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0 DAFNE QUINTAS WASZAK ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA) BENZO(A)PIRENO CANOAS, 2010
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DAFNE QUINTAS WASZAK
ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE
BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM
HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA)
BENZO(A)PIRENO
CANOAS, 2010
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DAFNE QUINTAS WASZAK
ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE
BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM
HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA)
BENZO(A)PIRENO
Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La salle – Unilasalle como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química.
Orientação: Prof. Dr. Delmar Bizani
Co-Orientação: Profª Dra. Ana Cristina Borba da Cunha
CANOAS, 2010
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DAFNE QUINTAS WASZAK
ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE
BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM
HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA)
BENZO(A)PIRENO
Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química do Centro Universitário La salle - Unilasalle.
Aprovado pelos avaliadores em 9 de Dezembro de 2010.
_______________________________________________
Prof. Dr. Delmar Bizani
Unilasalle.
________________________________________________
Profª Dra. Ana Cristina Borba da Cunha
Unilasalle.
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Aos meus pais, Robson e Mônica, eternos
e incansáveis incentivadores, pelo que
sou e realizo, simplesmente.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela minha vida, por estar sempre ao meu
lado me iluminando.
Ao meu pai Robson, sem ele com certeza eu não chegaria aqui. Pai, obrigada
pelo “paitrocínio”, pelo apoio, por todas as caronas de volta para a casa depois das
aulas, inverno, verão, sempre esteve presente nesta jornada! Te amo demais.
Agradeço à minha mãe Mônica, pela minha educação, pelo incentivo para o
estudo, pelo carinho, dedicação, “puxões de orelha”, paciência, e principalmente
pelo amor de mãe sempre presente. Te amo demais, obrigada!
Agradeço aos meus familiares que me ajudaram nesta jornada, principalmente
minhas avós, Marise e Elza, sempre presentes em minha vida, grandes
incentivadoras. Vó Marise, obrigada por tudo que tens feito por mim neste momento
decisivo, a Sra. Também faz parte dessa conquista.
Agradeço ao meu namorado Márcio por todo o carinho, atenção, paciência e
incentivo, por estar sempre ao meu lado.
Agradeço aos meus amigos que estiveram comigo nesta fase, ouviram minhas
angústias, meus medos, e sempre estiveram ao meu lado dando muita força.
Agradeço aos meus colegas de faculdade que se tornaram amigos também,
hoje fazem parte desta jornada, obrigada pelo apoio, pela ajuda no estudo, pela
parceria sempre.
Meus agradecimentos especiais por este trabalho são para as pessoas que
foram fundamentais. Agradeceria em inúmeras linhas por todo o tempo dedicado a
minha pessoa. Obrigada de coração por tudo! São eles:
Meu orientador Prof. Delmar, por todo o conhecimento passado de
microbiologia desde o estágio até a conclusão deste trabalho. Agradeço por toda a
dedicação na minha metodologia, pelo apoio e incentivo.
À co-orientadora Profª. Ana, presente desde o início da minha vida acadêmica.
Agradeço imensamente pela dedicação ao meu trabalho, pela sugestão do tema,
constante motivadora.
Ao Matheus, parceria de pesquisa, colega de curso, uma “pessoinha”
maravilhosa que me ajudou muito, esteve presente em todas as etapas no
laboratório. Obrigada por tudo querido!
5
Agradeço também ao Jéferson, aluno do mestrado, que esteve presente
durante toda a metodologia. Obrigada pela ajuda!
À Priscila, por todo o material concedido, pela disponibilidade no início da
pesquisa, você foi o ponto de partida. Obrigada Pri!
À Jéssica, técnica do laboratório de química, por todas as dicas, ajuda em
qualquer dúvida. Obrigada!
Aos professores, pela minha formação e por todo o conhecimento transferido.
Agradeço a todos que colaboraram de forma direta ou indireta para que este
trabalho pudesse ser concluído.
Obrigada a todos pela atenção e paciência, e pelo tempo a mim dedicado.
6
“Determinação, coragem e auto confiança são fatores decisivos para o sucesso. Se estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los. Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de orgulho.”
(Dalai Lama)
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RESUMO
Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos mutagênicos e
carcinogênicos aos humanos e aos animais que são introduzidos no ambiente em
grandes quantidades devido às atividades relacionadas à extração, ao transporte, ao
refino, à transformação e à utilização do petróleo e de seus derivados. Apesar disso,
a grande maioria dos microorganismos do solo não possui a capacidade de
degradá-los, o que resulta na sua acumulação no ambiente e na conseqüente
contaminação dos ecossistemas. Uma estratégia para eliminação dos HPAs do solo
é através da biorremediação, na qual os microorganismos que apresentam a
capacidade de metabolizar estes compostos irão transformá-los em substâncias
inertes, CO2 e água. O presente trabalho apresenta uma proposta para
biorremediação de um solo inerte contaminado com o benzo(a)pireno, o qual
apresenta um elevado grau de toxicidade. Após a contaminação, o solo foi
submetido a análises físicas e químicas para caracterização e determinação do
ponto de partida, foram realizadas análises microbiológicas para monitoramento do
crescimento microbiano, no qual o benzo(a)pireno foi monitorado quantitativamente.
Palavras-chave: Biorremediação. HPAs. Benzo(a)pireno.
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ABSTRACT
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are mutagenic and carcinogenic and
compounds to the humans and animals released through the environment buy
anthropogenic activities related to the extraction, transport, refine, transformation and
use of the petroleum and its derivatives. Most of the soils microorganisms do not
possess the capacity to degrade them, which results in its accumulation in the
atmosphere and contamination of the ecosystems. A strategy for PAHs elimination
from the soil is through the bioremediation, where microorganisms having capacity to
metabolize these compounds will transform them in inert substances, CO2 and water.
This paper presents a proposal bioremediation of soil inert contaminated with
benzo(a)pyrene, wich has a high degree of toxicity. After contamination, the soil was
subjected to physical and chemical characterization and of determining the starting
point, were analyzed for microbiological monitoring of microbial growth, in which
benzo(a)pyrene was monitored quantitatively.
Keywords: Biodegradation. PAH's. Benzo (a) pyrene.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................11
2 HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAs) ..........................13
2.1 Fontes de emissão de HPAs ............................................................................15
2.2 Propriedades físico-químicas ..........................................................................15
2.3Toxicidade ...........................................................................................................16
2.4 Rota dos HPAs no meio ambiente ...................................................................17
2.5 Benzo(a)pireno ..................................................................................................18
2.6 Legislações ........................................................................................................19
2.6.1 NBR 10.004......................................................................................................19
2.6.2 Environmental Protection Agecy (EPA) ............................................................20
3 BIODEGRADAÇÃO ...............................................................................................21
3.1 Fatores físico-químicos que influenciam o proce sso de biodegradação ....21
3.1.1 Receptores de elétrons ....................................................................................22
3.1.2 Nutrientes .........................................................................................................23
3.1.3 Água .................................................................................................................23
3.1.4 pH.....................................................................................................................24
3.1.5 Temperatura.....................................................................................................24
3.1.6 Solo ..................................................................................................................25
3.2 Biodegradação de HPAs ...................................................................................25
4 BIORREMEDIAÇÃO ..............................................................................................27
4.1 Fatores ambientais que influenciam a biorremedi ação dos HPAs no solo .28
5 MICROBIOLOGIA ..................................................................................................31
5.1 Microbiologia do solo .......................................................................................31
5.2 Crescimento Microbiano ...................................................................................34
5.3 Microrganismos degradadores de HPAs ........................................................34
5.4 Bactérias do solo ..............................................................................................36
5.4.1 Bacillus spp ......................................................................................................37
5.4.2 Pseudonomas spp............................................................................................38
5.4.3 Serratia marcescens.........................................................................................39
5.5 Fungos do solo ..................................................................................................40
5.5.1 Candida albicans ..............................................................................................41
10
5.6 Metabolismo microbiano na presença de HPAs .............................................43
6 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROSCOPIA DE MASSAS ...47
6.1 Cromatografia gasosa .......................................................................................47
6.1.1 Análise Quantitativa .........................................................................................48
6.1.1.1 Calibração com padrões................................................................................48
6.2 Método do padrão interno ................................................................................49
6.3 Espectroscopia de massas ..............................................................................49
7 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................52
7.1 Preparação e contaminação do solo ...............................................................53
7.2 Medição e redução do pH .................................................................................53
7.3 Planejamento fatorial ........................................................................................55
7.4 Preparação dos meios de cultura e inoculação do s microrganismos .........56
7.5 Incubação dos microrganismos ......................................................................57
7.5.1 Preparação dos frascos....................................................................................57
7.5.2 Preparação das amostras ................................................................................58
7.5.3 Incubação.........................................................................................................59
7.5.4 Incubação das amostras ..................................................................................61
7.6 Contagem dos microrganismos .......................................................................62
7.7 Quantificação Benzo(a)pireno ..........................................................................67
8 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................68
9 CONCLUSÃO ........................................................................................................71
REFERÊNCIAS .........................................................................................................72
ANEXO A – Resultado quantificação inicial ..........................................................75
ANEXO B – Cromatograma da quantificação inicial ............................................76
ANEXO C – Resultado quantificação final consórcio 1 .......................................77
ANEXO D – Cromatograma da quantificação final consó rcio 1 ..........................78
11
1 INTRODUÇÃO
Para que o homem possa continuar a desenvolver-se de uma forma que não
venha a prejudicar o meio ambiente e a si próprio, é preciso que o atual modelo de
desenvolvimento seja revisto. Este atual desenvolvimento terá que ser modificado
para um tipo de modelo que proporcione um futuro melhor, que é o desenvolvimento
sustentável. Neste tipo de desenvolvimento, o homem irá interagir com a natureza
de forma harmoniosa, sem deixar de lado o seu desenvolvimento, ou seja, ele
continuará produzindo, progredindo, mas sem danificar seu meio ambiente. (SILVA;
MELO; SOUZA, 2005).
A poluição se tornou inaceitável para a sociedade, aumentando a preocupação
com os seus efeitos sobre o meio ambiente. Preocupações com a qualidade do ar e
das águas são antigas, mas as preocupações com solos contaminados só se
tornaram evidente no final da década de 70. Infelizmente é impossível reverter todos
os danos causados ao ambiente utilizando técnicas de remediação. As estratégias
modernas de gerenciamento têm dado ênfase à minimização de resíduos,
reciclagem e remediação em preferência à disposição dos resíduos no meio
ambiente. (MESQUITA, 2004).
Atualmente, com o grande crescimento do número de postos de combustíveis
no Brasil a partir da década de 70, verificou-se também uma elevada preocupação
com essa problemática ambiental e, em especial, com o grande potencial de risco de
contaminação das águas subterrâneas decorrentes de derramamentos de
combustíveis. Os HPAs têm recebido mais atenção desde que foram encontrados
no solo pela primeira vez por Blümer, em 1961, devido ao elevado impacto no meio
ambiente e do seu potencial carcinogênico. A concentração de benzo(a)pireno
(BAP) no solo tem aumentado consideravelmente devido à ampliação de seu uso
industrial no último século, como o aumento do trânsito nos grandes centros urbanos
e aos freqüentes vazamentos de diesel provenientes de postos de combustíveis. (D’
AGOSTINO; FLUES, 2005).
Uma estratégia para a eliminação dos solos contaminados com HPAs, é
através da biorremediação, que é a utilização de processo ou atividade biológica
para transformar os contaminantes em substâncias inertes. Esta biotecnologia vem
sendo utilizada há vários anos em outros países e, certos casos apresentam menor
12
custo e maior eficiência na remoção dos contaminantes do que as técnicas físicas e
químicas (como incineração e lavagem do solo), sendo atualmente utilizada em
escala comercial no tratamento de diversos resíduos e na remediação de áreas
contaminadas. (JAQUES et al., 2007).
O uso da técnica de biorremediação já está regulamentada, conforme a
resolução 314 do CONAMA, que visa disciplinar o registro de produtos com a
finalidade de biorremediar solos contaminados por vazamentos de petróleo e seus
derivados. Esta resolução estabelece que os remediadores devem ser registrados
no IBAMA, para que possam ser produzidos, importados, comercializados e
utilizados ficando dispensados de registro aqueles que se destinam a pesquisa e
experimento necessitando da aprovação do órgão.(CONSELHO NACIONAL DO
MEIO AMBIENTE, 2010).
Desde o início do século XX são conhecidas espécies de bactérias e fungos
capazes de utilizar hidrocarbonetos como fonte de carbono aerobicamente. Somente
no fim da década de 80 foram identificados organismos que realizam este processo
em condições anaeróbias. (WIDDEL; RABUS, 2001).
A capacidade metabólica que certos organismos possuem de transformar ou
mineralizar contaminantes em formas menos tóxicas, as quais passam a ser
integradas aos ciclos bioquímicos, é chamada de biodegradação. (MIRANDA, 2008).
Esse trabalho tem como objetivo avaliar de forma exploratória o potencial da
utilização dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Serratia
marcenscens e Candida albicans na degradação de hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (HPAs - benzo(a)pireno) em solo contaminado. O benzo(a)pireno foi
selecionado por estar listado como contaminante classe I na NBR 10004, por possuir
mais de 3 anéis benzênicos, possuir pressão de vapor baixa 0,00002 Pa (HPAs com
mais de 4 anéis não permanecem muito tempo no ar como molécula gasosa, devido
sua baixa pressão de vapor condensam e tornam-se absorvidos nas superfícies e
partículas de fuligens e cinzas) apresentar uma meia vida longa no sedimento
(aproximadamente 6 anos), possuir log Kow 6,04 (log Kow entre 5,8 e 8,0 indica a
maior probabilidade do contaminante ser encontrado em sedimento) (NBR
10004/2004) e por haver padrão e metodologia disponível.
13
2 HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAs)
Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos orgânicos semi
voláteis formados em processos de combustão a alta temperatura. O processo de
queima incompleta de materiais orgânicos, que contém cadeias carbônicas em sua
estrutura, é a principal fonte de emissão de HPAs. A queima de combustível fóssil
em processos industriais, motores de automóveis, sistemas de aquecimento
domésticos (com carvão mineral ou gás butano), incineração de resíduos
domésticos e industriais, fumaça de cigarros, refinarias de petróleo, emissões de
foto copiadoras. Ainda várias fontes naturais, incluindo a queima de biomassa em
florestas e erupções vulcânicas são consideradas emissoras de HPAs. (FERRAZ,
2005).
Os HPAs constituem uma família de compostos caracterizada por possuírem
dois ou mais anéis aromáticos condensados. Estas substâncias, bem como seus
derivados nitrados e oxigenados, têm ampla distribuição e são encontrados como
constituintes de misturas complexas em todos os compartimentos ambientais como
o ar, água e sedimento, em diferentes níveis de concentração (FERRAZ, 2005).
As estruturas dos 16 HPAs identificados pela Agência de Proteção Ambiental
dos Estados Unidos da América (EPA) como os principais carcinogênicos e/ou
mutagênicos são mostrados na Figura 1.
14
Figura 1: Estrutura molecular dos 16 HPAs mais importantes segundo Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA).
Fonte: Ferraz, 2005.
15
2.1 Fontes de emissão de HPAs
Encontra-se na literatura resultados coincidentes de fontes de emissão de
determinados HPAs. Criseno, por exemplo, foi considerado como traçador de
emissões de incineradores e da queima de combustível fóssil, tais como: óleo
industrial ardente e exaustão veicular. Pequenas concentrações de criseno no ar
foram observadas em 25 estações quentes (média de 18 ng.m-3). Maiores
concentrações de criseno foram propostas relativamente as mais baixas
temperaturas atmosféricas durante as estações de inverno (média de 75 ng.m-3). Tal
fenômeno foi atribuído, ao aumento de consumo de combustíveis fósseis e à
pequena freqüência de chuva (FERRAZ, 2005).
Em geral, com a exceção à espécie instável benzo(a)pireno, os HPAs mais
estáveis como pireno, fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(g,h,i)perileno e
indeno (1,2,3-cd)pireno foram considerados na literatura como traçadores de
atividades de tráfego veicular. Destes, fluoreno, antraceno, fenantreno e pireno
foram considerados como traçadores de fontes de motores a diesel, já os compostos
fluoranteno, benzo(g,h,i)perileno e indeno(1,2,3-CD)pireno foram considerados como
traçadores de emissões de motores à gasolina. (FERRAZ, 2005)
2.2 Propriedades físico-químicas
A massa molar, a solubilidade em água, a constante de Henry e a pressão de
vapor, dos 16 principais HPAs são substâncias pouco solúveis em água e, em geral,
sua solubilidade diminui com o aumento do número de anéis aromáticos da molécula
(aumento da afinidade lipofílica). De mesmo modo, a volatilidade dos compostos
diminui com o aumento da massa molar e, conseqüentemente, HPAs de massas
molares mais baixas são mais voláteis e apresentam maiores pressões de vapor que
os mais pesados. O mesmo é observado com os valores da constante de Henry que
diminui com o aumento da massa molar. Destes compostos estima-se que
benzo(a)antraceno, criseno, benzo(b)fluoranteno, benzo(a)pireno, indeno(1,2,3,-
16
cd)pireno, dibenzo(a,h)antraceno e benzo(g,h,i)perileno, sejam os mais tóxicos para
saúde humana. (FERRAZ, 2005)
2.3Toxicidade
Pesquisas da Agência Internacional de Estudo do Câncer (IARC) classificam
alguns HPAs como carcinogênicos e/ou mutagênicos e/ou genotóxicos (PUC-RJ,
2005).
Compostos carcinogênicos são aqueles capazes de induzir um carcinoma,
tumor maligno com tendência a produzir metástase. Evidências sobre a
carcinogenicidade dos HPAs são indicadas principalmente por estudos de exposição
ocupacional a misturas de HPAs resultantes de processos como a produção de
coque, refinamento do petróleo, entre outros. (PUC-RJ, 2005)
Já compostos mutagênicos são capazes de induzir ou aumentar a frequência
de mutação no cromossomo de um organismo e compostos genotóxicos são
aqueles com capacidade de induzir alterações no material genético de organismos a
eles expostos (PUC-RJ, 2005).
Uma substância genotóxica é tóxica para o DNA. Ela pode se unir diretamente
a ele ou atuar indiretamente afetando as enzimas ligadas a sua replicação, levando
a mutações que podem levar ao aparecimento de um câncer. No entanto, vale
ressaltar que substâncias genotóxicas não são necessariamente cancerígenas
(PUC-RJ, 2005).
Estudos in vitro mostram que o benzo[a]pireno induz danos em células
procarióticas, eucarióticas de mamíferos produzindo efeitos genotóxicos variados,
incluindo mutações genéticas em células somáticas, formação de adutos de DNA,
síntese de DNA não programada, entre outros Toxicidade dos HPAs. É importante
ressaltar que muitos desses compostos, ao serem metabolizados, podem dar origem
a compostos mais tóxicos do que o original (PUC-RJ, 2005).
Nos Estados Unidos, a Agência de Proteção Ambiental americana (USEPA)
prioriza o monitoramento de 16 HPAs baseado em suas características tóxicas,
mutagênicas e carcinogênicas: naftaleno, antraceno, pireno, criseno, fenantreno,
benzo(a)pireno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[a]antraceno, benzo[g,h,i]perileno,
17
acenafteno, acenaftileno, fluoreno, fluoranteno, benzo[k]fluoranteno,
benzo[b]fluoranteno, indeno[1,2,3-cd]pireno (PUC-RJ, 2005).
A exposição humana (e de outros animais) aos HPAs ocorre por diferentes
vias. As mais importantes são a inalação de ar poluído e a ingestão de alimentos ou
água contaminada (PUC-RJ, 2005).
2.4 Rota dos HPAs no meio ambiente
A rota principal de transporte dos HPAs é feita através da atmosfera.
Resultados de monitoramento ambiental mostraram que concentrações de HPAs
são da ordem de poucos nanogramas por metro cúbico de ar. Os veículos
motorizados – todos que possuem motor de combustão interna - também contribuem
para o aumento da poluição atmosférica com HPAs através da exaustão de gases,
partículas de pneu e óleo lubrificante. Durante o processo de combustão, os veículos
que utilizam o óleo diesel são a maior fonte de HPAs de baixo peso molecular para a
atmosfera, enquanto os veículos movidos a gasolina são fonte de HPAs de alto peso
molecular (MESQUITA, 2004).
Os HPAs são caracterizados pela baixa solubilidade em água e alto coeficiente
de partição octanol-água. Devido a essa hidrofobicidade natural, os HPAs se
acumulam nas partículas finas e na matéria orgânica do sedimento marinho,
tornando-o assim, um reservatório de HPAs. Esse acúmulo nos sedimentos
marinhos pode ser proveniente de várias fontes, incluindo deposição atmosférica,
produção off-shore, transporte de petróleo e lançamento de esgoto (MESQUITA,
2004).
A concentração de HPAs no sedimento marinho varia de algumas ng/Kg até
g/Kg, dependendo da proximidade de áreas industriais, correntes marítimas e águas
servidas. A concentração de HPAs em solos contaminados de áreas industriais varia
em função da atividade, do tipo de solo, constituintes do solo e grau de saturação do
local (MESQUITA, 2004).
A concentração de HPAs no solo de países industrializados revelou um
aumento desde meados de 1800, com um pico entre 1950 e 1960. Um estudo feito
por Jones em amostras de solo da Inglaterra mostrou um aumento de concentração
18
de HPAs próximo aos centros urbanos. Mas a combustão antropogênica de
combustíveis fósseis e o longo alcance do transporte atmosférico contribuíram para
a dispersão de HPAs no ambiente. Observa-se que quando HPAs alquil substituídos
predominam nos sedimentos, eles são provenientes de derivados de petróleo, mas
quando predominam HPAs sem grupos substituintes, a origem é de processo de
combustão (MESQUITA, 2004).
Além do ar, sedimento marinho e solo, os HPAs podem se acumular em
organismos marinhos. A entrada de HPAs em organismos marinhos está ligada à
biodisponibilidade (ex.: partição entre sedimento, água e alimento), e à fisiologia do
organismo, sendo influenciada pelo tamanho do organismo, taxa de ingestão, taxa
de crescimento, permeabilidade da membrana, taxa de ventilação, tempo de
residência no intestino e regulação osmótica. Os HPAs podem ser eliminados dos
organismos por difusão passiva ou por excreção de substâncias polares, produzidos
em algum processo metabólico envolvendo HPAs (MESQUITA, 2004).
A presença de HPAs em plantas pode expor indiretamente o homem através
da cadeia alimentar. Deposições atmosféricas de HPAs sobre plantas, em alguns
casos, podem ser assimiladas pelo homem. Se o HPA penetrar na célula, ele pode
se transformar em β-O-glicosídeo e β-O-glucoronídeo conjugados; contudo, o
destino dessas moléculas e seus derivados nas folhas ainda não foram elucidados.
Vários fatores podem influenciar o acúmulo de HPAs nas plantas: propriedade física
do HPA, espécie e estrutura da planta e condições ambientais – concentração
atmosférica de HPAs e temperatura (MESQUITA, 2004).
2.5 Benzo(a)pireno
Composto pouco volátil. Quando presente no solo apresenta baixa mobilidade,
na água, é pouco solúvel e adsorve aos sólidos suspensos e ao sedimento.
Segundo a U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA), a exposição ao
benzo(a)pireno em períodos curtos pode produzir a deterioração dos glóbulos
vermelhos no sangue, levando à anemia. A exposição prolongada causa um efeito
potencial no desenvolvimento de cânceres.(WILD,1992).
19
Poucos microorganismos foram identificados como degradadores deste
composto, o tempo de meia vida para a mineralização por meio de biodegradação
varia entre 200 e 300 semanas (HSDB, 2003). Dentre os HPA’s, o benzo(a)pireno, é
o composto mais carcingênico e resistente à foto-oxidação. (MIRANDA, 2008).
Em alguns estudos de toxicidade em ratos, mostrou-se embriotóxico,
teratogênico e causou diminuição na fertilidade(CHEMINFO, 2007).
A figura 2 apresenta a estrutura do benzo(a)pireno.
Figura 2 : Estrutura química do benzo(a)pireno Fonte: AGENCIA ESPAÑOLA DE SEGURIDADE ALIMENTARIA Y NUTRICIÓN, 2010.
2.6 Legislações
Os HPAs são poluentes orgânicos de grande importância ambiental e interesse
toxicológico, pois muitos apresentam propriedades pré-carcinogênicas e ou
mutagênicas para homens e animais. (WHO, 1998).
Em resíduos sólidos a presença dos HPAs é de interesse, uma vez que pode
ocorrer contaminação humana direta (manuseio, tratamento ou disposição) ou
indireta (destino inadequado, contaminando o solo, lençóis freáticos, corpos d’água
superficiais, biota e ar (WHO, 1998).
2.6.1 NBR 10.004
A NBR 10.004 trata da classificação dos resíduos sólidos, tendo como objetivo
classificar os resíduos sólidos quanto aos seus riscos potenciais ao meio ambiente e
à saúde pública.
São previstas três categorias nesta norma:
a) Classe I – resíduos perigosos;
20
b) Classe II – resíduos não inertes;
c) Classe III – resíduos inertes.
Esta classificação é fundamental para o gerenciamento adequado dos
resíduos.
2.6.2 Environmental Protection Agecy (EPA)
A EPA estabeleceu uma lista de 16 HPAs considerados prioritários para o
monitoramento ambiental, em função de sua carcinogenicidade e ocorrência.
A tabela 1 apresenta a classificação toxicológica dada pela EPA, ABNT e IARC
para alguns HPA’s.
Tabela 1: Classificação toxicológica de alguns HPA’s
HPAs IARC EPA ABNT Fluoreno 3 P NM Antraceno 3 P NM Metilfenantrenos+Metilantracenos 3 P NM Pireno 3 P NM Fluoranteno 3 P CP Benzo(a)antraceno 2A P CP Criseno 3 P CP Benzo(b)fluoranteno 2B P CP Benzo(k)fluoranteno 2B P NM Benzo(e)pireno 3 P NM Benzo(a)pireno 2A P CP Indeno(1,2,3-c,d)pireno 2B P CP Dibenzo(a,h)antraceno 2A P CP Benzo(g,h,i)perileno 3 P NM Coroneno 3 P NM
IARC: International Agency for Research on Câncer; EPA: Environmental Protection Agency; ABNT: Associação Brasileira de Normas Técnicas (NBR 10004)
Fonte: Caderno de saúde pública, 2003.
21
3 BIODEGRADAÇÃO
Os fenômenos biológicos abrangem duas atividades fundamentais
interdependentes, que são a síntese dos compostos orgânicos e a biodegradação
destes compostos. A biodegradação é a decomposição de um material em
componentes mais simples por organismos vivos, em que este processo biológico
envolve dois fatores essenciais, que é a nutrição e a respiração (SILVA; MELO;
SOUZA, 2005).
Os microrganismos fazem uso da matéria orgânica constituída de um resíduo,
seja ele sólido ou líquido, servindo-se de uma boa parte desta para a sua
autoconstrução e reprodução. O restante é oxidado por meio da respiração,
aproveitando sua energia e compensando ao meio, elementos na forma de
subprodutos do seu metabolismo. Desta maneira, carbono, nitrogênio e fósforo, etc,
que faziam parte das moléculas orgânicas dos resíduos, são devolvidas ao meio (ar,
água, solo) na forma de compostos mais simples, como gás carbônico, fosfatos,
nitratos, etc (SILVA; MELO; SOUZA, 2005).
Um grande volume de biomassa pode ser processado por meio de vastos
processos produtivos e objetivando uma grande diversidade na produção final de
produtos, como: alimentos, bio-energia, bio-plásticos, papel, celulose e outros
produtos químicos (SILVA; MELO; SOUZA, 2005).
3.1 Fatores físico-químicos que influenciam o proce sso de biodegradação
Mesmo que o microrganismo possua habilidade para degradar o contaminante
existem muitas razões para que esse composto seja degradado lentamente ou não.
Entre as razões citam-se: receptor de elétrons, nutrientes, água, pH, temperatura e
tipo de solo, os quais serão discutidos nos itens abaixo (MESQUITA, 2004).
22
3.1.1 Receptores de elétrons
Na maioria dos casos, a biodegradação do contaminante depende de atividade
aeróbia dos microrganismos, embora existam alguns processos que utilizem a
biorremediação anaeróbia. Muitas vezes, os contaminantes podem servir como
doadores ou receptores de elétrons nas reações bioquímicas redox, podendo ser
parcialmente transformados ou mineralizados (MESQUITA, 2004).
Devido a maior quantidade de energia produzida durante o processo de
respiração aeróbia, o oxigênio é o receptor de elétrons final, quando presente.
Quando o oxigênio livre se torna limitante, os microrganismos passam a usar o
oxigênio proveniente do nitrato (NO3) e depois continuam a usar outras formas de
oxigênio que estejam presentes na região (SO4-2). As formas oxidadas de ferro e
manganês (Fe+3 e Mn+4) também podem ser utilizadas como receptores de elétrons.
As formas reduzidas de manganês e ferro (Mn+2 e Fe+2) são capazes de capturar o
oxigênio, tornando possível o desenvolvimento de microrganismos anaeróbios
estritos, como os sulfato-redutores e os metanogênicos (MESQUITA, 2004).
Na matriz do solo, o oxigênio está presente nos vazios dos poros. O solo pode
vir a ficar deficiente de oxigênio, ou anóxico, devido às dificuldades de difusão do
O2, quando os poros são preenchidos por água. Em geral, é necessário um mínimo
de 10% de ar na matriz do solo, para manter a atividade aeróbia. O aumento do
nível de oxigênio no solo pode ser obtido, evitando a saturação com água. Para
garantir a quantidade de oxigênio necessário para manter o crescimento aeróbio,
podem ser usadas técnicas de injeção de ar ou peróxido de hidrogênio (H2O2). O
uso de peróxido é limitado, porque em concentrações acima de 100 ppm ele se
torna tóxico aos microrganismos. Outro problema é que o peróxido tende a se
decompor rapidamente na presença de alguns componentes do solo (MESQUITA,
2004):
H2O2 → O2↑+ H2O
Condições anaeróbias podem ser usadas para degradar compostos clorados –
tóxicos aos microrganismos aeróbios - embora a taxa de degradação seja muito
baixa. Após a etapa anaeróbia, pode ser implementado o tratamento aeróbio para
completar a degradação do composto parcial ou totalmente clorado, assim como
outros contaminantes presentes (MESQUITA, 2004).
23
3.1.2 Nutrientes
Os nutrientes necessários, em ordem decrescente, para o crescimento celular
são: nitrogênio, fósforo, potássio, enxofre, magnésio, cálcio, manganês, ferro, zinco,
cobre e elementos traço. Se os nutrientes não estão disponíveis em quantidade
suficiente, a atividade microbiana ficará limitada (MESQUITA, 2005).
O nitrogênio pode estar presente no solo sob as formas inorgânicas e
orgânicas. A forma inorgânica do nitrogênio no solo inclui amônia, nitrato, nitrito e
óxido nitroso. As formas orgânicas ocorrem como aminoácidos ou proteínas. Em
geral, a forma preferida pelos microrganismos é a amônia. Quando outras formas de
nitrogênio estão presentes, elas são convertidas em amônia, para depois serem
assimiladas. O fósforo é freqüentemente limitado devido a sua baixa solubilidade.
Em solos orgânicos, o fósforo é encontrado no húmus, enquanto a fração inorgânica
ocorre em várias combinações com ferro, alumínio, cálcio e flúor. Os compostos
inorgânicos são normalmente pouco solúveis em água. Os fosfatos reagem com as
argilas formando complexos insolúveis de complexos argilo-fosfatados. As formas
mais comuns de fosfato no solo são (H2PO4)- e (HPO4) –2. Em solos ácidos, o
fosfato precipita na forma de fosfato de alumínio e ferro, enquanto em solos neutros
ou alcalinos ele é precipitado na forma de fosfato de cálcio. De maneira geral, o
fosfato é solúvel em solos cujo pH vai de 5,5 a 7,0 (MESQUITA, 2005).
3.1.3 Água
A água funciona como veículo de transporte no qual matéria orgânica e
nutrientes atravessam a parede celular dos microrganismos e leva os sub produtos
do metabolismo para fora da célula. O excesso de água pode ser limitante por inibir
a passagem de oxigênio pelo solo, a não ser que se esteja querendo trabalhar em
condições anaeróbias. A água está presente no solo sob três formas: livre, capilar e
higroscópica. A água livre é aquela que pode se mover livremente através do solo.
Ela pode deslocar o oxigênio da matriz do solo, desenvolvendo condições anóxicas.
Em sítios contaminados, o movimento dessa água é o principal responsável pelo
24
transporte de materiais para camadas inferiores de solo, podendo até chegar ao
aquífero. A água capilar é aquela presente nos poros da matriz do solo quando o
solo não está saturado. Essa água é a que está disponível para os microrganismos.
A água higroscópica representa a água que está interagindo com a superfície da
matriz do solo. Essa água é extremamente difícil de ser removida do solo e
geralmente não está biologicamente disponível (MESQUITA, 2004).
3.1.4 pH
A solubilidade dos nutrientes e a atividade microbiana estão diretamente
ligadas ao pH do solo. A biodegradação de um contaminante por bactérias
heterotróficas é tipicamente acelerada no pH neutro ou próximo dele. Podemos
encontrar valores de pH do solo que vão desde 2.5 (áreas de mineração) a 11
(desertos alcalinos). Os valores de pH do solo, em geral, são ácidos, assim em
muitos projetos de biorremediação, existe a necessidade de neutralizar a acidez do
solo de modo a elevar o pH próximo à neutralidade. A técnica mais usada para
elevar o pH do solo é a adição de cal. A quantidade da cal necessária não é
determinada somente pelo pH do solo. É preciso levar em consideração outros
fatores como: textura, quantidade de matéria orgânica e capacidade de troca
catiônica. Os dois fatores mais influenciam na diversidade microbiana, em geral, são
o pH e a capacidade de tamponamento do solo (MESQUITA, 2004).
3.1.5 Temperatura
A atividade microbiana está diretamente relacionada com a temperatura. As
taxas de reações metabólicas aumentam com aumento de temperatura, sendo que a
faixa ótima se situa entre 20 e 30ºC. A temperatura também está relacionada com a
diminuição do contaminante pelo processo de evaporação. A solubilidade dos
contaminantes aumenta com o aumento de temperatura, e a solubilidade do
oxigênio diminui com o aumento de temperatura (MESQUITA, 2004).
25
3.1.6 Solo
A textura do solo afeta a permeabilidade, a umidade, e a densidade. A textura
do solo deve ser levada em consideração. Para garantir que a adição de oxigênio, a
distribuição de nutrientes e que a umidade sejam mantidas de maneira efetiva. Por
exemplo, solos argilosos são difíceis de aerar e resultam numa baixa concentração
de oxigênio, dificultando a distribuição e homogeneização dos nutrientes. Esse tipo
de solo também é capaz de reter água por longos períodos de tempo após a
precipitação. Durante um longo período de chuvas a umidade do solo ficará maior
que a necessária ao tratamento. Por outro lado, durante o período de seca a
umidade ficará abaixo da faixa ótima para o crescimento microbiano. Em geral, a
biodegradação de contaminantes no solo é otimizada quando a umidade do solo
está entre 50 e 75% da capacidade de campo. É importante enfatizar que os níveis
de umidade devem estar relacionados à capacidade de campo e não ao percentual
de água no solo. Se esse fato não for observado, estarão sendo utilizados níveis
excessivos de água no solo, reduzindo assim, o nível de oxigênio disponível
(MESQUITA, 2004).
3.2 Biodegradação de HPAs
Desde a década de 1970, pesquisadores vêm demonstrando que bactérias,
fungos e algas possuem atividades catabólicas que podem ser utilizadas na
remediação de áreas contaminadas por HPAs (MESQUITA, 2004).
Atualmente, a biorremediação tem demonstrado ser efetiva na mitigação de
solos contaminados com HPAs de baixo peso molecular. Embora a falta de atividade
microbiológica para HPAs de alto peso molecular seja atribuída a fatores específicos
de campo, como biodisponibilidade do contaminante, nutriente, potencial redox, etc.,
o fator limitante pode ser a falta de microrganismos capazes de degradar os
compostos com mais de quatro anéis aromáticos. Embora exista uma grande
diversidade de organismos capazes de degradar HPAs de baixo peso molecular,
26
como naftaleno, acenafteno e fenantreno, apenas poucos gêneros são capazes de
degradar HPAs de alto peso molecular como o b[a]pireno (MESQUITA, 2004).
Acredita-se que as bactérias oxidem preferencialmente hidrocarbonetos
aromáticos que vão do benzeno ao benzo[a]pireno. No processo oxidativo são
gerados cis-dihidrodióis pelo processo de incorporação de átomos de oxigênio ao
anel aromático tendo as dioxigenases como catalisador. Os cis-dihidrodióis são
rearomatizados pela ação da enzima cis-diidrodiol desidrogenase. Em seguida, o
cis-diidrodiol é oxidado a catecol, que é substrato para outras dioxigenases que
levam à quebra do anel aromático. O caminho oxidativo orto envolve a quebra entre
os átomos de carbono dos dois grupos hidroxílicos, formando o ácido cis,cis-
mucônico. No caminho oxidativo meta quebra a ligação entre o carbono hidroxilado
e o carbono adjacente, formando o 2-hidroximucônico semialdeído (MESQUITA,
2004).
O produto final desse processo de degradação resulta na produção de
succinato, CoA (Coenzima A), ácidos pirúvico e acético, e aldeídos, todos eles
utilizados por microrganismos na síntese de constituintes celulares e energia (Ciclo
do Ácido Tricarboxílico). Os subprodutos dessas reações são CO2 e água. Uma vez
que o primeiro anel aromático hidroxilado do HPA é degradado (ácido pirúvico e
CO2), o segundo anel é enzimaticamente processado da mesma maneira. Contudo,
muitas moléculas de alto peso molecular (benzo[a]pireno) são degradadas com
dificuldade, devido a baixa solubilidade, grande energia de ressonância e toxicidade
(MESQUITA, 2004).
27
4 BIORREMEDIAÇÃO
A técnica de biorremediação consiste no emprego de microrganismos, com
ajuda de fatores ambientais, visando a degradação de compostos tóxicos em
produtos neutros que não irão agredir o meio ambiente (MESQUITA, 2004).
Esta técnica vem sendo usada há vários séculos em processos de
compostagem de resíduos orgânicos, para produzir condicionadores de solo ou
adubo. Desde a década de 1940 esse processo, como técnica de degradação de
contaminantes orgânicos, vem sendo usado na industria de petróleo para tratar
resíduos do processo de refino (MESQUITA, 2004).
O processo de biorremediação pode ser executado ex situ (i.e. land-farming,
bio-pilha, bio-reatores) ou in situ. No processo ex situ o material removido (solos
escavados, efluentes, sólidos) é tratado em sistema aberto ou fechado, utilizando
microrganismos na degradação do contaminante. Uma das alternativas é a
disposição do solo contaminado em células ou em áreas abertas para a dispersão
de nutrientes e microrganismos, além da aeração do sistema. Os principais gastos
com o sistema são: escavação e remoção do material contaminado, área para
disposição do solo contaminado, análises químicas periódicas para avaliação do
método, eficiência do método de oxigenação do sistema (MESQUITA, 2004).
O processo in situ tem como objetivo criar um ambiente favorável ao
crescimento e desenvolvimento de microrganismos capazes de degradar o
contaminante no local. O processo envolve projeto e instalação de sistemas de
suprimento de nutrientes, microrganismos (no caso da bioaumentação) e oxigênio
(para estimular processos aeróbios) ou nitrogênio (para processos anaeróbios) em
subsuperfície (MESQUITA, 2004).
A água doce e do mar, solo e efluentes domésticos possuem grande
quantidade e diversidade de comunidades microbianas que demonstram capacidade
de degradar moléculas xenobióticas. Embora a capacidade de degradação de um
organismo ou consórcio seja necessária, a sua mera existência não é o suficiente.
Além disso, as condições devem auxiliar a degradação de modo a aumentar a
eficiência do processo (MESQUITA, 2004).
Quando o tempo e as condições são favoráveis, mesmo que originalmente não
exista nenhuma via metabólica, é possível degradar um composto orgânico sintético
28
ou xenobiótico. Por outro lado, células bacterianas tendem a limitar a quantidade de
códigos genéticos às necessidades presentes, mas a capacidade genética de certas
bactérias é ampla e essa característica confere uma vantagem seletiva quando
ocorrem mudanças nas condições ambientais, ou por conferir melhor velocidade de
crescimento pela bactéria portadora, ou por transferir esse código genético as outras
bactérias - através de plasmídeos (MESQUITA, 2004).
Existem, no mínimo, quatro vias diferentes que resultam em uma bactéria
capaz de degradar certo composto ou grupo de compostos em um determinado sítio
(MESQUITA, 2004):
a) A microbiota natural ser exposta à molécula xenobiótica por tempo suficiente
de forma a expressar mudanças nos genes capazes de codificarem enzimas
para degradação de um composto. Esse tipo de evolução ocorre a todo o
momento, mas é relativamente lenta. Como conseqüência, a comunidade
microbiana passa a ter as vias degradativas, mas a degradação pode ser
insuficiente devido ao número reduzido de células ou à baixa atividade;
b) A microbiota natural que está adaptada às condições locais, é exposta a
moléculas xenobióticas. Com o tempo as bactérias trocam genes com
capacidade degradativa com outras células bacterianas próximas. Assim, a
transferência genética pode ser feita por conjugação, transdução ou
transformação. Do ponto de vista da biorremediação, esse tipo de evolução é
relativamente lento, mas pode ser melhorado;
c) Como o item 2, a microbiota natural pode ser “equipada” com a capacidade
degradativa. Uma vez que o contaminante é conhecido, o grupo de genes
pode ser introduzido. Se não houver nenhum gene natural, ele pode ser
construído. As cepas de laboratório podem ser usadas como doadoras, tanto
para transferir a capacidade para as cepas isoladas do sítio contaminado, ou
por introdução de doadores no local e deixar a transferência ocorrer;
d) Uma bactéria capaz de degradar o contaminante é isolada do sítio
contaminado. Contudo, a cepa precisa ser capaz de competir com a
microbiota natural do sítio a ser remediado.
4.1 Fatores ambientais que influenciam a biorremedi ação dos HPAs no solo
29
A biorremediação também pode ser limitada se as condições do solo não forem
favoráveis à sobrevivência e à atividade dos microrganismos degradadores. A
umidade do solo é considerada o fator ambiental mais crítico na biodegradação, pois
uma alta atividade microbiana somente ocorrerá se houver adequada disponibilidade
de aguá aos microrganismos. Além disso, o teor de água no solo tem relação
inversa com a disponibilidade de oxigênio e, consequentemente, com a atividade
dos microrganismos aeróbios, que são os principais responsáveis pela degradação
dos HPAs (JACQUES et al, 2007).
A temperatura afeta a atividade metabólica, o consumo de substrato pelos
microrganismos e, por conseqüência, a biodegradação dos HPAs. Apesar de a
biodegradação ocorrer numa ampla faixa de temperatura, as maiores taxas ocorrem
entre 25ºC e 35ºC, sendo que, em temperaturas acima ou abaixo destas, há
prejuízos para este processo. O pH do solo afeta diretamente a atividade dos
microrganismos através dos efeitos dos íons H+ na permeabilidade celular e na
atividade enzimática, assim como, indiretamente, pela influência na disponibilidade
de macro e micronutrientes e na solubilidade do alumínio e demais metais pesados,
que podem ser tóxicos aos microrganismos(JACQUES et al., 2007)..
Em ambientes naturais, o nutriente que normalmente limita o crescimento
microbiano é o C, sendo que os nutrientes inorgânicos estão presentes em
quantidades que normalmente excedem as demandas das comunidades
microbianas. No entanto, a presença de elevadas concentrações de HPAs no solo
com potencial para serem utilizadas como substrato para o crescimento dos
microrganismos pode fazer com que outros nutrientes, que não o C, tornem-se
limitantes. A relação de C:N:P: de 100:10:1 no solo a ser biorremediado tem sido
normalmente recomendada. Entretanto, as pesquisas que avaliaram os efeitos da
adição de N e P ao solo demonstraram resultados muito conflitantes, o que
provavelmente se deve às especificidades de cada ambiente, no que se refere a
teores de nutrientes no solo, tipo de contaminante e população microbiana envolvida
(JACQUES et al., 2007).
Outros nutrientes que poderiam influenciar a degradação dos HPAs no solo são
o ferro e o enxofre, porque desempenham funções celulares que estão intimamente
relacionadas ao metabolismo dos HPAs, como a participação na estrutura das
enzimas que realizam a degradação destes compostos nas células microbianas.
30
Após revisão sobre os efeitos destes fatores ambientais na biodegradação dos
HPAs , pode-se constar que a grande maioria dos pesquisadores recomenda que a
adição de nutrientes deve ser realizada somente após a criteriosa avaliação, de
forma a evitarem-se adições desnecessárias, que resultam em aumentos dos custos
e em prejuízos ao processo de biorremediação . (JACQUES et al., 2007).
Em vista da baixa solubilidade em água e da forte tendência de sorção dos
HPAs à fase sólida do solo, a degradação desses compostos pode ser limitada
devido a sua baixa biodisponibilidade aos microrganismos degradadores. O termo
sorção é definido como o processo em que compostos químicos tornam-se
associados à fase sólida. No solo, este processo ocorre porque os HPAs são
apolares e sua permanência na fase líquida demanda que as moléculas de água
rompam as pontes de H que estão estabelecidas com outras moléculas de água.
Como esta reorganização tem um custo energético muito elevado, o composto
apolar é forçado a deslocar-se na direção dos locais de maior hidrofobicidade,
representados no solo pela matéria orgânica (MO) e pela superfície dos minerais
(JACQUES et al., 2007)..
A MO é a principal matriz hidrofóbica do solo, porque é constituída
principalmente de átomos de C e de H, fazendo com que as pontes de H estejam
limitadas a determinados locais de uma estrutura. Além disso, por se encontrarem
em um meio hidrofílico, que é o solo, as moléculas de MO tendem a expor suas
superfícies com carga para o exterior e formar espaços hidrofílicos em seu interior,
nos quais os compostos apolares podem penetrar. O conteúdo de MO é a
característica do solo que mais influencia a sorção dos HPAs, sendo que vários
autores demonstraram relações lineares positivas entre o conteúdo de C orgânico do
solo e a capacidade de sorção dos HPAs (JACQUES et al., 2007)..
Em vista de que a composição da fase sólida do solo determina a sua
capacidade de sorção de HPAs, é de se esperar que solos com diferentes
conteúdos de MO e composições mineralógicas apresentem biodisponibilidade
desses compostos aos microrganismos degradadores do solo (JACQUES et al.,
2007).
31
5 MICROBIOLOGIA
Durante as últimas décadas, os microrganismos têm surgido como parte do
eixo principal das ciências biológicas. Entre as razões para isto, está o conceito de
“umidade em bioquímica”, que significa que muitos dos processos bioquímicos que
ocorrem em microrganismos são essencialmente os mesmos em todas as formas de
vida, inclusive o homem, e a descoberta de que toda informação genética de todos
os organismos, dos microrganismos a seres humanos, é codificada pelo DNA. Em
virtude da relativa simplicidade em realizar experimentos com microrganismos,
associada à rápida velocidade de crescimento e de sua variedade de atividades
bioquímicas, os microrganismos tornam-se o modelo experimental de estudo.
(RELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997).
Toda a matéria, organismos vivos contêm átomos e moléculas como suas
unidades estruturais básicas. A forma como estes átomos e moléculas interagem
determina as qualidades fundamentais dos compostos, tais como solubilidade e
acidez. Tais aspectos da química também são de grande importância para os
microrganismos, que dependem de nutrientes solúveis e são afetados por seus
ambientes. As substâncias químicas importantes nos organismos vivos são
baseadas em elementos contendo nucléicos. Os processos bioquímicos dependem
de substâncias especiais denominadas enzimas, que podem aumentar
significativamente a velocidade na qual uma reação específica ocorre. (RELCZAR
JR; CHAN; KRIEG, 1997).
Por meio do equilíbrio entre produção e utilização de milhares de substâncias
químicas, cada microrganismo pode regular e mesmo contribuir para seu ambiente.
(RELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997).
5.1 Microbiologia do solo
Bilhões de organismos, tanto microscópicos como grandes insetos e minhocas,
formam uma comunidade viva e vibrante no solo.Um solo típico tem milhões de
bactérias em cada grama. A população é maior nos poucos centímetros do topo do
32
solo e declina rapidamente com a profundidade. Os organismos mais numerosos no
solo são as bactérias. Embora os actinomicetos sejam bactérias, eles são estudados
separadamente. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005)
Populações de bactérias do solo são geralmente estimadas utilizando-se
contagem em placas em meio nutriente e os números atuais são provavelmente
subestimados por este método. Nenhum único meio nutriente ou condição de
crescimento pode encontrar todos os nutrientes e outras exigências necessárias
para todos os microrganismos do solo. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005)
Podemos pensar em solo como um “fogo biológico”. Uma folha que cai de uma
árvore é consumida por este “fogo” assim como sua matéria orgânica é
metabolizada pelos micróbios do solo. Elementos da folha entram nos ciclos
biogeoquímicos do carbono, nitrogênio e enxofre. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005)
Considerando a evolução histórica do conceito de solo, mais adequado e
mais abrangente, na atualidade pode ser: “Solo: corpo natural da superfície terrestre,
constituído de materiais minerais e orgânicos resultantes das interações dos fatores
de formação (clima, organismos vivos, material de origem e relevo) através do
tempo, contendo matéria viva e em parte modificada pela ação humana, capaz de
sustentar plantas, de reter água, de armazenar e transformar resíduos e suportar
edificações. (MATOS, 2006)
O solo é formado por três fases: líquida (constituída de água, de minerais e de
compostos orgânicos nela dissolvidos), formando a solução do solo, gasosa (os
mesmos gases da atmosfera, porém, com diferentes proporções) e sólida. Esta
última é composta de partículas minerais de várias formas, tamanhos e
características químicas, raízes de plantas, populações de organismos macro e
microscópicos vivos e com metabolismo ativo ou dormente, e matéria orgânica em
vários estádios de decomposição. A característica estrutural dominante é formada
por complexos de argila e matéria orgânica estabilizados em partículas de diferentes
tamanhos (areia, silte e argila), formas e arranjos. De modo geral, a fase sólida
representa em torno de 45% do volume total, o espaço poroso (fase líquida e
gasosa) 50% e a matéria orgânica 5% (incluindo os organismos vivos). A proporção
entre as três fases, porém, varia em função do tipo de solo e das condições
ambientais. (MATOS, 2006).
33
O solo apresenta características e propriedades morfológicas, físicas e
químicas e atividade biológica que são importantes para o seu estudo e
compreensão. (MATOS, 2006).
A fase aquosa (líquida) que ocupa o espaço poroso do solo constitui a
solução do solo. É a parte de um sistema dinâmico e aberto, cuja composição é
resultante de inúmeras reações que ocorrem com as outras fases que o constituem.
A composição da solução do solo varia muito com o material de origem do solo, com
o pH, com as condições de oxi-redução, com o teor de matéria orgânica, com a
adição de produtos químicos (fertilizantes, inseticidas, fungicidas, herbicidas) e com
seu manejo. Os elementos na solução do solo são influenciados por transformações
bióticas e abióticas específicas que regulam os processos de adição e perda, assim
como a biociclagem dos mesmos passando por diferentes formas no solo e
absorção pela vegetação e microbiota. (MATOS, 2006).
Na fração argila muitos fenômenos ocorrem, entre eles o da troca iônica.
Existem duas cargas na natureza: positiva e negativa. A maioria dos solos na crosta
terrestre apresenta maior número de cargas negativas do que o número de cargas
positivas – são solos eletronegativos. Essas cargas, que estão na superfície dos
minerais de argila e da matéria orgânica são capazes de adsorver íons com cargas
opostas (cátions): Ca2+
, Mg2+
, K+, H
+ e etc. Estes cátions adsorvidos podem ser
substituídos, isto é, trocados uns pelos outros, fenômeno denominado de troca de
cátions, enquanto que, ao conjunto das cargas negativas dá-se o nome de
capacidade de troca catiônica - CTC ou T. (MATOS, 2006).
O estudo da química do solo fornece informações que permitem caracterizar
os processos químicos que nele ocorrem e são importantes para a agricultura e para
o ambiente. (MATOS, 2006).
A matéria orgânica, juntamente com os componentes inorgânicos da fase
sólida, exerce um papel fundamental na química do solo. Ela é gerada a partir da
decomposição de resíduos de plantas e animais, sendo formada por diversos
compostos de carbono em vários graus de alteração e interação com as outras fases
do solo (mineral, gasosa e solução). Apesar de compor menos de 5% na maioria dos
solos, apresenta uma alta capacidade de interagir com outros componentes,
alterando assim as propriedades químicas, físicas e biológicas do solo, as quais
afetam o crescimento e desenvolvimento das plantas. É um componente bastante
34
sensível às condições ambientais e as mudanças nas práticas de manejo agrícola,
por isso esta deve ser levada em consideração na avaliação do potencial produtivo
do solo e na escolha das práticas de manejo a serem empregadas. (MATOS, 2006).
5.2 Crescimento Microbiano
Quando falamos em crescimento microbiano nos referimos ao número e não ao
tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão aumentando seu
número e se acumulando em colônias que contêm milhares de células ou
populações que agrupam milhares de células. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005)
Populações microbianas, durante um período de tempo muito curto, podem-se
tornar muito grandes. Por meio de entendimento das condições necessárias para o
crescimento microbiano podemos determinar como controlar o crescimento dos
microrganismos patogênicos ou daqueles que contaminam e degradam os
alimentos.
Os fatores necessários para o crescimento microbiano podem ser divididos em
duas categorias principais: físicos e químicos.
5.3 Microrganismos degradadores de HPAs
Para que um microrganismo utilize estes compostos como fonte de C e energia
para seu crescimento, é necessário que possua as várias enzimas que transformam
as complexas moléculas dos HPAs em intermediários comuns das suas rotas
catabólicas. Várias vias metabólicas de degradação dos HPAs já foram identificadas
em diferentes microorganismos, porém as mais estudadas são as do metabolismo
aeróbico realizado pelas bactérias, pelos fungos lignolíticos e pelos fungos não-
lignilíticos. No metabolismo bacteriano, a oxigenação inicial dos HPAs é realizada
por uma enzima intracelular dioxigenase, que tem função de reconhecer o HPA e
adicionar dois átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido à ressonância
35
do anel aromático. Após sucessivas oxidações, o último anel aromático é
transformado em um dos intermediários centrais da via de degradação dos HPAs,
que pode ser catecol, o protocatecol ou o gentisato. Até aqui atuaram as enzimas
denominadas de periféricas, que têm a função de reconhecer as moléculas dos
HPAs e convertê-las nestes intermediários centrais. A partir de então, atuam as
denominadas enzimas de fissão, que converterão os intermediários centrais em
compostos que possam ser utilizados nas vias comuns de geração de carbono e
energia de bactéria. As enzimas de fissão podem ser divididas em dois grupos,
conforme o local da clivagem no intermediário central: as enzimas de fissão podem
ser divididas em dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central:
as enzimas intradiol abrem o anel aromático por via orto, originando o cis-mucanato,
que, por passos sucessivos, será convertido em succinato e acetil-coenzima; e as
enzimas extradiol fazem a abertura do anel aromático por via meta, originando o
semialdeído 2-hidroximucônico, que, por passos sucessivos, será transformado em
ácido pirúvico e acetaldeído (JACQUES et al., 2007).
Devido ao grande número de enzimas envolvidas na degradação destes
compostos, a maioria dos microrganismos do solo não possui a capacidade de
degradar os HPAs, justificando a necessidade de se isolar e selecionar
microrganismos degradadores, visando a sua utilização na biorremediação de solos
contaminados. Desde a década de 1950, vêm sendo isoladas bactérias
degradadoras destes compostos, pertencentes principalmente aos gêneros
Pseudonomas, Aeromonas, Beijerinckia, Flavobacterium, Nocardia,
Corynebacterium, Sphingomonas, Mycobacterium, Stenotrophomonas, Paracoccus,
Burkholderia, Microbacterium, Gordonia, dentre outros. No entanto, nos últimos
anos, tem sido dada atenção à obtenção de consórcios microbianos, que,
comparativamente às culturas puras, têm-se mostrado mais efetivos na degradação
destes compostos. Estes consórcios apresentam maior capacidade de utilização de
um grande número de HPAs como fonte de C e, principalmente, podem mineralizar
completamente estes compostos, devido à complementaridade metabólica entre os
membros do consórcio, em que os HPAs seriam transformados em CO2 e água
através da ação de mais de um microrganismo. Estudando um consórcio bacteriano
degradador de óleo diesel no solo, verificaram que, dos sete membros deste
consórcio, quatro não utilizavam diretamente o óleo como fonte de carbono e
energia; no entanto, a presença destes aumentava a produção de CO2 pelo
36
consumo de intermediários produzidos pelos demais membros (RICHARD ;
VOGUEL, 1999).
5.4 Bactérias do solo
As bactérias são organismos procariontes, de tamanhos que variam entre 0,2
a 2,0 µm de diâmetro e 2 a 8 µm de comprimento. As formas mais comuns de
procariotos são cocos, espirilos e bacillus que podem apresentar alterações em
função das condições ambientais. As bactérias podem ser gram-positivas quando
apresentam na sua parede celular peptideoglicano, polissacarídeos e ácido
teióico.(SANTOS, 2006)
Nas bactérias gram-negativas há uma membrana externa permeável a
moléculas de polissacarídeo e lipopolissacarídeo. O peptideoglicano é bastante
poroso e circundado por lipoproteínas e pela membrama plasmática. A dispersão do
material genético pelo citoplasma, cromossomos circulares e reprodução geralmente
por fissão binária são características genéticas que os diferenciam dos eucariotos.
As bactérias mostram uma grande capacidade e diversidade no que se refere à
colonização de ambientes adversos. (SANTOS, 2006).
O número de bactérias normalmente é maior que os fungos e actinomicetos do
solo, representando entre 25 e 30% de biomassa microbiana. A população destes
grupos é maior na superfície do solo declinando com a profundidade. Os
microrganismos que vivem nos horizontes superfíciais do solo são os mais
envolvidos na formação do solo, no ciclo biogeoquímico dos nutrientes e na
regulação do fluxo da água. Assim, a microbiota dos horizontes superficiais é
responsável pelo funcionamento ecológico do solo, possuindo um importante papel
nas atividades de decomposição e transformação de nutrientes. (SANTOS, 2006).
Processos de redução de metais como cromo, cobre, urânio e ferro com a
presença de bactérias do solo são possíveis. A redução de Fe (III) e Mn (IV) é
possível porque estes organismos usam esses metais em seus processos
metabólicos como aceptores finais de elétrons. (SANTOS, 2006).
Bactérias termofílicas Sulfolobus acidocaldarius (Darland) exibem habilidade
em reduzir o Fe (III) em estudos de cultura pura. Resultados positivos também foram
37
encontrados em gêneros Termoanaerobacter, Anaerobranca e Sulfobacillus.
Estudos com Ni mostram que a concentração do metal extraído aumentou de 2,2 mg
kg-1 para 2,6 mg kg-1 quando o solo foi incubado com Microbacterium
arabinagalactanolyticum.( SANTOS, 2006).
A produção de sideróforos é bastante estimulada na presença de metais
pesados, alterando a biodisponibilidade dos metais para o solo e para plantas.
Trabalhos com Azotobacter vinelandii Lipman em presença de Zn (II) e
Pseudomonas aeruginosa mostraram aumento na produção de sideróforos.
(SANTOS, 2006).
5.4.1 Bacillus spp
Bactérias do gênero Bacillus subtilis são gram-positivas e podem ser aeróbias,
facultativas ou anaeróbias. São resistentes ao calor e a outros agentes destrutivos.
Podem oxidar uma ampla faixa de compostos orgânicos e em alguns casos são
fermentativas. A maioria delas tem exigências nutricionais simples, requerendo no
máximo alguns aminoácidos ou vitaminas B como fatores de crescimento. Formam
endósporos – característica que as coloca entre os esporulados – e apresentam a
habilidade de produzir antibiótico. A formação de endósporos aumenta a resistência
aos fatores adversos. Dessa forma, podem ser armazenados, como inoculantes, por
um período mais longo, e possuem maior tempo de permanência no solo, além da
facilidade de aplicação. (FREITAS; PIZZINATTO, 1997). A seguir a figura 3
apresenta os bacillus spp.
38
Figura 3: Bacillus spp Fonte: Lancaster city council, 2010.
5.4.2 Pseudonomas spp
O gênero Pseudomonas são bactérias gram-negativas e produzem um
pigmento verde-amarelado fluorescente em meio B, observado sob luz com
comprimento de onda próximo do ultravioleta. Esses organismos podem ser
encontrados na água e no solo. As espécies mais importantes desse grupo são
Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida, geralmente estudadas com o
objetivo de avaliar a promoção de crescimento em plantas, e P. aeruginosa,
considerada patogênica a animais. (KING et al, 2003).
A diversidade metabólica de bactérias do grupo fluorescente do gênero
Pseudomonas dá a essas bactérias uma grande habilidade para adaptação a vários
ambientes, tais como solo e rizosfera. (KING et al., 2003). A figura 4 apresenta a
morfologia típica do gênero Pseudonomas.
39
Figura 4: Pseudonomas spp Fonte: Bioweb,2010.
5.4.3 Serratia marcescens
Serratia é um gênero de bactéria gram-negativa, anaeróbia facultativa. É um
bacilo da família Enterobacteriaceae cuja espécie mais comum é a S. marcescens,
que normalmente causa infecção nosocomial. Porém, existem relatos de cepas de
S. plymuthica, S. liquefaciens, S. rubidaea e S. Odorifera e que causaram doenças.
Membros deste gênero produzem pigmento vermelho característico e podem ser
distinguidos de outros gêneros pertencentes á família das Enterobacteriaceae pela
produção de três enzimas: DNase, lipase e gelatinase.(ANÍ, 2007).
Em hospitais, espécies do gênero Serratia tendem a colonizar o trato
respiratorio e urinário ao invés do gastrointestinal, em adultos.
Infecções por Serratia são responsáveis por aproximadamente 2% das
infecções nosocomiais no trato respiratório baixo, trato urinário, sangue, feridas
cirúrgicas, pele e mucosas em pacientes adultos. (ANÍ, 2007). A figura 5 a seguir
apresenta a morfologia do gênero Serratia.
40
Figura 5: Serratia marcescens Fonte: Comons, 2010.
5.5 Fungos do solo
Os fungos podem ser classificados na Divisão Chytridiomycota, Zygomycota,
Ascomycota, Basiomycota e Deuteromycota. Os gêneros Mucor, Rhizopus,
Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium,Pythium, Verticillium e Alternaria são
fungos tidos considerados os mais comuns encontrados no solo. (SANTOS, 2006).
Os eucariontes apresentam características distintas como a organização do
seu material genético dentro do núcleo, presença de organelas citoplasmáticas e
divisão do corpo por mitos. Ao contrário dos procariotos, estes não apresentam a
capacidade de usar compostos inorgânicos e de fixar nitrogênio atmosférico. Mesmo
não sendo um grupo predominante no solo, os fungos representam entre 70 e 80%
da biomassa microbiana do solo e sua ocorrência está condicionada a fatores como
pH, umidade e quantidade de matéria orgânica. (SANTOS, 2006).
Os fungos apresentam grande capacidade de adaptação à presença de metais
pesados no solo. Este mecanismo pode ser explicado por mutações genéticas e
adaptações fisiológicas dos fungos em contato com o metal pois a capacidade de
um organismo sobreviver em condições adversas depende da rapidez de suas
respostas fisiológicas as condições ambientais. (SANTOS, 2006).
A capacidade de biossorção dos fungos se aplica aos metais pesados. Testes
41
contando o número de unidades formadoras de colônias (UFC) mostraram um
aumento de 21% na dose de 200 mg Cu L-1 quando comparado ao tratamento
controle. Resultados encontrados pelo mesmo autor relatam um crescimento de
24% dosfungos em solos poluídos com Zn quando comparados com o tratamento
controle onde o crescimento mostrado foi de 4,5%. (SANTOS, 2006)
Os fungos podem ser sensíveis a compostos radioativos e defensivos
agrícolas. Fusarium oxysporum apresenta alterações na presença de herbicidas da
classe das triazinas, mostrando diferenças na pigmentação e na velocidade de
crescimento quando colocado na presença de diferentes concentrações de
herbicidas. (SANTOS, 2006).
Os processos de agregação do solo, decomposição de resíduos orgânicos,
mineralização de nutrientes, controle de pragas, doenças e estabelecimento de
relações simbióticas são realizados com a participação efetiva dos fungos.
Participam também de processos de degradação de pesticidas e podem servir como
compartimentalizadores de metais pesados do solo, diminuindo a sua toxidez para
ambiente. (SANTOS, 2006).
5.5.1 Candida albicans
Candida albicans é uma espécie de fungo diplóide que causa, oportunamente,
alguns tipos de infecção oral e vaginal nos seres humanos. As infecções causadas
por fungos emergiram como uma das principais causas de morte em pacientes com
algum tipo de imunodeficiência (como é o que caso dos portadores da AIDS e das
pessoas que estão passando por algum tipo de quimioterapia). Além disso, esse
fungo pode ser perigoso para pacientes cuja saúde já esteja enfraquecida, como por
exemplo os pacientes de uma unidade de tratamento intensivo. Devido a estes
fatores, a Candida albicans tem despertado grande interesse das pesquisas na área
de saúde e da medicina. (KUNAMOTO et al, 2005)
A Candida albicans está entre os muitos organismos que vivem na boca e no
sistema digestivo humano. Sob circunstâncias normais, a Candida albicans pode ser
encontrada em 80% da população humana sem que isso implique em quaisquer
42
efeitos prejudiciais a sua saúde, embora o excesso resulte em candidiase.
(KUNAMOTO et al., 2005)
A virulência e patogenicidade da Candida albicans estão ligadas a diversos
factores, sendo a formação de hifas, a estrutura da sua superfície celular (que,
durante o contacto com células do hospedeiro, se adapta, sendo determinante para
uma eficaz adesão e penetração), alterações fenotipicas (transição espontânea
entre a forma típica de levedura, branca e circular, e uma forma opaca, em forma de
pequenos bastões) e produção de enzimas extracelulares hidroliticas os mais
estudados ao longo dos últimos anos. (KUNAMOTO et al, 2005)
A patogenicidade da Candida albicans não pode ser atribuída a apenas um
factor isolado; é da produção concomitante dos diversos factores que este
organismo se transforma numa célula adaptada à invasão dos tecidos de um
hospedeiro imunodeprimido. Como forma de resistência, tem capacidade de se
multiplicar unicelularmente por gemulação. Na presença de compostos que induzem
à sua patogenicidade, e.g. soro de mamíferos, a Candida albicans expressa os seus
factores de virulência, tal como a formação de hifas; estas capacitam a célula para
exercer força mecânica, ajudando na sua penetração nas superfícies epiteliais, e
uma vez na corrente sanguínea, têm uma acção danosa sobre o endotélio, o que
permite que a Candida albicans invada os tecidos profundos do organismo (em
casos mais graves, a invasão dos tecidos hepático e pancreático). (KUNAMOTO et
al., 2005)
Em determinadas condições a Candida albicans desenvolve-se como uma
pseudo-hifa, que se caracteriza por uma célula alongada que se propaga por uma
gemulação unipolar, apresentando um aspecto de um cordão de contas.
(KUNAMOTO et al, 2005). A figura 6 a seguir apresenta a morfologia do gênero
Candida.
43
Figura 6: Candida albicans Fonte: Curiosidades de microbiologia, 2010.
5.6 Metabolismo microbiano na presença de HPAs
Várias vias metabólicas de degradação dos HAPs já foram identificadas em
diferentes microrganismos, porém as mais estudadas são do metabolismo aeróbico
realizado pelas bactérias, pelos fungos lignolíticos e pelos fungos não-lignilíticos. No
metabolismo bacteriano dos HAPs, a oxigenação inicial é realizada por uma enzima
intracelular dioxigenase que tem a função de reconhecer o HAP e adicionar dois
átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido a ressonância do anel
aromático. Esta importante enzima do ciclo biogeoquímico do carbono no planeta é
constituída de três componentes, uma oxigenase terminal, uma ferredoxina e uma
ferredoxina redutase dependente de NADPH, que, conjuntamente, formam uma
cadeia curta de transporte de elétrons. Um cis-diidrodiol é o produto da dioxigenase,
que por ação de uma desidrogenase será transformado em um composto
diidroxilado. Subseqüentes oxidações permitem a aber tura de um anel aromático e
a formação de ácido pirúvico, que será utilizado para a produção de carbono e
energia pela célula. A molécula com o anel fechado será transformada em um dos
intermediários centrais da via de degradação dos HAPs, que pode ser o catecol, o
protocatecol ou o gentisato.(JAQUES et al., 2005).
44
Até aqui atuaram as enzimas denominadas de periféricas, que tem a função de
reconhecer as moléculas dos HAPs e convertê-las nestes intermediários centrais. A
partir de então, atuam as denominadas enzimas de fissão, que converterão os
intermediários centrais em compostos que possam ser utilizados nas vias comuns de
geração de carbono e energia da bactéria. As enzimas de fissão podem ser divididas
em dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central: as enzimas
intradiol abrem o anel aromático por via orto, originando o cis-muconato, que por
passos sucessivos será convertido em succinato e acetil-coenzima; e as enzimas
extradiol fazem a abertura do anel aromático por via meta, originando o semialdeído
2-hidroximucônico que por passos sucessivos será transformado em ácido pirúvico e
acetaldeído.(JAQUES et al., 2005).
A possibilidade de utilização integral dessas vias bioquímicas permite a
algumas bactérias crescerem utilizando os HAPs como única fonte de carbono e
energia para o seu crescimento, resultando na degradação destes compostos e na
sua eliminação do ambiente. isolaram três bactérias do gênero pseudomonas que
degradaram em média 51% do antraceno presente no meio de cultura mineral. A
utilização de HAPs marcados com 14C permitiu a comprovação da capacidade das
bactérias em utilizar integralmente estas vias bioquímicas, conduzindo a
mineralização destes compostos obtiveram mineralizações próximas a 100% quando
o fenantreno foi utilizado como única fonte de carbono e energia por uma bactéria do
gênero Sphingobium. .(JAQUES et al., 2005).
Os fungos também podem metabolizar os HAPs. As principais vias descritas na
literatura são duas: a primeira está relacionada aos fungos não-lignolíticos e a
segunda aos fungos lignolíticos. Para exemplificá-las utilizar-se-á as vias de
degradação do fenantreno. O metabolismo dos HAPs do Cunninghamella elegans é
bastante estudado entre os fungos não lignolíticos. Assim como em seres humanos,
o citocromo P450 realiza a monoxigenação inicial do fenantreno em óxidos arenos
(epóxidos), que, através das enzimas epóxido hidrolases, são transformados em
trans-diidrodióis, ou um dos anéis pode ser rearranjado nãoenzimaticamente a fenol
e ser conjugado, originando compostos como oglicosídeos e o-glicoronídeos. Os
trans-diidrodióis são transformados por desidratação em fenantróis, que podem
então ser convertidos em 9-fenantrilbeta-D-glicopiranosídeo, que se acredita ser um
dos produtos finais da via de degradação dos fungos não-lignolíticos. .(JAQUES et
al., 2005).
45
Em vista da baixa solubilidade em água e forte tendência de sorção as
partículas minerais e orgânicas, a degradação dos HAPs pode ser limitada devido a
baixa biodisponibilidade destes compostos, uma vez que bactérias e fungos
somente absorvem nutrientes que estejam em solução. Os microrganismos têm
buscado superar esta limitação utilizando-se de mecanismos como a produção de
biossurfactantes. Os surfactantes são compostos químicos que apresentam uma
porção hidrofílica e uma porção hidrofóbica, fazendo com que se posicionem
preferencialmente nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de
polaridade (como nas interfaces óleo/água ou ar/água). Uma das propriedades
destas moléculas é a redução da energia interfacial (tensão interfacial) e da tensão
superficial devido a formação de uma camada molecular ordenada na interface.
Além disso, promovem a formação de microemulsões, onde os HAPs são
incorporados no centro hidrofóbico das micelas e, desta forma, podem penetrar
numa solução aquosa. .(JAQUES et al., 2005).
Os surfactantes utilizados na biorremediação podem ser produzidos
industrialmente, a partir de derivados do petróleo, ou serem sintetizados
biologicamente por microrganismos. A utilização de surfactantes biológicos
(biossurfactantes) apresenta vantagens em relação aos industriais, como a menor
toxicidade aos microrganismos degradadores, menor recalcitrância no ambiente,
maior diversidade de estruturas químicas, atuação em uma gama maior de
condições, dentre outros fatores. .(JAQUES et al., 2005).
Os biossurfactantes são sintetizados nas células microbianas e liberados para
o meio; sua porção hidrofílica pode ser constituída de aminoácidos, peptídeos e
sacarídeos e a porção hidrofóbica é normalmente formada por ácidos graxos
saturados ou insaturados.adicionaram um biossurfactante ramnolipídeo produzido
por Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ao meio de cultura mineral e verificaram
que a solubilidade do fenantreno aumentou de 0,7 mg L-1 para 35 mg L-1, o que
resultou em um aumento significativo da biodegradação deste HPA obtiveram
aumentos da biodegradação do tetradecano, pristano e hexadecano no solo, com a
adição de um biossurfactante produzido por uma bactéria do gênero Pseudomonas.
Observou reduções de 90, 85 e 74% nas concentrações de antraceno, fenantreno e
pireno, respectivamente, após a adição ao solo de um biossurfactante. Estes relatos
são exemplos das potencialidades da utilização de biossurfactantes visando
46
aumentar a biodisponibilidade e, conseqüentemente, a degradação dos HAPs no
ambiente. .(JAQUES et al., 2005).
47
6 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROSCOPIA DE MASSAS
Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) é a
combinação de duas técnicas poderosas: a cromatografia gasosa para maior
eficiência na separação dos componentes em amostras complexas, e a
espectrometria de massas para identificação destes componentes bem como para
identificação de componentes desconhecidos.(NIESSEN, 2001).
6.1 Cromatografia gasosa
A cromatografia gasosa ou líquido/gasosa foi introduzida em 1952 por James e
Martin. Sua operação básica é a volatilização e a transferência dos analitos para
uma coluna cromatográfica, através de uma interface aquecida chamada de injetor.
A coluna cromatográfica também é aquecida de forma controlada podendo criar
rampas com temperaturas desejadas, e para movimentar a amostra dentro da
coluna usa-se um gás inerte, como hélio ou nitrogênio, que é chamado de gás de
arraste, o qual faz o papel da fase móvel. A aplicação desta técnica é ampla,
contudo sua principal limitação deve-se ao fato de que os analitos devem ser
voláteis e estáveis nas condições de análise (SOUZA, 2008).
A identificação dos compostos utilizando apenas o sistema de cromatografia
pelo seu tempo de eluição através da coluna era bastante difícil. A identificação
muitas vezes tinha que ser feita posteriormente, através da coleta do analito,
geralmente feita borbulhando o efluente da coluna em solvente ou então em
condensadores apropriados (chamados de cold trap), para só então realizar a
identificação por infravermelho ou por espectrometria de massas. Contudo não
demorou muito para que as técnicas de cromatografia gasosa e de espectrometria
de massas fossem acopladas, dando origem ao GC-MS. Um dos primeiros relatos
(senão o primeiro) sobre esta interface entre o GC e o MS é de Gohlke (1959). Hoje
em dia a técnica GC-MS é muito difundida, sendo que várias configurações podem
ser encontradas. Uma das mais comuns é o GC-MS utilizando ionização eletrônica
com detector do tipo ion trap (SOUZA, 2008).
48
6.1.1 Análise Quantitativa
A CG quantitativa está baseada na comparação da altura ou da área de um
pico analítico com aquele de um ou mais padrões. Se as condições são controladas
adequadamente, ambos os parâmetros variam linearmente com a concentração.
Portanto, considerando esse fato, a área é um parâmetro analítico mais satisfatório
que a altura do pico. Contudo, as alturas de pico são medidas de forma mais fácil e,
para os picos estreitos, mais exata. A maioria dos instrumentos cromatográficos
modernos é equipada com computadores que fornecem medidas de áreas relativas.
(HARRIS, 2005).
6.1.1.1 Calibração com padrões
O método mais direto de análise cromatográfica gasosa quantitativa envolve a
preparação de uma série de soluções padrão cuja composição se aproxima daquela
da amostra (método do padrão externo). Os cromatogramas para os padrões são
obtidos e as alturas dos picos ou suas áreas são empregadas em um gráfico em
função da concentração para se obter uma curva analítica. Um gráfico dos dados
deve fornecer uma linha reta passando pela origem; as análises quantitativas são
baseadas nesse gráfico. A calibração deve ser realizada sempre antes das
determinações para maior exatidão (NIESSEN, 2001).
Através da curva de calibração obtem-se uma regressão linear (y= a.x + b),
onde teremos:
Concentração do analito = (área do analito/área PI) x conc. PI + b
Onde:
PI: padrão interno
b: é o valor onde a reta corta o eixo y
49
6.2 Método do padrão interno
A maior precisão em CG quantitativa é obtida empregando-se padrões internos
porque as incertezas introduzidas pela injeção da amostra, vazão e variações nas
condições da coluna são minimizadas. Nesse procedimento, uma quantidade
cuidadosamente medida de um padrão interno é introduzida em cada padrão de
calibração e na amostra e a razão entre área do pico do analito (ou sua altura de
pico) e a área do pico do padrão interno (ou sua altura) é utilizada como parâmetro
analítico. Para que esse método seja bem-sucedido, é necessário que o pico do
padrão interno seja bem separado dos picos dos outros componentes da amostra.
Contudo, deve aparecer próximo ao pico do analito. Naturalmente, o padrão interno
deve estar ausente na amostra a ser analisada. Empregando-se um padrão interno
adequado, precisões relativas de 0,5% a 1% têm sido relatadas (NIESSEN, 2001).
6.3 Espectroscopia de massas
Espectrometria de massas pode ser entendida como uma técnica analítica que
permite a identificação da composição química de um determinado composto
isolado, ou de diferentes compostos em misturas complexas, através da
determinação de suas massas moleculares na forma iônica, (ou seja, com carga
elétrica líquida, positiva ou negativa), baseada na sua movimentação através de um
campo elétrico ou magnético. Esta movimentação é determinada pela razão entre a
massa de um determinado composto (analito) e sua carga liquida, designada por
m/z (mass to charge ratio). Assim, conhecendo o valor de m/z de uma molécula é
possível inferir sua composição química elementar, e com isso determinar sua
estrutura. A espectrometria de massas pode ser utilizada em análises quantitativas,
mas é em análises qualitativas que ela tem se destacado, como na identificação de
compostos em misturas e, principalmente, na caracterização estrutural de
compostos desconhecidos, que pode ser alcançado através da formação de íons-
molécula e de seus respectivos íons-fragmentos (SOUZA, 2008).
50
Poderíamos considerar então que a espectrometria massas fornece
informações precisas sobre a massa dos compostos analisados. Contudo devemos
tomar muito cuidado com este tipo de conclusão! Na realidade um espectrômetro de
massas fornece a massa obtida apenas de íons, entretanto nem todas as moléculas
contêm grupos químicos naturalmente carregados. Tomemos como exemplo a
glucose (Glc), uma molécula neutra, ou seja, sem carga líquida, que apresenta uma
massa molecular nominal de 180 Da. Os procedimentos de ionização para uma
molécula neutra como a Glc, envolvem a incorporação de adutores iônicos, sendo o
mais comum o cátion Na+. Neste processo, o adutor interage ou mesmo participa de
ligações coordenadas com o analito fornecendo a ele sua própria carga. Como
conseqüência deste processo de ionização a massa iônica da glucose passa de 180
Da para 203 Da, ou em termos mais apropriados, seu íon pseudo-molecular tem m/z
203 [M+Na]+, no qual z sendo igual a 1 (um) é possível pela subtração do adutor
conhecer a massa do composto original: m/z 203 – 23 (Na+) = 180 Da. É desta
forma que moléculas neutras podem ser analisadas por espectrometria de massas.
Em outros processos de ionização dependendo das características químicas das
moléculas a serem analisadas, pode se obter íons protonados, comuns em
moléculas contendo grupamentos R-NH2, ou então íons desprotonados, como no
caso de moléculas que apresentam grupamentos ácidos em suas estruturas. Nestes
dois casos os íons são chamados de íons quasi-moleculares (SOUZA, 2008).
A espectrometria de massas também é utilizada na determinação de razões
isotópicas. Tomemos como exemplo a análise de uma amostra de NaCl. Em solução
os íons Na+ e Cl- estarão dissociados, e quando analisados em modo de detecção
de íons positivos, será obtido apenas um íon de m/z 23 referente ao Na+
(SOUZA,2008).
Entretanto, quando analisamos esta mesma solução em modo de detecção de
íons negativos veremos o aparecimento de dois íons, um de m/z 35 sendo este o íon
base (aquele aparece representando 100%) e outro de m/z 37, que deverá
representar cerca de 1/3 do íon base. Estes resultados devem-se à relação isotópica
apresentada pelos íons analisados. Átomos de sódio são mono-isotópicos, com uma
massa de 22,98977 m.u. (nominal de 23 m.u.). Já os íons cloreto apresentam dois
isótopos, um com massa de 34,9688527 m.u. (nominal de 35 m.u., com abundância
natural de cerca de 75%) e outro com massa de cerca de 36,9659026 m.u. (nominal
de 37 m.u., com abundância natural de cerca de 25%) (SOUZA, 2008).
51
Moléculas orgânicas são formadas essencialmente por átomos de carbono e
hidrogênio, e ambos contêm dois isótopos principais, no caso do carbono temos o
isótopo leve 12C (~99%) e o pesado 13C (~1%), e para o hidrogênio temos o
isótopo leve 1H (>99,9%) e o isótopo pesado 2H (<0,1%). Apesar de aparecerem em
baixas concentrações naturais, moléculas contendo pelo menos 1 isótopo pesado
podem representar grande parte das moléculas naturais. Moléculas contendo
diferentes isótopos são designadas como isotopólogos (SOUZA, 2008).
52
7 MATERIAIS E MÉTODOS
Os seguintes materiais foram utilizados na pesquisa:
a) Solo
As amostras de solos estudados no presente trabalho foram provenientes do
Laboratório de Solo do Departamento de Análises de Solo da Faculdade de
Agronomia da UFRGS, o mesmo é classificado como solo inerte, ou seja, sem
presença de outros tipos de contaminantes.
b) Vidrarias e equipamentos:
Elermeyers de 500 mL para a incubação dos solos, eppendorf de 1 mL,
micropipetadores automáticos (0,01-10 mL), placas de Petry, pHmetro digital
Multitec PG 1800, cápsulas de porcelana, estufa De léo, dessecador, bico de
bunsen, autoclave Bio Eng A30, alça de platina, contador de colônias
mecânico Phoenix CP 602, tubo plástico com tampa, balão de fundo redondo
de 50 mL, funil, papel de filtro, ultra-som, rotaevaporador, mixer, vial 2 mL,
cap, cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas autosampler
Perkin Elmer e peneira de 2 mm.
c) Reagentes:
Foram utilizados água deionizada e destilada, bactérias Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, fungo Candida albicans,
PCA (Plate Count Agar), benzo(a)pireno (padrão interno) da Dr Ehrenstorfer,
cartucho de sílica, pentano grau HPLC, diclorometano grau HPLC da Tédia e
ciplohexano grau HPLC da Tédia para preparo dos padrões.
d) Análises:
As análises de pH foram realizadas do laboratório de química da
UNILASALLE, a incubação e contagem dos microrganismos foram realizadas
no laboratório de microbiologia da UNILASALLE, a contaminação de
benzo(a)pireno foi realizada no Laboratório de Análises Regulatórias do RPC
Américas da Souza Cruz AS, juntamente com a preparação do solo para a
incubação e as análises de benzo(a)pireno foram realizadas no laboratório
particular ALAC.
53
7.1 Preparação e contaminação do solo
A preparação do solo é muito importante para uma melhor eficiência na análise
de cromatografia gasosa acoplada com massas. Nesta etapa inicial, todo o solo a
ser utilizado em todas as análises foi peneirado com uma peneira de 2mm. A figura
7 apresenta o peneiramento do solo.
Figura 7: Peneiramento do solo Fonte: Autoria própria, 2010.
A contaminação do solo foi realizado com o contaminante Benzo(a)pireno
(padrão interno). Colocou-se a quantidade total de solo em um recipiente plástico de
2L, pesou-se o padrão benzo(a)pireno e foi adicionado a uma concentração de
647µg/Kg, mexeu-se bem até total homogeneização, deixou-se repousar por 10
dias.
7.2 Medição e redução do pH
A determinação do pH do solo é muito importante, pois o pH influencia no
crescimento e metabolismo dos microrganismos.
Foram adicionado 30 mL de água deionizada e destilada a um béquer
contendo 30 g de solo, deixando-se repousar por 10 min. Agitou-se novamente e a
54
amostra ficou em repouso por 20 min. A figura 8 apresenta a amostra para leitura de
pH.
Figura 8: Preparo da amostra para medição do pH Fonte: Autoria própria, 2010.
Após realizou-se a leitura do pH na solução sobrenadante. O pH normal do
solo fica em torno de 6,5 à 7,5, porém alguns microorganismos apresentam um
melhor comportamento com pH reduzido, entre 5,0 a 5,5.
Foi realizado a redução do pH do solo. Colocou-se toda a quantidade do solo
em um recipiente plástico de 2l. Pesou-se 100gr de nitrato de alumínio e adicionou-
se 100mL de água deionizada, homogeneizou-se a solução e foi adicionado no solo.
Deixou-se repousar por 7 dias e foi repetido a medição do pH, o resultado
apresentado foi de 5,25. A figura 9 apresenta o recipiente onde o solo ficou em
repouso.
Figura 9: Solo em repouso para a redução do pH Fonte: Autoria própria, 2010.
55
7.3 Planejamento fatorial
Utilizamos a técnica de planejamento fatorial, que permite a combinação de
todas as variáveis em todos os níveis, obtendo-se assim uma análise completa das
variáveis.
O planejamento fatorial é a melhor maneira de prever interação entre fatores.
Foi realizado um planejamento fatorial do tipo 2k , isto é, dois níveis, com duas
variáveis, gerando um 22, que é muito útil em investigações preliminares, quando
queremos saber se determinados fatores têm ou não influência sobre a resposta e
não estamos preocupados ainda em descrever muito rigorosamente essa possível
influência. É um planejamento muito simples de executar, que depois podem ser
ampliados para formar um planejamento mais sofisticado.
No planejamento de qualquer experimento, a primeira coisa que devemos fazer
é decidir quais são os fatores e as respostas de interesse. Os fatores, em geral, são
as variáveis que o experimentador tem condições de controlar. Podem ser
qualitativos, como o tipo de microrganismo, ou quantitativos, como a temperatura.
(NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2007).
As variáveis e níveis utilizados foram os seguintes:
a) Temperatura de incubação: (32ºC e 37ºC);
b) Colônias de microrganismos: (Consórcio 1: Pseudonomas e Bacillus,
Consórcio 2: Serratia e Candida).
Para fazer um planejamento fatorial completo, devemos realizar experimentos
com todas as possíveis combinações dos níveis dos fatores:
a) Consórcio 1 em temperatura de 32ºC;
b) Consórcio 1 em temperatura de 37ºC;
c) Consórcio 2 em temperatura de 32ºC;
d) Consórcio 2 em temperatura de 37ºC.
A lista dessas combinações, que é chamada de matriz de planejamento
(NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2007).
56
7.4 Preparação dos meios de cultura e inoculação do s microrganismos
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial de microrganismos. Estes
meios fornecem os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. (NEDER,
et al, 2000).
Pesou-se 2,8g de caldo de BHI, adicionou-se 75mL de água deionizada em
erlemeyer de 125mL. Tampou-se com papel de alumínio juntamente com papel
pardo, com camada dupla. Colocou-se na autoclave à 120ºC. A figura 10 apresenta
os meios de cultura.
Figura 10: Meios de cultura Fonte: Autoria própria, 2010.
A inoculação consiste em semear os microrganismo em meios de cultura
adequados a suas exigencias bioquimicas e nutricionais, onde estarão submetidas à
condições ideais de temperatura e oxigenação, obtendo assim reprodução dos
mesmos. (NEDER et al., 2000).
Colocou-se um fração de cada uma das colônias, Bacillus, Pseudonomas,
Serratia e Candida, nos erlenmeyers contendo a solução preparada de meios de
cultura, fechou-se com camada dupla de papel alumínio e papel pardo, logo após foi
levado para a estufa à 32ºC, ficando em incubação por 3 dias. As figuras 11 e 12
apresentam o processo de inoculação.
57
Figura 11: Inoculação dos microrganismos Fonte: Autoria própria, 2010.
Figura 12: Microrganismos inoculados Fonte: Autoria própria, 2010.
7.5 Incubação dos microrganismos
A seguir estão descritas as etapas que envolveram a incubação dos
microrganismos.
7.5.1 Preparação dos frascos
58
Vinte e quatro erlenmeyers de 500mL foram lavados com água, sabão e água
deionizada, para que não ocorresse nenhuma interferência com o meio externo.
Após a lavagem, os frascos foram para aquecimento sob uma temperatura de 105ºC
por um intervalo de 4 horas. Transcorrido o período de aquecimento na estufa, os
frascos foram retirados e colocados num local e um ambiente adequado, para evitar
contaminação com microrganismos presentes no ar.
7.5.2 Preparação das amostras
Amostras de aproximadamente 60 g de solo contendo como contaminantes
Benzo(a)pireno foram acrescentadas nos frascos. A quantidade de massa em cada
frasco está indicada na tabela 2 a seguir.
Tabela 2: Relação de frascos com massa de solo
Frasco Massa solo
1 59,97g
2 59,98g
3 60,08g
4 59,97g
5 59,97g
6 59,95g
7 60,06g
8 59,97g
9 59,95g
10 60,15g
11 60,43g
12 60,40g
13 60,38g
14 59,97g
15 60,24g
16 60,67g
17 60,06g
59
18 60,13g
19 60,46g
20 59,90g
21 60,53g
22 60,06g
23 60,33g
24 60,45g
Fonte: Autoria própria, 2010.
A figura 13 a seguir ilustra o solo sendo pesado e colocado no frasco.
Figura 13: Preparação das amostras Fonte: Autoria própria, 2010.
7.5.3 Incubação
Três espécies de bactérias foram usadas: Bacillus, Pseudonomas e Serratia,
uma espécie de fundo: Candida. Foram divididas em dois consórcios: consórcio 1 e
consórcio 2. Utilizamos as iniciais de cada microrganismo para identificação, segue
abaixo:
Bacillus – B
Pseudonomas – P
60
Serratia – S
Cândida – C.
Os consórcios foram divididos da seguinte maneira:
Consórcio 1: B&P
Consórcio 2: S&C
Os frascos foram divididos conforme a tabela 3 a seguir:
Tabela 3: Relação de frascos com espécies de microrganismos
Frasco Consórcio
1 Consórcio 1
2 Consórcio 1
3 Consórcio 1
4 Consórcio 1
5 Consórcio 1
6 Consórcio 1
7 Consórcio 2
8 Consórcio 2
9 Consórcio 2
10 Consórcio 2
11 Consórcio 2
12 Consórcio 2
13 Consórcio 1
14 Consórcio 1
15 Consórcio 1
16 Consórcio 1
17 Consórcio 1
18 Consórcio 1
19 Consórcio 2
20 Consórcio 2
21 Consórcio 2
22 Consórcio 2
23 Consórcio 2
24 Consórcio 2
Fonte: Autoria própria, 2010.
61
Foi acrescentado com uma pipeta automática 300 µL de cada consórcio nos
respectivos frascos e estes foram fechados com camada dupla de papel alumínio e
pardo, para não haver interação do meio externo com o interno, o que poderia
interferir no resultado final do procedimento, logo após este procedimento os frascos
foram levados para as estufas.
7.5.4 Incubação das amostras
As amostras foram incubadas em duas temperaturas, com a finalidade de
observar o comportamento bacteriano dos diferentes consórcios.
A tabela 4 a seguir apresenta a relação dos consórcios, condição e frasco
Tabela 4: Consórcios com relação à temperatura
Frasco Consórcio Temperatura
1 Consórcio 1 37ºC
2 Consórcio 1 37ºC
3 Consórcio 1 37ºC
4 Consórcio 1 37ºC
5 Consórcio 1 37ºC
6 Consórcio 1 37ºC
7 Consórcio 2 37ºC
8 Consórcio 2 37ºC
9 Consórcio 2 37ºC
10 Consórcio 2 37ºC
11 Consórcio 2 37ºC
12 Consórcio 2 37ºC
13 Consórcio 1 32ºC
14 Consórcio 1 32ºC
15 Consórcio 1 32ºC
16 Consórcio 1 32ºC
17 Consórcio 1 32ºC
62
18 Consórcio 1 32ºC
19 Consórcio 2 32ºC
20 Consórcio 2 32ºC
21 Consórcio 2 32ºC
22 Consórcio 2 32ºC
23 Consórcio 2 32ºC
24 Consórcio 2 32ºC
Fonte: Autoria própria, 2010.
A figura 14 a seguir ilustra o monitoramento das amostras.
Figura 14: Monitoramento das amostras Fonte: Autoria própria, 2010.
7.6 Contagem dos microrganismos
As contagens dos microrganismos foram realizadas no laboratório da
microbiologia da UNILASALLE.
Este procedimento foi realizado em placas pelo método das diluições. Este
método consiste em colocar um inoculo de uma cultura com quantidade
desconhecida de células em uma placa com meio de cultura. Contando as colônias
que cresceram após a incubação das placas, teremos o número de Unidades
Formadoras de Colônias (UFCs/mL) da cultura que estamos ensaiando. Porém,
como, em geral, pretendemos contar as células de culturas de crescimento denso,
63
torna-se necessário fazer diluições do inoculo, a fim de que apareça nas placas um
número final de colônias entre trinta e trezentas, o que facilitará a contagem e
fornecerá uma aproximação mais exata da população microbiana. (NEDER et al,
2000).
Foram realizadas quatro contagem, em cada etapa realizada, foi feito o mesmo
procedimento.
Foi pesado aproximadamente 0,1g de solo em eppendorf de cada consórcio
exposto as duas temperaturas, a divisão foi realizada da seguinte forma conforme
tabela 5 a seguir:
Tabela 5: Método contagem de colônias
Consórcio Temp. 10-1 10-2
10-3
32ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição
Consórcio 1
37ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição
32ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição
Consórcio 2
37ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição
Fonte: Autoria própria, 2010.
Após a etapa da pesagem do solo, iniciou-se a diluição de cada uma destas
alíquotas, adicionou-se 100 µL na original. Procedeu-se diluição seriada até 10-6. A
figura 15 mostra a seqüência de diluição.
64
Figura 15: Diluição da amostra para contagem dos microrganismos Fonte: Autoria própria, 2010.
Em cada diluição, levou-se cada alíquota para o misturador, para melhor
solubilização. A figura 16 apresenta a homogeneização da amostra.
Figura 16: Homogeneização das amostras Fonte: Autoria própria, 2010.
Após este processo, a solução das alíquotas foram transferidas para uma placa
de Petry com PCA (Plate Count Agar), para contagem das colônias. Foi utilizada
uma alça de vidro, tipo Drigalsky, flambada para espalhar a solução na placa. A
figura 17 apresenta o procedimento de transferência da amostra para a placa de
Petry.
65
Figura 17: Distribuição da amostra na placa de Petry Fonte: Autoria própria, 2010.
A distribuição das placas, ficou conforme a tabela a seguir.
Tabela 6: Distribuição nas placas de Petry
Consórcio Temp. 10-1 10-2
10-3
Placas
32ºC
Consórcio 1
37ºC
32ºC
Consórcio 2
37ºC
Fonte: Autoria própria, 2010.
As placas foram incubadas em estufa à 37ºC por 48 h em aerobiose, a seguir s
foram contadas as colônias, utilizando-se do equipamento Contador de Colônias
Mecânico CP602, apresentado na figura 18.
66
Figura 18: Contador de Colônias Mecânico CP602 Fonte: Autoria própria, 2010.
A contagem foi feita apenas nas colônias que possibilitaram a sua visualização
macroscópica e que possuíam a caracterização bem definidas, conforme a figura 19.
Figura 19: Consórcio 1- Colônia A: Bacillus; Colônia B: Pseudomonas Fonte: Autoria própria, 2010.
A cada contagem dos microorganismos foi realizado o descarte dos frascos,
devido à contaminação exposta com o procedimento. A tabela a seguir mostra a
ordem do descarte.
Tabela 7: Descarte dos frascos após procedimento
A
B
67
Contagem Frascos descartados
1ª 1, 7, 13 e 19
2ª 2, 8, 14 e 20
3ª 3, 9, 15 e 21
4ª 4, 10, 16 e 22
Fonte: Autoria própria, 2010.
7.7 Quantificação Benzo(a)pireno
A quantificação do benzo(a)pireno no solo foi realizado no laboratório particular
ALAC, o método utilizado foi o EPA 8270-d.
68
8 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Realizou-se a leitura do pH do solo que foi realizado a incubação, o resultado
foi de 5,25. Segundo Jaques, 2005, o pH atua diretamente na atividade dos
microrganismos através dos efeitos dos íons H+ na permeabilidade celular e na
atividade enzimática, assim como indiretamente, pela influência na disponibilidade
de macro e micronutrientes, e na solubilidade dos metais pesados, que podem ser
tóxicos aos microrganismos.
A quantificação inicial do solo foi realizada após a contaminação de b(a)p, o
resultado obtido foi de 647 µg/kg.
Realizou-se quatro contagens de crescimento dos microrganismos em cada 15
dias. O resultado das contagens encontra-se nas tabelas a seguir.
Tabela 8: Resultados da primeira contagem
Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC
Consórcio 1 2,2 X 108 UFC/g 1,9 x 108 UFC/g
Consórcio 2 2,0 X 108 UFC/g 1,51 X 108 UFC/g
Fonte: Autoria própria, 2010.
Tabela 9: Resultados da segunda contagem
Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC
Consórcio 1 3,8 X 108 UFC/g 9,51 x 108 UFC/g
Consórcio 2 2,3 X 108 UFC/g 1,1 X 109 UFC/g
Fonte: Autoria própria, 2010.
Tabela 10: Resultados da terceira contagem
Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC
Consórcio 1 4,1 X 107 UFC/g 3,2 x 107 UFC/g
Consórcio 2 3,1 X 106 UFC/g 1,3 X 107 UFC/g
Fonte: Autoria própria, 2010.
69
Tabela 11: Resultados da quarta contagem
Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC
Consórcio 1 1,2 X 105 UFC/g 2,2 x 106 UFC/g
Consórcio 2 3,3 X 104 UFC/g 4,7 X 105 UFC/g
Fonte: Autoria própria, 2010.
Através destes resultados, é possível plotar uma curva de crescimento
microrganismos. A figura 20 apresenta a curva de crescimento em escala logarítmica
dos consórcios ao longo do experimento.
0,00E+00
2,00E+08
4,00E+08
6,00E+08
8,00E+08
1,00E+09
1,20E+09
0 1 2 3 4
tempo (quinzena)
UF
C p
or g
ram
a
Consórcio 1 temperatura 32ºCConsórcio 2 temperatura 32ºCConsórcio 1 temperatura 37ºCConsórcio 2 temperatura 37ºC
Figura 20: Crescimento dos consórcios ao longo do experimento Fonte: Autoria própria, 2010.
O consórcio 2 à 37ºC foi o que demonstrou maior desenvolvimento microbiano
juntamente com o consórcio 1 nas mesmas condições. Foi observado que em
temperaturas mais elevadas favoreceu expressivamente o crescimento. Altas
temperaturas ajudam na atividade biológica, o consumo de substrato pelo
microrganismo e, por conseqüência, a biodegradação dos HPAs (JAQUES et al.,
2005).
O consórcio 1 e 2 à 32ºC não obtiveram a mesma eficiência, mostrou um
crescimento razoável.
70
Embora o decréscimo após a terceira quinzena, foi possível observar alguns
resultados. Os microrganismos poderiam não se desenvolver, ou até mesmo morrer
nas primeiras quinzenas. No presente experimento os microrganismos consorciados
utilizaram o contaminante benzo(a)pireno como forma de carbono, convertendo
como energia. As condições ambientais expostas, de alguma forma contribuíram
para tal resultado.
O resultado da quantificação final do solo foi realizada em apenas uma
variável. Foi escolhido o consórcio 1 à 37ºC, onde os resultados microbianos
apresentaram melhor desenvolvimento. O resultado final obtido foi de 86,3 µg/Kg.
Com o resultado obtido, foi possível mostrar um processo viável para a redução do
contaminante no solo, os microrganismos Pseudonomas e Bacillus utilizaram de
alguma forma o B(a)p como fonte de carbono inorgânico, o que justificaria a redução
de em 86,66%.
Para obtenção de resultados satisfatórios, foi estudado limitações bióticas e
abióticas que podem influenciar a biorremediação em solos contaminados com
HPAs. Foi fundamental a importância do conhecimento dos princípios e das
aplicações desta técnica, de acordo com as condições específicas do contaminante.
Além disso, volume de solo tratado, tempo de remediação, dependência de
condições ambientais, aceitação pública e impacto ambiental devem ser levados em
consideração para que este processo se torne economicamente viável e eficiente.
Entretanto, com somente uma variável, não é possível ter a confirmação da
biorremediação. Possíveis erros como transporte do solo contaminado, extração,
injeção, cálculos através da área dos picos, são fatores para que o resultado não se
torne confiável. Portanto sugere-se para próximos trabalhos a realização da
quantificação final em todas as análises em duplicata ou triplicata, para se ter a
confiabilidade no resultado.
71
9 CONCLUSÃO
A utilização de microrganismos degradadores é uma alternativa que já vem
sendo utilizada em outros países e tem grandes chances de se desenvolver no
Brasil. As pesquisas nacionais e internacionais já possibilitaram o isolamento e a
identificação destes microrganismos, assim como o conhecimento das vias
bioquímicas, que confirmam a capacidade de transformação dos HPAs. (JAQUES et
al., 2005).
Este trabalho comprovou um processo viável para uma possível
biorremediação com as bactérias como: Pseudonomas aeruginosa e Bacillus
subtilis. O bom crescimento do consórcio 1 à 37ºC, demonstrou uma redução de
86,66% do contaminante B(a)p, o que significou que estes microrganismos
provavelmente utilizaram o contaminante como forma de carbono convertido em
energia, transformando-o em substâncias menos tóxicas . Fatores ambientais como
disponibilidade de água e oxigênio, temperatura e pH e disponibilidade de nutrientes
inorgânicos influenciaram na sobrevivência e a atividade dos microrganismos
degradadores.
Altas temperaturas ajudam na atividade biológica, o consumo de substrato pelo
microrganismo e, por conseqüência, a biodegradação dos HPAs (JAQUES et al.,
2005). O crescimento microbiano foi comprovado melhor eficiência à temperatura
mais alta, 37ºC. Tanto no consórcio 1, quanto no consórcio 2, foi demonstrado que a
taxa de crescimento teve uma variação expressiva comparada a temperatura de
32ºC.
Para próximos trabalhos sugere-se fazer a quantificação final em todas as
amostras. Neste trabalho escolheu-se apenas um consórcio e uma temperatura, o
que demonstrou melhores resultados. Sendo assim, não foi comprovado a
biorremediação.
72
REFERÊNCIAS
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75
ANEXO A – Resultado quantificação inicial
76
ANEXO B – Cromatograma da quantificação inicial
77
ANEXO C – Resultado quantificação final consórcio 1
78
ANEXO D – Cromatograma da quantificação final consó rcio 1
