Estudo da Nefrotoxicidade de Venenos de Serpentes Botrópicas do Nordeste do Brasil
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ESTUDO DA NEFROTOXICIDADE DE VENENOS DE SERPENTES
BOTRÓPICAS DO NORDESTE DO BRASIL
Gdayllon Cavalcante Meneses
Universidade Federal do CearáDepartamento de Análises clínicas-
FFOELaboratório de Cultivo Celular
INTRODUÇÃO
O Brasil é um país com características climáticas e geográficas muito variadas, possuindo assim uma ampla diversidade biológica.
Pesquisas com toxinas de origem animal
apresentam-se como potencial fonte de futuros agentes terapêuticos e têm contribuído muito na compreensão de mecanismos fisiopatológicos de doenças (Mortari et al.2007).
SERPENTES DA FAUNA BRASILEIRA
Espécies Peçonhentas
Elapidae
Micrurus
Viperidae
Bothrops
Bothrops erythromela
s
Bothrops insularis
Crotalus Lachesis
COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES
VENENO
Componentes Protéicos
Propriedades enzimáticas
Não enzimáticas
Componentes Não
Protéicos
Orgânicos Não orgânicos
FOSFOLIPASES A2
CLASSIFICAÇÃO:
PLA2
Intracelulares ou citosólicas
Independentes de Ca+2
Extracelulares ou secretórias
Tipo I Tipo II
(Asp-49 PLA2s) (Lys-49 PLA2s) (Ser-49 PLA2s)
Tipo III
(Ownby, 1999; Lomonte, 2003).
ENVENENAMENTOS POR SERPENTES BOTRÓPICAS
As características importantes são sério dano muscular, hemorragia e coagulopatia;
A insuficiência renal, insuficiência respiratória e choque podem ocorrer nos casos mais graves (Bjarnason; Fox, 1994; Kamiguti et al., 1996; Gutiérrez, 2002; White, 2005);
A etiopatogenia da lesão renal tem sido atribuída à nefrotoxicidade direta da peçonha, miólise, hemólise, hipotensão, coagulação capilar glomerular, ação tóxica vascular e até mesmo reações de hipersensibilidade à toxina ou ao soro antiofídico (Pinho et al., 2000).
JUSTIFICATIVA
Os acidentes ofídicos representam um sério problema de saúde pública nos países tropicais, pela frequência com que ocorrem e pela morbimortalidade que ocasionam (Pinho et al., 2000);
O gênero Bothrops possui ampla distribuição e corresponde ao grupo de serpentes peçonhentas mais importantes em número de espécies e densidade populacional (Queiroz et al.,
2008);
A importância fisiológica do rim e a patogênese da IRA;
JUSTIFICATIVA
Quanto a linhagem de células MDCK e mesangiais;
A resposta a injúrias de células tubulares renais; Qual a importância do estudo do mecanismo
apoptótico?
OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos dos venenos das serpentes B. erythromelas, Bothrops insularis e suas frações fosfolipase A2 sobre linhagens de células renais, podendo contribuir para a descoberta de ferramentas farmacológicas e/ou elucidar os mecanismos de nefrotoxicidade.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudar o efeito dos venenos e frações das serpentes Bothrops erythromelas, Bothrops insularis e suas frações fosfolipase A2 em células mesangiais e tubulares renais;
Determinar o efeito dos venenos e frações sobre a viabilidade e proliferação das linhagens celulares em estudo;
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o potencial apoptótico do veneno e suas frações;
Investigar a expressão das proteínas pró-apoptóticas (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticas (BclxL) em células renais;
Investigar os possíveis mediadores
envolvidos no efeito renal.
METODOLOGIA
CULTIVO CELULAR (MDCK):
Meio de cultura RPMI 1640 + 10% de SBF;
100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina;
Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .
METODOLOGIA
CULTIVO CELULAR (Mesangiais):
Meio de cultura RPMI 1640 + 20% de SBF + 2% de glicose;
100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina;
Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .
METODOLOGIA
Armazenar em meio sem SBF por 24h para a obtenção de células na fase G0 do ciclo celular;
Retirar as células das garrafas utilizando tripsina-EDTA;
As células serão então quantificadas em câmara de Neubauer e subcultivadas (1-2x105céls/ml) permitindo o crescimento confluente por 24h.
METODOLOGIA
Ensaios de Viabilidade e Proliferação Celulares
MTT;
Lactato Desidrogenase;
MTT
Leitura em espectrofotômetro
LACTATO DESIDROGENASE
Avaliar a integridade de membrana no processo de morte celular;
Análise da liberação da enzima LDH, através da sua atividade enzimática.
AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR APOPTOSE
1) Detecção da Externalização de Fosfatidilserina;
2) Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial;
3) Isolamento de RNA total;
4) Reação de Transcriptase reversa;
5) Reação em cadeia de polimerase (PCR);
6) Eletroforese em gel de agarose.
DETECÇÃO DA EXTERNALIZAÇÃO DE FOSFATIDILSERINA
Novas descobertas do processo apoptótico estão surgindo com a descoberta de novos parâmetros, Um deles é a dosagem de fosfatidilserina (PS);
Mudanças na estrutura da membrana plasmática como forma de sinalização;
A Anexina V é uma proteína de ligação para fosfolipídeos que pertence a família das Anexinas. Na presença de íons de cálcio ela exibe alta afinidade para a ligação seletiva a fosfatidilserina.
DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO MITOCONDRIAL
Rodamina é um nome genérico para uma família de compostos orgânicos, corantes chamados fluoronas;
A rodamina-123 (Rh-123) é um fluorocromo específico para a marcação mitocondrial em células vivas;
Alterações ao nível da integridade mitocondrial podem ser detectadas através do aumento da fluorescência verde citosólica, indiciando uma difusão da Rh-123 da mitocôndria para o citosol (Johnson et al., 1980).
ISOLAMENTO DE RNA TOTAL
Serão isolados utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo descrito pelo fabricante:
SEPARAÇÃO PRECIPITAÇÃO ANÁLISE EM ESPECTROFOTÔMETRO
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
Extração do RNA Total feita para a formação do cDNA na reação de Transcriptase Reversa;
É feita então a ampificação do cDNA;
Analisar a expressão gênica dos diversos mediadores celulares pró-apoptóticos (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticos (BclxL) .
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
DETERMINAÇÃO DE MEDIADORES EM CULTURA DE CÉLULAS RENAIS
Determinação de nitrito;
Determinação de TNF-α;
Qual a importância da determinação desses mediadores?
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Serão realizados três experimentos independentes, em triplicata, para cada ensaio.
As médias obtidas em cada experimento serão comparadas utilizando o teste t ou ANOVA, seguido do teste de Bonferroni, quando apropriado, usando o software Prism GraphPad versão 5.0. Valores de p < 0,05 serão considerados para a análise.
OBRIGADO!