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Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e sua relação
filogenética com o gênero
Luana Barbosa Carvalho Nara
Dissertação de mestrado em Biodiversidade Tropical
Mestrado em Biodiversidade Tropical
Universidade Federal do Espírito Santo
São Mateus, Março de 2015
III
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Nara, Luana Barbosa Carvalho, 1988 -
N218e Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e
sua relação filogenética com o gênero / Luana Barbosa Carvalho Nara.
– 2015.
52 f. : il.
Orientador: Ana Paula Cazerta Farro
Dissertação (Mestrado em Biodiversidade Tropical) – Universidade
Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo.
1. Delphininae. 2. Citocromo b. I. Farro, Ana Paula Cazerta. II.
Universidade Federal do Espírito Santo. Centro Universitário Norte do
Espírito Santo. III. Título.
CDU: 502
IV
“You cannot change fate. However, you can rise to meet it, if you so choose.”
Princess Mononoke
V
Agradecimentos Agradeço à CAPES pelo apoio financeiro, mas principalmente a cada brasileiro e
brasileira que pagam seus impostos em dia apesar de um sistema econômico e fiscal que
não os beneficia.
Ao grande amor da minha vida, que em 17 anos me fez amar os animais mais do que
qualquer outra coisa, que me ensinou sem teoria alguma a respeitar todos os seres vivos
e que até hoje é a única razão pela qual eu não desisto. Eu devo e vou agradecer toda
minha vida à Salita por ser a fonte da força que eu tenho pra viver.
À Fiona, Madonna e Catuaba por terem sido a serendipity que eu precisava,
principalmente para suportar esses dois anos.
À 6ªturma da UNESP São Vicente por me lembrarem constantemente que a gente nasce
biólogo e continuarem sendo exemplos e fazendo de mim uma bióloga melhor.
À Prof.ª Dr.ª Ana Paula Cazerta Farro pelo apoio, amizade e paciência ao longo do
desenvolvimento desse projeto.
Ao Prof. Dr Mario Manoel Rollo Jr. pelo carinho, preocupação, incentivo e todo apoio que
foram além da graduação.
À Dr. Cecilia Kieruff por ter iluminado meus últimos meses no laboratório com tanto
conhecimento, experiência e alegria.
À Msc. Drienne Messa Faria por todo suporte laboratorial.
À Msc. Maria Paula Rozo pela amizade que se provou muito mais que verdadeira depois
de tantas horas rodando analises, arrumando ilustrações, discutindo resultados e
principalmente dividindo todo o sorvete e leite condensado possível.
À Kamyla Silva Amorim pelo apoio e todos os pavês e açaís que salvaram os dias ruins,
por não se preocupar apenas comigo, mas também com minhas filhotas e ser uma das
melhores coisas que me aconteceu no mestrado. E preciso agradecer muito ao Fernando
que foi diversas vezes obrigado a entrar nas suas loucuras pra me ajudar.
VI
Ao Leandro Rafael Perez que além da amizade foi quem mais me manteve firme e focada,
que desprendeu uma enorme paciência pra me ouvir tantas vezes, meu melhor
psicólogo, confidente, corretor ortográfico bilíngue e o escritor que eu pedi pra vida.
Ao André Sato, um amigo incrível, que me aturou em todos os meus momentos, foi meu
mestre do photoshop e ilustrator e sem o qual nenhum dos meus gráficos ou figuras
teriam o mínimo de qualidade.
Ao Caio Henrique de Araújo Bissa por perder uma boa parte de sua noite me ajudando
com correções do meu texto e embora tamanha distância e todos seus afazeres sempre
arrumar um tempinho pra me ver e matar as saudades.
À Janaina Barata por ser minha alma gêmea! Que mesmo com a vida de pernas pro ar e
cheia de problemas teve condições de ouvir e debater os meus problemas e aflições e
ainda ler minha dissertação. Ainda proporcionou o mínimo de vida social que tive
durante o mestrado, me levando para as melhores saídas de campo pra coletar as piores
formigas.
Aos meus pais, Carlos Alberto Carvalho Nara e Marcia Barbosa, que como diriam Renato
e Elis não posso culpá-los por tudo, afinal são crianças como eu e apesar de tudo que eu
faça eu sou como vocês. Pai sua visita foi muito importante.
Ao meu irmão, Carlos Eduardo Barbosa, que eu nunca vou saber como agradecer por
tudo que faz e é pra mim. Você não tinha obrigação nenhuma em assumir tantas funções
na minha vida e ainda assim faz sem se quer reclamar.
A minha vó Odete Elísio de Carvalho, minha tia Maria Cristina Alves Correa, meu tio
Pedro Alves Correa e minhas primas Camila Alves Correa, Beatriz Alves Correa e Heloiza
Alves Correa por serem a minha concepção de família. Na verdade o que vocês fizeram e
fazem por mim vai muito além do que a maioria das famílias são capazes e eu espero
poder um dia retribuir tudo.
À Livia Pires Martins Kaique, Ana Luiza Morati Receputi, Georgia Felix e Nair Hidelgard
que fizeram a minha estadia na cidade muito melhor e foram capazes de me deixar feliz
por estar em São Mateus. A companhia e o apoio de vocês fez toda a diferença nesses
últimos 2 anos, eu sei que não sou uma pessoa nem um pouco fácil de lidar, mas vocês
foram ótimas comigo, praticamente uma família. Ouviram todos os desabafos, me
VII
aguentaram bêbada, me alegraram, me acompanharam, me ajudaram muito e inclusive
cuidaram das minhas filhas. Definitivamente sem vocês eu talvez não teria conseguido
viver tanto tempo aqui.
À Luciana Cristina Raimundo de Souza e Vinicius Oliveira de Souza por terem sido a
melhor coincidência desses meus dois últimos anos e terem me acolhido como parte da
família inúmeras vezes. Se me perguntarem as melhores coisas de São Mateus vou logo
pensar em vocês.
Ao Raul Barbosa por aguentar todas as minhas lamurias, me fazer companhia mesmo
que por whatsapp e principalmente por ter me suportado e ainda cuidado de mim no dia
em que descontei todos os problemas no álcool.
Ao Sem Chance por não desistir de mim nesses dois últimos anos, atender minhas
ligações e me ligar pra conversar por horas e me deixar muito mais leve.
Aos amigos Darlan Storto, Ema, Franciele Vieira Sluminski, Jamille Oliveira, Nhanha,
Sayão, Thalissa Whertheimer, Valdemir e Wilson que na medida do possível se
mantiveram presentes nesses últimos anos independente da distância. Todos os
esforços de vocês para passarem mesmo que apenas alguns minutos comigo foram
muito importantes. E Jamille, desculpa, nunca vou conseguir retribuir a sua visita.
VIII
Sumário
Introdução Geral ................................................................................................................................ 3
Capítulo I - Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e sua relação
filogenética com o gênero .................................................................................................................. 7
Introdução ..................................................................................................................................... 7
Material e Métodos ....................................................................................................................... 9
Amostragem .............................................................................................................................. 9
Extração do DNA .......................................................................................................................10
Amplificação e sequenciamento do DNA ...................................................................................10
Alinhamento das sequências .....................................................................................................11
Análises de diversidade, estruturação e parâmetros filogenéticos .............................................12
Resultados ....................................................................................................................................14
Amplificação e sequenciamento ................................................................................................14
Stenella clymene no Brasil .........................................................................................................15
Stenella clymene no Atlântico ....................................................................................................18
Stenella clymene e o gênero ......................................................................................................20
Discussão ......................................................................................................................................29
Amplificação e Sequenciamento ................................................................................................29
Stenella clymene no Brasil .........................................................................................................29
Stenella clymene no Atlântico ....................................................................................................30
Stenella clymene e o gênero ......................................................................................................31
Conclusões ....................................................................................................................................33
Referências Bibliográficas ..............................................................................................................34
Anexos ..........................................................................................................................................40
Anexo I - Protocolo de extração de DNA utilizando solução salina Bruford et al. (1992). ............40
Anexo II - Protocolo de extração de DNA com resina Chelex. .....................................................41
Anexo III - Protocolo de extração de DNA de sangue adaptado de Montgomery and Sise (1990) e
Di Pietro et al. (2011). ...............................................................................................................41
Anexo IV - Protocolo de extração de DNA com fenol/clorofórmio o de Sheppard et al. (1992). ..42
Anexo V - Protocolo de extração de DNA para amostras em formol adaptado de Mesquita
(2001). ......................................................................................................................................43
IX
Lista de tabelas
TABELA 1: AMOSTRAS DE STENELLA CLYMENE PROVENIENTES DE DIFERENTES REGIÕES DO LITORAL DO NORDESTE
BRASILEIRO. ................................................................................................................................... 9 TABELA 2: ESPÉCIES DO GÊNERO STENELLA E NÚMERO DE SEQUÊNCIAS (N) DE DNAMT REGIÃO D-LOOP, COI E CYT B
OBTIDAS NO GENBANK. ...................................................................................................................11 TABELA 3: RESULTADO DA AMPLIFICAÇÃO E O SEQUENCIAMENTO DOS MOLECULARES D-LOOP, COI, CYT B; AMOSTRAS
APENAS AMPLIFICADAS (A) E AMOSTRAS SEQUENCIADAS (X). ...................................................................14 TABELA 4: DIVERSIDADE HAPLOTÍPICA (H) E NUCLEOTÍDICA (Π), PARES DE BASES (PB), SÍTIOS POLIMÓRFICOS (SP) E
TRANSIÇÕES E TRANSVERSÕES PARA STENELLA CLYMENE. ........................................................................15 TABELA 5: DIVERSIDADE HAPLOTÍPICA (H) E NUCLEOTÍDICA (Π), PARES DE BASES (PB), SÍTIOS POLIMÓRFICOS (SP) E
TRANSIÇÕES E TRANSVERSÕES DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO ............................................18
X
Lista de figuras
FIGURA 1: REDE DE HAPLÓTIPOS DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL PARA A REGIÃO D-LOOP (A), COI
(B), CYT B (C) E CONCATENADO (D) DO DNA MITOCONDRIAL. ...................................................................... 17
FIGURA 2: REDE DE HAPLÓTIPOS DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO PARA A REGIÃO D-
LOOP (A), COI (B), E CYT B (C) DO DNA MITOCONDRIAL. ............................................................................. 19
FIGURA 3: REDE DE HAPLÓTIPOS DOS INDIVÍDUOS DO GÊNERO STENELLA PARA A REGIÃO D-LOOP (A), COI (B), E CYT B
(C) DO DNA MITOCONDRIAL, INCLUEM-SE INDIVÍDUOS DE DELPHINUS DELPHIS E TURSIOPS TRUNCATUS. ........... 22
FIGURA 4: RELAÇÃO FILOGENÉTICA RECUPERADA DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL E AS DEMAIS
ESPÉCIES DE SEU GÊNERO COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO D-LOOP DO DNA
MITOCONDRIAL. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO
VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS
INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE............................................................................ 23
FIGURA 5: RELAÇÃO FILOGENÉTICA RECUPERADA DOS INDIVÍDUOS DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL E AS DEMAIS
ESPÉCIES DE SEU GÊNERO COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO COI DO DNA
MITOCONDRIAL. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO
VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS
INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE............................................................................ 24
FIGURA 6: RELAÇÃO FILOGENÉTICA DE STENELLA CLYMENE DO BRASIL E AS DEMAIS ESPÉCIES DE SEU GÊNERO COM
INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO CYT B DO DNA MITOCONDRIAL. VALORES À
ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO VALOR DE BOOTSTRAP,
SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS INDIVÍDUOS EXTERNOS
AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE. ........................................................................................................... 25
FIGURA 7: RELAÇÃO FILOGENÉTICA DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO E DEMAIS ESPÉCIES DE SEU GÊNERO,
INCLUINDO DUAS ESPÉCIES DE GÊNEROS PRÓXIMOS, COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA PARA A
REGIÃO D-LOOP. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA
AO VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO
OS INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE. ...................................................................... 26
FIGURA 8: RELAÇÃO FILOGENÉTICA DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO E DEMAIS ESPÉCIES DE SEU GÊNERO,
INCLUINDO DUAS ESPÉCIES DE GÊNEROS PRÓXIMOS, COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE VEROSSIMILHANÇA.
VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A POSTERIORI E À DIREITA AO VALOR DE
BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%. DESTACAM-SE EM VERMELHO OS
INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE............................................................................ 27
FIGURA 9: RELAÇÃO FILOGENÉTICA RECUPERADA DE STENELLA CLYMENE DO OCEANO ATLÂNTICO E DEMAIS ESPÉCIES DE
SEU GÊNERO, INCLUINDO DUAS ESPÉCIES DE GÊNEROS PRÓXIMOS, COM INFERÊNCIA BAYESIANA E DE
VEROSSIMILHANÇA PARA A REGIÃO CYT B. VALORES À ESQUERDA CORRESPONDEM A PROBABILIDADE BAYESIANA A
POSTERIORI E À DIREITA AO VALOR DE BOOTSTRAP, SENDO AMBOS REPRESENTADOS APENAS ACIMA DE 50%.
DESTACAM-SE EM VERMELHO OS INDIVÍDUOS EXTERNOS AO AGRUPAMENTO DE SUA ESPÉCIE. ........................... 28
1
Resumo
As informações existentes sobre Stenella clymene são escassas, principalmente
relacionadas à genética da espécie, por conta disso encontra-se classificada como
“dados deficientes” pela lista vermelha de espécies ameaçadas da IUCN. O que dificulta
estudos com a espécie é que, por esta possuir uma distribuição restrita a áreas
profundas das regiões tropicais e temperadas do Oceano Atlântico, seus avistamentos e
encalhes não são frequentes. Dos poucos estudos genéticos já realizados,
questionamentos surgiram quanto à posição da espécie no gênero, bem como a
hipótese de S. clymene ter uma origem híbrida. O presente estudo analisou as regiões
citocromo oxidase I (CoI), citocromo b (Cyt b) e região controle (D-loop) do DNA
mitocondrial de indivíduos do nordeste do Brasil, comparando-os com sequências da
subfamília Delphininae disponíveis no Genbank. Os indivíduos do Brasil apresentaram
uma alta diversidade genética e provavelmente constituem uma mesma unidade
populacional. Ademais, foi encontrada uma diferenciação significativa e altos valores no
nível de FST entre as unidades populacionais de S. clymene do Atlântico Norte e Atlântico
Sul. Entre as unidades populacionais do Atlântico Sul e Golfo do México a diferenciação
foi significativa, mas o valor no nível de FST foi baixo; além disso, a rede haplotípica e a
recuperação filogenética indicam que provavelmente existe uma conectividade entre as
duas populações. Quanto à reconstrução filogenética por região mitocondrial, para D-
loop S. clymene se apresentou parafilético e grupo irmão do clado composto por
Stenella coeruleoalba, Delphinus delphis e Stenella frontalis, enquanto para a região CoI
e Cyt b S. clymene foi polifilético e grupo irmão de S. coeruleoalba.
Palavras-chave: Citocromo b, citocromo oxidase I, diversidade genética, D-loop,
Golfinho-de-Clymene.
2
Abstract
The existing information concerning Stenella clymene are scarce specially when
considering genetic approaches, which leads to the IUCN red list of threatened species
classification as “data deficient”. In many circumstances, molecular studies are difficult
as sightings and stranding events are infrequent due the restricted distribution of S.
clymene in tropical and temperate deep waters of the Atlantic Ocean. The former
studies raised up questions regarding the species position in the genera and a
hypothesis that S. clymene has a hybrid origin. The present study analyzed the
cytocromo oxidase I (CoI), cytocromo b (Cyt b) and control region (D-loop) of the
mitochondrial DNA of northeastern Brazil individuals comparing them with Delphininae
sequences obtained from Genbank. Brazilian individuals showed a high genetic diversity
and they probably constitute the same population unit. A significant differentiation and
high values in the level of FST was found between population units of North Atlantic and
South Atlantic Ocean. Between the population units of South Atlantic and Mexican Gulf
the differentiation was significant, but FST value was low, in addition the haplotype
network and the phylogenetic recovery suggest a connectivity between the two
populations. Moreover, in the phylogenetic reconstruction for D-loop region S. clymene
is paraphyletic and sister group of Stenella coeruleoalba, Delphinus delphis e Stenella
frontalis clade, while for CoI and Cyt b regions S. clymene is polyphyletic and sister
group of S. coeruleoalba.
Key-words: Clymene dolphin, cytocromo b, cytocromo oxidase I, D-loop, genetic
diversity.
3
Introdução Geral
Stenella clymene está classificada na ordem Cetartiodactyla, dentro da
infraordem Cetacea, parvordem Odontoceti, família Delphinidae, subfamília
Delphininae (Rice 2009). Incluída no grupo dos odontocetos, Stenella clymene,
comumente conhecida por golfinho-de-Clymene1, foi descrita pela primeira vez por
Gray (1846) como Delphinus metis. O mesmo em 1850 retificou a descrição e a
renomeou como Delphinus clymene. O nome Stenella clymene foi utilizado pela
primeira vez por Hershkovitz (1966), mas somente em 1981 Perrin et al. (1981)
reconheceram como uma espécie válida ao redescrevê-la.
A espécie é relativamente pequena (190 cm), pesando cerca de 80kg (Jefferson
et al. 1995), e possui um padrão tricolor com o dorso cinza escuro, as laterais cinza claro
e o ventre branco, sendo característica marcante para o diagnóstico da espécie um
“bigode” no dorso de seu rostro (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 1995; Jefferson
1996; LeDuc et al. 1999; Jefferson et al. 2003; Jefferson 2009). Stenella clymene pode
ser facilmente confundida com Delphinus delphis Linnaeus, 1758, Stenella attenuata
Gray, 1846 e Stenella longirostris Gray, 1828, principalmente considerando o fato que
muitas vezes utilizam o mesmo habitat (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 1995; Moreno
et al. 2005; Weir 2006; Jefferson 2009), mas também já foi confundida com Stenella
frontalis Cuvier, 1829 e Stenella coeruleoalba Meyen, 1833 (Perrin et al. 1981).
Estudos sobre a alimentação de S. clymene realizados nos Estados Unidos
sugerem que a espécie tem hábitos noturnos e/ou em águas mesopelágicas com uma
dieta de cardumes de peixes pequenos (10-15 cm), que inclui principalmente as famílias
Myctophidae, Argentinidae e Bregmacerotidae (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 2009).
No Golfo do México foi observado comportamento de alimentação cooperativa entre os
indivíduos (Fertl e Wursig 1995) e existem inclusive relatos de grupos de S. clymene
1 Os principais nomes populares de Stenella clymene utilizados na língua portuguesa são golfinho clímene, golfinho-de-Clymene e golfinho-fiandeiro-de-bico-curto, optou-se o uso do segundo em acordo com Perrin et al. (1981).
4
associados à grupos S. longirostris na região da Flórida, Caribe e Golfo do México
(Jefferson et al. 1995; Fertl et al. 2003).
Na maioria das avistagens da espécie os indivíduos estavam em grupos de
tamanho pequeno e em grupos com cerca de 200 indivíduos (Perrin et al. 1981; Mullin
et al. 1994; Fertl e Wursig 1995; Weir 2006). Os golfinhos-de-Clymene comumente
acompanham embarcações (Mullin et al. 1994) e apresentam comportamento aéreo, ás
vezes com saltos de rotação em torno do próprio eixo corporal (Mullin et al. 1994), o
que favorece possíveis confusões de identificação com S. longirostris, que realiza o
mesmo tipo de comportamento.
S. clymene tem sua distribuição restrita à regiões tropicais e ocasionalmente
utiliza águas quentes das regiões temperadas (Davis et al. 1998; Weir 2006).
Considerada uma espécie oceânica (Perrin et al. 1981; Mullin et al. 1994), pode ser
encontrada em áreas mais profundas (de 44 até 4.500 m) com circulação ciclônica ou
confluente (Davis et al. 1998; Weir 2006). No Oceano Atlântico está geralmente
associada à Corrente do Brasil, que possui águas quentes, de modo que não existem
registros da espécie além da região extremo sul do Brasil ou em águas argentinas e
uruguaias (Fertl et al. 2003). Essa distribuição restrita implica em uma maior
vulnerabilidade a impactos que as demais espécies com distribuição pantropical ou
cosmopolita (Frankham et al. 2008). E de acordo com a lista vermelha de espécies
ameaçadas da IUCN (2012), S. clymene se encontra como “dados deficientes” (DD).
Nos poucos estudos já desenvolvidos relacionados à genética da espécie, alguns
questionamentos foram apontados quanto ao posicionamento da espécie no gênero
Stenella. O primeiro desses estudos analisou o cariótipo de S. clymene (2n = 44), que
apresentou o padrão das bandas C e G morfologicamente similar ao de S. frontalis
(Arnason 1980). Uma parte de seu Citocromo b (Cyt b) foi sequenciada para um estudo
da relação filogenética da família Delphinidae, constatando que dentro do gênero
Stenella, S. clymene estava mais próxima à S. coeruleoalba (LeDuc et al. 1999). Além
disso, LeDuc et al. (1999) sugeriram que o gênero Stenella seria na verdade um
agrupamento artificial, uma vez que apresenta alguns indivíduos mais próximos de
Tursiops, Delphinus, Sousa ou Lagenodelphis. E, recentemente, em um estudo de Cyt b
e DNA nuclear foi levantada a hipótese de S. clymene ter sua origem de um hibridismo
entre S. longirostris e S. coeruleoalba (Amaral et al. 2014).
5
Além das incongruências quanto às análises de DNA mitocondrial (DNA) e DNA
nuclear, as espécies dentro do gênero Stenella possuem características craniais
complexas, o que cria um problema na hora de posicioná-las no gênero e até mesmo
dentro da subfamília (Perrin et al. 1981; McGowen et al. 2008; Kingston et al. 2009;
Mcgowen et al. 2009; Steeman et al. 2009; Xiong et al. 2009).
A hibridização geralmente resulta de uma rápida radiação, na qual as barreiras
intrínsecas que evitariam o fluxo gênico entre espécies não são desenvolvidas por conta
do curto espaço de tempo (Seehausen 2004). Além disso, a divergência entre filogenias
de DNA mitocondrial e DNA nuclear, a distribuição incompleta das linhagens, as dúvidas
de posicionamento de táxons e um aumento na taxa de diversificação do grupo
sugerem que a subfamília Delphininae tenha surgido de uma radiação rápida (Kingston
et al. 2009; Mcgowen et al. 2009; Steeman et al. 2009; Xiong et al. 2009; Slater et al.
2010; Amaral et al. 2012).
A opção pela análise do genoma mitocondrial em diversos estudos se deve ao
fato deste ser relativamente fácil de ser amplificado, justamente por: aparecer nas
células em cópias múltiplas; nos animais se apresentar mais conservado, com poucas
duplicações, sem íntrons e pouquíssimas regiões intergênicas; ser bem variável em
populações naturais, devido sua elevada taxa mutacional, o que pode gerar sinais sobre
o histórico populacional em curtos espaços de tempo. Ainda que existam críticas ao uso
do DNA mitocondrial para estudos de diversidade genética e filogenia, ele ainda é o
marcador molecular de melhor custo benefício quando analisamos geneticamente uma
espécie para a qual não temos informação alguma. Além disso, o genoma mitocondrial
é mais eficaz em análises que utilizam amostras com DNA de baixa qualidade (Wan et
al. 2004; Frankham et al. 2008).
O DNA mitocondrial é uma região genômica haplóide, uma vez que sua herança
é estritamente materna e, portanto, não está sujeita aos mesmos padrões de
recombinação que a região autossômica (Wan et al. 2004; Frankham et al. 2008). Uma
das regiões mais variáveis no genoma mitocondrial é a região controle não-codificadora
denominada D-loop (displacement loop), que nos cetáceos apresenta um menor
número de deleções e inserções (Hoelzel et al. 1991). Para a maioria das espécies de
cetáceos as sequências do citrocromo oxidase I (CoI) são únicas, mas apesar de ser uma
ferramenta com potencial para o Barcode do grupo, o CoI não supera o sucesso
6
encontrado com sequências da região do citocromo b para cetáceos (Amaral et al.
2007; Viricel e Rosel 2012). O menor fragmento de Cyt b, comparado a um fragmento
de CoI duas vezes maior, apresenta o mesmo número de caracteres de diagnóstico para
membros de Stenella, Tursiops e Delphinus. Portanto, os menores fragmentos de Cyt b
são possivelmente uma opção melhor em relação aos fragmentos de CoI, mas a eficácia
da combinação de ambos os fragmentos ainda não foi relatada (Viricel e Rosel 2012).
Diante de todos os questionamentos em torno da espécie Stenella clymene,
estudos genéticos populacionais e filogenéticos tornam-se relevantes e necessários.
7
Estrutura genética populacional de Stenella clymene (Gray, 1850) e sua
relação filogenética com o gênero2
Introdução
Stenella clymene encontra-se distribuída próximo à região equatorial do Oceano
Atlântico (Jefferson et al. 2003), podendo ser avistada no Brasil principalmente no
nordeste, percorrendo a costa brasileira de 3°S a 29°59’S, 050°07’W. Outras espécies do
gênero, como Stenella attenuata Gray, 1846 e Stenella longirostris Gray, 1828
apresentam uma sobreposição significativa de habitat com S. clymene em regiões de
águas profundas e quentes (Perrin et al. 1981; Jefferson et al. 1995; Moreno et al.
2005). Além de existir esta sobreposição sua identificação por observação é difícil, uma
vez que a espécie tem o corpo e extremidades em formato similares as demais espécies
do gênero (Jefferson et al. 2003).
Como S. clymene se restringe às águas quentes e temperadas do Oceano
Atlântico (Fertl et al. 2003), um possível isolamento reprodutivo entre populações
tornaria a espécie mais susceptível a impactos humanos, tais como capturas em redes,
atividades petrolíferas, excesso de ruídos na água, pesca desenfreada, entre outras
degradações ambientais (Frankham et al. 2008). Considerando que na lista vermelha de
espécies ameaçadas da IUCN, S. clymene está classificada dentre a categoria “DD”, ou
seja, com dados deficientes (IUCN, 2012) estudos focando a espécie são necessários,
principalmente quanto a sua estrutura populacional.
Análises envolvendo os polimorfismos existentes nas sequências de DNA entre
indivíduos de populações diferentes nos permitem explorar os processos evolutivos e
eventos demográficos das espécies (Nosil et al. 2009). Ademais, atualmente algumas
das ferramentas genéticas mais utilizadas para esse fim são os marcadores
mitocondriais, caracteristicamente haplóides por conta de sua herança exclusivamente
materna (Wan et al. 2004; Frankham et al. 2008), cujo padrão de herança os tornam
2 Optou-se pelo formato de artigo seguindo as normas da revista Conservation Genetics.
8
mais eficientes para análises que utilizam DNA de pouca qualidade, como no caso de
encalhes, que implicam no uso de fragmentos menores de DNA (Wan et al. 2004;
Frankham et al. 2008).
Estudos genéticos da espécie tornam-se necessários, pois atualmente existe a
hipótese de que Stenella clymene seja um híbrido de S. longirostris e S. coeruleoalba
Meyen, 1833 (Amaral et al. 2014) e ainda permanecem dúvidas quanto ao seu
posicionamento dentro do gênero Stenella e até mesmo em sua subfamília (Perrin et al.
1981; LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-Collado
2008; Kingston et al. 2009; Mcgowen et al. 2009; Steeman et al. 2009; Xiong et al. 2009;
McGowen 2011).
É extremamente necessário esclarecer as questões filogenéticas de S. clymene
para adotar medidas adequadas de conservação da espécie, sendo assim o presente
estudo pretende enriquecer o conhecimento sobre a diversidade gênica de S. clymene
e sua estrutura populacional, bem como contribuir para o esclarecimento de seu
posicionamento filogenético no gênero.
9
Material e Métodos
Amostragem
Um total de 27 amostras de diferentes tecidos de Stenella clymene foram
utilizadas. Estas foram cedidas, em forma de parceria, pela Associação de Pesquisa e
Preservação de Ecossistemas Aquáticos (AQUASIS), pelo Instituto Mamíferos Aquáticos
(IMA) e Centro Mamíferos Aquáticos (ICMBio).
As amostras de tecidos foram removidas de animais encontrados encalhados
e/ou mortos em praias do litoral brasileiro. Dentre as 27 amostras, 12 são do litoral da
Bahia, seis do Ceará, quatro de Pernambuco, duas de Alagoas, duas de Sergipe e uma
da Paraíba (Tabela 1).
Tabela 1: Amostras de Stenella clymene provenientes de diferentes regiões do litoral do nordeste
brasileiro.
Registro Localidade Sexo Ano de coleta Amostra Conservação
Scl 1 Bahia Fêmea 2001 Ovário Formol
Scl 2 Bahia Fêmea 2003 Coração Álcool
Scl 3 Bahia Fêmea 2003 Fígado Álcool
Scl 4 Bahia Fêmea 2006 Ovário Álcool
Scl 5 Bahia Macho 2006 Fígado Álcool
Scl 6 Bahia Fêmea 2007 Coração Álcool
Scl 7 Bahia Fêmea 2007 Pele Álcool
Scl 8 Bahia Fêmea 2008 Músculo Álcool
Scl 9 Ceara Macho 2008 Pele Álcool
Scl 10 Ceara Macho 2012 Pele Álcool
Scl 11 Ceara Macho 2011 Pele Álcool
Scl 12 Ceara Macho 2012 Pele Álcool
Scl 13 Ceara Macho 2012 Músculo Álcool
Scl 14 Ceara Fêmea 2009 Músculo Álcool
Scl 15 Bahia Fêmea 2006 Pele Álcool
Scl 16 Pernambuco Fêmea Não identificado Pele Formol
Scl 17 Alagoas Fêmea 2002 Músculo Formol
Scl 18 Bahia Fêmea 2003 Fígado Álcool
Scl 19 Bahia Macho 2000 Testículo Formol
Scl 20 Pernambuco Fêmea Não identificado Fígado Formol
Scl 21 Pernambuco Macho Não identificado Pele Formol
Scl 22 Paraíba Fêmea 2010 Baço Formol
Scl 23 Pernambuco Fêmea 2010 Fígado Formol
Scl 24 Sergipe Fêmea 2010 Músculo Formol
Scl 25 Bahia Fêmea 2010 Músculo Formol
Scl 26 Sergipe Macho 2010 Testículo Formol
Scl 27 Alagoas Macho Não identificado Fígado Formol
10
Extração do DNA
Foram realizados cinco protocolos de extração (Anexos I a V). Para as amostras
de tecidos musculares, que não apresentavam evidências de degradação e estavam
armazenadas em álcool, foi aplicado o protocolo de solução salina (Bruford et al. 1992)
(Anexo I). As amostras de tecidos epiteliais, sem sinais de degradação e armazenadas
em álcool, foram extraídas com a resina Chelex (Anexo II). Foi incluída uma amostra de
Stenella frontalis de tecido sanguíneo armazenado em EDTA para a qual foi utilizado um
protocolo adaptado de Montgomery e Sise (1990) e Di Pietro et al. (2011) (Anexo III).
Para as amostras de tecidos musculares, armazenadas em álcool, que apresentaram
degradação (tecido de coloração preta ou verde e/ou tecido desmanchando) utilizou-se
um protocolo de fenol-clorofórmio (Sheppard et al. 1992) (Anexo IV). Por fim, as
amostras de tecidos musculares e epiteliais que estavam conservadas em formol foram
extraídas com um protocolo adaptado por Mesquita et al. (2001) (Anexo V).
Uma vez extraído, o DNA foi quantificado por meio da espectrofotometria no
Nanodrop 2000 (Uniscience) utilizando-se 1 µl. Em seguida, este foi armazenado a –
20°C.
Amplificação e sequenciamento do DNA
Foram amplificadas três regiões do DNA mitocondrial: D-loop; Cyt b e CoI. A PCR
(Polymerase Chain Reaction) da região controle D-loop foi realizada com os primers de
Pichler et al. (2001). As reações foram conduzidas com um volume final de 12,5µl com
10-100 ng de DNA, tampão de PCR 10× (Invitrogen), 2 mM de MgCl2, 0,12 µM de cada
primer, 0,05 mM de dNTP e uma unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e o perfil
da PCR consistiu de 95°C por 1 min, 40 ciclos de 94°C por 30s, 54°C por 30s e 72°C por
30s e extensão final de 72°C por 5 minutos. Para a amplificação do citocromo b (Cyt b)
foram utilizados os primers de LeDuc et al. (1999) sendo as reações com um volume
final de 12,5µl com 10-100 ng de DNA, tampão de PCR 10× (Invitrogen), 1,52 mM de
MgCl2, 0,3 µM de cada primer, 0,04 mM de dNTP e uma unidade de Taq DNA
polimerase (Invitrogen) e o perfil da PCR foi de 94°C por 3 min, 35 ciclos de 94°C por
45s, 48°C por 45s e 72°C por 1 min e extensão final de 72°C por 5 minutos. E a
amplificação do citocromo oxidase I (Cox I) foi feita com os primers de Amaral et al.
(2007). As reações foram realizadas para um volume final de 12,5µl com 10-100 ng de
11
DNA, tampão de PCR 10× (Invitrogen), 1,52 mM de MgCl2, 0,3 µM de cada primer, 0,04
mM de dNTP e uma unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e o perfil da PCR foi
de 94°C por 2 min, 35 ciclos de 94°C por 45s, 52°C por 45s e 72°C por 1 min com
extensão final de 72°C por 8 minutos.
Os fragmentos amplificados foram visualizados em gel de agarose (1%) corado
com Gelred e então fotodocumentados. O produto total das PCRs (12,5 µl) foi
purificado adicionando-se a enzima Exonuclease I (10u/µl) e Shrimp alkaline
phosphatase (1u/ µl), Exo/Sap (1/1) e incubando-se a 37°C por 15 min e 80°C por 15
minutos. Em seguida, os fragmentos foram sequenciados, em ambas as direções
(forward e reverse), utilizando o Big Dye Terminator CycleSequencing Kit (Applied
Biosystems) e um sequenciador automático ABI3500 (Applied Biosystems).
Alinhamento das sequências
Além das sequências geradas, foram obtidas sequências do banco de dados do
Grupo de Estudo para Conservação de Mamíferos (GECOM), CEUNES - UFES e do
GenBanK (Tabela 2).
Tabela 2: Espécies do gênero Stenella e número de sequências (n) de DNAmt região D-loop, CoI e Cyt b
obtidas no Genbank.
Espécie Localidade
D-loop CoI Cyt b
n GenBank n GenBank n GenBank
Stenella
attenuata
Atlântico 10 GQ504120-247,
GQ504126-307 6
EU496336-3911,
EU49635311,
EU55709612
4
AF0840968,
X925253,
EF0930305,
X562946,
Pacifico 1 AF0840978
Stenella
coeruleoalba Atlântico 10
GQ5041497,
GQ504152-537,
GQ504158-607,
GQ504162-647
10
EF090640-441,
EU496341-4411,
KF28169510
10 KF692007-112,
KF692014-172
Stenella
clymene Atlântico 20
Scl6*, Scl9*,
Scl11-14*,
Scl16*, Sc21*,
DQ845446-477,
GQ504137-487
14 Scl6-14*, Scl17*,
EU496346-488 22
Scl6-7*,
Scl9-14*, Scl17*,
EU517711-128,
AF08408311,
KF6919582,
KF691985 -912,
KF691994-952,
KF692012-132
12
Stenella
frontalis
Cuvier, 1829
Atlântico 7
Sfr697*
KC204733-354,
KC204737-384,
KC2047404,
EF6828199
10
EU49634011,
EU496349-5211,
EU49635411,
EF5687141,
EF090645-461
KF28169610
5
AF084089-908,
EU517713-1411,
EU12109211
Stenella
longirostris
Atlântico 10 Banco de dados
do GECOM
10 Banco de dados
do GECOM
10 KF691972-752,
KF6919772,
KF691979-832
Total de
sequências
57 50 52
Referências: 1Amaral et al. 2007;2Amaral et al. 2014, 3Arnason e Gullberg 1996; 4Caballero et al. 2013, 5Harlin-
Cognato e Honeycutt 2006; 6Irwin e Arnason 1994;7Kingston et al. 2009; 8LeDuc et al. 1999; 9Quérouil et al. 2010;
10Alfonsi et al. 2013; 11Viricel e Rosel 2012; 12Xiong et al. (2009); Grupo de Estudos para Conservação de Mamíferos
(GECOM) .* presente estudo
As sequências foram alinhadas com o algoritmo MUSCLE (Robert 2004) por meio
do programa MEGA v.6 (Kumar et al. 1994; Tamura et al. 2013), no qual estas também
foram manualmente editadas. Para confirmação das espécies, todas as sequências
foram submetidas a uma comparação com outras depositadas no banco de dados do
GenBank e do DNA Surveillance (Ross et al. 2003).
Análises de diversidade, estruturação e parâmetros filogenéticos
Por meio do programa Arlequin v.3.5 (Excoffier et al. 2005) calcularam-se os
componentes de variância, incluindo as diversidades haplotípica (H) e nucleotídica (π),
além da Análise de Variância Molecular (AMOVA) entre as diferentes localidades,
baseada no FST com 1000 permutações (Nei 1987).
As redes de haplótipos foram construídas com cálculos de Median Joining no
programa Network (Bandelt et al. 1999) e nomearam-se os haplótipos de acordo com a
espécie e o código identificação de cada indivíduo (para as amostras do GenBank foram
utilizados os últimos dígitos). Para as análises apenas com os indivíduos do Brasil, foi
possível realizar um concatenado das três regiões mitocondriais. Para as análises com
indivíduos de outras localidades, foram realizados testes de estruturação considerando-
se três localidades: norte do Oceano Atlântico (AN), Golfo do México (GM) e o sul do
Oceano Atlântico (AS).
13
Para as inferências filogenéticas obteve-se o melhor modelo evolutivo para cada
região do gene mitocondrial (D-loop: HKY+I+G; CoI: HKY+I+G; Cyt b: GTR+I+G) através
do programa JModeltest v2.1.6 (Guindon and Gascuel 2003; Darriba et al. 2012),
utilizando o teste AKAIKE information content (AIC).
No programa BEAST v.1.8.1 (Drummond et al. 2012) foram realizadas as análises
de inferência bayesiana para a reconstrução filogenética. O número de gerações para o
método da cadeia de Monte Carlo Markov (MCMC) estabelecido foi de 10.000.000 com
burning value foi de 1.000. E na plataforma PhyMl v3.0 (Guidon et al. 2003) realizarem-
se as análises de máxima verossimilhança com 1.000 de bootstrap.
A construção das árvores filogenéticas foi realizada no programa FigTree v.1.4.2
(Rambaut 2009), permanecendo os valores de probabilidade a posteriori acima de 0,5
de suporte e valor de bootstrap superior a 500.
Optou-se utilizar como outgroup para D-loop indivíduos de Pontoporia blainvillei
(GenBank: KF270692) e Sotalia guianensis Van Beneden, 1875 (GenBank: KF571740),
para CoI e Cyt b Megaptera novaeanglia Borowski, 1781 (GenBank: AP006467),
Pontoporia blainvillei Gervais e D’orbigny, 1844 (GenBank: respectivamente EU496358 e
AF334488) e Sotalia guianensis (GenBank: respectivamente JF681039 e KJ879248). E
uma vez que existem incongruências dentro da subfamília Delphininae, para as análises
do gênero foram incluídas sequências do GenBank de Delphinus delphis Linnaeus, 1758
(D-loop: EU365132, EU365134-41; CoI: DQ465991-98, EF090638-39; Cyt b: DQ378144-
49, DQ378151-53, DQ378159) e Tursiops truncatus Montagu, 1821 (D-loop: KF650828-
36; CoI: DQ466010-15, EU496324-28; Cyt b: AF084093-95, EF093029, DQ466025-29).
Estes são os dois gêneros que geralmente nos estudos filogenéticos estão relacionados
com Stenella (LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-
Collado 2008; Möller et al. 2008; Kingston et al. 2009; Mcgowen et al. 2009; Steeman et
al. 2009; Charlton-Robb et al. 2011; McGowen 2011; Amaral et al. 2012; Amaral et al.
2014).
14
Resultados
Amplificação e sequenciamento
Do total de 27 amostras, foram obtidas sequências de oito indivíduos para a
região D-loop, dez para a região citocromo oxidase I e nove para a região citocromo b
(Tabela 3).
Tabela 3: Amplificação e sequenciamento dos fragmentos das regiões D-loop, CoI, Cyt b; amostras apenas amplificadas (A) e amostras sequenciadas (X).
Sequenciamento
Registro D-loop CoI Cyt b
Scl 1 A
Scl 2 A
Scl 3
Scl 4
Scl 5 A
Scl 6 x x x
Scl 7 x x
Scl 8 x
Scl 9 x x x
Scl 10 x x
Scl 11 x x x
Scl 12 x x x
Scl 13 x x x
Scl 14 x x x
Scl 15
Scl 16 x A
Scl 17 A x x
Scl 18
Scl 19
Scl 20 A A
Scl 21 x A
Scl 22
Scl 23 A
Scl 24
Scl 25
Scl 26
Scl 27 A
15
Sete amostras amplificaram, porém não resultaram em uma sequência com
qualidade (cinco apresentaram picos pouco definidos e duas amplificaram
pseudogenes). Além disso, cinco eram amostras conservadas em formol. Duas destas
devem ter sido armazenadas em estágio avançado de decomposição, pois
apresentavam uma coloração esverdeada.
Stenella clymene no Brasil
Todas as regiões mitocondriais apresentaram uma alta diversidade haplotípica,
sendo que essa variou de 0,98 para CoI e Cytb a 1,0 para D-loop. A diversidade
nucleotídica variou de 0,006, quando os marcadores estavam concatenados, a 0,0261
para CoI (Tabela 4).
Para se verificar uma possível estruturação entre os indivíduos do Brasil foi
realizada a AMOVA e a análise de distância genética considerando-se as unidades
amostrais (Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco e Sergipe) como unidades populacionais.
Os resultados obtidos não foram significativos entre nenhuma localidade para nenhuma
das regiões mitocondriais (Dloop: FST-= 0,29/p=0,9; CoI: FST =-0,25/p=0,7; Cytb: FST =
0,25/p=0,12).
Tabela 4: Diversidade haplotípica (H) e nucleotídica (π), pares de bases (pb), sítios polimórficos (sp) e transições e transversões para todos os indivíduos de Stenella clymene analisados.
n pb Sp Transições Transversões H π
D-loop 8 356 14 11 3 1,0 +/-0,1 0,0133 +/-0,0
CoI 10 746 61 51 12 0,98 +/-0,0 0,0261 +/-0,0
Cytb 9 948 28 24 4 0,98 +/-0,1 0,007 +/-0.0
Concatenado
CoI/Cytb/D-loop
6 2052 32 27 5 1,0 +/-0,6 0,006 +/-0,0
Para a região D-loop o indivíduo Scl 11 apresentou maior distância em relação
aos demais: nove passos mutacionais (Figura 2A). Já para a região CoI os indivíduos Scl
10 e Scl 08 apresentaram maior distância em relação aos demais (33 passos
mutacionais), sendo que Scl 08 se encontra a 15 passos mutacionais de Scl 10 (Figura
2B). E para a região Cyt b o indivíduo Scl 10 apresentou 12 passos mutacionais em
relação aos demais, o Scl 17 mais de 50 passos mutacionais e Scl 07 mais de 100 (Figura
2C). No concatenado temos novamente o indivíduo Scl 11 pelo menos 13 passos
16
distantes dos demais (Figura 2D).
17
Figura 1: Rede de haplótipos dos indivíduos de Stenella clymene do Brasil para a região D-loop (A), CoI (B), Cyt b (C) e Concatenado (D) do DNA mitocondrial.
A
B
D
C
18
Stenella clymene no Atlântico
Para as análises de estruturação populacional no Oceano Atlântico adotou-se a
divisão das unidades populacionais pelas localidades em norte e sul. Como a análise de
FST para o marcador Cyt b resultou em uma maior distância intrapopulacional (FST =
0,92/p=0,04) que interpopulacional (FST = 0,08/p=0,04), para essa região mitocondrial
optou-se por dividir os indivíduos entre as localidades norte, sul e Golfo do México,
considerando todos os indivíduos de Amaral et. al (2014) como a unidade populacional
do Golfo do México.
Para a região D-loop, ambas as localidades, AN e AS, apresentaram uma
diversidade gênica de 1,0 e nucleotídica de 0,02. Já para a região do CoI a diversidade
gênica variou de 0,99 para o AS a 1,0 para o AN e uma baixa diversidade nucleotídica de
0,0042 para o AN a 0,0234 para o AS. E quanto à região do Cyt b, a diversidade gênica
variou de 0,83 para o GM a 1,0 para o AS; e a nucleotídica de 0,006 para o AS a 0,0128
para o GM (Tabela 5).
Tabela 5: Diversidade haplotípica (H) e nucleotídica (π), pares de bases (pb), sítios polimórficos (sp) e transições e transversões de Stenella clymene do Oceano Atlântico
n pb Sp H π
D-loop AS 8 400 14 1,0 +/-0,02 0,02 +/-0,01
AN 14 400 24 1,0 +/-0,02 0,02 +/-0,01
CoI AS 10 636 44 0,99 +/-0,04 0,0234 +/-0,1
AN 3 636 4 1,0 +/-0,27 0,0042 +/-0,01
Cytb AS 9 783 19 0,97 +/-0,06 0,006 +/-003
AN 3 783 11 1,0 +/-0,27 0,0112 +/-0,001
GM 12 783 51 0,83 +/-0,08 0,0128 +/-0,007
Na AMOVA, os resultados foram significativos entre todas as localidades para
todas as regiões mitocondriais D-loop, FST= 0,88 (p = 0,00), CoI, FST = 0,70 (p = 0,00) e
Cyt b, FST= 0,86 (p = 0,00), sendo que para o Cyt b os valores de FST entre AN e AS (FST=
0,96/p = 0,00) e entre AN e GM (FST= 0,93/p = 0,00) foram maiores do que entre AS e
GM (FST = 0,11/p = 0,00).
Na rede de haplótipos de D-loop, CoI e Cyt b podemos notar um padrão de
distribuição que corrobora os resultados de estruturação populacional entre as
localidades norte e sul do Oceano Atlântico (Figura 2). Nota-se que para Cyt b, apesar
das localidades AS e GM se encontrarem separadas, existem indivíduos mantendo a
conexão entre elas.
19
Figura 2: Rede de haplótipos dos indivíduos de Stenella clymene do Oceano Atlântico para a região D-loop (A), COI (B), e Cyt b (C) do DNA mitocondrial.
20
Stenella clymene e o gênero
Nas redes de haplótipos do gênero, incluindo D. delphis e T. truncatus pode-se
notar uma evidente separação entre as espécies, todavia D. delphis e T. truncatus estão
dentro do gênero Stenella, resultados esses congruentes para os três marcadores
moleculares (Figura 3).
Para a região D-loop S. clymene encontra-se mais próxima de S. frontalis e em
ambos os agrupamentos são encontrados indivíduos de D. delphis (Figura 3A). Quanto a
região CoI temos S. clymene próxima de S. coeruleoalba, mas os indivíduos Scl 10 e Scl
08 de S. clymene estão próximos do indivíduo Ttr 15, T. truncatus, estando esses três
indivíduos distantes dos demais agrupamentos (Figura 3B). Para a região Cyt b, S.
clymene também se encontra próxima de S. coeruleoalba, mas um indivíduo de S.
clymene (GM 58) está agrupado com S. longirostris (Figura 3C).
Nas análises de recuperação filogenética para os três marcadores moleculares
do gênero Stenella, quando considerados apenas os indivíduos de S. clymene do Brasil,
foram recuperadas como monofiléticas as espécies S. attenuata, S. frontalis e S.
longirostris, contudo S. clymene foi recuperada como monofilética apenas para D-loop e
S. coeruleoalba somente para Cyt b. Além disso, temos S. frontalis como grupo irmão do
clado S. clymene e S. Coeruleoalba, com exceção para D-loop em que S. clymene é grupo
irmão do clado S. coeruleoabla e S. frontalis. (Figuras 4, 5 e 6).
Para a região D-loop, a árvore de verossimilhança foi discordante da árvore
bayesiana e apresentou baixos suportes para os valores de bootstrap. Como não
contribuiria para as discussões, optou-se por ilustrar apenas a árvore bayesiana. Nessa
destaca-se o fato de que S. coeruleoalba não é monofilética, pois três de seus indivíduos
formam um grupo irmão de S. clymene (Figura 4). Na árvore de CoI S. coeruleoalba não
apresenta-se monofilética, pois dois de seus indivíduos formam um grupo irmão de S.
clymene. O mesmo ocorre com S. clymene, pois dois indivíduos estão em ramos
externos a todos os demais (Figura 5). E para Cyt b, S. clymene não é monofilética, uma
vez que um de seus indivíduo está em um ramo externo ao agrupamentos de S. clymene
e S. coeruleoalba (Figura 6).
Na relação filogenética recuperada do gênero, considerando os indivíduos de S.
clymene do Oceano Atlântico e incluindo D. delphis e T. truncatus, as principais
mudanças devem-se à inclusão de D. delphis e T. truncatus (Figuras 7, 8 e 9). Nessas
21
análises foram recuperadas como monofiléticas as espécies S. attenuata, S. frontalis e S.
longirostris. Entretanto S. clymene foi recuperada como monofilética apenas para D-
loop e S. coeruleoalba somente para Cyt b, enquanto D. delphis não foi recuperada
como monofilética apenas para D-loop e T. truncatus para CoI.
Para o marcador D-loop, D. delphis torna-se mais próxima de S. coeruleoalba do
que S. frontalis e as três são grupo irmão de S. clymene. Além disso, S. coeruleoalba não
é monofilética, pois os mesmos três indivíduos permanecem como grupo irmão de S.
clymene. D. delphis também não se mostrou monofilética, uma vez que um de seus
indivíduos está dentro do clado de S. clymene e outro indivíduo c está dentro do clado
de S. frontalis (Figura 7).
Na árvore de CoI, S. clymene permanece próxima de S. coeruleoalba, mas S.
frontalis encontra-se próxima de D. delphis e mais próxima de T. truncatus do que de S.
clymene e S. coeruleoalba. Ademais, junto aos dois indivíduos de S. coeruleoalba que
formam um grupo irmão de S. clymene encontra-se um indivíduo de D. delphis. E S.
clymene não é monofilética, pois os indivíduos da localidade norte do Oceano Atlântico
formam um grupo irmão do clado S. clymene e S. coeruleoalba. Junto aos dois
indivíduos de S. clymene que estão em ramos externos a todos os demais, encontra-se
um indivíduo de T. truncatus (Figura 8).
Já para Cyt b, permanecem as relações entre S. clymene, S. coeruleoalba e S.
frontalis, mas D. delphis e T. truncatus tornam-se mais próximas desse agrupamento do
que S. longirostris e S. attenuata. S. clymene não se mostrou monofilética já que um
indivíduo do Golfo do México encontra-se junto ao indivíduo do Brasil que está fora do
clado, e um indivíduo do Golfo do México encontra-se dentro do clado de S. longirostris.
Além disso dois indivíduos da localidade norte do Oceano Atlântico estão em ramos
externos a todas as demais espécies (Figura 9).
22
Figura 3: Rede de haplótipos dos indivíduos do gênero Stenella para a região D-loop (A), COI (B), e Cyt b (C) do DNA mitocondrial, incluem-se
indivíduos de Delphinus delphis e Tursiops truncatus.
23
Figura 4: Relação filogenética recuperada dos indivíduos de Stenella clymene do Brasil e as demais espécies de seu gênero com inferência
Bayesiana e de Verossimilhança para a região D-loop do DNA mitocondrial. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a
posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos
externos ao agrupamento de sua espécie.
24
Figura 5: Relação filogenética recuperada dos indivíduos de Stenella clymene do Brasil e as demais espécies de seu gênero com inferência
Bayesiana e de Verossimilhança para a região CoI do DNA mitocondrial. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a
posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos
ao agrupamento de sua espécie.
25
Figura 6: Relação filogenética de Stenella clymene do Brasil e as demais espécies de seu gênero com inferência Bayesiana e de Verossimilhança
para a região Cyt b do DNA mitocondrial. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a posteriori e à direita ao valor de
bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos ao agrupamento de sua
espécie.
26
Figura 7: Relação filogenética de Stenella clymene do Oceano Atlântico e demais espécies de seu gênero, incluindo duas espécies de gêneros
próximos, com inferência Bayesiana e de Verossimilhança para a região D-loop. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a
posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos
ao agrupamento de sua espécie.
27
Figura 8: Relação filogenética de Stenella clymene do Oceano Atlântico e demais espécies de seu gênero, incluindo duas espécies de gêneros próximos, com inferência Bayesiana e de Verossimilhança. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos ao agrupamento de sua espécie.
28
Figura 9: Relação filogenética recuperada de Stenella clymene do Oceano Atlântico e demais espécies de seu gênero, incluindo duas espécies de gêneros próximos, com inferência Bayesiana e de Verossimilhança para a região Cyt b. Valores à esquerda correspondem a probabilidade bayesiana a posteriori e à direita ao valor de bootstrap, sendo ambos representados apenas acima de 50%. Destacam-se em vermelho os indivíduos externos ao agrupamento de sua espécie.
29
Discussão
Amplificação e Sequenciamento
A amplificação e o sequenciamento de algumas amostras ficaram
comprometidos e não foram incluídos nas análises, devido à qualidade das amostras.
Por tratar-se de uma espécie oceânica, com preferência por áreas mais profundas
(Davis et al. 1998; Fertl et al. 2003; Weir 2006), os eventos de encalhes são mais raros e,
quando ocorrem, geralmente os indivíduos encontram-se em estágio avançado de
decomposição. Outro fator de importante influência é a forma de armazenamento das
amostras, já que muitas amostras cedidas estavam conservadas em formol que não é o
reagente adequado para conservação de material para análises moleculares. De 15
amostras conservadas em formol e/ou de pouca qualidade, após testes e adaptações
em protocolos de extração, conseguiu-se incluir quatro destas amostras nas análises.
Stenella clymene no Brasil
As amostras de S. clymene do Brasil apresentaram alta diversidade haplotípica
para todos os marcadores testados; já a nucleotídica foi alta para os marcadores CoI e
D-loop, sendo esses resultados similares ao encontrado em estudos com outros
Delphinidae (Natoli et al. 2005; Adams and Rosel 2006; Amaral et al. 2007; Quérouil et
al. 2007; Caballero et al. 2013; Stockin et al. 2014). Uma baixa diversidade nucleotídica
(0,006) foi encontrada para o marcador Cyt b, diferente do obtido no estudo de (Amaral
et al. 2014) em que S. clymene apresentou diversidade nucleotídica de 0,012 para Cyt b.
Uma vez que se verificou compartilhamento de haplótipos entre diferentes
regiões e não foi possível constatar um padrão de estruturação geográfico, pode-se
dizer que os indivíduos das diferentes localidades do Brasil constituem uma mesma
unidade populacional. Esse resultado poderá ser confirmado aumentando-se o número
de indivíduos, uma vez que isso diminuiria as chances de viés nas estimativas de FST
(Kalinowski 2005).
Ademais, a baixa diversidade nucleotídica encontrada para o marcador Cyt b e a
existência de haplótipos mais distantes dos agrupamentos encontrados para todos os
marcadores sugerem a ocorrência de um evento de gargalo na população como o
30
relatado em outros estudos de cetáceos (Hoelzel et al. 2002; Hoelzel et al. 2007; Luca et
al. 2009).
Stenella clymene no Oceano Atlântico
As diversidades haplotípicas e nucleotídicas foram similares para todos os
marcadores e para todas as localidades, exceto para o CoI nas amostras do Atlântico
Norte que apresentou uma menor diversidade nucleotídica em relação ao Atlântico Sul.
Tal fato pode ser devido as poucas amostras disponíveis para a região do CoI do AN.
Todos os resultados obtidos para AMOVA, distâncias genéticas, redes de
haplótipos e recuperações filogenéticas evidenciam uma estruturação populacional
entre as localidades do Atlântico Norte e Atlântico Sul e entre Atlântico Norte e Golfo
do México. A unidade populacional AN apresentou um alto FST em relação as unidades
populacionais AS e GM, o que foi confirmado com as recuperações filogenéticas nas
quais encontram-se em clados distintos. Já entre a unidade populacional AS e GM
observa-se um baixo valor de FST, o qual é refletido nas distâncias de apenas um passo
mutacional entre os indivíduos das redes haplotípicas e nas árvores filogenéticas onde
os indivíduos dessas unidades populacionais estão no mesmo clado.
Adams e Rosel (2006) em um estudo de estruturação populacional de S. frontalis
também encontraram diferenciação entre as localidades do Atlântico Norte e Golfo do
México e sugeriram que a hipótese mais provável seria a influência da distribuição de
suas presas, as quais teriam sua dispersão limitada por barreiras como as correntes
oceânicas (Dowling e Brown 1993; Hoelzel 1994). A mesma hipótese se aplica para S.
clymene considerando a relação com a distribuição das presas já que as principais
seriam espécies mesopelágicas (Jefferson et al. 2003) que sofrem influência até mesmo
da estratificação vertical das massas de água (Davis et al. 1998).
Um fato interessante que deve ser destacado é que tanto nas análises das redes
haplotípicas quanto nas árvores filogenéticas quando a região do Cyt b foi analisada
considerando apenas o Brasil, o indivíduo Scl 10 encontrou-se mais distante dos demais,
e quando considerado o Oceano Atlântico o indivíduo Scl 10 aproximou-se do indivíduo
GM 95 (Figura 3). Uma hipótese para explicar tal resultado seria a existência de fluxo
gênico entre as unidades populacionais do AS e GM, já que é possível que ocorra uma
migração sazonal da unidade populacional de S. clymene do Atlântico Sul para a região
31
do Golfo do México. Tendo em vista que no estudo de Stramma et al. (1995) foi
verificado que durante a primavera austral na corrente do Norte do Brasil temos uma
corrente submarina de intensa velocidade nos 1000m superiores da coluna d’agua
(profundidade dentro do raio de preferência de S. clymene) que pode influenciar a
migração de fito e zooplâncton e por consequência a dos demais níveis tróficos,
principalmente de peixes mesopelágicos com migração vertical, os quais já foram
reconhecidos como presas de S. clymene (Jefferson et al. 2003).
Stenella clymene e o gênero
Para a recuperação filogenética do gênero Stenella, quando considerados
apenas os indivíduos de S. clymene do Brasil, temos tanto para a região CoI como para a
Cyt b S. clymene e S. coeruleoalba como espécies irmãs e S. frontalis a espécie
imediatamente mais próxima, resultado similar ao de todos os estudos filogenéticos
realizados com Cyt b (LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e
May-Collado 2008; Möller et al. 2008; Mcgowen et al. 2009; Bilgmann et al. 2011;
McGowen 2011; Amaral et al. 2014). Já para a região D-loop, temos S. coeruleoalba e S.
frontalis como espécies irmãs e S. clymene a espécie mais próxima desse clado. O
agrupamento entre S. coeruleoalba e S. frontalis foi verificado no estudo de McGowen
(2011), para análises de DNA nuclear, nas quais S. clymene não estava inclusa. S.
clymene mostrou-se monofilética para a região D-loop, entretanto polifilética para as
regiões CoI e Cyt b, corroborando o verificado nas análises de Cyt b do estudo de
Amaral et al. (2014). Na árvore de D-loop temos S. coeruleoalba parafilética com
indivíduos dentro do clado de S. clymene, para CoI temos S. coeruleoalba polifilética
com indivíduos dentro do clado de S. clymene e S. frontalis, enquanto na árvore de Cyt
b é monofilética. O resultado obtido para CoI corrobora o encontrado por Amaral et al.
(2014).
Quanto à recuperação filogenética do gênero Stenella, considerado os indivíduos
de S. clymene do Oceano Atlântico e incluindo D. delphis e T. truncatus, os resultados
obtidos para D-loop, CoI e Cyt b incluem dentro do clado de Stenella as espécies D.
delphis e T. truncatus, o que corroboram as análises filogenéticas de Delphininae (LeDuc
et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-Collado 2008; Möller et
32
al. 2008; Kingston et al. 2009; Steeman et al. 2009; Charlton-Robb et al. 2011;
McGowen 2011; Amaral et al. 2012; Amaral et al. 2014).
Para a região D-loop temos S. clymene como grupo irmão do clado S.
coeruleoalba, S. frontalis e D. delphis, resultados que diferem do observado
anteriormente por Charlton-Robb et al. (2011). Neste estudo S. clymene é grupo irmão
de T. aduncus, seguida de S. frontalis, e D. delphis é mais próxima de S. attenuata. Mas
essa diferença entre os resultados possivelmente ocorreu, pois o foco de Charlton-Robb
et al. (2011) eram os indivíduos do gênero Tursiops, de modo que utilizaram poucos
indivíduos dos gêneros Stenella e Delphinus.
Tanto para CoI quanto para Cyt b o clado S. clymene e S. coeruleoalba
permaneceu, independentemente da inclusão de D. delphis e T. truncatus. Tal dado é
corroborado por estudos prévios realizados com Cyt b (LeDuc et al. 1999; May-Collado
e Agnarsson 2006; Agnarsson e May-Collado 2008; Möller et al. 2008; McGowen 2011).
No atual estudo foi recuperado para a região CoI o clado S. frontalis e D. delphis,
seguido de T. truncatus. Enquanto para Cyt b, D. delphis e T. truncatus ficam
posicionadas entre o clado S. clymene, S. coeruleoalba e S. frontalis e o clado S.
longirostris. Esses resultados foram obtidos pela primeira vez no presente estudo
provavelmente porque foi utilizado um número de indivíduos por espécie superior ao
dos estudos anteriores (LeDuc et al. 1999; May-Collado e Agnarsson 2006; Agnarsson e
May-Collado 2008; Möller et al. 2008; Kingston et al. 2009; Steeman et al. 2009;
Charlton-Robb et al. 2011; McGowen 2011; Amaral et al. 2012; Amaral et al. 2014).
Na recuperação filogenética para a região Cyt b temos apenas um indivíduo de S.
clymene dentro do clado de S. longirostris, diferente do encontrado por Amaral et al.
(2014), considerando que seus indivíduos de S. longirostris e S. clymene foram utilizados
nas análises do presente estudo. No estudo de Amaral et al. (2014) dois indivíduos de S.
clymene encontravam-se dentro do clado de S. longirostris, resultado que levantou a
hipótese de uma introgressão já que o estudo sugere que a espécie S. clymene tenha
uma origem hibrida de um cruzamento entre S. coeruleoalba e S. longirostris. Contudo,
o resultado aqui apresentado contradiz essa proposta de introgressão, uma vez que
demonstra que a inclusão de indivíduos de diferentes localidades aumentou a resolução
dos relacionamentos filogenéticos da espécie e fez com que seqüências analisada por
33
Amaral et al. (2014) fosse incluída no clado com indivíduos de Stenella clymene do
Atlântico Sul e não com outra espécie.
Conclusões
A partir deste estudo pode-se concluir que os indivíduos de S. clymene do Brasil
apresentam alta diversidade haplotípica e que constituem uma mesma unidade
populacional. Também é possível afirmar que no Oceano Atlântico existe uma unidade
populacional bem definida localizada na região norte e que provavelmente existe outra
unidade populacional que transita entre as localidades da região sul e o Golfo do
México. Ademais, S. clymene é provavelmente grupo irmão de S. coeruleoalba com S.
frontalis como a espécie mais próxima.
A inclusão de um maior número de indivíduos de diferentes localidades e
marcadores moleculares seria interessante para complementar os resultados aqui
apresentados. Ademais, é necessário promover a interdisciplinaridade entre os ramos
da ecologia, anatomia, comportamento e biogeografia, aprofundando assim as
discussões em torno da filogenia e conservação da espécie.
34
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Anexos
Anexo I - Protocolo de extração de DNA utilizando solução salina Bruford et al. (1992).
Solução de lise adaptada: volume final 50ml
Tris-HCl (1M, pH 8,0): 0,5 ml
EDTA (5 M, pH 8,0): 1,0 ml
ddH2O: 48,5 ml
Com uma pinça e lâmina de bisturi devidamente esterilizados a amostra é foi
cortada até atingir o tamanho mínimo possível. FoiÉ colocada em um microtubo (1,5
ml), devidamente nomeado, e são adicionados 410µl de buffer de extração, 80 µl de
SDS (10%) e 10µl de proteinase K. O microtubomicrotubo é deixado no banho-maria à
55°C durante 12 horas. Então centrifuga-se à 13.000 rpm por 5 min e o sobrenadante é
transferido para um novo microtubo. São adicionados 180 µl de NaCl (5M) e inverte-se
a amostra gentilmente 50 vezes até homogeneizar. Centrifuga-se à 13.000 rpm por 5
min e o sobrenadante é transferido para um novo microtubo. Adiciona-se 1ml de
isopropanol (gelado) e inverte-se a amostra gentilmente 20 vezes até homogeneizar.
Centrifuga-se à 13.000 rpm por 7 min e o sobrenadante é descartado. Adiciona-se 250
µl etanol (80%) e inverte-se a amostra gentilmente 50 vezes até homogeneizar.
Centrifuga-se à 13.000 rpm por 7 min e toda fase aquosa é descartada. Deixa-se secar
por completo o pellet. Quando o microtubo estiver completamente seco o DNA é
resuspendido em 20ul de ddH2O e armazenado a -4°C.
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Anexo II - Protocolo de extração de DNA com resina Chelex.
Com uma pinça e lâmina de bisturi, devidamente esterilizados, a amostra é
cortada até atingir o tamanho mínimo possível. É colocada em um microtubo (1,5 ml),
devidamente nomeado, e são adicionados 200 µl de resina Chelex (5%). O microtubo é
deixado no banho-maria à 65°C durante 16 horas. Então são colocados em outro
banho-maria à 95°C durante 15 minutos. Centrifuga-se à 14.000 rpm por 3 min e o
sobrenadante é transferido para um novo microtubo e armazenado a -20°C.
Anexo III - Protocolo de extração de DNA de sangue adaptado de Montgomery and Sise
(1990) e Di Pietro et al. (2011).
Para realizar a digestão celular em um microtubo (2 ml) são adicionados 500ul
de amostra de sangue, 500 µl de Tris-HCl (pH 7,5), 500 µl de fenol e 500 µl de água ultra
pura. O microtubo é levado ao vortex por 10 min e depois ao banho-maria à 55°C por
20min. O processo de vortexar e levar ao banho-maria é repetido durante 3 horas. A
amostra digerida é centrifugada à 7.500 rpm por 5min e a fase aquosa é removida e
colocada em um novo microtubo (2 ml). São adicionados 500 µl de Tris-HCl (pH 7,5)
saturado com fenol-clorofórmio, centrifuga-se à 7.500 rpm por 5 min e o sobrenadante
é selecionado e colocado em um microtubo (2 ml). São adicionados 500 µl de Tris-HCl
(pH 7,5) saturado com clorofórmio, centrifuga-se à 7.500 rpm por 5 min e o
sobrenadante é selecionado e colocado em um microtubo (2 ml). Novamente são
adicionados 500 µl de Tris-HCl (pH 7,5) saturado com clorofórmio, centrifuga-se à 7.500
rpm por 5 min e o sobrenadante é selecionado e colocado em um microtubo (2 ml).
Então para precipitar o DNA são adicionados NaCl (5M) numa proporção de 1:1/10 do
volume de sobrenadante e isopropanol na proporção de 1:1, deixando-os reagir, em
temperatura ambiente por 5 min. Centrifuga-se à 11.000 rpm por 10 min e dessa vez o
sobrenadante é descartado. Permanecerão algumas gotículas no microtubo que devem
secar à temperatura ambiente. Uma vez que o microtubo estiver completamente seco o
DNA é resuspendido em 100 µl de TE (1x) e por fim armazenado a -20°C.
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Anexo IV - Protocolo de extração de DNA com fenol/clorofórmio o de Sheppard et al.
(1992).
Soluções: volume final 50ml
Solução X Solução Y
Tris-HCl (2M, pH 6,8): 0,25 ml 7,5 ml
EDTA (0,5 M, pH 8,0): 1,00 ml 10,0 ml
NaCl (5M): 0,60 ml -
SDS 10%: 2,50 ml 3,7 ml
ddH2O: 39,5 ml 45,65 ml 28,8 ml
Com uma pinça e lâmina de bisturi, devidamente esterilizados, a amostra é
cortada até atingir o tamanho mínimo possível. É colocada em um microtubo (1,5 ml) e
são adicionados 250 µl de solução X e 1,25 µl de proteinase K (20mg/ml). O microtubo é
deixado no banho-maria à 55°C por 30min. Adiciona-se 250 µl de solução Y e inverte-se
a amostra gentilmente 10 vezes até homogeneizar. O microtubo é deixado no freezer
por 10 min. São adicionados 500 µl de fenol e inverte-se a amostra gentilmente até
obter um aspecto leitoso. O microtubo é deixado no freezer por 3 min. Centrifuga-se à
14.000 rpm por 5 min e transfere-se o sobrenadante para um novo microtubo. São
adicionados 250 µl de fenol e 250 µl de clorofórmio e inverte-se a amostra gentilmente
até obter um aspecto leitoso. O microtubo é deixado no freezer por 3 min. Centrifuga-
se à 14.000 rpm por 5 min e transfere-se o sobrenadante para um novo microtubo. São
adicionados 500 µl de clorofórmio e inverte-se a amostra gentilmente até
homogeneizar. Centrifuga-se à 14.000 rpm por 5 min e transfere-se o sobrenadante
para um novo microtubo. Adiciona-se 1 ml de etanol absoluto gelado e inverte-se
a amostra gentilmente até homogeneizar. A amostra é deixada overnight no freezer. No
dia seguinte é centrifugada à 14.000 rpm por 30 min e dessa vez descartar-se o
sobrenadante. São adicionados 70 µl de etanol (70%), centrifuga-se à 14.000 rpm por 5
min e descartar-se o sobrenadante. O pellet é deixado para secar à temperatura
ambiente. Quando o microtubo estiver completamente seco o DNA é resuspendido em
50 µl de TE (1%) e armazenado a -4°C.
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Anexo V - Protocolo de extração de DNA para amostras em formol adaptado de
Mesquita (2001).
Solução de lise adaptada: volume final 50ml
Tris-HCl (1M, pH 8,0): 0,5 ml
EDTA (0,5 M, pH 8,0): 1,0 ml
NaCl (1M): 1,0 ml
SDS 10%: 8,0 ml
ddH2O: 39,5 ml
Com uma pinça e lâmina de bisturi, devidamente esterilizados, a amostra é
cortada até atingir o tamanho mínimo possível. É colocada em um microtubo (1,5 ml) e
são adicionados 200 µl de solução de lise e 25ul de proteinase K (20mg/ml). O
microtubo é deixado no banho-maria à 55°C por 4 dias, sendo que em cada dia são
adicionados 12,5 µl de proteinase K (250 µl /ml) e a amostra é vortexada levemente. No
último dia a amostra é retirada do banho-maria à 55° C e colocada em outro banho-
maria à 95°C por 10min, parando a ação de digestão da enzima. Então são adicionados
1ml de fenol 99% (pH 8,0) e centrifuga-se à 4.200 rpm por 20 min e o sobrenadante é
colocado em um novo microtubo (1,5 ml). São adicionados 500 µl de fenol, 480 µl de
clorofórmio e 20 µl de álcool isopropílico, centrifuga-se à 4.200 rpm por 20min e o
sobrenadante é colocado em um novo microtubo (1,5 ml). São adicionados 2 volumes
de etanol absoluto gelado e acetato de amônio (7 M) na proporção de 1/10 do volume
de amostra. A amostra é deixada overnight no freezer. No dia seguinte a amostra é
centrifugada à 19.600 rpm por 20 min e dessa vez descartar-se o sobrenadante. São
adicionados 70 µl de etanol (70%), centrifuga-se à 14.000 rpm por 5 min e descartar-se
o sobrenadante. O pellet é deixado para secar à temperatura ambiente. Quando o
microtubo estiver completamente seco o DNA é resuspendido em 50 µl de TE (1%) e
armazenado a -4°C.