ESTUDO DA DETECÇÃO DO DNA DO PAPILOMAVÍRUS ESTUDO DA DETECÇÃO DO DNA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA HUMANO (HPV) E DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR NO CARCINOMA DE PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORALEPIDERMÓIDE ORAL

Doutoranda:Rosilene Calazans SoaresDoutoranda:Rosilene Calazans Soares

Orientador: Prof. Titular Dr. Leão Pereira PintoOrientador: Prof. Titular Dr. Leão Pereira Pinto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

REVISÃO DA LITERATURAREVISÃO DA LITERATURA• Carcinoma epidermóide oralCarcinoma epidermóide oral

– Aspectos geraisAspectos gerais– EtiologiaEtiologia

• Papilomavírus humano (HPV)Papilomavírus humano (HPV)– 130 tipos já identificados130 tipos já identificados– Regiões do genomaRegiões do genoma– Transformação celular:Transformação celular:

• Proteína E6 + p53Proteína E6 + p53• Proteína E7 + pRbProteína E7 + pRb

– Classificação:Classificação:• Grupos clínicos patológicosGrupos clínicos patológicos• Grau de risco para transformação malignaGrau de risco para transformação maligna

-Zur Hausen et al. (1996)

-Pereyra, Guerra, Villa (1997)

-Iamaroon et al. (2004)

REVISÃO DA LITERATURAREVISÃO DA LITERATURA

• Ciclo celularCiclo celular– CDKs, CKIs, ciclinasCDKs, CKIs, ciclinas– p21: membro da família dos CKIsp21: membro da família dos CKIs– pRb: gene supressor tumoralpRb: gene supressor tumoral– p21 x pRbp21 x pRb– Estudos imuno-histoquímicos em CEOEstudos imuno-histoquímicos em CEO

-Regezi et al. (1999)

-Nakahara et al. (2000)

-Piattelli et al. (2002)

-Shintani et al. (2002)

REVISÃO DA LITERATURAREVISÃO DA LITERATURA ESTUDOS DO HPV EM CEOESTUDOS DO HPV EM CEO

• Miguel et al. (1998):Miguel et al. (1998):– 45 amostras de CECP (21 de CEO)45 amostras de CECP (21 de CEO)– 5/45 (11%) HPV+ (1 caso de CEO)5/45 (11%) HPV+ (1 caso de CEO)

• Summersgill et al. (2000):Summersgill et al. (2000):– 58/202 (28,7%) amostras HPV+58/202 (28,7%) amostras HPV+

• Chen et al. (2002):Chen et al. (2002):– 24/29 (85,7%) amostras HPV+24/29 (85,7%) amostras HPV+

• Ha et al. (2002):Ha et al. (2002):– 1/34 (2,9%) amostras HPV+1/34 (2,9%) amostras HPV+

• Sugiyama et al. (2003):Sugiyama et al. (2003):– 30/86 (35%) amostras HPV+30/86 (35%) amostras HPV+

REVISÃO DA LITERATURAREVISÃO DA LITERATURA• Correnti et al. (2004):Correnti et al. (2004):

– 8/16 (50%) amostras HPV+8/16 (50%) amostras HPV+• Braakhuis et al. (2004):Braakhuis et al. (2004):

– 12/106 (11,3%) amostras HPV+12/106 (11,3%) amostras HPV+• Ibieta et al. (2005):Ibieta et al. (2005):

– 21/50 (42%) amostras HPV+ 21/50 (42%) amostras HPV+ • Azzimonti et al. (2004):Azzimonti et al. (2004):

– pRb x CECP x HPVpRb x CECP x HPV– 21/36 (58,3%) amostras HPV+21/36 (58,3%) amostras HPV+– 28/36 (77,7%) pRb+ (Imuno-histoquímica)28/36 (77,7%) pRb+ (Imuno-histoquímica)– pRB x HPV: 21 HPV+/18 pRb+ e 15 HPV-/10 pRb+pRB x HPV: 21 HPV+/18 pRb+ e 15 HPV-/10 pRb+

PROPOSIÇÃOPROPOSIÇÃO

Diante da possibilidade de relação do HPV Diante da possibilidade de relação do HPV com o CEO nos propomos investigar o DNA do com o CEO nos propomos investigar o DNA do HPV nessa lesão, com o intuito de obter-se HPV nessa lesão, com o intuito de obter-se informações inerentes ao comportamento informações inerentes ao comportamento biológico do CEO. Além disso, pretendeu-se biológico do CEO. Além disso, pretendeu-se realizar uma análise comparativa entre os grupos realizar uma análise comparativa entre os grupos de CEO HPV+ e HPV-, empregando-se de CEO HPV+ e HPV-, empregando-se marcadoresmarcadores do ciclo celulardo ciclo celular, , a fim de estabelecer a fim de estabelecer possível correlação entre a expressão IHQ dessas possível correlação entre a expressão IHQ dessas proteínas e a infecção pelo HPV em carcinoma proteínas e a infecção pelo HPV em carcinoma epidermóide oral.epidermóide oral.

MATERIAL E MÉTODOSMATERIAL E MÉTODOS

• Caracterização do estudoCaracterização do estudo• PopulaçãoPopulação• AmostraAmostra

– Tecido emblocado em parafina de 90 espécimes de Tecido emblocado em parafina de 90 espécimes de CEOCEO

– Critério de inclusãoCritério de inclusão• Estudo morfológicoEstudo morfológico• Extração do DNAExtração do DNA

– Técnica do acetato de amônia-isopropanolTécnica do acetato de amônia-isopropanol• Reação em cadeia da polimerase (PCR):Reação em cadeia da polimerase (PCR):

– Utilizando o par de Utilizando o par de primersprimers PCO3+/PCO4+ PCO3+/PCO4+– Utilizando o par de Utilizando o par de primersprimers GP5+/GP6+ GP5+/GP6+

MATERIAL E MÉTODOSMATERIAL E MÉTODOS

• Eletroforese em gel de agarose e Eletroforese em gel de agarose e marcação pelo brometo de etídiomarcação pelo brometo de etídio

• Tipagem para HPVs por hibridização Tipagem para HPVs por hibridização dot dot blotblot– Sondas radioativas para 19 tipos de HPVsSondas radioativas para 19 tipos de HPVs

• Estudo imuno-histoquímicoEstudo imuno-histoquímico– Técnica da estreptoavidina-biotinaTécnica da estreptoavidina-biotina– Análise do perfil imuno-histoquímicoAnálise do perfil imuno-histoquímico

• Análise estatísticaAnálise estatística• Implicações éticasImplicações éticas

RESULTADOS E DISCUSSÃORESULTADOS E DISCUSSÃO

• PCR para PCR para ββ-globina -globina (Figura 1)(Figura 1)

• PCR para HPVPCR para HPV– 26 (29,5%) de 88 CEOs foram HPV+ 26 (29,5%) de 88 CEOs foram HPV+ (Figura 2)(Figura 2) Difícil comparação entre resultados da Difícil comparação entre resultados da

literatura (parâmetros variados).literatura (parâmetros variados).A infecção pelo vírus pode ser transitória.A infecção pelo vírus pode ser transitória.Os resultados não fornecem dados sobre uma Os resultados não fornecem dados sobre uma

relação causal.relação causal.

-Saranath et al. (1999)

-Summersgill et al. (2000)

-Scully. (2002)

-Sugiyama et al. (2003)

RESULTADOS E DISCUSSÃORESULTADOS E DISCUSSÃO• Não houve associação entre o HPV e o sexo dos Não houve associação entre o HPV e o sexo dos

pacientes. pacientes. (Tabela 1)(Tabela 1)

– Bouda et al. (2000); Giovanelli et al. (2002); Zhang et al. Bouda et al. (2000); Giovanelli et al. (2002); Zhang et al. (2004); Correnti et al. (2004).(2004); Correnti et al. (2004).

• Não houve associação entre o HPV e a idade dos Não houve associação entre o HPV e a idade dos pacientes. pacientes. (Tabela 2)(Tabela 2)

– D’Costa et al. (1998); Bouda et al. (2000); Giovanelli et al. D’Costa et al. (1998); Bouda et al. (2000); Giovanelli et al. (2002); Zhang et al. (2004).(2002); Zhang et al. (2004).

• Não houve associação entre o HPV e a localização Não houve associação entre o HPV e a localização anatômica da lesão. anatômica da lesão. (Tabela 1)(Tabela 1)

– Zhang et al. (2004); D’Costa et al. (1998); Schwartz et al. Zhang et al. (2004); D’Costa et al. (1998); Schwartz et al. (2001); Premoli-de-Percoco et al. (2001); Sugiyama et al. (2001); Premoli-de-Percoco et al. (2001); Sugiyama et al. (2003).(2003).

RESULTADOS E DISCUSSÃORESULTADOS E DISCUSSÃO

• Tipagem para HPVs por hibridização Tipagem para HPVs por hibridização dot dot blotblot– Apenas os HPVs 16 e 18 foram detectados, Apenas os HPVs 16 e 18 foram detectados,

obtendo-se uma maior prevalência do HPV18.obtendo-se uma maior prevalência do HPV18.– Resultados de acordo com os de Shima et al. Resultados de acordo com os de Shima et al.

(2000), Giovanelli et al. (2002) e Lo Muzio et (2000), Giovanelli et al. (2002) e Lo Muzio et al. (2004), porém discordam com Chen et al., al. (2004), porém discordam com Chen et al., (2002), Tang et al. (2003), Zhang et al. (2002), Tang et al. (2003), Zhang et al. (2004), Ibieta et al. (2005) que detectaram o (2004), Ibieta et al. (2005) que detectaram o HPV16 como o tipo de maior prevalência.HPV16 como o tipo de maior prevalência.

RESULTADOS E DISCUSSÃORESULTADOS E DISCUSSÃO

• Expressão IHQ das proteínas p21 e pRb:Expressão IHQ das proteínas p21 e pRb:– 24/33 (72,72%) CEO (+) para pRb 24/33 (72,72%) CEO (+) para pRb (Figuras 3 e 4)(Figuras 3 e 4)

– 11/33 (33,33%) CEOs (+) para p21 11/33 (33,33%) CEOs (+) para p21 (Figuras 5 e (Figuras 5 e 6)6)

• Não houve associação entre a Não houve associação entre a expressão IHQ de p21 e o HPV expressão IHQ de p21 e o HPV (Tabela 3) (Tabela 3)

– Proteína E7 do HPV-16: bloqueio das Proteína E7 do HPV-16: bloqueio das funções inibitórias de p21, desde que não funções inibitórias de p21, desde que não esteja mutada. esteja mutada. (Cho et al., 2002; Helt, Funk, (Cho et al., 2002; Helt, Funk, Galloway, 2002).Galloway, 2002).

RESULTADOS E DISCUSSÃORESULTADOS E DISCUSSÃO

• Observou-se maior expressão IHQ de Observou-se maior expressão IHQ de pRb nos CEOs HPV positivos. pRb nos CEOs HPV positivos. (Tabela 2)(Tabela 2)

– A ligação de E7 do HPV à proteína A ligação de E7 do HPV à proteína pRb pode induzir um acúmulo de pRb pode induzir um acúmulo de pRb, denotando assim sua forma pRb, denotando assim sua forma inativa.inativa.

CONCLUSÕESCONCLUSÕES• O baixo percentual de detecção do HPV (29,5%) no CEO sugere O baixo percentual de detecção do HPV (29,5%) no CEO sugere

que em apenas um subgrupo de lesões, o HPV pode que em apenas um subgrupo de lesões, o HPV pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento e desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do CEO;progressão do CEO;

• O HPV 18 foi o tipo de maior prevalência, sugerindo que esse O HPV 18 foi o tipo de maior prevalência, sugerindo que esse tipo, especificamente, está relacionado com o CEO;tipo, especificamente, está relacionado com o CEO;

• Não houve associação significativa entre a presença do HPV e Não houve associação significativa entre a presença do HPV e idade e sexo dos pacientes, bem como não houve uma relação idade e sexo dos pacientes, bem como não houve uma relação entre a detecção do DNA viral e localização anatômica do CEO;entre a detecção do DNA viral e localização anatômica do CEO;

• A expressão IHQ de pRb foi significativamente maior nos CEOs A expressão IHQ de pRb foi significativamente maior nos CEOs HPV positivos que nos HPV negativos, sugerindo uma relação HPV positivos que nos HPV negativos, sugerindo uma relação importante entre o HPV e a proteína pRb no CEO;importante entre o HPV e a proteína pRb no CEO;

• Não houve diferença na expressão IHQ de p21 nos CEOs Não houve diferença na expressão IHQ de p21 nos CEOs positivos e negativos para o HPV, provavelmente, a infecção positivos e negativos para o HPV, provavelmente, a infecção pelo HPV e a proteína p21 atuam independentemente no pelo HPV e a proteína p21 atuam independentemente no desenvolvimento do CEO.desenvolvimento do CEO.

“ – “ – ...E quando o Reino Divino estiver às portas dos homens, a alma do mundo ...E quando o Reino Divino estiver às portas dos homens, a alma do mundo estará renovada:estará renovada:

O mais O mais PODEROSOPODEROSO não será o mais desapiedado e, sim, o que mais não será o mais desapiedado e, sim, o que mais ame.ame.

O O VENCEDOR VENCEDOR não será aquele que guerrear o inimigo exterior até a não será aquele que guerrear o inimigo exterior até a morte em rios de sangue, mas o que combater a iniqüidade e a ignorância, morte em rios de sangue, mas o que combater a iniqüidade e a ignorância, dentro de si mesmo, até a extinção do mal, nos círculos da própria dentro de si mesmo, até a extinção do mal, nos círculos da própria natureza.natureza.

O mais O mais NOBRE NOBRE não será o detentor do maior número de títulos que não será o detentor do maior número de títulos que lhe conferem a transitória dominação em propriedades efêmeras da Terra, lhe conferem a transitória dominação em propriedades efêmeras da Terra, mas aquele que acumular mais intensamente, os créditos do amor e da mas aquele que acumular mais intensamente, os créditos do amor e da gratidão nos corações das mães e das crianças, dos velhos e dos enfermos, gratidão nos corações das mães e das crianças, dos velhos e dos enfermos, dos homens leais e honestos, operosos e dignos, humildes e generosos.dos homens leais e honestos, operosos e dignos, humildes e generosos.

O mais O mais SANTOSANTO não será o que se isola em altares do supremo não será o que se isola em altares do supremo orgulho espiritual, evitando o contato dos que padecem, por temer a orgulho espiritual, evitando o contato dos que padecem, por temer a degradação e a imundície, mas, sim, aquele que descer da própria degradação e a imundície, mas, sim, aquele que descer da própria grandeza, estendendo mãos fraternas aos miseráveis e sofredores, grandeza, estendendo mãos fraternas aos miseráveis e sofredores, elevando-lhe a alma dilacerada aos planos da alegria e do entendimento.elevando-lhe a alma dilacerada aos planos da alegria e do entendimento.

O mais O mais PUROPURO não será o que foge ao intercâmbio com os maus e não será o que foge ao intercâmbio com os maus e criminosos confessos, mas aquele que se mergulha no lodo para salvar os criminosos confessos, mas aquele que se mergulha no lodo para salvar os irmãos decaídos, sem contaminar-se.irmãos decaídos, sem contaminar-se.

O mais O mais SÁBIOSÁBIO não será o possuidor de mais livros e teorias, mas não será o possuidor de mais livros e teorias, mas justamente aquele que embora saiba pouco, procura acender uma luz nas justamente aquele que embora saiba pouco, procura acender uma luz nas sombras que ainda envolvem o irmão mais próximo...”sombras que ainda envolvem o irmão mais próximo...”Do livro “Jesus no lar”, de Francisco Cândido Xavier