CULTIVO TRIDIMENSIONAL DE CÉLULAS‐TRONCO DE CARTILAGEM DE SEPTO‐NASAL HUMANO EM SISTEMA DE MICRO‐SEDIMENTO E EM

ARCABOUÇO DE POLI (L‐ÁCIDO LÁTICO) NANOESTRUTURADO PARA PROTOCOLOS DE ENGENHARIA DE TECIDOS

Belizario, J.V.S.1, Silva K.R.1,2, Pedrosa C.S. G.1, Dias, M. L.3, Gonçalves, R. P.3, Granjeiro, J.M1, Baptista L.S 1,4

1Diretoria de Programas, Instituto Nacional de Metrologia Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias (RJ), Brasil

2Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ)

3Instituto de Macromoléculas, Universidade Federal do Rio de Janeiro4Universidade Federal do Rio de Janeiro, Polo Xerém, Duque de Caxias (RJ)

E-mail: jv.belizario@gmail.com

Devido ao seu alto potencial condrogênico as células-tronco residentes na cartilagem humana de septo nasal aparecem como uma nova fonte de células-tronco adultas capazes de regeneração. Nos últimos anos os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis e bioabsorvíveis têm recebido grande atenção por diversas áreas, como o poli (L-ácido lático) (PLLA), um poliéster alifático que se apresenta como um material útil e atrativo como arcabouço de células para engenharia de tecidos. A população de células-tronco isoladas pelo nosso grupo de pesquisa possui grande capacidade de síntese dos principais constituintes da matriz de cartilagem hialina condrogênica em sistema de cultivo tridimensional de micro-sedimento, que será reforçada pela associação com material de nanofibras de PLLA, buscando propriedades mecânicas bem próximas a cartilagem nativa. Metodologia: As amostras de cartilagem do septo nasal foram obtidas a partir de doadores submetidos a procedimentos estéticos, conforme a aprovação do comitê de ética e pesquisa do (HUCFF - UFRJ). As nanofibras foram produzidas no Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano (IMA - UFRJ) por meio de eletrofiação, as soluções foram previamente preparadas em diferentes concentrações, utilizando clorofórmio como solvente. O equipamento de eletrofiação consistiu em uma fonte de alta tensão (Glassman High Voltage, modelo PS/FC 60p02.0-11), uma bomba de seringa (KD-100, KD-Scientific), e uma placa de alumínio aterrada como coletor. A eletrofiação foi realizada utilizando-se soluções de PLA 10 a 20% e tensões aplicadas de 15 a 30 kV. O fluxo foi mantido constante em 0,5ml/h e a distância de trabalho entre a ponta da agulha e o coletor de 15 cm. O filme produzido foi depositado em um coletor, e analisado por microscopia eletrônica de varredura (MagellanTM XHR SEM). Para visualização em microscópio confocal (Leica TCSSP5) o material foi incubado com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Os testes de citotoxidade serão realizados com base na ISO 10993-1. Resultados: A eletrofiação nos permitiu a fabricação de fibras contínuas com diâmetros da ordem micrométrica e nanométrica (200 nm a 10 um). Com as análises de microscopia conseguimos observar nanofibras porosas, e percebemos que quanto maior o tempo e a voltagem aplicada foram obtidos fibras com malhas mais finas, e bem embaraçadas semelhante a redes. A analise por fluorescência nos permitiu verificar que os poros não são ocos e a fibra não tem morfologia tubular. Conclusões: Os produtos e técnicas já desenvolvidas servirão como alicerces para a reconstrução in vitro de tecido de cartilagem de fácil aplicação e baixo custo.

PALAVRAS-CHAVES: Arcabouço de nanofibras, Células-tronco de cartilagem, Engenharia de tecido

1. INTRODUÇÃO

As lesões traumáticas atingem populações ainda jovens tendo um alto custo social, devido à recorrente geração de pessoas debilitadas permanentemente, impossibilitados de ter uma vida normal e produtiva. O tratamento exige terapias que possam preservar, melhorar e/ou restaurar as funções teciduais. A utilização de protocolos de terapias com células-tronco seria uma alternativa tem a perspectiva de oferecer um tratamento definitivo às lesões. O limitante para o sucesso da terapia celular é a escolha de uma fonte de células capazes de formação e/ou regeneração de cartilagem. Porém ainda existem muitos problemas relacionados à obtenção desse tecido de cartilagem autólogo à quantidade de células necessárias para o reparo da cartilagem. Assim há uma importância voltada para a criação de novas estratégias utilizando células-tronco adultas para o reparo ou substituição da cartilagem lesionada ou doente.

Peculiarmente, a população de células-tronco isoladas de septo-nasal pelo nosso grupo de pesquisa (AMARAL et al., 2012) é uma alternativa inovadora, já que ainda não consta descrita na literatura científica internacional o isolamento e manipulação de células-tronco de cartilagem que não necessitam da adição de fatores de crescimento in vitro.

1.1 Terapia celular para regeneração de cartilagem

O tecido cartilaginoso tem pouca ou nenhuma capacidade própria de reparo em resposta a traumas ou doenças.

Atividades tradicionais para o tratamento da cartilagem lesada incluem lavagem das juntas, debridamento de tecido, microfratura do osso subcondral, artroplastia de abrasão ou o transplante de enxertos de tecido osteocondral autólogos ou alogeneicos (HUNZIKER, 2002; AHMED & HINCKE, 2010). Embora esses ensaios mostrem implicações clínicas esperançosas, comumente não são aplicáveis para grandes defeitos na cartilagem ou até mesmo outras doenças degenerativas das juntas tais como osteoartrite. O transplante autólogo de condrócitos primários diferenciados da cartilagem articular mostrou bons resultados nos primeiros ensaios clínicos. Entretanto a randomização e o melhor controle da metodologia e resultados não mostram diferenças significativas quanto à eficácia desse procedimento comparado à técnica de microfratura do osso subcondral (AHMED & HINCKE, 2010). Mesmo com o grande número de tentativas iniciais para o tratamento de patologias associadas à degeneração de cartilagem terem se baseado no uso destas células diferenciadas, é importante notar que existem diversos problemas relacionados à coleta de amostras, e à quantidade de células necessárias para o reparo da cartilagem (MCNICKLE et al, 2009). Em vista disso, existe um grande interesse no desenvolvimento de novos procedimentos em terapia celular que atuem no reparo definitivo ou substituição da cartilagem lesionada.

1.2 Células-tronco de tecido adiposo e de cartilagem Um importante fator no desenvolvimento de novas abordagens na área de terapias celulares

(para reparo de cartilagem) é o domínio das técnicas de isolamento, expansão e diferenciação de células-tronco adultas para a linhagem condrogênica.

As células-tronco mesenquimais (MSCs, Mesenchymal Stem Cells) são obtidas e expandidas de diversos órgãos e tecidos sendo possível diferenciá-las in vitro para adipócitos, osteoblastos, condrócitos e mioblastos, quando em condições adequadas de cultivo. O tecido adiposo subcutâneo representa uma fonte atrativa de aquisição dessas células, pelo simples e repetitivo acesso a partir de

procedimentos de lipoaspiração (CASTEILLA et al, 2005), contudo não há um consenso na literatura científica relacionado à sua eficiência de diferenciação em células da linhagem condrogênica.

Nosso grupo de pesquisa foi responsável pelo isolamento e caracterização de células-tronco residentes no lipoaspirado humano (BAPTISTA et al, 2009) e na cartilagem de septo nasal humano (AMARAL et al, 2012). As células-tronco isoladas de septo nasal apresentam alto potencial condrogênico quando cultivadas em sistema de micro-sedimento, mesmo na ausência de fatores indutores no meio de cultivo. Estas células apresentam vantagens em relação aos condrócitos diferenciados isolados de cartilagem articular, uma vez que é possível a expansão ex vivo do número de células sem a perda de seu potencial condrogênico.

O sistema de cultivo de micro-sedimento proporciona ambientes celulares interativos similares aos encontrados dentro das culturas de micromassa (BOBICK et al, 2009). Células-tronco mesenquimais de medula óssea quando semeadas no sistema de micro-sedimento e na presença de fatores bioativos (tais como dexametasona e TGF-beta) passam pelo processo de condrogênese e formam um tecido morfologicamente e bioquimicamente definido como cartilagem. O sistema de micro-sedimento é uma ferramenta simples e de fácil controle das condições experimentais, o que a torna útil na dissecação de determinantes moleculares envolvidos na condrogênese (MURAGLIA et al, 2003).

A partir desse potencial intrínseco de diferenciação para via condrogênica, essa nova fonte de células-tronco pode ser ainda utilizada como padrão de referência para se atestar a formação de cartilagem in vitro a partir de cultivos de micro-sedimento de células-tronco de outras fontes mais acessíveis e viáveis para os protocolos de terapia celular, como é o caso do tecido adiposo subcutâneo.

1.3 Associação das células-tronco de cartilagem ao biomaterial nanoestruturado

A bioengenharia tecidual introduz uma dicotomia em potencial entre a necessidade de sofisticação e a facilidade de produção (Place et al., 2009). Suas estratégias compreendem além de metodologias de isolamento e de cultura de células, o desenvolvimento de polímeros e de arcabouços tridimensionais, aos quais as células serão associadas. O arcabouço deve ser um dispositivo estrutural que além de definir a geometria do tecido substituído, forneça sinais para a promoção da regeneração tecidual. O maior desafio dessa estratégia é recriar espacialmente e temporalmente os eventos de diferenciação celular e de organogênese. Para estimular a diferenciação celular, os arcabouços devem carrear informações complexas, codificadas nas suas estruturas físicas e químicas, que mimetizem o ambiente tecidual e a organização da matriz extracelular. Por outro lado, as considerações econômicas essenciais de transferência de tecnologia para o setor de saúde, ordenam que a complexidade deva ser mantida em um mínimo necessário para o alcance da regeneração tecidual.

A montagem da matriz da cartilagem confere a esse tecido seu conjunto único de propriedades biomecânicas que contribuem de maneira efetiva para a resistência a altos níveis de estresse e de deformação gerados pelo carregamento normal das juntas (Mow & Guo, 2002). A cartilagem articular possui mais de 60% de colágeno em seu peso seco, majoritariamente constituída de colágeno tipo II. As fibrilas de colágeno estão localizadas por toda a extensão da matriz extracelular entrelaçadas com proteoglicanos carregados negativamente, principalmente do tipo agrecana. As células-tronco de septo nasal humano cultivadas em sistema de cultivo tridimensional de micro-sedimento são capazes de sintetizar glicosaminoglicanos sulfatados e colágeno tipo II, principais constituintes da matriz de cartilagem hialina.

Para uma aplicação terapêutica, essa rede tridimensional de moléculas sintetizadas pelas células-tronco de cartilagem precisa ser reforçada por um arcabouço que auxilie na reprodução das propriedades mecânicas da cartilagem. Nos últimos anos os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis e bioabsorvíveis têm recebido grande atenção por diversas áreas. Entre eles, o poli (L-ácido lático)

(PLLA) nanoestruturado (Fujihara et al., 2010; Tanaka et al., 2010), um poliéster alifático que se apresenta como um material útil e atrativo como arcabouço de células para engenharia de tecidos.

O objetivo do presente estudo foi caracterizar a produção de matriz extracelular pelas células-tronco isoladas de septo nasal e de lipoaspirado humanos e de produzir e caracterizar um arcabouço nanofibrilar de PLLA que reforce a rede tridimensional de moléculas produzidas pelas células. Pretende-se gerar uma nova proposta para a engenharia de tecidos, através da associação das células-tronco de cartilagem ao material arcabouço nanoestruturado de PLLA. A hipótese é de que as células-tronco de cartilagem quando capturadas no arcabouço de PLLA, iniciem a síntese de glicosaminoglicanos sulfatados e de colágeno tipo II. A principal vantagem dessa associação será o aumento das propriedades mecânicas do tecido cartilaginoso formado in vitro.

2. MÉTODOS

2.1 Isolamento e expansão ex vivo das células-tronco de cartilagem e de tecido adiposo

Frações de cartilagem de septo nasal e de tecido adiposo subcutâneo abdominal humanos foram obtidas de doadores entre 18 e 50 anos submetidos a procedimentos de cirurgia estética, conforme aprovação do comitê de ética em pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (HUCFF – UFRJ).

Para o isolamento, essas amostras foram digeridas sob agitação constante orbital a 37º.C na presença de colagenase IA (Sigma Chemical Co) 1mg/mL. As células foram plaqueadas com o meio de cultura alpha-modified Eagle’s médium (α-MEM) enriquecido com 10% de soro fetal bovino e antibiótico, sendo mantidas em estufa com atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37º C. Após a cultura atingir 90% de confluência, as células foram dissociadas com solução de tripsina e replaqueadas posteriormente para expansão do número inicial de células, um processo caracterizado como uma passagem da cultura de células.

2.2 Cultivo tridimensional de micro-sedimento

Um a suspensão de 2 x 105 células foi centrifugada em tubos cônicos de polipropileno de capacidade de 15mL a 300g por 10 minutos. Os pellets formados foram mantidos em 5% CO2 a 37ºC com atmosfera úmida. O meio de cultivo utilizado era composto de alfa-MEM, 6,25µg/mL de insulina, 6,25µg/mL de transferrina, 1,25µg/mL de albumina bovina e 50µg/mL de ácido ascórbico. Os micro-sedimentos foram mantidos em cultivo por até 4 semanas de modo que o meio foi trocado a cada três ou quatro dias, mantendo a integridade do micro-sedimento.

2.3 Safranina O

Os micro-sedimentos foram fixadas em formol 10% tamponado e processadas para inclusão em parafina. Lâminas com cortes de 5μm de espessura provenientes deste material foram coradas com Safranina O 0,2% (Sigma Chemical Co) por 10 minutos, para visualização de glicosaminoglicanos sulfatados. Em seguida, as lâminas foram contracoradas com o marcador nuclear verde rápido 0,04% (Sigma Chemical Co) por 15 segundos, desidratadas, clarificadas em xilol e montadas em Entellan.

2.4 Imunofluorescência para Colágeno tipo II

Micro-sedimentos (n=3) foram fixados em paraformoldeído 4% subsequentemente banhadas em sacarose 15% e 30% por 24 horas em cada solução, para um posterior emblocamento em OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Zoeterwoude, NL). Cortes de 10m foram obtidos em criostato Leica C1850. Primeiramente foi realizada recuperação antigênica: os cortes foram tratados com Hialuronidase 0,1% (4800U/ml – Sigma) diluída em 0,025M NaCl e 0,05M de ácido acético, pH 5), por duas horas à temperatura ambiente, seguida de incubação com pepsina 0,4% (Sigma) diluída em HCl 10mM por 30 minutos a 37ºC. Os cortes foram então incubados com o anticorpo primário anti-colII (Santa Cruz Biotech) ou anti-colI (1:50, Santa Cruz Biotech) a 4ºC overnight na diluição 1:50. Em seguida, os cortes foram incubados com albumina de soro bovino 5%, soro de cabra 5% e triton X-100 0,5% em tampão fosfato por 1,5 hora para previnir ligação inespecífica de imunoglobulinas. Após este período, foi incubado o anticorpo secundário goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 (Cy5; Invitrogen Molecular Probes) diluido em tampão fosfato 1:100, por 1 hora. Os núcleos foram marcados com TO-PRO3 (1:500) e os cortes foram montados em Vectashield (Vector Lab). O exame das lâminas foi realizado no microscopio de fluorescência confocal (Leica TCS SP5).

2.5 Produção e Caracterização de PLLA

Este processo é considerado um método eficiente para produção de fibras ultrafinas, que consiste na aplicação de campos elétricos sobre uma solução polimérica ou um polímero fundido, no caso do nosso trabalho o PLLA. A tensão é induzida na superfície da solução gerando mutua repulsão de carga que causa uma força diretamente oposta à tensão superficial. Quando a intensidade do campo elétrico é aumentada, a superfície de hemisférica e jato da solução na ponta da agulha se alongam para formar uma gota cônica conhecida como cone de Taylor. Quando o campo elétrico atinge um valor crítico em que a força de repulsão elétrica supera a força de tensão superficial, um jato carregado de solução é ejetado da ponta do cone de Taylor. Uma vez que este jato é carregado, sua trajetória pode ser controlada por um campo elétrico. Durante o trajeto do jato, o solvente evapora, originando uma fibra de polímero carregado que se estabelece aleatoriamente em um coletor metálico formando uma rede. O material foi processado para análise por microscopia eletrônica de varredura e incubado com FITC para análise por microscopia confocal de fluorescência.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Produção de Glicosaminoglicanos

Após 4 semanas de cultivo em micro-sedimento, as células foram capazes de sintetizar matriz extracelular rica em glicosaminosglicanos sulfatados, evidenciados por safranina O (Fig.1). O grau de diferenciação pode ser observado de acordo com a morfologia celular e coloração da matriz. Quanto mais arrendodas as células e mais forte é a marcação da matriz, maior é o grau de diferenciação.

3.2 Produção de colágeno

Após 4 semanas de cultivo em micro-sedimento, as células foram capazes de sintetizar colágeno tipo II (Fig.2), típico de matriz extracelular de cartilagem.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) DO PLLA:

3.3 Síntese e caracterização do PLLA fabricado

O material produzido por eletrofiação, com tempo de deposição no coletor de 2 horas, apresentou superfície de nanofibras porosa (Fig.3) observadas ao microscópio eletronico de varredura, com comprimento de 100nm a 300mm e poros de 50 a 100mm de diâmetro. Com o aumento do potencial de fabricação do material de 10kV para 30kV, fibras mais finas foram produzidas.

Analisando o material marcado com FITC ao microscópio confocal de fluorescência, foi possível observar que os poros não são ocos e a fibra não possui morfologia tubular (Fig. 4).

Figura 2. Análise da produção de colágeno por células cultivadas em micro-sedimento: Produção de colágeno tipo II, evidenciado em verde. Campos representativos da produção de colágeno tipo II nos micro-sedimentos. (A) Aumento de 40x e (B) Aumento de 20x.

Figura 1. Análise da produção de glicosaminoglicanos por Safranina O após 4 semanas de cultivo em micro-sedimento. Células condrogênicas em cultivo tri-dimensional sintetizaram matriz extracelular rica em glicosaminosglicanos sulfatados, evidenciados por safranina O (A, B e C).

4. CONCLUSÃO

As células-tronco da cartilagem de septo nasal representam uma fonte versátil em relação às potenciais aplicações nas áreas tecnológicas e de medicina. Sua tecnologia de isolamento, expansão ex vivo e cultivo em três dimensões (associadas a arcabouço nanoestruturado ou em sistema de micro-sedimento), poderá ser utilizada em diversos protocolos de engenharia de tecidos.

Testes in vitro da nanotoxicidade do polímero de PLLA será avaliada pelo ensaio de MTT para determinação da viabilidade celular quando em contato com o material produzido. Em seguida, o presente projeto irá gerar através da associação das células‐tronco de cartilagem ao arcabouço polimérico nanoestruturado (PLLA), um tecido em laboratório que mimetize em curto prazo as

Figura 3. Microscopia eletrônica de transmissão do PLLA fabricado por eletrofiação: A) Micrografia do PLLA 15% concentrado com clorofórmio como solvente e tensão de 15kV em aumento de 40000x. B) Micrografia do PLLA 15% concentrado com clorofórmio como solvente e tensão de 15k em aumento de 4500x.

Figura 4. Análise estrutural do PLLA por fluorescência: (A) Marcação com isoticianato de fluresceína (FITC). (B) Contraste interferencial de fase.

características morfológicas e bioquímicas da cartilagem e estabelecer um novo processo baseado no cultivo de células-tronco de cartilagem em sistema de micro-sedimento, que reflita em uma melhor avaliação dos efeitos citotóxicos de fármacos utilizados no tratamento de diversas alterações e/ou disfunções do tecido cartilaginoso. São diversas as potencialidades para testes in vitro de avaliação de fármacos e para utilização em diversos campos da medicina, entre os quais podemos citar a Cirurgia Plástica e Reconstrutora, a Reconstrução de Cabeça e Pescoço, a Ortopedia e a Cirurgia Crânio-Maxilo- Facial, entre outros.

REFERÊNCIAS

Ahmed, T.A., Hincke, M.T., 2010. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng. Part. B Rev. 16 (3), 305-329.

Baptista LS, Amaral R.J.F.C, Carias R.B.V., Aniceto M, Claudio-da-Silva C, Borojevic R. An Alternative method to obtain mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirates samples. Cytotherapy. 2009;11: 706-15.

Bobick, B.E., Chen, F.H., Le, A.M., Tuan, R.S., 2009. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87(4), 351-371.

Casteilla L, Planat-Bénard V, Cousin B, Silvestre JS, Laharrague P, Charrière G, Carrière A, Pénicaud L. Plasticity of adipose tissue: a promising therapeutic avenue in the treatment of cardiovascular and blood diseases? Arch Mal Coeur Vaiss. 2005; 98: 922-6.

Do Amral, RJ, Pedrosa Cda S, Kochem MC, Silva KR, Aniceto M, Claudio-da-Silva C, Borojevic R, Baptista LS. Isolation of human nasoseptal chondrogenic cells: a promise for cartilage engineering. Stem Cell Res. 2012 Mar;8(2):292-9. Epub 2011 Oct 11.

Hunziker, E.B., 2002. Articular cartilage repair: Basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects. Osteoarthritis Cartilage 10 (6), 432–463.

McNickle, A.G., L'Heureux, D.R., Yanke, A.B., Cole, B.J., 2009. Outcomes of autologous chondrocyte implantation in a diverse patient population. Am. J. Sports Med. 37 (7), 1344 – 1350.

Muraglia, A., Corsi, A., Riminucci, M., Mastrogiacomo, M., Cancedda, R., Bianco, P., Quarto, R., 2003. Formation of a chondro-osseous rudiment in micromass cultures of human bone-marrow stromal cells. J Cell Sci. 116(Pt 14), 2949-2955.

CULTIVO TRIDIMENSIONAL DE CÉLULAS‐TRONCO DE CARTILAGEM DE SEPTO‐NASAL HUMANO EM SISTEMA DE MICRO‐SEDIMENTO E EM

ARCABOUÇO DE POLI (L‐ÁCIDO LÁTICO) NANOESTRUTURADO PARA PROTOCOLOS DE ENGENHARIA DE TECIDOS

Belizario, J.V.S.1, Silva K.R.1,2, Pedrosa C.S. G.1, Dias, M. L.3, Gonçalves, R. P.3, Granjeiro, J.M1, Baptista L.S 1,4

1Diretoria de Programas, Instituto Nacional de Metrologia Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias (RJ), Brasil

2Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ)

3Instituto de Macromoléculas, Universidade Federal do Rio de Janeiro4Universidade Federal do Rio de Janeiro, Polo Xerém, Duque de Caxias (RJ)

E-mail: jv.belizario@gmail.com

Introduction: Scaffolds represent the pivotal structure of the engineered tissue and establish an environment for neo-extracellular matrix synthesis. Nano-fibrous scaffolds which could potentially mimic the architecture of extracellular matrix (ECM) have been considered a good candidate matrix for cell delivery in tissue engineering applications. Cartilage tissue engineering has been widely investigated but is still hampered by cell differentiation and transplant integration issues within the constructs. Objectives: The population of human cartilage stem cells established by our group has a potential to synthesize extracellular matrix components typical of hyaline cartilage even in the absence of growth factors. To broaden the clinical application of cartilage regenerative medicine, we fabricated a nanofibrous scaffold consisting of poly (L-lactic acid) (PLLA) scaffold to reproduce the mechanical properties of cartilage, for future association with cartilage stem cells. Methodology: Cartilage fragments and three-dimensional pellet culture of cartilage stem cells were fixed and prepared for histological analysis. Sections were stained with Picrosirius and were then submitted to a polarized light assessment of fibrillar collagen content. Nanofibrous PLLA were produced at the Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano (IMA - UFRJ). PLLA (10 – 20%) was eletrospun with a potential of (15 – 30 kV) in a linear speed of 0,5ml/h. The distance between the tip of the needle and the fiber collection was set to 12 cm. The properties of PLLA nanofibrous membranes were characterized by confocal fluorescence and scanning electron microscopy (SEM). Quality control assays are in course to evaluate the citotoxicity potential of this material, based on the ISO 10993-5. Results: SEM showed that electrospinning generated PLLA fibers with micro and nanometric scales (100nm - 30mm), with a mesh-like organization. Besides that, increase in potential at the moment of fabrication (10kV to 30kV), lead to thinner fibers. Pores in nanofibers were also observed (50 – 100mm). Confocal fluorescence showed that these pores are not hollow, characterizing a non-tubular fiber. Conclusions: Nanostructured PLLA scaffolds were successfully produced. After performing citotoxicity assays, cartilage stem cells from human naso septum will be associated with nanofibrous PLLA to reproduce the hyaline cartilage microenvironment in vitro, through mimicry of three-dimensional organization of extracellular matrix and cell components.

 Keywords: Scafold of nanofibers; Stem cells cartilage, Tissue engineering