (em relação a força de contração inicial)
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
51
foram considerados com epitélio funcional. A retirada do epitélio foi confirmada pela
ausência de relaxamento em resposta à adição de AA a cuba ou quando este
relaxamento foi inferior a 10%, sendo este anel considerado sem epitélio funcional.
Os experimentos foram realizados com anéis de traqueia providos ou desprovidos
de epitélio funcional. Os anéis com relaxamento entre 10 e 50% foram excluídos.
Após a verificação da presença, ou não, do epitélio, as a soluções de banho foram
trocadas, sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs
durante um período total de 30 min. Após a verificação da presença, ou não, do
epitélio, as soluções de banho foram trocadas, sendo as preparações lavadas a
cada 15 min com solução de Krebs durante um período total de 30 min. Decorrido
este tempo, uma segunda contração foi induzida pela adição de 10-6 M de CCh e
durante a fase tônica e sustentada dessa segunda contração, as substâncias foram
adicionadas à cuba na concentração máxima (10-4 M) e de maneira cumulativa (10-7,
3.10-7, 10-6, 3.10-6, 10-5, 3.10-5 e 10-4 M), sendo avaliado o seu efeito relaxante,
eficácia e potência determinadas em anéis de traqueia de cobaia na presença e na
ausência de epitélio funcional.
Todos os relaxamentos foram expressos como a percentagem reversa da
tensão máxima obtida pela adição da CCh à cuba, onde o relaxamento máximo foi
obtido quando a tensão registrada era reduzida aos níveis iniciais, isto é, foram
numericamente iguais a tensão inicial antes da adição da CCh à cuba.
Figura 10: Fotos da traquéia de cobaia (A) e anéis de traquéia em hastes metálicas (B).
A
B
Fonte: LAFEX
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2016
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4.3 Análise dos Dados
Todos os dados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média.
O valor de “n” se refere ao número animais utilizados em cada experimento em um
dado protocolo, que pode chegar até um máximo de 7 animais, para que o resultado
obtido possa ser representativo e ao mesmo tempo não se use animais em demasia.
Para os experimentos in vitro, usando órgãos isolados, foi realizado ANOVA
seguido de Dunnet, onde as curvas mostrando a relação concentração-resposta de
uma substância foram ajustadas por uma regressão não-linear descrita pela
equação: Y = min + (max-min)/(1+10(LogEC50-X)*S)); onde “X” é o logaritmo na base 10
da concentração molar da substância testada, “Y” é a resposta relaxante da
substância testada em percentagem, “min” é o menor efeito assumido para “Y”,
“max” é o maior efeito assumido para “Y” e “S” é o valor da constante de Hill
(MOTULSKY; CHRISTOPOULOS, 2003). Através dessa equação foram calculados
os valores de pD2 (Logaritmo da concentração molar de uma substância em que ela
é capaz de causar 50% de seu efeito máximo), servindo como parâmetro de
potência relativa de uma substância, e o Emax (valor médio, em percentagem, do
efeito máximo obtido por uma substância em relação ao maior valor possível num
dado tecido) servindo como parâmetro de eficácia relativa de duas substâncias
(NEUBIG et al., 2003).
Diferenças entre as médias foram comparadas estatisticamente usando o teste
“t” de Student não-pareado, onde essas diferenças foram consideradas significantes
quando o valor calculado de “p” foi menor que 0,05. As análises estatísticas foram
realizadas usando o programa Graph-Pad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., San
Diego, CA, EUA).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
53
RESULTADOS
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
54
5 RESULTADOS
5.1 Estudo da atividade vasorrelaxante das oximas em aorta isolada de rato
5.1.1 Escolha do solvente para preparo da solução-estoque
Nos experimentos in vitro, as substâncias foram dissolvidas com DMSO e
H2O, na proporção de 1:1, ou apenas em DMSO, então foi realizada a análise
estatística e ambos não foram significativamente diferentes (Figura 11). Entretanto,
AO, AO+ e Pa não foram dissolvidos em DMSO e H2O, portanto foi padronizado
apenas o DMSO para dissolução no preparo da solução-estoque.
O DMSO foi o solvente escolhido pelo fato dele ser aprótico (ANGELO et. al.,
2005), o que favorece que as moléculas permaneçam na forma de oxima, uma vez
que elas estão em equilíbrio taltomérico entre oxima e nitroso.
Já para os experimentos in vivo, foi utilizada uma mistura de DMSO (12%),
Twin 80 (3%), água destilada (12%) e salina (73%). Foram avaliados os efeitos
deste veículo sobre a FC (Figura 21), PAS (Figura 22), PAD (Figura 23) e PAM
(Figura 24), que não alterou significativamente estes parâmetros, e também não
modificou o efeito da AO em reduzir os níveis pressóricos em rato.
Figura 11: Valores de Emax dos veículos DMSO+H2O e DMSO em enéis de aorta, pré-contraídos com
10-6 M de FEN, na presença e ausência de endotélio. As colunas e barras verticais representam a
média e o e.p.m, respectivamente; (n=3).
DM
SO
+H
2O
(E
+)
DM
SO
(E+)
DM
SO
+H
2O
(E
-)
DM
SO
(E-)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%)
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
55
5.1.2 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na
ausência de endotélio funcional
A aceto-oxima (AO) (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de
aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um Emáx de
36,3±2,9% e 63,0±0,5% (Figura 12) na presença e na ausência de endotélio
funcional, respectivamente. Observou-se que AO foi mais eficaz na ausência de
endotélio funcional.
Adicionalmente, AO (de 10-7 a 10-4 M) relaxou de maneira dependente de
concentração os anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M),
atingindo um Emáx, na concentração de 10-4 M, de 50,0±10,8%, em anéis com
endotélio, e de 100,0±13,2% em anéis sem endotélio (Figura 13). AO foi
significativamente mais eficaz (p<0,05) na ausência de endotélio.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO foi de 4,1±0,1 na
presença e de 4,9±0,1 na ausência de endotélio, e foi mais eficaz (p<0,05) na
ausência de endotélio.
5.1.3 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de aorta isolada de rato na presença
e na ausência de endotélio funcional
A aceto-oxima ativada (AO+) (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou
anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um Emáx
de 40,0±12,5% e 42,7±10,9% (Figura 12) na presença e na ausência de endotélio
funcional, respectivamente. Não houve diferença significativa em relação à eficácia.
Adicionalmente, a AO+ (de 10-7 a 10-4 M) relaxou de maneira dependente de
concentração os anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M),
atingindo um Emáx de 49,8±5,8%, na concentração de 10-4 M, na presença e de
63,0±8,9% na ausência de endotélio funcional (Figura 13). Não houve diferença
significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da oxima foi de 4,4±0,1 na
presença e de 4,1±0,1 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa
entre esses valores.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
56
5.1.4 Efeito da oxima substituída sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e
na ausência de endotélio funcional
A oxima substituída (OS) (Figura 3), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis
de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um Emáx de
40,3±9,3% e 40,3±10,5% (Figura 12) na presença e na ausência de endotélio
funcional, respectivamente. Não ocorreu diferença significativa em relação à
eficácia.
Adicionalmente, a oxima substituída (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira
dependente de concentração, anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com
FEN (10-6 M), atingindo um Emáx de 47,0±7,5%, na concentração de 10-4 M, na
presença de endotélio funcional e de 40,3±10,5% na ausência dele (Figura 13). Não
houve diferença significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da oxima foi de 4,6±0,6 na
presença e de 4,7±0,4 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa
entre estes resultados.
5.1.5 Efeito do Prenol acetilado sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e
na ausência de endotélio funcional
O prenol acetilado (Pa) (Figura 1) relaxou, na sua concentração de 10-4 M,
anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um efeito
máximo (Emáx) de 15,7±2,4% em anéis com endotélio e 0,7±0,3% em anéis sem
endotélio funcional (Figura 12). Observou-se que o Pa foi mais eficaz na presença
de endotélio (p<0,05).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
57
Figura 12: Valores de Emax do prenol acetilado (Pa), aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e
oxima substituída (OS) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença e na
ausência de endotélio. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m,
respectivamente. *p<0,05 (teste “t”: E+ vs. E-; n=3 a 7).
AO (E + ) AO (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%)
*
AO + (E + ) AO + (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%)
Em
ax
(%
)
O S (E + ) O S (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
P a (E + ) P a (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%)
*
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
58
Figura 13: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e oxima substituída (OS)
sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença (■) e na ausência (□) de
endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05
(teste “t”: E+ vs. E-; n=5 ou 6).
lo g [A O ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O (E + )
A O (E - )
*
**
lo g [A O + ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O + (E - )
A O + (E + )
lo g [O S ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
O S (E + )
O S (E - )
5.1.6 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de aorta isolada de rato na
presença e na ausência de endotélio funcional
Nos experimentos em anéis de aorta na presença de endotélio funcional a OS,
AO+, AO, Pa e veículo não foram significativamente diferentes em relação a eficácia,
tanto quando aplicados na sua concentração máxima (10-4 M) quanto
cumulativamente (10-7 a 10-4 M) (Figuras 14 e 15). Já na ausência de endotélio, AO
foi significativamente eficaz nas aplicações de 10-4 M e cumulativamente (10-7 a 10-4
M) (Figuras 16 e 17).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
59
Figura 14: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado
e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença de endotélio. As
colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente; (n=3).
OS
(E
+)
AO
+ (
E+)
AO
(E
+)
Pa (
E+)
Veíc
ulo
(E
+)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%)
Figura 15: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado
e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na ausência de endotélio. As
colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05 (n=3).
Em
ax
(%
)
OS
(E
-)
AO
+ (
E-)
AO
(E
-)
Pa (
E-)
Veíc
ulo
(E
-)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
*
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
60
Figura 16: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■) e
veículo (■) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença de endotélio. Os
símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente; (n=5).
lo g [X ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
O S (E + )
A O + (E + )
A O (E + )
V e íc u lo (E + )
Figura 17: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■) e
veículo (■) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na ausência de endotélio. Os
símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).
lo g [X ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
O S (E - )
A O + (E - )
A O (E - )
V e íc u lo (E - )* *
*
*
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
61
5.2 Estudo do efeito vasorelaxante das oximas em mesentérica superior
isolada de rato
5.2.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato na
presença e na ausência de endotélio funcional
A AO (Figura 2) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de
concentração, anéis de mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN
(10-6 M), atingindo um Emáx de 100,2±4,4%, na concentração de 10-4 M, na presença
de endotélio funcional e 89,8±10,9% na ausência dele (Figura 18). Não houve
diferença significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO foi de 4,9±0,1 na
presença e de 5,1±0,2 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa
entre esses resultados.
5.2.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de mesentérica superior isolada de
rato na presença e na ausência de endotélio funcional
A AO+ (Figura 2) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de
concentração, anéis de mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN
(10-6 M), atingindo um Emáx de 80,8±6,2%, na concentração de 10-4 M, na presença
de endotélio funcional e 67,2±10,3% na ausência dele (Figura 18). Não houve
diferença significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO+ foi de 4,8±0,2 na
presença e de 4,8±0,3 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa
entre eles.
5.2.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de mesentérica superior isolada de
rato na presença e na ausência de endotélio funcional
A OS (Figura 3) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de
concentração, anéis de mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
62
(10-6 M), atingindo um Emáx de 52,0±4,3%, na concentração de 10-4 M, na presença
de endotélio funcional e 68,8±5,7% na ausência dele (Figura 18). Não houve
diferença significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO+ foi de 4,3±0,2 na
presença e de 4,4±0,1 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa
entre esses valores.
5.2.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato
na presença e na ausência de endotélio funcional
O Pa (Figura 1) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de
concentração, anéis de mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN
(10-6 M), atingindo um Emáx de 68,5±5,3%, na concentração de 10-4 M, na presença
de endotélio funcional e 54,8±11,2% na ausência dele (Figura 18). Não houve
diferença significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante do Pa foi de 4,7±0,3 na
presença e de 3,9±0,5 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa
entre estes valores.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
63
Figura 18: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+), oxima substituída (OS)
e prenol acetilado (Pa) sobre anéis de mesentérica superior, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na
presença (■) e na ausência (□) de endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ±
e.p.m., respectivamente; (n=5).
lo g [A O ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O (E + )
A O (E - )
lo g [A O + ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O + (E + )
A O + (E - )
lo g [O S ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
O S (E + )
O S (E - )
lo g [P a ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
P a (E + )
P a (E - )
5.2.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de mesentérica isolada de
rato na presença e na ausência de endotélio funcional
Em anéis de mesentérica a AO, aplicada de maneira cumulativa (10-7 a
10-4 M), foi significativamente eficaz quando comparada as demais oximas, tanto na
presença (Figura 19) quanto na ausência de endotélio funcional (Figura 20).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
64
Figura 19: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol
acetilado (■) e veículo (■) sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na
presença de endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m.,
respectivamente. *p<0,05 (n=5).
lo g [X ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
O S (E + )
A O + (E + )
A O (E + )
P a (E + )
V e íc u lo (E + )*
Figura 20: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol
acetilado (■) e veículo (■) sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na
ausência de endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m.,
respectivamente. *p<0,05 (n=5).
lo g [X ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
O S (E - )
A O + (E - )
A O (E - )
P a (E - )
V e íc u lo (E - )
*
*
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
65
Tabela 3. Comparação entre os valores do Emax das oximas em aorta e mesentérica.
Oxima
Emax
Aorta Mesentérica
Presença
de endotélio
(E+)
Ausência
de endotélio (E-
)
Presença
de endotélio
(E+)
Ausência
de endotélio
(E-)
AO 50,0±10,8%
100,0±13,
2%
100,2±4,4%
89,8±10,
9%
AO+ 49,8±5,8% 63,0±8,9% 80,8±6,2%
67,2±10,
3%
OS 47,0±7,5% 40,3±10,5
%
52,0±4,3%
68,8±5,7
%
Tabela 4. Comparação entre os valores do pD2 das oximas em aorta e mesentérica.
Oxima
pD2
Aorta Mesentérica
Presença
de endotélio
(E+)
Ausência
de endotélio (E-
)
Presença
de endotélio
(E+)
Ausência
de endotélio
(E-)
AO 4,1±0,1 4,9±0,1 4,9±0,1 5,1±0,2
AO+ 4,4±0,1 4,1±0,1 4,8±0,2 4,8±0,3
OS 4,6±0,6 4,7±0,4 4,3±0,2 4,4±0,1
5.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a PA
Nos experimentos in vitro, AO apresentou maior potência relaxante, portanto
foi investigado seu efeito sobre a PA, in vivo, em ratos. As injeções intravenosas de
AO nas doses de 1 a 250 µg produziram reduções na FC, pressão arterial sistólica
(PAS), diastólica (PAD) e média (PAM). As reduções na PA e FC foram de início
rápido e curta duração. A FC foi significativamente diminuída nas doses de 1, 10, 20,
50, 100 e 250 µg da AO (Figura 21). Enquanto que as PAS e PAD foram reduzidas
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
66
nas doses de 20, 50, 100 e 250 µg (Figuras 22 e 23), entretanto a PAM foi a partir da
dose de 10 µg (Figura 24).
Figura 21: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a FC. Os
símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).
F
C (
bp
m)
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
V e íc u lo
A O
D o s e (g )
*
* **
* *
Figura 22: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a PAS. Os
símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).
D o s e (g )
P
AS
(m
mH
g)
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
V e ic u lo
A O
* ** *
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
67
Figura 23: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a PAD. Os
símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).
D o s e (g )
P
AD
(m
mH
g)
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
V e ic u lo
A O
** * *
Figura 24: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a PAM. Os
símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).
D o s e (g )
P
AM
(m
mH
g)
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
V e ic u lo
A O
*
** * *
De acordo com as figuras 21, 22, 23 e 24, geralmente o efeito hipotensor foi
observado a partir da dose de 20 µg. Portanto, esta foi a dose padronizada para
testar os inibidores.
As reduções da FC (Figura 25), PAS (Figura 26), PAD (Figura 27) e PAM
(Figura 28) em resposta a administração intravenosa da AO (20 µg) não foram
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
68
atenuadas após a administração de 0,5 mg/Kg de atropina, antagonista de
receptores muscarínicos, indicando que a redução da FC e da PA não foi mediada
pela ativação muscarínica.
O mesmo aconteceu após a administração intravenosa de 3 mg/Kg de
L-NAME, bloqueador da NOS, comprovando que a redução da FC e da PA não tem
relação com a produção fisiológica de NO (Figuras 25, 26, 27 e 28).
Já após a administração intravenosa de 0,5 mg/Kg de sildenafil, inibidor da
fosfodiesterase 5 (PDE5), também não ocorreu atenuação da redução da FC (Figura
25), PAS (Figura 26), PAD (Figura 27) e PAM (Figura 28) causadas pela AO,
entretanto ocorreu um aumento na duração do efeito redutor da PA (Figura 29). Isto
significa que, provavelmente, o efeito hipotensor da AO está envolvido com a via
GC/GMPc/PKG.
Figura 25: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a FC, na presença de atropina, L-NAME e
sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05
(n=5).
F
C (
bp
m)
VA
O
AO
At
AO
L
AO
S
Atr
op
ina
VA
t
L-n
am
eV
L
Sild
en
af i
lV
S
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
V: veículo
AO: aceto-oxima
AOAt: AO na presença de atropina
AOL: AO na presença de L-NAME
AOS: AO na presença de sildenafil
VAt: V na presença de atropina
VL: V na presença de L-NAME
VS: V na presença de sildenafil
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
69
Figura 26: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAS, na presença de atropina, L-NAME
e sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05
(n=5).
P
AS
(m
mH
g)
VA
O
AO
At
AO
L
AO
S
Atr
op
ina
VA
t
L-n
am
eV
L
Sild
en
af i
lV
S
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
* *
Figura 27: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAD, na presença de atropina, L-NAME
e sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05
(n=5).
P
AD
(m
mH
g)
VA
O
AO
At
AO
L
AO
S
Atr
op
ina
VA
t
L-n
am
eV
L
Sild
en
af i
lV
S
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
*
V: veículo
AO: aceto-oxima
AOAt: AO na presença de atropina
AOL: AO na presença de L-NAME
AOS: AO na presença de sildenafil
VAt: V na presença de atropina
VL: V na presença de L-NAME
VS: V na presença de sildenafil
V: veículo
AO: aceto-oxima
AOAt: AO na presença de atropina
AOL: AO na presença de L-NAME
AOS: AO na presença de sildenafil
VAt: V na presença de atropina
VL: V na presença de L-NAME
VS: V na presença de sildenafil
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
70
Figura 28: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAM, na presença de atropina, L-NAME
e sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05
(n=5).
P
AM
(m
mH
g)
VA
O
AO
At
AO
L
AO
S
Atr
op
ina
VA
t
L-n
am
eV
L
Sild
en
af i
lV
S
-1 0 0
-5 0
0
5 0
1 0 0
* *
Figura 29: Duração do efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PA, na presença de
atropina, L-NAME e sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m,
respectivamente. *p<0,05 (n=5).
Du
ra
çã
o d
o e
feit
o d
a A
O (
s)
AO
AO
At
AO
L
AO
S
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
*
V: veículo
AO: aceto-oxima
AOAt: AO na presença de atropina
AOL: AO na presença de L-NAME
AOS: AO na presença de sildenafil
VAt: V na presença de atropina
VL: V na presença de L-NAME
VS: V na presença de sildenafil
AO: aceto-oxima
AOAt: AO na presença de atropina
AOL: AO na presença de L-NAME
AOS: AO na presença de sildenafil
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
71
5.4 Estudo do efeito relaxante das oximas em traquéia isolada de cobaia
5.4.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na presença e
na ausência de epitélio funcional
A AO (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada
de cobaia pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de
19,3±1,4% e 32,7±3,9% (Figura 30) na presença e na ausência de epitélio funcional,
respectivamente. AO foi significativamente eficaz na ausência de epitélio.
AO (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de concentração, anéis
de traquéia isolada de cobaia pré-contraídos com CCh (10-6 M), atingindo um Emáx de
50,8±9,2%, na concentração de 10-4 M, na presença de epitélio funcional e
35,4±4,5% na ausência dele (Figura 31). Não houve diferença significativa em
relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO foi de 4,0±0,5 na
presença e de 3,7±0,9 na ausência de epitélio, não houve diferença significativa
entre esses valores.
5.4.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na
presença e na ausência de epitélio funcional
A AO+ (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada
de cobaia, pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de
36,3±2,4% e 20,7±6,1% (Figura 30) na presença e na ausência de epitélio funcional,
respectivamente. Não houve diferença significativa em relação à eficácia.
Adicionalmente, a AO+ (de 10-7 a 10-4 M) relaxou de maneira dependente de
concentração, anéis de traquéia isolada de cobaia pré-contraídos com CCh (10-6 M),
atingindo um Emáx de 73,0±5,2%, na concentração de 10-4 M, na presença de epitélio
funcional e 28,8±3,2% na ausência dele (Figura 31). AO+ foi significativamente
(p<0,05) eficaz na presença de epitélio.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
72
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO+ foi de 3,1±1,1 na
presença e de 4,0±0,5 na ausência de epitélio, esta oxima foi significativamente
(p<0,05) eficaz na presença de epitélio.
5.4.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na
presença e na ausência de epitélio funcional
A OS (Figura 3), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada
de cobaia, pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de
15,6±2,5% e 17,8±2,3% (Figura 30) na presença e na ausência de epitélio funcional,
respectivamente. Não ocorreu diferença significativa em relação à eficácia.
5.4.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na
presença e na ausência de epitélio funcional
O Pa (Figura 1), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada
de cobaia pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de
35,2±4,2% e 29,7±5,3% (Figura 30) na presença e na ausência de epitélio funcional,
respectivamente. Não ocorreu diferença significativa em relação à eficácia.
Adicionalmente, o Pa (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de
concentração, anéis de traquéia isolada de cobaia pré-contraídos com CCh (10-6 M),
atingindo um Emáx de 45,2±17,1%, na concentração de 10-4 M, na presença de
epitélio funcional e de 25,4±2,0% na ausência dele (Figura 31). Não houve diferença
significativa em relação à eficácia.
O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante do prenol acetilado foi de
0,9±0,0 na presença e de 3,8±0,7 na ausência de epitélio, não houve diferença
significativa entre esses valores.
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
73
Figura 30: Valores de Emax de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+), oxima substituída (OS)
e prenol acetilado (Pa) sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença e na
ausência de epitélio. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente;
p<0,05; (n=3 a 5).
Em
ax
(%
)
AO (E + ) AO (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
*
Em
ax
(%
)
AO + (E + ) AO + (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%
)
O S (E + ) O S (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Em
ax
(%
)
P a (E + ) P a (E -)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
74
Figura 31: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e prenol acetilado (Pa)
sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença (■) e na ausência (□) de
epitélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05
(teste “t”: E+ vs. E-; n=5).
lo g [A O ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O (E + )
A O (E - )
lo g [A O + ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O + (E + )
A O + (E - )
*
*
lo g [P a ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
P a (E + )
P a (E - )
5.3.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de traquéia isolada de cobaia
na presença e na ausência de epitélio
Em anéis de traquéia na presença de epitélio, concentração de 10-4 M, AO+ e
Pa foram significativamente (p<0,05) eficazes (Figura 32), enquanto que na ausência
dele, somente AO foi significativamente (p<0,05) eficaz (Figura 33). Já na aplicação
cumulativa (10-7 a 10-4 M), na presença de epitélio, apenas AO+ foi
significativamente (p<0,05) eficaz (Figura 34), e na ausência de epitélio, nenhuma
substância apresentou significância em relação à eficácia (Figura 35).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
75
Figura 32: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado
e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença de epitélio. As
colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05 (n=3).
Em
ax
(%
)
AO
(E
+)
AO
+ (
E+)
OS
(E
+)
Pa (
E+)
Veíc
ulo
(E
+)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
* *
Figura 33: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado
e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na ausência de epitélio. As
colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05 (n=3).
Em
ax
(%
)
AO
(E
-)
AO
+ (
E-)
OS
(E
-)
Pa (
E-)
Veíc
ulo
(E
-)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
*
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
76
Figura 34: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol acetilado (■) e veículo
(■) sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença de epitélio. Os símbolos
e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).
lo g [X ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O (E + )
A O + (E + )
P a (E + )
* V e íc u lo (E + )
Figura 35: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol acetilado (■) e veículo
(■) sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na ausência de epitélio. Os símbolos
e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente; (n=5).
lo g [X ] (M )
Re
lax
am
en
to (
%)
-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0
-4 0
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
A O (E - )
A O + (E - )
P a (E - )
V e íc u lo (E - )
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
77
DISCUSSÃO
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
78
6 DISCUSSÃO
No presente estudo foi possível observar o efeito relaxante, in vitro, da AO
(3-cloro-2-oxima-3-metilbutilacetato) (Figura 2) sobre a musculatura lisa de
vasos de condutância (aorta) e de resistência (mesentérica superior), bem
como um efeito hipotensor, in vivo, em ratos anestesiados. As evidências
farmacológicas dão suporte à hipótese que tais efeitos no sistema
cardiovascular se devem a doação de NO pela oxima, sendo o mecanismo de
sinalização celular relacionado à via do NO-GMPc-PKG. Vale ressaltar que o
atual trabalho é pioneiro na demonstração do efeito relaxante desta oxima, não
havendo outros relatos sobre tal atividade na literatura especializada.
Apesar deste ineditismo de AO, pesquisas com outras oximas
demonstraram atividade anti-inflamatória, anti-ulcerogênica, antiproliferativa
(ABDEL-AZIZ et. al., 2013), antiviral (SIN et. al., 2009) e anti-hipertensiva
(DANTAS et. al., 2014; JAROS et. al., 2007). Esta última foi investigado nesse
estudo.
Embora três oximas (AO, AO+ e OS) terem sido testadas, apenas a AO
demonstrou efeito significativo, sendo eficaz e possuindo maior potência, bem
como foi em aorta e mesentérica superior isoladas de rato, como podemos
comprovar pelas figuras 15, 17 e 20. Tal efeito foi semelhante apenas nos
vasos citados, uma vez que em traquéia isolada de cobaia, AO só foi eficaz na
concentração de 10-4 M (Figura 33), o que não se repetiu na aplicação
cumulativa (10-7 a 10-4 M) (Figura 35). Nesta última concentração, apenas AO+
apresentou eficácia (Figura 34), diferente do que foi observado em aorta e
mesentérica.
Diante do exposto, AO só foi eficaz em aorta na ausência de endotélio
funcional (Figuras 12 e 13), diferente do resultado em mesentérica, onde ela foi
eficaz tanto na presença quanto na ausência de endotélio (Figura 18). O que
também foi distinto em traquéia, em que AO só foi eficaz na ausência de
epitélio, quando aplicada na concentração de 10-4 M (Figura 33), sendo que
esse efeito não foi reproduzido na aplicação cumulativa (10-7 a 10-4 M) (Figura
35). Já na presença de epitélio, AO não foi eficaz em nenhuma concentração
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
79
(Figuras 32 e 34). Neste caso, dentre as oximas, apenas AO+ foi eficaz em
ambas as concentrações (Figuras 32 e 34), mas na concentração de 10-4 M, Pa
apresentou relaxamento semelhante a AO+. Portanto, AO foi independente de
epitélio, mas não apresentou efeito quando aplicada cumulativamente, e AO+
foi dependente de epitélio para promover broncodilatação. Já nos vasos, AO
demonstrou que seu efeito relaxante não depende dos fatores derivados do
endotélio.
Acredita-se que AO seja um doador de NO, pois pesquisas realizadas
com várias oximas indicam que elas são doadoras de NO, e seu efeito
relaxante está envolvido com a via do NO-GMPc e canais para K+ (ABDEL-
AZIZ et. al., 2013; DANTAS et. al., 2014; NAKAO et. al., 2013). Portanto, a
independência de endotélio já era esperada, uma vez que AO provavelmente
causa liberação de NO e não precisa da eNOS para formação do mesmo.
Como já foi observado, AO demonstrou eficácia em mesentérica tanto na
presença quanto na ausência de endotélio, mas em aorta isto só ocorreu na
ausência de endotélio. Esta diferença entre os resultados dos órgãos se explica
pelo fato da artéria aorta ser um vaso de condutância e a mesentérica de
resistência, uma vez que este último tipo é responsável por mais de 80% da
resistência do fluxo sanguíneo corporal, sendo fundamental para alterações na
RPT, e consequentemente na PA (QUEK et. al., 2016).
É importante mencionar que o Pa foi testado com intuito de observar se
as oximas, sintetizadas a partir dele (Figura 4), causavam relaxamento no
órgão pela liberação de NO, uma vez que o Pa não libera esse gás.
Com o intuito de embasar melhor a proposta de doação de NO pela AO,
seus efeitos foram comparados com os de alguns doadores de NO presentes
na literatura. Pesquisas in vitro em aorta, realizadas com nitroprussiato de
sódio (doador clássico de NO utilizado na clínica) apontaram um Emax de
101,2±2,8%, semelhante ao da AO, 100,0±13,2% (Figura 13). No entanto, em
relação à potência farmacológica, o nitroprussiato apresentou pD2 de
8.25±0.12 e a AO de 4,9±0,1, sendo menos potente que o primeiro (LIMA et.
al., 2014).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
80
Após comparar AO com outra oxima estudada por Dantas et. al. (oxima
S1), pode-se observar que AO relaxou, de maneira dependente de
concentração, os anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6
M), e apresentou Emáx de 50,0±10,8%, na presença de endotélio (Figura 13),
sendo inferior ao da oxima S1, que foi 80±15%. Já na ausência de endotélio,
AO demonstrou Emáx de 100,0±13,2% (Figura 13), semelhante ao da oxima S1
que obteve 94±4%. AO foi significativamente mais eficaz (p<0,05) na ausência
de endotélio, já a oxima S1 não apresentou diferença significativa em relação à
eficácia dela na presença e na ausência de endotélio, mostrando
comportamento semelhante em ambos os casos (DANTAS et. al., 2014).
Contudo, em anéis de mesentérica na presença de endotélio, AO
apresentou Emáx de 100,2±4,4% (Figura 18), semelhante ao da oxima S1 que
foi 98±1%. O mesmo ocorreu na ausência de endotélio, uma vez que a AO
obteve Emáx de 89,8±10,9% (Figura 18) e a oxima S1 de 100±1%. Portanto, AO
e oxima S1 não possuíram diferença significativa em relação à eficácia na
presença ou ausência de endotélio funcional (DANTAS et. al., 2014).
Outro doador de NO encontrado na literatura foi o nitrato ciclohexano
(HEX), que administrado cumulativamente (10-10 a 10-3 M) em mesentérica,
possuiu Emax, na presença de endotélio,de 67,0±2,8% enquanto AO (10-7 a 10-4
M) foi de 100,2±4,4% (Figura 18), que foi superior mesmo em menor
concentração. Entretanto, na ausência de endotélio, HEX atingiu Emax de
100,4±4,1% e AO de 89,8±10,9% (Figura 18), demonstrando semelhança em
seus resultados. Quanto a potência farmacológica, na presença de endotélio
funcional, HEX apontou um pD2 de 5,84±0,22 e AO de 4,9±0,1, enquanto que
na ausência de endotélio, o pD2 de HEX foi 5,11±0,12 e o de AO 5,1±0,2.
Portanto, na presença de endotélio AO foi mais eficaz que HEX, e na ausência
deste, ela apresentou eficácia e potência similares ao HEX, mas vale relembrar
que HEX foi administrado em maior concentração (MENDES-JÚNIOR et. al.,
2015).
Como as oximas, provavelmente, são doadoras de NO, este também
está envolvido em diversos processos fisiopatológicos do trato respiratório
(SILVA, 2014), por isso que as mesmas foram testadas tanto em vasos (aorta e
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
81
mesentérica) como em traquéia. Comparamos o Emax delas nos três órgãos, e
foi possível visualizar que AO possuiu maior eficácia na promoção de
vasorrelaxamento do que na de broncodilatação.
Com isto, experimentos in vivo foram realizados para analisar o efeito de
AO sobre os níveis pressóricos, cujos resultados demonstraram que ela
também é significativamente eficaz na redução da FC (Figura 21), PAS (Figura
22), PAD (Figura 23) e PAM (Figura 24). Esse efeito redutor da PA foi breve, ou
seja, rapidamente os níveis pressóricos retornaram ao normal. Sendo mais um
indício de doação de NO, uma vez que este é um gás, então a hipotensão se
inicia e termina velozmente.
Então, foi possível visualizar que AO foi eficaz tanto in vitro quanto in
vivo, semelhante aos resultados da oxima S1, formamidoxima, formaldoxima e
nitroprussiato de sódio, uma vez que o efeito destas substâncias ocorreu via
NO-GC (DANTAS et. al., 2014; JAROS et. al., 2007; LIMA et. al., 2014).
Foi visto que a PA pode ser calculada a partir da fórmula “PA = DC x
RVP”, portanto qualquer que seja a alteração no DC ou na resistência vai
promover modificação dos níveis pressóricos (LATERZA et. al., 2008). Como
AO provoca vasorrelaxamento, resultado visualizado nos experimentos in vitro
com aorta e mesentérica (Figuras 13 e 18), isto culmina na redução da RVP e
consequente redução da PA, como observado in vivo (Figuras 22, 23 e 24).
Com o intuito de investigar o mecanismo de ação da AO, foi observado
seu efeito hipotensor na presença da atropina, antagonista dos receptores
muscarínicos, o qual não foi alterado, isto confirma que seu relaxamento não
foi mediado pela ativação dos receptores muscarínicos (YOO et. al., 2015). Isto
foi semelhante a dois doadores de H2S (Na2S e NaHS), que também
promovem vasorrelaxamento, e a presença da atropina não atenuou seu efeito
hipotensor (YOO et. al., 2015).
Como já foi mencionado, pesquisas realizadas com várias oximas indicam
que elas são doadoras de NO, e seu efeito relaxante está envolvido com a via
do NO-GMPc e canais para K+ (ABDEL-AZIZ et. al., 2013; DANTAS et. al.,
2014; NAKAO et. al., 2013). Portanto, a AO foi investigada na presença de L-
NAME, inibidor da NOS, e o efeito redutor da PA não foi atenuado. Dessa
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82
forma observou-se que ela não depende da produção fisiológica de NO (YOO
et. al., 2015). O mesmo ocorreu com a formamidoxima (JAROS et. al., 2007) e
oxima S1, que também constataram ser independentes da NOS (DANTAS et.
al., 2014).
Então, para investigar se AO estava realmente envolvida com a
produção de GMPc, a mesma foi analisada após aplicação de sildenafil
(inibidor da fosfodiesterase 5), que impede a degradação do GMPc (JUPITER
et. al., 2015), com isso o período de duração do seu efeito sobre a PA foi
prolongado.
O sildenafil é bastante útil na disfunção erétil, segundo Jupter et. al,
Na2S é um doador de H2S e acredita-se que ele tenha atuação semelhante a
este fármaco. Na sua análise não ocorreu diferença significativa, em relação
aos níveis de pressão intracavernosa, do Na2S e do nitroprussiato de sódio
(doador de NO), uma vez que ambos atuam pela via do GMPc-PKG (JUPTER
et. al., 2015). Provavelmente, AO também é um doador de NO, e esse aumento
da duração do efeito hipotensor dela na presença do sildenafil, possivelmente
ocorreu pela produção de GMPc (induzida por AO) e pela inibição da
degradação dele (induzida por sildenafil), como o GMPc demorou para ser
metabolizado, devido a inibição da PDE5, o efeito hipotensor ocorreu por um
período maior.
De acordo com os resultados discutidos, é bastante provável que a AO
promova vasodilatação e redução da PA pela via do NO-GMPc, sendo um
doador de NO (ABDEL-AZIZ et. al., 2013; DANTAS et. al., 2014).
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respiratório
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83
CONCLUSÕES
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respiratório
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84
7 CONCLUSÕES
Diante dos resultados expostos no presente trabalho, foi possível concluir que
AO possui efeito tanto in vitro quanto in vivo, sendo a oxima mais eficaz e mais
potente. A mesma não depende da ativação dos receptores muscarínicos, nem da
produção fisiológica de NO, e aparentemente tem seu efeito dependente da doação
de NO, sendo uma oxima inédita na literatura.
Os resultados apresentados contribuíram para o estudo farmacológico das
oximas, sintetizadas a partir do prenol, na musculatura lisa. Entretanto outros
mecanismos precisam ser investigados para melhor elucidar sua sinalização celular.
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respiratório
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REFERÊNCIAS
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COM
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CLUSÕES
APÊNDICES
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respiratório
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Apêndice A – Artigo
Cardiovascular effects of two new oximes
(3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and
3-phenylamino-2-oxime-3-methylbutylacetate) in rats
Maria Alice Miranda Bezerra Medeirosa, Ayla Ribeiro Soaresb, Maíra Dias
Mangueira Bastosb, Jamile Morais de Albuquerquec, Jaknea dos Santos Leald,
Cleônia Roberta Melo Araújoe, Arlan de Assis Gonsalvesf, Darízy Flávia Silvag,
Raimundo Campos Palheta-Júniora, Luciano Augusto de Araújo Ribeiroa*
aPrograma de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido (PGRNSA),
Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-
205, Petrolina, PE, Brazil.
bCurso de Graduação em Farmácia, Universidade Federal do Vale do São
Francisco (UNIVASF), zip code 56304-205, Petrolina, PE, Brazil.
cCurso de Fonoaudiologia, Universidade Federal da Bahia, Av. Reitor Miguel
Calmon, S/n, zip code 41.100-110, Salvador, BA, Brazil.
dPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias do Semiárido,
Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-
205, Petrolina, PE, Brazil.
eColegiado de Ciências Farmacêuticas (CFARM), Universidade Federal do
Vale do São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-205, Petrolina, PE, Brazil.
fPós-Graduação em Ciências dos Materiais, Universidade Federal do Vale do
São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-205, Petrolina, PE, Brazil.
gUniversidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde, Departamento
de Biorregulação. Av. Reitor Miguel Calmon, S/n. Departamento de
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Biorregulação. zip code 41.100-110, Salvador, BA, Brazil.
*Corresponding author: Universidade Federal do Vale do São Francisco
(UNIVASF), Av. José de Sá Maniçoba, S/Nº, Campus Centro, P.O. Box 252,
CEP: 56.304-205, Petrolina-PE, tel.: +55-87-2101-6862, fax. +55-87-3862-
6974. E-mail address: [email protected] (Luciano A. A. Ribeiro).
Abstract
Some oximes are already considered new NO donors, being proven its
relaxing effect of smooth muscle and its action related to the NOsGC-cGMP pathway.
The main objective of this study was to evaluate the relaxant effect in vitro of two new
oximes (3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-oxime-3-
methylbutylacetate) in aorta and mesenteric vessels and the effect of the 3-chloro-2-
oxime-3-methylbutylacetate on arterial pressure, in vivo.
The two oximes promoted vasodilation in an endothelium independent
manner. The 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime also reduced heart rate
and arterial pressure. Its hypotensive effect was not attenuated by atropine or L-
NAME treatments. However, the hypotension effect was increased with sildenafil
addition. Thus, the AO may be a new NO donor, their activity is related to the way of
the NO-sGC-cGMP signally.
Keywords: oximes; NO-donor; vasorelaxant effect; hypotensive effect; NO-
dependent effects.
1. Introduction
Hypertension has been identified as a major trigger for other cardiovascular
diseases and lately it is believed that the vascular endothelial dysfunction is crucial in
the development and maintenance of hypertension (Tanaka and Minamino, 2015;
Gkaliagkousi et al., 2015; Bohlen, 2015).
Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e
respiratório
2016
98
The endogenous production of nitric oxide (NO), acts directly on soluble
guanylyl cyclase (sGC), leading to an increase in guanosine 3,5-cyclic
monophosphate (cGMP) concentration and subsequent activation of
cGMPdependent protein kinase (PKG), which triggers the phosphorylation of various
proteins that promote a pivotal role in many physiological processes, such as
vasorelaxation (Walter, 1989). Therefore, impairment on the NO production or
reduction its half-life can lead to various pathophysiological events, such as arterial
hypertension (Gkaliagkousi et al., 2015; Boger, 2003; Hornyak et al., 2011).
NO-based therapies has potential for the treatment of various cardiovascular
diseases, as has been described for portal hypertension (Fiorucci et al., 2004), in
myocardial protection from surgical ischemic-reperfusion injury (Vinten-Johansen,
Sato, Zhao, 1995), pulmonary hypertension (Fan and Du, 2004), erectile dysfunction
(Ferro, 2006), angina and coronary syndromes (Rajpurohit et al., 2015).
Indeed, NO donors, such as sodium nitroprusside, nitroglycerine, hydralazine
and isosorbide dinitrate are routinely used for the control and treatment of some of
cardiovascular diseases, including hypertension (Loskove and Frishman, 1995;
Popovic et al., 2005; Yiginer et al., 2015).
The increased interest on the physiological role of NO in the homeostatic
control of the cardiovascular system has been accompanied by even greater interest
in development of new NO donors, principally when occur a decrease in the
production of NO or NO synthase (NOS) activity leads to endothelial dysfunction,
which can be detected in heart failure and hypertension (Wong et al. 2010; Schulz et
al., 2008).
In these cases, they are being researches with NO donor molecules for
restoring NO deficiency, such as nitroglycerin and oximes, which do not need
endothelium participation to release NO (Dantas et al., 2014; Veras et al., 2013;
Chalupsky et al., 2004). The oximes, such as pralidoxime and obidoxime, have been
originally designed as therapeutic agents used in the clinical treatment of
organophosphorus compounds poisoning by being able to reactivate the inhibited
acetylcholinesterase (Buckley et al., 2011; van Helden et al., 1996; Jokanovic, 2012).
As recently has been describle a potential of oximes on the vasorelaxation of rodents
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trhought NO/sGC/PKG pathways (Dantas et al., 2014; Veras et al., 2013; Chalupsky
et al., 2004), they were tested.
In this work, the effects of two new oximes (3-chloro-2-oxime-3-
methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-oxime-3-methylbutylacetate) were
investigated on the cardiovascular system, through in vitro and in vivo approaches,
along with the possible NO-sGC-cGMP pathway that underlies the effects of
compound with more activity (eficacy and potency).
2 Material and methods
2.1 Chemicals and drugs
The following oximes were used: ethanoate 3-methyl-but-2-entile (referred
here as Pa), 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate (referred here as AO), 3-chloro-
2-oxime-3-methylbutylacetate activated by heating (40°C for 30 min; referred here as
AO+) and 3-phenylamino-2-oxime-3-methylbutylacetate (referred here as OS). The
oximes were synthesized in the General Chemistry Laboratory of the Federal
University of São Francisco Valley (UNIVASF). The phenylephrine (PE),
acetylcholine (ACh), atropine, Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), TWEEN®
80 and urethane were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and
sildenafil citrate that was gift from Pfizer Inc. (Sandwich, Kent, UK). All salts for the
Krebs’ solution were purchased from Vetec (São Paulo, SP, Brazil).
2.2 Preparation of oximes solutions
In the in vitro experiments, all oximes were dissolved into DMSO. The DMSO
concentration never exceeded 5% (v/v) into the organ chamber. However, in the in
vivo experiments, AO was dissolved in a solution composed by 12% of DMSO, 3% of
TWEEN® 80, 12% of distillated water, and 73% of saline.
2.3 Animals and ethic aspects
Male Wistar rats (weighing 250-350 g) were obtained from the Central
Bioterium of UNIVASF. They were housed in a controlled temperature room (22 ±
1°C) under a 12/12 h light/dark cycle and free access to food and water until the day
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of the experiment. All experiments were performed in accordance with local ethics
committee (CEDEP-UNIVASF), under approval code CEDEP/UNIVASF-
0002/180615, and following the National Council for Animal Experiments Control
(CONCEA) guidelines.
2.4 In vitro studies: preparation of the rat aortic and mesenteric rings
The rats under anesthetic effect were sacrificed through exsanguination. The
thoracic aorta and superior mesenteric arteries were carefully excised and placed in
Krebs’ salt solution, with the following composition: 118 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 5.7
mM MgSO4.7H2O, 1.1 mM NaH2PO4.H2O, 2.5 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 11 mM
glucose. The pH was adjusted to 7.4 by HCl addition. The aorta/mesenteric
immersed in Krebs’ solution was continuously bubbled with a 95% O2 and 5% CO2
gas mixture (carbogen). The aorta/mesenteric was cutted into rings (3-5 mm long),
which were immersed in water-jacketed organ-baths containing 10 mL of Krebs’
solution at 37 °C and bubbled with carbogen mixture. The aortic/mesenteric rings
were mounted between two L-shaped stainlesssteel hooks, with one end fixed in
place and the other end attached to a force transducer (TRO015, Panlab®,
Barcelona, Spain), which was coupled to an bridge system amplifier (Model 321,
Insight Instruments, São Paulo, SP, Brazil) and connected to an computer running
WinDaq software (DATAQ Instruments, Akron, OH, USA). The aortic/mesenteric
rings were allowed to stabilize for 60 min at a preload tension of 1 gF (baseline).
During the resting period, the Krebs’ solution was changed every 15 min to avoid
accumulation of metabolites. For some experimental protocols, the endothelium was
removed by gently rubbing the luminal surface of the ring with a cotton-stick swab.
2.5 In vivo studies: blood pressure and heart rate protocols on anesthetized rats
After a 60 min stabilization period, the aortic/mesenteric rings were contracted
by 0.3 µM PE and the isometric tension was recorded. When a stable contraction
was reached (plateau was reached in approximately 15-20 min) 1 µM ACh was
added to the organ bath to confirm the presence/absence of endothelium (Furchgott
and Zawadzki, 1980). After a second PE-induced contraction, a single concentration
(10-4 M) or cumulative concentrationresponse curves to the oximes (10-7 to 10-4 M)
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101
were performed. In addition, the relaxing effect of the vehicles used to dissolve the
oximes was determined.
The animals were then isolated in Bollman's cages and fasted for 16 h with
free access to a water. Next, the rats were anesthezied with 1.2 g/kg urethane (i.p.)
and fitted with polyethylene cannula inserted into the carotid artery and jugular vein.
Their arterial cannulae were connected to blood pressure transducer coupled to a
digital acquisition system (PowerLab/8SP, AD Instruments, Bella Vista, NSW,
Australia) for the continuous recording of systolic arterial pressure (SAP), diastolic
arterial pressure (DAP) and mean arterial pressure (MAP), and the jugular catheter
was utilized for pharmacologic treatments. Mean arterial pressure (MAP) was used to
characterize vasoactive effects of examined acetone oxime. Blood pressure effects
of examined AO oxime were studied in diferent conditions: (1) rats free of any drug
(control); (2) rats with an acute blockade of muscarinic receptors by i.v. injection of
0.5 mg/kg atropine (10 min prior to the experiment); (3) rats with an acute blockade
of NO synthase elicited by i.v. injection of 3 mg/kg L-NAME (10 min prior to the
experiment); and (4) rats with an acute blockade of phosphodiesterase by i.v.
injection of 0.5 mg/kg sildenafil citrate (10 min prior to the experiment). Each
experiment started with the recording of basal blood pressure values for at least 30
min. Thereafter, the AO oxime of interest were given intravenously at 5 min intervals
to construct their cumulative dose-response curves (1, 5, 10, 20, 50, 100 e 250 µg by
i.v. administration) of blood pressures and heart rate measurements. On the
protocols in the presence of blockers/inhibitors, the AO oxime was administered
intravenously at a single dose of 20 µg.
2.6 Statistical analysis
The data are presented as mean ± S.E.M or pD2 ± S.E.M, were pD2 is the
negative log of the concentration that produces a response which is 50% of the
maximum response (-log[EC50]), being a measure of agonist potency. The pD2
values were determined by non-linear regression from the dose-response curves.
Differences between means were statisticaly evalued by Student’s t-test or ANOVA
followed by Dunnett post-hoc test, when it was appropriate, and differences with
calculated p value of less than 0.05 (p<0.05) were considered statisticaly significant.
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All statistical analyses were performed in GraphPad Prism© 6.0 (GraphPad Software
Inc., San Diego, USA).
3 Results
In aortic rings pre-contracted by PE, the AO, AO+ and OS oximes had a
concetration-dependent (from 10-7 to 10-4 M) relaxant effect both in the presence and
absence of endothelium (Fig. 1). Among the oximes tested, AO was the more
effective and potent in to relax the aortic rings, with an Emax=100.0±13.2% and
pD2=4.1±0.1 in the presence of endothelium than in the absence of endothelium
(Emax=50.0±10.8% and pD2=4.9±0.1) (Fig. 1A). Despite that, AO+ and OS also
relaxed the aortic rings in the concentration-dependent manner, with a full relaxation
effect attained at 10-4 M (Fig. 1B and C), although the AO+ Emax was of 40.0±12,5%
and 42.7±10.9% in aortic rings with and without endothelium, respectively. For the
AO+ pD2 values was 4.4±0.1 and 4.1±0.1 in aortic rings with and without
endothelium, respectively. The OS oxime had an Emax and pD2 (Fig. 1C) in the
presence (47.0±7.5% and 4.6±0.6, respectively), and in the absence of endothelium
(40.3±10.5% and 4.7±0.4, respectively). There were no significant differences either
between these values of Emax or pD2 for AO+ and OS.
Since the compound 3-methyl-but-2-entile (Pa) was the precursor to the
synthesis of 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate (AO) (see Supplementary
Material for molecular formulas and synthesis diagram) was investigated its relaxing
effect on the aortic and mesenteric rings, in precense and absence of endothelium.
The administration of 10-4 M of Pa showed an inexpressive relaxing effect (less than
10%) in both the presence and the absence of the endothelium (data not shown).
Similarly, the DMSO 5% (v/v) had a small (less than 15%) relaxant effect on aortic
and mesenteric rings regardless of the presence of endothelium (data not shown).
In the mesenteric rings, AO, AO+ and OS oximes presented a relaxant effect
in both, with and without endothelium rings, in the concentrationdependent manner
(into a range of 10-7 to 10-4 M; see Fig. 1D, E and F). The Emax values of AO, AO+
and OS on mesenteric rings with endothelium were (100.2±4.4%, 80.8±6.2% and
52.0±4.3%, respectively) and without endothelium (89.8±10.9%, 67.2±10.3% and
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68.8±5.7%, respectively. The pD2 values of AO, AO+ and OS on mesenteric rings
with endothelium were (4.9±0.1, 4.8±0.2 and 4.3±0.2 respectively), and without
endothelium (5.1±0.2, 4.8±0.3 and 4.4±0.1, respectively). Comparing the values Emax
and pD2, the AO oxime is more effective (p<0.05) than AO+ and OS, however all
oximes has the same potency in to relax the rings of mesenteric, regardless of the
presence or absence of endothelium.
The compound Pa was also tested in mesenteric rings and unlike what
occurred on aortic rings it presented a relaxant effect (in a concentrationdependent
manner). There are no significant differences between that values Emax of compound
Pa on mesenteric rings with endothelium (68.5±5.3%) and without endothelium
(54.8±11.2%), as well as pD2 values (4.7±0.3, and 3.9±0.5, respectively).
In vivo assessment, the AO diminish the SAP, DAP (Fig. 2), as well as heart
rate (HR) and MAP, it was observed after the i.v. treatment with AO ranging from 1
up to 250 μg (Fig. 3). The reduction of the blood pressure (Fig. 4A) and HR had a
fast onset and was short-lived (89.8±11.5 s). The HR was significantly decreased
after the treatment with 1, 10, 20, 50, 100, and 250 µg of AO (Fig. 3A) while SAP and
DAP were significantly decreased after the treatment with 20, 50, 100 and 250 µg
(Fig. 2A and B). Moreover, from 10 up to 250 µg doses was observed an outstanding
reduction of MAP from19 to 38 mmHg (Fig. 3B).
The reductions of SAP (Fig. 5A), DAP (Fig. 5B), MAP (Fig. 5C) and HR values
(Fig. 5D) in response to administration of AO (20 µg, i.v.) were not significantly
changed after treatment with atropine (0.5 mg/Kg) or L-NAME (3 mg/kg). However,
the treatment with sildenafil (0.5 mg/Kg, i.v) significantly enhance (over 2-fold) the
effect of AO on SAP (-20.5±3.5 to -42.7±4.3 mmHg), DAP (-18.2±5.2 to -41.0±4.6
mmHg) and MAP (-19.7±4.6 to -42.6±3.8 mmHg), except for HR, as can be seen in
Fig. 5. Further, the duration of effect of AO on MAP level was significantly increased
(from 89.8±11.5 s to 208.5±20.3 s), in the presence of sildenafil (Fig. 6).
4 Discussion
The findings from this study shows relaxing effect of AO (3-chloro-2-oxime-3-
methylbutylacetate) on the conductance (aorta) and resistace arteries (mesenteric) in
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vitro, as well as AO diminish arterial pressure and heart rate on anesthetized rats.
The pharmacological evidences supports the hypothesis that more effects on the
cardiovascular system are due to the NO-donation by oxime and the cellular
signaling mechanism related to the NOsGC-GMPc pathway. It is noteworthy that the
current research is a pioneer in the demonstration of the relaxing effect of this oxime,
with no other reports of such activity available in the literature.
The term oxime results from the union of the words oxygen and imine,
discovered in the mid-nineteenth century. They are organic compounds whose
general formula is RR'C=NOH, where R is an organic substituent and R' may be
hydrogen or other organic group (Pratt et al., 2004).
Many oximes have shown biologic effects such as anti-inflamatory activity,
anti-ulcer, antiproliferative (Abdel-Aziz et al., 2013), antiviral (Sin et al., 2009),
vasorelaxant effect (Veras et al., 2013) and anti-hypertensive (Dantas et al., 2014;
Jaros et al., 2007). It is well accepted that oximes have some of their biological
effects explained by their potential to donate NO by the catalysis of its C=NOH group
(Abdel-Aziz et al., 2013). In biological systems, the synthesis of NO is linked to
reaction of L-arginine with O2 catalyzed by one of the NOS isoforms. The reaction
occurs in two stages, the first one consisting in the Nhydroxylation of guanidine group
of L-arginine, leading to formation of N- hydroxy-L-arginine (L-NOHA), and the
second one is the catabolism of C=NOH group of L-NOHA into L-citrulline and NO.
Besides of NOS, other enzymes, such as microsomal cytochromes P450 and
peroxidases, may also catalyze the release of NO from groups C=NOH (Chalupsky
and Cai, 2014; Chalupsky et al., 2004).
It was demonstrated the vassorexant effect of two oximes (AO and OS) and
AO activated by heating (AO+) in the aorta and mesenteric vessels (Fig. 1). AO
presented itself as the most effective and potent as well as it was the only oxime that
has demonstrated a differentiated action in rings with and without endothelium, at lest
in rat aorta. In aortic ring in the absence of endothelium AO was about 2-fold more
effective than in presence of endothelium and approximately 10-fold more potent (Fig
1A).
There are reports that oximes had its relaxing effect increased after the
removal of the vascular endothelium and, by the other hand, some oximes had its
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105
effects independently on the vascular endothelium (Stepanovic-Petrovic et al, 2004,
2010; Veras et al., 2013). This discrepancy seems to be justified by tissue and/or
species differences (Vetrovský et al., 2002).
In a similar study, a new oxime derivated from lapachol was more effective
and potent in relaxing rat aorta rings without endothelium than those with
endothelium (Dantas et al., 2014). Another example was found to cyclohexane
nitrate, an oxime that also proved to be more effective and potent in relaxing rings
devoid of vascular endothelial (Mendes-Júnior et al., 2015). Furthermore, not only
oximes exhibit this pattern, but also other NO donors such as sodium nitroprusside
(SNP) has its effects markedly augmented and prolonged by endothelium removal
(Iwatani et al., 2007).
Despite the different effect presented by AO in the aorta, with respect to
vascular endothelium, AO demonstrated similar efficacy and potency in rat
mesenteric rings in the presence and absence of endothelium (Fig. 1D), showing a
marked difference between the action in these two different types of arteries. As
might be expected, some differences are found when comparing to relaxation
response of substances in the aorta and mesenteric, especially regarding the
presence and absence of endothelium (Greenberg et al., 1991; Adegunloye and
Sofola, 1997; Oliva et al., 1984), what could explain the fact that AO effect be
different on aorta and mesenteric vessels.
Since AO had a more effective vasorelaxant effect on rat aortic and
mesenteric rings, in vivo experiments were performed to investigate its effect on
blood pressure and heart rate. The results showed that AO, in a dosedependent
manner (1 to 250 µg) significantly reduced the SAP, DAP (Fig. 2), HR and MAP (Fig.
3).
Studies conducted with many oximes indicate they potential as NO-donors,
where vasorelaxing effects, by means of activation of NO-cGMP-PKG pathway, could
explain changes in blood pressure (Abdel-Aziz et al., 2013; Dantas et al., 2014).
Besides, the fast onset and short-lived effect of AO on MAP and HR it is typical for a
NO-donor (Maliszewska-Scislo et al., 2008).
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106
Therefore, to access the role of NO-sGC-cGMP pathway in the hypotensive
effect of AO, were performed experiments using atropine (a muscarinic antagonist),
L-NAME (the NOS inhibitor), and sildenafil (selective PDE5 inhibitor).
In this work, it was observed that neither atropine (Fig. 4B) or L-NAME
significantly alter the AO effect on SAP, DAP, HR or MAP parameters, indicating that
neither the activation of endothelial M3 receptor or the endogenous production of NO
by eNOS enzyme are involved in the hypotensive effect of AO. Similar results can be
found for other oximes, such as formamidoxime (Jaros et al., 2007) and S1 oxime
(Dantas et al., 2014), thus the hypothesis the vasorelaxation activity by oximes, such
as AO oxime, due to the directly NO-donation here are reinforced.
The involvement of NO pathways in the present effects is supported by
sildenafil treatment significantly increases the AO effects on SAP (Fig. 4C), DAP and
MAP (Fig. 5) as well as the length of effect (Fig. 6), indicating that increased cGMP
levels could be involved in the hypotensive effect and corroborating the presented
hypothesis of NO donation with consequent activation of the sGC-cGMP pathway. In
many studies sildenafil, as well as other PDE inhibitors, is used as a tool to confirm
involvement of NO-sGC-cGMP signaling pathway on effect of many vasoactive and
hypotensive drugs (Goulopoulou et al., 2015; Wang et al., 2013; Caremel et al.,
2010).
The vascular relaxation induced by NO-sGC-cGMP pathway is associated with
differents intracelullar events, such as a decrease in cytosolic Ca2+ concentration, the
activation of different potassium channels, decreased inositol 1,4,5-trisphophate (IP3)
production and closure of voltage-dependent L-type Ca2+ channels (L-type Cav)
(Chadha et al., 2008). In this sense, further studies should be focused on molecular
mechanism of cardiovascular effects due to AO.
In conclusion, the present study demonstrates pharmacological evidence that
the 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime (AO) has its vasorelaxant and
hipotensor effect possibly explained by its ability to donate NO and subsequently
activate the sGC-cGMP signaling pathway.
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Acknowledgments
The authors would like to thanks to CAPES by granting scholarship and to
UNIVASF by the technical and financial support to this work. We would like to also
thank to Pedro G. S. Sá by improvements in the manuscript.
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Fig. 1. Concentration-response curves showing the vasorelaxant effect of AO, AO+
and OS oximes on aortic (A, B, C) and mereseteric (C, D, F) rings with (filled
symbols) and without (hollow symbols) endothelium (n=6). The vasorelaxant effect of
oximes was expressed as reverse percentage of maximal tension attained in PE-
induced contractions. The symbols and vertical bars showed in the figure represent
the means and SEM, respectively. *p<0.05 (with vs. without endothelium: Student’s t
test).
Fig. 2. Concentration-response curves showing the effect of AO () and vehicle ()
on the systolic blood pressure (SAP, A) and diastolic blood pressure (DAP, B) on
anesthetized rats (n=5). The effect of AO was expressed as pressure variation (in
mmHg). The symbols and vertical bars showed in the figure represent the means and
SEM, respectively. *p<0.05 (AO vs. vehicle: Student’s t test).
Fig. 3. Concentration-response curves showing the effect of AO () and vehicle ()
on heart rate (HR, A) and mean arterial pressure (MAP, B) on anesthetized rats
(n=5). The effects of AO were expressed as beats per minute (bpm) on HR or as
expressed as pressure variation (in mmHg) on MAP. The symbols and vertical bars
showed in the figure represent the means and SEM, respectively. *p<0.05 (AO vs.
vehicle: Student’s t test).
Fig. 4. Original records oh the hypotensor effect of sequential administration of AO
(A), the effect of AO (20 µg) in the absence or presence of atropine (B) and the effect
of AO (20 µg) in the absence or presence of sildenafil (C) on anesthetized rats.
Fig. 5. Effect of AO (20 µg) on the systolic blood pressure (SAP, A) and diastolic
blood pressure (DAP, B), mean arterial pressure (MAP, C) and heart rate (HR, D) in
absence and presence of atropine, L-NAME and sildenafil on anesthetized rats (n=5).
The effects of AO were expressed as pressure variation (in mmHg) or beats per
minute (bpm). The columns and vertical bars showed in the figure represent the
means and SEM, respectively. *p<0.05 (AO vs. AO+Atropine/L-NAME/Sildenafil:
One-Way ANOVA followed by Dunnett’s post-test).
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Fig. 6. Duration of AO (20 µg) effect on the mean arterial pressure (MAP) on
anesthetized rats in absence and presence of atropine, L-NAME and sildenafil (n=5).
The duration effects of AO was expressed as time (in seconds). The columns and
vertical bars showed in the figure represent the means and SEM, respectively.
*p<0.05 (AO vs. AO+Atropine/L-NAME/Sildenafil: One-Way ANOVA followed by
Dunnett’s post-test).
Professor F.P. Nijkamp
Editor in Chief of European Journal of Pharmacology
Feb 29th, 2016
Dear Professor F.P. Nijkamp,
Please find enclosed our manuscript entitled "Cardiovascular effects of two new
oximes (3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-oxime-3-
methylbutylacetate) in rats" by Medeiros et al., which we would like to submit for
publication as a ‘Research Paper’ in European Journal of Pharmacology. In this work
the relaxant effects of 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-
oxime-3-methylbutylacetate were investigated on rat isolated aortic and mesenteric
rings and the effect of 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate was also investigated
in the blood pressure and heart rate protocols on anesthetized rats. In this work was
demonstrated that the two new oximes promoted vasodilation effect, in an
endothelium independent manner, of both aortic and mesenteric rings. Besides that,
the 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime also reduced heart rate and arterial
pressure on anesthetized rats and its hypotensive effect was not attenuated by
atropine or L-NAME treatments.
However, the hypotensive and bradycardic effects were significantly increased
after sildenafil treatment. Based on these facts, we rise the hypothesis that the at
least 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime may be a new NO donor and their
activity is related to the NO-sGC-cGMP signally pathway.
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We confirm that this manuscript has not been published elsewhere and is not
under consideration by another journal. All authors have approved the manuscript
and agree with submission to European Journal of Pharmacology.
The authors have no conflicts of interest to declare.
Please address all correspondence to:
Luciano A. A. Ribeiro, Ph.D.
Cover Letter
Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF)
Colegiado de Ciências Farmacêuticas (CFARM)
Av. José de Sá Maniçoba, Campus Centro, Caixa Postal 252,
56.304-205, Petrolina-PE, Brazil.
Phone: +55-87-2101-6862/Fax.: +55-87-3862-6974
e-mail: [email protected]
We shall look forward to hearing from you at your earliest convenience.
Yours sincerely,
Ribeiro, Luciano (PhD)
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Apêndice B – Participação de eventos
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Apêndice C – Participação da comissão organizadora de evento
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Apêndice D – Participação de evento como palestrante
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Apêndice E – Participação de evento como avaliador de trabalho científico
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Apêndice F – Resumos apresentados em eventos
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ANEXOS
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ANEXO A