Enzimas: Funções, Nomenclatura e Propriedades · PDF fileSOLOMONS, G., FRYHLE,...
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FFI0772
ADRIANO D ANDRICOPULOADRIANO D ANDRICOPULOADRIANO D. ANDRICOPULOADRIANO D. ANDRICOPULORAFAEL V. C. GUIDORAFAEL V. C. GUIDO
Objetivos Gerais
� Enzimas: Funções, Nomenclatura e Propriedades� Fundamentos da Cinética Enzimática� Cinética Enzimática: Michaelis-Menten� Cinética Enzimática: Michaelis-Menten� Ensaios Cinéticos: Padronização e Validação� Parâmetros Cinéticos: vo, KM, Vmax, kcat, kcat/KM� Análise Gráfica: Lineweaver-Burk e Regresão Não-Linear� Inibição Enzimática� Tipos e Mecanismos de Inibição� Tipos e Mecanismos de Inibição� Determinação de IC50 e Ki� Exemplos de Inibidores Enzimáticos
BIBLIOGRAFIA
� Material didático das aulas� Bibliografia: livros de cinética enzimática, bioquímica,� Bibliografia: livros de cinética enzimática, bioquímica,
química orgânica e química medicinal
BIBLIOGRAFIA
� WILLIAMS, D.A., LEMKE, T.L. Foye's Priniples of Medicinal Chemistry, 5a edição,
BIBLIOGRAFIA
S, , , oye s p es o ed c a C e st y, 5a ed ção,Philadelphia, EUA: Lippincott Williams & Wilkins, 2002.
� PATRICK, G.L. An Introduction to Medicinal Chemistry, 2a edição, Nova Iorque, EUA: Oxford, 2001.
í ã� BARREIRO, E.J., FRAGA, C.A.M. Química Medicinal. As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos, Porto Alegre: Artmed, 2001.
� SOLOMONS, G., FRYHLE, C.B. Organic Chemistry, 7a edição, Nova Iorque, EUA: John Wiley & Sons 2000John Wiley & Sons, 2000.
� ALLINGER, N.L., CAVA, M.P., JONGH, D.C., C.R. JOHNSON, C.R., LEBEL, N.A., STEVENS, C.L. Química Orgânica, 2a edição, Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1978.
� SILVERMAN, R.B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, San Diego, S , e O ga c C e st y o ug es g a d ug ct o , Sa ego,EUA: Academic Press, 1992.
� LEHNINGER, A.L., Bioquímica, 2.ed., São Paulo, Editora Edgard Blücher, 1976.� STRYER, L., Bioquímica, 3ªed., Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 1992.� JENCKS, W. Catalysis in Chemistry and Enzymology –– Dover Pub.1987.� FERSHT, Enzyme Structure and Mechanism. San Francisco, W. H. Freeman and
Company, 1977.
ENZIMASENZIMASENZIMAS E INIBIDORES ENZIMÁTICOSENZIMAS E INIBIDORES ENZIMÁTICOS
Por Quê?
11
ENZIMAS COMOENZIMAS COMOALVOS BIOLÓGICOS
“Druggable Genome” “Genoma com Potencial de Fármaco”
ALVOS MOLECULARES
As proteínas são fundamentais para a vida
ÍENTIDADES QUÍMICAS
SildenafilSildenafil
O QUE HÁ EM COMUM ENTRE
SÃO INIBIDORES ENZIMÁTICOS
� o fármaco mais vendido
� o fármaco mais consumido
� o fármaco mais “popular”
22� o fármaco mais popular
da indústria farmacêutica em todos os tempos?da indústria farmacêutica em todos os tempos?
O M i V didO Mais Vendido
Atorvastatina
Ato astatinaAtorvastatina
O M i C idO Mais Consumido
Ácido Acetilsalicílico
Ácido AcetilsalicílicoÁcido Acetilsalicílico
Seletividade
ESTRUTURASESTRUTURASCOX-1 e COX-2
Valina(Cox-2)
Isoleucina(Cox-1)
O M i P lO Mais Popular
SildenafilaSildenafila
Sild filSildenafila
ESPAÇO QUÍMICO BIOLÓGICOESPAÇO QUÍMICO-BIOLÓGICO
ENZIMAS
Enzimas são consideradas por muitos laboratóriosEnzimas são consideradas por muitos laboratórios farmacêuticos os alvos moleculares mais atrativos para intervenção de doenças humanas através de moléculas pequenaspequenas
Isso se deve ao seu papel catalítico essencial em muitos fi i ló i f di d dprocessos fisiológicos que afetam diretamente estados de
desordens, disfunções ou doenças
ENZIMAS
Os fatores determinantes para a catálise enzimática se aplicam apropriadamente na inibição através de moléculas pequenas (candidatas a novos fármacos)
O estudo da inibição enzimática passa essencialmente pelo entendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvoentendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvo
ENZIMAS
Projetos de descoberta de fármacos, comumente, se beneficiam da avaliação in vitro de moléculas contra enzimas-alvo
Parâmetros como afinidade, potência e seletividade podem ser quantificados a partir de ensaios in vitroquantificados a partir de ensaios in vitro
ENZIMAS
A i â i d i bi ló i d l d lid d éA importância de ensaios biológicos de elevada qualidade é evidente neste processo
Fase farmacodinâmica X fase farmacocinética X Atividade Biológica X Efeito Terapêutico
ENZIMAS
Transformações metabólicas de xenobióticos, incluindo a maioria dos fármacos, são catalisadas por enzimas
Interações com enzimas metabólicas da família do citocromoInterações com enzimas metabólicas da família do citocromo P450 (CYP) – otimização de propriedades farmacocinéticas essenciais
ENZIMAS
D t f é i t t i d t hDesta forma, é importante que o pesquisador tenha um conhecimento sólido da atividade enzimática e das maneiras apropriadas de avaliar as interações entre enzimas e inibidores
ENZIMAS
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAReações Catalíticas
Esquema de reação química catalisada por uma enzima
CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAReações Catalíticas
As enzimas não alteram a energia livre de Gibbs (�G) das reações e exercem seu poder catalítico através da diminuição da energia de ativação dos sistemas (�G‡)
CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAProximidade e Orientação
ENZIMAENZIMA
� As moléculas devem se aproximar, estar na orientação correta, e alcançar o patamar mínimo de energia para iniciar a reação
� As enzimas catalisam reações, eliminando o caráter randômico dasreações
CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAProximidade e Orientação
ENZIMA
PRODUTO
ENZIMAENZIMAENZIMA
PROXIMIDADE: as enzimas se ligam aos substratos de forma que seus grupos reativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer Estereativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer. Este processo elimina a natureza randômica das colisões em soluções livres
ORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de formaORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de forma randômica, seus grupos reativos podem não estar necessariamente na orientação correta que permita a reação ocorrer
ENZIMASENZIMASAtividade Catalítica
COFATORES
ENZIMASENZIMASAtividade Catalítica
A atividade catalítica depende muitas vezes da presença de moléculas pequenas denominadas cofatores
Apoenzima + cofator = holoenzima
Sem Cofatorou Ligante
MoléculasOrgânicas
Coenzimas
GruposProstéticosProstéticos
CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações
A cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas porA cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas por enzimas
As reações enzimáticas diferem das outras reações químicas em vários aspectos
CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações
(i) As velocidades de reação são mais elevadas: uma reação catalisada por um enzima pode ser 106 a 1017 vezes mais rápida que uma reação não catalisada, e á d d d á d ã l dvárias ordens de grandeza mais rápida que uma reação catalisada por um
catalisador inorgânico.
(ii) Condições de reação mais suaves: as reações catalisadas por enzimas ocorrem em condições relativamente suaves – temperaturas baixas, pressão atmosférica, e pH próximos da neutralidadee pH próximos da neutralidade.
(iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações(iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações catalisadas.
CATÁLISE ENZIMÁTICACATÁLISE ENZIMÁTICAReações Catalíticas
Muitas reações nos sistemas biológicos não ocorreriam em proporções mensuráveis naç g p p çausência de enzimas. As enzimas aceleram as reações por fatores na ordem dos milhões
CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações
Catálise Química
Exemplo: hidrogenação com catalisador de carvão-paládio
CH3H3C+ H2
CH3CH3
H3CH3CPd/C
CH3H3C 2HH
CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações
Ação do catalisador de paládio sobre carvãoAção do catalisador de paládio sobre carvão
H H H H HH
CH3H3CCH3H3C
H H H H HH
Superfície de paládio Superfície de paládio Superfície de paládio
CH3H3CCH3
CH3
H3CH3C
HHCH3H3C
HH
Superfície de paládioSuperfície de paládio
CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações
Produtos
Catálise Enzimática
Produtos
Sítio ativo
Ligação do substrato nosítio ativo da enzimaSubstrato
Sítio ativo
ENZIMA E • S E • P E + PENZIMA E S E P E + P
CINÉTICACINÉTICAControle da velocidade de reações
O sítio ativo de uma enzima
Aminoácidos presentes no sítio ativo podem ter dois papéis principais:
Ligação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação doLigação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação do substrato ao sítio ativo
Catalítico (catalytic): o aminoácido está envolvido diretamente no mecanismo de reação
Lei de Beer-Lambert:
constanteabsorbância
(��fixo)
=
(para um ��fixo)
A� ���c.l distância percorridapelo feixe luminoso
concentraçãoda solução
patravés da amostra
da solução absorvente
A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendoconstantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso econstantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso edemais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica econcentração
Onde: � = absorbtividade molar ou coeficiente de extinção molar, uma constante característica para uma dada substância absorvente.Para o NADH a 340 nm, � = 6200 L mol-1 cm-1 (ou M-1 cm-1)
c = concentração de NADH em mol/Ll = comprimento da amostra em cm (usual 1 cm para cubetas padrões)
A intensidade I do feixe diminui a medida que passa pela amostra
Amostra emsolução
MonocromadorFonte de luz com comprimento de onda
1 cm Detectorcomprimento de ondaselecionável
IIo Io
ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICADefinições e Fundamentos
1,0 unidade de atividade enzimática (enzyme unit, U ou EU) é definidacomo a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6
M) de substrato por minuto (250C, condições padrões de ensaio) (U = μmolmin-1). A atividade se refere ao total de unidades de enzima em solução.
A atividade específica é o número de unidades de enzima por mg total dep p gproteína. A atividade específica é uma medida da pureza da enzima, eaumenta de acordo com a evolução do processo de purificação de umaenzima e torna-se máximo e constante quando a enzima estáenzima e torna se máximo e constante quando a enzima estácompletamente pura.
ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICADefinições e Fundamentos
d d á d d d / l d l ã� Atividade enzimática = unidades de enzima / volume de solução (e.g., units / mL)
� Ati id d E ífi id d d i / t t l d t í� Atividade Específica = unidades de enzima / mg total de proteína
� A atividade específica de uma solução de enzima depende diretamente da sua purezasua pureza
A atividade específica aumenta durante o processo de purificação alcançando umA atividade específica aumenta durante o processo de purificação, alcançando um máximo quando a enzima estiver totalmente pura e ativa
ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICAAtividade Enzimática versus Atividade Específica
Mesma atividade total da enzima (em vermelho)
Maior especificidade (em vermelho)
Atividade Específica = atividade enzimática / total de proteína. Ou seja, mols convertidos por unidade de tempo por massa de proteína.
A ti id d ífi t d t d ifi ã l d á i
Atividade enzimática = mols convertidos por unidade de tempo
A atividade específica aumenta durante o processo de purificação, alcançando seu máximo quando E = 100% pura e ativa
É a própria atividade catalítica da enzima, em geral expressa em unidades de velocidade, ou seja, massa transformada por unidade de tempo (μmol min-1)
ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICAAtividade Enzimática versus Atividade Específica
66 KDa
45 KDa
30 KDa
22 KDa
Proteína Pura
13 KDa
Sucessivas etapas de purificação geralmente diminuem o total de proteína. Uma proteína pode ser considerada pura quando etapas adicionais de purificação não p p p q p p çmelhoram a atividade específica e quando somente uma espécie de proteína pura pode ser detectada.
ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICADefinições
A atividade enzimática é uma função da quantidade de enzimaá(unidade prática, 1 EU = 1 μmol min-1) (SI, 1 katal = mol s-1)
Atividade Específica = atividade enzimática / massa total de enzima presente(unidade prática μmol mg-1 min-1 ou μmol μg-1 min-1)(unidade prática, μmol mg 1 min 1 ou μmol μg 1 min 1)
A atividade enzimática é uma medida da eficiência, usualmente constante para um enzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostraenzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostra impura da enzima deverá apresentar atividade específica menor, permitindo o cálculo da pureza
í í% pureza = 100% x atividade específica da amostra de enzima / atividade específica da enzima pura