Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em...

Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos

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Instituto Superior Técnico / Campus Tecnológico e Nuclear

Ciência Viva no Laboratório - Ocupação Científica de Jovens nas Férias

Formadora: Mestre Telma Silva

Ana Raquel Saramago

Ana Teresa Ferreira

Sara Isabel Gomes

Agosto de 2013


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Índice

I. Objetivos .................................................................................................. 3

II. Introdução teórica ..................................................................................... 4

III. Desenvolvimento Experimental ................................................................ 6

DIA 1 – 22 de julho de 2013 ............................................................................ 6

»Preparação de soro fisiológico a 0,9% e soro fisiológico com Tween ....... 6

»Preparação do meio de cultura .................................................................. 6

DIA 2 – 23 de julho de 2013 ............................................................................ 8

»Validação do técnico de microbiologia ....................................................... 8

DIA 3 – 24 de julho de 2013 ............................................................................ 9

»Preparação das amostras para irradiação ................................................. 9

»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes ... 11

DIA 4 – 25 de julho de 2013 .......................................................................... 13

»Leitura dos dosímetros ............................................................................ 13

»Teste sensorial ........................................................................................ 13

DIA 5 – 26 de julho de 2013 .......................................................................... 13

»Preparação de soro fisiológico a 0,9% com Tween ................................. 13

DIA 6 – 29 de julho de 2013 .......................................................................... 14

»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes ... 14

»Preparação do álcool utilizado para desinfetar mãos e material .............. 14

DIA 7 – 30 de julho de 2013 .......................................................................... 14

»Caracterização de microrganismos a nível macroscópico ....................... 14

DIA 8 – 31 de julho de 2013 .......................................................................... 15

»Isolamento dos microrganismos para caracterização a nível microscópico

................................................................................................................... 15

DIA 9 – 01 de agosto de 2013 ...................................................................... 16

»Caracterização dos microrganismos a nível microscópico ...................... 16

IV. Resultados Experimentais e Respetiva Análise ..................................... 19

V. Conclusão .............................................................................................. 23

VI. Bibliografia .............................................................................................. 24


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I. Objetivos

Este estágio tem como objetivos dar a conhecer o modo de trabalho em condi-

ções de assepsia, avaliar a inativação da flora microbiana presente em moran-

gos frescos, após o seu tratamento a doses sub-letais de radiação gama (fonte

de cobalto-60) bem como o aumento do seu tempo de prateleira e estudar tra-

tamentos alternativos à lavagem (simples ou com desinfetantes) que garantam

a segurança e qualidade dos alimentos antes da sua comercialização, pois este

método apresenta pouca eficácia na eliminação de microrganismos de deterio-

ração e patogénicos, responsáveis por surtos de toxinfeções bacterianas e/ou

virais.

Figura 1 – Embalagem com morangos utilizados neste trabalho experimental


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II. Introdução teórica

Foi estudado o efeito da radiação gama na inativação dos microrganismos pre-

sentes nos morangos frescos.

Os morangos são uma fonte de vitaminas, minerais e antioxidantes naturais

necessários ao bom funcionamento do organismo humano, mas devido à ele-

vada atividade microbiana e respiratória o seu tempo de prateleira é reduzido.

O tratamento com radiação gama é considerado um meio de aumentar a vida-

de prateleira dos mais variados alimentos, pois a excitação e ionização das

moléculas gera radicais livres, que provocam reações químicas que afetam as

funções estruturais e metabólicas das células, podendo retardar o abrolhamen-

to e amadurecimento, inativar microrganismos e destruir parasitas e pragas,

reduzindo o número de microrganismos de deterioração e patogénicos neles

presentes.

A radiação é a propagação da energia proveniente de uma fonte natural ou arti-

ficial através de ondas eletromagnéticas (campos elétricos e magnéticos osci-

lantes, perpendiculares entre si e à direção de propagação) e que têm a capa-

cidade de penetrar em diversos materiais e em diferentes escalas. Embora a

maioria dos elementos que ocorrem naturalmente sejam isótopos estáveis (ou

seja, não se decompõem espontaneamente num nuclídeo), há também alguns

núcleos que são radioativos, o que quer dizer que emitem espontaneamente

pequenas partículas e radiação eletromagnética de energia elevada, originando

núcleos mais estáveis, fenómeno ao qual chamamos radioatividade.

Os três tipos de emissão mais conhecidos são as partículas alfa (núcleos de

hélio), as partículas beta (eletrões de elevada energia) e os raios gama (forma

de radiação eletromagnética de elevada energia e frequência, baixo compri-

mento de onda e grande poder de penetração).

A radiação classifica-se em ionizante e não ionizante. A radiação ionizante é

aquela que tem a capacidade de ionizar a matéria que atinge, sendo a não io-

nizante aquela que não possui essa capacidade. A radiação ionizante, provém

de átomos instáveis que para atingirem a estabilidade libertam a energia em

excesso sob a forma de radiação. Existem 3 fontes de radiação ionizante, os

raios X, os feixes de eletrões e as fontes radioativas (cobalto-60 ou césio-37).

Em vários países utiliza-se a irradiação de alimentos como meio de inativar os

microrganismos neles presentes, uma vez que o objetivo é semelhante ao tra-

tamento por temperatura, como a pasteurização. Esta técnica consiste na ex-

posição do alimento a uma determinada dose de radiação, tornando-o mais

seguro para consumo e até mesmo para a saúde pública. O seu valor nutricio-

nal é muito pouco afetado não sofrendo alterações significativas. Geralmente

para este processo são utilizadas fontes radioativas de cobalto-60, pois como

não são radioativas não ativam a amostra em estudo, pelo que os alimentos


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não ficam radioativos e não produzem nenhum efeito adverso para o ser hu-

mano. A avaliação dos aspetos toxicológicos e genéticos não demonstrou ne-

nhuma evidência direta de atividade cancerígena ou toxicidade a nível genéti-

co.

A interação da radiação com o alimento tem como objetivo inativar a população

microbiana presente, através da interrupção da divisão celular. Deste modo

aquando da absorção da radiação, os microrganismos sofrem danos biológicos

que podem ser devidos a dois tipos de efeitos, diretos ou indiretos. Estes efei-

tos distinguem-se pelo local onde é depositada a radiação. Os efeitos diretos

são caracterizados pela interação direta da radiação com a estrutura do ADN

(ácido desoxirribonucleico) da célula, enquanto os efeitos indiretos estão rela-

cionados com a formação de radicais livres resultantes da radiólise da água.

Esses radicais, quando entram em contacto com as estruturas biológicas cau-

sam danos irreversíveis pois são altamente radioativos.

Dependendo das suas estruturas químicas e físicas, da radiossensibilidade das

células e da sua capacidade de reparar os danos causados, os microrganismos

apresentam diferentes níveis de resistência à radiação. Pode descrever-se este

fator pelo valor que corresponde à dose necessária a aplicar num produto para

inativar cerca de 90% da população microbiana aí presente, sendo por isso a

dose de radiação aplicada variável consoante o tipo de alimento e o resultado

final que se pretende atingir.

Há vários processos de tratamento de alimentos através de radiação e conso-

ante a dose aplicada e o objetivo final estes são denominados radurização

(quando o objetivo é a desinfestação de insetos, a inativação de parasitas e o

retardamento da maturação, sendo a dose aplicada inferior a 1 kGy), radiciação

(quando o objetivo é a redução do número de microrganismos responsáveis

pela deterioração dos alimentos e a inativação dos microrganismos potencial-

mente patogénicos, sendo a dose aplicada de 1 a 10 kGy) e radapertização,

(quando o objetivo é a redução do número total de microrganismos para garan-

tir a esterilização, sendo a dose aplicada superior a 10 kGy).

A irradiação de alimentos é um processo que já é aplicado a nível comercial em

mais de 60 países devido às suas inúmeras vantagens, de entre as quais sali-

entamos que os alimentos podem ser irradiados já na sua embalagem final,

pelo que o risco de recontaminação é baixo; este processo permite ainda au-

mentar a validade ou tempo de vida útil de certos alimentos bem como torná-

los mais seguros sem induzir radioatividade no alimento; o valor nutricional, tal

como anteriormente se referiu, não sofre alterações significativas; verifica-se

um decréscimo no desperdício de alimentos; o elevado poder de penetração da

radiação permite irradiar vários tamanhos e formas bem como alcançar não só

os organismos na superfície mas em toda a amostra, garantindo total eficácia

do processo; é um tratamento seguro, limpo, eficiente e de baixo custo que

preserva o alimento não produzindo nenhum efeito adverso para o ser humano.


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III. Desenvolvimento Experimental

DIA 1 – 22 de julho de 2013

»Preparação de soro fisiológico a 0,9% e soro fisiológico (0,9%) com Tween 80

(0,1%)

Materiais e Reagentes: Equipamento:

Espátula

Gobelé

Proveta 2000mL

3 Frascos

Pipeta graduada de escoamen-

to total de 1mL

Cloreto de sódio

Água Milli-Q

Tween 80

Agitador magnético

Balança digital

Placa de aquecimento com agi-

tação

Pipetador automático

Procedimento Experimental:

1. Pesou-se 9g de cloreto de sódio num gobelé, com a balança digital, previ-

amente tarada.

2. Dissolveu-se os 9g de cloreto de sódio em 1000mL de água Milli-Q.

3. Transferiu-se a solução preparada para um frasco.

4. Repetiu-se o processo anterior (pontos 1 a 3) duas vezes.

5. Em dois dos frascos adicionou-se 1mL de Tween 80 com recurso a uma

pipeta volumétrica de 1mL e um pipetador automático.

6. As soluções foram esterilizadas em autoclave 121 °C durante 15 minutos

»Preparação do meio de cultura


2 Erlenmeyer

Funil

Frascos de vidro

Placas de Petri (descartáveis)

Tryptic Soy Agar – TSA

Água Milli-Q esterilizada

Fita indicadora de calor húmido

Balança digital

Placa de aquecimento com agi-

tação

Autoclave

Bico de Bunsen

Câmara de fluxo laminar



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1. Verteu-se, com o auxílio de um funil, 1000mL de água Milli-Q, para cada

Erlenmeyer.

2. Os Erlenmeyer foram submetidos a um aumento progressivo de temperatu-

ra com homogeneização, numa placa de aquecimento com agitador.

3. Assim que a água começou a ferver, dissolveram-se 80 gramas de TSA,

em cada Erlenmeyer.

4. Adicionou-se de seguida outros 1000mL de água Milli-Q a cada Er-

lenmeyer, perfazendo um total de 2000mL.

5. Deixou-se a mistura em aquecimento e agitação constante até se tornar

translúcida.

6. Uma vez atingida uma solução homogénea, esta foi distribuída por vários

recipientes (respetivamente: cinco frascos de 400mL, quatro frascos de

200mL e um frasco de 900mL).

7. Os recipientes com TSA foram identificados e colocou-se também um pe-

daço de fita indicadora em cada um deles.

8. Fechou-se os frascos deixando as tampas ligeiramente soltas, para que as

pressões e temperaturas elevadas existentes no interior do Autoclave não

destruam as preparações.

9. Os frascos de TSA, de soro fisiológico e de soro fisiológico com Tween que

tinham sido preparados anteriormente foram levados a esterilizar no Au-

toclave no modo de “Exaustão Lenta” (121°C durante 15 minutos).

10. Depois de terminada a esterilização no Autoclave, fechou-se de imediato

as tampas para evitar possíveis contaminações.

11. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar com álcool a 70% por este

ter um período de evaporação mais lento e por isso ser mais eficaz na des-

contaminação microbiológica.

12. Dentro da câmara, abriu-se e distribuiu-se as placas (do canto esquerdo ao

fundo para o canto direito à frente de modo a não contaminar as placas)

para de seguida ser possível verter o conteúdo dos frascos de TSA para

cada uma delas.

13. Verteu-se sensivelmente 20mL para cada placa.

14. Antes do meio de cultura solidificar eliminaram-se todas as bolhas tocando-

lhes com a ponta de uma agulha esterilizada no Bico de Bunsen.

15. Assim que o meio de cultura solidificou, fecharam-se as placas ainda den-

tro da câmara de fluxo laminar.

16. Repetiu-se os pontos 12 a 15 até se consumir todo o volume de TSA, ob-

tendo-se assim 184 placas de meio de cultura.

17. Identificou-se o lote do meio (TSA 33/13) nas placas.


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»Validação do técnico de microbiologia


Placas de TSA

Kitasato

Pinças estéreis

Vedantes

Medalhões

Membranas estéreis (Ø poro 0,45 µm)

Funis de filtração

Pipetas de 1 e 25 mL

Pipetador

Água Milli-Q esterilizada

Água Milli-Q não esterilizada


Rampa de filtração

Bomba de vácuo

Bico de Bunsen


1. Marcou-se as placas de TSA (amostra, réplica, data, técnico).

2. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar.

3. Montou-se o sistema de filtração (como descrito na imagem 1).

4. Colocou-se o bico de Bunsen dentro da câmara de fluxo laminar.

5. Abriu-se as 3 placas de controlo do fluxo laminar (esquerda, centro e direi-

ta) dispostas ao fundo da câmara.

6. Esterilizou-se as pinças à chama.

7. Colocou-se o vedante com a pinça (como descrito na imagem 2).

8. Colocou-se o medalhão com a pinça (como descrito na imagem 2).

9. Colocou-se a membrana de filtração com a pinça (como descrito na ima-

gem 2).

10. Instalou-se o funil de filtração (como descrito na imagem 2).

11. Esterilizou-se o bocal do frasco de água estéril à chama.

12. Pipetou-se 50mL de água esterilizada sobre a membrana.

13. Abriu-se a válvula para iniciar a filtração.

14. Retirou-se o funil de filtração.

15. Colocou-se a membrana retirada no centro da placa de TSA com a pinça

(réplica 1).

16. Repetiu-se os passos de 7 a 15 mais 2 vezes (réplicas 2 e 3).

17. Fechou-se as placas de controlo do fluxo laminar.

18. Desmontou-se o sistema de filtração.

19. Limpou-se a câmara.

20. Desligou-se a câmara de fluxo laminar.

21. Incubou-se as placas de TSA a 30°C durante 3 dias.

22. Lavou-se e arrumou-se o material utilizado bem como o laboratório.


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Legenda:

A - Rampa de filtração, no interior da

câmara de fluxo laminar

B - Kitasato, reservatório de água, fora

da câmara de fluxo laminar

C - Bomba de vácuo, fora da câmara

de fluxo laminar

Legenda:

A - Vedante, peça plás-

tica

B - Medalhão, peça

metálica

C - Membrana estéril

(Ø poro 0,45 µm)

D - Funil de filtração,

peça metálica


»Preparação das amostras para irradiação


Morangos ≈1 kg

Pinças estéreis

Caixas de morangos

Balança digital

6 Dosímetros Amber Prespex

Fonte experimental de cobalto-60 (Precisa22)

Imagem 1: Esquema do sistema de filtração

Imagem 2: Pormenor da montagem da rampa de filtração


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1. Pesou-se a quantidade de morangos necessária por dose e guardou-se em

caixas separadas (como indicado na tabela 1).

2. Identificaram-se os dosímetros Amber Perspex por dose (dose, ci-

ma/baixo).

3. Colocaram-se dois dosímetros por caixa para monitorizar as doses absor-

vidas.

4. Irradiaram-se os morangos, uma dose de cada vez (primeiro a de 1,5kGy,

seguida pela de 3kGy e por fim a de 0,5kGy), na Precisa22, no nível 2, nas

posições A, B e C de 1 a 3 (figura 2), durante os períodos de tempo indica-

dos na tabela 2.

Figura 2 – Representação do suporte metálico com os respectivos níveis e posições de irradiação.

Dose (kGy) Tempo de irradiação (hh:mm)

0 00:00

0,5 00:30

1,5 01:20

3 02:40

0kGy - 300g 0,5kGy - 150g 1,5kGy - 150g 300kGy - 300g

Massa da caixa sem

tampa 23,98g 10,96g 10,83g 10,76g

Massa da caixa com

tampa 39,04g 22,23g 21,71g 22,52g

Massa de morangos

302,71g 150,97g 163,89g 309,42g

Tabela 1: Massa de morangos por dose de radiação

Tabela 2: Tempo de irradiação por dose de radiação


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»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes (t=0)


Morangos ≈1 kg

Soro fisiológico 0,9%

Soro fisiológico 0,9% com 0,1% de Tween 80

12 sacos de stomacher estereis

Pipetas volumétricas de 1, 10 e 25mL

Pipetador

84 placas de TSA

Pinças estéreis

9 Tubos de ensaio estéreis


Balança digital

Stomacher

Agitador (vórtex)

Bico de Bunsen


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Procedimento experimental:


2. Identificou-se os sacos de stomacher (dose, aluno, data).

3. Pesou-se na câmara de fluxo laminar cerca de 25 g de morangos para um

saco de stomacher estéril (1 saco por dose e por aluno).

4. Adicionou-se com auxílio de uma pipeta volumétrica 100mL de SF + TW80

a cada saco.

5. Fecharam-se os sacos.

6. Macerou-se manual e cuidadosamente os morangos.

7. Colocou-se os sacos no stomacher durante 15 minutos a homogeneizar.

8. Deixou-se repousar cerca de 1 minuto.

9. Abriu-se as placas de controlo da câmara (esquerda, centro e direita) e co-

locou-se no fundo da câmara.

10. Efectuou-se o controlo microbiológico das soluções utilizadas através do

espalhamento de 0,1mL de cada solução (SF e SF+TW) em 3 placas de

TSA. AS placas foram incubadas a 30ºC durante 7 dias.

11. Colocou-se 9mL de soro fisiológico em cada um dos tubos de ensaio, pas-

sando sempre o bocal à chama depois de abrir o tubo e antes de o fechar.

12. Efetuaram-se as diluições necessárias adicionando 1mL da solução inicial

(10-1) e 1mL da diluição anterior (10-2) aos tubos de ensaio.

13. Homogeneizou-se os tubos de ensaio no vórtex.

14. Inocularam-se vários volumes para cada dose em estudo.

a. 0kGy: identificaram-se os tubos (10-1 e 10-2). Posteriormente, usando

um pipetador automático e uma pipeta de 1mL inoculou-se um volume

de 0,1mL de cada solução, em três placas (3 réplicas por dose e por di-

luição) de TSA. De seguida fez-se o espalhamento.

b. 0,5kGy: Colocou-se 9mL de soro fisiológico num tubo e adicionou-se

1mL da solução do saco, identificado para esta dose, para fazer a dilui-

ção 10-1. Seguidamente inoculou-se um volume de 0,1mL da diluição

anterior em três placas de TSA. Pipetou-se diretamente um volume de

0,1mL da solução do saco para as outras três placas. De seguida fez-

se o espalhamento.

c. 1,5kGy: Inoculou-se volumes de 1mL e 0,1mL em cada uma das três

placas de TSA a partir da solução do saco identificado para esta dose.

De seguida fez-se o espalhamento e deixou-se secar as placas inocu-

ladas com 1mL dentro da câmara.

d. 3,0kGy: Repetiu-se o procedimento realizado para a dose de 1,5kGy.

15. Uma vez secas, as placas foram fechadas ainda no interior da câmara.

16. No final do trabalho fecharam-se as placas de controlo e foram incubadas a

30ºC durante 7 dias.

17. Limpou-se a câmara de fluxo laminar.

18. Incubaram-se as placas de TSA a 30ºC durante 7 dias.

19. Lavou-se e arrumou-se o material utilizado bem como o laboratório.


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»Leitura dos dosímetros


Tesoura

Pinça

Dosímetros

Espectrofotómetro

Micrómetro


1. Abriu-se a embalagem dos dosímetros com uma tesoura.

2. Retirou-se os dosímetros do interior das embalagens com uma pinça.

3. Leu-se a absorvância dos dosímetros no espectrofotómetro.

4. Mediu-se a espessura do dosímetro com um micrómetro.

5. Registou-se todos os valores obtidos por dosímetro e por dose.

6. Efetuou-se o cálculo da dose real absorvida.

»Análise sensorial

Uma vez irradiados os morangos, iniciou-se uma nova etapa – a análise senso-

rial – que tem como principal objetivo manifestar as diferenças no paladar, con-

sistência, rigidez e aroma entre os morangos irradiados e os morangos não

irradiados.

1. Para isso foi confecionado gelado de morango utilizando os das doses de

0kGy e 3kGy com recurso a azoto líquido (-160°C), um processo eficaz e

muito utilizado na indústria alimentar.


»Preparação de soro fisiológico a 0,9% com Tween

À semelhança do dia 1 (22-07-13) preparou-se mais soro fisiológico a 0,9%

com Tween80 (0,1%), mas desta vez um volume total de 1400mL.


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»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes (t=5)

À semelhança do dia 3 (24-07-13) refez-se todo processo de determinação da

contaminação inicial e do número de sobreviventes nos morangos, 5 dias após

a irradiação dos mesmos que foram armazenados em condições de refrigera-

ção, com o objectivo de avaliar se existiam diferenças ao nível da contamina-

ção microbiológica e assim inferir sobre o tempo de parteleira de morangos

irradiados.

»Preparação do álcool utilizado para desinfetar mãos e material

Materiais e Reagentes:

Proveta de 1000mL

Etanol

Água Milli-Q


1. Numa proveta mediram-se 700mL de etanol.

2. Nessa mesma proveta adicionou-se 300mL de água Milli-Q, perfazendo um

total de 1000mL de solução de etanol a 70%.


»Caracterização morfológica dos microrganismos isolados – observação ma-

croscópica

Identificou-se e fez-se a caracterização morfológica das colónias existentes a

nível macroscópico (pigmentação, textura, opacidade, forma, elevação e mar-

gem).


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»Isolamento dos microrganismos para caracterização morfológica – observa-

ção microscópica


Placas de TSA

Ansas de inoculação



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2. As colónias identificadas foram isoladas em TSA pela técnica do riscado:

a. Após ter retirado a massa de microrganismos a isolar, procedeu-

se ao riscado com a ansa de inoculação (nota: é necessário ter

atenção na força aplicada com a ansa de modo a não perfurar o

meio de cultura).

b. De seguida, mudou-se a direção da placa de modo a ser possível

espalhar os microrganismos por toda a placa, até ser possível

atingir uma colónia isolada.

3. Quando terminado este processo incubou-se as placas a 30°C durante 24

horas.

DIA 9 – 01 de agosto de 2013

»Caracterização morfológica - preparação a fresco, coloração Gram e ensaios

bioquímicos

Materiais e Reagentes:

Cristal Violeta Lugol Safranina

Descolorante (álcool + acetona)

Óleo de Imersão

Equipamento:


Microscópio

Bico de Bunsen

Placas de petri

Lâminas

Fita-cola

Papel de filtro

Ansas de inoculação

Lamelas

Pinça

Pipetas de Pasteur

Papel absorvente

Água

Reagente de oxidase

Reagente de catalase



2. Identificaram-se as lâminas segundo a codificação atribuída aos microrga-

nismos isolados da amostra inicial.

3. Começou-se por utilizar a técnica da fita-cola nos fungos, que consiste em,

levemente, colar um pedaço de fita-cola no fungo.Feita a recolha colou-se

o pedaço de fita-cola na lâmina, onde se colocou previamente uma gota de

água.


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4. Observaram-se as preparações ao microscópio com ampliação de 100x e

óleo de imersão, fotografando cada uma delas.

5. Seguidamente fizeram-se as preparações a fresco, os testes bioquímicos

(oxidase e catalase) e as preparações para a coloração de Gram.

a. Preparações a fresco: com o auxílio da ansa de inoculação remo-

veu-se uma pequena quantidade de colónia, depositou-se e espa-

lhou-se a amostra numa lâmina com uma gota de água, colocando-

se de seguida uma lamela. Por fim observaram-se e fotografaram-se

as preparações ao microscópio com ampliação de 100x e óleo de

imersão.

b. Oxidase: recortou-se uma folha de papel de filtro de modo a que

"encaixasse" no fundo de uma placa de petri. Humedeceu-se o filtro

com o reagente de oxidase (0,1g de N,N,N,N-tetrametil-1-4-diclorido

de fenil diamónio + 10mL H2O). Com recurso a uma ansa de inocu-

lação colocaram-se uma massa da colónia a caracterizar em cima

do papel esfregando-as. Esperou-se cerca de um minuto para ver o

resultado. Caso esteja presente a enzima citocromo oxidase então o

teste dará positivo assumindo a cor violeta escuro ou azul forte (oxi-

dase positiva).

c. Catalase: colocaram-se várias gotas de reagente de catalase (3 %

de H2O2 em H2O) na tampa de uma caixa de petri e com o auxílio de

uma ansa de inoculação colocaram-se uma massa das colónias em

cima de uma gota esfregando. Verificou-se a existência de bolhas de

gás como indicador de atividade catalásica por parte dos microrga-

nismos.

d. Coloração de Gram: preparou-se o esfregaço, deixou-se secar e fi-

xou-se, passando-se à chama três vezes. Coloriu-se, com muito cui-

dado para não tingir a área circundante, com Cristal Violeta. Aguar-

dou-se um minuto e de seguida lavaram-se as lâminas com água

corrente, apenas durante alguns segundos, tendo o cuidado de evi-

tar que a água atinja diretamente a massa de microrganismos. Re-

petiu-se o processo de coloração dos isolados desta vez com Lugol.

Lavaram-se as lâminas com um descolorante (solução de álcool a

96% e acetona) três vezes e de seguida com água corrente. Repe-

tiu-se o processo de coloração já efetuado com com Safranina. Por

fim, lavaram-se as lâminas em água corrente e secaram-se com pa-

pel absorvente. Observaram-se ao microscópio (ampliação 100x e

óleo de imersão), fotografando cada uma e registando o resultado da

coloração de Gram (positivo-azul/violeta, negativo-rosa).


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Esquema 1: Tipificação de microrganismos


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IV. Resultados Experimentais e Respetiva Análise

Para avaliar a inativação da população microbiana ao longo do tempo (t=0 dias

e t=5 dias após a irradiação) foram determinadas as unidades formadoras de

colónias por aproximadamente 25g de morangos para três subamostras de mo-

rangos frescos (antes da irradiação - contaminação inicial 0kGy e após irradia-

ção a três doses 0,5; 1,5 e 3kGy) através de contagens realizadas às 24h, 48h,

72h, 5º dia e 7º dia.

Aquando da irradiação foram colocados dois dosímetros por dose. Posterior-

mente efetuou-se a leitura dos dosímetros obtendo-se os seguintes resultados:

Após os sete dias de incubação a 30ºC cada aluno determinou através das

contagens efetuadas o valor de unidades formadoras de colónias por g de mo-

rango analisadas (ufc/g de morango) e com base nos resultados obtidos cons-

truíram-se duas curvas de sobrevivência (logaritmo de ufc/g de morango em

função da dose absorvida em kGy), uma para cada tempo após a irradiação em

estudo (t=0 e t=5)

Dose real (kGy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Confiança

Decréscimo relativo (%)

0 4,41 0,32 0,15 0

0,68 3,91 0,21 0,10 72

1,77 3,42 0,39 0,20 88

3,72 2,75 0,55 0,26 97

Amostra Tempo de irradiação

Nível Posição Absorvância Espessura

(mm)

Dose Absorvida

(kGy)

Dose média (kGy)

Débito dose

(kGy/h) 603 nm 651 nm

0,5 kGy

frente A

00h30

2

A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, C3

0,086 0,049 0,313

0,800

0,68

1,36

B 0,085 0,049 0,793

baixo A 0,101 0,06

0,379 0,782

B 0,094 0,055 0,742

1,5 kGy

frente A

01h20

0,304 0,182 0,316

2,327

1,77 B 0,291 0,175 2,232

baixo A 0,189 0,114

0,385 1,268

B 0,186 0,111 1,251

3 kGy

frente A

02h40

0,428 0,254 0,327

3,139

3,72 B 0,432 0,26 3,168

baixo A 0,556 0,336

0,306 4,379

B 0,534 0,323 4,200

Tabela 4: Dados recolhidos t=0 dias

Tabela 3: Resultados obtidos pela leitura dos dosímetros


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Após o tempo de incubação efectuou-se a caracterização morfológica dos mi-

crorganismos isolados para o t=0, bem como a determinação da frequência

relativa de cada tipo identificado. A representação gráfica apresentada no Grá-

fico 2 ilustra a frequência relativa dos tipos morfológicos por dose analisada.

Gráfico 1: Curva de sobrevivência t=0 dias

Gráfico 2: Frequência relativa de microrganismos consoante o tipo (esquema 1) e a

dose absorvida


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Como se pode observar no Gráfico 2, os grupos X (fungos filamentosos) e XI

(leveduras) apresentam maior frequência relativa como seria expectável, visto

que estão descritos como sendo os principais tipos de microrganismos em mo-

rangos frescos, além de que apresentam uma maior resistência aos efeitos ne-

fastos da radiação ionizante. Este facto é notório quando verificamos que a po-

pulação resitente a doses mais elevadas (3 kGy) de radiação gama é maiorita-

riamente constituída por fungos filamentosos e leveduras (tipo X – 67%, tipo XI

– 32,5%).

Dose real (kGy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Confiança

Decréscimo relativo (%)

0 4,93 0,19 0,09 0

0,68 4,65 0,46 0,21 25

1,77 3,66 0,65 0,37 87

3,72 3,37 0,45 0,23 96

Tabela 5: Dados recolhidos t=5 dias

Gráfico 3: Curva de sobrevivência t=5 dias


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Relativamente ao teste sensorial verificou-se que a diferença entre os moran-

gos irradiados e os não irradiados é notória, sendo que os irradiados são me-

nos rijos, com menor consistência, mais doces e com um aroma mais ativo.


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V. Conclusão

O aumento progressivo do número de indivíduos da população mundial gera

constantes desafios à sociedade. Segundo a ONU, estima-se que em 2050 a

população mundial atingirá os 9,6 biliões de pessoas. Surgem então necessi-

dades fundamentais, como a alimentação e cuidados de saúde para este nú-

mero de seres humanos.

Quanto menos contaminados os alimentos chegarem às prateleiras, menor se-

rá o número significativo de microrganismos neles presentes e assim maior

será o seu período de consumo em segurança, o que aumentará a quantidade

de alimento disponível.

Neste estudo foi explorada a técnica de inativação microbiana através de radi-

ação gama proveniente de uma fonte de Cobalto-60. Foi usada uma amostra

de aproximadamente 1kg de morangos, dos quais cerca de 600g foram irradia-

dos a diferentes doses.

Através dos resultados obtidos, concluiu-se que a taxa de sobrevivência de

microrganismos é menor quanto maior for a dose de radiação gama aplicada e

que o grande pico de crescimento dos microrganismos se dá às 72 horas.

Verificou-se, também, que nas doses de 1,5kGy e 3kGy existia um número su-

perior de fungos do que de bactérias. Este número chegava por vezes a ser

superior ao número de fungos presentes nas doses de 0kGy e 0,5kGy. Isto de-

ve-se ao facto de os fungos possuírem uma maior resistência a condições ad-

versas e a agentes letais como por exemplo os raios gama. A radiação ionizan-

te, consoante a dose e o tempo aplicado, inibe ou retarda a divisão celular nas

bactérias, mas nos fungos pode não surtir qualquer efeito na sua reprodução,

já que estes apresentam uma forma esporulada com elevada resistência a

condições inóspitas.

Tal como acima referido, comprovou-se com a análise sensorial que os moran-

gos irradiados passavam a apresentar menos rigidez, menor consistência, um

sabor mais doce e um aroma mais ativo, possivelmente devido ao facto de as

fibras, que garantem a consistência, textura e rigidez estarem associadas a

cadeias de polissacarídeos que são decompostos por ação da radiação dando

origem a polissacarídeos mais simples

Tendo em consideração todos estes aspetos pensamos ter atingido todos os

objetivos a que nos propusemos.


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VI. Bibliografia

http://www.cbesa.com.br/files/Revista_Controle_de_Contaminacao_162.pdf

(visitado em 28.07.2013)

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-

20611999000300018&nrm=iso&tlng=pt (visitado em 28.07.2013)

http://www.e-escola.pt/ftema.asp?tema=71&canal=5 (visitado em 30.07.2013)

AGRADECIMENTOS

Este trabalho é financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacio-

nal Factores de Competitividade – COMPETE e por Fundos Nacionais através

da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projeto RE-

CI/AAG-TEC/0400/2012

http://www.cbesa.com.br/files/Revista_Controle_de_Contaminacao_162.pdf

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20611999000300018&nrm=iso&tlng=pt

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20611999000300018&nrm=iso&tlng=pt

http://www.e-escola.pt/ftema.asp?tema=71&canal=5

Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em...

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