Ensaios in Vitro - Biologia Molecular, Cultivo Celular, Scaffolds e Engenharia Tecidual

Ensaios in vitroBiologia Molecular, Cultivo Celular, Scaffolds e Engenharia Tecidual

Marcus Conde DDS, PhDBolsista de Ps-Doutorado (DOCFIX PPGO UFPel)

Email: [email protected]

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASPROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ODONTOLOGIA

DISCIPLINA METODOLOGIA CIENTFICA APLICADA 2015/1

Princpio de Cultivo Celular


Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas

animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado (Manual Fiocruz).

Ross Granville Harrison

O isolamento e cultivo de clulas de animais tornou-se uma tcnica laboratorial

rotineira na dcada de 1950 mas o conceito de manter linhagens de clulas vivas

separadas do seu tecido-fonte original foi descoberto no sculo XIX.


Frascos de plstico tem a superfcie tratada qumica

(Agentes oxidantes) ou fisicamente (UV) para que

apresentem cargas negativas favorveis ao processo de

ancoragem das clulas

Formao da Monocamada Celular


Clulas Aderentes x Clulas No-Aderentes


Reagentes para manuteno do cultivo celular


37C

95% Umidade

5% CO2

Reagentes para manuteno do cultivo celular

Meio de Cultivo

Soro Fetal Bovino

Tipos de cultivo


Isolar o Tecido

Desagregar

Semear Explants

Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de clulasoriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregao mecnicaou enzimtica;

As clulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagregao eaderirem garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daqueletecido. (Manual Fiocruz)

Cultivo Primrio - Vantagens

Clulas Primrias possuem as caractersticas do tecido de origem

Manuteno das caractersticas Fenotpicas e Genotpicas

Utilizadas na produo de vacinas

Cultivo Primrio - Desvantagens

Clulas Primrias possuem um tempo de vida curta

Apoptose Morte celular programada Botes apoptticos

Contaminao, Adeso, Agentes Exgenos - So menosresistentes

Cultivo Primrio - Desvantagens

Clulas Primrias possuem um tempo de vida curto

Apoptose Morte celular programada Botes apoptticos

Contaminao, Adeso, Agentes Exgenos - So menosresistentes

Clulas-Tronco Necessidade de Caracterizao

Passagens Celulares

Confluncia Celular e Inibio por Contato

Conde, Chisini e Schultze, 2015Ferrua e Nedel, 2013

Passagens Celulares

Tripsina Ao proteoltica nas junes clula-clula e clula substrato

EDTA Agente Quelante (Ca2 e Mg-)

Passagens Celulares

Sub-cultivo ou Repique Celular

No decorrer de sub-cultivos das culturas primrias, pode haver a seleo declones, capazes de sobreviver e se multiplicar por 50 ou mais passagens.

Esses clones do origem s chamadas linhagens celulares, tambmdenominadas de linhagens estabelecidas ou contnuas. (ManualFiocruz)

Devem ser congelados com poucas passagens para posteriorutilizao

Culturas Finitas

Culturas Contnuas Imortalizao Celular

Clulas de tecidos humanos raramente se tornam imortais

Modificaes genticas que permitem mutaes nos genesresponsveis pelo controle do ciclo celular

Podem ser obtidas diretamente de tecidos submetidos mutao Clulas Tumorais

Culturas Contnuas Imortalizao Celular

Contagem das clulas

As clulas foram contadas utilizando 0.4%

de azul de tripano (1:1) em cmara de

Neubauer (Gibco, Invitrogen, Grand Island,

NY, USA).

Ensaios de Citoxicidade

um ensaio in vitro;

um teste inicial e no pode ser extrapolado de imediato para sereshumanos;

Determina preliminarmente o comportamento do material;

o teste inicial mais comumente selecionado;

Ensaios de Citoxicidade - Vantagens

Controle das condies experimentais; temperatura, umidade,nutrientes

Baixo custo; quando comparado a estudos in vivo

Resultados rpidos; 7, 15, 30 dias

Ensaios de Citoxicidade - Desvantagens

O teste no consegue simular as condies in vivo;

Dificuldade em extrapolar os dados obtidos;

A falta de cautela pode confundir o pesquisador;

DNA Watson e Crick

A estrutura da molcula de DNA foi

descoberta conjuntamente pelo norte-

americano James Watson e pelobritnico Francis Crick em 7 deMaro de 1953,

Prmio Nobel de Fisiologia ouMedicina em 1962, juntamente com

Maurice Wilkins.

Dentro da gentica moderna, o gene uma sequncia de nucleotdeos do DNA que pode

ser transcrita em uma verso de RNA.

Segmento de DNA que leva produo de uma

cadeia polipeptdica e inclui sequncias que no

so traduzidas (ntrons) que se intercalam aos

segmentos codificadores individuais (xons),

que so traduzidos.

Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition


RNA polimerase a principal enzima do complexo

enzimtico responsvel pela transcrio do DNA

em RNA.

Reao em cadeia da polimerase (em ingls

Polymerase Chain Reaction - PCR) um

mtodo de amplificao (de criao de

mltiplas cpias) de DNA (cido

desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo

vivo

Consiste em reproduzir o processo de transcrio do RNA in vitro

Se baseia na aplicao de repetidos ciclos (marcados pela troca de temperatura)

Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)


O Isotiocianato de Guanidina utilizado como um desnaturante na purificao e extrao de

mRNA, cidos nuclicos e protenas, agindo como potente inibidor de RNAse, protegendo

os transcritos da degradao durante a extrao dos tecidos.

1l das amostra

Quantificao RNA total obtido

Quantificao do material gentico isolado

uma enzima que polimeriza molculas de DNA a partir de molculas de RNA,

exatamente o oposto do que geralmente ocorre nas clulas, nas quais produzido RNA a

partir de DNA.

MATERIAIS E MTODOS

RT-PCR DSPP, DMP1, MEPE e GAPDH (Genenormalizador)40 ng RNA utilizado na reao RT-PCR (One-step Superscript TMIII Platinum, Invitrogen)

- denaturao, 94 C por 45s;

- anelamento, 55 C por 45s GAPDH;

50 C por 45s DSPP, DMP1, MEPE

- extenso, 72 C por 60s, 35 ciclos;

O isolamento da transcriptase reversa permitiu a adaptao da tecnologia da PCR, que

destinada a amplificao a partir de moldes de DNA, para permitir a amplificao a partir

de moldes de RNA, chamada RT-PCR (transcrio reversa - PCR)

A tcnica de RT-PCR amplamente utilizada para verificar a expresso gnica.

MATERIAIS E MTODOS

Transcriptase Reversa Reao dePolimerase em Cadeia (RT-PCR)

-Os produtos do PCR foram separados emeletroforese (gel de agarose 1.5%).

Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose

As molculas iniciam o processo de migrao induzido pelo diferencial de corrente eltrica

Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose

Os produtos do PCR iro migrar pelo gel de forma diferente, de acordo com seu peso molecular

Molculas mais leves migram mais rpido pelo gel

Smith et al.,2008Ferracane e Smith, 2010

Reparo limitado da funo e esttica

dos tecidos afetados

CONTEXTO

ENGENHARIA TECIDUAL

ENGENHARIA TECIDUAL

Campo interdisciplinar que funde princpios e inovaes da Engenharia e das Cincias Biolgicas

Langer and Vacanti (1993)Nr (2006)Demarco (2011)

EngenhariaTecidual

Scaffolds

Clulas-Tronco

MolculasBioativas

ENGENHARIA TECIDUAL NA ODONTOLOGIA

Anormalidades congnitas necessitam reconstruo tecidual;

Maioria dos tecidos no regeneram aps as injrias;

Aqueles que regeneram espontaneamente (ex. pele, osso) podem no

regenerar se o defeito grande;

Transplantes so limitados pela escassez de doadores;

Implantes tem um histrico de sucesso, mas tambm uma srie de

problemas;

Vrias so as justificativas para a pesquisada engenharia tecidual na odontologia

Esmalte

Os tecidos dentais possuem pouca ou nenhumacapacidade regenerativa

Dentina

Polpa

Cemento

Lig. periodontal

No possui capacidade reparativa

No possui capacidade reparativa

Pode produzir dentina reacional e reparativa

Baixa capacidade reparativa/cementoblastos

Baixa capacidade reparativa/cementoblastos

Scaffold

O scaffold proporciona substrato em 3 dimensespara desenvolvimento das clulas, atuando comomatriz para a regenerao tecidual (DEMARCO et al., 2011)

A seleo do material e tcnica para a confecode um scaffold de extrema importncia nodesenvolvimento e terapias regenerativas dapolpa dental.

SCAFFOLDS

Polmeros Sintticos

PLLA

PGA

PLGA

Poly Caprolactona

Polmeros Naturais

Colgeno Tipo I

Quitosana

cido Hialurnico

Base de Clcio Materiais Alternativos

Hidrogis Anffilos

Seda

HA/TCP

Propriedades Fsicas dos Scaffolds

Tamanho dos Poros

Espessura das Fibras

Forma dos Poros

Para que possam mimetizar a MEC, os scaffolds

devem possuir um tamanho mdio de poros que

permitam o crescimento, migrao e

diferenciao celular

Modelo de estudo atual

Terceiros molares hgidos

Pacientes jovens

Corte com disco diamantado

Refrigerao (1X PBS)

Semeadura das clulas

- 5 x 104 (20l) - semeadas nas matrizes (placa

de cultura - 24 poos).

- 45 min - incubadora (37o C, 5% CO2).

- 500L de DMEM - adicionado a cada poo de

cultura, e as matrizes foram incubadas a 37o C.

- DMEM - trocado a cada 2 dias (7, 14, 21, 28

dias).

- Clulas de 4a a 6a passagem.

Proliferao celular (WST-1)

(5 x 104) semeadas nas matrizes e cultivadas durante

7, 14, 21 e 28 dias;

WST-1 adicionado ao meio na diluio 1:10 e

incubados durante 1 hora (37C em 5% CO2).

meio de cultura/WST-1 (100L) - transferidos para

placa de 96 poos de para leitura do nvel de

densidade tica (450nm)

one-way ANOVA seguido do teste de Tukey

(Sigmastat 2.0 software, SPSS, Chicago, IL, USA),

p

Modelo de estudo in vivo

Cordeiro MM, Dong Z, Kaneko T, Zhang Z, Miyazawa M, Shi S, etal. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliateddeciduous teeth. J Endod. 2008;34(8):962-9.

Sakai VT, Zhang Z, Dong Z, Neiva KG, Machado MA, Shi S, SantosCF, Nr JE. SHED Differentiate into Functional Odontoblasts andEndothelium. J Dent Res. 2010 Apr 15.

Casagrande L, Demarco FF, Zhang Z, Araujo FB, Shi S, Nr JE.Dentin-derived BMP-2 and odontoblast differentiation. J DentRes. 2010 Jun;89(6):603-8.

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