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ESTUDO DA INIBIÇÃO DA DOENÇA ENXERTO CONTRA HOSPEDEIRO EXPERIMENTAL AGUDA POR GRANULÓCITOS ESTIMULADOS COM G-CSF Zilton Farias Meira de Vasconcelos Rio de Janeiro Outubro de 2007 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Imunologia). Orientadora: Adriana Bonomo
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ESTUDO DA INIBIÇÃO DA DOENÇA ENXERTO CONTRA HOSPEDEIRO EXPERIMENTAL AGUDA
POR GRANULÓCITOS ESTIMULADOS COM G-CSF
Zilton Farias Meira de Vasconcelos
Rio de Janeiro Outubro de 2007
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Imunologia). Orientadora: Adriana Bonomo
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ESTUDO DA INIBIÇÃO DA DOENÇA ENXERTO CONTRA HOSPEDEIRO EXPERIMENTAL AGUDA
POR GRANULÓCITOS ESTIMULADOS COM G-CSF
Zilton Farias Meira de Vasconcelos
Orientadora: Adriana Bonomo
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Imunologia).
Aprovada por:
_______________________________ Presidente, Prof. Alberto Nóbrega
_______________________________ Prof. Adriana Bonomo (Orientadora) _______________________________ Prof. Pedro Paulo Elsas (Revisor) _______________________________ Prof. Júlio Voltarelli _______________________________ Dr. Martin Bonamino
Rio de Janeiro Outubro de 2007
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Vasconcelos, Zilton Farias Meira de. Estudo da inibição da doença enxerto contra hospedeiro
experimental aguda por granulócitos estimulados com G-CSF / Zilton Farias Meira de Vasconcelo. - Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2007.
xi, 141f.: il.; 31 cm. Orientador: Adriana Bonomo Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Professor
Paulo de Góes/ Programa de Pós-graduação em Ciências (Imunologia), 2007.
Referências Bibliográficas: f. 130-140. 1. Transplante de medula óssea. 2. Doença enxerto contra
hospedeiro. 3. Neutrófilos. 4. Linfócitos. 5. Citocinas. 6. G-CSF. I. Bonomo, Adriana. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Programa de Pós-graduação em Ciências (Imunologia). III. Título.
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RESUMO
ESTUDO DA INIBIÇÃO DA DOENÇA ENXERTO CONTRA HOSPEDEIRO EXPERIMENTAL AGUDA POR GRANULÓCITOS ESTIMULADOS COM G-CSF
Zilton Farias Meira de Vasconcelos
Orientadora: Adriana Bonomo
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Em trabalho anterior demonstramos que o G-CSF induz a geração de granulócitos de baixa densidade (GBDs) que são co-purificados com células mononucleares de sangue periférico e que inibem a produção de interferon gamma (IFN-g) por células T humanas.
Esses resultados nos levaram a postular um papel imuno-modulatório para os GBDs na doença enxerto-contra-hospedeiro aguda (DECHa). Neste trabalho, utilizando um modelo experimental em camundongos, demonstramos que o tratamento in vitro e in vivo com G-CSF gera GBDs que são capazes de inibir em 80% a produção de IFN-γ por linfócitos T. Para avaliar o papel desses GBDs na DECHa, camundongos (C57BL/6 x BALB/c)F1 foram reconstituídos com medula óssea depletada de células T (MODT) em associação com células esplênicas purificadas em coluna de lã de nylon provenientes de doadores C57BL/6 controles (CECN) ou de doadores tratados in vivo com G-CSF (CECN-G). Os recipientes de CECN-G apresentaram 75% de sobrevida contra 25% dos receptores de CECN. Ao final de 60 dias de acompanhamento, o efeito protetor foi completamente abolido quando as células Gr-1 positivas do CECN foram depletadas, fazendo a sobrevida cair para 0% no mesmo período. Se GBDs são co-infundidos com CECN é observada uma proteção completa sobre a DECHa, sem nenhum sinal de doença que possa ser atribuída à DECHa, avaliada pela taxa de mortalidade, perda de peso e histopatologia dos órgãos alvo. Esses resultados evidenciam um efeito novo e imunossupressor para o G-CSF mediado pela geração de GBDs, o que sugere a possibilidade de utilização dessas células como inibidoras da DECHa em humanos.
Palavras-chave: Transplante de medula óssea, doença enxerto contra hospedeiro, neutrófilos, linfócitos, citocinas, G-CSF.
Rio de Janeiro Outubro de 2007
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ABSTRACT
ACUTE EXPERIMENTAL GRAFT VERSUS HOST DISEASE INHIBITION STUDY BY G-CSF STIMULATED GRANULOCYTES
Zilton Farias Meira de Vasconcelos
Orientadora: Adriana Bonomo
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
In previous work we demonstrated that G-CSF induces the generation of low density granulocytes (LDGs) that co-purify with peripheral blood mononuclear cells in a density gradient separation and inhibit interferon gamma (γ-IFN) production by humans T cells.
These results led us to hypothesize an immune-modulatory role for LDGs in acute graft versus host disease (aGVHD). In this work, using an experimental model, we demonstrate that in vivo and in vitro treatment with G-CSF generates LDGs capable of inhibiting by 80% T cell γ-IFN production. To confirm a role for LDGs in aGVHD, (C57BL/6 x BALB/c) F1 mice were reconstituted with T cell depleted bone marrow (TCDBM) in association with nylon wool-purified spleen cells from normal (NWS) of from in vivo G-CSF-treated (NWS-G) C57BL/6 donors. The NWS-G recipients had a 75% survival rate against only 25% in NWS receptors over a 60 day follow up period. This protective effect was completely abolished when we depleted Gr1 positive cells from the NWS-G, resulting in a survival rate of 0%. Moreover, if LDGs were co-infused with NWS cells, we observed a complete protection in aGVHD, without any sign of pathology, as evaluated by mortality rate, weight loss and target organ histopathology. These results show an unexpected role of G-CSF as an immune-suppressor mediated by LDGs generations. This suggests the potential use of these cells as part of a strategy to control aGVHD in humans.
Key-Words: Bone marrow transplantation, graft versus host disease, neutrophils, lymphocytes, cytokines, G-CSF.
Rio de Janeiro Outubro de 2007
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Sumário
1. Introdução............................................................................................................... 10 1.1. História do transplante de medula óssea......................................................... 10 1.2. Tipos de TMO ................................................................................................ 13 1.3. Fontes de CTH................................................................................................ 15 1.4. G-CSF e o seu receptor................................................................................... 20 1.5. Polimorfonucleares neutrófilos ...................................................................... 25 1.6. Intercorrências no TMO ................................................................................. 27 1.7. História da DECH........................................................................................... 32 1.8. Aspectos Clínicos e histopatológicos da DECH............................................. 35 1.9. Imunobiologia da DECH................................................................................ 47 1.10. Estratégias farmacológicas de prevenção e tratamento da DECH ............. 54 1.11. Modelos experimentais de DECH .............................................................. 58 1.12. Estratégias experimentais de controle da DECH aguda ............................. 63 1.13. Resultados anteriores do nosso laboratório e perspectivas......................... 70
2. Objetivos................................................................................................................. 72 3. Material e Métodos................................................................................................. 73
3.1. Animais........................................................................................................... 73 3.2. Reagentes........................................................................................................ 73 3.3. Obtenção de suspensão de esplenócitos de camundongo............................... 75 3.4. Obtenção de suspensão de esplenócitos de camundongo separados por lã de nylon... ........................................................................................................................ 75 3.5. Obtenção de suspensão de células de medula óssea de camundongo ............ 77 3.6. Preparo de granulócitos de baixa densidade in vitro ...................................... 77 3.7. Cultura para pesquisa de citocinas intra-celulares.......................................... 79 3.8. Detecção de antígenos de superfície............................................................... 80 3.9. Citocentrifugação............................................................................................ 81 3.10. Coloração hematológica ............................................................................. 81 3.11. Detecção de antígenos intra-celulares ........................................................ 81 3.12. Detecção de espécies reativas de oxigênio ................................................. 82 3.13. Depleção de células com Complemento..................................................... 83 3.14. Transplante de medula óssea alogeneico.................................................... 84 3.15. Avaliação da DECH aguda......................................................................... 85
4. Resultados............................................................................................................... 87 4.1. O tratamento in vivo e in vitro com rhG-CSF gera granulócitos de baixa densidade (GBD) ........................................................................................................ 87 4.2. GBD inibem a produção de IFN-g por linfócitos T através de um mecanismo dependente de peróxido de hidrogênio....................................................................... 91 4.3. O efeito protetor do baço de camundongos tratados com G-CSF é mediado por granulócitos de baixa densidade........................................................................... 95 4.4. Granulócitos de baixa densidade gerados in vitro inibem completamente a DECHa ..................................................................................................................... 101 4.5. A inibição da DECHa mediada por granulócitos requer tratamento dos neutrófilos com G-CSF e histocompatibilidade ....................................................... 104
5. Discussão.............................................................................................................. 107 5.1. Contextualização .......................................................................................... 107 5.2. Literatura ...................................................................................................... 108
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5.3. Dados prévios do laboratório........................................................................ 113 5.4. Os dados atuais ............................................................................................. 114 5.5. Hipóteses ...................................................................................................... 122 5.6. Perspectivas .................................................................................................. 129
6. Bibliografia........................................................................................................... 132 7. Anexo – Artigos Publicados ................................................................................. 147
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Dedico esse trabalho Àquele que me concedeu meus
principais “títulos” de esposo e pai.
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Agradecimentos
Acho que agradecer foi o experimento mais difícil dessa tese. Digo
isso porque não existia um “protocolo”, muito menos uma referência que
pudesse me guiar...Opa, guiar me lembra a pessoa sem a qual não conseguiria
terminar esse trabalho, obrigado Adriana por tudo! Não apenas pela
orientação, mas por construir um ser humano além do profissional.
Construir o ser humano, isso me faz pensar em algumas pessoas que
foram responsáveis por exatamente isso...Meus queridos pais! Pai e Mãe,
sem vocês eu não poderia nem sonhar, muito menos realizar.
Calma mana, não esqueci de você, obrigado pela infância que
amadureceu e aproveitando que já estou agradecendo a nova família, Lielson,
um grande abraço. Por falar em nova família, com certeza ganhei uma nova
quando me casei, Dona Nete, Cris, Beto, Marcos e Marcelo, valeu pela força.
Força que me recordam as pessoas que me ajudaram na minha tese e
que em hipótese nenhuma podem ser esquecidas, Bruna, Tereza, Júlia,
Rômulão e Rômulinho, muuuuuuuito obrigado!
Cosme e Flávio vocês são amigos do peito e nem centenas de
“Lurdinhas” pagariam o convívio no Banco de Cordão, vocês são simplesmente
insubstituíveis.
Por falar em convívio, não poderia existir um grupo melhor com
pessoas únicas e incomparáveis, valeu Bonomianos !!!
Por falar em galera, pessoal do Banco de Cordão, Marcelo, Juliana
Rodrigues, Juliana Jardim, Rodrigo, Adriana, Evely, Marina, Dulce, grande
abraço.
Só pra finalizar, agradeço ao professor Marcelo Barcinski por abrir a
Medex e permitir trilhar meu caminho e a galera nova do IFF que me
aturaram durante a confecção desse manuscrito.
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1. Introdução
1.1. História do transplante de medula óssea
As observações do pesquisador dinamarquês, Fabricius-Moller, em
cobaias em 1922 e os experimentos realizados 27 anos mais tarde por
Jacobson, em camundongos, foram as bases para o que chamamos hoje de
transplante de células-tronco hematopoiéticas (Jacobson, Simmons et al.,
1951; Dupont, 1997). Naquela época, ambos os pesquisadores demonstraram
que a proteção da medula óssea durante a irradiação corpórea total
permitia a sobrevivência dos animais. Em 1951, Lorenz demonstrou que a
transferência de células vivas da medula óssea era responsável por essa
proteção (Dupont, 1997).
No entanto, a utilização do transplante de medula óssea (TMO), em
humanos, como terapia alternativa para diversas patologias teve sucesso
apenas na década de 60 (Horowitz, 1999; Thomas e Storb, 1999; Baron,
Storb et al., 2003), após o transplante de uma paciente portadora de
leucemia que recebeu células de medula óssea da irmã gêmea idêntica
(Horowitz, 1999; Thomas e Storb, 1999; Baron, Storb et al., 2003). Nesse
caso, foi demonstrado que também em humanos os transplantes de células
de medula óssea são capazes de resgatar a hematopoiese após o tratamento
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radioterápico.
O procedimento de transplante foi repetivo exaustivamente em
vítimas de acidentes nucleares com infusões de medula ósseas de doadores
voluntários com inúmeros insucessos. Essas tentavivas, realizadas
anteriormente ao conhecimento da necessidade de histo-compatibilidade, só
alcançavam o sucesso em indivíduos que tiveram recuperação da própria
medula óssea (Horowitz, 1999; Thomas e Storb, 1999; Baron, Storb et al.,
2003).
Atualmente as patologias de base que são tratadas com o TMO são,
de maneira geral, relacionadas a distúrbios na hematopoiese medular que
podem ser congênitos ou adquiridos, disfunção no sistema imune, ou ainda,
tumores sólidos (Horowitz, 1999; Baron, Storb et al., 2003). No caso de
doenças malignas, a terapia convencional consiste de quimioterapia e/ou
radioterapia, que têm como objetivo principal a destruição das células
transformadas, atingindo sua característica principal, a proliferação. O
limitante deste tratamento é a inespecificidade do mesmo. Desta forma, os
fármacos que não “sabem” quais células são malignas e quais não são, atuam
preferencialmente sobre as células que proliferam muito, uma vez que agem
como anti-proliferativos. Dentre estes tecidos o mais atingido pelo
tratamento é a medula óssea (MO). Em indivíduos adultos, este tecido
localiza-se principalmente nos ossos chatos como esterno e crista ilíaca e
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sua principal função é a hematopoiese (Weissman, Anderson et al., 2001).
O TMO atualmente consiste na coleta de células-tronco
hematopoiéticas (CTH) de um doador, mantendo-se a viabilidade e
características funcionais e proliferativas. O paciente, recipiente das CTH,
é então submetido a doses altas de quimio e/ou radioterapia, permitindo o
tratamento mais agressivo da doença. Após este período de tratamento
ocorre a infusão das CTH, perifericamente, por simples transfusão
sanguínea. Como as CTH só sobrevivem e proliferam no microambiente
medular, a outra etapa no processo do TMO é a migração das CTH para o
seu nicho, onde existem todas as condições ótimas para o re-
estabelecimento hematopoiético (Quesenberry, Colvin et al., 2005). Após
isto as células podem iniciar o processo de proliferação e diferenciação, que
tem como objetivo a reconstituição desse sistema. Esta reconstituição é
acompanhada clinicamente pelas contagens periféricas de neutrófilos e
plaquetas. No momento em que estas contagens atingem um número mínimo,
caracteriza-se a “pega” clínica, ou seja, a granulopoiese e, em alguns casos, a
megacariocitopoiese estão reconstituídas (Thomas e Storb, 1999). Este
período entre a infusão e a pega clínica varia entre os tipos de transplante
(citados abaixo), mas a média gira em torno de 28 dias, onde o paciente é
mantido em uma unidade de tratamento intensivo.
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1.2. Tipos de TMO
O TMO pode ser dividido em 3 tipos principais: O TMO alogeneico
(figura 1), o TMO singeneico (figura 1) e o TMO autólogo (figura 2)
(Horowitz, 1999). O primeiro tipo tem como conceito básico ser feito entre
indivíduos geneticamente diferentes, mas histo-compatíveis. Os genes que
codificam os antígenos responsáveis por essa histo-compatibilidade em
humanos são localizados no braço curto do cromossomo 6, no complexo
principal de histo-compatibilidade, e são chamados de genes de antígenos
leucocitários humanos (ALH) (Mickelson e Petersdorf, 1999). Este tipo de
transplante pode ainda ter a particularidade de ser efetuado entre
indivíduos da mesma família ou sem parentesco nenhum, caracterizando os
transplantes chamados de aparentados e não-aparentados. No caso do TMO
singeneico a doação das CTH é feita por um indivíduo geneticamente
idêntico, ou seja, um irmão gêmeo univitelino. Nestes 2 tipos de transplante,
como o doador e o paciente são indivíduos diferentes, a preparação do
doador e coleta das CTH é feita concomitantemente ao condicionamento do
paciente.
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Figura 1 - Esquema de transplante singeneico e alogeneico.
O paciente submetido a um regime mieloablativo de quimioterapia (QT) torna-se aplasiado, recebendo a partir de um doador a fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH), necessária para a reconstituição hematopoética.
Figura 2 - Esquema de transplante autólogo.
O paciente submetido a um regime não-mieloablativo de quimioterapia (QT) permite a coleta e posterior criopreservação das células-tronco hematopoiéticas (CTH). Num segundo momento, este mesmo torna-se aplasiado após a QT mieloablativa, recebendo suas próprias células descongeladas necessárias para a reconstituição hematopoética.
+ =
Doador: - Alogeneico - Singeneico
PACIENTE PRÉ-TMO
QT
PACIENTE APLASIADO
Fonte de CTH
PACIENTE PÓS-TMO
PACIENTE PRÉ-COLETA DE
QT PACIENTE APLASIADO
Fonte de CTH
PACIENTE PÓS-TMO
PACIENTE PRÉ-TMO
QT
PERÍODO PRÉ-TMO
COLETA DE CTH CRIOPRESERVAÇÃO
DESCONGELAMENTO
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O terceiro tipo de TMO, o autólogo, tem como princípio a coleta das
CTH do próprio indivíduo. Após esta coleta procura-se manter a viabilidade
e capacidade proliferativa das células por um período muitas vezes longo,
pois o paciente precisa ser tratado para a patologia de base antes da
reinfusão do material. Desta forma, diferentemente dos TMO alogeneicos,
os TMO autólogos dependem de técnicas de criopreservação das CTH que
têm como finalidade a manuntenção das propriedades acima citadas por
períodos superiores à 5 anos (Cottler-Fox, 1996; Fleming e Hubel, 2006).
1.3. Fontes de CTH
A coleta de CTH convencional consiste na punção da crista ilíaca e
aspiração da medula óssea. A punção é realizada em centro cirúrgico onde o
doador é submetido à anestesia geral. O objetivo nestas coletas é conseguir
um número aproximado de 1-5 milhões de células-tronco por cada quilo de
peso corporal do recipiente. Sabendo-se que numa medula óssea a proporção
normal de CTH é de 1-3% de todas as células deste tecido (Gratama, Kraan
et al., 1997; Baech e Johnsen, 2000), pode-se estimar que um indivíduo de
70 Kg precisaria receber uma infusão de aproximadamente 7 bilhões de
células totais, que numa medula normocelular corresponde a 1 L de aspirado.
Diante destes números pode-se avaliar quantas punções devem ser
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realizadas e o grau de agressão ao qual o doador é submetido, o que levou a
busca de procedimentos menos invasivos, que facilitariam grandemente a
doação de CTH. O primeiro passo foi a descoberta de fontes alternativas de
células-tronco e uma delas é o sangue de cordão umbilical (SCU) (Broxmeyer
e Smith, 1999; Chao, Emerson et al., 2004). Esta fonte por sua vez
apresenta um rendimento menor que um aspirado convencional e,
consequentemente, contêm uma quantidade de CTH capaz de reconstituir
hematopoéticamente apenas crianças ou indivíduos com menos de 50 Kg de
peso. Diversos estudos para a expansão das células-tronco do SCU estão
sendo realizados para se tentar expandi-las permitindo que o transplante
em adultos seja possível (Chao, Emerson et al., 2004). Uma outra estratégia
que está sendo utilizada é a infusão de sangue de cordões combinados, para
aumentar o número de células-tronco por quilo de peso, necessárias ao re-
estabelecimento hematopoiético (Lister, Gryn et al., 2007).
A segunda fonte de CTH não é uma fonte natural, e sim, uma fonte
induzida. Neste caso o paciente ou doador é tratado com fatores de
crescimento, como o fator estimulador de colônias granulocíticas (G-CSF),
que tem a função de mobilizar as células-tronco da medula óssea para a
corrente sanguínea (Nervi, Link et al., 2006). É importante dizer que no
sangue periférico de pessoas não-tratadas o percentual destas células varia
entre 0,01 a 0,03% e a coleta do número suficiente para o transplante seria
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impossível. No entanto, após o tratamento com alguns fatores de
crescimento hematopoiéticos, aumenta o número de progenitores na
corrente sanguínea. Atualmente, esta mobilização é realizada de diversas
formas, dependendo do doador das células. No caso de doadores normais,
estes são tratados com os fatores de crescimento, sendo o fator
estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF, do inglês granulocyte colony
stimulating factor) amplamente usado nos centros de transplante devido à
melhor mobilização das células da medula, quando comparados a outros
fatores como o fator estimulador de colônias granulocíticas e monocíticas
(GM-CSF) (Nervi, Link et al., 2006). Mesmo sem conhecer o exato
mecanismo pelo qual o G-CSF atua, sabe-se que este estímulo induz
periferalização dos progenitores, possibilitando um aumento de mais de 20
vezes nos níveis circulantes dessas células. Já no caso de doadores
portadores de patologias específicas, a mobilização das CTH pode ou não
ser feita com o G-CSF. No caso dos pacientes serem tratados apenas com
quimioterapia, serão detectados altos níveis de progenitores circulantes no
início da reconstituição hematológica.
Nesta última fonte de CTH a avaliação do sucesso da mobilização é
indispensável, sendo esse sucesso relativo ao número de CTH presentes no
produto colhido. O primeiro método adotado para a quantificação de CTH
foi a cultura de curta-duração de unidades formadoras de colônia (CFU, do
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inglês colony forming unit) (Ravagnani, Siena et al., 1991). Estas culturas são
desenvolvidas em meio semi-sólido e permitem avaliar a formação de
colônias. O ensaio é desenhado para que a contagem das colônias possa
indicar o número de progenitores presentes na amostra, já que precursores
não são capazes de formar colônia. No entanto, estes ensaios são culturas
demoradas, de aproximadamente 14 dias, e nesse caso existe a necessidade
de um resultado mais rápido. Outro problema deste ensaio é que o resultado
mede apenas a quantidade de progenitores presentes no produto, inferindo-
se indiretamente o número de CTH. A técnica que atualmente é amplamente
usada para superar estas limitações é a imunofenotipagem por citometria de
fluxo, que pesquisa a presença de marcadores que caracterizam
fenotipicamente a CTH (Ravagnani, Siena et al., 1991; Venditti, Battaglia et
al., 1999). Diversos estudos conduziram à validação da molécula CD34 como
sendo o melhor marcador de CTH disponível até o momento. No entanto, já
que progenitores, tanto da série mielóide como da linfóide, retêm alguma
expressão de CD34, outros estudos estão em andamento para melhor
caracterizar estas células. A desvantagem deste método de dosagem de
CTH é a falta da avaliação funcional. Dessa forma, as duas técnicas,
citometria e ensaio de CFU, são métodos complementares e, certamente,
associados provêm uma melhor correlação clínica.
A diferença não fica apenas nas fontes das CTH. Existem
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particularidades no período após o TMO quando diferentes fontes são
administradas nos pacientes. A primeira diferença notada é que os
transplantes de células-tronco mobilizadas para o sangue periférico (TCTP)
apresentam a pega clínica em períodos muito menores quando comparadas
com fontes como a MO e o SCU (Berger, Bertz et al., 1999; Ringden,
Remberger et al., 1999; , 2000). Nos dois últimos a granulopoiese e a
megacariocitopoiese são reconstituídas em torno de 35 dias, sendo o SCU
mais demorado que a MO, principalmente em transplantes não aparentados
(Chao, Emerson et al., 2004). Já os TCTP apresentam apenas 20 dias de
aplasia destes setores. Isto tem uma grande importância clínica, porque com
um período de aplasia granulopoiética menor, a gravidade e incidência de
infecções oportunistas diminui muito. Outro lado positivo é que há uma
menor necessidade de transfusões de produtos hemoterápicos como
plaquetas e hemácias, reduzindo assim os custos e os riscos associados. O
exato motivo pelo qual a pega é antecipada, não se sabe, mas provavelmente
o maior número dos progenitores mielóides presentes no TCTP pode
contribuir para a pega clínica. Outra diferença extremamente interessante,
é que o transplante onde o SCU é utilizado como fonte de CTH apresenta a
reconstituição da linfopoiese B mais acelerada que as outras fontes
(Broxmeyer e Smith, 1999). Este fato deve-se provavelmente aos
precursores B que se encontram em grande quantidade no SCU.
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Diante dessas novas fontes de CTH o nome transplante de medula
óssea (TMO) não reflete adequadamento o procedimento, sendo atualmente
utilizado a terminologia transplante de células-tronco hematopoética
(TCTH).
1.4. G-CSF e o seu receptor
O G-CSF é o fator estimulador de colônias granulocíticas produzido
por monócitos, macrófagos, células dendríticas, granulócitos ativados,
células endoteliais e fibroblastos (Demetri e Griffin, 1991). A síntese desse
fator é induzida por endotoxinas bacterianas como o lipopolissacarídeo
(LPS), pelo fator de necrose tumoral-α (TNF-α), pela interleucina 1 (IL-1) e
pelo fator estimulador de colônias granulocíticas e monocíticas (GM-CSF).
O G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) é uma glicoproteína
monomérica de 19,6 KDa (Demetri e Griffin, 1991), constituída de 207
aminoácidos, com 5 resíduos de cisteína, dos quais 4 formam pontes
dissulfeto. Um dado importante é a homologia entre rhG-CSF com o G-CSF
murino, que chega a 72%, permitindo a manuntenção da ação biológica do
fator humano quando administrado em camundongos e vice-versa.
Além de induzir formação de colônias, ou seja, induzir a proliferação
de progenitores, o G-CSF é responsável pela diferenciação de granulócitos
21
maduros e pela ativação de algumas funções dos neutrófilos. Dentre as
funções destaca-se a secreção de grânulos específicos e o aumento da
capacidade oxidativa dessas células (Hampton e Orrenius, 1997; Baehner,
2000). Após a ativação do neutrófilo existe um consumo alto de oxigênio que
é resultado da ativação de um complexo enzimático que normalmente é
latente nessas células, a chamada nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato (NADPH) oxidase (Hampton e Orrenius, 1997; Hampton, Kettle et
al., 1998). Esse complexo localiza-se na membrana plasmática e na
membrana de fagossomos, e sua função é transferir elétrons ao oxigênio
molecular (figura 3) com produção de altas quantidades de ânion superóxido.
Após a formação do superóxido pela NADPH, a enzima superóxido
dismutase o converte em peróxido de hidrogênio, que tem livre passagem
por membranas plasmáticas. A maior parte do peróxido de hidrogênio é
degradada pela enzima mieloperoxidase, o principal constituinte dos
grânulos azurofílicos dos neutrófilos. Essa enzima é responsável pela
formação de diversas espécies oxidantes, inclusive o ácido hipoclórico,
principal agente bactericida dos neutrófilos.
22
Figura 3 - Esquema da produção de radicais oxidativos pelos neutrófilos.
A ativação do complexo enzimático Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato(NADPH) leva ao consumo de oxigênio molecular (O2), que é reduzida a ânion superóxido (O2
-). Em seguida a enzima superóxido dismutase converte o superóxido em peróxido de hidrogênio (H2O2), que, junto com a enzima mieloperoxidase (MPO), é responsável pela formação das espécies oxidantes.
Adaptado de Hampton, Kettle e colaboradores (Hampton, Kettle et al., 1998)
O receptor de G-CSF (G-CSFR) é expresso por granulócitos em todos
os estágios de maturação, em monócitos e plaquetas maduras (Demetri e
Griffin, 1991). Em tecidos não hematopoiéticos, é encontrado em células
endoteliais, placenta e trofoblastos. Não foi descrito em eosinófilos,
linfócitos e eritrócitos. O G-CSFR é membro da superfamília de receptores
23
de citocinas de classe I, (Taga e Kishimoto, 1997). A família é composta por
vários receptores de citocinas como o receptores de IL-6, Oncostatina M,
IL-11, que, como regra geral apresentam duas cadeias, α e β, das quais a
cadeia α dá especificidade ao complexo, e realiza a ligação da citocina
enquanto todos os receptores compartilham a mesma cadeia β, a chamada
gp130, que é responsável pela sinalização intracelular.
No caso do G-CSFR, existem algumas peculiaridades importantes: a
primeira é que o G-CSFR não apresenta 2 cadeias α e β e, não recruta a
gp130 para sinalização, pois o próprio receptor apresenta homologia com a
gp130 apresentando porção intracelular capaz de sinalizar (Taga e
Kishimoto, 1997) (figura 4).
24
Domínio de imunoglobulina
Domínio da família de receptor de citocina classe I
Domínio de fibronectina tipo III
Resíduo de Tirosina Resíduo de Tirosina STAT1 e STAT5
Resíduo de Tirosina STAT3
Figura 4 - Esquema da gp130 e a homologia com o G-CSFR.
O receptor de G-CSF apresenta uma homologia com a proteína gp130, tanto nos seus domínios extracelulares como nos intracelulares. Esses últimos sendo responsáveis pelo recrutamento de proteínas transdutoras de sinal e ativadoras de transcrição (STATs) Adaptado de Taga and Kishimoto (Taga e Kishimoto, 1997)
A segunda diferença é que ele apresenta uma estequiometria de
ligação com o G-CSF de 2 moléculas do fator para 2 cadeias de G-CSFR. A
porção intracitoplasmática do receptor não possui atividade tirosina cinase,
mas é capaz de ativar proteínas tirosina cinases citoplasmáticas chamadas
JaKs (Janus tirosinas cinases) (Ward, Hermans et al., 1999). Essas cinases
fosforilam os resíduos de tirosina do receptor, tornando-os capazes de
25
recrutar as proteínas transdutoras de sinal ativadoras de transcrição 1, 3 e
5 (STAT1, STAT3 e STAT5). Finalmente, ocorre a fosforilação das STATs,
que dimerizam entre si e sofrem translocação para o núcleo, onde passam a
regular a expressão de genes envolvidos em proliferação e maturação dos
granulócitos. Aparentemente, os resíduos de tirosina da parte intracelular
do G-CSFR mais próximos à membrana estão relacionados à proliferação
celular e estão ligados ao recrutamento de STAT1 e STAT5 (Ward,
Hermans et al., 1999); já os resíduos mais distantes da membrana parecem
estar relacionados à maturação neutrofílica e são dependentes de STAT3
(Ward, Hermans et al., 1999) (figura 4). Nos casos de neutropenia severa
congênita (síndrome de Kostmann) existe uma mutação pontual no resíduo
Y704 que leva à incapacidade de maturação da linhagem neutrofílica, mesmo
com capacidade proliferativa normal dos progenitores.
1.5. Polimorfonucleares neutrófilos
Os neutrófilos são células com alta capacidade fagocítica, de meia-
vida curta e essenciais para a imunidade inata (Segal, 2005). Essas células
são formadas na medula óssea e constituem cerca de 60 % dos leucócitos do
sangue periférico humano (Boxio, Bossenmeyer-Pourie et al., 2004). Ainda
em humanos, estima-se que 1011 neutrófilos são produzidos diariamente na
26
medula óssea, com uma meia-vida de aproximadamente 24 horas no sangue.
Em camundongos, essa proporção é bem menor, 5 a 25% dos leucócitos no
sangue são neutrófilos (variações ocorrem entre as linhagens e sexo)
(Laboratory, 2007), com uma meia vida de permanência de 6 horas.
Essas células foram descobertas em 1886 por Élie Metchnikoff,
quando este inseriu espinhos de rosa em larvas de estrelas-do-mar e
verificou o acúmulo de células mesodermais no local da ferida. Após mostrar
que estas células eram fagocíticas, separou-as em fagócitos maiores,
macrofagócitos ou macrófagos, e menores, microfagócitos, agora
conhecidos como neutrófilos (Segal, 2005).
Concomitantemente à descoberta de Metchnikoff, Paul Ehrlich fez a
primeira caracterização dessas células em sangue periférico humano.
Nessas amostras, Ehrlich estabelecia técnicas de fixação e coloração que
permitiram observar núcleos lobulados e grânulos no citoplasma dessas
células (Borregaard e Cowland, 1997). Estas características deram nome a
estes leucócitos, conhecidos como células polimorfonucleares granulocíticas.
Em seus experimentos com técnicas de coloração, Ehrlich descobriu a
presença de 3 tipos de granulócitos com propriedades tintoriais distintas,
conhecidos hoje como eosinófilos, basófilos e neutrófilos, nomes dados por
27
seus grânulos serem corados por corantes ácidos, básicos ou por nenhum
deles, respectivamente (Borregaard e Cowland, 1997).
Sua habilidade de fagocitar e degradar bactérias indicava uma função
microbicida, possibilitadas por seus abundantes grânulos citoplasmáticos
descarregados em vacúolos contendo micróbios. Análises desses grânulos
identificaram várias proteínas com atividade microbicida (Borregaard e
Cowland, 1997).
1.6. Intercorrências no TMO
O objetivo desta parte da tese é listar as principais complicações
relacionadas ao TCTH, indicando sua relevância quanto a morbidade e
incidência nesse procedimento terapêutico (Carreras, 2004).
Inicialmente, temos as complicações relacionadas ao regime de
condicionamento. Este regime de condicionamento é baseado em
quimioterapia e irradiação corpórea total e tem 3 finalidades principais: a
geração de espaço necessário ao estabelecimento da “nova” medula óssea no
indivíduo recipiente do transplante; a necessidade de imunossupressão do
recipiente, impedindo a rejeição desse enxerto e o tratamento da patologia
de base, que é mieloablativo.
28
Esses últimos são os efeitos desejados do condicionamento, mas são
acompanhados por diversas intercorrências associadas a esse regime. Um
exemplo seria a alta incidência de náusea e vômitos decorrentes da
irradiação corpórea total, que ao serem tratadas não costumam apresentar
morbidade significativa (Gratwohl, 2004). Por outro lado, outras
complicações também são correlacionadas à dose de irradiação e ao regime
quimioterápico. No primeiro caso, irradiações com doses maiores que 8 Gy
correlacionam-se com toxicidade pulmonar (Gopal, Ha et al., 2001). No caso
de quimioterapia, o uso de bussulfan correlaciona-se com toxicidade
hepática (Mccune, Gibbs et al., 2000), enquanto a ciclofosfamida resulta em
toxicidade de bexiga e trato gastro-intestinal (Langford, 1997).
Além disso, esses regimes quimio e radioterápicos em altas doses
resultam frequentemente em eritema, edema, atrofia e ulceração da mucosa
oral, uma circunstância geralmente conhecida como mucosite oral (Wardley,
Jayson et al., 2000). Essa complicação leva à dor e à limitação da
alimentação normal, e, em casos severos, obrigando à nutrição parenteral
total e ao uso aumentado de analgésicos. Essa mucosite é um aspecto
bastante debilitante no TCTH, e a ulceração permite a colonização de
microorganismos da flora oral, levando em alguns casos, à septicemia. Como
esses pacientes são temporariamente neutropênicos, existe uma incidência
aumentada de candidíase nessas ulcerações de mucosite oral (Epstein,
29
Hancock et al., 2003), razão pela qual são utilizadas profilaxias anti-
micóticas de rotina.
Para finalizar as complicações relacionadas ao condicionamento, uma
patologia associada ao regime quimioterápico com fisiopatologia ainda muito
pouco compreendida é a chamada doença veno-oclusiva (DVO) (Carreras,
Granena et al., 1993). Acredita-se que a injúria inicie-se com a toxicidade
hepática induzida pelos metabólitos resultantes da interação de drogas
como a ciclofosfamida com o sistema enzimático citocromo P-450.
Normalmente, a eliminação desses metabólitos é realizada por outro
sistema enzimático envolvendo conjugação com glutationa, que se acredita
estar ineficiente nesses pacientes que desenvolvem a DVO. Especula-se que
essa ineficiência poderia ser causada por alguma patologia prévia existente
no fígado, que resulta numa lesão das células endoteliais sinusoidais das
veias hepáticas. Esse processo eventualmente leva à obstrução completa do
espaço venoso, com extensa necrose hepatocelular e deposição de tecido
fibroso no parênquima hepático, gerando hipertensão intra-hepática pós-
sinusoidal.
Como as oclusões de veias hepáticas não foram encontrados durante a
autópsia em 25% dos pacientes com DVO severa, baseado em sinais clínicos
característicos como a hepatomegalia, icterícia e retenção de fluidos com
30
ganho de peso, foi feita uma proposta de mudança do nome da doença para
síndrome de obstrução sinusoidal (Carreras, 2004).
Além das complicações associadas ao condicionamento, por se tratar
de um indivíduo neutropênico temporário, as infecções são causas
importantes de morbidade e mortalidade nesse tipo de paciente
(Cordonnier, 2004). No entanto, até a recuperação neutrofílica, os
pacientes submetidos a transplantes autólogos e alogeneicos apresentam o
mesmo risco de infecções oportunistas, geralmente bacterianas ou por
Aspergillus ou ainda pelo vírus do herpes simples (HSV, do inglês herpes
simplex virus) (Cordonnier, 2004). A mortalidade associada à infecção nessa
fase é dada exclusivamente por sepse bacteriana, pneumonia e infecções
fúngicas severas (Kruger, Hornung et al., 2001).
Por outro lado, os pacientes submetidos a transplantes alogeneicos
apresentam riscos maiores de infecções tardias relacionadas à recuperação
imunológica. Novos métodos de avaliação da função tímica in vivo, como a
análise de círculos de excisão do rearranjo do receptor de célula T (TREC,
do inglês T cell receptor excision circles) (Ribeiro e Perelson, 2007), já
demonstraram de uma forma mais direta a correlação entre neo-gênese de
linfócitos T e o controle de novas infecções (Lewin, Heller et al., 2002).
Dentre essas infecções, uma complicação usual é a reativação do
citomegalovírus (CMV). Infecção que acomete a maioria da população, razão
31
pela qual falamos em reativação. No entanto, deve-se impedir a infecção de
pacientes que ainda são soro-negativos por doadores, tanto de medula
quanto de hemoderivados como plaquetas e hemácias, sendo necessário
nesses casos a filtração dos hemoderivados para a retirada de leucócitos,
fontes principais de partículas virais. Além desses cuidados, os pacientes
soro-positivos devem ser acompanhados periodicamente com testes de
antigenemia para CMV (Osarogiagbon, Defor et al., 2000). Mesmo sendo
freqüente a terapia profilática, a terapia preemptiva vem sendo cada vez
mais indicada para impedir a mortalidade associada a essa reativação.
Para finalizar, a principal intercorrência em pacientes alo-
transplantados é a doença enxerto contra hospedeiro (DECH), que
constitui-se na maior barreira terapêutica no TCTH alogeneico (Chao, 1996;
Vogelsang, Lee et al., 2003). Trata-se em termos simplificados de uma
reação alogeneica mediada por linfócitos T do doador frente aos tecidos do
hospedeiro, resultando em intensa destruição tecidual e falência funcional
dos órgãos acometidos (Reddy e Ferrara, 2003). No entanto, uma grande
mudança conceitual iniciou-se no momento em que a retirada do linfócito T
foi realizada com o objetivo primário de impedir o desenvolvimento da
DECH, e foram observados resultados catastróficos que não tinham sido
previstos. Nesses transplantes, chamados de TCTH depletados de linfócitos
T, foram evidenciados índices aumentados de falência hematopoética e
32
maior incidência de recaídas da doença de base (Maraninchi, Gluckman et
al., 1987; Horowitz, Gale et al., 1990; Glass, Uharek et al., 1998). Esse fato
demonstrou que o transplante alogeneico não é apenas uma terapia de
resgate hematopoiético como o autólogo, mas também tem o aspecto imuno-
terapêutico. Dessa forma, o conhecimento da história, da clínica e da
imunobiologia envolvida na DECH revela-se primordial para o controle da
mesma, sem prejuízo das outras funções linfocitárias que contribuem para o
sucesso do tratamento (Horowitz, 1990).
1.7. História da DECH
Da mesma forma que o TCTH, a doença enxerto contra hospedeiro foi
primariamente observada em modelos experimentais e posteriormente
confirmada em humanos. E, diferentemente da maioria das revisões da
história da DECH, defendo que a possibilidade do conhecimento e
entendimento dessa patologia começa com uma das mais importantes
descobertas imunológicas, a tolerância imunológica neonatal, descrita por
Peter Medawar em 1951 (Medawar, 1960; Brent, 1995).
Medawar já havia demonstrado, em 1943, que transplantes de pele
entre camundongos adultos de diferentes linhagens falhavam no processo
de enxertia. Além dessa rejeição do hospedeiro, ele observou que um
33
transplante secundário levava a uma rejeição acelerada, com falha de
enxertia em um menor intervalo de tempo (Medawar, 1960). Este fato
sugeria, para Medawar, que os animais sensibilizados apresentavam alguma
memória imunológica para o fenômeno de rejeição.
Em seguida Medawar utilizou sua experiência com transplantes de
pele para auxiliar na identificação de gêmeos monozigóticos e dizigóticos em
bovinos. Isso era importante economicamente, uma vez que, nesses animais,
quando dizigóticos e de sexo diferentes, a fêmea usualmente é estéril.
Nessa época, Peter Medawar e Rupert Billingham (revisto por Brent, 2005)
realizaram uma série de experimentos de transferência de pele que tinham
a intenção de identificar esses gêmeos monozigóticos a partir de enxertos
de pele persistentes, ao contrário de gêmeos dizigóticos em que ocorreria
rejeição. No entanto, ambos ficaram perplexos com o resultado de que
todas as peles enxertadas foram plenamente aceitas. O mistério foi
parcialmente resolvido quando, num relato na Science de 1945, Owen
(revisto por Medawar, 1960) descreveu uma anastomose natural que ocorria
in útero em gêmeos dizigóticos de bovinos, levando ao quimerismo de
hemácias nesses animais. Como estas misturas perduravam por anos após o
nascimento, foi possível demonstrar que eram devidas à passagem de
células-tronco hematopoiéticas de um indivíduo para outro no período
gestacional.
34
Medawar e Billingham descobriram em 1951 que o contato do feto
com antígenos alogeneicos permitia o desenvolvimento de tolerância aos
mesmos antígenos na vida adulta. Isto foi induzido através de injeções de
células de indivíduos adultos em fetos in útero ou camundongos neonatos,
realizando-se mais tarde o transplante de pele no indivíduo adulto para
demonstrar a aceitação. E justamente nesses experimentos de
transferências de células que a história da DECH começa.
Para demonstrar que a transferência de células era capaz de induzir
tolerância, foram realizados experimentos com transferência de linfócitos
intravenosa em camundongos neonatos. Leslie Brent em 1957 (revisto por
Brent, 1995), em colaboração com Medawar e Billingham, observaram que
vários recipientes dessas transferências morriam entre 2 e 3 semanas.
Foram realizadas necropsias cuidadosas desses animais que, além de
apresentarem retardo no crescimento, mostraram evidencias de atrofia em
linfonodos e, comumente, splenomegalia. Essas observações levaram a
chamar essa doença de “runting disease”, o primeiro nome da DECH.
Medawar, Billingham e Brent já naquela época postulavam que esse
fenômeno era iniciado pelo reconhecimento de antígenos no hospedeiro
pelas células do doador (Brent, 2005).
35
Nesse mesmo ano o pesquisador Simonsen publicou uma descrição de
patologia análoga em galinhas, usando a esplenomegalia como índice de
doença (revisto por Brent, 2005).
Anos mais tarde foi demonstrado que indivíduos imunodeficientes ou
condicionados para o transplante com irradiação ou quimioterapia
apresentavam a mesma patologia após transfusão sanguínea ou TCTH,
respectivamente. Essa doença foi inicialmente chamada de doença
secundária ao transplante e depois foi associada à “runting disease”.
Atualmente, toda essa fisiopatologia é chamada pelo nome de doença
enxerto contra hospedeiro (DECH).
Os progressos realizados levaram Billingham em 1966 (revisto por
Devergie, 2004) a postular 3 condições essenciais para o desenvolvimento
da DECH, sendo essas condições aceitas até hoje:
1. Transferência de células de indivíduos imunocompetentes;
2. Histo-incompatibilidade entre o doador e o recipiente;
3. Incapacidade do recipiente em destruir ou inativar as células
transfundidas ou transplantadas, por um período suficiente para o
estabelecimento de uma resposta alogeneica.
1.8. Aspectos Clínicos e histopatológicos da DECH
36
Tanto em humanos, quanto em modelos experimentais, a DECH é
subdividida em aguda e crônica (Chao, 1996; Vogelsang, Lee et al., 2003;
Devergie, 2004). A forma aguda evolui com dermatite, enterite e hepatite
que ocorre nos primeiros 100 dias após o transplante, com maior incidência
entre os dias 30 e 40. A DECH crônica normalmente desenvolve-se após 100
dias e evolui como uma síndrome auto-imune com acometimento de múltiplos
órgãos e sistemas. Atualmente, grandes grupos clínicos estão unindo
esforços para melhor classificar, diagnosticar e encontrar bio-marcadores
que auxiliem na classificação da DECH em aguda e crônica (Schultz, Miklos
et al., 2006).
A incidência média de DECH aguda clinicamente significativa (grau
II-IV) gira em torno de 40%. No entanto, a variação entre centros vai de
10 a 80% (Ringden, Horowitz et al., 1993; Przepiorka, Anderlini et al., 1997;
Martino, Romero et al., 1999; Ji, Chen et al., 2002; Devergie, 2004; Oehler,
Radich et al., 2005). Essa variabilidade é dada por diversos fatores que
incluem a dificuldade de um diagnóstico diferencial e preciso até diferentes
fatores de risco entre doadores e recipientes.
37
Os principais fatores de risco relativos ao doador são:
• O grau de histo-compatibilidade entre o doador e recipiente,
principalmente se este é relacionado ou não com o receptor.
Recentemente, estudos demonstraram que o transplante entre
indivíduos não-relacionados, mesmo com identidade em todos os loci
do complexo HLA, apresenta um risco 4,51 vezes maior de
desenvolver a doença quando ocorre disparidades nos haplótipos
(Petersdorf, Malkki et al., 2007), ou seja, doadores não-relacionados
com a organização dos genes polimórficos HLA-A, B e DR, na mesma
organização haplotípica que os recipientes, apresentam risco menor
de DECHa (Figura 5);
Figura 5 – Esquema exemplo de possibilidades de haplótipos HLA em humanos Ilustração do fenótipo HLA de um paciente e seus possíveis doadores HLA-compatíveis, mas com diferentes ligações entre os haplótipos de HLA-A, B e DRB1. Petersdorf e colaboradores demonstraram que os doadores não-relacionados que apresentam haplótipo compatível tem menor risco de desenvolver DECHa. Adaptado de Petersdorf, Malkki e colaboradores (Petersdorf, Malkki et al., 2007)
Haplótipo do paciente Haplótipos potenciais do doador
Haplótipo compatível Haplótipos incompatíveis
38
• Outro fator de risco para DECH aguda é relacionada a disparidades
entre sexo, sendo o risco maior associado à combinação de um doador
do sexo feminino e um recipiente masculino (Kollman, Howe et al.,
2001);
• Alo-imunizações prévias, como ocorre em doadoras multíparas ou
doadores dos dois sexos submetidos a múltiplas transfusões,
apresentam maior risco no desenvolvimento de DECHa;
• A fonte da célula-tronco também influencia o risco, e transplantes
feitos a partir de sangue cordão apresentam menor incidência de
DECHa (Rocha, Wagner et al., 2000), enquanto que os transplantes de
sangue periférico e de medula óssea apresentam uma incidência
comparável (Bensinger, Martin et al., 2001; Korbling e Anderlini,
2001);
• O número de linfócitos T infundidos, sendo demonstrado em humanos
e em camundongos que a dose de linfócitos por quilo de peso do
paciente se correlaciona com morbidade e mortalidade (Korngold e
Sprent, 1999).
Já os fatores de risco relativos ao recipiente são:
• a idade, sendo recipientes mais velhos associados a uma maior
incidência de DECHa (Kollman, Howe et al., 2001); Isso já foi também
39
demonstrado em modelos experimentais e parece estar relacionado à
maior atividade das células apresentadoras de antígeno do hospedeiro
(Ordemann, Hutchinson et al., 2002);
• O regime de condicionamento também relaciona-se positivamente com
o desenvolvimento da doença, e já tem sido demonstrado em humanos
que os mini-transplantes, que utilizam regime de condicionamento
não-mieloablativo, apresentam menor incidência de DECHa
(Sandmaier, Mackinnon et al., 2007);
• Outro fator é a profilaxia da DECHa, onde as monoterapias com MTX
ou CSA foram alteradas para terapias conjuntas com os dois
fármacos, além da dosagem sérica de CSA para confirmação do
efeito protetor (Locatelli, Bruno et al., 2000); Finalmente a
predisposição genética do recipiente está associada com uma maior
incidência de desenvolvimento de DECHa. Recentemente, foi
demonstrado que polimorfismos nos genes de citocinas, IL-10 (Laguila
Visentainer, Lieber et al., 2005) e TNF-α (Takahashi, Furukawa et al.,
2000) estão associados à probabilidade de desenvolvimento da
DECHa,
40
Já na DECH crônica, tanto a incidência como os fatores de risco são
muito difíceis de mensurar. Existem relatos que variam entre 6% e 80% de
incidência, a qual, como na DECHa, depende de vários fatores como: a idade
do recipiente, a fonte da CTH, infusões de linfócitos do doador, etc
(Sullivan, Agura et al., 1991; Filipovich, Weisdorf et al., 2005). A incerteza
se deve à heterogeneidade dos estudos, ao número limitado de pacientes
acompanhados e às variações no diagnóstico/tratamento. No entanto, pode-
se estimar a incidência a partir de um estudo multi-cêntrico em 172
pacientes (Flowers, Parker et al., 2002). Os pacientes incluídos são apenas
os que sobreviveram após 100 dias do transplante sem recaída da doença de
base. Nesse estudo foi ainda realizada a comparação entre pacientes que
foram transplantados com aspirado de medula óssea ou com sangue
periférico mobilizado, observando-se que, em ambos os casos, cerca de 50
% dos pacientes desenvolveram a DECH crônica. A única diferença
encontrada entre os grupos TCTP e TCTM foi a refratariedade ao
tratamento da DECHc que se apresentou maior nos que receberam sangue
periférico mobilizado.
Como dito anteriormente, as manifestações clínicas da DECHa são
predominantes na pele, trato gastrointestinal e fígado (Devergie, 2004).
Com base no acometimento destes órgãos é feita a gradação da doença. Na
pele, o exantema máculo-papular que geralmente envolve as palmas das
41
mãos, solas dos pés e extremidades, como orelha e cabeça, é um marcador
da DECH aguda (Vogelsang, Lee et al., 2003). As lesões podem ser
purulentas e doloridas. Esse exantema inicial pode se alastrar por toda a
superfície do corpo, e, em casos mais severos, pode evoluir para formas
bolhosas, bem semelhantes a queimaduras, que são extremamente dolorosas
e estão associadas à perda de proteínas e ao risco de infecção. Mesmo sem
achados histo-patológicos característicos apenas de DECHa em pele que
permitam diferenciá-la de outras manifestações cutâneas, a apoptose na
base de criptas dérmicas é bem característico de DECHa (Vogelsang, Lee et
al., 2003). Outros achados incluem disqueratose, exocitose de linfócitos,
linfócitos adjacentes a queratinócitos epidermais disqueratinizados,
infiltração linfocítica perivascular na derme e, em pacientes graves,
separação das camadas epidérmica e dérmica.
Já o envolvimento do fígado resulta em hepatopatia colestática, com
ou sem icterícia, associada ao aumento substancial da fosfatase alcalina e
da bilirrubina no soro (Vogelsang, Lee et al., 2003). O diagnóstico
diferencial da DECHa no fígado é extremamente complicado devido à
toxicidade hepática dos medicamentos e as manifestações das infecções e
da DVO. A primeira evidência histo-patológica no fígado é a presença de
linfócitos aderidos ao endotélio vascular. Em seguida ocorre a infiltração
42
linfocitária da área portal com posterior destruição do ducto biliar
(Vogelsang, Lee et al., 2003).
O envolvimento do trato gastro-intestinal manifesta-se
primariamente como náuseas e diarréia. A perda de fluidos entéricos é
usada como medida do envolvimento do intestino, sendo relatados até 10
litros de diarréia por dia, com perda de sangue e dor abdominal severa,
para os casos mais graves (Devergie, 2004). A histopatologia da DECHa
intestinal, da mesma forma que nos outros órgãos, não é específica para a
doença. No entanto, a presença de corpos apoptóticos na base de criptas em
alguns casos, associada a infiltrados agudos ou crônicos é sugestiva de
DECHa (Socie, Mary et al., 2004). É necessário lembrar que biópsias
anteriores ao dia 20 após o transplante apresentam essas manifestações,
mas como efeito do regime de condicionamento.
Todos esses fatores, em conjunto, levam a uma perda de peso
importante, com comprometimento da condição geral do paciente. Dessa
forma, o estadiamento da doença é importante para a predição do curso
clínico do paciente. No caso da DECHa, de acordo com Gluckberg, foram
estabelecidos 4 graus de doença (Glucksberg, Storb et al., 1974), dos quais,
em geral, o grau I tem um prognóstico favorável. Já o grau II é considerado
moderado, o grau III é severo com acometimento de múltiplos órgãos, e o
43
grau IV apresenta risco de vida, sendo frequentemente fatal (Devergie,
2004).
Por se tratar de uma doença que acomete diversos órgãos, fez-se
necessário a criação de um estadiamento relativo para cada órgão em
separado. A tabela abaixo reflete o consenso em estadiamento de cada
órgão baseado na análise de 8249 pacientes em um estudo retrospectivo
conduzido em 12 grandes centros transplantadores (Przepiorka, Weisdorf
et al., 1995).
Tabela 1 – Estadiamento da DECHa relativa a cada órgão acometido
Estadiamento Exantema
(Pele)
Bilirrubina (Fígado) Diarréia/Náusea (Intestino)
1 <25% 34-50 mmol/L > 500mL ou náusea
2 25-50% 51-102 mmol/L > 1000mL
3 >50% 103-255 mmol/L > 1500mL
4 Eritroderma >255 mmol/L Dor/obstrução intestinal
44
A partir desse estadiamento, no mesmo consenso, foi estabelecido a
graduação da DECHa de acordo com a tabela abaixo:
Tabela 2 – Graduação da DECHa baseada no estadiamento
Grau Pele Fígado Intestino
I Estágio 1-2 0 0
II Estágio 3 ou Estágio 1 ou Estágio 1
III-IV Estágio 4 ou Estágio 2-4 ou Estágio 2-4
As manifestações clínicas da DECHc são definidas como tardias e
pleotrópicas podendo ocorrer sem DECHa (DECHc de novo), em seguida à
DECHa (DECHc progressiva) ou ainda após uma DECHa que não remitiu
completamente (DECHc quiescente). Essa intercorrência, cada vez mais,
torna-se a principal determinante da qualidade de vida do paciente a longo
prazo, indicando a importância no entendimento e controle do
desenvolvimento dessa forma da DECH (Devergie, 2004).
A forma crônica da DECH apresenta similaridades com doenças
autoimmunes sistêmicas, sendo sua incidência extremamente alta na pele
(80% dos casos) e boca (70% dos casos) (Vogelsang, Lee et al., 2003). No
primeiro caso, as manifestações incluem despigmentação, placas liquenóides
e fibrose dérmica e subcutânea associada à alopécia (esclerodermia). O
45
envolvimento oral inclui líquen-plano, ulceração, atrofia e ressecamento.
Diversos órgãos são acometidos:
• Olhos, apresentando ressecamento, fotofobia, etc;
• Órgãos genitais, com estenoses genitais, atrofias genitais,
ressecamento;
• Fígado, com alterações das funções hepáticas;
• Pulmão, apresentado casos com bronquiolite obliterante, tosse,
dispnéia, etc;
• Trato gastro-intestinal, com anorexia, náusea, vômitos, disfagia, etc;
• Sistema músculo-esquelético, com amiotrofia, fraqueza, artralgia;
• Sistema hematopoiético, com citopenias possivelmente por dano em
estroma.
O estadiamento da DECHc foi realizado em 1980 por Schulman, com
base na extensão da doença (Shulman, Sullivan et al., 1980). A doença foi
caracterizada como limitada ou extensa, e a lista abaixo relaciona os
critérios dessa classificação:
• Limitada:
1. Anormalidades na cavidade bucal, com 1 lábio ou biópsia de pele
positiva, sem outros sinais de DECHc;
46
2. Modificações moderadas nos testes de função hepáticas com 1
lábio ou biópsia de pele positiva, sem outros sinais de DECHc;
3. Menos que 6 placas papulo-escamosas ou exantema cutâneo
limitado ou despigmentação em menos de 20% da superfície
corporal com biópsia de pele positiva, sem outros sinais de DECHc;
4. Ressecamento ocular com 1 lábio ou biópsia de pele positiva, sem
outros sinais de DECHc;
• Extensa:
1. Manifestações em mais de 2 órgãos com sintomas de DECHc e
biópsia positiva;
2. Perda de peso de mais de 15%, com biópsia positiva em qualquer
órgão;
3. Acometimentos de pele acima dos definidos na doença limitada e
biópsia de pele positiva;
4. Esclerodermia;
5. Deformidades em unhas com biópsias positivas em qualquer órgão;
6. Inflamações nos tecidos conjuntivos (Fasciites);
7. Contraturas decorrentes de DECHc;
8. Bronquiolite obliterante;
9. Biópsia de fígado positiva e testes de função hepática anormais;
47
10. Biópsia de intestino positiva.
Atualmente, está sendo desenvolvido um projeto de consenso entre
18 grandes centros transplantadores, que têm a intenção de melhorar o
diagnóstico e graduação da DECHc. Esse esforço é necessário para
normatizar os critérios de identificação da extensão e da severidade da
doença crônica, levando-se em conta, principalmente, o impacto funcional
causado pela patologia (Filipovich, Weisdorf et al., 2005).
1.9. Imunobiologia da DECH
A idéia de se curar as doenças que comprometem o sistema
hematopoiético ou o sistema imune com TMO alogeneico é muito promissora,
mas essa terapia tem como principal obstáculo a doença enxerto-contra-
hospedeiro (DECH) (Chao, 1996; Ferrara e Antin, 1999), Originalmente
chamada de doença secundária, sustentando questionamentos sobre o
sucesso da terapia, visto que se trocava a doença de base do paciente por
um fenômeno imunopatológico caracterizado como uma reação do enxerto
(rico em células imuno-competentes) contra os tecidos do hospedeiro. Nessa
alo-reação, ocorria morte celular, que, dependendo da sua intensidade,
levaria à falência do órgão, com posterior morte do paciente (Reddy e
48
Ferrara, 2003).
Como citado anteriormente, os órgãos-alvo principais desta
intercorrência são o trato gastrointestinal, fígado, pele e pulmão,
discutindo-se bastante sobre a correlação entre a infecção nestes sítios e o
desenvolvimento da DECH (Chao, 1996; Ferrara e Antin, 1999).
O seu desenvolvimento é atualmente dividido em 4 fases principais
(Murphy e Blazar, 1999; Reddy e Ferrara, 2003): 1ª) O regime de
condicionamento; 2ª)A fase indutora; 3ª)A fase de expansão e 4ª) os
mecanismos efetores da DECH aguda (figura 8).
A primeira fase ocorre antes da infusão das células e diversas
correlações entre o regime de condicionamento e a gravidade da DECH
aguda foram evidenciados (Sandmaier, Mackinnon et al., 2007; Schwarte,
Bremer et al., 2007). A relação existente entre a incidência de DECH e o
condicionamento é que este causa danos teciduais, que por sua vez
acarretam produção de diversas citocinas pró-inflamatórias, como o fator
de necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina-1 (IL-1) (Ferrara, 1998).
Estas citocinas provocam a super-expressão de moléculas de adesão e das
moléculas de HLA (Reddy e Ferrara, 2003). Todas estas alterações
inflamatórias teciduais criam um ambiente propício à ativação das células
imunes que serão posteriormente infundidas.
Além da inflamação, existe uma quebra de barreira importante após o
49
condicionamento, o que permite a translocação bacteriana, aumentando
ainda mais a ativação da imunidade inata do hospedeiro (Hill, Crawford et
al., 1997; Cooke, Hill et al., 1998). A primeira descrição de uma possível
correlação entre a ativação da imunidade inata e o desencadeamento da
DECHa foi feita por van Bekkum em 1974, demonstrando o papel da
microflora bacteriana na DECHa. Nesses experimentos, animais “germ-free”
apresentaram atraso na curva de mortalidade pós-transplante em
comparação com animais convencionais (Van Bekkum, Roodenburg et al.,
1974). Em humanos, regimes de condicionamento são precedidos por
“descontaminação” bacteriana com antibiótico-terapia (Beelen, Elmaagacli et
al., 1999). Nesse caso, a intenção é diminuir a flora bacteriana do trato
gastro-intestinal, tratamento que gerou uma diminuição na incidência da
DECHa.
Outra demonstração experimental importante da relação de quebra
de barreira e translocação bacteriana com a doença aguda foi observada em
modelos experimentais tratados ou não com o fator de crescimento de
queratinócitos (KGF, do inglês keratinocyte growth factor) que induz o
crescimento de células epiteliais do tecido intestinal lesado. Esse
tratamento se mostrou tão eficaz em controlar a DECHa (Krijanovski, Hill
et al., 1999) que estudos clínicos com esse fármaco já foram realizados. No
50
entanto, os resultados em humanos não foram entuasiasmantes (Blazar,
Weisdorf et al., 2006).
Atualmente, existe ainda uma evidência de correlação entre
polimorfismos genéticos no gene NOD2/CARD15, que é responsável pelo
reconhecimento de motivos bacterianos da microflora intestinal, e uma
maior incidência de DECHa em humanos (Holler, Rogler et al., 2004),
reforçando mais uma vez a importância da imunidade inata no
desencadeamento dessa patologia.
51
Figura 8 - Fases da doença enxerto contra hospedeiro aguda (DECH).
A DECH é dividida em 4 fases principais: a primeira tem relação com o regime de condicionamento, a segunda relaciona-se com a indução da resposta aloreativa, em seguida a fase de expansão clonal e por último a fase que é chamada de efetora. Adaptado de Murphy and Blazar (Murphy e Blazar, 1999)
A segunda fase consiste na ativação dos linfócitos T que acabam de
ser infundidos no hospedeiro, após a interação com as células
apresentadores de antígenos (APC do inglês antigen presenting cell) do
hospedeiro (Shlomchik, Couzens et al., 1999). Esta interação ocorre entre o
receptor de célula T (TCR do inglês T cell receptor) e o complexo HLA mais
peptídeo. Se esse complexo está sendo apresentado no contexto de HLA
citocinas inflamatórias
b) indução
c) expansão
a) regime de condicionamento
d) efetuação da resposta
moléculas co-estimulatórias
Quimiocinas
agressão do hospedeiro
Citocinas
IFN-γ
52
classe I, eles serão reconhecidos por linfócitos T CD8+. No caso de HLA
classe II, o peptídeo será apresentado às células CD4+ (Korngold e Sprent,
1999). Já foi demonstrado a importância das placas de Peyer no
desencadeamento dessa ativação in vivo em modelos murinos (Murai,
Yoneyama et al., 2003), sendo inclusive a migração após a ativação nos
órgãos linfóides secundários observada por métodos de bio-imagem
(Beilhack, Schulz et al., 2005).
Adicionalmente, modelos experimentais já demonstraram a
importância das células T virgens no desenvolvimento da DECHa, sendo
células T de memória incapazes de desenvolver a doença (Anderson, Mcniff
et al., 2003; Chen, Cui et al., 2004; Beilhack, Schulz et al., 2005). Ainda
nessa fase, Shlomchik demonstrou em 1999 que as células apresentadoras
de antígeno do hospedeiro são as responsáveis pela iniciação da DECHa
(Shlomchik, Couzens et al., 1999); logo em seguida Duffner demonstrou que
apenas as células dendríticas são necessárias, sem contribuição de células B
(Duffner, Maeda et al., 2004). Finalmente, ainda nessa fase, foi descrito
que células T amadurecidas funcionalmente para o fenótipo Th2, produtor
de interleucina-4, são incapazes de desenvolver a DECHa (Krenger, Snyder
et al., 1995) e, além disso, inibem a DECHa mediada por células Th1
produtoras de interferon-gama (Fowler, Kurasawa et al., 1994).
Após essas interações celulares e moleculares os linfócitos passarão
53
à terceira fase do processo, que consiste na expansão clonal das células alo-
reativas. Essa expansão culmina no aumento do número de células capazes
de causar danos aos tecidos do hospedeiro.
Finalmente, a última fase da DECH aguda é o resultado das fases
anteriores, entrando em jogo mecanismos efetores. Dentre eles, pode-se
citar a citotoxicidade mediada por linfócitos CD8, o aumento na produção
de citocinas inflamatórias e a citotoxicidade mediada por linfócitos CD4
utilizando vias alternativas como a via Fas-FasL. Finalmente, podem ser
evidenciados sinais clínicos da DECHa, que são a erupção cutânea, perda de
pêlos, perda de peso, falência de órgãos, mucosite, que ao longo de um
período variável, podem levar à morte.
Já a doença crônica tem uma incidência de aproximadamente 50% nos
pacientes que sobrevivem livres da doença de base após 100 dias de
transplante (Flowers, Parker et al., 2002). Esta forma é muito mal
caracterizada quanto aos mecanismos celulares, sabendo-se apenas que os
linfócitos também são responsáveis pelo desenvolvimento da patologia. No
entanto, existem dúvidas inclusive sobre quais linfócitos são os reais
responsáveis pela doença, podendo ser atribuídos aos infundidos
inicialmente, ou aos diferenciados no hospedeiro sobre um timo alterado
pelo tratamento e incapaz de realizar uma seleção negativa eficaz (Sakoda,
Hashimoto et al., 2007; Zhang, Hexner et al., 2007).
54
1.10. Estratégias farmacológicas de prevenção e tratamento da
DECH
Devido a DECH permanecer como a principal causa de morbidade e
mortalidade relacionada aos transplantes, um regime profilático para
impedir o desenvolvimento da doença é extremamente necessário (Devergie,
2004). No entanto, mesmo a DECH tendo um papel deletério durante o
curso do transplante, a erradicação completa da doença está associada ao
aumento da recaída da doença original (Horowitz, Gale et al., 1990),
mostrando que a DECH tem uma associação direta com o efeito enxerto
contra tumor/leucemia, e que soluções radicais como a depleção de
linfócitos T do enxerto são igualmente prejudiciais ao paciente.
De uma forma bastante simplificada, a tabela abaixo mostra os
principais regimes profiláticos e de tratamento da DECHa (Devergie, 2004):
55
Tabela 3 – Regimes profiláticos e de tratamento para a DECHa
Prevenção 1ª linha de tratamento 2ª linha de
tratamento
Ciclosporina + Metotrexate MP 2mg/Kg + esquema em curso Altas doses de MP
Depleção de linfócitos T ATG
Tacrolimus Tacrolimus
Micofenilato Mofetil
(MMF)
MMF
Metil-prednisolona (MP) Sirolimus
Sirolimus Anticorpos Monoclonais
Historicamente, o metotrexate (MTX) foi o primeiro tratamento
profilático para DECHa, sendo usado por volta dos anos 70. Somente em
1985, a ciclosporina A (CSA) foi incluída nos regimes profiláticos e nesse
período ocorreu um aumento expressivo no número de transplantes
alogeneicos, uma vez que esse fármaco teve um sucesso muito grande no
controle dessa patologia (Locatelli, Bruno et al., 2000; Hogan e Storb,
2004). Esse sucesso é devido a especificidade desse fármaco em inibir a
proliferação dos linfócitos T, através da inibição da produção de IL-2, ao
contrário dos efeitos citotóxicos e inespecíficos do MTX. No entanto, uma
grande limitação na terapia é a nefrotoxicidade causada pelos metabólitos
da CSA (Locatelli, Bruno et al., 2000).
56
O uso do Tacrolimus em conjunto com o MTX está sendo indicado, já
que, em estudos de fase II e III, este se mostrou eficaz no controle da
DECHa (Nash, Antin et al., 2000). Esse fármaco, assim como a ciclosporina,
inibe as vias de ativação dos linfócitos T dependentes de cálcio in vitro e in
vivo, impedindo especificamente a ação da serina-treonina fosfatase
chamada calcineurina. Essa proteína é responsável pela desfosforilação de
fatores citoplasmáticos, como o fator nuclear de células T ativadas (NFAT,
do inglês nuclear factor of activated T cell), que sofre translocação para o
núcleo e atua na transcrição gênica de diversas interleucinas, parecendo
também atuar em ciclinas envolvidas na proliferação celular (Carvalho,
Teixeira et al., 2007). Além disso, o tacrolimus têm sua ação em doses
muito pequenas, o que preservaria a função renal (Hogan e Storb, 2004).
Outro fármaco promissor seria o sirolimus (rapamicina) que assim
como as duas anteriores parece agir nas mesmas vias de sinalização. No
entanto, o sirolimus não apresenta nenhuma nefrotoxicidade e suas funções
são aparentemente não competitivas com o tacrolimus. Quando estudadas in
vivo, a conjugação de tacrolimus, sirolimus e MTX não aumentou a
toxicidade renal e, quando comparado aos controles históricos, os
resultados de prevenção da DECHa pareceram promissores (Antin, Kim et
al., 2003).
57
O MMF é utilizado para o controle de proliferação de linfócitos B e
T, esse fármaco impede a síntese de purinas pela via de novo, via
extremamente importante para os linfócitos no processo proliferativo (Mele
e Halloran, 2000; Holler, 2007).
A MP é um corticosteróide muito utilizado no tratamento da DECHa,
no entanto o seu papel profilático ainda é controverso. Atua como inibidor
de respostas inflamatórias, com supressão da produção de citocinas e ação
pró-apoptótica direta em linfócitos (Holler, 2007).
O tratamento da DECHa mais eficaz considerado igualmente um
indicador prognóstico importante, é a resposta a corticosteróides. O
corticosteróide mais utilizado é a MP, com doses de 2 mg/Kg/dia (Devergie,
2004; Holler, 2007). Os pacientes refratários à corticoterapia entram em
tratamentos de segunda linha, com diversos regimes de tratamento
diferentes (listados na tabela 3), sendo importante ressaltar que não
existem ainda estudos comparativos, nem padronização para essas terapias
(Holler, 2007).
Para o tratamento da DECHc, a prednisona e ciclosporina A
combinados, são os fármacos para a primeira linha de tratamento (Devergie,
2004), embora a sobrevida global só tenha sido estatisticamente superior
no grupo de alto risco de DECHc, quando a terapia foi realizada em dias
alternados de CSA e predinisona (Koc, Leisenring et al., 2002). No entanto,
58
os pacientes refratários ao tratamento padrão são encaminhados para
diversas terapias alternativas, como:
• Irradiação de baixa dose de órgãos linfóides;
• Psoraleno com UVA;
• Fotoquimioterapia extracorpórea;
• MMF;
• Tacrolimus;
• Talidomida.
Da mesma forma que em DECHa, não existem estudos comparativos
entre os tratamentos de segunda linha para DECHc que estabeleçam os
protocolos e rotinas para o controle dessas doenças refratárias.
1.11. Modelos experimentais de DECH
Os modelos experimentais de DECH existentes, podem ser divididos
em 2 grandes grupos. Os modelos que utilizam animais recipientes que
recebem irradiação corpórea total (ICT) e os não irradiados (Hakim, Fowler
et al., 1998; Korngold e Sprent, 1999). Deve-se ressaltar que os modelos
com tratamentos quimioterápicos devem ser empregados apenas para
estudos de enxertia, sendo os resultados para DECH ainda controversos
59
(Xun, Thompson et al., 1994). No caso dos animais que recebem ICT, existe
um mimetismo maior com o transplante alogeneico realizado em humanos,
devido à geração de um ambiente inflamatório importante para o
desenvolvimento da fase I da DECHa (Sandmaier, Mackinnon et al., 2007;
Schwarte, Bremer et al., 2007). Já nos modelos que utilizam camundongos
não-irradiados o que se sugere é o desenvolvimento de DECHc (Hakim,
Fowler et al., 1998). Essa sugestão é baseada no surgimento de patologias
associadas a doenças autoimunes, e não necessariamente refletem a pato-
fisiologia real da DECHc em humanos. Já que os animais nesse caso não são
irradiados, a realização só é possível na combinação de doadores parentais
em camundongos receptores F1 (incapazes de rejeitar as células do doador),
semelhante aos experimentos de Brent quando descobriu a DECH (Brent,
1995).
Além da combinação de linhagens comentada no parágrafo anterior, a
evolução da doença para a forma aguda ou crônica, dependerá em alguns
casos do número de células infundidas e dos subtipos linfocitários
infundidos (Sprent, Schaefer et al., 1990; Korngold e Sprent, 1999).
Dentre as análises realizadas para o acompanhamento da progressão
da DECH, as mais importantes estão listadas abaixo:
• Avaliação da sobrevivência após o transplante;
• Avaliação da perda de peso relativa;
60
• Avaliação das condições gerais do animal (postura, pele,
agilidade, etc);
• Histopatologia dos órgãos alvo.
Dentre os modelos mais conhecidos, os que geram DECHa são os que
utilizam camundongos das cepas C57BL/6 (B6) ou C57BL/10 (B10) como
doadores e camundongos F1 irradiados (normalmente B6D2F1) ou B10.BR
como recipientes (Hakim, Fowler et al., 1998; Korngold e Sprent, 1999).
Nesse modelo existe uma disparidade de MHC tanto de classe I como de
classe II. Já nesse momento percebe-se que o modelo murino apresenta
disparidade em antígenos maiores de histocompatibilidade, embora seja tido
como informativo sobre uma doença compatível com a encontrada em seres
humanos no contexto de identidade HLA. Existem também modelos que
utilizam disparidades apenas em moléculas de MHC de classe I ou classe II,
necessários para demonstrar o papel tanto de CD8 quanto de CD4 no
desenvolvimento da DECHa, respectivamente (Hakim, Fowler et al., 1998;
Korngold e Sprent, 1999). Esses experimentos demonstraram que ambos os
subtipos de linfócitos T contribuem para a doença aguda. No entanto,
camundongos transplantados com células de doadores incompatíveis apenas
em classe I apresentam atraso na curva de mortalidade pós-transplante em
61
comparação com combinações doador-recipiente que apresentam
disparidade em classe II (Sprent, Schaefer et al., 1988).
Os modelos crônicos podem ser desenvolvidos em camundongos
parentais de BALB/C em recipientes F1(BALB/C x A/J) não irradiados,
através da transferência de células parentais de doador BALB/C (Hakim,
Fowler et al., 1998). Nesse caso, também existe uma disparidade de MHC
tanto de classe I como de classe II, mas os animais desenvolvem uma
doença crônica, mediada por células Th2, caracterizada por síndromes
autoimunes em diversos sistemas, incluindo: Glândulas salivares, juntas,
músculo, intestino e unhas (Claman, Jaffee et al., 1985; Declerck, Draper et
al., 1986). Outro modelo seria com doadores DBA/2 em receptores B6D2F1
não irradiados, que apresentam um quadro de DECHc com desenvolvimento
de glomérulo-nefrite (Kuppers, Suiter et al., 1988).
Um modelo de estudo de DECH muito interessante é o que utiliza o
doador LP/J em receptores B6 irradiados. Nesta situação existem
disparidades apenas em antígenos de histocompatibilidade menores,
semelhante ao que ocorre no transplante em humanos. Nesse caso,
transferências com baixa dose de linfócitos T, cerca de 2 x 107 células por
animal, fazem doença crônica com desenvolvimento de esclerodermia. Em
contrapartida, a transferência de números maiores de linfócitos, cerca de 5
62
x 107 células por animal, fazem doença aguda letal com acometimento de
intestino (Declerck, Draper et al., 1986).
Outro modelo bastante interessante é o que utiliza células de
doadores B10.D2 em recipientes BALB/C. Nessa combinação, ocorre
também uma disparidade apenas em antígenos menores e o que determina a
evolução da doença é a dose de irradiação. Altas doses na faixa da
letalidade (cerca de 900 cGy) levam ao desenvolvimento de DECHa, e doses
sub-letais (cerca de 600 cGy) induzem uma doença crônica com
esclerodermia (Claman, Jaffee et al., 1985).
Apesar dessas diferenças entre os modelos experimentais de DECH,
tanto agudo como crônico e a doença no homem, que se pretende estudar
através destes modelos, deve-se ter em mente que muito pode se aprender
sobre a fisiopatologia da doença e sobre novos métodos de controle de
desenvolvimento da mesma em camundongos. No entanto, é indiscutível a
necessidade de investigação clínica e de busca de correlação dos dados
encontrados na bancada como os dados avaliados à beira do leito. A
mensagem é que diversas lições podem ser aprendidas com os modelos
experimentais, mas todas são lições que devem ser postos à prova em
ensaios clínicos para que sua validade seja confirmada.
63
1.12. Estratégias experimentais de controle da DECH aguda
Assim que ficou claro que a célula T era a responsável pela DECH
aguda, a primeira estratégia de controle da doença foi retirar os linfócitos
do produto a ser infundido. Esse procedimento realmente impediu o
desenvolvimento da DECHa, mas evidenciou outros papéis do linfócito T que
antes eram desconhecidos no TCTM. Primeiramente, o papel de facilitador
da pega do enxerto, pois nesses transplantes ocorria uma maior incidência
da falência medular, gerando hipóteses de que o linfócito T poderia ser
responsável pela produção de fatores de crescimento indispensáveis à
hematopoiese (Monteiro, Benjamin et al., 2005), ou ainda, impedir a rejeição
mediada por células imuno-competentes residuais do hospedeiro (Cudkowicz
e Bennett, 1971a; 1971b). Além disso, os transplantes depletados de
linfócitos T totais apresentam uma incidência maior da recaída da doença de
base do paciente (Maraninchi, Gluckman et al., 1987; Horowitz, Gale et al.,
1990; Glass, Uharek et al., 1998). Com isso, se demonstra um papel
imunoterapêutico do TMO que antes não se discutia. Esse efeito é chamado
efeito enxerto contra leucemia (ECL) e agora é considerado indispensável
para o sucesso do TCTH (figura 5).
64
Dessa forma, diversos trabalhos começaram a investir na modulação
da ativação linfocitária, tentando inibir a DECH com a manutenção dos
efeitos benéficos dos linfócitos (Blazar e Murphy, 2005).
Primeiramente discutirei as estratégias que utilizam as vias de
sinalização intracelular como alvo terapêutico. A primeira evidência de que
esses alvos poderiam ser interessantes partiu de estudos experimentais
com o inibidor de histona desacetilase chamado ácido hidroxâmico
suberoilanide (SAHA, do inglês suberoylanide hydroxamic acid). Esse
Figura 5 – O papel do linfócito T no TMO
O linfócito T tem papel central no TMO, pois atua facilitando a pega do transplante, é responsável direto da DECH e efeito enxerto contra leucemia (ECL)
ECL
65
fármaco aumenta a acetilação de histonas e, consequentemente, altera a
expressão gênica (Leoni, Zaliani et al., 2002). Já havia sido descrito como
regulador negativo da produção de citocinas inflamatórias como IL-1, IL-12
e TNF-α in vivo. Em modelos experimentais de DECHa, foi demonstrada a
proteção contra o desenvolvimento da doença e a manutenção do efeito
enxerto contra tumor (Reddy, Maeda et al., 2004).
Outro fármaco utilizado foi o bortezomid, que é um inibidor de
proteassoma, recentemente aprovado para o tratamento de mieloma
múltiplo (Kane, Bross et al., 2003). Estudos demonstraram que o alvo
principal do bortezomid é o NF-kB, que é regulado pela degradação do seu
inibidor IkB, um processo dependente do proteossoma. Em modelos de
DECHa, esse inibidor de proteassoma foi capaz de inibir o desenvolvimento
da patologia, desde que administrado imediatamente após o transplante
(Sun, Welniak et al., 2004).
Outra estratégia de inibição de DECHa é utilizar como alvo as
citocinas que medeiam o desenvolvimento da doença. Obviamente, as
citocinas Th1, como o IFN-g, foram os primeiros alvos escolhidos. No
entanto, camundongos geneticamente deficientes para IFN-g, quando
utilizados como doadores, apresentaram aumento na incidência de DECHa,
sugerindo um papel protetor dessa citocina na patofisiologia da doença
(Murphy, Welniak et al., 1998). No entanto, o desvio de fenótipo de ativação
66
linfocitária para Th2 impede o desenvolvimento da doença (Krenger, Snyder
et al., 1995) e protege frente ao desafio apresentado pela infusão de
linfócitos totais de um baço não manipulado (Fowler, Kurasawa et al., 1994).
Já a IL-12 parece ter efeitos contraditórios quando injetada exógenamente
em momentos diferentes do transplante, podendo aumentar ou diminuir a
doença aguda (Sykes, Pearson et al., 1999). Alternativamente, o tratamento
com anticorpos anti-TNF-α parece proteger contra a DECHa em modelos
experimentais (Wall e Sheehan, 1994) e atualmente estão em ensaios
clínicos para assegurar sua eficácia (Ferrara, 2007).
Outra citocina que aparentemente era promissora no combate ao
desenvolvimento da DECHa é o fator de crescimento de queratinócito
(KGF). Nesse caso a tentativa é reconstruir a barreira lesada pelo
condicionamento, impedindo a re-ativação da imunidade inata. Em modelos
experimentais, o KGF apresentou resultados impressionantes (Krijanovski,
Hill et al., 1999), mas em humanos os primeiros ensaios clínicos não
obtiveram o mesmo sucesso (Blazar, Weisdorf et al., 2006).
Uma estratégia ainda muito pesquisada é utilizar como alvo
terapêutico as moléculas co-estimulatórias, responsáveis pela plena ativação
do linfócito T. Dentre as estratégias já estudadas, um primeiro estudo
clínico nessa linha usou a molécula do fator 4 associado a linfócito T
citotóxico fusionado a imunoglobulina (CTLA4-Ig, do inglês cytotoxic T
67
lymphocyte-associated factor 4 immunoglobulin) que compete com o CD28
pela molécula B7 presente na membrana das APCs (Blazar, Taylor et al.,
1994). Com isso, ocorre a inibição do segundo sinal dado pelas APCs e,
conseqüentemente, a DECH aguda é diminuída. Outro protocolo visou inibir a
interação do CD40L presente nos linfócitos ativados com o CD40 presente
na APC, com anticorpos anti-CD40L (Blazar, Taylor et al., 1998). A ligação
do CD40L aumenta a capacidade de co-estímulo e produção de citocinas pela
APC, mecanismo importante para a ativação subseqüente dos outros
linfócitos que venham a interagir com essa APC.
Além das estratégias in vivo de bloqueio de moléculas co-
estimulatórias, muito tem sido feito in vitro para gerar células tolerizadas
ou ainda selecionadas negativamente, com o objetivo de impedir o
desenvolvimento da DECHa. Culturas com células apresentadoras de
antígeno do hospedeiro, estabelecidas na presença de citocinas anti-
inflamatórias como o TGF-β e IL-10, ou ainda na presença de CTLA-4Ig,
foram capazes de inibir o desenvolvimento da doença (Guinan, Boussiotis et
al., 1999). Por outro lado, a eliminação de células ativadas, após uma reação
mista leucocitária, por seleção negativa baseada em marcadores de ativação
(Fehse, Frerk et al., 2000), por estratégias de gene suicida (Drobyski,
Morse et al., 2001), por morte celular induzida por ativação (AICD, do inglês
activated induced cell death) (Hartwig, Robbers et al., 2002) ou ainda por
68
fotoativação (Truitt, Johnson et al., 1999; Chen, Cui et al., 2002) também
foram capazes de inibir o desenvolvimento dessa patologia.
Finalmente, as terapias celulares com células potencialmente
controladoras da aloreatividade são alvos de intensos estudos
experimentais. As primeiras da lista são as células T regulatórias, que já
demonstraram sua capacidade supressora em modelos de DECHa, tanto no
controle da doença como alterando a cinética de proliferação das células
CD4+CD25- (Cohen, Trenado et al., 2002; Hoffmann, Ermann et al., 2002;
Jones, Murphy et al., 2003; Trenado, Charlotte et al., 2003). Associado a
isso, foi verificado que a pré-ativação dessas células aumenta a sua
eficiência do ponto de vista da regulação da alo-reativatividade (Taylor,
Lees et al., 2002). Estudos em expansão dessas células para utilização em
terapias celulares em seres humanos já estão em curso. Toda a esperança
nessas células é reforçada por recentes descobertas em humanos, onde
diversas correlações foram estabelecidas entre a presença dessas células
em tecidos-alvo de DECHa (Rieger, Loddenkemper et al., 2006), ou em
sangue periférico (Schneider, Munder et al., 2006), e o desenvolvimento da
doença.
Além das células T regulatórias, a depleção de APCs pela ação de
células NK foi eficiente em modelos murinos e preveniu o desenvolvimento
de DECHa (Ruggeri, Capanni et al., 2002). Como a citotoxicidade mediada
69
por células NK depende da ausência de reconhecimento de moléculas de
HLA na célula alvo, a histo-incompatibilidade entre as células NK do doador
e as células apresentadoras de antígeno do recipiente, permite a depleção in
vivo destas células. A identificação de combinações doador e recipiente
favoráveis a citotoxicidade mediada por células NK, possivelmente,
permitirão condicionar o paciente antes da infusão dos linfócitos T e
impedirão o desenvolvimento da DECHa (Shlomchik, Couzens et al., 1999;
Giebel, Locatelli et al., 2003).
Outro tipo celular que desperta muito interesse atualmente são as
células mesenquimais. Sugere-se que essas células estão envolvidas não só
na prevenção (Lazarus, Koc et al., 2005) mas também no tratamento de
DECHa (Ringden, Uzunel et al., 2006). Nesse caso, os resultados em
humanos precederam os resultados experimentais, mas pouco se sabe a
respeito dos mecanismos envolvidos na regulação aloreativa. In vitro já foi
demonstrado o potencial inibitório sobre a proliferação de linfócitos T,
tanto com células mesenquimais autólogas como alogeneicas, sugerindo a
utilização de qualquer doador, mesmo histo-incompatível, como fonte de
células mesenquimais para uso terapêutico (Le Blanc, Tammik et al., 2003).
70
1.13. Resultados anteriores do nosso laboratório e perspectivas
Nosso trabalho teve início a partir de uma questão clínica que ainda
encontrava-se pouco explorada em humanos. Essa questão comparava a
incidência de DECHa entre os TCTH utilizando o aspirado de medula óssea
(TCTM) e o que utilizava o sangue periférico mobilizado (TCTP), mostrando
que, apesar do número 30 vezes maior de linfócitos T presentes nesse
último produto, a incidência de DECHa era semelhante (Przepiorka,
Anderlini et al., 1997; Ringden, Remberger et al., 1999; Bensinger, Martin et
al., 2001; Korbling e Anderlini, 2001). A hipótese mais aceita para explicar
esse fenômeno é baseado em experimentos em camundongos, realizados no
grupo do professor Ferrara. Seus experimentos demonstram que após o
tratamento com G-CSF in vivo existe um desvio de resposta dos linfócitos
para um fenótipo Th2, com proteção a DECHa (Pan, Delmonte et al., 1995).
Em 2001, resolvemos estudar as diferenças entre os linfócitos presentes
em ambos os materiais em humanos e comprovar se o mesmo desvio para
Th2 era observado. Nessa época não existiam relatos na literatura que
comparassem esses transplantes em humanos.
A partir dessa pergunta, nosso grupo descreveu, em 2003, que os
linfócitos presentes no TCTP eram incapazes de produzir citocinas tanto
Th1 como Th2 quando avaliadas ex vivo (Vasconcelos, Santos et al., 2003).
71
Em seguida, demonstramos a presença de granulócitos de baixa densidade
(GBD) nesses materiais após o tratamento do doador saudável com G-CSF
por 5 dias, subcutaneamente. Nesse mesmo estudo, esses GBD
demonstraram-se capazes de inibir ativamente a produção de citocinas em
ensaios ex vivo com amostras de sangue periférico e técnicas de ativação
linfocitária e marcação intra-citoplasmática específica para IFN-g e IL-4
(Vasconcelos, Diamond et al., 2001). Fomos capazes de gerar essas células in
vitro durante o tratamento com G-CSF a partir de neutrófilos maduros e
esses apresentavam certa capacidade inibitória sobre a produção das
mesmas citocinas linfocitárias.
A pergunta que nos moveu adiante foi: Se realmente essas células
têm algum papel no controle de desenvolvimento da DECHa em humanos, a
geração delas in vitro ou in vivo em modelos experimentais poderia ser
capaz de inibir a DECHa?
72
2. Objetivos
• Verificar se o tratamento de camundongos in vivo e in vitro
com rhG-CSF gera granulócitos de baixa densidade;
• Avaliar a capacidade desses granulócitos em inibir a produção
de γ-IFN por linfócitos T;
• Avaliar a capacidade imuno-moduladora desses granulócitos de
baixa densidade no desenvolvimento da DECHa experimental.
73
3. Material e Métodos
3.1. Animais
Todos os animais utilizados nesse trabalho foram criados no biotério
do Centro de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer (Rio de Janeiro,
Brasil). As linhagens utilizadas foram fêmeas A/J (H-2a), C57BL/6 (H-2b) e
machos [C57BL/6 x BALB/c] F1 (H-2b x H-2d). Estes últimos foram
utilizados como recipientes de transplante de medula óssea e
obrigatoriamente têm mais de 10 semanas de vida. Esses animais eram
mantidos em caixas com micro-isoladores para a manutenção de um
ambiente asséptico. Nas outras linhagens listadas, os animais sempre foram
utilizadas com idade entre 8 e 10 semanas.
3.2. Reagentes
- Tampão Fosfato – PBS – pH: 7,2 - Sigma Chemical Co, MO, Estados
Unidos
- Forbol Miristato Acetato – PMA - Concentração de uso 20 nM -
Sigma Chemical Co, MO, Estados Unidos
- Ionomicina - Concentração de uso 2 μM - Sigma Chemical Co, MO,
Estados Unidos
74
- Monensina - Concentração de uso 3 μM - Sigma Chemical Co, MO,
Estados Unidos
- Saponina 0,3% em PBS - Sigma Chemical Co, MO, Estados Unidos
- Paraformaldeído 2% em PBS - Sigma Chemical Co, MO, Estados
Unidos
- G-CSF humano e recombinante – Biosintética, SP, Brazil
- Catalase – Merck, Darmstadt, Alemanha
- Soro Fetal Bovino – Gibco, MD, Estados Unidos
- Hystopaque® 1.077 - Sigma Chemical Co, MO, Estados Unidos
- Anti-CD4 FITC clone GK1.5 – eBiosciences, CA, Estados Unidos
- Anti-CD8 Cy clone 53-6.7– eBiosciences, CA, Estados Unidos
- Anti-CD3 FITC clone 145-2C11 – eBiosciences, CA, Estados Unidos
- Anti-CD5 PE clone 53-7.3 – eBiosciences, CA, Estados Unidos
- Anti-IFN-γ PE clone XMG1.2 – eBiosciences, CA, Estados Unidos
- Anexina V FITC – Invitrogen, CA, Estados Unidos
- Iodeto de propídeo - Invitrogen, CA, Estados Unidos
- Di-hidro-rodamina 123 - Sigma Chemical Co, MO, Estados Unidos
- Meio de cultura celular DMEM - Sigma Chemical Co, MO, Estados
Unidos - suplementado com vitaminas, aminoácidos essenciais, não-
essenciais e L-glutamina 200 mM - Invitrogen, CA, Estados Unidos
75
3.3. Obtenção de suspensão de esplenócitos de camundongo
Após a eutanásia do camundongo C57BL/6 ou A/J, foi aberta a
cavidade peritoneal em capela de segurança biológica em condições estéreis.
O baço do camundongo foi retirado e acondicionado em placas de cultura
contendo PBS com 2% de soro fetal bovino (SFB). Com auxílio de um pedaço
de tecido de algodão (trama 44) e pinças curvas, o baço foi macerado de
forma a obter uma suspensão de esplenócitos, enquanto a cápsula do órgão
ficou aprisionada no tecido de nylon. Em seguida, a suspensão celular foi
transferida, com pipetas pasteur, para tubos Falcon de 15 mL para
posterior processamento ou cultivo celular. Os tubos que continham as
células em suspensão foram acondicionados em um container de isopor com
gelo até o momento do processamento.
3.4. Obtenção de suspensão de esplenócitos de camundongo
separados por lã de nylon
A partir da suspensão de esplenócitos, foram realizadas separações
celulares por colunas de lã de nylon. Essa técnica visa separar as células
presentes no baço ou linfonodo devido a pouca aderência ao nylon dos
linfócitos T, quando comparados às outras células.
76
Na extremidade inferior de uma coluna de lã de nylon estéril de 10
mL, montada em seringa, conectou-se um adaptador 3-vias e, neste, uma
agulha de coleta de sangue (25x7). Em seguida, em capela de segurança
biológica, adicionou-se meio de cultura DMEM com 10% de SFB a 37ºC até
completar a coluna. Logo após, retiraram-se as bolhas presas na coluna com
batidas leves na mesma. Incubou-se essa coluna por 45 minutos na estufa de
CO2, tomando o cuidado de cobrir a coluna para manter a esterilidade.
Em seguida, aplicaram-se 108 células provenientes da suspensão de
esplenócitos à coluna, num volume de 2 mL, abrindo-se o adaptador 3-vias
durante a aplicação, o que permitiu que a suspensão entrasse na coluna.
Adicionou-se mais 1 mL de meio com soro acima da suspensão, de forma a
permitir que todas as células entrassem em contato com a coluna e evitar
que a mesma não secasse na parte superior. Em seguida, incubou-se a coluna
por mais 45 minutos na estufa.
Após a incubação, permitiu-se que as células não aderentes saíssem
da coluna, abrindo o adaptador 3-vias com um fluxo controlado e
recolhendo-se a suspensão em um tubo falcon de 15mL estéril, na cabine de
segurança biológica. A confirmação da pureza dos linfócitos T coletados foi
realizada por citometria de fluxo, com marcações específicas com o
anticorpo anti-CD3 FITC. A partir desta etapa chamamos essas células de
células esplênicas de lã de nylon (CELN).
77
3.5. Obtenção de suspensão de células de medula óssea de
camundongo
Após a eutanásia do camundongo C57BL/6 ou A/J, com auxílio de
material cirúrgico apropriado, foram retirados tíbias e fêmures dos
camundongos em capela de segurança biológica. Em seguida, com auxílio de
bisturis foram retiradas as epífises destas, seguindo-se a lavagem da
cavidade do osso com agulhas e seringas, contendo PBS com 2% de SFB.
Para as tíbias foram utilizadas agulhas de insulina (13x8) e para os fêmures
agulhas de coleta de sangue (25x7). A suspensão celular proveniente dessa
lavagem foi recolhida em tubos Falcon de 15 mL para o posterior
processamento ou cultivo celular. Os tubos que continham as células em
suspensão foram acondicionados em um container de isopor com gelo até o
momento do processamento.
3.6. Preparo de granulócitos de baixa densidade in vitro
Para o preparo de granulócitos de baixa densidade, foram utilizados
tanto suspensões de esplenócitos como de medula óssea. Em ambos os casos,
78
as células foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque.
Todo o procedimento foi realizado de forma estéril em capela de segurança
biológica. Para tal, foi adicionado 1 parte do gradiente ao tubo Falcon,
seguido da adição cuidadosa de 2 partes da suspensão celular obtida
anteriormente. Após o gradiente ser montado, e o tubo fechado, este
sistema foi centrifugado por 25 minutos a temperatura ambiente (25ºC),
numa velocidade de 450g. Após a centrifugação, as células mais densas que
o gradiente, que se encontravam no fundo do tubo, foram recolhidas e
lavadas com PBS 2% SFB por 2 vezes e resuspendidas em DMEM com 10%
de SFB. Essas células foram chamadas de granulócitos de alta densidade
(GAD), já que a composição preponderante de leucócitos, nessa fração, era
de granulócitos.
Em seguida, os GAD foram quantificados em hemocitômetro e
plaqueados na concentração de 4x106 células/mL em placas de cultivo
celular de 6 poços, num volume final de 5 mL de DMEM com 10% de SFB. Em
seguida, foi adicionado a cada poço 200 ng/mL de rhG-CSF.
Essa cultura foi mantida em estufa de CO2 a uma temperatura de
37ºC por 15 horas. O passo seguinte consistiu na recuperação das células
com auxílio de uma pipeta Pasteur e, posteriormente, da passagem dessa
suspensão por um novo gradiente de densidade. O gradiente foi
centrigugado da mesma forma que o anterior, mas a recuperação das células
79
foi realizada na fração de densidade inferior ao gradiente. Em seguida as
células foram quantificadas e mantidas em gelo para conservação até o
próximo passo de cultivo celular ou transferência celular.
3.7. Cultura para pesquisa de citocinas intra-celulares
A técnica utilizada para a pesquisa de citocinas por citometria
baseia-se numa cultura com PMA na concentração final de 20 nM e
ionomicina (2 μM), na presença de Monensina (3 μM). O PMA é uma molécula
lipossolúvel que atravessa livremente as membranas celulares, o que facilita
a sua utilização. Este composto é um análogo estrutural do diacilglicerol
(DAG) segundo mensageiro intracelular que está envolvido com diversas vias
de ativação e proliferação celular, através da ativação da proteína quinase
C. A ionomicina que é um ionóforo de cálcio, que permite o influxo de cálcio
para o citoplasma da célula. A ionomicina também é lipossolúvel e atravessa
livremente as membranas; com isso, a liberação de cálcio de reservatórios
intracelulares também ocorre quando se utiliza este composto. Enfim, a
monensina é responsável pela desorganização do complexo de Golgi, inibindo
então o tráfego das vesículas através da organela. Com essa desorganização,
a secreção das citocinas é impedida, promovendo o acúmulo de citocinas no
interior da célula. Após 4 horas de cultivo, as células podem ser pesquisadas
80
para a presença das citocinas de interesse, pois a concentração atingida é
ótima para este tipo de ensaio (Prussin e Metcalfe, 1995).
O procedimento inicia-se com o plaqueamento de 2x106 células
mononucleares por poço em uma placa de 24 poços, no volume final de 1 mL
de DMEM com 10% de SFB. Adiciona-se à cultura 20 nM de PMA e 2 μM de
Ionomicina por poço e, ainda, 3 μM de Monensina. Cultiva-se por 4 horas em
estufa de CO2 a 37°C.
3.8. Detecção de antígenos de superfície
Para a detecção de antígenos de superfície para análise por
citometria de fluxo, foram incubadas 106 células por 15 minutos à
temperatura ambiente, com 1μL dos anticorpos específicos. Após lavagem
com PBS, centrifugando as células a 450g por 5 minutos, procedeu-se à
leitura e análise em citômetro de fluxo. Caso a amostra não pudesse ser lida
no mesmo dia, esta era fixada em solução de parafolmaldeído 2% em PBS.
Todas as colorações foram realizadas em microplacas de 96 poços fundo em
“u”. As aquisições foram realizadas no citômetro Facscalibur® da B&D e as
análises realizadas no software CellQuest®.
81
3.9. Citocentrifugação
Qualquer suspensão celular obtida pode ser citocentrifugada para
posterior coloração das células na lâmina. Para a realização da
citocentrifugação, foram ajustadas as concentrações celulares para 5 x 105
células por mL e, em seguida, 100 μL da suspensão foram aplicados no
citofunil que foi previamente preparado para a centrifugação. Após a
aplicação da amostra, essa foi centrifugada contra uma lâmina previamente
identificada, por 5 minutos a 100g. Finalmente, a lâmina era separada da
cubeta e guardada adequadamente para uma coloração posterior.
3.10. Coloração hematológica
As lâminas de citocentrifugado eram preparadas com 5 x 104 células
em 100μL, e coradas com o kit Hemacolor® (Merck, RJ, Brasil) de acordo
com o protocolo do fabricante.
3.11. Detecção de antígenos intra-celulares
Para a detecção de antígenos intracelulares, inicialmente era
realizada a cultura (descrita no item 2.7), para posterior marcação.
Primeiramente as células eram fixadas com solução de paraformaldeído 2%
82
em PBS, previamente aquecido a 37°C, por 5 minutos. Após lavagem com PBS
para retirada do paraformol, com uma centrifugação a 450g por 5 minutos,
realizava-se a permeabilização com saponina, adicionando-se 10 µL da
solução de saponina 0,3% diretamente sobre o centrifugado. Neste
momento, eram adicionados os anticorpos específicos para as citocinas de
interesse e para marcadores apropriados para a identificação do subtipo
celular. Incubava-se a amostra por 30 minutos à temperatura ambiente,
seguido de lavagem com 200 µL de saponina. Após a última centrifugação de
450g por 5 minutos, ressuspendiam-se as células em PBS para leitura
imediata em citômetro de fluxo. Todas as análises de produção de citocinas
foram realizadas com no mínimo 10000 células CD3+. Todas as colorações
foram realizadas em microplacas de 96 poços fundo em u. As aquisições
foram realizadas no citômetro Facscalibur® da B&D e as análises realizadas
no software CellQuest®.
3.12. Detecção de espécies reativas de oxigênio
Para medir a produção de espécies reativas de oxigênio, utilizou-se a
dihidrorodamina 123. Esse reagente é um corante não-fluorescente que
difunde-se passivamente pela membrana celular, e que, após oxidação pelo
peróxido de hidrogênio, transforma-se na rodamina 123. A rodamina, por
83
sua vez, fluoresce na cor verde em cerca de 523 nm. Desta forma, qualquer
célula que contenha em seu citoplasma a dihidrorodamina e ao mesmo tempo
peróxido de hidrogênio terá um aumento significativo de fluorescência na
faixa do verde (Richardson, Ayliffe et al., 1998).
Nesse trabalho, para o acompanhamento de produção intracelular de
peróxido de hidrogênio, as células foram ativadas por 5 minutos com 20nM
de PMA seguido de mais 5 minutos de incubação na presença de 45 uM de
dihidrorodamina 123. Todas essas incubações foram realizadas em banho-
maria a 37ºC. Nos casos específicos e sinalizados nos resultados, foram
adicionados aos tubos, antes da ativação com PMA e dihidrorodamina,
anticorpos anti-CD4/CD8 marcados com Cy-Chrome para identificação da
sub-população de linfócitos T. A incubação dos anticorpos foi de 15 minutos
a temperatura ambiente sob proteção da luz. Após essas incubações os
tubos foram mantidos no gelo até a leitura no citômetro de fluxo e
posteriormente analisados no software CellQuest.
3.13. Depleção de células com Complemento
Para depletar células de uma suspensão foi realizada uma técnica de
reação específica com anticorpos seguido da lise mediada pelo Complemento.
Para tal, as células eram incubadas com anticorpos na presença de
84
Complemento de coelho a 20% por 30 minutos numa temperatura de 37ºC.
Após esse período, as células eram centrifugadas por 5 minutos a 450g e
re-incubadas por mais 30 minutos na presença de meio DMEM com 20% de
complemento de coelho, na mesma temperatura.
Nesse trabalho foram depletados linfócitos T com auxílio do
sobrenadante dos hibridomas GK1.5 (rico em anticorpo anti-CD4) e 53-6.7
(rico em anticorpo anti-CD8). Após a depleção das suspensões, a
confirmação da depleção era realizada com anticorpo anti-CD3 marcado com
fluoresceína e lido em citômetro de fluxo.
Já a depleção de granulócitos foi realizada com o sobrenadante do
hibridoma RB6-8C5 (rico em anticorpo anti-Gr1). Após a depleção de
granulócitos a confirmação era realizada por análise citológica e por
citometria de fluxo. Para a citometria as células eram marcadas com
anticorpo anti-Gr1 marcado com fluoresceína.
3.14. Transplante de medula óssea alogeneico
Para realização do transplante de medula óssea, os animais
hospedeiros receberam água acidificada (pH entre 2,5 a 3) por duas
semanas anteriores à irradiação e por mais 2 semanas após o transplante.
Como dito anteriormente, todos os animais hospedeiros eram mantidos em
85
microsoladores e em grupos de no máximo 6 animais por caixa. No dia
anterior ao transplante, os animais hospedeiros receberam 850 cGy de
irradiação corpórea total. Essa irradiação era realizada em um aparelho de
irradiação modelo TH780C com uma fonte irradiadora de cobalto 60 (60Co)
e durante a irradiação os camundongos eram mantidos aprisionados em
caixas de acrílico.
Cerca de 24 horas após a irradiação, todos os animais recebiam a
transferência de 5 x 106 células provenientes da medula, após a depleção de
linfócitos T (MODT). Nos grupos identificados, os animais recebiam,
adicionalmente, 5 x 106 CELN para desenvolvimento de DECHa. Em alguns
grupos, foram ainda co-transplantados granulócitos de alta e baixa
densidade.
3.15. Avaliação da DECH aguda
Para o acompanhamento da DECHa foram analisados 3 parâmetros
principais: perda de peso; histopatologia de íleo terminal e mortalidade. Para
a realização dessas medidas, todos os animais foram marcados e pesados no
dia anterior à irradiação. Em seguida, todos os animais eram diariamente
observados para avaliação de mortalidade e a cada 2 dias os animais
sobreviventes eram pesados. A avaliação histopatológica foi realizada no dia
86
20 após o transplante. Para a realização da histopatologia, todas as
amostras foram fixadas em formalina. E, após um período mínimo de 24
horas, as amostras foram incluídas em parafina. Todos os tecidos foram
cortados e corados com hematoxilina e eosina, para posterior observação
em microscópio ótico.
87
4. Resultados
4.1. O tratamento in vivo e in vitro com rhG-CSF gera granulócitos
de baixa densidade (GBD)
Nosso grupo já havia previamente demonstrado que o tratamento, in
vivo, com G-CSF subcutâneo gera granulócitos de baixa densidade (GBD) na
corrente sanguínea de indivíduos sadios (Vasconcelos, Santos et al., 2003).
Adicionalmente, o tratamento in vitro com G-CSF alterava a densidade de
neutrófilos maduros de sangue periférico, tornando-os GBD.
Nossa pergunta nesse momento era: Em modelos murinos, o mesmo
fenômeno acontece?
Para avaliar a geração de granulócitos de baixa densidade in vivo,
camundongos C57BL/6 foram tratados por 5 dias com injeções subcutâneas
diárias contendo 1,2 ug/g de peso do animal de rhG-CSF. Após esse
tratamento, os esplenócitos dos camundongos foram separados por
gradiente de densidade e as células de baixa densidade foram analisadas
por microscopia ótica e citometria de fluxo. A análise morfológica das
células foi realizada após citocentrifugação com posterior coloração das
células com hematoxilina e eosina. A análise dos citocentrifugados mostrou
que cerca de 20% das células presentes na fração de baixa densidade do
88
baço desses animais tinham um núcleo polimorfonuclear e citoplasma neutro,
compatíveis com neutrófilos (Figura 6a, painéis superiores). Na citometria
de fluxo, essas células apresentavam alta granulosidade e marcação
específica para o antígeno Gr-1 nas suas membranas, enquanto que os
marcadores CD14 e CD11b não apresentaram marcação positiva (Figura 6a,
painéis inferiores), enquanto que nos animais controles, não tratados com
rhG-CSF, o percentual de granulócitos é menor que 1% (dados não
mostrados).
Para avaliação da geração de granulócitos de baixa densidade in vitro,
foram realizadas culturas com a fração de alta densidade das células do
baço de camundongos C57BL/6. Essas culturas eram realizadas na presença
de rhG-CSF por 15 horas na concentração de 200 ng/mL dessa citocina.
Após essa cultura a fração de baixa densidade era recolhida e analisada
morfologicamente e por citometria de fluxo. Na análise morfológica, os
citocentrifugados corados com H&E mostraram a presença de cerca de 90%
de células com o núcleo polimorfonuclear e citoplasma neutro, idênticos aos
gerados in vivo (Figura 6b, painéis superiores). A análise de citometria de
fluxo nessa população demonstrou que as células possuem o fenótipo
também idêntico ao gerado in vivo, sendo elas Gr-1+ CD14- CD11b- (Figura
6b, painéis inferiores). A geração de granulócitos de baixa densidade a
partir de medula óssea foi realizada da mesma forma que a anterior, e foi
89
realizada a confirmação da presença de células Gr-1 positivas no segundo
gradiente de densidade (Figura 6c).
De acordo com a figura 6c, os GBD gerados a partir de medula óssea
apresentavam 2 picos de expressão do antígeno Gr-1. Esse dado, de acordo
com artigos de diferenciação hematopoética de granulócitos (Fleming,
Fleming et al., 1993), indicaria que as células com menor expressão de Gr-1
seriam imaturas. Para descartar essa possibilidade, as células foram
marcadas com um marcador de imaturidade SCA-1, presente em células
hematopoiéticas desde a célula tronco até o estágio de progenitor
hematopoiético. Nesse caso, os GBD gerados in vitro apresentam um número
diminuído de células imaturas quando comparado aos GDB gerados in vivo,
descartando essa possibilidade (Figura 6d).
90
Figura 6 – O Tratamento in vivo e in vitro com rhG-CSF gera granulócitos de baixa densidade. Camundongos C57BL/6 foram tratados com injeções subcutâneas de rhG-CSF para posterior análises dos esplenócitos de baixa densidade, citocentrifugados e corados com H&E (A, painéis superiores, aumento de 40x e 100x). Esses mesmos esplenócitos foram marcados com anticorpos específicos de acordo com a indicação e analisados por citomeria de fluxo, a análise foi realizadas nas células totais após o gradiente de densidade e apenas nas células de alta granulosidade de acordo com a indicação (A, painéis inferiores). Esplenócitos de alta densidade de camundongos C57BL/6 foram cultivados por 15 horas com rhG-CSF e, em seguida, separadas novamente por um novo gradiente de densidade. As células agora de baixa densidade foram avaliadas morfologicamente em citocentrifugados corados com H&E (B, painéis superiores, aumento de 40x e 100x). Além disso, a mesma população foi avaliada por citometria de fluxo com os marcadores indicados na figura, todas as análises foram feitas na população total após o segundo gradiente (B, painéis inferiores). Células de alta densidade de medula óssea de camundongos C57BL/6 foram tratadas in vitro com rhG-CSF e, em seguida, submetidas a um novo gradiente de densidade onde as células de baixa densidade foram recolhidas e marcados com o anticorpo anti-Gr-1 para análise por citometria de fluxo (C). Granulócitos de baixa densidade de medula óssea gerados in vitro e granulócitos de baixa densidade de baço gerados in vivo (análise apenas das células de alta granulosidade) foram analizadas por citometria de fluxo com os anticorpos específicos anti-Gr-1 e Sca-1 (D).
A I n vivo
C
Gr-1 CD14 CD11b Gr-1
Células Totais Células com alta granulosidade
20 % 90 % 1 % 0 %
Gr-1
D MO in vitro
Baço in vivo
B
CD14 CD11b Gr-1
Células Totais
In vitro
95 % 1 % 2 %
4 2 3 91
1 25 2 72
MO In vitro
89 %
91
4.2. GBD inibem a produção de IFN-g por linfócitos T através de
um mecanismo dependente de peróxido de hidrogênio
Nosso grupo já havia demonstrado previamente que, em humanos, a
inibição da produção de IFN-γ por linfócitos T era dependente de peróxido
de hidrogênio produzido por GBD (Vasconcelos, Santos et al., 2003).
Nossa pergunta nesse momento era: GBD gerados in vitro, da mesma
forma que em humanos, impedem a produção de citocinas através de um
mecanismo dependente de peróxido de hidrogênio?
Dessa forma, fomos avaliar, em modelos murinos, a produção
intracelular de IFN-γ por linfócitos T. O método escolhido foi a citometria
de fluxo. Na figura 7A, a primeira coluna representa o controle
experimental, onde as células do linfonodo mesentérico (LNM) de um animal
C57BL/6 foram estimuladas in vitro com anti-CD3 por 15 horas e re-
estimulados por 5 horas com PMA e ionomicina, na presença de monensina.
Este protocolo permite a posterior detecção de IFN-γ intracelular com
marcação concomitante de CD5, caracterizando a freqüência de linfócitos T
produtores dessa citocina. Nesse mesmo experimento, demonstrou-se que o
co-cultivo de LNM com GBD induzir uma inibição significativa da produção
de citocinas. Demonstrou-se, ainda, que tanto o co-cultivo com GAD como o
92
co-cultivo com GBD na presença de catalase apresentam índices
semelhantes ao controle (Figura 7a).
Para eliminar a possibilidade da ausência de células T produtoras de
IFN-γ ser decorrente da morte das mesmas, avaliou-se a possibilidade de
morte por apoptose dos linfócitos T em presença de espécies reativas de
oxigênio, produzidas pelos neutrófilos tratados com G-CSF. O gráfico de
citometria (Figura 7B) mostra uma marcação dupla com annexina V
conjugada a fluoresceína e iodeto de propídeo (PI), na população linfóide. O
gráfico da esquerda da figura 7B, representa a população linfóide de um
linfonodo mesentérico cultivado sozinho e o segundo, a população linfóide do
linfonodo co-cultivado com GBD. Em ambos os casos, não fica evidenciada
morte expressiva, nem por apoptose (Annexina V+ PI-), nem por necrose
tardia (Annexina V+ PI+).
Uma vez que a catalase reverte a inibição a níveis do controle, o
experimento seguinte visa detectar a presença de peróxido de hidrogênio
em linfócitos T, já que este se difunde livremente através das membranas
celulares. Para detectar peróxido de hidrogênio foi utilizada a sonda di-
hidro-rodamina 123, que ao ser oxidada pelo peróxido é convertida a
rodamina 123 que fluoresce na cor verde e pode ser detectada por
citometria de fluxo. Nesse experimento, demonstrou-se que os GBD são
capazes de gerar peróxido de hidrogênio quando estimulados com PMA por
93
5 minutos e que após a adição de catalase à cultura essa produção não é
diminuída. Já na população linfóide, apenas quando co-cultivados com GBD,
visualiza-se um aumento na intensidade da fluorescência detectada por
citometria de fluxo, correspondendo ao peróxido de hidrogênio. A adição de
catalase à cultura, abole completamente a marcação dos linfócitos,
indicando a produção externa de peróxido provavelmente pelos GBD (Figura
7C). Vale ressaltar que a catalase não modifica a fluorescência decorrente
da oxidação da rodamina nos granulócitos (Fig 7 C).
94
Figura 7. GBD inibem a produção de IFN-g por linfócitos T num mecanismo dependente de peróxido de hidrogênio. (A) Linfonodos mesentéricos foram ativados com anticorpos anti-CD3 por 15 horas. Essas células foram ativadas e, posteriormente, cultivadas sozinhas (Co) ou co-cultivadas com GAD ou com GBD ou ainda GBD + catalase (1000 U/mL) e novamente ativadas com PMA, ionomicina e monensina por mais 5 horas. Após a cultura, as células foram marcadas com anticorpos anti-IFN-g e anti-CD5 de forma a quantificar as células T produtoras de IFN-g. Os resultados foram mostrados em percentual de resposta em relação ao controle. O percentual de células T produzindo IFN-g nos controles variaram entre 9% e 17%. Os números entre parênteses indicam o número de experimentos. As barras representam o erro padrão. * P<0,05. (B) Linfonodos mesentéricos cultivados ou não com GBD, assim como no painel A, foram avaliados para viabilidade celular com marcações específicas para annexina V e iodeto de propídeo. Os dados apresentados correspondem à região de linfócitos baseada em parâmetros de tamanho e complexidade por citometria de fluxo. (C) O conteúdo intracelular de peróxido de hidrogênio foi medido com a di-hidro-rodamina 123 em GBD (painéis superiores) ou linfócitos (painéis inferiores). Os GBDs foram cultivados na ausência (Estimulado) ou na presença de catalase (Estimulado + Catalase), ou foi mantido não marcado (Controle). A população CD4/CD8 de linfonodos mesentéricos pré-ativados foram cultivados sozinhos (Controle) ou com GBD na ausência (GBD) ou na presença (GBD+Catalase) de catalase. Os dados mostrados são histogramas de citometria de fluxo de GBD sozinhos ou linfócitos. Ressaltamos que a fluorescência da população de linfócitos só ocorre na presença de GBD.
0
20
40
60
80
100
LNM GAD GBD GBD +CATALASE
% d
e re
spos
ta d
o co
ntro
le
B
Annexina -V FITC
PI
LNM LNM + GBD
0 %
0,36 %
0,2 %
0,48 %
A
*
controle estimulado
estim / cat GBD
controle
+GBD
+GBD/ cat
DHR
Linf
C
(7) (3) (7) (3)
95
4.3. O efeito protetor do baço de camundongos tratados com G-
CSF é mediado por granulócitos de baixa densidade
Existem na literatura demonstrações, tanto em modelos
experimentais (Pan, Delmonte et al., 1995; Zeng, Dejbakhsh_Jones et al.,
1997), quanto em pacientes humanos transplantados (Przepiorka, Anderlini
et al., 1997; Ringden, Remberger et al., 1999; Bensinger, Martin et al., 2001;
Korbling e Anderlini, 2001), de que o tratamento com G-CSF do doador com
posterior TCTP diminuem a incidência da DECHa, mesmo com o número
aumentado de linfócitos sendo infundidos.
Nossas perguntas nesse momento eram: 1) Existem granulócitos nas
células esplênicas de animais tratados com G-CSF, enriquecidas em
linfócitos T por coluna de lã de nylon?
2) Sendo a primeira pergunta positiva, a eliminação dessas células
com posterior transplante reverte a proteção ao desenvolvimento da
DECHa, em transplantes experimentais?
Dessa forma, procurávamos avaliar se essas células seriam capazes
de modular o desenvolvimento da DECHa in vivo. De acordo com a figura 8B,
pode-se observar que as células esplênicas de um animal controle separadas
por coluna de lã de nylon são preponderantemente linfóides, enquanto que os
camundongos tratados in vivo com G-CSF apresentam cerca de 20% de
96
células de alta granulosidade positivas para Gr-1, por citometria de fluxo,
compatíveis com granulócitos neutrófilos.
Em seguida, foi realizado um experimento para avaliar a capacidade
desses granulócitos presentes no baço em modular in vivo o desenvolvimento
da DECHa experimental. A estratégia escolhida foi à retirada dos
neutrófilos “contaminantes” desse material por lise mediada por anticorpos
e complemento. Essa eliminação foi confirmada por citometria de fluxo no
terceiro gráfico da figura 8B. Sequencialmente, foi realizado o transplante
experimental, de acordo com a figura 8A, com quatro grupos experimentais.
O grupo controle negativo de DECHa com a transferência de apenas medula
óssea depletada de linfócitos T (MODT), apresentou uma sobrevida de 75%
ao longo de 12 semanas de acompanhamento (tempo esse suficiente para o
desenvolvimento da DECHa). Ao longo desse acompanhamento, os animais
foram pesados duas vezes por semana, gerando o gráfico de perda de peso
relativa ao peso inicial. Esse acompanhamento mostra uma perda de peso
inicial em todos os grupos associado à irradiação (Figura 8C).
Especificamente no grupo MODT, essa perda inicial é revertida e todos os
animais tendem a recuperar o peso inicial ao longo das semanas após o
transplante. Associado aos dados de sobrevida e perda de peso, os animais
foram analisados histo-patologicamente para confirmar a DECHa. Como essa
patologia acomete principalmente o trato gastro-intestinal, amostras de
97
intestino delgado foram incluídas em parafina e posteriormente coradas
com hematoxilina e eosina para observação em microscópio ótico. Os
resultados da figura 9A mostram que esse grupo que recebeu apenas MODT
não apresentam sinais característicos de DECHa como infiltrado
mononuclear e destruição de células epiteliais das criptas intestinais.
Já o grupo controle positivo de DECHa recebeu a transferência de
MODT e células de baço de animais controle separado por coluna de lã de
nylon (MODT + CELN). Estes animais apresentaram uma sobrevida
significativamente menor que o grupo anterior, com apenas 25% de animais
sobreviventes ao longo de 12 semanas de análise (Figura 8A). A figura 8C
mostra que esse grupo apresenta uma perda de peso irreversível, já que a
maioria deles morre ao longo do acompanhamento. Histo-patologicamente
(Figura 9B), apresentou um importante infiltrado mononuclear na lâmina
própria, com destruição das células epiteliais das criptas intestinais. O
terceiro grupo experimental (MODT + CELNG) confirmou os dados prévios
da literatura (Pan, Delmonte et al., 1995; Zeng, Dejbakhsh_Jones et al.,
1997) pois camundongos doadores tratados com G-CSF apresentaram uma
menor incidência de DECHa, verificada por sobrevida semelhante à do grupo
MODT (Figura 8A). Os dados de perda de peso dos animais desse grupo
apresentaram um padrão muito variável após a queda inicial, no entanto é
importante ressaltar que a maioria dos animais terminou por recuperar o
98
peso inicial (Figura 8C). Histo-patologicamente, os intestinos apresentaram
um infiltrado discreto, sem destruição da arquitetura do intestino delgado
(Figura 9C). Finalmente, a reversão da proteção após a eliminação dos
neutrófilos do CELNG (MODT + CELNG - G), mostrada através da morte de
todos os animais do grupo com apenas 2 semanas de acompanhamento,
sugere um papel primordial dessas células na proteção da DECHa. O
acompanhamento da perda de peso nesse grupo não foi possível devido à
morte acelerada de todos os animais (Figura 8C). Além desses resultados, a
análise do intestino desses animais demonstrou um intenso infiltrado de
células mononucleares na lâmina própria, com destruição importante de
células epiteliais presentes nas criptas intestinais (Figura 9D), com
ulcerações na camada epitelial. Todos esses resultados sugerem um papel
imuno-modulatório importante desses neutrófilos presentes no baço de
animais tratados com G-CSF, impedindo o desenvolvimento da DECHa.
99
Figura 8. O efeito protetor do baço de camundongos tratados com G-CSF é mediado por granulócitos de baixa densidade. Camundongos F1 de C57BL/6 x BALB/c foram letalmente irradiados e receberam medula óssea depletada de linfócitos T somente (MODT) ou associado a células esplênicas enriquecidas em linfócitos T por coluna de lã de nylon (MODT + CELN), ou ainda células esplênicas após coluna de lã de nylon de um camundongo tratado in vivo com G-CSF (MODT + CELNG) e, finalmente, o mesmo material anterior depletado de células Gr-1 positivas (MODT + CELNG – G). (A) Percentual de animais sobreviventes ao longo do tempo. Teste Log rank: P < 0.05 tanto entre MODT + CELNG e MODT + CELNG – G como entre MODT e MODT + CELN. (B) CELN de camundongos C57BL/6 foram analisadas por citometria de fluxo para a presença de células Gr-1 positivas em animais controles, tratados com G-CSF (CELNG) e tratados com G-CSF e após a depleção com Gr-1 (CELNG – G). Essas células foram marcadas com anti-Gr-1 FITC e analisadas por histogramas, como indicado no material e métodos. Os pequenos painéis são confirmações de depleção de granulócitos apenas por gráficos de tamanho x complexidade (note o desaparecimento de células de alta complexidade no gráfico CELNG – G). (C) Os camundongos de cada grupo foram pesados antes da irradiação e duas vezes por semana ao longo do acompanhamento pós-transplante. Em seguida foram calculados e os percentuais de perda de peso assinalados nos grupos MODT, MODT + CELN, MODT + CELNG e MODT + CELNG – G. Os dados mostrados são representativos de 2 experimentos com 4 a 5 animais por grupo de transplante.
2% 20%
B CELN CELNG – G
CELNG
MODT MODT + CELN MODT + CELNG MODT + CELNG – G
A
Semanas após o transplante
C
1%
Gr1MODT
0 10 20 30 40 50 60 7070
80
90
100
% p
erda
de
peso
MODT + CELN
0 10 20 30 40 50 60 7070
80
90
100
MODT + CELNG
0 10 20 30 40 50 60 7070
80
90
100
Dias após o transplante
MODT + CELNG - G
0 10 20 30 40 50 60 7070
80
90
100 C1C2C3C4C5
100
A
C
B
D
Figura 9. A histo-patologia confirma o papel imuno-regulatório das células Gr-1 positivas. Histo-patologia de intestine delgado. (A) Arquitetura das criptas intestinais mantida sem acúmulo de células inflamatórias na lâmina própria no grupo MODT. (B) Moderado infiltrado inflamatório de células mononucleares na lâmina própria (indicado por seta) associado a destruição de células epiteliais das criptas intestinais no grupo MODT + CELN. (C) Discreto infiltrado inflamatório na lâmina própria no grupo MODT + CELNG (indicado por seta). (D) Intenso infiltrado de células mononucleares com destruição de toda a arquitetura das criptas nos animais que receberam células de baço de camundongos tratados com G-CSF e depletados de granulócitos. Aumentos de 20x. Os dados são representativos de 2 experimentos com 4 a 5 animais por grupo.
MODT MODT + CELN
MODT + CELNG – GMODT + CELNG
101
4.4. Granulócitos de baixa densidade gerados in vitro inibem
completamente a DECHa
Como demonstrado anteriormente, os granulócitos gerados in vivo
pelo tratamento com G-CSF são responsáveis pela proteção ao
desenvolvimento da DECHa. Resta saber se essas células quando geradas in
vitro também serão capazes de inibir a doença.
Nossa pergunta nesse momento era: Os GBD gerados in vitro após o
tratamento com G-CSF são capazes de inibir o desenvolvimento da DECHa?
Repetiu-se o protocolo de transplante anterior, mas agora com os
seguintes grupos experimentais: O grupo MODT, controle negativo de
DECHa com reconstituição hematopoética. Nosso segundo grupo foi o
MODT + CELN, controle positivo de DECHa. E, finalmente, adicionamos os
GBD na proporção de 1:1 com os CELN ao grupo anterior, formando o novo
grupo MODT + CELN + GBD.
102
A MODT MODT + CELN MODT + CELN + GBD
Dias após o transplante
Semanas após o transplante
B
Figure 10. GBDs gerados in vitro inibem completamente a DECHa. Camundongos F1 de C57BL/6 x BALB/c letalmente irradiados foram reconstituídos apenas com MODT, ou MODT associado a CELN e MODT associado a CELN e GBD. (A) Percentual de animais sobreviventes ao longo do transplante. Teste Log rank: P < 0.05 entre MODT e CELN, P < 0.01 entre MODT + CELN + GBD e MODT e CELN. (B) Perda de peso percentual dos grupos MODT e MODT + CELN + GBD. Antes da irradiação e duas vezes por semana, os camundongos eram pesados e os resultados são calculados e graficados como percentuais de perda de peso em relação ao peso inicial. Os resultados são representativos de 2 experimentos de 4 a 5 animais por grupo.
MODT
0 10 20 30 40 50 60 7070
80
90
100
% p
erda
de
peso
MODT + CELN + GBD
0 10 20 30 40 5070
80
90
100 C1C2C3C4C5
103
A figura 10A, que representa a sobrevida dos animais ao longo do
período pós-transplante, mostra que 75 % dos animais transplantados
apenas com MODT sobreviveram num período de 8 semanas. Na mesma
figura percebe-se que o controle positivo de doença apresentou um padrão
semelhante ao do experimento anterior, com apenas 20 % dos animais
sobrevivendo ao transplante. Surpreendentemente, o nosso principal grupo
experimental MODT + CELN + GBD apresentou uma sobrevida superior ao
grupo MODT, com 100 % de sobrevivência após o transplante. Esses animais
foram acompanhados por mais tempo e apresentaram sobrevida superior a
um ano após o transplante, apresentando apenas despigmentação nos pelos
do dorso e ventre (dados não mostrados), fenômeno também evidenciado no
grupo MODT.
Adicionalmente, foi avaliado o peso dos animais do grupo MODT +
CELN + GBD. A figura 10B mostra a comparação entre esse grupo e o
gráfico anterior do grupo MODT. Percebe-se que o padrão de recuperação
de peso no grupo que recebeu os GBD é mais lento do que o que recebe
apenas medula óssea, mas fica evidente a tendência em todos os animais
rumo à recuperação do peso inicial.
A avaliação da histo-patologia desses animais nos mostrou resultados
ainda mais surpreendentes. Percebe-se na figura 11B que o intestino delgado
dos camundongos transplantados não apresentou nenhum infiltrado
104
significativo, na lâmina própria, com preservação do epitélio intestinal,
padrão histo-patológico compatível com o grupo MODT (Figura 11A e 9A).
4.5. A inibição da DECHa mediada por granulócitos requer
tratamento dos neutrófilos com G-CSF e histocompatibilidade
Nossos resultados até agora leva-nos a crer que granulócitos gerados
in vivo e in vitro com G-CSF impedem o desenvolvimento da DECHa. No
entanto, os experimentos in vitro da figura 7A levantam a hipótese de que
A B
Figure 11. A histo-patologia confirma que GBD gerados in vitro inibem completamente a DECHa experimental. Histo-patologia de intestino delgado. Preservação da estrutura de todo o epitélio intestinal e ausência de infiltrados de células mononucleares na lâmina própria em ambos os grupos MODT (A) e MODT + CELN + GBD (B). Aumentos de 20x. Os resultados são representativos de 2 experimentos com 4 a 5 animais por grupo.
MODT MODT + CELN + GBD
105
apenas GBD tratados com G-CSF são capazes de inibir a produção de IFN –g
por linfócitos T.
Nossa pergunta nesse momento era: Da mesma forma que in vitro, os
GAD serão incapazes de inibir a DECHa experimental?
Para responder a essa pergunta, foi realizado um experimento de
transplante com os seguintes grupos: MODT + CELN + GBD e MODT + CELN
+ GAD. Após 20 dias da transferência de células, todos os animais foram
eutanasiados e seus intestinos delgados foram analisados histo-
patologicamente. A figura 12A mostra, novamente, que o co-transplante de
GBD inibe a DECHa e apenas um infiltrado discreto é observado, sem
destruição tecidual. Já o grupo que recebeu granulócitos maduros não
tratados com G-CSF (GAD) apresentaram um intenso infiltrado mononuclear
com destruição do epitélio intestinal, compatível com DECHa (figura 12B).
Em seguida questionamos ainda a necessidade de compatibilidade
entre os neutrófilos co-transplantados e os linfócitos T. Para resolver essa
questão, foram transplantados dois grupos experimentais: MODT + CELN +
GBD e MODT + CELN + GBD A/J. Onde GBD de camundongos A/J foram co-
transplantados com células de baço separadas em coluna de nylon de B6.
Da mesma forma que o anterior, os animais foram analisados por
histo-patologia de intestino delgado, vinte dias após a transferência das
células. Na figura 12C, observa-se um intenso infiltrado mononuclear na
106
lâmina própria do intestino desses animais, mostrando a necessidade de
compatibilidade entre o doador/receptor e os granulócitos para a
evidenciação do papel imuno-modulador.
A B
C
Figure 12. A inibição da DECHa experimental requer ativação e histocompatibilidade dos granulócitos. Camundongos F1 de C57BL/6 x BALB/c irradiados receberam MODT + CELN + GBD de C57BL/6 (A), ou MODT + CELN + GAD também de C57BL/6 (B), ou ainda MODT + CELN + GBD de camundongos A/J (C). Depois de 20 dias do transplante todos os animais foram eutanasiados e realizou-se histo-patologia dos intestinos delgados. Nota-se um intenso infiltrado inflamatório na lamina própria dos animais que receberam GAD (B) e GBD A/J (C), indicados por setas. Aumentos de 20x. Os resultados são representativos de 2 experimentos.
MODT + CELN + GBD MODT + CELN + GAD
MODT + CELN + GBD A/J
107
5. Discussão
5.1. Contextualização
Atualmente o transplante de células-tronco hematopoética é
realizado com diferentes fontes de células-tronco: o aspirado de medula
óssea (TCTM), o sangue periférico de um indivíduo tratado com doses
subcutâneas de G-CSF (TCTP) e o sangue de cordão umbilical (SCU). Além
de diferentes concentrações de células-tronco (Cottler-Fox, 1996;
Horowitz, 1999), esses materiais são compostos por diversos outros tipos
celulares que podem apresentar funções diferentes num transplante
hematopoiético.
Comparando-se apenas os dois primeiros materiais, sabe-se que um
TCTM carreia consigo uma quantidade de linfócitos T por quilo do indivíduo
a ser transplantado, trinta vezes menor que um TCTP. Sabendo que essas
células são determinantes da incidência e morbidade causadas pela DECHa,
é de se esperarar um aumento dessa doença no TCTP. No entanto, os
estudos clínicos demonstram uma incidência semelhante de DECHa grau 2 a
4 entre os dois tipos de transplante (Przepiorka, Anderlini et al., 1997;
Ringden, Remberger et al., 1999; Bensinger, Martin et al., 2001; Korbling e
Anderlini, 2001), sugerindo um possível papel imuno-regulador do G-CSF.
108
5.2. Literatura
Esse achado clínico provocou a busca de um mecanismo imuno-
regulatório para o G-CSF e vários grupos apresentaram hipóteses baseados
em dados experimentais in vitro e in vivo.
Primeiramente, existe um único relato na literatura defendendo o
efeito direto do G-CSF sobre a célula T (Sloand, Kim et al., 2000). Essa
hipótese foi sustentada mesmo com a ausência de receptor para o fator de
crescimento, G-CSF, na membrana dos linfócitos, o que impediria a ação
direta deste. Desta forma, o maior número de relatos de células candidatas
a mediar a inibição concentra-se sobre os monócitos. Esses possuem
receptor para G-CSF e vários trabalhos demonstram alterações nessas
células após o tratamento com essa citocina (Ageitos, Varney et al., 1999;
Boneberg, Hareng et al., 2000; Nawa, Teshima et al., 2000). Estes
trabalhos propõem que a diminuição da expressão de moléculas co-
estimulatórias na membrana dos monócitos (Mielcarek, Martin et al., 1997)
faça com que a célula T receba apenas o primeiro sinal na ausência do
segundo, gerando anergia. Além da ausência de moléculas co-estimulatórias,
Mielcarek e colaboradores discutem o possível papel dos monócitos na
inibição da ativação linfocitária pela alta produção de IL-10 após o
109
tratamento com G-CSF (Mielcarek, Graf et al., 1998). Outra hipótese
defendida para o papel dos monócitos nesse sistema foram publicadas em
2000 por Boneberg e colaboradores (Boneberg, Hareng et al., 2000) e Nawa
e colaboradores (Nawa, Teshima et al., 2000), ambos demonstrando a
inibição da produção de IL-12 pelos monócitos.
Além desses dados em monócitos, foi descrito em 2000 por Arpinati
et al. que após o tratamento com G-CSF in vivo, ocorre uma mobilização para
o sangue periférico de células dendríticas do tipo DC2 (Arpinati, Green et
al., 2000). Com isso, eles propõe que o tratamento com G-CSF poderia
desviar a resposta dos linfócitos T para um padrão fenotípico Th2, que seria
protetor a DECHa.
Estes dados reforçam a hipótese levantada por Ferrara e
colaboradores (Pan, Delmonte et al., 1995), a partir de estudos em modelos
experimentais, segundo a qual o G-CSF desviaria a resposta de células T
para Th2. Hipótese esta que é atualmente a mais aceita na comunidade
científica.
Discutindo especificamente os achados do grupo do professor
Ferrara (Pan, Delmonte et al., 1995), os autores mostram em modelos
experimentais que doadores tratados in vivo com G-CSF apresentam menor
capacidade de desenvolver DECHa que doadores não tratados. Nesse ponto,
nosso grupo reproduziu completamente os resultados de seu estudo (Figura
110
8A). Com relação à histo-patologia, observamos que os animais do grupo
MODT + CELNG apresentaram um discreto infiltrado inflamatório na lâmina
própria que não se correlaciona com morte ao longo do acompanhamento.
Isso nos leva a postular que essas células possam ser linfócitos regulatórios
que não estão envolvidos com a agressão progressiva do intestino e, sim,
com o fenômeno protetor que confere a esse grupo uma sobrevivência de
75%.
Em seguida, o artigo demonstra que linfócitos CD4 e CD8 aumentam a
produção de IL-4 e diminuem a produção de IFN-g apenas em reações
mistas leucocitárias (MLR do inglês mixed leucocyte reaction) secundárias,
sendo as respostas primárias semelhantes entre os grupos que receberam
G-CSF e os que não foram tratados com essa citocina. É importante
ressaltar que os ensaios de MLR realizados nesse artigo tinham como
método a estimulação alogeneica por 48 horas, período em que os
granulócitos já estariam sofrendo apoptose (Vasconcelos, Santos et al.,
2003), fenômeno que se agravaria numa MLR secundária que certamente
transcorreu sem granulócitos. Dessa forma o desvio para Th2 percebido
pelo grupo nesse momento é compatível com os nossos dados, uma vez que
analisamos a produção de citocinas em momentos diferentes, com culturas
que possuem populações celulares distintas.
111
Finalmente, os autores reativaram in vitro as células esplênicas dos
camundongos recipientes 13 dias após o transplante. O sobrenadante dessa
reativação com concanavalina A, apresentou um aumento da concentração de
IL-4 e diminuição da concentração de IFN-g no grupo de animais que
recebeu células de um doador tratados com G-CSF quando comparado ao
grupo que recebeu células de um doador não tratado. Novamente, a
avaliação da produção de citocinas pelos linfócitos, foi realizada num
período, que certamente os granulócitos transferidos já estariam ausentes.
Dessa forma, o desvio para Th2 não é incompatível com os nossos achados e
pode ser importante para a manuntenção da tolerância à longo prazo,
diferentemente dos nossos achados que poderiam permitir o controle da
fase 1 da DECHa.
Enfim, os dados do grupo do professor Ferrara, sugerem que
realmente existe um desvio de padrão fenotípico de resposta de linfócitos
T após o tratamento com o G-CSF; no entanto, não foi diretamente
demonstrada a relação direta entre o fenômeno e a inibição da DECHa. Por
outro lado, não foram realizados experimentos com camundongos
deficientes em IL-4, para demonstrar um papel decisivo para essa citocina
no controle da DECHa, nesse modelo específico. Por outro lado, nossos
dados são totalmente compatíveis com os resultados encontrados pelo grupo
do professor Ferrara, uma vez que a prevenção da DECHa mediada por GBD
112
permite a ativação posterior dos linfócitos por células dendríticas do tipo
DC2, citadas anteriormente, resultando na geração de um aumento na
produção de citocinas Th2 evidenciados nesse artigo.
Essa hipótese, amplamente aceita, surge como a principal explicação
do paradoxo aparente representado pelo sucesso do transplante alogeneico
de sangue periférico mobilizado com G-CSF, pois este em princípio, deveria
ser um péssimo produto para a finalidade de transplantes, pois carreia um
número 30 vezes maior de linfócitos T maduros do que o encontrado no
aspirado de medula óssea, e deveria acarretar numa incidência e gravidade
maior da DECHa. No entanto, quando foram iniciados protocolos de
transplante desse tipo, a incidência de DECHa se mostrou muito semelhante
nos dois casos (Przepiorka, Anderlini et al., 1997; Ringden, Remberger et al.,
1999; Bensinger, Martin et al., 2001; Korbling e Anderlini, 2001). Associando
este dado clínico ao fato experimental de que células Th2 são incapazes de
gerar doença aguda (Fowler, Kurasawa et al., 1994), Pan e colaboradores
sustentam a teoria de desvio de fenótipo de ativação linfocitária após o
tratamento com o G-CSF como mecanismo para a proteção da DECHa nos
TCTP (Pan, Delmonte et al., 1995).
O mesmo fenômeno de desvio de fenótipo foi demonstrado
posteriormente, em humanos, por Sloand e colaboradores em 2000 (Sloand,
Kim et al., 2000). Nesse artigo, foi demonstrado que a frequência de células
113
produtoras de citocinas Th2 é aumentada após o tratamento com G-CSF em
células humanas. Esse dado está em desacordo com os nossos achados em
humanos, mas o protocolo de ativação dos linfócitos nesse caso foi em 48
horas com fitohemaglutinina, tempo que impediria a ação dos GBDs, como já
tivemos oportunidade de demonstrar no contexto de reações mistas
leucocitárias, em ensaios que envolviam descanso por 48 horas antes da
reativação in vitro (Vasconcelos, Santos et al., 2003). Nesse artigo ainda
existe uma proposta de ação direta do G-CSF sobre os linfócitos in vitro.
5.3. Dados prévios do laboratório
Nosso grupo já havia demonstrado anteriormente, em humanos, que o
tratamento com G-CSF in vivo e in vitro, gera granulócitos de baixa
densidade (GBD). Demonstramos, ainda, que essas células têm função
inibitória sobre linfócitos T in vitro (Vasconcelos, Santos et al., 2003),
especificamente impedindo a produção de IFN-g e IL-4 por linfócitos CD3+.
Esses dados se opunham à literatura da época, tanto em modelos murinos
(Pan, Delmonte et al., 1995) como em humanos (Sloand, Kim et al., 2000),
uma vez que esta defendia um desvio de padrão de resposta de linfócitos ao
fenótipo Th2 após o tratamento in vivo com G-CSF.
114
Mesmo com os nossos resultados iniciais sendo contraditórios aos
dados murinos de outros grupos, perguntamos se os GBD gerados in vivo e in
vitro em humanos também poderiam ser gerados no modelo experimental, e,
em caso positivo, se poderíamos avaliar a capacidade dessas células como
imuno-moduladoras da DECHa experimental.
5.4. Os dados atuais
Estudamos a geração in vivo e in vitro de GBD em camundongos
C57BL/6. A escolha dessa linhagem foi vinculada à posterior utilização
desses animais como doadores para o modelo de DECHa experimental.
A figura 6a mostra que o baço dos animais apresenta cerca de 20%
de GBD após o tratamento com 5 doses de rhG-CSF. Essas células
apresentam morfologia e fenótipo compatível com neutrófilos maduros. O
tratamento in vitro com G-CSF também é capaz de gerar granulócitos de
baixa densidade a partir de neutrófilos maduros separados por gradiente de
Ficoll, tanto de baço (figura 6b) como de medula óssea (Figura 6c).
A medula óssea apresentava maior rendimento final de GBD, uma vez
que o número de granulócitos presentes na medula é maior que no baço
desses animais. Este fato é extremamente importante, uma vez que
tínhamos a intenção de transferir essas células em um modelo de
transplante. Mesmo com essa vantagem numérica, por se tratar de um
115
tecido hematopoiético, existia a possibilidade de contaminação da
preparação com granulócitos imaturos. Para descartar a presença de
granulócitos imaturos, foi realizada a marcação das células Gr-1 com SCA-1,
e a grande maioria das células Gr-1 presentes após o protocolo de geração
de GBD são SCA-1 negativos. A semelhança entre estes GBD provenientes
da medula óssea e os granulócitos obtidos de baço possibilitou a utilização
da MO para geração de GDB e, posteriormente, para os testes in vivo.
O passo seguinte seria a demonstração que essas células seriam
capazes de inibir a produção de citocinas em linfócitos T. Para responder
essa pergunta, co-cultivamos essas células com linfócitos provenientes de
linfonodos mesentéricos, e demonstramos que apenas na presença de GBD a
inibição ocorre. Nesse experimento, definimos ainda que o mecanismo de
inibição também é dependente da produção de peróxido de hidrogênio
(figura 7a).
Vários artigos discutem a indução de apoptose após a exposição ao
peróxido de hidrogênio (Hampton e Orrenius, 1997; Avula e Fernandes,
2002). Por outro lado, outros relatos demonstraram que o estresse
oxidativo crônico iniciado por baixas concentrações de peróxido de
hidrogênio não induz morte, mas modifica a produção de citocinas por
linfócitos (Lahdenpohja, Savinainen et al., 1998; Malmberg, Arulampalam et
al., 2001) ao inativar o fator de transcrição NF-kB, impedindo a
116
translocação deste para o núcleo e, consequentemente, bloqueando a
transcrição de vários genes de citocinas. Nossos dados levam a crer que a
produção de peróxido de hidrogênio pelos GBDs se encontra nessa janela de
concentração que não induz apoptose, pois a marcação com annexina V e
iodeto de propídeo não foi aumentada após o co-cultivo de GBD com
linfócitos (figura 7b). Além disso, o H2O2, por ser quimicamente semelhante
à água, atravessa livremente as membranas celulares e alcança intra-
celularmente o linfócito T (figura 7c).
Todos esses dados somados, permitem dizer que o modelo
experimental apresenta a mesma capacidade de geração dos neutrófilos de
baixa densidade com a mesma capacidade funcional demonstrada nos
estudos com doadores humanos.
Em relação ao modelo experimental, optamos pelo modelo de
transferência de células do camundongo parental C57BL/6 em um
camundongo F1 de (C57BL/6 x BALB/c) dentre os vários modelos existentes
para DECHa experimental (Hakim, Fowler et al., 1998; Korngold e Sprent,
1999). Esse modelo foi escolhido pela disponibilidade dos camundongos no
nosso biotério associado a alguns parâmetros de interesse como: a) o
camundongo C57BL/6 apresenta uma predominância de resposta Th1 em
diversos modelos experimentais de doença (Karupiah, 1998; Ulett,
Ketheesan et al., 2000; Alexander e Bryson, 2005); e b) o transplante em
117
camundongos F1 avalia exclusivamente a DECHa, sem a interferência da
resposta imunológica do hospedeiro.
Reproduzimos os dados já conhecidos da literatura que
demonstravam uma proteção contra o desenvolvimento da DECHa, quando o
doador era pré-tratado com G-CSF (Pan, Delmonte et al., 1995; Zeng,
Dejbakhsh_Jones et al., 1997). Nesses artigos, os autores discutiam que a
possível regulação era decorrente de um desvio da maturação funcional dos
linfócitos para um fenótipo Th2. No entanto, percebemos que após o
tratamento in vivo com G-CSF ocorre um acúmulo de granulócitos no baço
desses animais. Mais importante que isso, esses granulócitos não ficam
retidos na coluna de lã de nylon utilizada para enriquecimento de linfócitos
T. Com isso havia a possibilidade de que a diferença da mortalidade
associada ao G-CSF pudesse ser causada apenas pelo menor número de
linfócitos T transferidos do animal tratado com G-CSF para o receptor
irradiado. Para descartar essa possibilidade, fizemos a separação por coluna
de lã de nylon e posteriormente ajustamos a concentração de linfócitos T
de modo que todos os recipientes fossem submetidos ao mesmo inoculo de
linfócitos T. Percebe-se na figura 8 que o fenômeno de proteção se mantém
e que os animais que receberam células do baço de um animal tratado
previamente com G-CSF (CELNG) têm uma maior sobrevida, assim como
menor perda de peso que os animais que receberam CELN. Para testar o
118
papel dos granulócitos na inibição da DECHa, retiramos os neutrófilos Gr-1
positivos do grupo CELNG. Surpreendentemente, o grupo CELNG-G
apresentou uma curva de sobrevida ainda menor que o controle positivo de
doença, com morte de todos os animais ainda na segunda semana após a
transferência. Esse dado leva-nos a pensar que a proteção conferida ao
receptor é associada à presença dessa células Gr-1 positivas e que a
retirada delas aumenta o potencial aloreativo dos linfócitos co-existentes
nesse baço. Pode-se supor que mesmo no animal que nunca foi tratado com
G-CSF co-existam algumas células Gr-1 positivas que limitam o processo
aloreativo e consequentemente a morte aguda de todos os animais, enquanto
que nos animais depletados de células Gr-1 ocorre o licenciamento de todos
os linfócitos aloreativos contra o hospedeiro imuno-incompetente.
Quando avaliamos a histo-patologia dos animais transplantados nesse
experimento (figura 9), verificamos um padrão de infiltrado difuso
presente no animal transplantado com CELNG. Resultado também
inesperado uma vez que o artigo que apresenta o primeiro e mais importante
relato do G-CSF como imuno-modulador de DECHa experimental não
apresenta a histo-patologia (Pan, Delmonte et al., 1995). Mesmo com este
infilitrado, os animais sobrevivem ao transplante de forma similar aos
animais transplantados apenas com medula óssea.
119
Sabendo que os granulócitos provenientes de animais tratados in
vitro com G-CSF eram capazes de inibir a DECHa, objetivamos desenvolver
um protocolo de prevenção através da administração de GBD gerados in
vitro. Neutrófilos de MO foram tratados com G-CSF in vitro, e selecionados
de acordo com a propriedade de perder densidade após esse tratamento
com um gradiente de densidade (e se tornarem GBD). Os GBDs assim
gerados foram co-infundidos com as CELN. O resultado desse experimento
foi além de nossas expectativas e demonstramos um papel crucial dos GBD
na prevenção do desenvolvimento da DECHa. A presença dessas células no
momento da transferência dos linfócitos impede completamente o
desenvolvimento da doença em todos os parâmetros avaliados. Dentre os
dados gerados, a sobrevida dos animais transplantados com GBD era
superior ao transplantado apenas com medula óssea. Esse dado levanta a
possibilidade não apenas de inibir a alo-reatividade mediada por linfócitos
T, mas também do sucesso do estabelecimento da quimera à longo prazo,
sucesso este que não pôde ser alcançado apenas com a transferência de
células de medula óssea. Uma das possibilidades seria a proteção contra a
infecção conferida pelos granulócitos co-transplantados. Outra
possibilidade seria o papel facilitador do estabelecimento da célula tronco
hematopoética dado pela presença de linfócitos T, tanto no posto de vista
de uma rejeição mediada por células imunocompetentes residuais do
120
tratamento quimio/radioterápico (Maraninchi, Gluckman et al., 1987),
quanto pela produção de mediadores que participem da reconstituição
hematopoética (Monteiro, Benjamin et al., 2005).
Quando analisamos a histo-patologia dos animais co-transplantados
com GBD (figura 11), percebemos que toda a arquitetura das criptas
intestinais foi mantida e não se percebe nenhum infiltrado significativo na
lâmina própria, corroborando os dados da figura 10.
Para nos certificarmos de que o efeito observado era decorrente de
granulócitos de baixa densidade pré-tratados com G-CSF, testamos in vivo a
capacidade de granulócitos não tratados com G-CSF, e, portanto de alta
densidade,(GAD) de prevenir o desenvolvimento da DECH. De fato, havíamos
mostrado nos estudos com doadores humanos que GADs não inibem a
produção de IFN-g por linfócitos T. No modelo experimental estas células
não tiveram qualquer efeito protetor. Apesar da correlação entre os dados
in vitro e in vivo, não existe nenhuma evidência que a inibição da produção de
citocinas por linfócitos seja o mecanismo regulatório in vivo.
A possibilidade da utilização de GBD na prática clínica nos levou a
testar a necessidade de compatibilidade entre doador de GBD e o par
doador/receptor do transplante. Isto porque, na transfusão de granulócitos
comumente utilizada para o tratamento de pacientes neutropenicos com
infecções refratária a antibioticoterapia não se respeita compatibilidade
121
HLA, nem ABO (quando indisponível no banco de sangue) (Adkins, Goodgold
et al., 1997; Adkins, Spitzer et al., 1997; Oza, Hallemeier et al., 2006). Para
nossa surpresa, em nosso caso é imperativa a compatibilidade entre doador
de linfócitos/MO e GBD (figura 7). No entanto, esses dados são
extremamente difíceis de serem analisados, uma vez que abrem um leque de
possibilidades: A primeira questão é sobre a possibilidade de citotoxicidade
mediada por células do doador sobre os GBD do A/J, impedindo a ação
imunosupressora direta, caso ela seja o mecanismo; outra possibilidade seria
a citotoxidade mediada por células do próprio receptor, que nesse caso é
aloreativo. Existia ainda uma última possibilidade, já parcialmente
descartada pelo nosso grupo, da restrição por MHC na atividade supressora
mediada por esses GBD. Em experimentos, in vitro, conduzidos com
diferentes GBD gerados em BALB/C e C57BL/6, foi demonstrado que a
inibição da produção de citocinas ocorre tanto em linfócitos T de BALB/C e
C57BL/6 com seus respectivos GBD e com os GBD trocados (Areal, 2007).
Diante desses dados, pode-se afirmar que encontramos uma
possibilidade de controle do desenvolvimento da DECHa experimental
mediado por neutrófilos tratados com G-CSF. Mas é importante ressaltar
que nosso grupo não foi pioneiro em demonstrar atividade imuno-regulatória
mediada por neutrófilos, pois existem diversos relatos na literatura com
neutrófilos imaturos sendo mediadores de imuno-supressão (Almand, Clark
122
et al., 2001; Gabrilovich, Velders et al., 2001; Kusmartsev, Nefedova et al.,
2004). No entanto, esses neutrófilos supressores são descritos em modelos
de tumor, onde ocorre um acúmulo espontâneo dessas células no baço dos
animais e a retirada delas permite a resolução do tumor. Além do fato de
que nossas células não são geradas espontaneamente, nossos neutrófilos
apresentam fenótipo e morfologia diferentes dos citados, inclusive com
núcleo em rosca o que define um grau de maturação terminal nessas células.
Outro relato, diferente do papel imuno-regulatório de células
mielóides supressoras descritas anteriormente, foi realizado por Zehntner
em 2005. Neste artigo foi demonstrado o papel inibitório de neutrófilos
maduros sobre linfócitos em um modelo experimental de encefalomielite
alérgica (Zehntner, Brickman et al., 2005). Neste modelo os neutrófilos
apresentaram mecanismos inibitórios sobre a proliferação e atividade de
linfócitos T dependente da produção de óxido nítrico.
5.5. Hipóteses
Nosso grande desafio agora é tentar responder, de forma
organizada, algumas perguntas que foram geradas com esses dados.
Primeiramente, é importante ressaltar que o mecanismo envolvido no
controle do desenvolvimento da DECHa nesse modelo deve residir na fase I
123
da pato-fisiologia da doença, fase onde todos os fatores convergem para a
ativação do linfócito T, que representa o início da segunda fase da patologia.
Minha afirmativa é baseada principalmente na meia-vida do granulócito, que
no transplante em humanos é de 24 horas, quando o mesmo foi tratado com
G-CSF (dados não mostrados). Ainda em humanos, já havíamos demonstrado
que in vitro essas células têm meia-vida de 48 horas em cultura. Dessa
forma, se o granulócito exerce alguma função ativa sobre alguma célula
envolvida no estabelecimento da resposta alo-reativa, a mesma deve ocorrer
nesse período de 2 dias (Vasconcelos, Santos et al., 2003).
Este dado sozinho, da ação mediada nas primeiras horas, se
determinante de todo o processo que foi acompanhado por 60 dias, já
levantam dúvidas a serem respondidas com experimentações futuras.
Relatos da literatura apontam para essa possibilidade, como os de Xun e
colaboradores, que demonstraram que a transferência de linfócitos com
atraso de 4 dias após a transferência da medula óssea diminuiu em 40 % a
mortalidade dos animais (Xun, Tsuchida et al., 1997). Este dado é reforçado
pela observação, em seres humanos, de que a infusão de linfócitos de
doador em caso de recaída pós-transplante apresentar menor incidência de
DECH que o mesmo número de linfócitos sendo infundido no momento do
transplante (Johnson, Becker et al., 1999). Diante disso, a primeira
pergunta que surge é: qual o possível papel dos GBDs em conter as etapas do
124
processo inflamatório inicial, descrito nas primeiras 72 horas após à
irradiação (Hill, Crawford et al., 1997; Cooke, Hill et al., 1998). Dentre
essas etapas, a produção de citocinas inflamatórias, capacita a plena
ativação dos linfócitos T do doador (Ferrara, 1998). Essa ativação permite a
produção de IFN-g, mediadora da DECHa, que amplificaria a ativação inicial
das células apresentadoras de antígeno do hospedeiro. Na presença dos
GBDs, os linfócitos seriam impedidos de produzir essa citocina diminuindo a
alça amplificadora da inflamação. No entanto, esses linfócitos, como
provavelmente apresentam meia-vida superior aos GBDs, estariam “prontos”
e licenciados para uma reação alo-reativa num segundo momento
inflamatório qualquer na ausência desses granulócitos. Dessa forma, um dos
experimentos propostos seria a indução de um segundo processo
inflamatório tardio, após 48 horas da transferência das células, sendo esse
resultado um possível esclarecedor do mecanismo como ativo e importante
nessa fase. Um dado clínico que indica que esse fato é possível, é a
manutenção da incidência da DECHc nos pacientes que recebem TCTP,
inclusive com doenças mais refratárias ao tratamento, nos pacientes que
receberam o TCTP, quando comparados aos que receberam o TCTM
(Flowers, Parker et al., 2002). Ou seja, se essa doença for causada por
linfócitos previamente infundidos, mas silenciados pelos neutrófilos, um
125
segundo momento de ativação como uma infecção viral poderia deflagrar um
processo alo-reativo.
Uma segunda hipótese seria a possibilidade de geração de células T
regulatórias decorrentes da interação desses neutrófilos com células
apresentadoras de antígenos originárias do recipiente, células que já se
mostraram capazes de controlar à DECHa (Hoffmann, Ermann et al., 2002;
Taylor, Lees et al., 2002; Jones, Murphy et al., 2003). Esses linfócitos T
reguladores poderiam ser células do doador, que ao interagir com células
apresentadoras de antígeno do recipiente, modificadas diretamente pela
interação com os GBD, seriam desviadas para um fenótipo imuno-regulador,
apresentando especificidade para os antígenos alogeneicos. Nessa hipótese,
uma reativação do sistema não seria capaz de gerar novamente a DECHa,
mas a transferência dessas células regulatórias para um hospedeiro recém-
transplantado deveria controlar o desenvolvimento da DECHa. A
confirmação dessa hipótese levaria a crer que, no caso de desenvolvimento
da DECHc descrita acima, a pato-fisiologia da doença necessariamente
deveria ser completamente diferente, sendo gerada por linfócitos T
selecionados “erroneamente” num timo prejudicado pelo transplante
(Sakoda, Hashimoto et al., 2007; Zhang, Hexner et al., 2007). A DECHc
nesse caso deve também ser desencadeada em alvos teciduais diferentes
das especificidades de células regulatórias geradas no início do transplante,
126
permitindo a ativação de novos linfócitos T em áreas “pobres” em células T
regulatórias alo-específicas.
Existe ainda a possibilidade de corpos apoptóticos desses neutrófilos
serem responsáveis pela inativação das células apresentadoras de antígeno
do receptor, mecanismo já demonstrado em modelos experimentais como
capaz de controlar a DECHa (Bittencourt, Perruche et al., 2001; Kleinclauss,
Perruche et al., 2006). No entanto, nossos dados com GAD e GBD de A/J
indicam que esse mecanismo provavelmente não está envolvido. A única
possibilidade, de esse mecanismo ser efetivo depende da migração
diferencial entre os neutrófilos tratados com G-CSF e não tratados (desde
que se acredite que os GBD de A/J realmente foram mortos). Nesse caso,
os GBD alcançariam micro-ambientes dentro do hospedeiro inatingíveis aos
GAD. Essas perguntas associadas ao exato mecanismo de ação dos
granulócitos passam então pela localização e, posteriormente, na co-
localização desses neutrófilos com os linfócitos T.
Para responder essas perguntas, nosso grupo já está realizando
experimentos com GBD marcados por fluorescência, com demonstrações da
migração dessas células para o intestino dos camundongos. Evidenciou-se
ainda que os GAD têm o mesmo padrão migratório, descartando a
possibilidade de migração diferencial.
127
Fica ainda a dúvida da co-localização dos linfócitos T com os
granulócitos, uma vez que a correlação das atividades in vitro com as
demonstrações in vivo depende desta resposta. No entanto, testar esta
hipótese é difícil, tendo em vista a demonstração em modelos experimentais
de DECHa de que os linfócitos responsáveis pela alo-reatividade são
linfócitos virgens (Chen, Cui et al., 2004; Beilhack, Schulz et al., 2005)
ativados em placa de Peyer e/ou em linfonodos mesentéricos (Murai,
Yoneyama et al., 2003) os quais após 3 dias de ativação, migram para os
sítios inflamatórios (Murai, Yoneyama et al., 2003; Beilhack, Schulz et al.,
2005). Essa cinética é incompatível com a meia-vida dos neutrófilos em
humanos, restando ao grupo conhecer a meia-vida real dos GBD murinos.
Finalmente, a hipótese mais defendida pelo grupo nesse momento
seria o papel dos GBD na imunidade de mucosa, durante o processo de
transplante de células-tronco hematopoiéticas. Como mencionado na
introdução, já está bem estabelecido na literatura que a flora comensal
presente no trato gastro-intestinal tem um papel direto no estabelecimento
da DECH tanto em modelos animais (Cooke, Hill et al., 1998; Cooke, Gerbitz
et al., 2001) como em humanos (Gerbitz, Schultz et al., 2004). Além desses
dados, recentemente foi descrito que o polimorfismo de nucleotídeo único
no sensor de dipeptídeo de muramil (NOD2/CARD15), um componente da
parede bacteriana, é uma variável independente de mortalidade relacionada
128
ao transplante (Holler, Rogler et al., 2004). Esse sensor é um receptor
intracelular, envolvido no reconhecimento de patógenos e regulação da
ativação de NF-kB, presente em células epiteliais intestinais e
monócitos/macrófagos. Esse polimorfismo já havia sido associado à doença
de Crohn (Ogura, Bonen et al., 2001), que é uma doença inflamatória
intestinal com uma pato-fisiologia semelhante à da DECHa. Nesse caso, o
mesmo polimorfismo foi associado a um aumento da incidência da DECHa em
humanos, quando presente apenas no doador, apenas no receptor e, ainda
mais associada, se presente em ambos. Discute-se nesse relato a análise
desse polimorfismo para escolha de doadores, principalmente no caso de
doadores não-relacionados.
Além desses dados, outros estudos experimentais demonstraram que
ocorrem translocações de bactérias para órgãos linfóides periféricos como
linfonodos mesentéricos e a quantificação destas é correlacionada com a
incidência de DECHa (Holler, Rogler et al., 2004). Ainda neste mesmo
artigo, os autores defendem o tratamento profilático com pró-bióticos,
como lactobacilos, para prevenir a DECHa, postulando a existência de flora
protetora e indutora de doença. Essa hipótese já foi confirmada em
modelos experimentais de colite induzida pelo ácido 2,4,6-trinitro benzeno
sulfônico (TNBS do inglês 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid), onde células
dendríticas foram tratadas in vitro com L. salivarius e L. rhamnosus e
129
posteriormente transferidas intra-peritonealmente para camundongos.
Nesse modelo, ficou demonstrada a proteção ao desenvolvimento de colite
num mecanismo dependente de NOD2 e a partir de geração de células T
regulatórias in vivo (Foligne, Zoumpopoulou et al., 2007).
Todos esses dados associados permitem postular que esses GBD são
capazes de diminuir a disponibilidade de LPS ou ainda outros componentes
bacterianos indutores da DECHa. Alguns experimentos estão em andamento
nessa direção e já existem resultados demonstrando uma maior capacidade
fagocítica dos GBD quando comparada aos GAD. Além desses resultados, os
GBD apresentaram maior atividade oxidativa quando comparada aos GAD,
dado importante se pensarmos na capacidade de eliminação completa da
bactéria contra apenas a capacidade fagocítica dessas células.
5.6. Perspectivas
Além de todos os experimentos sugeridos anteriormente, nosso grupo
está diretamente envolvido com um ensaio clínico para utilização dessas
células como imuno-moduladoras da DECHa em humanos. Para viabilizar esse
ensaio clínico, estamos realizando uma padronização para geração dessas
células em larga escala com qualidade funcional e sem riscos para o paciente.
130
Nesta padronização será avaliado a capacidade inibitória de
neutrófilos maduros gerados in vivo após o tratamento de um doador com
dose única de G-CSF. Além dessa avaliação, será questionada a necessidade
de separação dessas células baseadas nas propriedades de densidade
descritas anteriormente pelo grupo, ou se a população neutrofílica total
colhida por aférese é suficiente para o protocolo clínico posterior.
A proposta do protocolo clínico é co-transplantar essas células com
aspirados de medula óssea, desejando que elas impeçam o desenvolvimento
da DECHa, sem os efeitos deletérios da DECHc refratária que ocorrem
após o TCTP (rico em granulócitos tratados com G-CSF). Algumas evidências
na literatura indicam que esse protocolo possa ter sucesso, como o relato de
Morton e cols (Morton, Hutchins et al., 2001), utilizando medula óssea de
um doador tratado previamente com G-CSF. Nesse caso houve diminuição de
DECHa sem aumento da DECHc. Deve-se levar em consideração ainda nesse
relato que não houve aumento de recaídas após o transplante, indicando uma
manuntenção do efeito ECL.
Mesmo com esses resultados promissores do grupo do Morton, temos
consciência em nosso grupo de que experimentos envolvendo a avaliação do
efeito enxerto contra leucemia (ECL) em modelos experimentais devem ser
realizados no mesmo modelo descrito na tese.
131
Finalizando, o transplante de células-tronco hematopoiéticas
alogeneico ainda apresenta uma barreira até agora intransponível, a barreira
imunológica conhecida como DECHa. Diversos grupos de pesquisa clínica e
experimental buscam soluções para solucionar esse problema. Nas pesquisas
clínicas os sucessos foram acompanhados de efeitos colaterais importantes,
como recaída aumentada ou falência hematopoética, enquanto que os
estudos em modelos murinos utilizam estratégias elaboradas que dificultam
a aplicação clínica. Esperamos que estratégias celulares simples como a
nossa possam contribuir para o controle da DECHa sem detrimento de
efeitos desejados e necessários para o sucesso dessa terapia, como a
enxertia a longo prazo e o efeito enxerto contra leucemia.
132
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7. Anexo – Artigos Publicados
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