Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos … · 2019-06-06 · Estudo de...
Transcript of Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos … · 2019-06-06 · Estudo de...
Dissertação para a candidatura ao grau de
Mestre em Biologia Celular e Molecular
submetida à Faculdade de Ciências da
Universidade do Porto.
O presente trabalho foi desenvolvido sob a
orientação científica da Professora Doutora
Sofia Dória Príncipe dos Santos Cerveira e
foi realizado no Departamento de Genética
da Faculdade de Medicina da Universidade
do Porto.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água
no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”
Madre Teresa de Calcutá
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
VII
Agradecimentos
Ao Prof. Doutor José Pissarra, diretor do Mestrado em Biologia Celular e Molecular da
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, pelo trabalho realizado em prol
deste mestrado. Ao restante corpo docente, agradeço os ensinamentos e a
experiência que nos transmitiram.
Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto,
na pessoa do seu diretor Prof. Doutor Alberto Barros, por me ter acolhido e pela
disponibilização de todos os materiais e equipamentos para a realização da presente
dissertação. Obrigada pelo voto de confiança.
À Prof. Doutora Sofia Dória, orientadora desta dissertação, agradeço a confiança que
depositou em mim. Estou também grata pelo acompanhamento disponibilizado ao
longo das diferentes etapas deste trabalho e pelo apoio nas dúvidas e inseguranças
que me foram surgindo.
À Dra. Vera Lima, co-orientadora desta dissertação, agradeço a amizade, o apoio, os
ensinamentos e os bons conselhos que me foi transmitindo desde que nos
conhecemos. Agradeço também a disponibilidade, a orientação e a revisão desta
dissertação
Aos restantes colaboradores do Departamento de Genética, obrigada pelo apoio na
realização deste trabalho. Um agradecimento especial à Dra. Ana Paula Neto pela
ajuda na realização do QF-PCR, bem como pela disponibilidade e paciência que
sempre demonstrou. À Prof. Doutora Filipa Carvalho agradeço as críticas construtivas
que me ajudaram a melhorar o meu trabalho.
Um agradecimento muito especial a todos os casais que participaram neste estudo,
pela sua disponibilidade, simpatia e boa-vontade.
À minha turma, Mestrado em Biologia Celular e Molecular 2011/2013, pelos excelentes
momentos que fomos partilhando.
Aos meus amigos, em especial à Eduarda, Marta e Tânia, pela compreensão e pelas
palavras de incentivo. Obrigada por me perdoarem tantas ausências!
À Liliana, minha colega de estágio e minha amiga. Obrigada por todo o apoio e ajuda
que tornaram este processo mais simples. Mas, acima de tudo, obrigada por todos os
bons momentos que passamos dentro e fora do Departamento. Obrigada por todas as
conversas, bem humoradas ou mais profundas, por todos os almoços e lanches, pelas
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
VIII
palavras amigas nos momentos mais complicados. Em suma: obrigada por seres
minha amiga!
A ti, Tiago, obrigada por existires na minha vida!
À minha família, nomeadamente aos meus pais e irmã, pelo apoio incondicional,
mesmo nos meus piores momentos. Aos meus pais, agradeço o exemplo de trabalho
e determinação que contribuiu muito para me incentivar ao longo deste longo caminho.
À minha irmã devo um agradecimento especial pela paciência com que lidou comigo
ao longo desta fase e pela disponibilidade para me ajudar sempre que necessário.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
IX
Índice
Agradecimentos VII
Índice IX
Índice de Tabelas XI
Índice de Figuras XIII
Lista de Abreviaturas XV
Resumo XVII
Abstract XIX
I- Introdução 1
1. Aneuploidia 3
1.1. Mecanismos de origem da aneuploidia 3
1.1.1. Meiose 3
1.1.2. Origem pós-zigótica (mitótica) 7
1.1.3. Aneuploidias autossómicas mais frequentes 9
2. Diagnóstico pré-natal de aneuploidias 15
2.1. Técnicas de análise de patologia cromossómica 15
2.1.1. Cariótipo 15
2.1.2. FISH (Hibridação in situ de fluorescência) 16
2.1.3. QF-PCR (Quantitative fluorescent polymerase chain
reaction) 17
2.1.4. MLPA ® (Multiplex ligation-dependent probe
amplification) 18
3. Alteração da expressão génica e aneuploidia 19
3.1. Aneuploidia e instabilidade cromossómica 19
3.1.1. MAD2L2 21
3.1.2. BUB1 22
3.1.3. BUB1B 25
3.1.4. KIF2C 27
II- Objetivos 31
III- Metodologia 35
1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C 37
1.1. Obtenção e preparação das amostras 37
1.2. Extração de RNA 37
1.3. Síntese de cDNA 38
1.4. PCR quantitativo em tempo real 38
1.5. Análise dos resultados 39
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
X
2. Avaliação da origem parental do cromossoma supranumerário em produtos de
abortamento com trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22 40
2.1. Amostras Biológicas 40
2.2. Extração de DNA 41
2.3. PCR quantitativo de fluorescência 41
2.4. Eletroforese capilar 42
2.5. Análise de resultados 43
IV- Resultados 45
1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C 47
2. Avaliação da origem parental do cromossoma supranumerário em produtos de
abortamento com trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22 52
V- Discussão 53
1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C 55
2. Avaliação da origem parental do cromossoma supranumerário em produtos de
abortamento com trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22 60
VI- Conclusão 63
VII- Referências Bibliográficas 67
Anexos 77
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XI
Índice de Tabelas
Tabela 1: Condições da PCR de transcrição reversa .................................................. 54
Tabela 2: Componentes da reação de PCR quantitativo em tempo real ..................... 55
Tabela 3: Condições de amplificação da QF-PCR ..................................................... 57
Tabela 4: Primers utilizados para os diferentes Short Tandem Repeats ..................... 58
Tabela 5: Informação clínica das amostras selecionadas e média das idades maternas
para cada trissomia .................................................................................................... 64
Tabela 6: Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e
KIF2C considerando todas as trissomias em estudo .................................................. 65
Tabela 7: Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e
KIF2C, excluindo a trissomia 15 ................................................................................. 66
Tabela 8: Dados clínicos e resultado obtido com a técnica QF-PCR .......................... 67
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XIII
Índice de Figuras
Fig. 1: Estimativa da incidência de trissomias com o aumento da idade materna, obtida
por combinação de dados relativos às diferentes trissomias, considerando uma taxa de
abortamento espontâneo de aproximadamente 15%. (Adaptado de Hassold & Hunt,
2001) ............................................................................................................................ 6
Fig. 2: Representação esquemática dos mecanismos causadores de aneuploidia
mitótica (Adaptado de Mantikou et al, 2012) ................................................................. 9
Fig. 3: Cariótipo de indivíduo com trissomia do cromossoma 13 (Imagem cedida pelo
Departamento de Genética/FMUP) ............................................................................. 10
Fig. 4: Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 18 (Imagem cedida
pelo Departamento de Genética/FMUP) ..................................................................... 12
Fig.5 - Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 21 (Imagem cedida
pelo Departamento de Genética/FMUP) ..................................................................... 13
Fig. 6: Procedimento de MLPA® (Adaptado de
http://www.invitrotek.com.tr/en/mlpa.asp) .................................................................... 19
Fig.7 - Ciclo de aneuploidia e instabilidade cromossómica. (Adaptado de Potapova et
al 2013)....................................................................................................................... 20
Fig.8 - Localização genómica do gene MAD2L2 (Retirado de
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAD2L2) ................................... 21
Fig.9 - Localização genómica do gene BUB1 (Retirado de
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1&search=bub1) ................. 22
Fig.10 - Funções de Bub1 no checkpoint do fuso mitótico. a) Recrutamento de Mad1 e
Mad2 para os quinetocoros e subsequente formação do complexo MCC. b) Ação
direta de Bub1 fosforilando Cdc20 e impedindo a activação do complexo APC/C.
Adaptado de (Yu & Tang, 2005) ................................................................................. 23
Fig.11 - Ação de BUB1 na protecção da coesão centromérica, contribuindo para
prevenir a separação prematura das cromátides-irmãs. Adaptado de (Yu & Tang,
2005) .......................................................................................................................... 24
Fig.12 - Localização genómica do gene BUB1B (Retirado de
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1B&search=bub1b) ............ 25
Fig.13 - Localização genómica do gene KIF2C (Retirado de
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KIF2C) ....................................... 27
Fig.14 - Esquema das fases obtidas após adição de clorofórmio na extracção de RNA
pelo método convencional do TriPure® ....................................................................... 37
Fig.15 - Processo de seleção das amostras fetais a analisar ...................................... 40
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XIV
Fig.16 - Picos de fluorescência detetados pelo sequenciador automático ABI 3500 e
analisados pelo software GeneMapper v4.1 para a amostra 9. O painel superior
corresponde ao DNA fetal, sendo visíveis três picos de fluorescência. O painel
intermédio corresponde ao DNA materno e o painel inferior ao DNA paterno,
apresentando ambos dois picos de fluorescência. ...................................................... 41
Fig. 17- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes
MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C; As caixas representam o intervalo interquartil. A
linha tracejada representa a mediana dos valores de expressão. Os extremos
representam os valores máximos e mínimos observados. .......................................... 41
Fig. 18- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes
MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C excluindo as amostras com trissomia 15; As caixas
representam o intervalo interquartil. A linha tracejada representa a mediana dos
valores de expressão. Os extremos representam os valores máximos e mínimos
observados. ................................................................................................................ 41
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XV
Lista de Abreviaturas
APC- Complexo promotor da anafase
APC/C- Complexo promotor da anafase/ ciclossoma
BUB1- Budding uninhibited by benzimidazole 1
BUB1B- Budding uninhibited by benzimidazole 1 homolog beta
CENP-E - Kinesin like centromere motor protein
CGH- Hibridação Genómica Comparativa
CIN- Instabilidade Cromossómica
DNA- Ácido Desoxirribonucléico
DPN- Diagnóstico Pré-Natal
FISH- Hibridação in situ Fluorescência
GAPDH - gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
KIF2C- Kinesin family member 2C
MAD2L2- mitotic arrest deficient like 2
MCC- complexo de checkpoint mitótico
MLPA®- Multiplex ligation-dependent probe amplification
mRNA- Ácido ribonucleico mensageiro
PCR- Reação em cadeia da polimerase (do inglês Polymerase chain reaction)
QF-PCR- Reação em cadeia da polimerase quantitativa de fluorescência
RNA- Ácido Ribonucleico
SAC- Checkpoint do fuso mitótico (do inglês Spindle assembly checkpoint)
STR’s- Short Tandem Repeats
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XVII
Resumo
A aneuploidia, uma das alterações cromossómicas mais comuns na espécie
humana, define-se como perda ou ganho de um ou mais cromossomas. A aneuploidia
constitucional deriva de erros de segregação cromossómica na divisão meiótica,
maioritariamente com origem materna, ou de erros na segregação cromossómica
durante as primeiras divisões mitóticas do embrião. Se a aneuploidia surgir numa
célula diferenciada designa-se por aneuploidia somática adquirida, estando fortemente
associada com o desenvolvimento de diversos tipos de cancro. Uma das hipóteses
propostas para explicar o efeito deletério de ambos os tipos de aneuploidia nos
organismos é a existência de uma relação cíclica entre aneuploidia e instabilidade
cromossómica. A desregulação de genes intervenientes no controlo do ciclo celular é
um dos mecanismos que integram a interação entre aneuploidia e instabilidade
cromossómica.
O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da expressão dos genes
MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C em produtos de abortamento de constituição
cromossómica aneuplóide. Para tal, foi aplicada a técnica de PCR em tempo real a
cinquenta amostras de produtos de abortamento ou tecido fetal com trissomias dos
cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e a trinta controlos com cariótipo normal. A
análise dos resultados mostrou que, quando se consideram todas as trissomias, existe
sobre-expressão de BUB1 e BUB1B. A alteração dos níveis de expressão de ambos
os genes tem sido detetada em diversos cancros com instabilidade cromossómica,
sendo este o primeiro trabalho a indicar sobre-expressão destes genes em produtos
de abortamento aneuplóides. Uma vez que o gene BUB1B se localiza no cromossoma
15, realizou-se uma segunda análise excluindo as amostras com trissomia 15, tendo
sido detetada sobre-expressão apenas do gene BUB1. Assim, é provável que a sobre-
expressão inicialmente detetada para BUB1B esteja relacionada com a presença de
uma cópia supranumerária deste gene nas sete amostras com trissomia 15.
Adicionalmente, pretendeu-se determinar a origem parental dos cromossomas
supranumerários em vinte amostras de produtos de abortamento e tecidos fetais
aneuplóides. Com esse objetivo foram recolhidas amostras de DNA de ambos os
progenitores e aplicada a técnica de PCR quantitativo de fluorescência. Os resultados
obtidos estão, na sua maioria, de acordo com os descritos na literatura. Das vinte
amostras analisadas, dezoito casos derivam de origem materna, um tem origem
paterna e foi impossível determinar a origem para uma das amostras devido a
homozigotia dos progenitores.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XVIII
Assim, os resultados deste trabalho contribuíram para o aumento do
conhecimento acerca da aneuploidia em produtos de abortamento e da possível
relação entre a aneuploidia constitucional e a instabilidade cromossómica,
estabelecendo-se, de certa forma, um paralelismo com a aneuploidia adquirida.
PALAVRAS-CHAVE: ANEUPLOIDIA, INSTABILIDADE CROMOSSÓMICA,
BUB1, BUB1B, PRODUTOS DE ABORTAMENTO
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XIX
Abstract
Aneuploidy, one of the most common chromosomal alterations on human
species, is defined as gain or loss of one or more chromosomes. Constitutional
aneuploidy results from errors in chromosome segregation during meiotic division, the
majority of which have maternal origin, or from chromosomal missegregation during the
embryo early mitotic divisions. If aneuploidy arises in a differentiated cell it is called
acquired somatic aneuploidy, being strongly associated with the onset of several types
of cancer. One of the hypotheses to explain the deleterious effect of aneuploidies in
organisms is the existence of a cyclical association with chromosomal instability. The
disruption of genes involved in cell cycle control is one of the mechanisms related with
the interaction between aneuploidy and chromosomal instability.
The overall aim of the present study is evaluate the expression pattern of genes
known to be involved in cell-cycle regulation (MAD2L2, BUB1, BUB1B and KIF2C), in
miscarriage products with a confirmed aneuploidy for chromosomes 13, 15, 16, 18, 21
and 22. In order to do that, quantitative Real-Time PCR was performed in fifty samples
and thirty controls with normal karyotype. The results analysis showed that, when all
six trisomies are included, both BUB1 and BUB1B expression levels were upregulated.
The overexpression of these two genes has been detected in several cancers with
chromosomal instability. This is the first work indicating overexpression of BUB1 and
BUB1B in miscarriage products with aneuploidy. Once the BUB1B gene is located on
chromosome 15, a second analysis was performed without trisomy 15 samples. The
results showed upregulation only of BUB1B gene. So, it is likely that the
overexpression initially detected for BUB1B may be related with the presence of a
supranumerary copy of this gene in the seven samples with trisomy 15.
Additionally, it was intended to determine the parental origin of the extra
chromosome of twenty miscarriage and fetal products samples with aneuploidy. With
this purpose samples were collected from both parents and subjected to quantitative
fluorescence PCR. The vast majority of results were consistent with that previous
described in literature. From the twenty samples analyzed, eighteen cases had
maternal origin, one had paternal origin and for one sample it was not possible to
determine the origin of the aneuploidy due to homozygosity of the parents.
As a conclusion, the results of this work contributed to increase the knowledge
about aneuploidy in miscarriage products and about the possible relationship between
constitutional aneuploidy and chromosomal aneuploidy, being possible, at least at
some extent, to establish a parallel with somatic acquired aneuploidy.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
XX
KEY WORDS: ANEUPLOIDY, CHROMOSOMAL INSTABILITY, BUB1, BUB1B,
MISCARRIAGE SAMPLES
I. INTRODUÇÃO
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
3
I. Introdução
1. Aneuploidia
A aneuploidia é uma condição caraterizada por um número incorreto de
cromossomas que resulta da perda ou ganho de cromossomas relativamente ao
complemento cromossómico normal da espécie em questão. O complemento
cromossómico humano normal é constituído por 22 pares de autossomas e 1 par de
cromossomas sexuais.
Atualmente, estima-se que cerca de 10-30% dos óvulos humanos fertilizados e
7-10% das gravidezes clinicamente comprovadas têm alterações cromossómicas
numéricas. A maioria destas serão trissomias, tornando a aneuploidia na alteração
cromossómica mais frequente em humanos e na principal causa genética de
abortamentos espontâneos e malformações congénitas (Hunt, 2008). Quando se
consideram apenas dados relativos a produtos de abortamento com idade gestacional
inferior a 15 semanas, as taxas de aneuploidia podem ascender a cerca de 50%
(Hassold et al., 1980, Nicolaidis & Petersen, 1998). No entanto, existe a hipótese de os
valores indicados estarem subestimados. Por um lado, a perda ou ganho de
determinados cromossomas é tão letal que inviabiliza a progressão da gravidez ainda
antes de esta ser clinicamente reconhecida. Por outro, sabe-se que a incidência de
aneuploidias aumenta muito consideravelmente com o aumento da idade materna, de
tal forma que, para mulheres no fim do período reprodutivo, a taxa de ovócitos
aneuplóides pode atingir os 50% (Hunt, 2008).
Estes valores estão muito acima das médias para outros mamíferos,
nomeadamente para o ratinho, que é o modelo animal mais usado neste tipo de
investigação (Hassold & Hunt, 2001). O motivo para esta discrepância entre espécies
ainda permanece desconhecido (Martin, 2008).
1.1. Mecanismos de origem da aneuploidia
1.1.1. Meiose
A meiose é um mecanismo de divisão celular especializado que origina
gâmetas haplóides a partir de células progenitores diplóides. A meiose é antecedida
por uma primeira fase de replicação de DNA e consiste em duas divisões celulares,
dando assim origem a células com metade do complemento cromossómico das suas
progenitoras.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
4
Na primeira divisão meiótica (Meiose I), os cromossomas que consistem em
pares de cromátides-irmãs emparelham com os seus homólogos, formando-se um
complexo sinaptonémico entre eles. Neste ponto, as cromátides homólogas não-irmãs
sofrem recombinação e permanecem ligadas por estes pontos de quiasma, mesmo
após a dissociação do complexo sinaptonémico. Assim, os pares de cromossomas
homólogos alinham-se no fuso meiótico na metafase I. Na anafase I os pontos de
quiasma são removidos e os cromossomas homólogos são segregados para pólos
opostos do fuso meiótico, por ação de microtúbulos.
A segunda divisão meiótica inicia-se sem replicação prévia de DNA e decorre
de forma mais rápida. Na profase II forma-se um novo fuso meiótico no qual se
alinham os cromossomas constituídos por duas cromátides-irmãs cada, durante a
metafase II. Na anafase II as duas cromátides-irmãs são segregadas para pólos
opostos do fuso meiótico, forma-se um invólucro nuclear na telofase II e dá-se a
citocinese. A partir de uma célula progenitora diplóide o processo meiótico origina
quatro células-filhas haplóides.
Apesar da meiose ser um mecanismo altamente conservado e transversal à
maioria dos organismos superiores, na espécie humana existem diferenças
consideráveis entre a meiose feminina e masculina, e consequentemente na
gametogénese.
i. Gametogénese feminina
A meiose feminina inicia-se no ovário fetal, após um breve período de
proliferação mitótica. No entanto, após a dissociação do complexo sinaptonémico, a
célula entra num período de quiescência (dictióteno) até ocorrer ovulação, que se
inicia na puberdade. A meiose I é então retomada e, quando termina, ocorre a
extrusão do primeiro glóbulo polar. Após um breve período denominado Intercinese
inicia-se a Meiose II. Esta divisão prossegue até metafase II e apenas se completa se
ocorrer fertilização, ocorrendo a extrusão do segundo glóbulo polar. Caso não se dê a
fertilização, a célula sofre um processo de degeneração (Hunt, 2008).
A elevada taxa de aneuploidias de origem materna tem levantado muito
interesse no seio da comunidade científica. Nas últimas décadas foram surgindo
diversas teorias no sentido de explicar os mecanismos moleculares na base deste
fenómeno e a sua relação com o aumento da idade materna (Figura 1).
Atendendo ao facto de a maioria destes erros ocorrer em meiose I, pensa-se
que possam estar em larga medida relacionados com o período de quiescência
existente após a profase I. Para que ocorra uma correta segregação cromossómica é
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
5
crucial que os pontos de quiasma formados se mantenham intactos e,
consequentemente, a coesão entre as cromátides-irmãs constituintes de cada
cromossoma e entre os pares de cromossomas homólogos tem de ser mantida
durante décadas. Caso esta conexão seja de alguma forma quebrada precocemente,
ou seja, antes de ser atingida a metafase I, os pontos de quiasma perdem-se e podem
ocorrer erros de segregação na meiose I. Esta coesão é assegurada por complexos
proteicos denominados coesinas. Na transição da metafase I para a anafase I as
coesinas entre os cromossomas homólogos são libertadas por ação enzimática,
permitindo assim a segregação dos cromossomas homólogos, mas não das
cromátides-irmãs que deverão nesta fase permanecer ligadas. A perda de coesão
prematura entre as cromátides-irmãs pode ser uma consequência direta do aumento
da idade materna, devido a uma eventual degradação das coesinas. A não ocorrência
de recombinação diminui a estabilidade das ligações entre cromossomas homólogos e
entre cromátides-irmãs, podendo também contribuir para a perda de coesão prematura
(Handyside, 2012, Nagaoka S., 2012).
Um outro mecanismo gerador de aneuploidia na meiose I é a clássica não-
disjunção de um dos cromossomas constituído por duas cromátides-irmãs, embora
seja responsável por apenas 3% das aneuploidias (Gabriel et al., 2011).
A meiose, como referido anteriormente, não está isenta de erros. No entanto,
as células são sujeitas a diversos mecanismos de controlo (checkpoints), numa
tentativa de assegurar que apenas células com um correto complemento
cromossómico prosseguem a divisão. Um dos checkpoints mais estudados é o SAC
(Spindle Assembly Checkpoint) que atua impedindo a ativação do APC (Anaphase
Promoter Complex), bloqueando a progressão para anafase até todos os
cromossomas estarem corretamente alinhados no plano equatorial e devidamente
ligados a microtúbulos provenientes dos pólos, através dos seus cinetocoros. Assim
sendo, além dos mecanismos de não-disjunção descritos anteriormente, para serem
gerados gâmetas aneuplóides é necessário que as células ultrapassem este controlo,
o que pode ocorrer devido a mutações nos seus componentes, inativando o
checkpoint ou tornando-o mais permissivo (Zhou et al., 2002). Existem também
trabalhos que apontam no sentido de o SAC feminino ser naturalmente mais
permissivo do que o masculino, permitindo a progressão da meiose mesmo na
presença de um ou mais cromossomas univalentes (Hawley, 2011, Nagaoka et al.,
2011). Adicionalmente, estruturas como ligações bipolares podem contornar o
mecanismo de controlo do SAC.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
6
Os mecanismos geradores de aneuploidia na metafase II são de certa forma
semelhantes aos verificados em metafase I, assentando essencialmente em não-
disjunção dos centrómeros-irmãos ou separação prematura das cromátides-irmãs
(Nagaoka S., 2012).
ii. Gametogénese masculina
A gametogénese masculina é um processo relativamente rápido. Ainda na vida
fetal, as células germinativas, espermatogónias, sofrem numerosas divisões mitóticas,
que continuam após o nascimento e se prolongam pela vida adulta. Quando é atingida
a puberdade, as espermatogónias são estimuladas a progredir o seu desenvolvimento
para espermatócitos primários. Estas células iniciam a primeira divisão meiótica,
originando espermatócitos secundários que, por sua vez, sofrem a segunda divisão
meiótica dando origem a espermátides. Posteriormente, são sujeitas a um mecanismo
de amadurecimento de onde resultam espermatozóides.
Sendo um processo sequencial em que cada célula que entra em meiose
produz quatro espermatozóides e em que não existem períodos de pausa durante a
Incid
ência
de
tris
som
ias
(%
de
gra
vid
ezes
clin
ica
men
te r
econhecid
as)
Idade materna
Fig. 1: Estimativa da incidência de trissomias com o aumento da idade materna, obtida por combinação de dados relativos às diferentes trissomias, considerando uma taxa de abortamento espontâneo de aproximadamente 15%. (Adaptado de Hassold & Hunt, 2001)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
7
meiose, a espermatogénese é menos propensa à ocorrência de erros de segregação
cromossómica. Estudos realizados em homens saudáveis indicam que cerca de 1 a
2% dos espermatozóides produzidos têm um complemento cromossómico incorreto,
sendo as alterações mais comuns as trissomias dos cromossomas 21 e 22 e
aneuploidias dos cromossomas sexuais. Por outro lado, estima-se que cerca de 6 a
13% dos espermatozóides produzidos por um indivíduo saudável possam ser
portadores de alterações estruturais, o que se pode dever à elevada taxa de divisões
mitóticas que aumenta a probabilidade de ocorrência de mutações ou de alterações
pós-meióticas. A questão do efeito da idade paterna na incidência de anomalias
cromossómicas tem sido bastante debatida sem que, no entanto, pareça haver
consenso entre os diversos autores. Estudos mais recentes vieram acrescentar
evidências que apontam no sentido de a idade paterna avançada aumentar a
probabilidade de alterações estruturais mas não de alterações numéricas (Revisto por
Martin, 2008).
A aneuploidia de origem paterna tem na sua génese mecanismos semelhantes
aos verificados na meiose feminina. A não-disjunção pode derivar de emparelhamento
anormal dos cromossomas, sinapses deficientes ou inexistentes ou perda de coesão
prematura entre as cromátides-irmãs (Uroz & Templado, 2012).
1.1.2. Origem pós-zigótica (mitótica)
A ocorrência de um erro de segregação durante as mitoses correspondentes às
primeiras clivagens, pode levar ao desenvolvimento de um embrião aneuplóide, por
divisão preferencial da célula com o complemento cromossómico anormal em
detrimento das células diplóides normais, embora este fenómeno seja raro. Mais
frequentemente, erros neste mecanismo de divisão celular originam embriões com
mosaicismo, ou seja, onde coexistem duas ou mais linhas celulares de constituição
cromossómica distinta, mas ambas com origem em células progenitoras provenientes
do embrião. Assim, a maioria dos estudos nesta área estima a incidência de erros de
disjunção na mitose a partir da frequência de mosaicismos detetada em embriões. No
entanto, estes valores não reúnem consenso, podendo variar entre 15 e <90%, de
acordo com os diferentes autores (Bielanska et al., 2002, Daphnis et al., 2005, Harper
et al., 1995, van Echten-Arends et al., 2011). Esta discrepância de resultados deve-se
a questões como a definição de mosaicismo, o número de cromossomas analisados e
a proveniência e qualidade dos embriões usados na pesquisa (Mantikou et al., 2012).
As aneuploidias mitóticas encontram-se em todas as fases de desenvolvimento
pré-implantatório humano, mas a percentagem relativa de células aneuplóides diminui
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
8
com a ativação do genoma fetal e continua a diminuir ao longo da vida fetal e após o
parto (Fragouli et al., 2013). Mantikou et al refere que, se analisado a fundo, o
mosaicismo estará presente em virtualmente todos os indivíduos da população
comum, mas a um nível de tal forma baixo que é praticamente indetetável, não
causando efeitos a nível fenotípico (Mantikou et al., 2012).
Numa divisão mitótica normal, a partir de uma célula progenitora diplóide são
originadas duas células filhas também elas diplóides. Diversos mecanismos podem
estar na base do surgimento de linhas celulares aneuplóides ou poliplóides (Figura 2).
Na situação de atraso na anafase em mitose (anaphase lag), ocorre o atraso na
movimentação de uma cromátide durante a anafase, não sendo incorporado no
genoma de nenhuma das células-filhas, podendo resultar em monossomia. A não-
disjunção é a situação clássica em que as cromátides-irmãs não se separam
corretamente, resultando numa célula-filha com uma perda cromossómica e outra com
um ganho cromossómico. Em conjunto com a ocorrência de anaphase lag, é
responsável pela grande maioria das aneuploidias de causa mitótica. Existem outros
mecanismos que contribuem para a taxa de aneuploidias mitóticas, mas a uma escala
menor. A extrusão cromossómica é tida como um mecanismo celular de resgate de
trissomias. No entanto, quando ocorre em células cromossomicamente normais, este
fenómeno leva à perda de um cromossoma, originando monossomias. A quebra
cromossómica é um mecanismo algo semelhante mas provoca aneuploidias parciais
pois alguns segmentos cromossómicos permanecem viáveis. A aneuploidia pode
também resultar de separação prematura das células-filhas ou de citocinese
incompleta ou inexistente, das quais podem resultar células-filhas com diferentes
padrões de erros do complemento cromossómico. Pode ainda ocorrer fusão de
blastómeros no embrião, o que vai originar uma linhagem celular poliplóide (Mantikou
et al., 2012).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
9
Fig. 2: Representação esquemática dos mecanismos causadores de aneuploidia mitótica (Adaptado de Mantikou et al, 2012)
1.1.3. Aneuploidias autossómicas mais frequentes
Os primeiros estudos citogenéticos acerca da incidência das aneuploidias
foram realizados em recém-nascidos, tendo sido observada aneuploidia envolvendo
apenas 3 dos 22 autossomas (cromossomas 13, 18 e 21) presentes na espécie
humana (Jacobs et al., 1992). No entanto, rapidamente se equacionou a hipótese de a
aneuploidia humana se poder estender praticamente a todos os autossomas, sendo as
consequências fenotípicas da aneuploidia para os restantes autossomas
habitualmente incompatíveis com a vida (exeto quando em mosaico), o que acabou
por se comprovar mediante estudos realizados em produtos de abortamento (Jackson-
Cook, 2011).
i. Trissomia 13
A trissomia 13, ou Síndrome de Patau, foi descrita pela primeira vez por Klaus
Patau em 1960 (Patau et al., 1960). Esta aneuploidia afeta cerca de 0,18% de todas
as gravidezes clinicamente reconhecidas, a maioria das quais termina em abortamento
espontâneo. Estima-se que 1,1% do total de abortamentos espontâneos e 0,3% do
total de nados-mortos sejam portadores de trissomia 13 (Hassold et al., 1980).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
10
Segundo Hassold et al, a incidência de trissomia 13 em nados-vivos é de 1/5000-
20000, sendo uma das poucas aneuploidias compatível com gestações de termo na
espécie humana (Hassold et al., 1980).
As alterações fenotípicas associadas à Síndrome de Patau incluem alterações
graves do desenvolvimento psico-motor, microcefalia, malformações oculares, fenda
lábio-palatina, onfalocelo, hipotonia, malformações renais e cardíacas, entre outras
(Baty et al., 1994a, Baty et al., 1994b, Patau et al., 1960). Devido à grave
apresentação clínica da Síndrome de Patau, 95% das crianças afectadas não
sobrevivem habitualmente ao primeiro ano de vida (Rasmussen et al., 2003).
Relativamente ao mecanismo pelo qual é originada, a trissomia 13 pode
ocorrer devido à existência de um cromossoma 13 supranumerário livre (Figura 3) ou
de uma translocação Robertsoniana envolvendo este cromossoma. No caso de
trissomias provocadas por um cromossoma 13 livre, a grande maioria tem origem
materna, com contribuição equitativa de erros na primeira e segunda divisão meiótica
(Bugge et al., 2007).
ii. Trissomia 15
A Trissomia 15 é uma alteração cromossómica incompatível com a vida pós-
parto. Estima-se que cerca de 1,4% do total de abortamentos espontâneos tenham
esta alteração (Hassold et al., 1980), sendo maioritariamente de origem materna,
principalmente devido a erros de não disjunção na meiose I (Zaragoza et al., 1994).
Fig. 3: Cariótipo de indivíduo com trissomia do cromossoma 13 (Imagem cedida pelo Departamento de Genética/FMUP)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
11
iii. Trissomia 16
A Trissomia 16 é a trissomia mais frequentemente encontrada em produtos de
abortamento do primeiro trimestre (Nicolaidis & Petersen, 1998, Doria et al., 2009).
Estima-se que ocorra em aproximadamente 1,5% do total de gravidezes clinicamente
reconhecidas (Wolstenholme, 1995) e em 5,1% dos abortamentos espontâneos
(Hassold et al., 1980). A trissomia 16 é considerada incompatível com a vida pós-
parto.
Segundo vários estudos, virtualmente todos os casos de trissomia 16 derivam
de erros de não disjunção na meiose I materna (Hassold et al., 1991, Hassold et al.,
2007).
iv. Trissomia 18
A trissomia 18, também conhecida como Síndrome de Edwards, é a segunda
trissomia autossómica mais comum no recém-nascido, afetando cerca de 1 em cada
2500 conceções, a maioria das quais termina em abortamento espontâneo (Crider et
al., 2008). Os primeiros casos reportados desta alteração cromossómica remontam a
1960, quando dois grupos de investigadores publicaram independentemente
descrições de um quadro clínico associado à presença de um cromossoma 18
supranumerário em todas as células do organismo (Figura 4) (Edwards et al., 1960,
Smith et al., 1960).
A Síndrome de Edwards caracteriza-se por um marcado atraso no crescimento
e no desenvolvimento psico-motor e cognitivo. Uma das manifestações clínicas mais
características é a malformação das mãos que leva à sobreposição dos dedos. Outras
alterações fenotípicas incluem dolicocefalia, micrognatia, onfalocelo, excesso de pele
no pescoço e malformações nos pés, bem como graves problemas cardíacos em
cerca de 90% dos casos (Cereda & Carey, 2012).
Devido à severidade dos sintomas provocados pela trissomia 18 existe uma
elevada taxa de mortalidade durante o trabalho de parto e período neonatal, sendo
que apenas aproximadamente 20% das crianças afetadas atingem um ano de vida
(Niedrist et al., 2006). Existem, no entanto, relatos de pacientes que sobreviveram
além dos 15 anos, embora se tratem de casos esporádicos (Niedrist et al., 2006, Kelly
et al., 2002, Shanske, 2006).
No que diz respeito à origem da trissomia 18, a grande maioria dos casos tem
origem materna (aproximadamente 91%), principalmente devido a erros na segunda
divisão meiótica (Nicolaidis & Petersen, 1998, Hassold et al., 2007).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
12
v. Trissomia 21
A trissomia 21, responsável pela maioria dos casos de Síndrome de Down, é a
alteração cromossómica numérica mais comum em recém-nascidos, afetando cerca
de 1 em cada 750 nados-vivos (O'Connor, 2008), sendo que a incidência aumenta
marcadamente com o aumento da idade materna. Esta patologia é referida pela
primeira vez em 1886 por John Langdon Down numa publicação em que é descrito o
conjunto de sintomas característico desta patologia (Down, 1866). No entanto, só na
década de 50 do século XX é estabelecida a relação causa-efeito entre a presença de
uma cópia supranumerária do cromossoma 21 e a sintomatologia descrita cerca de
100 anos antes por Down, em duas investigações independentes realizadas por
Jerome Lejeune (Lejeune J, 1959) e Patrícia Jacobs (Jacobs et al., 1959). Atualmente,
sabe-se que a trissomia 21 é responsável por cerca de 95% do total de casos de
Síndrome de Down (Figura 5), sendo que os restantes 5% devem-se a translocações
envolvendo o cromossoma 21 (O'Connor, 2008).
Cerca de 90% dos casos de trissomia 21 tem origem materna, maioritariamente
devido a erros de não-disjunção na meiose I. Dos restantes, estima-se que cerca de
5% tenham origem em alterações pós-zigóticas ocorridas muito cedo no
desenvolvimento embrionário (Nicolaidis & Petersen, 1998).
Esta patologia caracteriza-se por um défice ligeiro a moderado no
desenvolvimento psicológico e cognitivo, sendo mesmo considerada como a principal
causa de atraso mental a nível mundial (Galdzicki et al., 2001). No que diz respeito ao
fenótipo, as alterações são variáveis mas, por norma, incluem baixa estatura, pescoço
Fig. 4: Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 18 (Imagem cedida pelo Departamento de Genética/FMUP)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
13
Fig.5 - Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 21 (Imagem cedida pelo Departamento
de Genética/FMUP)
largo, fissuras palpebrais oblíquas, língua protuberante, prega palmar transversal
única, entre outras. Do ponto de vista clínico, as complicações associadas à Síndrome
de Down prendem-se com malformações cardíacas (afetam cerca de 50% dos recém
nascidos com Síndrome de Down), perda de audição (38-78%), problemas
oftalmológicos, malformações gastro-intestinais e propensão para infeções e doenças
hematológicas, nomeadamente leucemias (Roizen & Patterson, 2003). A esperança
média de vida de um indivíduo com Trissomia 21 é variável de acordo com o conjunto
de sintomas apresentado. No entanto, para países economicamente desenvolvidos
esta situa-se acima dos 55 anos (Glasson et al., 2002).
vi. Trissomia 22
A trissomia 22 é a terceira trissomia mais comum em produtos de abortamento,
estimando-se que afete 1 em cada 200 gravidezes clinicamente reconhecidas e sendo
responsável por pelo menos 2,7% do total de abortamentos espontâneos e 0,2% do
total de nados-mortos (Hassold & Jacobs, 1984). Devido à severidade dos sintomas
associados à trissomia 22, que incluem microcefalia, malformações cardíacas e renais
e restrição de crescimento intra-uterino, são raros os relatos de gravidezes que
atingem o termo (Heinrich et al., 2013). No caso de nados-vivos, a sobrevivência
média é de apenas 4 dias e a maior longevidade registada foi de 29 dias (Heinrich et
al., 2013, Tinkle et al., 2003).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
14
Segundo Hall et al, cerca de 96% dos casos de trissomia 22 derivam de erros
na meiose materna, sendo que 90% deles estão relacionados com erros de disjunção
na primeira divisão meiótica (Hall et al., 2007).
vii. Triploidia
A triploidia é uma das anomalias cromossómicas mais comuns na espécie
humana, ocorrendo em cerca de 1% do total de conceções que, na sua maioria,
resultam em abortamento frequentemente ainda numa fase precoce da gravidez. Em
casos muito raros, fetos com triploidia completa sobrevivem até ao termo da gestação.
O tempo máximo de sobrevivência de uma criança com triploidia (não mosaico)
registado até hoje é de 11 meses (Sherard et al., 1986). Esta anomalia cromossómica
consiste na existência de uma cópia adicional de cada um dos cromossomas em todas
as células do organismo, ou seja, indivíduos com esta condição possuem um
complemento cromossómico haplóide adicional, resultando num total de 69
cromossomas.
Esta condição pode resultar de diginia (complemento cromossómico adicional
tem origem materna) ou de diandria (complemento cromossómico adicional tem
origem paterna). A prevalência de cada um destes mecanismos de origem varia de
acordo com a idade gestacional atingida. Tratando-se de abortamentos ocorridos nas
primeiras semanas de gestação, a origem é predominantemente paterna.
Abortamentos mais tardios tendem a relacionar-se com diginia. Considerando a
triploidia como um todo, a diandria é o mecanismo de origem mais comum (Wick et al.,
2013, Zaragoza et al., 2000).
A nível do fenótipo provocado por esta condição também existem diferenças de
acordo com a origem parental da anomalia. Em casos derivados de diandria, verifica-
se um crescimento fetal normal ou moderadamente afetado de forma simétrica, com
glândulas adrenais normais. A placenta tende a ser de grandes dimensões e com
características histológicas conhecidas como mola hidatiforme parcial. Quando a
triploidia deriva de diginia, o feto apresenta habitualmente uma restrição de
crescimento grave e hipoplasia adrenal. A placenta classifica-se como não molar. Em
comum, os fetos tendem a apresentar anomalias congénitas generalizadas,
nomeadamente sindactilia nos dedos das mãos e nos dedos dos pés, anomalias
genitais e cardíacas bem como malformações cerebrais, entre outras (McFadden &
Robinson, 2006).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
15
2. Diagnóstico Pré-Natal de Aneuploidias
Por norma, no acompanhamento normal de uma gravidez é realizado de forma
generalizada o rastreio pré-natal de cromossomopatias que, levando em consideração
uma série de fatores, fornece indicações sobre a existência ou não de risco
aumentado de patologia cromossómica. Nas situações em que o resultado deste
rastreio é positivo, deve ser oferecida à grávida a possibilidade de realização de
diagnóstico pré-natal (DPN). O DPN engloba um conjunto de técnicas de recolha de
material fetal, nomeadamente amniocentese, biópsia de vilosidades coriónicas,
cordocentese e recolha de material fetal em circulação no plasma materno, permitindo
assim a determinação direta da constituição cromossómica do feto.
2.1. Técnicas de análise da patologia cromossómica
2.1.1. Cariótipo
A análise do cariótipo, ferramenta tradicional de citogenética, é um processo
demorado e relativamente trabalhoso. Inicialmente, é necessário estabelecer uma
cultura celular do material biológico em questão (vilosidades coriónicas, sangue,
líquido amniótico, ou outros) que posteriormente é sincronizada no sentido de se obter
a maior quantidade de metafases possível. Os cromossomas metafásicos são sujeitos
a processos de coloração, tradicionalmente Bandas-G, que permitem a sua
visualização ao microscópio. A análise do cariótipo permite avaliar a ploidia bem como
a existência, dentro de certos limites de resolução, de rearranjos estruturais,
equilibrados ou não, em qualquer cromossoma.
Apesar da sua inegável importância esta técnica apresenta limitações,
nomeadamente a necessidade de cultura celular prévia. A falência de culturas, que se
pode dever a uma multiplicidade de fatores, impossibilita a obtenção de cariótipos,
surgindo a necessidade de recorrer a outras técnicas que não necessitam de cultura
celular, nomeadamente de análise molecular.
Adicionalmente, na cultura celular pode ocorrer crescimento preferencial de
células de origem materna, contaminação por material externo ou mesmo seleção
contra as células anormais, tratando-se de fetos com mosaicismo.
A análise do cariótipo está muito dependente da experiência do profissional,
podendo por vezes surgir situações ambíguas, nomeadamente devido à resolução do
bandeamento, que dificultam a determinação dos resultados.
A limitação mais importante da análise do cariótipo é, no entanto, o tempo
necessário até serem reportados os resultados (aproximadamente 15 dias), o que em
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
16
contexto de Diagnóstico Pré-Natal coloca o casal sob uma grande ansiedade. Do
ponto de vista médico esta situação também é problemática pois procedimentos como
a interrupção médica da gravidez são mais seguros se realizados mais precocemente.
2.1.2. FISH (Hibridação in situ de Fluorescência)
É uma técnica pela qual um segmento de DNA conjugado previamente com um
fluorocromo (sonda) hibridiza numa metafase ou interfase, com determinado
cromossoma ou determinada região de um ou mais cromossomas, na sua região
complementar. Uma vez que permite a deteção de aneuploidias e alterações da ploidia
em células em interfase, não exige cultura celular prévia, possibilitando resultados
mais rápidos do que os obtidos pela técnica convencional de análise do cariótipo. Esta
técnica possibilita ainda a deteção de mosaicismo mesmo que de baixo grau (<10%)
bem como de situações de contaminação materna em fetos de sexo masculino. No
contexto do diagnóstico pré-natal de aneuploidias, são usadas sondas específicas
para as aneuploidias mais comuns (13, 16, 18, 21 e 22), disponíveis em kits
comerciais.
Esta técnica tem como principal desvantagem o facto de estar limitada às
sondas utilizadas no estudo, não fazendo um estudo integral de todo o genoma.
Um dos desenvolvimentos mais importantes conseguidos a partir da técnica de
FISH foi a introdução da Hibridação Genómica Comparativa (CGH), que alarga a
pesquisa de alterações numéricas e estruturais desequilibradas a todo o genoma.
Nesta técnica o DNA em estudo e o DNA controlo (extraído de um indivíduo
cariotipicamente normal) são marcados com fluorocromos distintos e hibridados com
cromossomas metafásicos humanos de referência. A interpretação dos resultados é
feita avaliando o rácio da intensidade de fluorescência entre o controlo e o DNA
estudado, através de ferramentas de análise digital (Revisto por Bishop, 2010). Esta
técnica clássica já deixou de ser usada pois foi substituída pela técnica de array-CGH,
em que a hibridação é feita numa lâmina de array, comumente designada de chip,
onde são impressas milhares de sondas de DNA (mais recentemente
oligonucleótideos) permitindo a análise da totalidade do genoma (perdas e ganhos)
com uma resolução muito superior (pelo menos 100kb ou mesmo maior resolução,
conforme o tipo de array).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
17
2.1.3. QF-PCR (Quantitative fluorescent polymerase
chain reaction)
A técnica de QF-PCR baseia-se na amplificação de sequências de DNA
altamente polimórficas, nomeadamente STR’S (Short Tandem Repeats) específicas
para um cromossoma, recorrendo a pares de primers marcados com fluorescência.
Uma vez que se assume que na fase exponencial do PCR a quantidade de DNA
específico produzida é proporcional à quantidade de DNA-alvo inicial, é possível
determinar o número de cópias do cromossoma em questão, por análise da
intensidade de fluorescência dos fragmentos amplificados.
A interpretação dos resultados baseia-se no número de picos de fluorescência
e no cálculo do rácio entre a altura dos mesmos, para cada marcador polimórfico
usado. Assim, um indivíduo heterozigótico euplóide para o cromossoma em questão
deve apresentar dois picos de fluorescência com rácio de intensidade de fluorescência
não superior a 0,8-1. Tratando-se de um indivíduo homozigótico, deverá existir apenas
um pico de fluorescência. Quando estamos perante uma trissomia para o cromossoma
em questão, as três cópias cromossómicas podem ser detetadas como três picos de
fluorescência distintos com um rácio de intensidade de 1:1:1 ou como dois picos com
rácio de intensidade inferior a 0,65 ou superior a 1,8 (Diego-Alvarez et al., 2005,
Hulten et al., 2003).
A QF-PCR permite a realização de ensaios em multiplex, ou seja, com vários
pares de primers em simultâneo, existindo mesmo kits comerciais disponíveis em
várias empresas que permitem o diagnóstico de forma relativamente económica. Uma
vez que o DNA usado para esta técnica é extraído a partir de líquido amniótico,
vilosidades coriónicas ou tecido fetal sem cultura celular prévia, a QF-PCR permite a
obtenção de resultados num curto período de tempo (24-48 horas). Esta técnica tem
ainda a vantagem de permitir detetar células com genótipo diferente do DNA da
maioria das células presente na amostra, o que pode representar contaminação
materna, mosaicismo, quimerismo ou mesmo contaminação externa (Mann & Ogilvie,
2012). Adicionalmente, permite obtenção de resultados em casos em que o
diagnóstico citogenético não foi possível, sendo ainda informativo relativamente à
origem parental e meiótica da aneuploidia.
Relativamente às desvantagens da QF-PCR, a existência de resultados não
informativos (existência de um só pico de fluorescência que pode corresponder a um
padrão de 1:1 ou de 1:1:1) é apontada com alguma frequência. Adicionalmente, a
existência de tetraploidia e de mosaicismos de baixo grau pode ser difícil de identificar
(Diego-Alvarez et al., 2005). Devido ao facto de os kits comerciais só testarem as
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
18
aneuploidias mais comuns (cromossomas 13, 16, 18, 21, 22 e sexuais), aneupoidias
dos restantes cromossomas não são detetadas por esta técnica.
2.1.4. MLPA® (Multiplex ligation-dependent probe
amplification)
A técnica de MLPA foi desenvolvida pela empresa “MCR-Holland” em 2002
como um método de quantificação relativa que permitia a pesquisa direcionada de
alterações do número de cópias de DNA de até 50 sequências de DNA, baseada na
técnica de PCR quantitativa. No contexto do Diagnóstico Pré-natal, a MLPA pode ser
usada para detetar aneuploidias, microdeleções e estudos familiares de alteração do
número de cópias num gene.
Numa reação de MLPA, para cada alvo são usadas duas sondas
oligonucleotídicas que são complementares a regiões imediatamente adjacentes na
sequência de DNA em estudo. Cada sonda contém um local de ligação para um
primer, forward e reverse respetivamente. A sonda 3’ contém ainda uma sequência de
DNA, conhecida como stuffer sequence, que não emparelha com a sequência-alvo e
que confere um comprimento distinto aos amplicões, permitindo a sua distinção em
ensaios multiplex, através de separação por eletroforese capilar. Uma vez que os
primers usados são marcados com fluorescência, a análise dos resultados baseia-se
na interpretação da intensidade dos picos de fluorescência detetados por eletroforese
capilar, por comparação com um padrão de referência ou com os rácios relativamente
a outros cromossomas (Figura 6). Rácios abaixo de 0,7 são indicativos de perda de
material-alvo e acima de 1,3 de ganho de material-alvo. Os valores intermédios são
considerados normais. (Willis et al., 2012).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
19
As vantagens da MLPA relativamente a outras técnicas relacionam-se com o
facto de ser uma técnica rápida (resultados disponíveis em cerca de 48 horas) e
relativamente simples, com resultados fiáveis, robustos e replicáveis devido à
existência de kits comerciais otimizados para a deteção das aneuploidias mais
comuns. A quantidade de DNA necessária é relativamente baixa. Adicionalmente, a
MLPA elimina o problema dos resultados não informativos existentes na QF-PCR. Os
aspetos negativos desta técnica incluem a não deteção de triploidias, cujo resultado é
igual ao de um indivíduo diplóide, bem como a não deteção de contaminação materna.
3. Alteração da expressão génica e aneuploidia
3.1. Aneuploidia e instabilidade cromossómica
O efeito prejudicial da aneuploidia no desenvolvimento humano está
largamente documentado, sendo particularmente evidente no fenótipo associado às
trissomias compatíveis com a vida pós-parto. Adicionalmente a aquisição de
aneuploidia em células diferenciadas tem vindo a ser associada ao desenvolvimento
de diversos tipos de cancro. O mecanismo pelo qual a aneuploidia afeta de tal forma
Fig. 6: Procedimento de MLPA® (Adaptado de http://www.invitrotek.com.tr/en/mlpa.asp)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
20
os organismos tem vindo a ser alvo de estudo nas últimas décadas e, embora tenham
surgido diversas teorias, permanece por esclarecer.
Uma das hipóteses colocadas é a relação entre a aneuploidia e a instabilidade
cromossómica. Potapova et al sugerem que esta relação se baseia num ciclo, em que
a existência de uma potencia a outra. Assim, a existência de aneuploidia provoca um
desequilíbrio da expressão de mRNA, o que por sua vez altera os níveis proteicos.
Estas perturbações podem afetar diversos complexos proteicos e vias metabólicas,
alterando o correto funcionamento de processos biológicos essenciais à célula e
podendo provocar, entre outros, defeitos na maquinaria de checkpoint e no fuso
celular. Estas alterações levam ao aumento de erros de segregação, contribuindo
assim para o aumento da instabilidade cromossómica e, consequentemente, da
incidência de aneuploidia (Figura 7) (Potapova et al., 2013).
Fig.7 - Ciclo de aneuploidia e instabilidade cromossómica. (Adaptado de Potapova et al 2013)
A maioria dos trabalhos que focam a instabilidade cromossómica baseia-se em
situações de aneuploidia adquirida, nomeadamente em oncologia. No entanto, a
relação entre aneuploidia e instabilidade cromossómica também existe em
aneuploidias constitucionais. Potapova et al afirmam que células provenientes de
pacientes com Síndrome de Down, Edward e Patau são menos estáveis do que
células provenientes de indivíduos cariotipicamente normais (Potapova et al., 2013).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
21
Muito embora aparentemente a alteração dos componentes do checkpoint seja
responsável apenas por uma minoria dos casos de instabilidade cromossómica, esta
continua a ser uma contribuição relevante para o conhecimento global acerca de
aneuploidia.
3.1.1. MAD2L2
Os genes envolvidos no mecanismo de checkpoint do fuso mitótico de
Saccaromyces cerevisiae têm sido amplamente estudados ao longo das últimas
décadas. O gene MAD2, responsável por monitorizar a ligação dos microtúbulos ao
cinetocoro pertence a uma das famílias de genes melhor caracterizadas, a família
MAD (mitotic arrest deficent). Em organismos eucarióticos superiores existem dois
homólogos de MAD2: MAD2L1 (mitotic arrest deficient like 1), frequentemente
designado apenas como MAD2, e MAD2L2 (mitotic arrest deficient like 2), também
designado por MAD2B ou hREV. Este último gene foi identificado e caracterizado por
Cahill et al em linhas celulares humanas provenientes de tumores com instabilidade
cromossómica. MAD2L2 tem localização citogenética em 1p36 (Figura 8) e codifica a
proteína Mad2l2. Esta proteína intervém no mecanismo de checkpoint, inibindo o
complexo APC/C através da ligação a um dos seus ativadores, CDC20 ou CDH1. No
entanto, atendendo ao facto de Mad2l2 se localizar essencialmente no núcleo mas não
se associar com os cinetocoros ao longo do ciclo celular, pensa-se que esta proteína
estará envolvida em algum processo celular para além do checkpoint do fuso.
Adicionalmente, Mad2l2 representa uma subunidade da enzima polimerase de DNA
zeta. Esta enzima é mais permissiva a alterações na cadeia molde, sendo capaz de
prosseguir a replicação de DNA em situações em que as DNA-polimerases
convencionais parariam. Quando atinge o local da lesão na cadeia molde, a DNA
polimerase zeta insere um nucleótido (correto ou não) na posição correspondente da
cadeia sintetizada e prossegue a replicação. Este processo tem a desvantagem de
poder fixar mutações (Murakumo, 2002). Como esta DNA polimerase não tem
atividade de revisão da cadeia sintetizada, há maior propensão para a ocorrência de
mutações. Apesar deste risco, este mecanismo tende a implicar menos consequências
do que a paragem da replicação.
Fig.8 - Localização genómica do gene MAD2L2 (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAD2L2)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
22
Trabalhos focando a DNA polimerase zeta em leveduras indicam que Mad2l2 é
fundamental para a sua capacidade de síntese transpondo a lesão. Assim, é de
esperar que a redução de Mad2l2 prejudique a capacidade de tolerância de erros na
cadeia de DNA, levando à paragem da síntese, com consequências drásticas para os
organismos.
Por outro lado, dados relativos à sobre-expressão de Mad2l2 que provêm
maioritariamente de estudos em tumores (nomeadamente colo-retais e
neuroblastomas) mostram que pacientes em que este gene se encontra sobre-
expresso têm pior prognóstico, com diminuição das taxas de sobrevivência.
Apesar das informações disponíveis acerca da intervenção de Mad2l2 em
processos distintos, o seu papel exato no controlo do ciclo celular e os mecanismos
através dos quais ele se processa permanecem pouco claros.
3.1.2. BUB1
O gene BUB1 (Budding uninhibited by benzimidazole) tem localização
citogenética 2q13 (figura 9) e foi identificado pela primeira vez em levedura.
Posteriormente, foi identificada a sequência de cDNA que codifica o gene BUB1 em
humanos. A comparação desta sequência com a de Saccaromyces cerevisiae e com a
de ratinho, previamente determinadas, revelou uma grande similaridade, indicativa de
elevado grau de conservação (Cahill et al., 1999). A proteína codificada por este gene,
uma cínase rica em serinas e treoninas denominada Bub1, está presente em níveis de
concentração variáveis de acordo com o tecido considerado, tendo sido detetados
níveis máximos em amostras de tecido testicular e níveis mínimos em amostras de
baço (The GeneCards human gene database).
A maioria da informação sobre o papel de Bub1 na mitose provém de estudos
em S. cerevisiae e S. pombe (Marchetti & Venkatachalam, 2010). As evidências em
vertebrados derivam maioritariamente de trabalhos com linhas celulares tumorais
humanas ou de modelos animais como o ratinho. No seu conjunto, estes trabalhos
Fig.9 - Localização genómica do gene BUB1 (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1&search=bub1)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
23
Fig.10 - Funções de Bub1 no checkpoint do fuso mitótico. a) Recrutamento de Mad1 e Mad2 para os quinetocoros e subsequente formação do complexo MCC. b) Ação direta de Bub1 fosforilando Cdc20 e impedindo a activação do complexo APC/C. Adaptado de (Yu & Tang, 2005)
denotam o papel essencial de Bub1 na correta segregação cromossómica na mitose.
Durante a profase, esta proteína acumula-se nos cinetocoros não ligados, para onde
recruta dímeros Mad1-Mad2. Em resposta a danos no fuso mitótico, Bub1 fosforila
Mad1, levando à dissociação do complexo Mad1-Mad2. Uma vez livre, Mad2 liga-se a
Cdc20, um ativador do complexo APC/C. Pensa-se que esta ligação pode
desencadear a formação do complexo de checkpoint mitótico (MCC) constituído por
BubR1-Bub3-Mad2-Cdc20, qua atua inibindo o complexo APC/C e,
consequentemente, a progressão para anafase. No entanto, a formação do complexo
MCC no cinetocoro ainda não está suficientemente documentada (Figura 10a).
Adicionalmente, pensa-se que Bub1 pode atuar diretamente fosforilando Cdc20,
impedindo assim a ativação do complexo APC/C, embora o mecanismo através do
qual esta inibição ocorre ainda não esteja totalmente esclarecido (Figura 10b)
(Marchetti & Venkatachalam, 2010, Williams et al., 2007). Existem ainda autores que
defendem que a proteína Bub1 pode sinalizar células que escaparam aos mecanismos
de controlo, tendo herdado um complemento cromossómico incorreto, promovendo a
sua degradação (Jeganathan et al., 2007).
No que diz respeito à meiose, à semelhança do que acontece na mitose, Bub1
é um componente-chave do checkpoint do fuso. Assim, a inativação ou o decréscimo
de atividade de Bub1 afetaria numerosos aspetos em ambos os processos de divisão
celular, nomeadamente o correto alinhamento cromossómico e a sincronização
temporal pois seria desencadeada uma entrada precoce em anafase (Marchetti &
Venkatachalam, 2010).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
24
Uma vez que a perda total de função de Bub1 é letal ainda na fase embriónica,
a investigação do papel desta proteína in vivo tem sido realizada em ratinhos mutantes
com redução de atividade ou mutação de apenas uma das cópias do gene em
questão. Estes trabalhos permitiram concluir que o fenótipo provocado pela redução
de Bub1 na meiose é marcadamente diferente entre os sexos. O estudo dos
espermatozóides destes organismos mutantes não revelou alterações significativas
nas taxas de aneuploidia detetadas. Por oposição, quando foram analisados óvulos, s
taxas de aneuploidia detetadas sofreram um incremento relativamente a controlos não
mutados. Este aumento de aneuploidia em óvulos de organismos mutantes estará,
muito provavelmente relacionado com separação prematura das cromátides-irmãs
(Leland et al., 2009).
Além do seu papel como proteína de checkpoint, Bub1 atua também evitando a
separação prematura das cromátides-irmãs. Para que ocorra segregação dos
cromossomas homólogos, os complexos de coesinas localizados ao longo dos braços
dos cromossomas têm de ser retirados por fosforilação mediada por Plk1/Aurora B,
durante a profase. No entanto, é necessário que se mantenha a coesão no centrómero
para conservar as cromátides-imãs unidas, evitando a remoção das coesinas desta
região. Este papel é levado a cabo por proteínas denominadas sugosinas, que
protegem a coesão centromérica. Bub1 regula a estabilidade e a correta localização
centromérica das sugosinas, contribuindo assim para evitar a separação prematura
das cromátides-irmãs. Posteriormente, em meiose II a enzima separase cliva as
coesinas centroméricas para permitir a segregação das cromátides-irmãs (Figura 11)
(Yu & Tang, 2005, Marchetti & Venkatachalam, 2010).
Fig.11 - Ação de BUB1 na protecção da coesão centromérica, contribuindo para prevenir a
separação prematura das cromátides-irmãs. Adaptado de (Yu & Tang, 2005)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
25
Os efeitos de uma eventual sobre-expressão de BUB1 não estão muito
documentados. No entanto, sabe-se que existe sobre-expressão de BUB1 em
determinados tipos de cancro, nomeadamente linfomas, por oposição a outras
neoplasias referidas anteriormente em que a expressão deste gene está diminuída.
Segundo um trabalho de Ricke et al, a sobre-expressão de BUB1 pode ser
potenciadora do desenvolvimento de neoplasias de constituição cromossómica
aneuplóide por promover erros de segregação cromossómica. No entanto, as
consequências moleculares e fisiológicas desta sobre-expressão ainda não são
conhecidas (Ricke et al., 2011). Assim, embora sejam necessárias evidências
adicionais para suportar estes dados, poderá ser de esperar um aumento das taxas de
aneuploidia tanto quando existe sub-expressão de BUB1 como quando este gene é
sobre-expresso.
3.1.3. BUB1B
O gene BUB1B (Budding uninhibited by benzimidazole 1 homolog beta),
localizado no cromossoma 15 em q15 (Figura 12), foi inicialmente identificado devido à
homologia com BUB1. Pouco depois da sua identificação, este gene foi reconhecido
como o ortólogo em mamíferos do gene MAD3 de leveduras. No entanto existem
diferenças entre a proteína BubR1, codificada por BUB1B e a proteína Mad3,
nomeadamente a existência de um domínio de cínase na primeira. Esta
particularidade é indicativa de que a atividade de cínase de BubR1 terá sido adquirida
no decorrer da evolução, provavelmente no sentido de dar resposta a novas funções
que lhe terão sido atribuídas (Elowe, 2011). Atualmente, pensa-se que a proteína
BubR1 é muito importante tanto para os mecanismos de checkpoint da divisão celular
como para estabilizar a ligação dos microtúbulos aos cinetocoros.
Esta proteína é recrutada para os cinetocoros onde provavelmente atua
regulando a acção de CENP-E (Kinesin like centromere motor protein). CENP-E
intervém na ligação dos microtúbulos aos cinetocoros bem como no alinhamento dos
cromossomas na placa metafásica. A monitorização destes processos foi comprovada
pelo facto de células em que CENP-E está ausente permanecerem bloqueadas no
processo de divisão, não completando a meiose. Esta monitorização é, pelo menos
Fig.12 - Localização genómica do gene BUB1B (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-
bin/carddisp.pl?gene=BUB1B&search=bub1b)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
26
em parte, levada a cabo por BubR1, como demonstrado por Chan e colaboradores
(Chan et al., 1999). Adicionalmente, BubR1 integra o complexo MCC que, em resposta
a erros de ligação ao fuso, impede a ativação de APC/C e consequente progressão
para anafase. É ainda sugerido um papel de BubR1 na sinalização de células
aneuplóides, promovendo a sua apoptose, à semelhança do que foi descrito para o
gene BUB1 (Elowe, 2011).
Trabalhos com linhas celulares e organismos mutantes com diminuição da
expressão de BubR1, nomeadamente ratinho, têm vindo a acrescentar informação
acerca das funções desta proteína. Células de levedura em que foram induzidas
mutações que inativam BUB1B permanecem viáveis. No entanto, desenvolvem-se
mais lentamente e apresentam erros de segregação cromossómica e aneuploidia. De
forma semelhante, trabalhos com fibroblastos de ratinho com níveis reduzidos de
BubR1 indicam um elevado nível de aneuploidia, enquanto que os ratinhos em si
apresentam uma marcada propensão para o desenvolvimento de tumores. Estes
resultados estão em concordância com os obtidos em humanos com sub-expressão
desta proteína. (Harris et al., 2005).
A redução de expressão de BUB1B e/ou do nível da sua proteína tem vindo a
ser associada a um conjunto de sintomas denominado de Síndrome de Separação
Prematura das Cromátides Irmãs com Aneuploidia Variegada em Mosaico. Trata-se de
uma condição autossómica recessiva rara, caracterizada por atraso no
desenvolvimento psico-motor, microcefalia e elevada taxa de desenvolvimento de
cancro nos primeiros anos de infância ou mesmo durante o desenvolvimento
embrionário (Hanks et al., 2004). Cerca de 37% dos pacientes desenvolvem cancro
nos primeiros 3 anos de vida (Suijkerbuijk et al., 2010). Adicionalmente, estes
pacientes tendem a apresentar separação prematura das cromátides irmãs para todos
os cromossomas, bem como mosaicismo para várias trissomias e monossomias. A
pesquisa em famílias afetadas por esta condição revelou comprometimento das
funções normalmente desempenhadas por BubR1, nomeadamente ao nível do
checkpoint mitótico e do correto alinhamento cromossómico. Foram também detetadas
mutações no gene em questão, causadoras de redução da quantidade de BubR1
disponível ou da perda de funcionalidade desta proteína (Suijkerbuijk et al., 2010).
Embora muito provavelmente a ocorrência desta síndrome não possa ser atribuída
exclusivamente às mutações de BUB1B, os dados existentes apontam no sentido de
contribuírem maioritariamente para esta condição.
Existem ainda trabalhos que relacionam a sub-expressão de BUB1B com
fenótipos típicos de quadros de envelhecimento. Sabe-se também que os níveis de
BubR1 diminuem com o envelhecimento cronológico. Assim, especula-se que este
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
27
gene esteja de alguma forma envolvido no controlo do envelhecimento precoce (Baker
et al., 2013).
A sobre-expressão de BUB1B, por sua vez, não reúne consenso no que diz
respeito às consequências provocadas. Por um lado, seria de esperar um conjunto de
efeitos semelhantes aos observados quando ocorre sobre-expressão de BUB1. Esta
conjetura é apoiada por trabalhos na área da oncologia que evidenciam a existência
de sobre-expressão de BUB1B em diversos tumores de constituição cromossómica
aneuplóide, nomeadamente tumores do ovário, da mama, do estômago e da bexiga,
entre outros. No entanto, segundo um trabalho recente de Baker et al., a sobre-
expressão de BubR1 pode ter um papel protetor relativamente ao aparecimento de
aneuploidia e cancro (Baker et al., 2013).
3.1.4. KIF2C
O gene KIF2C (Kinesin family member 2C), localizado em 1p34.1 (Figura 13),
codifica a proteína Kif2c também designada por MCAK (mitotic centromere associated
kinesin). Esta proteína é o membro melhor caraterizado da família cinesina-13 e foi
identificada através da sua elevada homologia com a proteína Mcak já conhecida em
hamster (Kim et al., 1997). As proteínas pertencentes a esta família são “motores
moleculares” que despolimerizam microtúbulos através da remoção de unidades de
tubulina na extremidade onde ocorre a polimerização. Kif2c, em particular, tem uma
afinidade muito elevada para as extremidades dos microtúbulos, tendo a capacidade
de destabilizar cataliticamente ambas as extremidades a níveis semelhantes.
Esta proteína pode ser encontrada no citoplasma da maioria das células ao
longo de todo o ciclo celular, havendo no entanto um considerável enriquecimento nas
regiões dos cromossomas, cinetocoros e fuso durante a mitose. Atendendo a este
facto, têm sido atribuídas a Kif2c funções na elaboração do fuso mitótico, na dinâmica
dos microtúbulos e no movimento cromossómico no sentido da sua correta
segregação (Sanhaji et al., 2011).
A sobre-expressão de Kif2c está associada à diminuição de erros de
segregação em linhas celulares cromossomicamente instáveis. Assim, pensa-se que
Fig.13 - Localização genómica do gene KIF2C (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KIF2C)
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
28
esta proteína recorre à sua atividade de despolimerizadora para desligar os
microtúbulos dos cinetocoros e promover a reparação de ligações incorretas (Sanhaji
et al., 2011).
A inibição de Kif2c em mitose leva à acumulação de microtúbulos
incorretamente ligados causando nomeadamente a ligação de um cinetocoro a ambos
os polos, o que se designa por ligação merotélica. Por norma, este tipo de ligações
incorretas não é detetado pelos mecanismos de controlo do SAC, o que torna a
merotelia numa potencial causa de aneuploidia (Cimini et al., 2001, Salmon et al.,
2005). Em concordância com este facto, a diminuição da atividade ou ausência de
Kif2c não impede a progressão da divisão em células somáticas mas, em
consequência, estas células apresentam problemas no alinhamento cromossómico em
prometafase, atraso no movimento cromossómico em anafase e erros de segregação
cromossómica (Sanhaji et al., 2011).
A redução de kif2c pode também, de certa forma, estar relacionada com o
efeito da idade materna no aumento da taxa de ovócitos aneuploides. Estudos de
expressão génica em ovócitos de ratinho sugerem uma redução de quantidade de
Kif2c à medida que a idade materna avança (Pan et al., 2008). A confirmar-se existe a
possibilidade de que, devido à redução da proteína, exista uma redução da
capacidade de Kif2c na reparação de ligações cinetocoro-microtúbulo incorretas,
contribuindo assim para o aparecimento de ovócitos aneuplóides. No entanto, diversos
trabalhos têm vindo a apontar no sentido de, apesar de Kif2C ser importante para o
correto alinhamento cromossómico, a sua inibição não implicar necessariamente
aumento na taxa de aneuploidias verificada (Illingworth et al., 2010, Vogt et al., 2010).
Níveis baixos de Kif2c podem estar também implicados na ocorrência de separação
prematura das cromátides-irmãs. Um estudo de Vogt e colaboradores sugere a
possibilidade de esta proteína se acumular nos locais de conexão entre cromátides-
irmãs, evitando que se formam ligações estáveis de microtúbulos aos seus
cinetocoros, o que provocaria a sua separação prematura (Vogt et al., 2010).
As evidências provenientes de trabalhos na área da oncologia permitem
concluir que diferentes tipos de tumores estão associados a diferentes alterações da
expressão de KIF2C. Este gene encontra-se sobre-expresso em tumores da mama
(Shimo et al., 2008), gástricos (Nakamura et al., 2007), colo-retais (Ishikawa et al.,
2008), entre outros. A expressão aumentada deste gene encontra-se ainda
relacionada com prognósticos piores, nomeadamente com maior invasão de células
tumorais nos tecidos circundantes, possibilidade aumentada de metástases e
progressão acelerada da doença (Sanhaji et al., 2011). Estes dados indicam que
existe desregulação de Kif2c em células tumorais, que culmina no desenvolvimento de
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
29
instabilidade cromossómica o que, aparentemente não é impeditivo da proliferação
descontrolada deste tipo de células.
II. OBJETIVOS
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
33
II. Objetivos
O objetivo global deste estudo consiste na avaliação da expressão de genes
associados ao controlo do ciclo celular em produtos de abortamento de constituição
cromossómica aneuplóide.
Para tal foram estabelecidos três objetivos sequenciais:
1. Realização de uma base de dados com todos os produtos de abortamento
com cariótipo aneuplóide para os cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22, que foram
estudados no Departamento de Genética FMUP, entre 2004 e 2012, e respetivo
registo de dados clínicos.
2. Seleção de genes-alvo que, de acordo com a literatura, têm um papel
relevante na segregação cromossómica;
3. Avaliação da expressão dos genes selecionados por Real-Time PCR,
usando ensaios de expressão com sondas TaqMan.
Adicionalmente, pretende-se também determinar a origem parental do
cromossoma supranumerário em produtos de abortamento aneuplóides (Trissomias
dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22) e triplóides recorrendo à técnica de QF-
PCR (Quantitative Fluorescense Polymerase Chain Reaction).
III. Metodologia
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
37
III. Metodologia
1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B
e KIF2C
1.1.Obtenção e preparação das amostras biológicas
As amostras de produtos de abortamento (fragmentos ovulares, placenta ou
tecido fetal) foram enviadas pelo Departamento de Obstetrícia/Ginecologia do Hospital
São João para o Departamento de Genética FMUP/HSJ (Campos, 2008). O material
foi dividido em duas partes, uma para realização de cultura celular e posterior análise
de cariótipo e a restante armazenada em RNA later a -80ºC até à sua utilização.
Após realização do cariótipo selecionaram-se 50 amostras com trissomia
(quatro amostras com trissomia 13, sete com trissomia 15, onze com trissomia 16, dez
com trissomia 18, onze com trissomia 21 e sete amostras com trissomia 22).
Adicionalmente foram selecionados 30 controlos com cariótipo normal, provenientes
de interrupções voluntárias de gravidez, com informação clínica de provável infeção ou
abortamentos de causa materna.
1.2. Extração de RNA
As amostras selecionadas foram submetidas a um processo de desagregação
mecânica (MiniLys, Bertin Technologies, França), seguindo-se a extração do RNA total
pela técnica convencional do TriPure (Roche Diagnostics, Indianapolis, EUA) (Anexo
I). Este reagente leva à disrupção da membrana celular e à desnaturação das
nucleases endógenas. Com a adição de clorofórmio e subsequente centrifugação dá-
se a separação da amostra em três fases: uma fase superior incolor, uma interfase
branca e uma fase inferior vermelha, constituída por substâncias orgânicas.
Transferindo a fase superior para um novo tubo é possível recuperar o RNA mediante
precipitação com Isopropanol (Figura 14). O RNA total foi eluído em água livre de
nucleases.
Fig.14 - Esquema das fases obtidas após adição de clorofórmio na extracção de RNA pelo método convencional do TriPure
®
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
38
A concentração de RNA total extraído por amostra foi avaliada usando o
Nanodrop 2000c (Thermo Scientific).
1.3. Síntese de cDNA
Para a síntese de cDNA, 500ng de RNA total foram sujeitos a transcrição
reversa com primers aleatórios, usando o kit comercial qScript cDNA Supermix
(Quanta BioSciences Inc., Gaithersburg, MD, EUA) de acordo com o protocolo
fornecido pelo fabricante. As condições da PCR estão sumariadas na tabela 1.
Tabela 1: Condições da PCR de transcrição reversa
Temperatura (ºC) Tempo (min)
25,0 5,0
42,0 30,0
85,0 5,0
4,0 ∞
1.4. PCR quantitativo em tempo real
Analisaram-se os níveis de expressão de RNA dos quatro genes-alvo
selecionados (BUB1, BUB1B, MAD2L2 e KIF2C) e de um gene housekeeping
(GAPDH) por PCR quantitativo em tempo real utilizando o sistema StepOne Plus Real-
Time PCR™ (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Foram usados ensaios Taqman
Gene Expression Assays (Sondas MGB, marcadas com o corante FAM; Applied
Biosystems, Foster City, EUA) para cada gene: MAD2L2 (Hs01057448_m1), BUB1
(Hs01557701_m1), BUB1B (Hd01084828_m1) e KIF2C (Hs00901710_m1) e para o
controlo GAPDH (Hs99999905_m1). As reações foram levadas a cabo num volume de
20µL, de acordo com o indicado na tabela 2, para cada gene. Foi construída uma reta
padrão com diluições sucessivas para cada gene analisado (Doria et al., 2010).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
39
Tabela 2: Componentes da reação de PCR quantitativo em tempo real
Componentes Volume (µL) por reacção
Mix do ensaio de expressão génica TaqMan® (20X) 1,0
Molde de Cdna 2,0
Água livre de RNAses 7,0
Master Mix TaqMan® Fast Universal PCR (2X), No AmpErase
® UNG 10,0
Volume final 20,0
1.5. Análise dos resultados
A análise de resultados foi efetuada usando o software REST 2009 (Relative
Expression Software Tool), que permite estimar variações da expressão génica,
comparando duas populações: casos e controlos. Esta ferramenta considera ainda
fatores como a eficiência da reação e normalização com genes de referência. O teste
de hipótese P(H1) representa a probabilidade de a hipótese alternativa de que a
diferença entre a amostra e os grupos de controlo se deve apenas ao acaso. A
negatividade do PCR em tempo real é definida como a ausência de produto
amplificado após 40 ciclos. O valor de significância foi estabelecido em P<0.05. Como
o software REST usa para o cálculo os valores Ct e a eficiência da reação ao invés de
valores relativos de expressão, assumiu-se que o valor do último ciclo de amplificação
(Ct=40 ciclos) corresponde ao valor de ausência de expressão relativa (Doria et al.,
2010).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
40
Amostras Aneuplóides e Triplóides
258
Outras aneuploidias
74
Trissomias dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e triploidias
184
Não puderam ser contactadas ou não aceitaram participar
164
Amostras analisadas
20
2. Avaliação da origem parental do cromossoma
supranumerário em produtos de abortamento com
trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22
2.1. Amostras Biológicas
Nas amostras de produtos fetais (fragmentos ovulares, placenta, tecido fetal,
líquido amniótico, vilosidades coriónicas ou sangue do cordão umbilical) com indicação
para estudo molecular procedeu-se à extração de DNA e análise da ploidia, pelas
técnicas de MLPA ou QF-PCR. Após seleção das amostras com trissomia para os
cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e triploidia, procedeu-se ao contacto telefónico
com os pais no sentido de aferir a sua disponibilidade para colaborar neste estudo.
Nos casos em que a resposta foi afirmativa, foi obtido consentimento informado e
procedeu-se à recolha do material biológico por esfregaço bucal (IsoHelix SK-1; Cell
Projects Ltd, Kent, Inglaterra). Procedeu-se à secagem dos esfregaços bucais à
temperatura ambiente e ao seu armazenamento até serem utilizados (não mais do que
72 horas). O procedimento de triagem das amostras biológicas a analisar encontra-se
sumariado na Figura 15.
Fig.15 - Processo de seleção das amostras fetais a analisar
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
41
2.2. Extração de DNA
O DNA fetal foi extraído usando o kit comercial DNeasy® (Qiagen, Hilden,
Alemanha), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O DNA materno e
paterno foi extraído a partir de esfregaços bucais recorrendo ao kit comercial JETquick
Blood & Cell Culture DNA Spin Kit (Genomed, Löhne, Alemanha) e eluído em 50 µL de
água estéril bidestilada. A concentração de DNA das amostras foi posteriormente
quantificada usando um Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). As amostras foram
armazenadas a 4ºC até à sua utilização.
2.3. PCR quantitativo de fluorescência (QF-PCR)
As reações de QF-PCR foram realizadas usando uma mix de primers
específica para os marcadores de cada trissomia em particular. Os pares de primers
utilizados são compostos por um primer forward marcado com fluorescência e um
primer reverse não marcado e estão sumariados na tabela 4. As condições de
amplificação estão descritas na tabela 3.
Temperatura Tempo (min) Número de ciclos
95,0ºC 5,0 1
94,0ºC 0,48 35
58,0ºC 0.48 1
72,0ºC 1,0 1
72,0ºC 30,0 1
Tabela 3: Condições de amplificação da QF-PCR.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
42
Tabela 4 : Primers utilizados para os diferentes Short Tandem Repeats
2.4. Eletroforese capilar
Para cada poço da placa de 96 poços utilizada foram pipetados 13,7 µL de
formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems) (agente desnaturante) e 0,3 µL de
GeneScan™-600Liz™ (Applied Biosystems) (padrão interno), bem como 2 µL de
produto de PCR. Posteriormente as amostras foram desnaturadas a 94ºC por 3
minutos, arrefecidas em gelo por 3 minutos e colocadas no sequenciador automático
Primer Sequência Marcação
Tri
ss
om
ia 1
5
D15S1028-F TGTCCTGAAATTCCCAAC VIC
D15S1028-R GAACTGTGCTCTGTGCTC
D15S211-F AAAAGCCCCAGGTAGGG PET
D15S211-R AAGCAGGTGGAATCCTTG
D15S1023-F GGTATTGTTTTGGACCACATCTTAG NED
D15S1023-R GGGAGGCTGAGACAGTTTC
D15S125-F TTCCACACATGACCGC VIC
D15S125-R CCCCTGAAGACCGTGA
Tri
ss
om
ia 1
6
D16S539-F GATCCCAAGCTCTTCCTCTT NED
D16S539-R ACGTTTGTGTGTGCATCTGT
D16S753-F CAGGCTGAATGACAGAACAA VIC
D16S753-R ATTGAAAACAACTCCGTCCA
D16S518-F GGCCTTTTGGCAGTCA PET
D16S518-R ACCTTGGCCTCCCACC
D16S519-F AGCTTACCAGTCTCACAGGG NED
D16S519-R AAACCATGCTTGTCTAGCC
Tri
ss
om
ia 1
8
D18S386-F TCAGGAGAATCACTTGGAAC PET
D18S386-R TCCATGAAGTAGCTAAGCAG
D18S535-F TCATGTGACAAAAGCCACAC 6-FAM
D18S535-R AGACAGAAATATAGATGAGAATGCA
D18S51-F GAGCCATGTTCATGCCACTG VIC
D18S51-R CAAACCCGACTACCAGCAAC
D18S1002-F CAAAGAGTGAATGCTGTACAAACAGC 6-FAM
D18S1002-R CAAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG
Tri
ss
om
ia 2
1
D21S11-F GTGAGTCAATTCCCCAAG NED
D21S11-R GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC
D21S1411-F ATGATGAATGCATAGATGGATG VIC
D21S1411-R AATGTGTGTCCTTCCAGGC
D21S1412-F CGGAGGTTGCAGTGAGTTG NED
D21S1412-R GGGAAGGCTATGGAGGAGA
D21S1437-F ATGTACATGTGTCTGGGAAGG 6-FAM
D21S1437-R TTCTCTACATATTTACTGCCAACA
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
43
ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, EUA) onde se deu a
separação dos fragmentos marcados com fluorescência por electroforese capilar.
2.5. Análise dos resultados
A análise dos resultados foi realizada recorrendo ao software GeneMapper
v4.1. (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Esta ferramenta permite interpretar os
picos de fluorescência detetados na eletroforese capilar (Figura 16). O software
recorre ao tamanho do padrão incluído em cada amostra para criar uma reta-padrão.
Por comparação com esta reta-padrão foi então determinado o tamanho relativo de
cada fragmento marcado com fluorescência.
Fig.16 - Picos de fluorescência detetados pelo sequenciador automático ABI 3500 e analisados pelo software GeneMapper v4.1 para a amostra 9. O painel superior corresponde ao DNA fetal, sendo visíveis três picos de fluorescência. O painel intermédio corresponde ao DNA materno e o painel inferior ao DNA paterno, apresentando ambos dois picos de fluorescência.
IV. Resultados
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
47
IV. Resultados
1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B
e KIF2C em produtos de abortamento
No sentido de avaliar a expressão de quatro genes envolvidos no controlo do
ciclo celular (MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C) em produtos de abortamento foi
realizada uma reação de PCR quantitativa em tempo real em 50 amostras com
trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e em 30 controlos com cariótipo
normal. As informações clínicas relativas às amostras encontram-se sistematizadas na
tabela 5. O cálculo da média das idades maternas para cada trissomia em estudo foi
indicativo de que a trissomia 18 teve a idade materna média mais elevada (39,1 anos),
seguindo-se a trissomia 21 (37,1 anos), a trissomia 15 (36,3 anos) e a trissomia
trissomia 13 (35,8 anos). Para as trissomias 13 e 18 foram obtidas as médias de idade
materna mais baixas, 32,6 anos e 32,5 anos, respetivamente.
Para a análise dos resultados da PCR quantitativa em tempo real usou-se o
software REST 2009 e o gene GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) como
gene de referência para a normalização. Os rácios de expressão génica foram
calculados usando a fórmula:
Os resultados relativos à análise de todas as trissomias em estudo encontram-
se sumariados na tabela 6. Para os genes MAD2L2 e KIF2C não se verificou alteração
dos valores de expressão, comparativamente com o grupo controlo. No que diz
respeito aos genes BUB1 e BUB1B foi possível detetar sobre-expressão relativamente
aos valores obtidos para o grupo controlo (Tabela 6, Figura 17).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
48
Tabela 5 : Informação clínica das amostras selecionadas e média das idades maternas para cada trissomia
Nº Amostra Idade Gestacional
(Semanas)
Idade Materna
(Anos)
Média da Idade
Materna (Anos) T
risso
mia
13 A22 12 41
35,8 A23 ? 32
A26 ? 32
A27 ? 38
Tri
sso
mia
15
A36 ? 29
36,3
A37 9 40
A38 ? 32
A39 ? 31
A40 9 42
A41 ? 42
A42 8 38
Tri
sso
mia
16
A04 ? 33
32,6
A05 ? 33
A06 ? 29
A09 ? 31
A10 ? 36
A12 ? 25
A16 5 25
A18 6 40
A19 10 38
A21 ? 35
A50 ? 34
Tri
sso
mia
18
A24 17 37
32,5
A25 ? 20
A28 15 43
A29 ? 39
A30 17 39
A31 9 31
A32 13 36
A33 28 20
A34 13 31
A35 ? 29
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
49
Tabela 6 : Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C considerando todas as trissomias em estudo.
Gene Expressão 95% C.I. P(H1) Resultado
MAD2L2 1,611 0,000 - 11.498,539 0,509 ↔
BUB1 3,826 0,003 - 29.981,105 0,036 ↑
BUB1B 4,023 0,000 - 78.430,260 0,042 ↑
KIF2C 3,353 0,001 - 29.582,351 0,068 ↔
(C.I.: Intervalo de confiança; P(H1): Probabilidade hipótese alternativa)
Tri
sso
mia
21
A01 ? 34
37,1
A02 12 42
A03 9 41
A07 ? 37
A08 18 35
A11 16 40
A13 ? 33
A14 ? 37
A15 ? 35
A17 16 36
A20 18 38
Tri
sso
mia
22
A43 7 34
39,1
A44 ? 41
A45 8 37
A46 ? 41
A47 8 38
A48 ? 42
A49 8 41
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
50
Tendo em conta a localização do gene BUB1B no cromossoma 15, optou-se
por realizar uma segunda análise com o software REST 2009 excluindo as sete
amostras com trissomia para o cromossoma 15, no sentido de avaliar se a sobre-
expressão detetada para este gene estaria relacionada com a presença de uma cópia
supranumerária do gene BUB1B. Os resultados obtidos mostram que, excluindo as
amostras com trissomia do cromossoma 15, existe sobre-expressão de BUB1 nas
amostras quando comparadas com os controlos. Para os restantes genes testados,
incluindo BUB1B, não foram detetadas alterações dos níveis de expressão
estatisticamente significativas (Tabela 7, Figura 18).
Tabela 7 : Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C, excluindo a trissomia 15.
Gene Expressão 95% C.I. P(H1) Resultado
MAD2L2 1,948 0,000 - 12.210,700 0,380 ↔
BUB1 4,235 0,003 - 34.634,942 0,046 ↑
BUB1B 4,006 0,001 - 83.988,820 0,072 ↔
KIF2C 3,495 0,001 - 30.955,781 0,080 ↔
Fig. 17- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C; As caixas representam o intervalo interquartil. A linha tracejada representa a mediana dos valores de expressão. Os extremos representam os valores máximos e mínimos observados.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
51
Fig. 18- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C excluindo as amostras com trissomia 15; As caixas representam o intervalo interquartil. A linha tracejada representa a mediana dos valores de expressão. Os extremos representam os valores máximos e mínimos observados.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
52
2. Avaliação da origem parental do cromossoma
supranumerário em produtos de abortamento com
trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22
Com o objetivo de determinar a origem parental do cromossoma
supranumerário ou, no caso da triploidia, do complemento cromossómico adicional, foi
aplicada a técnica de QF-PCR a vinte amostras de produtos de abortamento. Os
resultados obtidos, bem como os dados relativos à idade materna e idade gestacional
na altura do abortamento encontram-se sistematizados na tabela 8.
Tabela 8: Dados clínicos e resultado obtido com a técnica QF-PCR.
Amostra Origem parental
Idade
Gestacional
(Semanas)
Idade Materna
(Anos)
Idade Materna
Média (Anos)
Trissomia 15
01 Materna ? 42
35,3 02 Materna ? 32
03 Materna ? 32
Trissomia 16
04 Materna 9 29
33,5 05 inconclusiva ? 34
06 Materna ? 31
07 Materna 6 40
Trissomia 18
08 Materna ? 40
33,8 09 Materna ? 20
10 Materna 17 37
11 Materna 12 38
Trissomia 21
12 Materna ? 33
38,2
13 Materna 9 41
14 Materna 16 35
15 Materna 18 38
16 Materna 17 44
Triploidia
17 Materna ? 32
32,0 18 Paterna 8 27
19 Materna 12 31
20 Materna 21 38
V. Discussão
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
55
V. Discussão
1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B
e KIF2C em produtos de abortamento
A necessidade de manter um genoma euplóide equilibrado é uma condição
essencial para o sucesso de todos os organismos multicelulares. A divisão celular,
absolutamente necessária para a reprodução e desenvolvimento dos organismos
superiores é um processo extremamente complexo e, apesar de ser altamente
regulado, está sujeito à ocorrência de erros. Se, por algum motivo, este mecanismo
falhar, as células-filhas resultantes podem herdar um complemento cromossómico
anormal, condição denominada como aneuploidia. Se a aneuploidia tiver sido
originada no processo meiótico aquando da formação de gâmetas ou nas primeiras
divisões mitóticas de um embrião, denomina-se aneuploidia constitucional. São
exemplos deste tipo de aneuploidia as trissomias 13, 18 e 21, responsáveis pelos
síndromes de Patau, Edwards e Down, respetivamente. No entanto, a aneuploidia
também pode surgir numa célula ou população de células somáticas diferenciadas,
designando-se neste caso como aneuploidia adquirida (Jackson-Cook, 2011).
Diversos trabalhos indicam que a aneuploidia tem efeitos prejudiciais no
desenvolvimento humano, o que é ilustrado pelo efeito letal ainda em período
embriogénico bem como pelo severo fenótipo associado às raras aneuploidias
compatíveis com a sobrevivência em humanos (Siegel & Amon, 2012, Sheltzer &
Amon, 2011). Também em organismos modelo como leveduras e ratinho é possível
verificar efeitos deletérios associados à alteração do complemento cromossómico
(Torres et al., 2008). Adicionalmente, estes efeitos foram também comprovados ao
nível celular, tendo sido verificado que células aneuplóides têm taxas de proliferação
consideravelmente inferiores quando comparadas com células semelhantes, mas com
complemento cromossómico normal, em condições padronizadas de crescimento
(Sheltzer & Amon, 2011). No entanto, estes dados parecem estar em desacordo com
as evidências que têm vindo a surgir de que um elevado número de tumores tem
cariótipo aneuplóide. A aneuploidia, de facto, tem vindo a ser apontada como uma das
principais características da maioria dos tumores sólidos e de cerca de metade dos
processos oncológicos hematopoiéticos (Pariente, 2012). Trabalhos na área da
oncologia têm vindo a evidenciar que em determinados tumores a aneuploidia
adquirida é transmitida de forma estável ao longo das divisões celulares
subsequentes. No entanto, mais frequentemente, o complemento cromossómico tem
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
56
tendência a sofrer alterações rápidas ao longo das sucessivas divisões celulares,
sugerindo a existência de defeitos na capacidade das células replicarem ou
segregarem corretamente os seus cromossomas (King, 2008). Este fenómeno é
designado como instabilidade cromossómica (CIN, do inglês chromosomal instability) e
tem vindo a ser descrito em numerosos processos oncológicos na espécie humana
(Yuen & Desai, 2008). No seguimento destas evidências, Thompson e Compton
realizaram a medição direta das taxas de erro de segregação em linhas celulares
derivadas de tumores com instabilidade cromossómica. Esta análise revelou que, em
média, estas células falham na correta segregação de um cromossoma a cada uma a
cinco divisões celulares (Thompson & Compton, 2008). Algumas evidências apontam
no sentido de, ao contrário do que se verifica nos casos de aneuploidia estável, a CIN
não acarretar diminuição da proliferação celular (Zasadil et al., 2013).
Existem diversos mecanismos que podem estar na origem da CIN,
nomeadamente defeitos na coesão cromossómica ou no SAC, número incorreto de
centrossomas, alteração da dinâmica das ligações cinetocoro-microtúbulo e
desregulação do ciclo celular (Thompson et al., 2010). Muito embora a maioria das
situações de CIN derive provavelmente de centrossomas em número anormalmente
elevado (Vitre & Cleveland, 2012), a contribuição da alteração da atividade do SAC
não deve ser ignorada.
A relação entre a aneuploidia constitucional e a instabilidade cromossómica
não está bem definida. No entanto, o aumento da prevalência de determinados tipos
de cancro com instabilidade cromossómica em pacientes com trissomias sugere a
existência de algum tipo de ligação entre estes dois fenómenos (Ganmore et al.,
2009).
Um dos objetivos deste trabalho consistiu na avaliação do nível de expressão
dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C em produtos de abortamento aneuplóides
através da técnica de PCR quantitativa em tempo real. Trata-se de genes envolvidos
no mecanismo de checkpoint meiótico e mitótico e, particularmente no caso de KIF2C,
na monitorização da ligação entre cinetocoros e microtúbulos, mecanismos essenciais
para a correta divisão celular. Assim sendo, e atendendo à possível contribuição de
alterações no SAC para o desenvolvimento de CIN, equacionou-se a hipótese de
existirem alterações na expressão destes genes comparativamente a amostras de
produtos de abortamento de constituição cromossómica normal.
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que, quando consideradas as
seis trissomias, dois dos genes estudados, BUB1 e BUB1B, se encontram sobre-
expressos nas amostras. Para os genes MAD2L2 e KIF2C não foram detectadas
diferenças significativas entre as amostras e os controlos (Tabela 6, Figura 17).
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
57
A proteína Bub1, codificada pelo gene BUB1, tem um papel crucial no SAC,
participando não só no recrutamento de outras proteínas fundamentais como também
de forma mais direta no adiamento da progressão para anafase em situações em que
o mecanismo de checkpoint não foi satisfeito. A maioria dos trabalhos acerca de BUB1
foca os efeitos da sua sub-expressão, nomeadamente no que diz respeito à redução
dos níveis ou da funcionalidade da proteína Bub1, associando-os ao desenvolvimento
de processos tumorais e produção de gâmetas haplóides. Os efeitos da sobre-
expressão deste gene não têm sido tão visados pela investigação, pelo que não se
encontram bem documentados. Em leveduras, Warren et al. demonstraram que a
sobre-expressão de BUB1 provoca instabilidade cromossómica, levando à diminuição
da competência dos mecanismos de checkpoint e ao aumento da taxa de erros de
segregação cromossómica (Warren et al., 2002). Em ratinhos mutantes usados como
modelo de cancro da próstata foi também detetada a sobre-expressão deste gene,
estando associada ao desenvolvimento de instabilidade cromossómica (Guo et al.,
2006). Na espécie humana, sabe-se que existe sobre-expressão de BUB1 em
determinados tipos de cancro, nomeadamente gástricos (Grabsch et al., 2003), da
mama (Yuan et al., 2006), e linfomas (Alizadeh et al., 2000). Segundo um trabalho de
Ricke et al, a sobre-expressão de BUB1 pode ser potenciadora do desenvolvimento de
neoplasias de constituição cromossómica aneuplóide por promover erros de
segregação cromossómica (Ricke et al., 2011, Ricke & van Deursen, 2011) e,
consequentemente, CIN. Atendendo ao seu papel protetor da coesão das cromátides-
irmãs (Marchetti & Venkatachalam, 2010), é possível especular que em níveis
demasiados elevados, a proteína Bub1 possa atuar atrasando esta separação,
culminando num aumento da taxa de aneuploidia nas células-filhas.
Relativamente ao gene BUB1B, sabe-se que codifica uma das proteínas
cruciais tanto para o funcionamento do SAC, como para a estabilização da ligação dos
cinetocoros aos microtúbulos, contribuindo assim para a correta segregação
cromossómica (Hanks et al., 2004). A sub-expressão deste gene durante o processo
meiótico, à semelhança do que foi descrito para BUB1, tem vindo a ser associada com
o desenvolvimento de gâmetas aneuplóides e, consequentemente contribuindo para o
aparecimento de aneuploidias constitutivas. Durante a mitose, a redução da expressão
de BUB1B relaciona-se com o desenvolvimento de processos tumorais associados a
instabilidade cromossómica e prognósticos clínicos pouco favoráveis. Mutações
conducentes a expressão reduzida de BUB1B estão ainda implicadas na origem de
uma doença rara denominada Síndrome de separação prematura das cromátides-
irmãs com aneuploidia variegada em mosaico. Esta condição caracteriza-se por uma
elevada instabilidade cromossómica que conduz ao aparecimento de várias
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
58
aneuploidias em mosaico que, por sua vez, parecem relacionar-se com a elevada
prevalência de diversos tipos de cancro nos primeiros anos de vida ou ainda durante o
desenvolvimento fetal. Por sua vez, diversos trabalhos indicam que a sobre-expressão
deste gene também se correlaciona com determinados tipos de cancro,
nomeadamente da tiróide (Wada et al., 2008), rim (Pinto et al., 2008), mama
(Maciejczyk et al., 2013) e bexiga (Yamamoto et al., 2007), bem como linfomas (Chen
et al., 2013) e neoplasias gástricas (Grabsch et al., 2003, Ando et al., 2010).,
associados a instabilidade cromossómica. Por oposição, um trabalho recente de Baker
et al refere que a sobre-expressão de BUB1B em ratinhos transgénicos tem um papel
protetor relativamente ao surgimento de aneuploidia adquirida e de cancro. Os autores
sugerem que o aumento da expressão deste gene reforça a actividade de vigilância do
SAC, reduzindo assim a incidência de instabilidade cromossómica. Outra hipótese
sugerida no trabalho em questão é a influência desta sobre-expressão em
mecanismos pós-zigóticos em que BubR1 também intervém, nomeadamente
morfogénese e diferenciação (Baker et al., 2013). Estes resultados parecem colidir
com as evidências que associam a sobre-expressão de BUB1B ao desenvolvimento
de processos tumorais. Uma explicação possível é que a sobre-expressão de BUB1B
tenha um papel protector até um determinado limiar, a partir do qual os seus efeitos
passam a ser deletérios.
A sobre-expressão de ambos os genes tem vindo a ser associada ao
desenvolvimento de processos tumorais relacionados com cariótipos aneuplóides, ou
seja, a aneuploidias adquiridas. Até à data, este é o único trabalho a indicar a sobre-
expressão destes genes em produtos de abortamento com diferentes trissomias
constitucionais. Estes resultados podem permitir, em parte, estabelecer um
paralelismo entre as aneuploidias adquiridas e as aneuploidias constitucionais,
nomeadamente no que diz respeito à instabilidade cromossómica. Como foi descrito
anteriormente, diversos trabalhos associam a desregulação de BUB1 e BUB1B ao
desenvolvimento de tumores aneuplóides com instabilidade cromossómica. No caso
das aneuploidias constitucionais, a sobre-expressão detetada pode, pelo menos em
certa medida, ser responsável pelo aumento da prevalência de determinados tipos de
cancro em pacientes com síndromes associados à alteração do complemento
cromossómico, cujo exemplo paradigmático é a síndrome de Down.
Os resultados obtidos na análise em que foram excluídas as amostras com
trissomia do cromossoma 15 continuam a indicar a existência de sobre-expressão de
BUB1. No entanto, para BUB1B já não se verifica o aumento de expressão (Tabela 7,
Figura 18). A discrepância de resultados entre as duas análises realizadas parece
suportar a hipótese de que a sobre-expressão detetada para BUB1B na análise global
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
59
se poderá dever à presença de uma terceira cópia do gene em questão nas amostras
com trissomia 15.
Embora o aumento da expressão de BUB1 e BUB1B seja significativo do ponto
de vista estatístico, não se tratam de diferenças muito pronunciadas. Assim, existe a
hipótese de o aumento de expressão verificado se tratar de um mecanismo para tentar
colmatar uma eventual perda de função do SAC. Importa também salientar que o facto
de o gene BUB1B se localizar no cromossoma 15 e de este trabalho ter incluído sete
casos de trissomia 15, o que pode ter influenciado os resultados obtidos. Por outro
lado, os níveis elevados de mRNA detetados podem não se traduzir em efeitos ao
nível da quantidade e/ou funcionalidade da proteína. Assim, como perspectivas
futuras, seria importante analisar a funcionalidade e quantidade das proteínas Bub1 e
BubR1, no sentido de confirmar os resultados obtidos através da quantificação relativa
de mRNA. Seria também importante analisar o nível de expressão génica para cada
trissomia em particular, sendo para isso necessário aumentar a dimensão da amostra
para se obterem resultados representativos.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
60
2. Avaliação da origem parental do cromossoma
supranumerário em produtos de abortamento com
trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22
Apesar de na triagem inicial terem sido selecionadas 184 amostras de produtos
de abortamento com trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e triploidia,
apenas 20 casais acederam a colaborar com este estudo (Figura 15). Esta reduzida
adesão poderá estar relacionada com a carga emocional que um abortamento
acarreta. Segundo um estudo conduzido por Adolfsson et al., que consistiu na
realização de entrevistas periódicas a mulheres que experienciaram abortamentos, os
principais sentimentos envolvidos são o luto, a depressão, a revolta e impotência face
ao sucedido (Adolfsson et al., 2004). A maioria dos trabalhos relacionados com o
impacto psicológico de um abortamento foca-se na mãe. No entanto, a maioria dos
pais também experiencia sentimentos de perda, ansiedade e impotência após um
abortamento (Conway & Russell, 2000). Um abortamento pode também ser um fator
gerador de tensão no casal, estando registado um ligeiro aumento de separações e
divórcios em casais com pelo menos um abortamento, comparativamente com casais
que não foram sujeitos a esta condicionante (Gold et al., 2010). Assim, no entender de
alguns casais, a participação neste estudo podia de certa forma reavivar a memória
desse acontecimento traumático, tendo optado por não participar.
Embora a reduzida dimensão da amostra não permita que sejam tiradas
conclusões com relevância estatística, é possível observar que a grande maioria das
aneuploidias analisadas deriva de erros de origem materna (Tabela 8). Esta tendência
está de acordo com o referido na literatura.
Relativamente à trissomia 15, embora não seja muito comum, estando
presente apenas em cerca de 1,4% dos abortamentos espontâneos, existem trabalhos
publicados que indicam uma elevada prevalência da origem materna do cromossoma
supranumerário (Zaragoza et al., 1994). Trabalhos relacionados com as síndromes de
Prader-Willi e Angelman focando dissomias monoparentais fornecem mais
informações acerca da contribuição materna para esta aneuploidia. Assim, sabe-se
que em cerca de 73% das trissomias 15 de origem materna a não-disjunção ocorre na
meiose I, em 12% dos casos o erro ocorre em meiose II e os restantes 15% são
atribuídos a mecanismos pós-zigóticos, também eles com origem materna (Robinson
et al., 1996). Neste trabalho foram analisados apenas três casos de trissomia 15,
tendo todos eles origem materna, o que está de acordo com o descrito na literatura.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
61
A trissomia 16 é a aneuploidia mais comum nas conceções humanas, embora
seja incompatível com a vida, exceto quando em mosaico. Segundo vários estudos
visando a origem parental e meiótica desta condição, praticamente todos os casos
descritos têm origem na primeira divisão meiótica materna. Este padrão de não-
disjunção é específico para este cromossoma e ainda não foi devidamente elucidado.
Existem evidências que apontam no sentido de este padrão de não disjunção derivar
de configurações anormais dos locais de crossing-over (Garcia-Cruz et al., 2010). Os
resultados obtidos neste trabalho estão enquadrados com os anteriormente descritos,
uma vez que três das trissomias 16 analisadas derivaram de erros de disjunção
materna. A origem parental da quarta amostra analisada foi inconclusiva pois os pais
eram homozigóticos para os marcadores testados. Quanto ao efeito da idade materna,
os casos descritos em trabalhos anteriores referem que a trissomia 16 é transversal a
todas as idades maternas. O aumento da idade materna relaciona-se com o aumento
da incidência de trissomia 16 de forma muito menos acentuada do que o que se
verifica com outras trissomias. A média de idade materna das amostras incluídas
neste trabalho foi de 33,5 anos, sendo a segunda mais baixa do conjunto de cinco
alterações cromossómicas numéricas analisadas, estando assim de acordo com o que
foi previamente descrito.
No que diz respeito à trissomia 18, os resultados obtidos neste trabalho vão de
encontro aos descritos em publicações anteriores, segundo as quais cerca de 91%
dos casos derivam de erros de não-disjunção materna, 31% dos quais devido a erros
na meiose I, 60% devido a mecanismos de não-disjunção em meiose II e cerca de 8%
devido a erros mitóticos que levaram à duplicação do cromossoma materno (Nicolaidis
& Petersen, 1998). Nas quatro amostras analisadas, a aneuploidia foi associada a
origem materna. A média da idade materna foi de 33,8 anos, estando de acordo com
trabalhos que indicam um aumento da prevalência desta condição quando a idade
materna ultrapassa os 30 anos (Savva et al., 2010).
A trissomia 21, mecanismo responsável pela maioria dos casos de síndrome de
Down, tem sido detalhadamente estudada ao longo das últimas décadas. Os
resultados provenientes destes trabalhos indicam que, na maioria dos casos, o
cromossoma supranumerário tem origem materna, contribuindo para
aproximadamente 90% do total. De entre estes casos, três em cada quatro terão
resultado de erros de disjunção em meiose I. Mecanismos de não disjunção na meiose
paterna são responsáveis por cerca de 8% do total de casos, dividindo-se de forma
praticamente equitativa entre não disjunção em meiose I ou em meiose II. Erros de
disjunção nas divisões pós-zigóticas estão na base de uma minoria de 2% do total de
casos. Relativamente à idade materna média, os resultados provenientes da literatura
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
62
mostram que é mais elevada nos casos de origem materna (cerca de 32 anos), não
havendo diferenças significativas entre meiose I e meiose II. Nos casos com origem
paterna ou pós-zigótica a média de idade materna é semelhante (aproximadamente 28
anos) (Hassold & Sherman, 2000). Neste trabalho foram analisados cinco casos de
trissomia 21, tendo todos eles origem materna. A média da idade materna foi de 38,2
anos, o que está de acordo com a relação amplamente descrita entre esta condição e
a idade materna avançada. Das aneuploidias analisadas, a trissomia 21 apresentou a
idade materna média mais elevada.
A origem parental da triploidia permanece de certa forma controversa. Estudos
citogenéticos antigos indicavam que a maioria das triploidias teria origem paterna,
nomeadamente devido a mecanismos de dispermia. Trabalhos mais recentes,
baseados na análise de microssatélites indicam uma prevalência da origem materna.
Esta discrepância pode dever-se a diferenças nas populações em estudo. Segundo
Zaragoza et al., a dispermia é a principal responsável pela ocorrência de triploidias
detectadas em amostras de idade gestacional de 5-18 semanas. Fetos com triploidia
de origem materna têm tendência a abortar mais precocemente ou, caso resistam às
primeiras semanas de gestação, tipicamente resultam em abortamentos tardios, de
fetos já consideravelmente desenvolvidos (Zaragoza et al., 2000). No que diz respeito
à triploidia, os resultados obtidos neste trabalho não estão de acordo com o padrão
descrito anteriormente. No entanto, foram analisadas apenas quatro amostras sendo
que para uma delas não foi possível obter informação relativa à idade gestacional.
Assim sendo, esta discrepância pode ser motivada por um enviesamento dos
resultados deste estudo, motivado pela reduzida dimensão da amostra que pode não
ser representativa da população.
VI. Conclusão
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
65
VI. Conclusão
Em conclusão, devido ao elevado impacto clínico da aneuploidia, é importante
conhecer detalhadamente os mecanismos que estão na sua origem e na origem dos
fenótipos a si associados.
Relativamente à análise da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e
KIF2C em produtos de abortamento de constituição cromossómica aneuplóide, os
resultados obtidos permitem equacionar a existência de uma relação entre a
aneuploidia constitucional e a instabilidade cromossómica, estabelecendo-se, de certa
forma, um paralelismo com a aneuploidia adquirida.
No que diz respeito ao estudo da origem parental do cromossoma
supranumerário em produtos de abortamento com trissomias, a reduzida dimensão da
amostra não permitiu conclusões significativas. Embora os resultados obtidos estejam
de acordo com o referido na literatura, é necessário aumentar a dimensão da amostra.
Assim, de forma geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para
aumentar o conhecimento na área da aneuploida, particularmente no que diz respeito
à aneuploida em produtos de abortamento.
VII. Referências Bibliográficas
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
69
VIII. Referências Bibliográficas
Adolfsson, A., Larsson, P.G., Wijma, B. & Bertero, C. (2004) Guilt and emptiness: women's experiences of miscarriage. Health care for women international, 25, 543-60.
Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., Ma, C., Lossos, I.S., Rosenwald, A., Boldrick, J.C., Sabet, H., Tran, T., Yu, X., Powell, J.I., Yang, L., Marti, G.E., Moore, T., Hudson, J., Jr., Lu, L., Lewis, D.B., Tibshirani, R., Sherlock, G., Chan, W.C., Greiner, T.C., Weisenburger, D.D., Armitage, J.O., Warnke, R., Levy, R., Wilson, W., Grever, M.R., Byrd, J.C., Botstein, D., Brown, P.O. & Staudt, L.M. (2000) Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature, 403, 503-11.
Ando, K., Kakeji, Y., Kitao, H., Iimori, M., Zhao, Y., Yoshida, R., Oki, E., Yoshinaga, K., Matumoto, T., Morita, M., Sakaguchi, Y. & Maehara, Y. (2010) High expression of BUBR1 is one of the factors for inducing DNA aneuploidy and progression in gastric cancer. Cancer science, 101, 639-45.
Baker, D.J., Dawlaty, M.M., Wijshake, T., Jeganathan, K.B., Malureanu, L., Van Ree, J.H., Crespo-Diaz, R., Reyes, S., Seaburg, L., Shapiro, V., Behfar, A., Terzic, A., Van De Sluis, B. & Van Deursen, J.M. (2013) Increased expression of BubR1 protects against aneuploidy and cancer and extends healthy lifespan. Nature cell biology, 15, 96-102.
Baty, B.J., Blackburn, B.L. & Carey, J.C. (1994a) Natural history of trisomy 18 and trisomy 13: I. Growth, physical assessment, medical histories, survival, and recurrence risk. American journal of medical genetics, 49, 175-88.
Baty, B.J., Jorde, L.B., Blackburn, B.L. & Carey, J.C. (1994b) Natural history of trisomy 18 and trisomy 13: II. Psychomotor development. American journal of medical genetics, 49, 189-94.
Bielanska, M., Tan, S.L. & Ao, A. (2002) Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human reproduction, 17, 413-9.
Bishop, R. (2010) Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons, 3.
Bugge, M., Collins, A., Hertz, J.M., Eiberg, H., Lundsteen, C., Brandt, C.A., Bak, M., Hansen, C., Delozier, C.D., Lespinasse, J., Tranebjaerg, L., Hahnemann, J.M., Rasmussen, K., Bruun-Petersen, G., Duprez, L., Tommerup, N. & Petersen, M.B. (2007) Non-disjunction of chromosome 13. Human molecular genetics, 16, 2004-10.
Cahill, D.P., Da Costa, L.T., Carson-Walter, E.B., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. & Lengauer, C. (1999) Characterization of MAD2B and other mitotic spindle checkpoint genes. Genomics, 58, 181-7.
Campos, D.A., Montenegro, N., Rodrigues, T (2008) Protocolos de Medicina Materno-Fetal. Lisboa: Lidel Edições técnicas.
Cereda, A. & Carey, J.C. (2012) The trisomy 18 syndrome. Orphanet journal of rare diseases, 7, 81.
Chan, G.K., Jablonski, S.A., Sudakin, V., Hittle, J.C. & Yen, T.J. (1999) Human BUBR1 is a mitotic checkpoint kinase that monitors CENP-E functions at kinetochores and binds the cyclosome/APC. The Journal of cell biology, 146, 941-54.
Chen, F., Yang, G. & Xia, B. (2013) Increased Expression of the Spindle Checkpoint Protein BubR1 is Associated with High Cell Proliferation in Primary Gastrointestinal Diffuse Large B Cell Lymphoma. Cell biochemistry and biophysics, 66, 747-52.
Cimini, D., Howell, B., Maddox, P., Khodjakov, A., Degrassi, F. & Salmon, E.D. (2001) Merotelic kinetochore orientation is a major mechanism of aneuploidy in mitotic mammalian tissue cells. The Journal of cell biology, 153, 517-27.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
70
Conway, K. & Russell, G. (2000) Couples' grief and experience of support in the aftermath of miscarriage. The British journal of medical psychology, 73 Pt 4, 531-45.
Crider, K.S., Olney, R.S. & Cragan, J.D. (2008) Trisomies 13 and 18: population prevalences, characteristics, and prenatal diagnosis, metropolitan Atlanta, 1994-2003. American journal of medical genetics. Part A, 146, 820-6.
Daphnis, D.D., Delhanty, J.D., Jerkovic, S., Geyer, J., Craft, I. & Harper, J.C. (2005) Detailed FISH analysis of day 5 human embryos reveals the mechanisms leading to mosaic aneuploidy. Human reproduction, 20, 129-37.
Diego-Alvarez, D., Garcia-Hoyos, M., Trujillo, M.J., Gonzalez-Gonzalez, C., Rodriguez De Alba, M., Ayuso, C., Ramos-Corrales, C. & Lorda-Sanchez, I. (2005) Application of quantitative fluorescent PCR with short tandem repeat markers to the study of aneuploidies in spontaneous miscarriages. Human reproduction, 20, 1235-43.
Doria, S., Carvalho, F., Ramalho, C., Lima, V., Francisco, T., Machado, A.P., Brandao, O., Sousa, M., Matias, A. & Barros, A. (2009) An efficient protocol for the detection of chromosomal abnormalities in spontaneous miscarriages or foetal deaths. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology, 147, 144-50.
Doria, S., Sousa, M., Fernandes, S., Ramalho, C., Brandao, O., Matias, A., Barros, A. & Carvalho, F. (2010) Gene expression pattern of IGF2, PHLDA2, PEG10 and CDKN1C imprinted genes in spontaneous miscarriages or fetal deaths. Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society, 5, 444-50.
Down, J.L.H. (1866) Observations on an ethnic classifications of idiots. London Hospital Reports, 3, 259-262.
Edwards, J.H., Harnden, D.G., Cameron, A.H., Crosse, V.M. & Wolff, O.H. (1960) A new trisomic syndrome. Lancet, 1, 787-90.
Elowe, S. (2011) Bub1 and BubR1: at the interface between chromosome attachment and the spindle checkpoint. Molecular and cellular biology, 31, 3085-93.
Fragouli, E., Alfarawati, S., Spath, K., Jaroudi, S., Sarasa, J., Enciso, M. & Wells, D. (2013) The origin and impact of embryonic aneuploidy. Human genetics, 132, 1001-13.
Gabriel, A.S., Thornhill, A.R., Ottolini, C.S., Gordon, A., Brown, A.P., Taylor, J., Bennett, K., Handyside, A. & Griffin, D.K. (2011) Array comparative genomic hybridisation on first polar bodies suggests that non-disjunction is not the predominant mechanism leading to aneuploidy in humans. Journal of medical genetics, 48, 433-7.
Galdzicki, Z., Siarey, R., Pearce, R., Stoll, J. & Rapoport, S.I. (2001) On the cause of mental retardation in Down syndrome: extrapolation from full and segmental trisomy 16 mouse models. Brain research. Brain research reviews, 35, 115-45.
Ganmore, I., Smooha, G. & Izraeli, S. (2009) Constitutional aneuploidy and cancer predisposition. Human molecular genetics, 18, R84-93.
Garcia-Cruz, R., Casanovas, A., Brieno-Enriquez, M., Robles, P., Roig, I., Pujol, A., Cabero, L., Durban, M. & Garcia Caldes, M. (2010) Cytogenetic analyses of human oocytes provide new data on non-disjunction mechanisms and the origin of trisomy 16. Human reproduction, 25, 179-91.
Glasson, E.J., Sullivan, S.G., Hussain, R., Petterson, B.A., Montgomery, P.D. & Bittles, A.H. (2002) The changing survival profile of people with Down's syndrome: implications for genetic counselling. Clinical genetics, 62, 390-3.
Gold, K.J., Sen, A. & Hayward, R.A. (2010) Marriage and cohabitation outcomes after pregnancy loss. Pediatrics, 125, e1202-7.
Grabsch, H., Takeno, S., Parsons, W.J., Pomjanski, N., Boecking, A., Gabbert, H.E. & Mueller, W. (2003) Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1, BUBR1, and BUB3 in gastric cancer--association with tumour cell proliferation. The Journal of pathology, 200, 16-22.
Guo, C., Wu, G., Chin, J.L., Bauman, G., Moussa, M., Wang, F., Greenberg, N.M., Taylor, S.S. & Xuan, J.W. (2006) Bub1 up-regulation and hyperphosphorylation promote malignant
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
71
transformation in SV40 tag-induced transgenic mouse models. Molecular cancer research : MCR, 4, 957-69.
Hall, H.E., Surti, U., Hoffner, L., Shirley, S., Feingold, E. & Hassold, T. (2007) The origin of trisomy 22: evidence for acrocentric chromosome-specific patterns of nondisjunction. American journal of medical genetics. Part A, 143A, 2249-55.
Handyside, A.H. (2012) Molecular origin of female meiotic aneuploidies. Biochimica et biophysica acta, 1822, 1913-20.
Hanks, S., Coleman, K., Reid, S., Plaja, A., Firth, H., Fitzpatrick, D., Kidd, A., Mehes, K., Nash, R., Robin, N., Shannon, N., Tolmie, J., Swansbury, J., Irrthum, A., Douglas, J. & Rahman, N. (2004) Constitutional aneuploidy and cancer predisposition caused by biallelic mutations in BUB1B. Nature genetics, 36, 1159-61.
Harper, J.C., Coonen, E., Handyside, A.H., Winston, R.M., Hopman, A.H. & Delhanty, J.D. (1995) Mosaicism of autosomes and sex chromosomes in morphologically normal, monospermic preimplantation human embryos. Prenatal diagnosis, 15, 41-9.
Harris, L., Davenport, J., Neale, G. & Goorha, R. (2005) The mitotic checkpoint gene BubR1 has two distinct functions in mitosis. Experimental cell research, 308, 85-100.
Hassold, T., Chen, N., Funkhouser, J., Jooss, T., Manuel, B., Matsuura, J., Matsuyama, A., Wilson, C., Yamane, J.A. & Jacobs, P.A. (1980) A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions. Annals of human genetics, 44, 151-78.
Hassold, T., Hall, H. & Hunt, P. (2007) The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human molecular genetics, 16 Spec No. 2, R203-8.
Hassold, T. & Hunt, P. (2001) To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature reviews. Genetics, 2, 280-91.
Hassold, T. & Sherman, S. (2000) Down syndrome: genetic recombination and the origin of the extra chromosome 21. Clinical genetics, 57, 95-100.
Hassold, T.J. & Jacobs, P.A. (1984) Trisomy in man. Annual review of genetics, 18, 69-97. Hassold, T.J., Pettay, D., Freeman, S.B., Grantham, M. & Takaesu, N. (1991) Molecular studies
of non-disjunction in trisomy 16. Journal of medical genetics, 28, 159-62. Hawley, R.S. (2011) Oogenesis: when most is good enough. Current biology : CB, 21, R288-90. Heinrich, T., Nanda, I., Rehn, M., Zollner, U., Frieauff, E., Wirbelauer, J., Grimm, T. & Schmid,
M. (2013) Live-born trisomy 22: patient report and review. Molecular syndromology, 3, 262-9.
Hulten, M.A., Dhanjal, S. & Pertl, B. (2003) Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction, 126, 279-97.
Hunt, P.H., T.J. (2008) Human female meiosis: what makes a good egg go bad? Trends in genetics : TIG, 24, 86-93.
Illingworth, C., Pirmadjid, N., Serhal, P., Howe, K. & Fitzharris, G. (2010) MCAK regulates chromosome alignment but is not necessary for preventing aneuploidy in mouse oocyte meiosis I. Development, 137, 2133-8.
Ishikawa, K., Kamohara, Y., Tanaka, F., Haraguchi, N., Mimori, K., Inoue, H. & Mori, M. (2008) Mitotic centromere-associated kinesin is a novel marker for prognosis and lymph node metastasis in colorectal cancer. British journal of cancer, 98, 1824-9.
Jackson-Cook, C. (2011) Constitutional and acquired autosomal aneuploidy. Clinics in laboratory medicine, 31, 481-511, vii.
Jacobs, P.A., Baikie, A.G., Court Brown, W.M. & Strong, J.A. (1959) The somatic chromosomes in mongolism. Lancet, 1, 710.
Jacobs, P.A., Browne, C., Gregson, N., Joyce, C. & White, H. (1992) Estimates of the frequency of chromosome abnormalities detectable in unselected newborns using moderate levels of banding. Journal of medical genetics, 29, 103-8.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
72
Jeganathan, K., Malureanu, L., Baker, D.J., Abraham, S.C. & Van Deursen, J.M. (2007) Bub1 mediates cell death in response to chromosome missegregation and acts to suppress spontaneous tumorigenesis. The Journal of cell biology, 179, 255-67.
Kelly, M., Robinson, B.W. & Moore, J.W. (2002) Trisomy 18 in a 20-year-old woman. American journal of medical genetics, 112, 397-9.
Kim, I.G., Jun, D.Y., Sohn, U. & Kim, Y.H. (1997) Cloning and expression of human mitotic centromere-associated kinesin gene. Biochimica et biophysica acta, 1359, 181-6.
King, R.W. (2008) When 2+2=5: the origins and fates of aneuploid and tetraploid cells. Biochimica et biophysica acta, 1786, 4-14.
Lejeune J, G.M., Turpin R. (1959) Etudes des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. Comptes Rendues Hebdomadaires des Seances de L’Academie des Sciences., 248, 602-603.
Leland, S., Nagarajan, P., Polyzos, A., Thomas, S., Samaan, G., Donnell, R., Marchetti, F. & Venkatachalam, S. (2009) Heterozygosity for a Bub1 mutation causes female-specific germ cell aneuploidy in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106, 12776-81.
Maciejczyk, A., Szelachowska, J., Czapiga, B., Matkowski, R., Halon, A., Gyorffy, B. & Surowiak, P. (2013) Elevated BUBR1 expression is associated with poor survival in early breast cancer patients: 15-year follow-up analysis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society, 61, 330-9.
Mann, K. & Ogilvie, C.M. (2012) QF-PCR: application, overview and review of the literature. Prenatal diagnosis, 32, 309-14.
Mantikou, E., Wong, K.M., Repping, S. & Mastenbroek, S. (2012) Molecular origin of mitotic aneuploidies in preimplantation embryos. Biochimica et biophysica acta, 1822, 1921-30.
Marchetti, F. & Venkatachalam, S. (2010) The multiple roles of Bub1 in chromosome segregation during mitosis and meiosis. Cell cycle, 9, 58-63.
Martin, R.H. (2008) Meiotic errors in human oogenesis and spermatogenesis. Reproductive biomedicine online, 16, 523-31.
Mcfadden, D.E. & Robinson, W.P. (2006) Phenotype of triploid embryos. Journal of medical genetics, 43, 609-12.
Murakumo, Y. (2002) The property of DNA polymerase zeta: REV7 is a putative protein involved in translesion DNA synthesis and cell cycle control. Mutation research, 510, 37-44.
Nagaoka S., H.T.a.H.P. (2012) Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Review Genetics, 13.
Nagaoka, S.I., Hodges, C.A., Albertini, D.F. & Hunt, P.A. (2011) Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current biology : CB, 21, 651-7.
Nakamura, Y., Tanaka, F., Haraguchi, N., Mimori, K., Matsumoto, T., Inoue, H., Yanaga, K. & Mori, M. (2007) Clinicopathological and biological significance of mitotic centromere-associated kinesin overexpression in human gastric cancer. British journal of cancer, 97, 543-9.
Nicolaidis, P. & Petersen, M.B. (1998) Origin and mechanisms of non-disjunction in human autosomal trisomies. Human reproduction, 13, 313-9.
Niedrist, D., Riegel, M., Achermann, J. & Schinzel, A. (2006) Survival with trisomy 18--data from Switzerland. American journal of medical genetics. Part A, 140, 952-9.
O'connor, C. (2008) Trisomy 21 causes Down syndrome. Nature Education, 1. Pan, H., Ma, P., Zhu, W. & Schultz, R.M. (2008) Age-associated increase in aneuploidy and
changes in gene expression in mouse eggs. Developmental biology, 316, 397-407. Pariente, N. (2012) A balancing act: focus on aneuploidy. EMBO reports, 13, 472.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
73
Patau, K., Smith, D.W., Therman, E., Inhorn, S.L. & Wagner, H.P. (1960) Multiple congenital anomaly caused by an extra autosome. Lancet, 1, 790-3.
Pinto, M., Vieira, J., Ribeiro, F.R., Soares, M.J., Henrique, R., Oliveira, J., Jeronimo, C. & Teixeira, M.R. (2008) Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1 and BUBR1 is associated with genomic complexity in clear cell kidney carcinomas. Cellular oncology : the official journal of the International Society for Cellular Oncology, 30, 389-95.
Potapova, T.A., Zhu, J. & Li, R. (2013) Aneuploidy and chromosomal instability: a vicious cycle driving cellular evolution and cancer genome chaos. Cancer metastasis reviews.
Rasmussen, S.A., Wong, L.Y., Yang, Q., May, K.M. & Friedman, J.M. (2003) Population-based analyses of mortality in trisomy 13 and trisomy 18. Pediatrics, 111, 777-84.
Ricke, R.M., Jeganathan, K.B. & Van Deursen, J.M. (2011) Bub1 overexpression induces aneuploidy and tumor formation through Aurora B kinase hyperactivation. The Journal of cell biology, 193, 1049-64.
Ricke, R.M. & Van Deursen, J.M. (2011) Aurora B hyperactivation by Bub1 overexpression promotes chromosome missegregation. Cell cycle, 10, 3645-51.
Robinson, W.P., Langlois, S., Schuffenhauer, S., Horsthemke, B., Michaelis, R.C., Christian, S., Ledbetter, D.H. & Schinzel, A. (1996) Cytogenetic and age-dependent risk factors associated with uniparental disomy 15. Prenatal diagnosis, 16, 837-44.
Roizen, N.J. & Patterson, D. (2003) Down's syndrome. Lancet, 361, 1281-9. Salmon, E.D., Cimini, D., Cameron, L.A. & Deluca, J.G. (2005) Merotelic kinetochores in
mammalian tissue cells. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences, 360, 553-68.
Sanhaji, M., Friel, C.T., Wordeman, L., Louwen, F. & Yuan, J. (2011) Mitotic centromere-associated kinesin (MCAK): a potential cancer drug target. Oncotarget, 2, 935-47.
Savva, G.M., Walker, K. & Morris, J.K. (2010) The maternal age-specific live birth prevalence of trisomies 13 and 18 compared to trisomy 21 (Down syndrome). Prenatal diagnosis, 30, 57-64.
Shanske, A.L. (2006) Trisomy 18 in a second 20-year-old woman. American journal of medical genetics. Part A, 140, 966-7.
Sheltzer, J.M. & Amon, A. (2011) The aneuploidy paradox: costs and benefits of an incorrect karyotype. Trends in genetics : TIG, 27, 446-53.
Sherard, J., Bean, C., Bove, B., Delduca, V., Jr., Esterly, K.L., Karcsh, H.J., Munshi, G., Reamer, J.F., Suazo, G., Wilmoth, D. & Et Al. (1986) Long survival in a 69,XXY triploid male. American journal of medical genetics, 25, 307-12.
Shimo, A., Tanikawa, C., Nishidate, T., Lin, M.L., Matsuda, K., Park, J.H., Ueki, T., Ohta, T., Hirata, K., Fukuda, M., Nakamura, Y. & Katagiri, T. (2008) Involvement of kinesin family member 2C/mitotic centromere-associated kinesin overexpression in mammary carcinogenesis. Cancer science, 99, 62-70.
Siegel, J.J. & Amon, A. (2012) New insights into the troubles of aneuploidy. Annual review of cell and developmental biology, 28, 189-214.
Smith, D.W., Patau, K., Therman, E. & Inhorn, S.L. (1960) A new autosomal trisomy syndrome: multiple congenital anomalies caused by an extra chromosome. The Journal of pediatrics, 57, 338-45.
Suijkerbuijk, S.J., Van Osch, M.H., Bos, F.L., Hanks, S., Rahman, N. & Kops, G.J. (2010) Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer research, 70, 4891-900.
The Genecards Human Gene Database). Thompson, S.L., Bakhoum, S.F. & Compton, D.A. (2010) Mechanisms of chromosomal
instability. Current biology : CB, 20, R285-95. Thompson, S.L. & Compton, D.A. (2008) Examining the link between chromosomal instability
and aneuploidy in human cells. The Journal of cell biology, 180, 665-72.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
74
Tinkle, B.T., Walker, M.E., Blough-Pfau, R.I., Saal, H.M. & Hopkin, R.J. (2003) Unexpected survival in a case of prenatally diagnosed non-mosaic trisomy 22: Clinical report and review of the natural history. American journal of medical genetics. Part A, 118A, 90-5.
Torres, E.M., Williams, B.R. & Amon, A. (2008) Aneuploidy: cells losing their balance. Genetics, 179, 737-46.
Uroz, L. & Templado, C. (2012) Meiotic non-disjunction mechanisms in human fertile males. 2012, 27.
Van Echten-Arends, J., Mastenbroek, S., Sikkema-Raddatz, B., Korevaar, J.C., Heineman, M.J., Van Der Veen, F. & Repping, S. (2011) Chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos: a systematic review. Human reproduction update, 17, 620-7.
Vitre, B.D. & Cleveland, D.W. (2012) Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current opinion in cell biology, 24, 809-15.
Vogt, E., Sanhaji, M., Klein, W., Seidel, T., Wordeman, L. & Eichenlaub-Ritter, U. (2010) MCAK is present at centromeres, midspindle and chiasmata and involved in silencing of the spindle assembly checkpoint in mammalian oocytes. Molecular human reproduction, 16, 665-84.
Wada, N., Yoshida, A., Miyagi, Y., Yamamoto, T., Nakayama, H., Suganuma, N., Matsuzu, K., Masudo, K., Hirakawa, S., Rino, Y., Masuda, M. & Imada, T. (2008) Overexpression of the mitotic spindle assembly checkpoint genes hBUB1, hBUBR1 and hMAD2 in thyroid carcinomas with aggressive nature. Anticancer research, 28, 139-44.
Warren, C.D., Brady, D.M., Johnston, R.C., Hanna, J.S., Hardwick, K.G. & Spencer, F.A. (2002) Distinct chromosome segregation roles for spindle checkpoint proteins. Molecular biology of the cell, 13, 3029-41.
Wick, J.B., Johnson, K.J., O'brien, J. & Wick, M.J. (2013) Second-trimester diagnosis of triploidy: a series of four cases. AJP reports, 3, 37-40.
Williams, G.L., Roberts, T.M. & Gjoerup, O.V. (2007) Bub1: escapades in a cellular world. Cell cycle, 6, 1699-704.
Willis, A.S., Van Den Veyver, I. & Eng, C.M. (2012) Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and prenatal diagnosis. Prenatal diagnosis, 32, 315-20.
Wolstenholme, J. (1995) An audit of trisomy 16 in man. Prenatal diagnosis, 15, 109-21. Yamamoto, Y., Matsuyama, H., Chochi, Y., Okuda, M., Kawauchi, S., Inoue, R., Furuya, T., Oga,
A., Naito, K. & Sasaki, K. (2007) Overexpression of BUBR1 is associated with chromosomal instability in bladder cancer. Cancer genetics and cytogenetics, 174, 42-7.
Yu, H. & Tang, Z. (2005) Bub1 multitasking in mitosis. Cell cycle, 4, 262-5. Yuan, B., Xu, Y., Woo, J.H., Wang, Y., Bae, Y.K., Yoon, D.S., Wersto, R.P., Tully, E., Wilsbach, K. &
Gabrielson, E. (2006) Increased expression of mitotic checkpoint genes in breast cancer cells with chromosomal instability. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 12, 405-10.
Yuen, K.W. & Desai, A. (2008) The wages of CIN. The Journal of cell biology, 180, 661-3. Zaragoza, M.V., Jacobs, P.A., James, R.S., Rogan, P., Sherman, S. & Hassold, T. (1994)
Nondisjunction of human acrocentric chromosomes: studies of 432 trisomic fetuses and liveborns. Human genetics, 94, 411-7.
Zaragoza, M.V., Surti, U., Redline, R.W., Millie, E., Chakravarti, A. & Hassold, T.J. (2000) Parental origin and phenotype of triploidy in spontaneous abortions: predominance of diandry and association with the partial hydatidiform mole. American journal of human genetics, 66, 1807-20.
Zasadil, L.M., Britigan, E.M. & Weaver, B.A. (2013) 2n or not 2n: Aneuploidy, polyploidy and chromosomal instability in primary and tumor cells. Seminars in cell & developmental biology, 24, 370-9.
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
75
Zhou, J., Yao, J. & Joshi, H.C. (2002) Attachment and tension in the spindle assembly checkpoint. Journal of cell science, 115, 3547-55.
Anexos
FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C
79
Anexo I
Extração de RNA – Método Clássico do Trizol
1. Em gelo, distribuir 1 mL de solução de extracção de RNA (TriPure®, Roche
Diagnostics, Indianapolis, EUA ) pelos tubos com esferas.
2. Selecionar um pequeno fragmento de tecido e triturá-lo em placa de Petri, com
o auxílio de lâminas de bisturi.
3. Colocar no Minilys (Bertin Technologies, França) durante 10 segundos à
velocidade máxima (se o tecido não ficar devidamente homogeneizado, repetir
este passo).
4. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
5. Transferir para um eppendorf livre de nucleases com o auxílio da P1000.
6. Adicionar 200 µL de clorofórmio.
7. Agitar bem (Vórtex – 15’’).
8. Incubar 3 min à temperatura ambiente.
9. Centrifugar 15 min., 4ºC, 10600rpm.
10. Transferir o sobrenadante (fase superior) obtido em 9 para um eppendorf livre
de nucleases.
11. Adicionar lentamente 500µL de isopropanol e homogeneizar, invertendo várias
vezes o eppendorf.
12. Incubar 10 min à temperatura ambiente para o RNA precipitar.
13. Centrifugar 10 min, 4ºC, 10600rpm.
14. Descartar cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar a pellet.
15. Adicionar 1mL de etanol a 75% e lavar a pellet utilizando o vórtex (a pellet deve
destacar da parede do eppendorf).
16. Centrifugar durante 5 min., 4ºC, 8400rpm.
17. Descartar cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar a pellet.
18. Secar a pellet ao ar, à temp. ambiente.
19. Ressuspender a pellet em 30-200µL de RNA Storage Solution ou H2O estéril
livre de nucleases.
Deixar em gelo durante 30 min e guardar a -80ºC.