Estrutura dos Ácidos Nucléicos -...
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HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1869 → Johann Friedrich
Miescher
# Buscava determinar os componentes
químicos do núcleo celular.
# Usava os glóbulos brancos contidos no
pus para suas pesquisas (células que
apresentam núcleos grandes e fáceis de
serem isolados do citoplasma).
# Descobriu a presença de um composto de
natureza ácida desconhecido até o
momento (rico em fósforo e em
nitrogênio, desprovido de enxofre e
resistente à ação da pepsina - enzima
proteolítica)) → nucleína
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1880 → Albrecht Kossel
# Demonstrou que a nucleína continha
bases nitrogenadas em sua estrutura.
1889 → Richard Altmann
# Obteve nucleína com alto grau de pureza,
comprovando sua natureza ácida e dando-
lhe o nome de ácido nucléico.
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1900: Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns
Redescoberta de Mendel
Leis da Hereditariedade
Leis de Mendel
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
1953: James Watson e Francis Crick
Maurice Wilkins e Rosalind Franklin
DNA → INTRODUÇÃO
• Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de
auto-replicação é fundamental.
• Conter a informação genética significa armazená-la, transmiti-la ao
longo das gerações, e expressá-la na forma de proteínas.
• Avanços significativos tem sido alcançados na área da Biologia
Molecular a partir do isolamento, análise e síntese de seqüências de
DNA.
• DNA recombinante → estudos de função e dos mecanismos que
controlam a expressão gênica
ÁCIDO NUCLÉICO → PROTEÍNA
Pentose (Açúcar)
Ribose -D-Ribofuranose
OH
-
R
2’-Desoxirribose -D-2-desoxirribofuranose
H
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
PURINAS
Bicíclicas
PIRIMIDINAS
Monocíclicas
Adenina = Timina Guanina Citosina
Uracil
Purina Adenina Guanina
Pirimidina Citosina Uracil Timina
Bases Nitrogenadas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
PIRIMIDINAS
Curiosidade sobre as Bases Nitrogenadas
Uracil Timina
5-Metiluracil
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Nucleotídeo
Nucleosídeo
Nucleosídeo
(2’-) Desoxirribonucleotídeo
Ribonucleotídeo
Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato
-
Monofosfato
-
Difosfato
-
Trifosfato
5’-Difosfato de Adenosina - ADP
5’-Difosfato de Desoxiadenosina - dADP
5’-Trifosfato de Adenosina - ATP
5’-Trifosfato de Desoxiadenosina - dATP
5’-Monofosfato de Adenosina - AMP
5’-Monofosfato de Desoxiadenosina - dAMP
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Grupo Ceto (C=O) e Amino (C-NH2)
Chargaff
Relação Molar (1949)
A
T = 1,0
C
G = 1,0
AT = CG (?)
(A+G) = (T+C)
Bases Nitrogenadas
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Ligações Fosfodiéster
Ligação (-) Glicosídica (Glicosílica)
Ligações Importantes
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Ligações Covalentes
Sítios Hidrofóbicos
Sítios Hidrofílicos
Forças de Van der Walls
Pontes de
Hidrogênio
Interações Iônicas (Mg+2)
Estabilidade do DNA: Integridade e Flexibilidade
DUPLA-HÉLICE DO DNA
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
• Fenômenos físicos que ocorrem com o DNA
dupla-hélice fundamentais para os processos
de replicação, transcrição e recombinação.
• DESNATURAÇÃO → rompimento das
pontes de hidrogênio entre as cadeias
complementares do DNA.
• RENATURAÇÃO → ligamento das pontes de
hidrogênio entre as cadeias complementares
do DNA.
• Esses processos podem ser observados in
vitro
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida através
dos seguintes mecanismos:
→ aumento de temperatura
→ titulação com ácidos ou álcalis (protonizam ou desprotonizam os anéis
aromáticos)
→ agentes desnaturantes (formamida)
# Tais tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice
(levando ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares).
Efeito
Hipercrômico
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro de
absorbância de luz ultravioleta (UV).
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A temperatura necessária para a desnaturação de um dado DNA está diretamente relacionada com sua seqüências de pares de bases.
Adenina = Timina Guanina Citosina
Uracil
Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)
• Em condições fisiológicas, a dupla-hélice é
muito estável.
• Para que estes processos ocorram há a
necessidade da participação de enzimas
especializadas (DNA-helicases e SSBs)
Rompimento das Pontes de Hidrogênio
Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
• Mesmo quando as duas fitas do DNA estão completamente separadas,
o processo pode ser revertido.
• Se uma solução contendo DNA desnaturado por calor for lentamente
resfriada, as fitas complementares reassociam-se.
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
• No início, a renaturação ocorre lentamente. Porém, à medida que as
bases complementares se associam, a velocidade do processo aumenta.
• Resfriamentos abruptos colapsam a renaturação
# Quanto maior a complexidade do genoma, maior será o tempo de sua
renaturação.
DUPLA-HÉLICE DO DNA
As ligações glicosídicas no DNA, por não estarem diretamente opostas na
dupla-hélice, geram duas cavidades desiguais em seu contorno:
→ cavidade maior
→ cavidade menor
# Nestas regiões, as bases estão expostas ao meio solvente.
# Moléculas que agem com seqüências específicas de bases (proteínas)
podem identificar estas seqüências sem romper a estrutura da dupla-hélice.
TIPOS DE DNA
O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua
composição de bases e do meio em que se encontra
→ DNA A
→ DNA B
→ DNA Z
Tipo A → forma mais abundante encontrada na célula (forma de dupla-
hélice clássica)
Tipo B → formado a partir da desidratação ou diminuição do teor de sal
no meio em que se encontra o Tipo A.
TIPOS DE DNA
Tipo Z → encontrado, aparentemente, em apenas algumas regiões do DNA
Tipo B ou Tipo A.
# Fatores que estabilizam sua formação:
→ metilação ou bromação de bases
→ estresse torcional
→ ligação de proteínas específicas ao DNA
• Alterações nas conformações podem facilitar ou dificultar a interação do
DNA com proteínas.
Conformação anti e syn
C2’-endo
C3’-endo
DNA B DNA A
DNA Z
Etanol 75%
[Sal]
Dupla RNA
Metilação ou Bromação
Umidade
Relativa (92%)
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
Principais características dos DNAs A, B e Z
CARACTERÍSTICAS FORMA A FORMA B FORMA Z
Sentido helicoidal
(Giro) Direita Direita Esquerda
Diâmetro (nm) ~2,6 ~2,0 ~1,8
Pb por giro (n) 11 10 12
Espaço entre as
bases (nm) 0,26 0,34 0,37
Inclinação da base 20o 6o 7o
Sulco maior Estreito/Profundo Largo/Profundo Achatado
Sulco menor Largo/Raso Estreito/Profundo Estreito/Profundo
Ligação glicosídica anti anti anti(pir) sin(pur)
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
RNA mensageiro (mRNA)
Fim da
mensagem
Sinal de ligação ao
Ribossomo
Códon de
Iniciação
(Start Códon)
Início da Transcrição
Hairpin
AAAAA
CAU
AGGAGGU
AUG
O DNA nem sempre está na forma de um bastão de dupla-hélice (linear).
# Quando as duas extremidades de um DNA ligam-se covalentemente,
formam-se as chamadas estruturas circulares.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
• Além da estrutura secundária da
dupla-hélice, o DNA assume uma
conformação tridimensional
supertorcida.
# A dupla-hélice enrola-se sob si
mesma (extremamente importante
nos processos de replicação,
transcrição, recombinação e
expressão gênica).
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Estrutura Supertorcida, Superenrolada ou Super-hélice
A B
C
Grau de superenrolamento crescente
A: Relaxada
B: Superenrolamentos parciais
C: Totalmente Superenrolado
Topois
ôm
ero
s
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
• Plectonêmico → DNA em solução.
• Toroidal → DNA enrolado em proteínas (histonas), para formar os
nucleossomos.
# O desenrolamento das hélices pode induzir à formação de estruturas
criciformes, triplex ou DNA Tipo Z.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Tipos de Superenrolamentos
Topoisômeros → moléculas com seqüências e tamanhos idênticos, que
diferem apenas na sua topologia.
Topoisômerases → enzimas que, quando presentes, promovem a quebra
transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo
superenrolamentos.
• A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas
passem umas sobre as outras.
• Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como
eucarióticas.
TOPOISOMERASES
Topoisômerase I → quebram apenas uma das fitas de DNA
Topoisômerase II → quebram as duas fitas da dupla-hélice
Participam de importantes etapas nos processos de replicação,
transcrição e recombinação
# o grau de superenrolamento, sua geração e remoção em moléculas
de DNA pode ser medido de diferentes maneiras.
TOPOISOMERASES
Topoisomerase do tipo I
Topo I: Monômero de 100 kDa (+ e –)
Mutação no Gene topA Inviável
Topo III: Monômero de 74 kDa (+)
Mutação no Gene topB Viável
Relaxamento de Superenrolamento
ATP
Ligação e
Desnaturação
Ligação
Fosfotirosina Restauração
do DNA
E. coli
TOPOISOMERASES
Topoisomerase do tipo II
Topo II Tetrâmero 400 kDa
DNA-Girase Sub A e B
Adiciona Supertorções –
Gene gyrA e gene gyrB
Topo IV Catenadas
Antibióticos e Antitumorais
E. coli
105 a 140 pb Central: 20 pb (AT)
Lateral: Rica em GC
5’-Tyr(122)A
TOPOISOMERASES
Métodos de aferição do grau de superenrolamento
• Eletroforese em gel de agarose
→ separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação
(funções diretas do superenrolamento)
→ o DNA migra em géis com diferentes velocidades (dependendo de seu
tamanho e forma)
# Moléculas de DNA de mesmo tamanho migram com diferentes
velocidades se estiverem na forma circular relaxada, linear ou
supertorcida.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Métodos de aferição do grau de superenrolamento
Gel Agarose
Velocidade de Sedimentação
Microscopia
Eletrônica
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ácidos Nucléicos maiores representantes do genótipo (DNA)
Proteínas maiores representantes do fenótipo
DNA Envolvido com todo metabolismo do organismo
Molécula da Hereditariedade: Seqüências de bases nitrogenadas
Informações
DNA Moléculas principais
RNA Moléculas intermediárias
Proteína Resultado final da informação