ESTUDO DA AÇÃO DO PROPRANOLOL SOBRE A … · estudo da aÇÃo do propranolol sobre a secreÇÃo...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ESTUDO DA AÇÃO DO PROPRANOLOL SOBRE A SECREÇÃO DE TESTOSTERONA EM CÉLULAS

INTERSTICIAIS TESTICULARES DE RATO

MARIA DO CARMO DE CARVALHO E MARTINS

Recife, PE – Brasil

2002

ESTUDO DA AÇÃO DO PROPRANOLOL SOBRE A SECREÇÃO DE TESTOSTERONA EM CÉLULAS

INTERSTICIAIS TESTICULARES DE RATOS

MARIA DO CARMO DE CARVALHO E MARTINS

Tese apresentada ao Curso de Doutorado em

Ciências Biológicas do Centro de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de

Pernambuco, como parte dos requisitos para

obtenção do grau de doutor em Ciências

Biológicas, área de Concentração em

Farmacologia, Fisiologia e Química Medicinal.

Orientadora:

Profª. Dr.ª Maria Inês Wanderley

Co-orientador:

Dr. Daniel Pedro Udrisar

Recife, PE – Brasil

2002

2 MARTINS,M.C.C. Ação do propranolol sobre a secreção de testosterona em células intersticiais de rato in vitro

“Dois horizontes fecham nossa vida: Um horizonte – a saudade do que não há de voltar; Outro horizonte – a esperança dos tempos que hão de chegar.”

Machado de Assis


Ao César, pela tolerância, compreensão e apoio, por

tudo o que vivemos juntos desde a adolescência e, por

todas as dificuldades superadas;

Aos meus filhos Rafael, Dalila, Daiane e Mariana, pelas

incontáveis horas de convívio que lhes foram roubadas;

À minha mãe, por dedicar sua vida aos filhos e netos e,

especialmente, por cuidar de mim e da Mariana durante

seus primeiros meses de vida (aqui em Recife)


AGRADECIMENTOS

- Aos Doutores Maria Inês Wanderley e Daniel Pedro Udrisar,

Docentes da Disciplina de Fisiologia do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco, pela orientação,

tolerância, compreensão, apoio e paciência em todas as fases do

trabalho, bem como pelo acompanhamento constante desde o mestrado,

pela confiança, pelos anos de convivência e, especialmente, pelo

exemplo de conduta científica e humana;

- À Universidade Federal do Piauí pela oportunidade para a

realização do curso de Pós-graduação;

- À Coordenadoria Geral de Capacitação de Docente e à CAPES

pelo suporte financeiro e pelas informações prestadas, sempre que

necessário;

- Ao Prof. Antônio de Deus Filho, Diretor do Centro de Ciências

da Saúde da Universidade Federal do Piauí, pelo apoio e pela

colaboração prestados;

- Ao Prof. Francisco Teixeira Andrade, Chefe do Departamento de

Biofísica e Fisiologia da Universidade Federal do Piauí, pela amizade,

pelos ensinamentos, pela confiança e pelo constante incentivo

concedidos para o ingresso na carreira científica e para a realização

deste curso de pós-graduação;

- À Profª. Dr.ª Lis Cardoso Marinho Medeiros, docente do

Departamento de Biofísica e Fisiologia da Universidade Federal do Piauí,

pela amizade, pelo constante incentivo e precioso apoio concedidos para

a realização deste curso de pós-graduação;

- À Profª. Maria Marilza Moita e demais professores e funcionários

técnico-administrativos do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Universidade Federal do Piauí pela convivência e carinho;


- À Coordenadora do Curso de Doutorado em Ciências Biológicas,

Dr.ª Luana Cassandra B. Coelho e às secretárias Adenilda Eugênia,

Jaciene e Liane Santos, pelo carinho e pela disposição em ajudar;

- À todos os colegas do curso de pós-graduação, pela convivência

e carinho;

- À Profª. Maria do Amparo Andrade, pessoa maravilhosa sempre

pronta a ajudar, pela grande amizade, pelos anos de convivência, pelo

carinho e incondicional apoio em todos os momentos difíceis longe de

minha família;

- Aos familiares e amigos, em especial aos meus pais, irmãos e

avó, pelo amor, incentivo e apoio nos momentos difíceis;

- À Alexandra, Barnabé e Cilene, por cuidar de meus filhos,

especialmente durante minha permanência em Recife;

- À Sara Regina Rufino, pela amizade, convivência e apoio;

- À Daniela Carneiro (bolsista de Iniciação Científica) e Carla,

Maria do Carmo e Regina (mestrandas) do Laboratório de Endocrinologia

do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal

de Pernambuco, amizades novas consolidadas no convívio no

laboratório, pelo carinho e apoio;

- Ao Prof. Dr. José Moita, Docente da Disciplina de Química da

Universidade Federal da Piauí, pela disposição em colaborar e pelas

orientações acerca da utilização do programa estatístico "origin";

- Finalmente, a todos aqueles de uma forma ou de outra, contribuíram

direta ou indiretamente, para a realização deste trabalho.


SUMÁRIO

Página

DEDICATÓRIA...........................................................................................3

AGRADECIMENTOS..................................................................................4

LISTA DE

FIGURAS...................................................................................9

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.....................................................11

RESUMO..................................................................................................13

ABSTRACT...............................................................................................15

I. INTRODUÇÃO......................................................................................17

1. Vias de tradução do sinal hormonal no testículo................................21

2.Ações do propranolol no testículo: envolvimento da PK-

C................30

II. OBJETIVOS..........................................................................................31

1. OBJETIVOS GERAIS.......................................................................31

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................31

III. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................32

1. ANIMAIS........................................................................................32

2. REAGENTES................................................................................32

3. GRUPOS

EXPERIMENTAIS.........................................................33

3.1. Células intersticiais tratadas agudamente com propra-


nolol.......................................................................................33

3.2. Animais tratados cronicamente com propranolol

.................32

4. METODOLOGIA............................................................................3

4

4.1. Preparação e incubação das células intersticiais

testiculares............................................................................34

4.1.1.Obtenção das células intersticiais testiculares............34

4.1.2.Purificação das Células de Leydig...............................35

4.1.3.Secreção de testosterona in

vitro.................................36

4.2. Viabilidade Celular.................................................................37

4.3. Radioimunoensaio da Testosterona......................................37

4.4. Atividade da proteína quinase C............................................38

4.4.1.Preparação da fração citosol + membrana..................38

4.4.2.Purificação parcial da PK-C por cromatografia em

DEAE-Agarose............................................................39

4.4.3.Determinação da atividade da PK-

C............................40

4.5. Ligação do [3H]PDBu às células intersticiais testiculares......41


4.6. Ligação do [3H]PDBu à fração DEAE-

Agarose......................42

5. Tratamento Estatístico....................................................................43

IV. RESULTADOS...................................................................................45

1. TRATAMENTO AGUDO.................................................................45

1.1.Efeito do propranolol sobre a secreção de testosterona em

em preparação enriquecida em células de

Leydig...................45

1.2.Efeito do propranolol adicionado junto com PDBu, LHRH

ou H-7 na secreção de testosterona em preparação enri-

quecida em células de Leydig..................................................46

1.3.Efeito do propranolol na atividade da PK-C..............................47

1.4.Comparação da ligação do [3H]PDBu às células intersti-

ciais testiculares e à fração DEAE-agarose.............................50

2. TRATAMENTO CRÔNICO COM PROPRANOLOL...........................53

2.1.Efeito do tratamento crônico com propranolol durante oito

dias sobre a secreção de testosterona estimulada com pro-

pranolol, LHRH e PDBu em células intersticiais testiculares.......53

2.2.Efeito do tratamento crônico com propranolol durante oito

dias sobre a atividade da proteína quinase C .............................55

2.3.Efeito do tratamento crônico com propranolol durante cinco

semanas sobre a secreção de testosterona estimulada com


propranolol, LHRH e PDBu em células intersticiais de rato .........56


semanas sobre a atividade da proteína quinase C ..........................57

2.5.Ligação do [3H]PDBu às células intersticiais testiculares de

animais tratados com propranolol durante cinco semanas...........59



hCG e dbAMPc em células intersticiais de rato ..........................61

V. DISCUSSÃO........................................................................................65

VI. CONCLUSÕES...................................................................................75

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................77


LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Via do AMPc no testículo......................................................23

Figura 2. Via dos lipídios de inositol no testículo.................................24

Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de S-propranolol

sobre a secreção de testosterona em preparação enri-

quecida em células de Leydig de rato...................................45

Figura 4. Efeito do propranolol sobre a atividade da PK-C..................48

Figura 5. Efeito do H-7 e da ausência de Ca2+ na ação do pro-

pranolol sobre a atividade da PK-C......................................49

Figura 6. Ligação de [3H]PDBu à fração DEAE-A e às células

intersticiais testiculares em função da concentração de

PDBu (A) ou de propranolol

(B).............................................51

Figura 7. Análise de Scatchard da ligação de [3H]PDBu às célu-

células intersticiais testiculares.............................................52

Figura 8: Efeito do tratamento crônico com 30 mg/Kg propranolol

(via intraperitoneal) durante oito dias sobre a secreção

de testosterona estimulada pelo S-propranolol (100 μM),

LHRH ( 10-7 M), PDBu (200 nM)...........................................54

Figura 9: Efeito do tratamento com 30 mg/Kg propranolol por via

intraperitoneal durante oito dias sobre a atividade da

proteína quinase

C................................................................55

Figura 10. Efeito do tratamento com propranolol (500 mg/L na

água de beber) durante cinco semanas sobre a secreção

de testosterona estimulada por S-propranolol (100 μM),

LHRH (10-7 M) e PDBu (200

mM)..........................................57

Figura 11. Efeito do tratamento com propranolol (500 mg/L na


água de beber) durante cinco semanas sobre a ativi-

dade da proteína quinase C.................................................58

Figura 12. Ligação de [3H]PDBu às células intersticiais testicula-

res obtidas de animais tratados com propranolol

durante cinco semanas, em função da concentração

de PDBu (A) ou de propranolol (B).....................................60

Figura 13. Análise de Scatchard da ligação de [3H]PDBu às cé-

lulas intersticiais testiculares de animais tratados com

propranolol durante cinco semanas....................................61

Figura 14. Efeito do tratamento crônico com 30 mg/Kg proprano-

lol (por via intraperitoneal) durante oito dias sobre a

secreção de testosterona estimulada pelo hCG

(1mUI/mL), na ausência ou na presença de 100μM

S-propranolol......................................................................62

Figura 15. Efeito do tratamento crônico com 500 mg/L proprano-

lol na água de beber durante cinco semanas sobre a

secreção de testosterona estimulada pelo hCG

(1mUI/mL), na ausência ou na presença de 100μM

S-propranolol.......................................................................63

Figura 16. Efeito do tratamento crônico com 500 mg/L proprano-

lol na água de beber durante cinco semanas sobre a

secreção de testosterona estimulada pelo dbAMPc

(1 mM), na ausência ou na presença de 100μM

S-propranolol.......................................................................64

Figura 17. Representação esquemática dos possíveis sítios de

ação do propranolol na via que envolve a proteína qui-

nase C para produzir dessensibilização das células

intersticiais testiculares ao propranolol e aos ativado-

res da PK-C........................................................................72


LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA: ácido araquidônico

AMPc: 3’,5’- adenosina-monofosfato cíclico

BSA: albumina sérica bovina

CaMKII: proteína quinase II dependente de Ca2+/calmodulina

1,2-DAG: 1,2-diacilglicerol

dbAMPc: dibutiril AMP cíclico

DEAE-A: DEAE-Agarose

EPM: erro padrão da média

GAP: proteína ativadora de GTPase

GnRH: hormônio liberador de gonadotrofina

GRK: quinases de receptor acoplado à proteína G

hCG: gonadotrofina coriônica

H-7: 1-(5-isoquinolinylsulfonyl)-2-methyl-piperazine

i.p.: intra-peritoneal

IP3: inositol 1,4,5-trifosfato

LH: hormônio luteinizante

LHRH: hormônio liberador de hormônio luteinizante

LIT: líquido intersticial testicular

MAPKs: proteínas quinases ativadas por mitógenos

M199: meio 199

PA: ácido fosfatídico

PAPase: fosfohidrolase do ácido fosfatidíco

PBS: tampão fosfato-salina

PC: fosfatidilcolina

PDBu: forbol 12,13-dibutirato

PDD: forbol 12,13-didecanoato


PIP2: fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

PIP3: fosfatidilinositol 3,4,5-trifofosfato

PK-A: proteína quinase A

PK-C: proteína quinase C

PLA2: fosfolipase A2

PLC: fosfolipase C

PLCβ: fosfolipase C β

PLD: fosfolipase D

PMA: forbol 12-miristato 13--acetato

PPI: lipídio de inositol ou fosfoinositídeo

PPI-PLC: fosfolipase C específica para lipídio de inositol

PS: fosfatidilserina

OAG: 1-oleoil-2-acetil-rac-glicerol

RIE: radioimunoensaio

TPA: 12-O-tetradidecanoilforbol 13-acetato


RESUMO

O propranolol, utilizado frequentemente na patologia cardíaca

por seu efeito bloqueador β-adrenérgico, está freqüentemente

associado com efeitos sexuais colaterais. Esses efeitos não parecem

estar relacionados ao bloqueio β-adrenérgico. O efeito do propranolol

sobre o metabolismo dos fosfolipídios e do diacilglicerol tem sido

referido na literatura. No presente trabalho foi estudado o envolvimento

da via de tradução do sinal do diacilglicerol/proteína quinase C

(DAG/PK-C) na ação do propranolol sobre a secreção de testosterona

em células intersticiais testiculares de rato. O tratamento agudo com

propranolol estimulou a secreção de testosterona in vitro com

concentrações da droga variando de 1μM a 100 μM. O H-7 (20 μM),

inibidor da PK-C, reduziu esse efeito em aproximadamente 50%. Na

concentração de 75 μM o S-propranolol reduziu 50% da ligação do

[3H]12,13-dibutirato de forbol ([3H]PDBu) às células enquanto que no

homogeneizado dessas células a redução da ligação foi de apenas

5%. Esses resultados sugerem que o efeito do S-propranolol sobre a

ligação do [3H]PDBu poderia ser indireto, possivelmente por aumentar

a concentração de um mediador químico que interage com o domínio

regulatório da PK-C. Em concentrações ainda mais baixas (1 nM a

100 nM), o S- ou R-propranolol adicionado diretamente à mistura de

reação com PK-C parcialmente purificada das células intersticiais

aumentou a fosforilação da histona. Essa fosforilação foi comparável

àquela obtida com (25 μM) fosfatidilserina, não ocorreu em ausência

de Ca2+ e foi revertida com 20 μM H-7. O tratamento crônico com

propranolol por via intraperitoneal (30 mg/Kg/8 dias) bloqueou o efeito


estimulatório do S-propranolol e dos ativadores da PK-C (PDBu e

LHRH) sobre a secreção de testosterona em células intersticiais

testiculares in vitro, sugerindo a dessensibilização da via do DAG/PK-C

nessas células. Contudo, a atividade da PK-C não foi modificada. O

tratamento mais prolongado, por via oral, com propranolol (500 mg/L/5

semanas) produziu uma dessensibilização mais suave na resposta

secretória das células, não modificou a ligação do [3H]PDBu e não

modificou a atividade, em valores absolutos, da PK-C. Esses

resultados sugerem que a PK-C não está envolvida na

dessensibilização da resposta secretória. A especificidade dessa

dessensibilização é sugerida pela não modificação (redução) do efeito

inibitório do propranolol sobre a secreção de testosterona estimulada

pelo hCG e dbAMPc, ativadores indireto e direto da PK-A. Concluindo,

os resultados sugerem que a PK-C pode ser a quinase putativa

envolvida no efeito agudo estimulatório do propranolol sobre a

secreção de testosterona pelas células intersticiais testiculares e que a

dessensibilização dessas células após tratamento crônico com

propranolol não envolve diminuição da atividade ou de concentração

dessa enzima.

Palavras chave: Propranolol – Tradução de sinal – Proteína

quinase C – Esteroidogênese – Testículo

Endereço eletrônico: [email protected]

[email protected]


ABSTRACT

Propranolol is a drug frequently used in cardiac pathology for its

adrenergic β–blocker effect. It is frequently associated with collateral

sexual effects. These effects appeared to be unrelated with the β-

adrenergic blockade. The propranolol effect on the phospholipids and

diacylglycerols metabolism has been reported. In this work the

diacylglycerol/kinase C protein (DAG/PK-C) signal transduction

pathway involvement in the propranolol action on the testosterone

secretion in rat testicular interstitial cells was studied. The propranolol

acute treatment stimulated the in vitro testosterone secretion at

concentrations ranging from 1μM a 100 μM. The PK-C inhibitor H-7 (20

μM) reduced this effect in 50% approximately. S-propranolol in the 75

μM concentration reduced 50% of [3H]phorbol 12,13-dibutyrate

([3H]PDBu) binding to the interstitial cells while that in homogenate of

the these cells the binding reduction was by only 5%. These findings

suggest that the effect of the S-propranolol on [3H]PDBu binding could

be indirect, possibly by increasing the concentration of a chemical

mediator interacting with the PK-C regulatory domain. At even lower

concentrations, propranolol L- or D- (1nM a 100 nM) directly added to

the reaction mixture with PK-C partially purified from interstitial cells

increased the histone phosphorylation. This phosphorylation was

comparable to that obtained with (25 μM) phosphatidylserine. It did not

occur in Ca2+ absence and it was reverted with 20 μM H-7. The

propranolol chronic treatment by intraperitoneal administration (30

mg/Kg/8 days) blocked the stimulatory effect of S-propranolol and PK-

C activators (PDBu and LHRH) on the in vitro testosterone secretion in


testicular interstitial cells, that suggests the DAG/PK-C pathway

desensitization in these cells. However, the PK-C activity was not

modified. The more prolonged treatment propranolol (500 mg/L/5

weeks) by oral administration has produced a softer desensitization in

the secretory reply of the cells, but it did not modify the [3H]PDBu

binding and PK-C activity, in absolute values. These results suggest

that the PK-C is not involved in the secretory reply desensitization. The

especifity of this desensitization is suggested by the absence of

modification (reduction) of the propranolol inibitory effect on the

stimulated testosterone secretion by hCG and dbcAMP, PK-C

activators indirect and direct. In conclusion, the results suggest that

PK-C could be the putative quinase involved in the propranolol

stimulatory acute effect on the testosterone secretion for the testicular

interstitial cells and that the desensitization of these cells after chronic

propranolol treatment does not involve activity or concentration

reduction of this enzyme.


I. INTRODUÇÃO

O propranolol é um agente bloqueador β-adrenérgico não-

seletivo amplamente utilizado para o tratamento da hipertensão,

profilaxia da angina pectoris e para o controle de arritmias cardíacas, e

que está entre as drogas mais amplamente prescritas nas sociedades

industrializadas. Bloqueia competitivamente os receptores β1 e β2

(Gilman et al.,1990; Dash e Rao, 1995). Apenas o isômero óptico S(-)

tem atividade β-bloqueadora, sendo o isômero R(+) totalmente ineficaz

(Barrett e Cullum,1968; Svetlov e Hanahan,1997).

Tem-se verificado que concomitantemente com o aumento no

uso de β-bloqueadores na prática médica, um número crescente de

artigos têm enfatizado o risco de efeitos sexuais colaterais −seu uso no

controle da pressão sanguínea, em pacientes moderadamente

hipertensos, está frequentemente associado à diminuição da

capacidade erétil, da libido e impotência masculina (Croog et al.,1986;

Knarr,1976; Miller,1976; Moss e Procci,1982; Poloniecki e

Hamilton,1985; Warren e Warren,1977). Tais efeitos, geralmente,

surgem dentro de dias após o início da administração da droga, e com

a descontinuação do uso é observado um rápido retorno da função

sexual normal (Knarr,1976). A disfunção sexual com o propranolol

parece estar relacionada com a dose, visto que vários estudos

encontraram evidências de impedimento erétil em doses de 120

mg/dia e acima (Moss e Procci,1982). Recentemente foi demonstrado

em ratos, que a administração aguda de propranolol por via

subcutânea está associada com diminuição da performance

copulatória e dos reflexos eréteis e ejaculatórios (Smith et al., 1995). A

impotência induzida pelo propranolol pode ser parcialmente devida ao


efeito bloqueador β-adrenérgico periférico da droga que pode exercer

efeitos diretos no componente nervoso simpático do mecanismo erétil

e/ou no débito cardíaco impedindo a circulação nos vasos sanguíneos

penianos em pacientes com doença vascular periférica, uma vez que

tem sido documentado fluxo sanguíneo diminuído nas artérias

penianas de pacientes durante o tratamento com propranolol (Neil-

Dwyer et al.,1981). Por outro lado, durante o tratamento crônico com

propranolol em homens saudáveis foi observada uma redução

significativa da concentração plasmática de testosterona (Rosen et

al.,1988). Lewis et al. (1981) já haviam mostrado que os níveis de

testosterona plasmática eram reduzidos pela administração de doses

únicas de RS-propranolol (80 mg) em homens saudáveis. Resultados

opostos, contudo, têm sido referidos por outros autores utilizando

pacientes saudáveis (Dart et al.,1981) ou ratos adultos tratados

cronicamente com propranolol (Plecas et al.,1997). Provavelmente,

esse aumento é devido a uma ação central do propranolol, o qual

penetra no cérebro (Hoffman e Lefkowitz,1992) e/ou a uma ação direta

na gônada (Martins et al.,1996; Wanderley,1986). Os dados

correntemente disponíveis sugerem que enquanto os efeitos diretos

das catecolaminas sobre a secreção de testosterona são

estimulatórios (Anakwe et al.,1985; Cooke et al.,1982; Moger et

al.,1982; Moger e Murphy,1983; Wanderley,1986; Wanderley et

al.,1989), efeitos indiretos, centrais ou locais, sobre a produção de

testosterona são principalmente inibitórios e envolvem interação de

diferentes hormônios e fatores (Rivier e Rivest,1991), além das

influências sobre o fluxo sanguíneo testicular (Damber e Janson,1978).

Wanderley (1986) e Martins et al. (1996) demonstraram um efeito

estimulatório direto do propranolol sobre o volume do líquido intersticial

testicular (LIT) e a produção de testosterona basal e estimulada pela

gonadotrofina coriônica humana (hCG) nesse compartimento


testicular. O(s) mecanismo(s) preciso(s) através do(s) qual(is) o

propranolol induz disfunção sexual é(são) desconhecido(s). Esse efeito

estimulatório do propranolol sobre a secreção de testosterona sugere

um mecanismo de ação dessa droga que independe de seu clássico

bloqueio β-adrenérgico, que pode resultar de uma ação intrínseca da

droga e aqui denominada de “agonista-símile”.

São várias as evidências que suportam outras ações do

propranolol, diferentes da clássica ação β-bloqueadora, e que são

dependentes da integridade da membrana. Nesse sentido, estudos in

vitro demonstraram o efeito inibitório equipotente dos isômeros R e S

do propranolol na agregação secundária de plaquetas, captação e

liberação de 5-hidroxi [14C]triptamina, adesão ao colágeno, retração do

coágulo e geração de tromboxano A2, em concentrações da droga

similares ou ligeiramente maiores que aquelas atingidas in vivo na

prática clínica (Weksler et al.,1977). Os mecanismos responsáveis por

essas ações são pouco compreendidos e são frequentemente

referidos como ações “quinidina-símile”, ou seja, resultantes de

interações hidrofóbicas com os componentes lipídicos de membrana,

desde que, como a quinidina, o propranolol exerce atividade

anestésica local, a qual parece contribuir para sua atividade anti-

arrítmica (Barrett e Cullum,1968; Marshall et al.,1975). Essas ações

são também referidas como propriedades estabilizadoras não-

estereoespecíficas de membrana e que modificam a fluidez de

membrana (Weitman et al.,1989). Outros autores demonstraram que o

propranolol se associa preferencialmente com os fosfolipídios acídicos

negativamente carregados (fosfatidilserina -PS e ácido fosfatídico -PA)

(Surewicz e Leyko,1981); ou que o propranolol aumenta a mobilidade

das cadeias de ácidos graxos associadas aos fosfolipídios (Akiyama e

Igisu,1979), sendo sugerido então que o propranolol perturba as

interações proteína-lipídio na superfície da membrana


(Surewicz,1982). Dash e Rao (1990), através de estudos in vitro

demonstraram que o propranolol, em concentrações terapêuticas,

diminui a microviscosidade equivalente da membrana de plaquetas e

aumenta o grau de desordem das cadeias de hidrocarbonetos da

bicamada lipídica. Além disso, foi demonstrado que o propranolol liga-

se especificamente à fosfatidilserina e ao fosfatidilinositol presentes na

face interna da membrana plaquetária (Dachary-Prigent et al., 1979). A

perturbação do microambiente fisicoquímico da membrana pode

interferir com a tradução molecular do sinal através da membrana,

afetando a resposta celular aos agonistas (acoplamento do receptor

aos sistemas de segundos mensageiros – adenosina 3’-5’ monofosfato

cíclico (AMPc), Ca2+ citosólico, fosfatos de inositol e diacilglicerol- ou

ainda influenciar diretamente o metabolismo dos fosfoinositídeos -PPI).

Bazan et al.(1985) demonstraram que na retina bovina a forma

racêmica do propranolol estimula a degradação de fosfoinositídeos

provavelmente pela ativação da fosfolipase C (PLC) fosfoinositídeo-

específica (PPI-PLC) possivelmente por uma perturbação na

membrana causada pela intercalação da droga na membrana ou como

resultado da mobilização de Ca2+. A forma racêmica do propranolol

além de inibir a conversão de PA em diacilglicerol pela fosfohidrolase

em hepatócitos (Jamal et al.,1991) também inibe a ativação da

proteína quinase C (PK-C) em neutrófilos humanos, provavelmente

pela interação ao nível do domínio regulatório da enzima (Sozzani et

al.,1992 ). Os estereoisômeros R e S do propranolol apresentam

efeitos igualmente potentes sobre a atividade da PK-C em neutrófilos

(Sozzani et al.,1992 ). Em plaquetas estimuladas pela trombina a

forma racêmica do propranolol parece inibir a tradução de sinal

inibindo a atividade da PLC e da PK-C (Dash e Rao,1995). Dados

obtidos em plaquetas estimuladas pela trombina sugerem que o

propranolol inibe a tradução do sinal, possivelmente interagindo a nível


do acoplamento proteína G-fosfolipase C (PLC) e/ou na própria PLC

(Dash e Rao,1995).

Recentemente, Svetlov e Hanahan (1997) demonstraram que

tanto a forma racêmica quanto o isômero R do propranolol potenciam

o aumento na concentração intracelular de cálcio e inibem a atividade

da fosfolipase D (PLD) induzidos pela trombina em plaquetas

humanas, possivelmente afetando a função plaquetária pela regulação

do balanço fosforilação/defosforilação presumivelmente pela inibição

de componentes (diferentes fosfatases e fosfohidrolases) mediando o

“cross-talk” entre a PLC e a PLD, os quais poderiam ser isoenzimas da

PK-C ou outros elementos ainda não caracterizados.

1. Vias de tradução do sinal hormonal no testículo

O controle da produção de esteróides pelas células de Leydig é

realizado primariamente pela ação da gonadotrofina hormônio

luteinizante (LH) (Dufau e Catt,1978), secretado em pulsos de alta

atividade biológica pela adenohipófise sob o controle da secreção

episódica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) (Clarke e

Cummins,1982; Levine e Duffy,1988; Pau et al.,1986; Urbanski et

al.,1988; Wildt et al.,1981).

Há dois sistemas principais de segundo mensageiros que

parecem ser os efetores da ação hormonal no testículo: a via do AMPc

e a dos lipídios de inositol (Steele e Leung,1992).

O LH estimula a função esteroidogênica da célula de Leydig

através da interação com receptores de LH na superfície celular

(Figura 1), resultando principalmente na estimulação de eventos

dependentes de AMPc (Dufau e Catt,1978). Após a ocupação dos

sítios receptores específicos de LH nas células de Leydig pelo

LH/hCG, vários processos são iniciados na membrana plasmática

através de uma proteína ligante de GTP (proteína G) e que levam à


ativação da adenilato ciclase ligada à membrana (Dufau et al.,1980,

1984; Dufau,1988; Gore-Langton e Armstrong,1988). Esta enzima, por

sua vez, catalisa a síntese de AMPc a partir de ATP no lado

citoplasmático da membrana plasmática (Steele e Leung,1992). A via

do AMPc parece ser altamente compartimentalizada (Dufau et

al.,1978) e pode ser afetada por níveis intracelulares e vias não-AMPc

na membrana (Dufau et al.,1987; Dufau e Knox,1985; Sullivan e

Cooke,1986).

As proteínas G são heterogêneas com diferentes subtipos (Gs,

Gi, Gq, Go, etc.) capazes de interagir com diferentes tipos de

receptores (Gershengorn e Perlman,1995; Kaziro et al.,1991),

traduzindo sinais a partir dos receptores de membrana para diferentes

moléculas efetoras incluindo a adenilato ciclase, PLC e canais iônicos

(Birnbaumer,1990; Freissmuth et al., 1989; Gilman,1987, 1990; Kaziro

et al., 1991; Levis e Bourne,1992; Neer,1994). Os receptores de LH,

além do receptor β-adrenérgico e vários outros receptores interagem

com a Gs, que por sua vez interage seletivamente e estimula a

atividade do efetor enzimático adenilato ciclase levando a um aumento

dos níveis de AMPc celular (Dufau,1988; Gilman,1990).

O AMPc é o segundo mensageiro que media muitas

modificações dependentes de hormônio no metabolismo celular. Esta

resposta à estimulação hormonal é mediada através de um aumento

nos níveis de AMPc o qual, por sua vez, ativa a proteína kinase A (PK-

A) dependente de AMPc (Cooke et al.,1979; Marsh,1975; Rommerts

et al.,1974). O AMPc liga-se à subunidade regulatória inibitória da PK-

A inativa e promove sua dissociação do complexo, dessa forma

permitindo o aumento da atividade da subunidade catalítica, a qual,

então, para a esteroidogênese pelas células de Leydig parece

fosforilar uma proteína substrato ainda não identificada em um resíduo


treonina, iniciando a produção de testosterona estimulada pelo LH

(Edelman et al.,1987; Stocco e Clark,1991).

1º mensageiro(hormônio)

Adenilatociclase

Proteina-G

ATP

AMPc

Subunidaderegulatória

Subunidadecatalítica

PK - A

Espaçoextracelular

Membranaplasmática

Citosol

Fosforilação de proteína substrato Figura 1. Via do AMPc no testículo

Apesar da regulação da esteroidogênese testicular estar

predominantemente sob o controle das gonadotrofinas hipofisárias,

outros hormônios e fatores localmente produzidos, dentre eles o

LHRH, podem influenciar a diferenciação da célula de Leydig e as

ações agudas ou crônicas do LH na esteroidogênese (Dufau,1988;

Saez,1994; Steele e Leung,1992). O LHRH estimula um outro sistema

de segundo mensageiro envolvido na esteroidogênese no testículo; a

via que utiliza a hidrólise de fosfoinositídeos (PPI’s), fosfolipídios que


contêm o açúcar mio-inositol como grupo polar (Berridge e

Irvine,1989).

Os PPI’s, ou lipídios de inositol, são compostos de um esqueleto

de glicerol contendo grupos de ácidos graxos nas posições 1- e 2- e

um grupo fosfato acoplado através de uma ligação fosfodiéster na

posição 3- ao mio-inositol (Berridge e Irvine,1989). A hidrólise desses

fosfolipídios ocorre por ação de uma fosfolipase. No caso dos PPI’s

atua a PLC PPI-específica ou PPI-PLC, que não hidrolisa outros

fosfolipídios, tais como a fosfatidilcolina (PC) (Rhee e Choi,1992). A

fosfolipase C beta (PLCβ) é um sistema de segundo mensageiro

extensamente estudado ativado por receptores que se acoplam por

meio de interação com proteínas G (Dohlman et al.,1991; Kaziro et

al.,1991), e consiste em uma família de enzimas que hidrolizam

fosfolipídios na ligação fosfodiéster da posição 3- do esqueleto de

glicerol (Rhee e Choi,1992).

fosfolipase C- ativadaPIP2

diacilglicerol ESPAÇOEXTRACELULAR

MEM

BR

AN

APL

ASM

ÁTI

CA

CITOSOL

quinase-Cativadamimetizado por

esteres de forbol

IP3

CLIVAGEMGTP

proteína G ativadaq

Y q

receptorativado

LIBERA CaDO RETÍCULO

ENDOPLASMÁTICO

2+

simulada porionóforos de Ca2+

FOSFORILAPROTEÍNAS CELULARES

LHRH

Figura 2. Via dos lipídios de inositol no testículo


Quando o PIP2 (fosfadilinositol 4,5-bifosfato) é o substrato, como

ocorre na via que leva à produção de testosterona estimulada pelo

LHRH, a ação da PLCβ leva à formação de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3)

e 1,2-diacilglicerol (1,2-DAG) (Rhee e Choi,1992; Gershengorn e

Perlman,1995; Steele e Leung,1992). Cada um destes mensageiros

afeta o metabolismo celular através de diferentes vias sinalizadoras,

razão pela qual esta via sinalizadora é referida como uma via

sinalizadora bifurcante.

O IP3 pode aumentar a concentração intracelular de Ca2+ pela

mobilização dos estoques no retículo endoplasmático e/ou estimulando

o transporte através da membrana plasmática (Berridge,1984,1987;

Berridge e Irvine,1989).

O diacilglicerol (DAG), em combinação com a fosfatidilserina

(PS) e, dependendo do subtipo de isoenzima, com ou sem elevação

da concentração intracelular de Ca2+, ativa a PK-C dependente de

fosfolipídio (Nishizuka,1984), resultando na formação de um complexo

quaternário altamente ordenado consistindo da kinase, o 1,2-DAG, os

cofatores Ca2+ e fosfatidilserina, e o substrato (Gershengorn e

Perlman,1995; Hannun e Bell,1986). Outros produtos da membrana

celular, tais como o ácido araquidônico (AA) e o fosfatidilinositol 3,4,5-

trifosfato (PIP3) também ativam fisiologicamente a PK-C e sinergizam

com o 1,2-DAG para ativar a PK-C de forma máxima (Liu,1996).

Uma outra via que leva indiretamente à formação de 1,2-DAG é

a via que envolve a ativação do receptor de uma fosfolipase D (PLD)

que hidrolisa fosfolipídios, como a fosfatidilcolina (PC) para gerar

colina e ácido fosfatídico (PA) (Cook e Wakelam,1992; Exton,1990). A

PLD pode ser ativada pela PK-C, e há algumas indicações de ativação

direta mediada por receptor via proteínas G (Geny e Cockroft,1992).

Existe a possibilidade de que a ativação da PLD seja uma

consequência secundária da ativação da PLC (McKenzie et al.,1992).


O PA, por sua vez, pode ser defosforilado para 1,2-DAG pela PA

fosfohidrolase (Cook e Wakelam,1992; Gershengorn e Perlman,1995;

Koul e Hauser,1987). Alguns estudos sugerem que o ácido fosfatídico

possa atuar como um segundo mensageiro e que a fosfohidrolase do

ácido fosfatídico (PAPase) seja uma enzima regulatória chave na

interação entre PLC e PLD na tradução de sinal (Agwu et al.,1991;

Gay e Murray,1991). Além disso, há evidências sugerindo que o PA

possa atuar como um fator modulador da produção de testosterona em

células de Leydig (Lauritzen et al., 1994). Em relação aos efeitos do

PA, alguns estudos mostraram que este fosfolipídio parece mais

potente que o DAG na ativação da PLC específica para PIP2

(Jackowski e Rock,1989), que o PA ativa várias isoformas de

fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase tipo I –enzima que gera substratos

para a PLC (Jenkins et al.,1994), e ainda que o PA é capaz de ativar

quinases Ca2+-dependentes e Ca2+-independentes em extratos de

tecidos, incluindo fígado, cérebro, pulmões, testículos e plaquetas

(Bocckino et al.,1991; Khan et al.,1994). Khan et al.(1994) sugerem

que estas serina/treonina quinases podem representar uma

superfamília de quinases dependentes de fosfolipídios que

desempenham um importante papel na mediação dos efeitos celulares

do PA gerado pela ação da PLD.

A PK-C, descoberta em 1977, é considerada como um elemento

regulatório chave na tradução de sinal e exerce seus efeitos através da

catalisação da fosforilação de um substrato específico, modulando a

atividade de diversas proteínas diferentes, e está geralmente envolvida

em diversos processos incluindo crescimento e proliferação celular,

desenvolvimento neural, transmissão sináptica, regeneração axônica,

contração e relaxamento do músculo liso, estimulação da secreção de

células endócrinas, exócrinas e sanguíneas, lipogênese em

adipócitos, glicogenólise em hepatócitos, promoção de tumores e


envelhecimento (Berridge e Irvine,1989; Liu,1996; Nishizuka,1984,

1986,1988).

A PK-C é uma serina e treonina quinase que catalisa a

transferência de fosfato do ATP para o grupo hidroxila livre em

resíduos serina ou (menos freqüentemente) treonina de proteínas

substrato, que é amplamente distribuída em vários tecidos de

mamíferos, sendo o sistema nervoso a fonte mais abundante

(Edelman et al.,1987; Nikula e Huhtaniemi, 1988; Nishizuka, 1980).

Vários hormônios e efetores ativam a PK-C como parte de sua

transmissão de sinal transmembrana (Kikkawa e Nishizuka,1986).

Quando totalmente ativa, a PK-C é considerada como um complexo

quaternário consistindo de fosfolipídio aniônico, Ca2+, DAG e a enzima

(Hannun e Bell,1986; Liu,1996). Nos testículos, a atividade da PK-C foi

identificada nos túbulos seminíferos e células de Leydig, e está

envolvida na regulação destes compartimentos testiculares (Galdieri et

al.,1986; Kimura et al., 1984; Nikula et al.,1987), participando na ação

do LHRH e seus análogos agonistas na secreção de andrógeno pela

célula de Leydig devido a fosforilação e (ativação) de algumas

proteínas implicadas na produção de esteróides (Nikula e

Huhtaniemi,1988; Steinschneider et al.,1989; Wanderley e Negro-

Villar,1996). Os ésteres de forbol são potentes promotores de tumores

que podem mimetizar a ação do DAG e ativar a PK-C, afetando as

funções das células de Leydig e das células de Sertoli (Castagna et

al.,1982; Nikula e Huhtaniemi, 1988). Os ésteres de forbol têm uma

estrutura DAG-símile, aumentando a afinidade da PK-C pelo cálcio e

fosfolipídios e, em sua forma ativa, apresentam um grupo cabeça

relativamente polar (a molécula de forbol) com ésteres substituintes

lipofílicos (Lee e Blackshear,1987). As evidências disponíveis indicam

que os ésteres de forbol não levam à quebra de fosfolipídios de

inositol, à geração de DAG endógeno, ou à mobilização de Ca2+


intracelular (Lee e Blackshear,1987). Nishizuka (1984) sugeriu que

cada molécula de éster de forbol se intercala na bicamada de

fosfolipídios da membrana e ao interagir com uma molécula de PK-C

produz um complexo quaternário pelo qual a enzima é ativada. Além

disso, como são lentamente metabolizados, os ésteres de forbol

persistem nos tecidos por períodos muito mais longos que o DAG,

causando ativação prolongada da PK-C, e produzindo depleção

("down-regulation”) da enzima pela indução da inserção da PK-C na

membrana plasmática onde ela é gradualmente proteolisada (Liu,1996;

Nishizuka,1995). Os ésteres de forbol depletam seletivamente

algumas, e não todas as isoenzimas da PK-C (Adams e Gullick,1989;

Ase et al., 1988; Cooper et al., 1989; Olivier e Parker,1992). Os

ésteres de forbol ativos mais comumente empregados são o forbol 12-

miristato 13-acetato (PMA; também referido como 12-O-

tetradecanoilforbol 13-acetato ou TPA), forbol 12,13-dibutirato (PDBu)

e o forbol 12,13-didecanoato (PDD) (Lee e Blackshear,1987).

Evidências recentes sugerem que o LH também ativa a via dos

fosfoinositídeos, aumentando a atividade da PLC, gerando DAG e

subseqüentemente ativando a PK-C (Rommerts e Cooke,1988).

Apesar da contribuição da via dos fosfoinositídeos estimulada pelo LH

para a esteroidogênese não estar totalmente esclarecida, os

metabólitos dessa via podem contribuir para um efeito facilitatório ou

para a potenciação do estímulo mediado pelo AMPc na célula de

Leydig (Dufau,1988). Baixas concentrações de LH aumentam o Ca2+

livre intracelular sem produzir qualquer alteração detectável no AMPc

(Sullivan e Cooke,1985), o que pode indicar um mecanismo não-

dependente de AMPc na mobilização de Ca2+, como por exemplo o

mecanismo de IP3 (Steele e Leung,1992). No entanto, para a

esteroidogênese máxima ambas as vias parecem estar envolvidas

(Sullivan e Cooke,1985).


Tem sido demonstrado também que a ligação de alguns

receptores, além de ativar a fosfolipase C, também ativa a fosfolipase

A2 (PLA2), o que resulta na liberação de ácido araquidônico (AA) a

partir de fosfolipídios (Minegishi et al.,1987). O AA e seus metabólitos,

na via dos fosfoinositídeos, podem aumentar a atividade da PK-C

(McPhail et al.,1984). No testículo há evidências da implicação desta

via que leva à formação de AA no mecanismo de sinalização tanto do

LH (Abayasekara et al.,1990) quanto do LHRH (Lin,1985; Steele e

Leung,1992). O AA tem se mostrado efetivo em ativar a proteína

kinase dependente de Ca2+ e fosfolipídio, e estimular diretamente a

esteroidogênese na célula de Leydig, sugerindo que sua conversão

em prostaglandinas ou leukotrienos não é necessária para seu efeito

esteroidogênico (Lin,1985). Entretanto, outros investigadores

observaram que a hidrólise de fosfolipídios estimulada pelo LHRH é

acompanhada por níveis aumentados de prostaglandina E que

coincidem com a estimulação da esteroidogênese (Molcho et al.,1984),

ou ainda, encontraram produtos da lipoxigenase modulando os efeitos

de um agonista do LHRH (luliberina) dependentes do cálcio na

produção de testosterona em células de Leydig de rato (Sullivan e

Cooke,1985). Dix et al.(1984) sugerem que o AA também pode

desempenhar um papel significante como segundo mensageiro em

razão do fato de seus metabólitos estarem envolvidos na

esteroidogênese estimulada pelo LH; em seus estudos mostraram que

os produtos da via da lipoxigenase, mas não os da via da

cicloxigenase são importantes na ação do LH.

2. Ações do propranolol no testículo: envolvimento da PK-C

Wanderley (1986), em estudo in vitro utilizando uma preparação

de células intersticiais testiculares de rato referiu que a adição de

propranolol em concentrações variando de 1 μM a 10 μM aumenta


significativamente a produção basal de testosterona e diminui a

produção de AMPc e testosterona estimuladas pela gonadotrofina

coriônica humana (hCG). Nesse mesmo estudo observou que a

injeção intraperitoneal de propranolol não modificou os níveis

plasmáticos de testosterona. Tinajero et al. (1993) também referiram

que o S-propranolol inibe a secreção de testosterona e de AMPc

estimuladas pelo hCG. Contudo, esses autores observaram que o

propranolol inibe a secreção basal de testosterona. Lauritzen et

al.(1994) mostraram que o propranolol (RS e R de maneira

equipotente) induz um aumento no nível de PA (possível mensageiro

intracelular envolvido na modulação local da esteroidogênese

testicular) e uma inibição da síntese de testosterona estimulada pelo

LH em células de Leydig de rato. No seu estudo esses autores referem

que o efeito do propranolol sobre a secreção basal de testosterona foi

oposto ao encontrado por Tinajero et al.(1993).

Os efeitos do propranolol nos diferentes experimentos in vitro

aqui referidos foram demonstrados com concentrações da droga

similares ou um pouco mais elevadas do que aquelas alcançadas in

vivo na prática clínica. Assim, pode-se pensar que a droga quando

administrada terapeuticamente pode afetar os sistemas de tradução do

sinal nas células intersticiais testiculares.

Considerando o amplo uso clínico do propranolol, da

hipertensão à angina pectoris, onde são referidos os efeitos sexuais

colaterais, a elucidação do efeito estimulatório do propranolol sobre as

células de Leydig em um nível molecular é de significado terapêutico

potencial.


II. OBJETIVOS

1. OBJETIVOS GERAIS

1.1. Analisar os efeitos dos tratamentos agudo (diretamente in

vitro) e crônico (in vivo) com propranolol sobre a secreção

basal e estimulada de testosterona em preparações de

células intersticiais testiculares (in vitro);

1.2. Avaliar o envolvimento da via do DAG/PK-C na ação do

propranolol sobre a secreção de testosterona;

1.3. Avaliar os efeitos do tratamento crônico com propranolol

sobre a secreção de testosterona envolvendo a via do

AMPc/PK-A .

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.1. Comparar o efeito do propranolol com o de dois ativadores

da proteína quinase C – PDBu e LHRH, sobre a secreção

de testosterona;

2.2. Determinar o efeito do propranolol sobre a ligação do

[3H]PDBu às células intersticiais testiculares intactas ou

homogeneizadas;

2.3. Determinar o efeito do propranolol sobre a atividade da

PK-C;

2.4. Determinar o efeito do tratamento crônico com propranolol

sobre a secreção de testosterona estimulada por dois

ativadores da proteína quinase A – dbAMPc e hCG .


III. MATERIAL E MÉTODOS

1. Animais

Ratos machos Wistar (Ratus norvegicus albinus) adultos com

pesos entre 240 e 360g foram utilizados nos experimentos. Os animais

foram criados no biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco, recebendo

alimentação (ração Purina para ratos) e água filtrada ad libitum. Os

animais foram mantidos em sala com ventilação e iluminação naturais

(aproximadamente 12 horas de claro e 12 horas de escuro) e

temperatura que variava entre 25 e 29ºC durante todo o ano.

2. Reagentes

Albumina sérica bovina (BSA) Fração V obtida de Miles

(Naperville, IL) e de ICN Biomedicals Inc; Ácido tricloroacético (TCA),

Álcool etílico P.A., Azida de sódio, Bicarbonato de sódio (NaHCO3),

Cloreto de potássio (KCl), Cloreto de sódio (NaCl), Sacarose obtidos

de VETEC; Adenosina 5’-trifosfato (ATP), Azul tripan (direct blue 14),

Carvão ativado, Colagenase tipo I, Coomassie brilliant blue R 250,

Coquetel de inibidores de fosfatases, Coquetel de inibidores de

proteases, Dextran, Dithithreitol (DTT), Ácido

etilenodiaminotetraacético (EDTA), Ácido etilenoglicol bis (β-aminoetil

éter)-N,N,N’,N’-tetracético (EGTA), Fluoreto de fenilmetilsulfonato

(PMSF), Forbol 12,13-dibutirato (PDBu), Fosfatidilserina (PS, cérebro

bovino), Gelatina tipo III, Histona de timo de bezerro tipo III-S, Inibidor

da tripsina tipo 1S, Leupeptina, R-propranolol, RS-propranolol, S-

propranolol, 1-oleoyl-2-acetyl-rac-glycerol (OAG), 2,5-diphenyl-oxazole

(PPO), Testosterona, t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100),

Trizma hidrocloreto (Tris[hydroxymethyl]aminomethane hydrochloride)

obtidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); Meio de cultura 199


(Meio 199) obtido de GIBCO (Grand Island, NY); Etanol absoluto, 2,2’-

p-phenylen-bis(5-phenyloxazol) (POPOP) obtidos de MERCK; Percoll

obtido de Pharmacia (Uppsala, Sweden); 1,2,6,7 [3H] Testosterona,

[3H] Phorbol- 12,13-dibutyrate ([3H]PDBu) 16 Ci/mmol obtidos de

Amersham International (Buckinghamshire, England); Hormônio

liberador de hormônio luteinizante (LHRH) obtido de Península (San

Carlos, CA); [γ-32P] ATP 5000Ci/mmol obtido de New England Nuclear

(Boston, MA); DEAE-agarose obtida de Bio-rad (Hercules, CA); 1-(5-

Isoquinolinylsulfonyl)-2-methyl-piperazine (H-7) obtido de Seikagaku;

Éter etílico P.A. obtido de Proanalysi-Isofar; Cloreto de cálcio (CaCl2),

Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), Fosfato de sódio dibásico

(Na2HPO4.7H2O), Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O),

Glicerol, Tolueno P.A. obtidos de Reagen; Ácido fosfórico 85 % obtido

de Nuclear; Propranolol (Inderal 80 mg) obtido de Zeneca.

3. Grupos Experimentais

3.1. Células intersticiais tratadas agudamente com propranolol

Nesse estudo o S-propranolol foi adicionado diretamente

(in vitro) a uma preparação de células intersticiais testiculares

(enriquecidas ou não em células de Leydig) oriundas de

animais intactos.

3.2. Animais tratados cronicamente com propranolol

Para este estudo foram utilizados dois modelos de

tratamento crônico. O primeiro, referido por Martinez e Barthe

(1981) com ligeiras modificações, consistiu na administração de

RS-propranolol a 1% em água destilada nas doses de 30, 50 e

60 mg/Kg por via intraperitoneal durante um período de oito a

treze dias, fracionadas em duas injeções diárias, alternando a


cada injeção o lado da aplicação. Os controles receberam

solução salina isotônica.

O segundo modelo consistiu no tratamento durante cinco

a oito semanas com RS-propranolol (Inderal) 500 mg/L na água

de beber. Os controles receberam água de beber. Essa dose e

regime de tratamento foram escolhidos por serem eficazes em

produzir bloqueio β-adrenérgico (Gay et al., 1990). O inderal foi

escolhido por ser comumente usado para o tratamento de

hipertensão, induzindo disfunção sexual (Croog et al., 1988). O

tratamento foi iniciado com animais entre 50 e 60 dias de idade.

Após o período de tratamento previsto, os animais foram

sacrificados, os testículos foram removidos e as preparações

de células intersticiais foram obtidas e tratadas in vitro com S-

propranolol e os demais ativadores da esteroidogênese,

conforme descrito em Metodologia (itens 4.1.1 e 4.1.3).

4. Metodologia

4.1. Preparação e incubação das células intersticiais

testiculares

4.1.1.Obtenção das células intersticiais testiculares:

A obtenção das células foi realizada conforme

descrito por Hedger e Eddy (1986) modificado por

Wanderley e Udrisar (1994), e Wanderley e Negro-Villar

(1996). Os animais foram sacrificados por anestesia com

éter, e os testículos foram rapidamente removidos e

cuidadosamente descapsulados. Os testículos

descapsulados foram incubados em uma solução

enzimática (2 mL/testículo) contendo colagenase (0,5

mg/mL), inibidor da tripsina (0,2 mg/mL) e leupeptina (5


μg/mL) dissolvidos em tampão fosfato-salina (PBS)

(136,9 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4.7H2O,

1,47 mM KH2PO4) contendo albumina sérica bovina

(BSA) (1 mg/mL). O pH foi ajustado para 7,4. A

incubação durou 20-30 minutos em um banho-maria a

37ºC, sob agitação de 100 ciclos/minuto até a dispersão

dos túbulos em uma massa homogênea. O tecido

disperso foi imediatamente diluído à 50 mL com

PBS/BSA para diminuir o efeito da enzima, os túbulos

seminíferos sedimentados durante 2 minutos e o

sobrenadante foi filtrado através de malha de nylon (80

μm). O filtrado foi centrifugado em tubos plásticos de 50

mL a 150xg, 21ºC, durante 15 minutos. O sobrenadante

foi descartado e as células sedimentadas foram

ressuspendidas em M199/BSA contendo NaHCO3 (2,2

mg/mL) e BSA (1 mg/mL), com o auxílio de uma pipeta

plástica até que nenhum agregado celular fosse visível.

Essa suspensão foi centrifugada como anteriormente e

repetida a mesma operação duas vezes (3 lavagens). Em

seguida, as células foram contadas utilizando uma

câmara de Neubauer. O número de células a serem

incubadas foi determinado previamente em 0,25 x 106

células/0,5 mL de meio de incubação.

4.1.2.Purificação das Células de Leydig

As células de Leydig foram purificadas em gradiente

de Percoll descontínuo (Hedger e Eddy,1986; Wanderley

e Negro-Villar,1996; Wanderley et al., 2000). Para isto,

colocou-se cuidadosamente a suspensão de células (5


mL) dispersas obtidas através do procedimento descrito

no item 2.1 (após a primeira lavagem do filtrado das

células intersticiais) sobre o gradiente de Percoll (0 a

90%), realizando em seguida centrifugação a 1.300xg

durante 30 min a 21ºC. Os primeiros 8 mL aspirados a

partir do fundo do tubo −fração contendo as hemácias

(interface 82-90%)− foram descartados, e nos 8 mL

seguintes (interface 43-68%) foram obtidas as células de

Leydig. A fração de células de Leydig foi lavada duas

vezes em M199/BSA como descrito anteriormente para

as células intersticiais. Em seguida, as células foram

contadas utilizando uma câmara de Neubauer. O número

de células a serem incubadas foi determinado

previamente em 0,25 x 106 células/0,5 mL de meio de

incubação.

4.1.3.Secreção de testosterona in vitro

As preparações de células intersticiais testiculares,

enriquecidas ou não em células de Leydig (0,25 x 106

células/0,5 mL) foram pré-tratadas, em triplicata, em tubos

de polipropileno 12x75, por 5 minutos com M199 ou com

S-propranolol diluído em M199, e a seguir, foram

incubadas por 3 horas com M199, S-propranolol com ou

sem outras drogas teste, segundo protocolo de trabalho

(LHRH 10-7 M, PDBu 200 nM, hCG 1mUI/mL e dbAMPc 1

mM). As incubações foram realizadas, logo após a

obtenção da suspensão celular , a 34ºC sob atmosfera de

95% de O2 e 5% de CO2, em banho-maria tipo Dubnoff

com agitação de 60 ciclos por minuto. O inibidor da

proteína quinase C, H-7, foi adicionado 30 minutos antes


da adição de propranolol e, a suspensão foi então

incubada por um período adicional de 2 horas e 30

minutos. Após o término da incubação as células foram

precipitadas por centrifugação (150xg por 15 min) a 4 ºC,

o sobrenadante coletado e armazenado a -20ºC para

posterior determinação da testosterona por

radioimunoensaio (RIE).

4.2. Viabilidade Celular

Foi utilizado o critério de exclusão do corante azul tripan

(0,5%), o qual depende da integridade da membrana celular. A

leitura das células foi realizada na câmara de Neubauer. A

viabilidade celular foi expressa como a porcentagem de células

não coradas em relação ao número total de células. Essa

porcentagem variou entre 90 e 95 %. Esse estudo foi realizado

após o término das incubações.

4.3. Radioimunoensaio da Testosterona

A testosterona foi determinada diretamente no meio de

incubação (sem extração). As amostras do meio de incubação

(100 μL para os basais e 50 μL para células de Leydig

incubadas com hCG e dbAMPc) foram incubadas com

anticorpo anti-testosterona e 10.000 cpm de [3H]-Testosterona

a 4ºC, durante 20 horas, sendo o volume final da reação de

0,32 mL. O tampão de ensaio utilizado foi o PBS - 0,1%

gelatina. O anticorpo anti-testosterona foi desenvolvido em

coelhos e produzido no laboratório da Dra. Inês Wanderley

(UFPE), e sua diluição final no ensaio foi de 1:5.000.

Uma mistura de carvão-dextrana na concentração de

0,625% de carvão e 0,0625% de dextrana foi utilizada para


remover a testosterona livre. Os tubos foram centrifugados a

1.300xg, à 4ºC, durante 20 minutos. O traçador ligado ao

anticorpo foi lido em 0,4 mL do sobrenadante adicionado a

frascos de cintilação contendo 5 mL de solução de cintilação (3

g de PPO + 0,2 g de POPOP + 20 mL de metanol + 980 mL de

tolueno). A leitura foi realizada em um contador de cintilação

líquida (Liquid Scintillation Analyzer). Foram preparados

padrões de testosterona de 8, 16, 32, 64, 128, 256 e 512 pg/20

μL e dosados em triplicata. A testosterona das amostras foi

dosada em duplicata.

O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 8,1% e o

coeficiente inter-ensaio foi de 15,1%.

4.4. Atividade da proteína quinase C

4.4.1.Preparação da fração citosol + membrana

A preparação da enzima e o ensaio para atividade da

PK-C foram realizados de acordo com o procedimento de

Nikula et al. (1987), modificado por Wanderley e Negro-

Villar (1996), e Wanderley et al. (2000). As células

intersticiais testiculares de rato, aproximadamente 30x106

células, foram lavadas (150xg, 15 min, 4οC) 2 vezes em

0,5 mL de M199 e 1 vez em 2 mL de tampão de

homogeneização (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 2mM EDTA,

2 mM EGTA, 5 mM dithiothreitol (DTT) e 250 mM

sacarose), ressuspendidas em 1 mL deste tampão

contendo 0,1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonato (PMSF) e

50 μg/50μL de leupeptina, e homogeneizadas utilizando

um “Sonic dismembrator”, em intensidade baixa durante

30 segundos (3 sonicações com duração de 10 segundos


cada). O homogeneizado foi incubado com 0,1% de

triton X-100 a 4 οC por 30 minutos e, em seguida,

centrifugado a 100.000xg durante 60 minutos a 4 οC. O

sobrenadante (extrato cru) foi coletado e o “pellet”

descartado. A atividade da PK-C foi determinada após

cromatografia em DEAE-Agarose.

4.4.2.Purificação parcial da PK-C por cromatografia em

DEAE-Agarose

Os extratos crus de homogeneizados celulares

foram aplicados sobre colunas de DEAE-Agarose (de

volume total de aproximadamente 0,4 mL) equilibradas e

lavadas com tampão de homogeneização. As amostras

foram colocadas sobre as colunas e as colunas foram

então lavadas com 2mL de um tampão contendo 20 mM

Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 5 mM

DTT, 50 μg/mL leupeptina e 20 mM NaCl (tampão de

lavagem). As amostras foram eluídas da coluna com 1,2

mL de tampão de lavagem contendo 200 mM NaCl. As

proteínas totais do eluato foram determinadas, por

espectrofotometria no visível, pelo método de Bradford

(1976). Para isso, reagiram-se as proteínas da amostra

com 5 mL do corante Coomassie blue e foi feita a leitura

de absorbância em 595 nm (faixa de maior absorção do

corante). A concentração de proteínas na amostra foi

determinada por interpolação na curva de calibração,

obtida através das leituras de absorção para padrões

com concentrações conhecidas de albumina.


4.4.3.Determinação da atividade da PK-C

A atividade da PK-C foi determinada medindo-se a

incorporação de 32P a partir do [γ-32P] ATP na histona. A

mistura de reação ( volume total de 300 μl) continha 20

mM Tris-HCl, pH 7,4, 8 mM MgCl2, 400 μg/mL histona,

600 μM CaCl2, 25 μg/mL fosfatidilserina (PS), 3 μg/mL 1-

oleoil-2-acetil-rac-glicerol (OAG), 17 μM [γ- 32P] ATP (4 x

104 cpm/nmol) e 20 μL fração da enzima (30 μg). A

reação foi realizada em tubos de polipropileno 12x75.

Para preparar a mistura de lipídios, alíquotas de 10 mg

PS/mL de clorofórmio e 10 mg OAG/mL de clorofórmio

foram misturadas e o solvente removido sob nitrogênio.

O resíduo foi então suspendido em 20 mM Tris-HCl, pH

7,4, por sonicação em um “Sonic dismembrator” em

intensidade alta (3 sonicações com duração de 1 minuto

cada), em gelo, e as micelas lipídicas resultantes foram

adicionadas conforme especificado acima para o ensaio.

Para a medida da atividade basal, amostras em

triplicatas foram incubadas na ausência de PS e OAG. A

reação foi iniciada pela adição da fração da enzima. A

incubação, realizada por 3 min a 30 °C, foi finalizada pela

rápida adição em sequência de 50 μL 0,2% BSA, 50 μL

0,5% desoxicolato de sódio (DOC) e 2 mL de ácido

tricloroacético (TCA) 10% v/v, 4 °C, para obter um

precipitado firme. O precipitado foi lavado 3 vezes (1

mL/lavagem) com TCA 5% v/v a 4 °C contendo 10 mM

ATP e, então solubilizado com 0,25 mL 1 N NaOH a 60

°C por 10 minutos. Amostras de 100 μL foram removidas

em duplicatas e transferidas para viais de cintilação


contendo 0,1 mL 1 N HCl. A radioatividade foi medida

por espectrometria de cintilação líquida. A atividade da

proteína quinase C foi calculada pela diferença de

incorporação de 32P na histona em presença e em

ausência dos fosfolipídios (PS e OAG) e Ca2+, sendo

expressa em picomoles de 32P incorporado min-1 mg

proteína-1.

4.5. Ligação do [3H]PDBu às células intersticiais testiculares

O ensaio de ligação para as células intersticiais

testiculares foi realizado em tubos Eppendorf com um volume

final de 500 μL para a mistura de incubação. As células

intersticiais testiculares (5x106 células em M199 contendo 0,1

% BSA) foram pré-incubadas com diferentes concentrações de

S-propranolol ou PDBu a 34°C durante 15 minutos, e tratadas

com [3H]PDBu (≈40.000 cpm) durante 15 minutos. Os tubos

foram centrifugados a 12.000 rpm durante 1 minuto em uma

microcentrífuga IEC MB. Após a centrifugação, o sobrenadante

foi decantado de cada tubo e uma alíquota foi retirada para

determinar a concentração de [3H]PDBu livre. O “pellet” foi

lavado uma vez em M199/BSA e o sobrenadante

completamente removido e descartado. O fundo do tubo

contendo o “pellet” foi cortado e transferido para um vial de

cintilação. O “pellet” foi dissolvido com 100 μL de 1 N NaOH, e

neutralizado com igual volume de 1 N HCl. A radioatividade foi

contada tanto nas alíquotas de sobrenadante quanto nos

“pellets” dissolvidos. A ligação inespecífica foi avaliada na

presença de 10 μM PDBu não marcado. A ligação específica


representa a diferença entre a ligação total e a inespecífica. A

determinação da capacidade e afinidade de ligação do

[3H]PDBu às células intersticiais testiculares foi realizada

segundo o método gráfico Scatchard (Scatchard, 1949).

4.6. Ligação do [3H]PDBu à fração DEAE-Agarose

Após obtenção, as células intersticiais testiculares de rato,

aproximadamente 30x106 células, foram centrifugadas a 150xg

durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o

“pellet” foi lavado em 3 mL de tampão de homogeneização a

150xg durante 15 minutos a 4 °C. Após nova lavagem em 1 mL

de tampão de homogeneização a 1.300xg durante 10 minutos a

4°C, o “pellet” foi ressuspendido em 1 mL de tampão de

homogeneização 0,1 mM PMSF, e então sonicado em

intensidade baixa (3 sonicações com duração de 10 segundos

cada) em um “Sonic dismembrator” a 4°C. O homogeneizado

foi incubado durante 30 minutos a 4 °C com 0,1 % triton X-100

em 1 mL de tampão de homogeneização. Em câmara fria,

foram pipetados 1 mL de amostra por tubo Eppendorf para

microcentrífuga. Após 2 minutos de centrifugação, o

sobrenadante foi colocado sobre coluna de DEAE-agarose

(volume total igual a 2 mL) previamente lavada e equilibrada

com tampão de homogeneização. O eluato foi coletado e

passado 3 vezes pela coluna para obter saturação. A coluna foi

lavada com 2 x volume da coluna com tampão contendo 20

mM NaCl. As amostras foram eluídas da coluna com 3 mL de

tampão contendo 200 mM NaCl (1 mL por vez). O ensaio de

ligação foi realizado em tubos de reação contendo, em um

volume total de 300 μL, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mg/mL


BSA, 1 mM CaCl2, 7,5 mM MgCl2, 200-400 μg/mL de proteína

da fração DEAE-A, 200 μg/mL PS e [3H]PDBu (≈ 40.000 cpm).

Para preparar a mistura de lipídios, alíquotas de 10 mg PS/mL

de clorofórmio e 10 mg OAG/mL de clorofórmio foram

misturadas e o solvente removido sob nitrogênio. O resíduo foi

então suspendido em 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, por sonicação

em um “Sonic dismembrator” em intensidade alta (3 sonicações

com duração de 1 minuto cada), em gelo, antes da adição à

mistura de incubação. Os tubos foram pré-incubados com

diferentes concentrações de PDBu ou propranolol a 37 °C por

15 minutos e tratados com [3H]PDBu por mais 15 minutos. A

ligação inespecífica foi avaliada na presença de 10 μM PDBu

não marcado. Os tubos foram imediatamente transferidos para

um banho de gelo. A separação do [3H]PDBu livre do ligado foi

obtida pelo uso de uma mistura de carvão-dextrana (7,5

mg/tubo). Os tubos foram centrifugados a 1.300xg, à 4 ºC,

durante 20 minutos. A fração ligada (sobrenadante) foi

transferida para viais contendo 5 mL de solução de cintilação

para contagem. A ligação específica representa a diferença

entre a ligação total e a inespecífica.

5. Tratamento Estatístico

Os dados experimentais representam a média ± o erro padrão

da média (média ± EPM) dos valores obtidos para cada grupo.

A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o teste t

de Student para comparações dos valores basais de cada grupo

com os experimentais (propranolol, LHRH, PDBu, hCG, hCG +

propranolol, dbAMPc e dbAMPc + propranolol), e análise de


variância para comparação entre os grupos. Os valores com p <

0,05 (quando indicado) foram considerados significativos.


III. RESULTADOS

1. TRATAMENTO AGUDO

1.1. Efeito do propranolol sobre a secreção de testosterona em

preparação enriquecida em células de Leydig

O objetivo desses estudos foi verificar os efeitos da adição

direta do propranolol em uma preparação enriquecida em células

de Leydig, sobre a secreção basal e estimulada de testosterona,

para determinar se o propranolol estimula a secreção de

testosterona em células de Leydig de rato através da ativação da

via da proteína quinase C (PK-C). A Figura 3 mostra que o

0

TEST

OST

ERO

NA

(n

g/m

L)

CONCENTRAÇÃO DE PROPRANOLOL ( M)

0,0

0,5

1,0

10 100 10001

Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de S-propranolol sobre a

secreção de testosterona em preparação enriquecida em células de Leydig de

rato. As células (0,25 x 106/0,5 mL) foram incubadas durante 3 horas. Os

resultados representam a média ± EPM de três determinações.


propranolol, em doses variando de 100 nM a 100 μM (10-7 M a 10-4

M), produziu um aumento dependente da concentração da

secreção de testosterona após 3 horas de incubação. A adição de

uma concentração mais alta de propranolol (1000 μM) não

modificou a secreção de testosterona pela preparação enriquecida

em células de Leydig.

1.2. Efeito do propranolol adicionado junto com PDBu, LHRH

ou H-7 na secreção de testosterona em preparação

enriquecida em células de Leydig

Os objetivos desse experimento foram: 1. Determinar se o

propranolol era capaz de modificar o estímulo secretório máximo

produzido pelo PDBu ou pelo LHRH, conhecidos ativadores da PK-

C, sobre a secreção de testosterona por células de Leydig de rato

(Nikula et al., 1987; Romanelli et al.,1987; Wanderley e Negro-

Villar,1996), e 2. Determinar o efeito do inibidor da PK-C, H-

7, adicionado 30 minutos antes da adição do propranolol,

sobre o efeito estimulatório desta droga na secreção de

testosterona. A Tabela 1 mostra que concentrações estimulantes

máximas de propranolol (100 μM) e PDBu (200 nM) ou LHRH (10-7

M) foram adicionadas isoladamente ou em combinação ao meio de

incubação. A combinação de qualquer um dos ativadores da PK-C

produziu um aumento leve e não significante na secreção de

testosterona quando comparada com a produzida em resposta à

adição do propranolol isoladamente. Em relação à resposta obtida

pela adição do H-7, a tabela mostra que esta droga suprimiu a

resposta ao propranolol em aproximadamente 50%. A falta de

aditividade de resposta às concentrações máximas das drogas

estudadas e a inibição do efeito estimulatório do propranolol pelo


H-7 sugerem uma provável participação da PK-C na ação do

propranolol nestas células.

Tabela 1. Efeito do S-propranolol adicionado junto com PDBu, LHRH ou H-7

sobre a secreção de testosterona em preparação enriquecida em células de

Leydig. As células (0,25 x 106/0,5 mL) foram incubadas durante 3 horas.

Adições Testosterona (ng/mL)

Ausência 100

μM

S-propranolol

Presença 100 μM

S-propranolol

Basal 0,16 ± 0,02 1,15 ± 0,15

PDBu (200 nM) 1,06 ± 0,09 1,43 ± 0,28

LHRH (10-7 M) 1,13 ± 0,12 1,53 ± 0,17

H-7 (20 μM) 0,34 ± 0,03 0,59 ± 0,09*

O H-7 foi adicionado 30 minutos antes da adição de S-propranolol. Os

dados representam a média ± EPM de determinações em triplicata. *

p< 0,05 versus propranolol isoladamente.

1.3. Efeito do propranolol na atividade da PK-C

Os resultados mostrando que os efeitos estimulatórios do

propranolol e do PDBu sobre a secreção de testosterona não

foram aditivos sugerem a possibilidade de ativação da PK-C pelo

propranolol. Para determinar se o propranolol ativa diretamente a

PK-C, esta droga foi adicionada diretamente à mistura de reação

(conforme descrito na Metodologia). A Figura 4 mostra que, em

baixas concentrações o S- ou o R-propranolol (os dois

estereoisômeros opticamente ativos de propranolol) na ordem de 1


nM (10-9 M) fosforilaram totalmente a histona. O aumento na

fosforilação da histona foi cerca de 90 - 100% para

concentrações de propranolol variando de 1 nM a 100 μM

(aumento equivalente ao obtido com quantidades saturantes de PS

(25 μg/mL)). Em concentrações suficientemente altas (1000 μM) o

propranolol aumentou a fosforilação da histona em apenas cerca

de 30% acima dos níveis basais. Para evidenciar se este efeito

estimulatório do propranolol foi na atividade da PK-C, o H-7, um

inibidor desta enzima, foi adicionado à mistura de reação (Figura

200

100

0BASAL PS

S - Propranolol

R - Propranolol

% D

E AT

IVID

AD

E D

A P

K-C

10 100 10001


Figura 4. Efeito do propranolol sobre a atividade da PK-C. As células

intersticiais testiculares (30 x 106) foram lisadas por sonicação para extração,

purificação parcial em DEAE-Agarose (fração DEAE-A) e ensaio de atividade

da PK-C como descrito na Metodologia. A atividade na ausência de PS e Ca2+

(30,13 ± 1,14 pmoles 32P min-1 mg proteína-1) foi definida como basal (100%).

Os resultados representam a média ± EPM de um experimento representativo.


5). O H-7 é um inibidor de quinases que, na PK-C, atua no domínio

catalítico desta enzima (Hayashi,1992). Na presença do H-7 o

efeito estimulatório do propranolol na enzima foi abolido. Um

resultado similar foi obtido na ausência de Ca2+ (Figura 5).

A ligação da PK-C à PS é cooperativa e aumentada na presença

de Ca2+ de uma maneira dependente da concentração (Hannun e

Bell, 1986) e, postula-se que o Ca2+ possa participar no

"clustering" de

200

100

0

% D

E AT

IVID

AD

E D

A P

K- C

BASAL PS S-Prop. 10 Mμ PS+Ca2+ +Ca2+ - Ca2+

S-Prop.- Ca2+

PS+ H7 + H7

S-Prop.10 Mμ 10 Mμ

Figura 5. Efeito do H-7 e da ausência de Ca2+ na ação do propranolol sobre a

atividade da PK-C. As células intersticiais testiculares (30 x 106) foram lisadas

por sonicação para extração, purificação parcial em DEAE-Agarose (fração

DEAE-A) e ensaio de atividade da PK-C como descrito na Metodologia. A

atividade da PK-C foi medida na presença de 25 μg/mL de PS ou S-propranolol

(10 μM) na presença ou ausência de 500 μM Ca2+ ou 20 μM H-7. A atividade na

ausência de PS e Ca2+ (30,13 ± 1,14 pmoles 32P min-1 mg proteína-1) foi definida

como basal (100%). Os resultados representam a média ± EPM de um


experimento representativo.

fosfolipídio (Bazzi e Nelsestuen, 1991), formando uma ponte entre

a PK-C e o lipídio acídico (Hannun et al.,1985, 1986).

1.4. Comparação da ligação do [3H]PDBu às células

intersticiais testiculares e à fração DEAE-agarose

Devido ao efeito estimulatório do propranolol sobre a

atividade da PK-C in vitro considerou-se necessário verificar se o

sítio de interação do propranolol com a PK-C era o mesmo que o

do PDBu com esta enzima. Com este propósito, foi estudada a

capacidade do propranolol inibir a ligação do [3H]PDBu às células

intersticiais testiculares ou à fração DEAE-agarose. O PDBu é

conhecido por ligar-se e ativar a PK-C. Os sítios que se ligam ao

[3H]PDBu são específicos também para o PDBu, de forma que o

PDBu impede, por competição, a ligação do PDBu marcado

proporcionalmente às suas concentrações relativas no meio de

incubação. A Figura 6A mostra que a concentração de PDBu que

dá uma ligação de 50% da máxima obtida com o PDBu marcado

para 5 x 106 células/tubo ou para 265,2 μg da fração DEAE/tubo,

foi de 20 nM. O Kd e a capacidade máxima de ligação (gráfico de

Scatchard –Figura 7) foi 20 nM e 94,962/célula, respectivamente.

Conforme esperado, as curvas de competição correspondentes se

superpuseram, indicando a mesma afinidade para o [3H]PDBu e

PDBu em ambas preparações. Considerando que o propranolol

une-se aos mesmos sítios aos quais o PDBu se une e que

apresenta afinidade e especificidade equivalentes, era de se

esperar que o propranolol prevenisse, como o fez o PDBu, a

ligação de [3H]PDBu às células intersticiais testiculares e à fração

DEAE-agarose. A Figura 6B, mostra a ligação sob condições de


ensaio idênticas às da Figura 6A, mas na presença de diferentes


95

90

80

7060504030

20

10

10 100 1000

CÉLULA

FRAÇÃO DEAE - agarose

CONCENTRAÇÃO DE PDBu (nM)

PER

CEN

TUA

L D

E [

H] P

DB

u LI

GA

DO

3

A

95

90

80

7060504030

20

10

10 100 1000

CÉLULA

FRAÇÃO DEAE - agarose


PER

CEN

TUA

L D

E [

H] P

DB

u LI

GA

DO

3

B

Figura 6. Ligação de [3H]PDBu à fração DEAE-A e às células intersticiais

testiculares em função da concentração de PDBu (A) ou de propranolol (B). A

fração DEAE-A foi analisada para ligação específica do [3H]PDBu na presença

de 200 μg/mL de PS, 500 μM Ca2+ e 7,5 mM MgCl2. As células intersticiais

testiculares (5 x 106) foram pré-incubadas a 37°C durante 15 minutos com as

concentrações indicadas de PDBu ou S-propranolol e expostas durante mais

15 minutos ao [3H]PDBu (≈ 40.000 cpm). A ligação inespecífica foi determinada

na presença de excesso de PDBu não radioativo (10 μM). Os pontos

representam a média ± EPM de quadruplicatas de um experimento

representativo. Dois experimentos adicionais deram resultados similares.


concentrações de propranolol. A inibição de 50% da ligação

máxima do [3H]PDBu às 5 x 106 células/tubo ocorreu na

concentração de aproximadamente 75 μM de propranolol. Em

contraste, com a mesma concentração de propranolol,

aproximadamente 95% do [3H]PDBu permaneceram ainda ligados

aos 265,2 μg da fração DEAE/tubo, indicando que o propranolol

não foi capaz de se ligar aos mesmos sítios que o [3H] PDBu.

Figura 7. Análise de Scatchard da ligação de [3H]PDBu às células intersticiais

testiculares. As células intersticiais testiculares (5 x 106) foram pré-incubadas a

37 °C durante 15 minutos com PDBu e expostas durante mais 15 minutos ao

[3H]PDBu (≈ 40.000 cpm). Os parâmetros para a reta foram determinados por

regressão linear (r= -0,9879).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,80,00

0,02

0,04

0,06

0,08

LIG

AD

O/L

IVR

E (p

mol

/5 x

106 c

élul

as/n

M)

[3H]PDBu LIGADO (pmol/5 x 106 células)


2. TRATAMENTO CRÔNICO COM PROPRANOLOL

O tratamento crônico justificou-se por duas razões: 1ª) pelo fato

conhecido de que o uso prolongado de um fármaco pode levar à

dessensibilização da resposta do organismo ao mesmo e, 2ª) pela

maior semelhança com o uso clínico do propranolol.

Foram utilizadas as mesmas abordagens metodológicas vistas

nos estudos anteriores (agudos), para demonstrar o envolvimento

da PK-C. Também foram realizados estudos para determinar se o

tratamento crônico com propranolol dessensibilizava a via do

AMPc/PK-A, tendo em vista que o tratamento agudo in vitro reduz a

secreção de testosterona estimulada pelo hCG (Tinajero et al.,1993;

Wanderley, 1986) e pelo dbAMPc (Lauritzen et al.,1994;

Wanderley,1986), ativadores indireto e direto da PK-A,

respectivamente.

2.1. Efeito do tratamento crônico com propranolol durante oito

dias sobre a secreção de testosterona estimulada com

propranolol, LHRH e PDBu em células intersticiais testiculares

Nesses estudos os animais foram tratados com doses de 30, 50

e 60 mg/Kg de peso corporal de propranolol por via intraperitoneal,

fracionadas em duas injeções diárias durante um período de oito a

catorze dias, de acordo com protocolo de Martinez e Barthe (1981),

escolhendo-se a dose de 30 mg/Kg e um período de oito dias de

tratamento devido a alta letalidade observada com as outras doses

e/ou períodos de tratamentos mais longos. Observou-se que a

injeção intraperitoneal de propranolol em doses mais elevadas

produzia intensa perda de peso nos animais tratados, e ao exame

da cavidade abdominal foram observadas áreas de fibrose mais

intensas com tratamentos mais prolongados, tais lesões também


foram referidas pelos autores citados acima. Entretanto, não foram

observadas diferenças nos pesos dos testículos.

Na Figura 8 são apresentados os resultados da produção de

testosterona em preparação de células intersticiais de rato obtidas

de animais tratados durante oito dias com propranolol. Os agentes

estimulatórios foram o S-propranolol, o LHRH e o PDBu, estes

últimos ativadores indireto e direto da PK-C, respectivamente, os

quais foram adicionados diretamente às preparações celulares.

Observou-se que o tratamento durante oito dias bloqueou

completamente o efeito estimulatório do S-propranolol, do LHRH e

-70

0

70

140

210

280

** *

PDBuLHRHS-prop

TES

TOS

TER

ON

AΔ%

(ES

TIM

ULA

DO

- B

AS

AL)

Controle RS-prop 8 dias

Figura 8: Efeito do tratamento crônico com 30 mg/Kg propranolol (por via

intraperitoneal) durante oito dias sobre a secreção de testosterona estimulada

pelo S-propranolol (100 μM), LHRH ( 10-7 M), PDBu (200 nM). As células

intersticiais testiculares (0,25 x 106/0,5 mL) foram incubadas durante 3 horas.

Δ% estimulado-basal: diferença percentual (Δ%) da produção de testosterona

estimulada menos a basal do respectivo grupo. Os resultados representam a

média ± EPM de incubações em triplicata.

* p<0,05 em relação ao respectivo controle (ANOVA).


do PDBu sobre a produção de testosterona.


dias sobre a atividade da proteína quinase C

Tendo em vista os resultados obtidos de estimulação da

atividade de uma putativa PK-C in vitro pelo propranolol, os animais

foram submetidos a um tratamento prolongado com propranolol

para verificar se o mesmo modificava a atividade da PK-C nas

células intersticiais testiculares. A Figura 9 mostra que houve uma

tendência

0

30

60

90

120

ATI

VID

AD

E D

A P

K-C

Δ% (E

STI

MU

LAD

O -

BA

SA

L)

Controle RS-prop 8 dias

Figura 9: Efeito do tratamento com 30 mg/Kg propranolol por via intraperitoneal

durante oito dias sobre a atividade da proteína quinase C. As células intersticiais

testiculares (30 x 106) foram homogeneizadas por sonicação para extração,

purificação parcial em DEAE-Agarose (fração DEAE-A) e ensaio de atividade da

proteína quinase C, conforme descrito em Material e Métodos. A atividade na

ausência de PS e Ca2+ (controle:39,67 ± 4,43 pmoles 32P min-1 mg proteína-1;

propranolol: 44,5 ± 0,45 pmoles 32P min-1 mg proteína-1) foi definida como basal


(100 %). Os resultados representam a média ± EPM de incubações em

triplicata.

à redução da atividade da PK-C após o tratamento crônico

durante oito dias com 30 mg/kg propranolol, sem contudo haver

alcançado significância estatística.

2.3. Efeito do tratamento crônico com propranolol durante cinco


propranolol, LHRH e PDBu em células intersticiais de rato

Considerando que o tempo de oito dias de exposição ao

propranolol não tenha sido suficiente para modificar a atividade da

proteína quinase C, passou-se a utilizar um período de tratamento

mais longo. Contudo, devido aos inconvenientes observados

utilizando a via peritoneal após um período prolongado de tempo

(com catorze dias observou-se intensa reação inflamatória com

fibrose no local da aplicação, levando à perda de peso e maior

número de mortes dos animais) adotou-se para esse tratamento

mais prolongado a via oral (500mg/L propranolol na água de beber

durante cinco a seis semanas).

A Figura 10 mostra que o tratamento crônico com propranolol

durante cinco semanas inibiu completamente o efeito estimulatório

do S-propranolol sobre a produção de testosterona. Essa Figura

mostra ainda que o tratamento com propranolol também

diminuiu, porém de forma não significante, o efeito estimulatório do

PDBu, ativador direto da PK-C, sobre a secreção de testosterona.

Em relação ao LHRH, ativador indireto da PK-C, o tratamento

crônico com propranolol, ao contrário, mostrou tendência a aumento

do efeito estimulatório desse ativador sobre a secreção de

testosterona.


0

30

60

90

*

PDBuLHRHS-prop

TES

TOST

ER

ON

AΔ%

(EST

IMU

LAD

O -

BA

SA

L)

Controle RS-prop 5 semanas

Figura 10. Efeito do tratamento com propranolol (500 mg/L na água de beber)

durante cinco semanas sobre a secreção de testosterona estimulada por S-

propranolol (100 μM), LHRH (10-7 M) e PDBu (200 nM). As células intersticiais

testiculares (0,25 x 106/0,5 mL) foram incubadas durante 3 horas.

Δ% estimulado – basal: diferença percentual (Δ%) da produção de testosterona

estimulada menos a basal. Os resultados representam a média ± EPM de

incubações em triplicata.

* p<0,05 em relação ao respectivo grupo controle.

2.4. Efeito do tratamento crônico com propranolol durante

cinco semanas sobre a atividade da proteína quinase C

Na Figura 11 observa-se que o tratamento mais prolongado

com propranolol modificou significativamente a atividade da PK-

C. Contudo, quando os valores basais ou estimulados dos dois

grupos são comparados entre si não são observadas diferenças

significativas. Ou seja, a diferença entre o grupo controle e o grupo

tratado com propranolol se deu às custas do valor basal médio do


grupo tratado ser mais alto (embora não significante) e do valor

estimulado médio ser mais baixo (embora não significante) em

relação ao controle.

0

30

60

90

*

ATI

VID

AD

E D

A P

K-C

Δ% (E

STI

MU

LAD

O -

BA

SA

L)


Figura 11. Efeito do tratamento com propranolol (500 mg/L na água de beber)

durante cinco semanas sobre a atividade da proteína quinase C. As células

intersticiais testiculares (30 x 106) foram homogeneizadas por sonicação para

extração, purificação parcial em DEAE-Agarose (fração DEAE-A) e ensaio de

atividade da proteína quinase C, conforme descrito em Material e Métodos. A

atividade na ausência de PS e Ca2+ (controle: 57,34 ± 3,01 pmoles 32P min-1 mg

proteína-1; propranolol: 60,15 ± 3,36 pmoles 32P min-1 mg proteína-1) foi definida

como basal (100 %).

Os resultados representam a média ± EPM de incubações em triplicata.

* p < 0,05 em relação ao Δ % da atividade da PK-C do grupo controle.

2.5. Ligação do [3H]PDBu às células intersticiais testiculares de

animais tratados com propranolol durante cinco semanas


A capacidade do propranolol adicionado in vitro de inibir a

ligação do [3H]PDBu às células intersticiais testiculares obtidas dos

animais cronicamente tratados com esta droga foi estudada. A

Figura 12A mostra que a concentração de PDBu que dá uma

ligação de 50% da máxima obtida com o PDBu marcado para 5 x

106 células/tubo foi de 25 nM. O Kd e a capacidade máxima de

ligação (Figura 13) foi 17,54 nM e 75,877/célula, respectivamente

para as células de animais controle e de animais tratados

cronicamente com o propranolol. Não houve diferença entre as

curvas de competição correspondentes às células intersticiais

testiculares de animais tratados com propranolol cinco semanas e

aquelas obtidas dos animais controle, indicando a mesma afinidade

para o [3H]PDBu e PDBu em ambas preparações. A Figura 12B,

mostra a ligação sob condições de ensaio idênticas às da Figura

12A, mas na presença de diferentes concentrações de propranolol.

A inibição de 50% da ligação máxima do [3H]PDBu às 5 x 106

células/tubo ocorreu na concentração de aproximadamente 100 μM

de propranolol. E, novamente não foram observadas diferenças na

ligação ao [3H]PDBu e PDBu entre as preparações celulares obtidas

de animais controle e de animais tratados durante cinco semanas

com propranolol.


1 10 100 10005

10

25

50

75

90

95

A

CONTROLE PROP 5 SEMANASPE

RC

ENTU

AL

DE

[3 ]PD

Bu L

IGA

DO

CONCENTRAÇÃO DE PDBu (nM)

1 10 100 10005

10

25

50

75

90

95

B

CONTROLE PROP 5 SEMANASP

ERC

ENTU

AL

DE

[3 H]P

DBu

LIG

ADO

CONCENTRAÇÃO DE PROPRANOLOL (μM)

Figura 12. Ligação de [3H]PDBu às células intersticiais testiculares obtidas de

animais tratados com propranolol durante cinco semanas, em função da

concentração de PDBu (A) ou de propranolol (B). As células intersticiais

testiculares (5 x 106) foram pré-incubadas a 37°C durante 15 minutos com as

concentrações indicadas de PDBu ou S-propranolol e expostas durante mais 15

minutos ao [3H]PDBu (≈ 40.000 cpm). A ligação inespecífica foi determinada na

presença de excesso de PDBu não radioativo (10 μM). Os pontos representam a

média ± EPM de quadruplicatas de um experimento representativo. Dois

experimentos adicionais deram resultados similares.


0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

RS-PROP 5 SEMANAS

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

CONTROLE

LIG

ADO

/LIV

RE

(nm

ol/5

x 1

06 cél

ulas

/nM

)

PDBu LIGADO (nmol/5 x 106 células)

Figura 13. Análise de Scatchard da ligação de [3H]PDBu às células intersticiais

testiculares de animais tratados com propranolol durante cinco semanas. As

células intersticiais testiculares (5 x 106) foram pré-incubadas a 37 °C durante 15

minutos com PDBu e expostas durante mais 15 minutos ao [3H]PDBu (≈ 40.000

cpm).


dias ou cinco semanas sobre a secreção de testosterona

estimulada com hCG e dbAMPc em células intersticiais de rato

Considerando que o propranolol adicionado diretamente in vitro

inibe a via do AMPc/PK-A, a qual está envolvida na secreção de

testosterona pelas células de Leydig (Tinajero et al.,1993,

Wanderley,1986), foi de interesse verificar se o tratamento crônico

com propranolol também modificava a via do AMPc/PK-A. Para isso

as células intersticiais testiculares oriundas de animais tratados

cronicamente com propranolol foram estimuladas com hCG e


dbAMPc, ambos ativadores indireto e direto da PK-A,

respectivamente. Na Figura 14 observa-se que o tratamento com

propranolol durante oito dias inibiu o efeito estimulatório do hCG

sobre a secreção de testosterona. A Figura 15 mostra que o

tratamento com propranolol durante cinco semanas também inibiu

o efeito estimulatório do hCG sobre a secreção de testosterona. Nas

Figuras 14 e 15 observa-se ainda que a adição direta in vitro de

100 μM propranolol às células obtidas de animais cronicamente

tratados com propranolol foi capaz de inibir (completamente no

0

900

1800

2700

hCG + S-prophCG

*

TES

TOS

TER

ON

AΔ%

(ES

TIM

ULA

DO

- B

AS

AL) Controle

RS-Prop 8 dias

Figura 14. Efeito do tratamento crônico com 30 mg/Kg propranolol (por via

intraperitoneal) durante oito dias sobre a secreção de testosterona estimulada

pelo hCG (1mUI/mL), na ausência ou na presença de 100 μM S-propranolol. As

células intersticiais testiculares (0,25 x 106/0,5 mL) foram incubadas durante 3

horas.


estimulada menos a basal do respectivo grupo.


* p<0,05 em relação ao Δ % do respectivo grupo controle.


caso do tratamento durante cinco semanas) o efeito estimulatório do

hCG sobre a secreção de testosterona, resultado similar ao obtido

em estudos agudos in vitro (Tinajero et al., 1993; Wanderley,1986).

0

200

400

600

800 Controle RS-Prop 5 semanas

*

hCG + S-prophCG

TES

TOS

TER

ON

AΔ%

(ES

TIM

ULA

DO

- B

AS

AL)

Figura 15. Efeito do tratamento crônico com propranolol 500 mg/L na água de

beber durante cinco semanas sobre a secreção de testosterona estimulada pelo

hCG (1mUI/mL), na ausência ou na presença de 100 μM S-propranolol. As


horas.


estimulada menos a basal do respectivo grupo.


* p<0,05 em relação ao Δ % do respectivo grupo controle (ANOVA).

A produção de testosterona estimulada pela adição do

dbAMPc às preparações celulares também foi inibida pelo

tratamento crônico com propranolol (Figura 16), ou seja, o dbAMPc

não reverteu a ação inibitória do propranolol, indicando que a ação

inibitória do propranolol sobre a secreção de testosterona

poderia


ocorrer em um efetor intracelular posterior à formação do AMPc.

0

400

800

1200

1600


*

dbAMPc + S-propdbAMPc

TES

TOS

TER

ON

AΔ%

(ES

TIM

ULA

DO

- B

AS

AL)

Figura 16. Efeito do tratamento crônico com propranolol 500 mg/L na água de

beber durante cinco semanas sobre a secreção de testosterona estimulada pelo

dbAMPc (1 mM), na ausência ou na presença de 100 μM S-propranolol. As


horas.


estimulada menos a basal.


* p<0,05 em relação ao respectivo grupo controle.


V. DISCUSSÃO

Diversos trabalhos têm descrito vários efeitos do propranolol

não atribuídos a sua clássica ação bloqueadora β-adrenérgica que

dependem de suas propriedades anestésicas e estabilizadoras da

membrana e, que podem interferir com a tradução de sinal através da

membrana a nível molecular (Anderson et al.,1996; Bazan et al.,1985;

Dachary-Prigent et al.,1979; Dash e Rao,1995; Gay e Murray,1991;

Jamal et al.,1991; Koul e Hauser,1987; Lauritzen et al.,1994; Marshall

et al.,1975; Sozzani et al.,1992; Surewicz e Leyko,1981; Weitman et

al.,1989; Weksler et al.,1977). O propranolol é uma amina lipofílica

primária, relativamente não tóxica (English,1996), que atravessa

rapidamente as membranas celulares (Meier e Ruoho,1984 apud

Meier et al.,1998), liga-se preferencialmente aos fosfolipídios

(fosfatidilserina, ácido fosfatídico e fosfatidilinositol) em membranas

celulares (Bazan et al.,1985; Dachary-Prigent et al.,1979; Surewicz e

Leyko,1981; Weksler et al.,1977), acumula-se nas células por

particionamento nos compartimentos acídicos intracelulares (Perry et

al.,1992), afetando também a via metabólica para ácido fosfatídico e

fosfoinositídeos de diferentes tecidos (Bazan et al.,1985; Koul e

Hauser,1987; Lauritzen et al.,1994; Sozzani et al.,1992).

Os resultados deste estudo obtidos com o modelo de tratamento

agudo com propranolol mostram que o propranolol produz um

aumento na secreção de testosterona, dependente da concentração,

em doses variando de 100 nM a 100 μM. Adicionalmente, mostram

que em baixas concentrações (1 nM a 100 nM) essa droga aumenta a

fosforilação da histona e que a PK-C pode ser a quinase putativa

envolvida nesta reação. Foi também referido que a ativação desta

quinase putativa pode estar envolvida no efeito estimulatório do


propranolol sobre a secreção de testosterona pelas células de Leydig

de ratos. Este envolvimento é substanciado pelas seguintes

observações. Primeiro, o achado de que o H-7, um inibidor da PK-C,

bloqueou o efeito estimulatório do propranolol na secreção de

testosterona, e o fato de que o aumento na secreção de testosterona

exercido pelo PDBu e pelo LHRH (ativadores direto e indireto da PK-

C, respectivamente - Nikula e Huhtaniemi,1988; Wanderley e Negro-

Villar,1996) não foi modificado pelo propranolol, indicando o mesmo

mecanismo de ação para as três drogas. Apesar de se saber que o H-

7 pode bloquear outras proteínas quinases, particularmente a proteína

quinase dependente de AMPc, estes efeitos adicionais não

representam um problema no caso do propranolol, uma vez que foi

demonstrado que este β-bloqueador inibe a via do AMPc em células

de Leydig (Tinajero et al.,1993; Wanderley,1986). Contudo, não é

possível descartar a participação de outras quinases no efeito inibitório

do H-7. Segundo, o propranolol inibiu a ligação de [3H]PDBu às células

intersticiais testiculares. Esta inibição foi dependente da dose.

Entretanto, a concentração de propranolol necessária para obter 50%

de ligação do [3H]PDBu às células (5 x 106 células/tubo), foi

aproximadamente 1.000 vezes maior do que aquela observada com o

PDBu. Na fração DEAE-A, o estudo da ligação do [3H]PDBu mostrou

um comportamento diferente quando comparado ao estudo da ligação

do [3H]PDBu à preparação celular. Nas células, a inibição de 50% da

ligação ocorreu com 75 μM S-propranolol, uma concentração que

inibiu apenas 5% da ligação do [3H]PDBu à fração DEAE-A. Assim, a

diferença marcante na concentração de propranolol e PDBu

juntamente com o não paralelismo das curvas de ligação às células e

à fração DEAE-A indicam que os efeitos do propranolol na ligação do

[3H]PDBu às células poderia ser indireto, possivelmente aumentando a

concentração de diacilglicerol ou de outros mediadores químicos para


interagir com o domínio regulatório da PK-C. Esta possibilidade se

fundamenta no estudo que refere que o propranolol estimula a

degradação de polifosfoinositídeos a araquidonoil-diacilgliceróis pela

ativação de uma fosfolipase C específica para polifosfoinositídeo

(Bazan et al.,1985). Um outro efeito conhecido do propranolol é inibir a

conversão de ácido fosfatídico (PA) a diacilglicerol pela fosfohidrolase

do ácido fosfatídico (PAPase) (Bazan et al.,1985; Jamal et al.,1991;

Koul e Hauser,1987; Lavie et al.,1990; Lauritzen et al.,1994)

aumentando a concentração de PA, o qual poderia atuar como um

segundo mensageiro. Em neutrófilos, a correlação direta entre a

formação de PA e a produção de superóxido durante a atividade

respiratória explosiva ("burst" respiratório) sugere que o PA pode ser

um segundo mensageiro na ativação da NADPH oxidase (Bauldry et

al.,1991; Rossi et al.,1990). A atividade da proteína quinase C pode

ser regulada pelo PA (Lauritzen et al.,1994; Lee e Bell,1989), e

também existem algumas indicações da existência de uma proteína

quinase dependente de fosfatidato (Bocckino et al.,1991; Lauritzen et

al.,1994). Outros estudos têm implicado o PA na regulação da

secreção de insulina (Lauritzen et al.,1994; Metz e Dunlop,1991), na

ativação da proteína H-ras e inibição da proteína ativadora da GTPase

(GAP) (Lauritzen et al.,1994; Tsai et al.,1990), na modulação da

atividade da fosfolipase C (Knauss et al.,1990; Lauritzen et al.,1994;

Moolenaar et al.,1986; Qian e Drewes,1991;), na proliferação e

diferenciação induzidas pela interleucina-2 (Cano et al.,1992), e na

ativação da quinase do fosfatidilinositol 4-fosfato (Lauritzen et al.,1994;

Moritz et al.,1992). Nesse sentido, Koul e Hauser (1987)

demonstraram que a forma racêmica do propranolol impede a

formação de DAG dependente de IgE a partir de PA em células RBL

2H3 e que isto resulta na inibição da liberação de mediador

dependente de IgE. Lin et al. (1991) referiram que o propranolol inibe a


liberação de mediadores da inflamação a partir de células RBL 2H3,

de maneira não dependente de sua forma isomérica, provavelmente

pela sua capacidade de inibir a ativação da PAPase. Vários estudos

indicam funções potenciais do PA como segundo mensageiro em

resposta a fatores de crescimento e a alguns mediadores

extracelulares. Também foi encontrado que a inibição da PAPase pelo

propranolol leva à potenciação da produção de O2 em neutrófilos

estimulados com o agonista do receptor putativo FMLP, sugerindo um

papel para o PA como um segundo mensageiro e para a PAPase

como uma enzima regulatória chave na interação entre PLC e PLD na

tradução do sinal (Agwu et al.,1991; Gay e Murray,1991; Svetlov e

Hanahan,1997). E, finalmente, em células de Leydig de rato, Lauritzen

et al. (1994) mostraram que o propranolol aumenta o nível de PA e

inibe a secreção de testosterona induzida pelo LH. Terceiro, em

nossos estudos o propranolol ativou a proteína quinase C putativa a

partir da fração DEAE-A. Entretanto, visto que o citosol das células

intersticiais testiculares utilizado nos nossos experimentos como fonte

de PK-C era parcial e não totalmente purificado e que a histona não é

um substrato específico para a PK-C, não podemos descartar a

participação de outras quinases na fosforilação da histona. Contudo,

os dados já referidos aqui, sugerindo o propranolol como um inibidor

da via do AMPc em células de Leydig (Tinajero et al.,1993;

Wanderley,1986) não indicam a participação da PK-A na fosforilação

da histona. Uma interação direta do propranolol com a PK-C putativa é

inferida a partir destes estudos de atividade enzimática. Foi

encontrado que quando o propranolol, ao invés de fosfatidilserina

(PS), era adicionado diretamente à mistura de reação, a atividade

enzimática era aumentada na mesma proporção que aumentava pela

fosfatidilserina. Foi também observado que o comportamento da

reação de fosforilação resultante da ação do propranolol era similar


àquele resultante da ação da PS em termos de reversão da

fosforilação pelo H-7 e ausência de fosforilação na ausência de Ca2+

na mistura de reação. A possibilidade de que o aumento na atividade

da PK-C putativa pelo propranolol possa ser devida à interação da

droga com o domínio regulatório (o sítio de interação com lipídios

cofatores) dessa quinase em um sítio diferente do sítio de interação

com o PDBu é sugerida pelo achado de que o propranolol inibiu a

ligação de [3H]PDBu à fração DEAE-A em apenas 5%. Foi também

observado que a concentração de propranolol necessária para a

ativação da proteína quinase C in vitro foi aproximadamente 10.000

vezes menor que aquela requerida para a secreção de testosterona.

Presumivelmente mais propranolol é necessário para intercalar sua

porção hidrofóbica na estrutura da bicamada lipídica das células de

Leydig intactas, levando à ativação da proteína quinase C. Foi descrito

que o propranolol inibe a PK-C ativada por PS e dioleína em

neutrófilos humanos (Sozzani et al.,1992). Os autores demonstraram

que diferentes concentrações de PS superam o efeito inibitório do

propranolol na atividade da PK-C, sugerindo uma inibição competitiva

em relação à PS. Contudo, os dados relatados por estes

investigadores não foram conclusivos. Com a quantidade saturante de

PS (25 μg/mL) usada no presente estudo, nenhuma inibição da

atividade da PK-C foi observada.

Uma vez realizado o estudo do tratamento agudo com o

propranolol sobre a secreção de testosterona, a pergunta proposta a

responder foi se nas condições de tratamento crônico, que são as que

mais se assemelham às do uso clínico do propranolol, seriam

encontrados resultados diferentes daqueles do tratamento agudo com

essa droga. Considerando as referências de disfunção sexual

(impotência e incapacidade erétil) em pacientes hipertensos recebendo

propranolol por período prolongado (Hogan et al.,1980; Knarr,1976), e


também que o uso prolongado de um fármaco pode levar à tolerância

do organismo ao mesmo (Gilman et al., 1990), além de que a indução

de respostas celulares pela ativação da PK-C é seguida de

dessensibilização (por “down-regulation” da PK-C) (McArdle e

Conn,1989; Niedel e Blackshear,1986; Wanderley e Negro-Villar,

1996), esperava-se encontrar depleção (“down-regulation”) dessa

enzima e diminuição (dessensibilização) da resposta secretória das

células intersticiais testiculares aos agentes estimulatórios que utilizam

a via do DAG/PK-C.

De fato, utilizando uma preparação de células intersticiais

testiculares de animais tratados cronicamente com 30 mg/Kg de

propranolol durante oito dias, não foi observado o efeito estimulatório

do propranolol ou dos ativadores direto e indireto da PK-C, PDBu e

LHRH, respectivamente, sobre a secreção de testosterona, indicando

que o tratamento crônico com propranolol dessensibilizou a via do

DAG/PK-C nessas células. Entretanto, a atividade dessa enzima não

foi modificada pelo propranolol com esse modelo de tratamento. Para

descartar a possibilidade de que o tempo de tratamento utilizado não

tenha sido suficiente para causar depleção da PK-C e, pela maior

semelhança com a aplicação clínica da droga, utilizou-se o modelo de

tratamento crônico descrito por Gay et al.(1990), que consiste no

tratamento dos animais com 500 mg/L propranolol na água de beber

durante cinco a seis semanas. Do mesmo modo que no modelo

anterior, o tratamento durante cinco a seis semanas inibiu o efeito

estimulatório do propranolol e do PDBu (este parcialmente)

adicionados in vitro sobre a secreção de testosterona. Contudo, não

inibiu o efeito estimulatório do LHRH sobre a secreção de testosterona.

Isso sugere que o tratamento por via oral é mais suave que por via

intraperitoneal, o que é suportado pelo fato de que os animais não

morreram. O tratamento com propranolol durante cinco semanas


diminuiu significativamente a atividade da PK-C, mas isso foi devido a

um aumento na atividade basal e a uma diminuição no pós-estímulo

das células tratadas com propranolol, sem observar-se diferença

significativa nas comparações entre os basais e pós-estímulos entre si

(dos grupos controle e tratado cronicamente com propranolol). Isso

sugere fortemente que a inibição total da produção de testosterona

não foi devida à essa pequena diminuição na atividade da PK-C, ou

que, se houve contribuição foi apenas em parte. Como foi referido

anteriormente, o propranolol pode modificar diferentes efetores

intracelulares. Em termos especulativos é possível inferir a partir dos

dados desse estudo que provavelmente outros efetores sejam

responsáveis pela dessensibilização das células intersticiais

testiculares ao propranolol e aos ativadores da PK-C, e não a PK-C

per se (Figura 17). Existem várias evidências de que a

dessensibilização observada após tratamento crônico com diferentes

drogas resulta da fosforilação de receptores, de proteínas G e vários

efetores relacionados. Dentre as diferentes quinases envolvidas

encontram-se as PK-C, PK-A, CaMKII (proteína quinase II dependente

de Ca2+/calmodulina), GRK (quinases de receptor acoplado à proteína

G) e as MAPKs (proteínas quinases ativadas por mitógenos) (Liu e

Anand, 2001; Naor et al., 2000). De modo importante, o propranolol já

foi referido como ativador da MAPK (Meier et al.,1998).


RASGRP

Ca2+CaMK

BTK? SRC RAF1

SRC

PYK/FAK

das MAPKcascatas

Transcrição

PIP2

ESPAÇOEXTRACELULAR

MEM

BR

AN

APL

ASM

ÁTI

CA

CITOSOL

quinase-Cativada

IP3

CLIVAGEMGTP

proteína G ativadaq

Y q

receptorativado

PLC

LHRH

PROPRANOLOL (+/-)

(+/-)

Núcleo

(+/-)

DAG/Ca2

DAG

+

Figura 17. Representação esquemática dos possíveis sítios de ação do propranolol

na via que envolve a proteína quinase C para produzir dessensibilização das

células intersticiais testiculares ao propranolol e aos ativadores da PK-C

Em relação à ligação do [3H]PDBu às células intersticiais

testiculares, não houve diferença entre as curvas de competição

correspondentes às células intersticiais testiculares de animais

tratados com propranolol cinco semanas e aquelas obtidas dos

animais controle, indicando a mesma afinidade para o [3H]PDBu e

PDBu em ambas preparações. O tratamento crônico com propranolol

não alterou a inibição, dependente da dose, da ligação de [3H]PDBu

às células intersticiais testiculares resultante da adição do propranolol

in vitro. A concentração de PDBu que dá uma ligação de 50% da

máxima obtida com o PDBu marcado foi de 25 nM. Entretanto, a

concentração de propranolol necessária para obter 50% de ligação do

[3H]PDBu às células, foi aproximadamente 4.000 vezes maior do que


aquela observada com o PDBu (aproximadamente 100 μM de

propranolol versus 25 nM de PDBu).

Quanto à resposta secretória das células intersticiais testiculares

oriundas de animais tratados com propranolol aos agentes

estimulatórios que utilizam a via do AMPc/PK-A, o tratamento crônico

com propranolol, de forma similar ao tratamento agudo já referido em

literatura, também diminuiu o efeito estimulatório do hCG (ativador

indireto da PK-A) e do dbAMPc (ativador direto da PK-A) sobre a

secreção de testosterona. O fato de que houve inibição do efeito

estimulatório do dbAMPc sobre a secreção de testosterona indica que

o local de ação do propranolol é distal à formação do AMPc.

Resultados similares foram obtidos por Lauritzen et al.(1994)

adicionando o propranolol diretamente a uma preparação de células de

Leydig, esses autores adicionalmente demonstraram que a inibição

pelo propranolol não só situa-se distal à formação de AMPc como

ainda proximal à conversão do colesterol em pregnenolona. Por outro

lado, Tinajero et al.(1993) também adicionando o propranolol

diretamente a uma preparação de células de Leydig referiram que o

propranolol causava inibição da secreção de testosterona, mas por um

mecanismo diferente do observado por nós e Lauritzen et al. (1994),

ou seja, eles observaram que a ação inibitória do propranolol sobre a

esteroidogênese era completamente revertida pela adição de 8-bromo-

AMPc, sugerindo um sítio de ação proximal à formação de AMPc.

Tendo em vista que o tratamento crônico com o propranolol

pode afetar diferentes sistemas de tradução do sinal hormonal,

levando a uma dessensibilização inespecífica das células intersticiais

testiculares, foi realizado um experimento adicional para verificar se a

via do AMPc/PK-A estava dessensibilizada. Para isso foi adicionado

propranolol direta e previamente à adição do hCG e do dbAMPc à

preparação de células intersticiais testiculares oriunda de animais


cronicamente tratados com propranolol. Os resultados obtidos

mostraram completa inibição do efeito estimulatório do hCG e do

dbAMPc, indicando que o tratamento crônico com propranolol não

dessensibilizou a via do AMPc/PK-A.


VI. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos nesse estudo mostram que o tratamento

agudo com propranolol estimula a secreção basal de testosterona em

células intersticiais testiculares in vitro e que esse efeito envolve a

ativação de uma PK-C putativa. É possível que essa ativação resulte

de uma interação direta da droga com o domínio regulatório desta

quinase em um sítio diferente do sítio de interação com o PDBu. Isto é

sugerido pelos resultados de atividade biológica da enzima

(fosforilação da HISTONA em baixas doses de ambos os isômeros do

propranolol) e pelo achado de que o propranolol inibiu a ligação de

[3H]PDBu à fração DEAE-A em apenas 5%. A inibição da ligação de

[3H]PDBu às células pelo propranolol pode ser devida a um aumento

no diacilglicerol ou outros mediadores químicos que interagem com o

domínio regulatório da PK-C. A possibilidade de participação de outras

quinases ou cascata de quinases (Ex: cascata das MAPKs, da qual a

PK-C também participa), nessa resposta biológica ao propranolol

também deve ser considerada. O tratamento crônico com o propranolol resulta em

dessensibilização das células intersticiais testiculares aos ativadores

da PK-C sobre a secreção de testosterona. Esse efeito não parece ser

devido à diminuição relativa da atividade da PK-C. É possível

especular que o propranolol esteja modificando outros efetores

intracelulares, como as proteínas quinases ativadas por mitógenos

(MAPKs).

Também conclui-se que o tratamento crônico com propranolol

por via intraperitoneal foi mais eficaz na dessensibilização que o


tratamento por via oral. Provavelmente por assegurar adequado nível

plasmático de propranolol.

Adicionalmente, mostrou-se que a dessensibilização causada

pelo tratamento crônico com propranolol não foi um fenômeno

inespecífico, já que o sistema de tradução do sinal mediado pelo

AMPc/PK-A não foi dessensibilizado.


VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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