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BIOTECNOLOGIAENGENHARIAGENÉTICA
Manualdeapoioàs
AulasPráticasLaboratoriais
2019-2020
CarlosSinogas
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 2
ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA.................................................................................................................................................................3
Vestuárioecomportamentos...................................................................................................................................................................3 Riscosfísicos....................................................................................................................................................................................................3 Riscosquímicos..............................................................................................................................................................................................4 Riscosbiológicos............................................................................................................................................................................................5 Planeamento....................................................................................................................................................................................................5 Procedimentosgerais..................................................................................................................................................................................5
REGISTOSERELATÓRIOS....................................................................................................................................................................................6 TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMLABORATÓRIODEMICROBIOLOGIA........................................................................7
Meiosdecultura.............................................................................................................................................................................................7 Esterilização....................................................................................................................................................................................................8 TubosdeculturaePlacasdePetri.........................................................................................................................................................8 Instrumentosparatransferênciadeculturas...................................................................................................................................8 Câmarasdecultura.......................................................................................................................................................................................9 Frigorífico.........................................................................................................................................................................................................9
MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃO.......................................................................................................................................................................10 A.Esterilizaçãoporcalorhúmido.......................................................................................................................................................10 B.Esterilizaçãoporcalorseco..............................................................................................................................................................11 C.Esterilizaçãoporgases........................................................................................................................................................................11 D.Radiações..................................................................................................................................................................................................11 E.Filtraçãoestéril......................................................................................................................................................................................11 F.Desinfetanteseantissépticos...........................................................................................................................................................11
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS.....................................................................................................................................................................12 1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES......................................................................................................................................12 3. VERIFICAÇÃOECALIBRAÇÃODEPIPETAS..............................................................................................................................17 4. CULTURADEBACTÉRIARECOMBINANTE(E.coli)...............................................................................................................20 5. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-LiseAlcalina.............................................................................................................21 6. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-MiniPrep....................................................................................................................22 7. DIGESTÃOCOMENZIMASDERESTRIÇÃO................................................................................................................................23 8. ANÁLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE..................................................................................................................................24 9. PREPARAÇÃODEBACTÉRIASCOMPETENTES.......................................................................................................................25 10. TRANSFORMAÇÃO..........................................................................................................................................................................26 11. SELEÇÃODERECOMBINANTES...............................................................................................................................................27 12. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–InduçãodaExpressão.........................................................................28 13. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–PAGE...........................................................................................................29 14. CROMATOGRAFIADEEXCLUSÃOMOLECULAR................................................................................................................31 15. DOTBLOT(proteínas)...................................................................................................................................................................33
ANEXOS.....................................................................................................................................................................................................................34 EnzimasdeRestrição................................................................................................................................................................................34 TabelaPeriódica.........................................................................................................................................................................................35
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 3
PROCEDIMENTOSDESEGURANÇA(Adaptadode“BiotechnologyExplorations”,ASMPress)
EnsinareaprendernolaboratóriodeBiotecnologiaenvolvesempreumcertonívelderiscoparaooperadorecompanheiros.Novosequipamentos,reagentesemateriaisbiológicossãoparteintegrantedostrabalhosexperimentaisqueenvolvemácidosnucleicoseproteínas.Osestudantesestãoaaprendernovastécnicas,usandoreagentesemateriaisbiológicosenovosequipamentosqueapresentamalgumrisconocontextodasuautilizaçãolaboratorial.Nãosendopossívelfazeraexperimentaçãosemusarosequipamentos,osreagenteseomaterialbiológico,espera-sedosestudantesqueadotemasatitudesadequadasparaminimizaçãodosriscosassociados.
“Alertapermanente”,umconceitoimportadodospilotosdeavião,criaoenquadramentoparaamanutençãodasegurançaapropriadafaceaosriscosinerentes.Talcomoopilotodeveestaralertaparaasuaenvolvente,comconstantevigilânciaparaasuasegurançaeadosoutros,assimosestudantesdebiotecnologiadevemfazernolaboratório.Opilototemsempredesaber“ondeestá,paraondevaiecomoláchegar”.Traduzidoparaoambientelaboratorial,osestudantesdevemestarconcentradosnastarefasquedesenvolvem,compreenderoequipamento,osreagenteseosmateriaisbiológicosqueusam,devendoseguirospassosadequadosàconduçãodaexperiência.Aomesmotempocadaestudantedeveconheceroqueosseuscolegasfazemeosprotocolosqueseguem.
Nesteenquadramentosãoquatroasprincipaisquestõesdesegurançaquesecolocam:
¾ Vestuárioecomportamentos¾ Riscosfísicos¾ Riscosquímicos¾ RiscosBiológicos
VestuárioecomportamentosReduziraomínimoospertencespessoaiseoutrosmateriaisnabancadadetrabalho.Casacos,sacoseoutrospertencesdeverãoserdepositadosnobengaleiroàentradadolaboratório.
Usodebataobrigatório(Sempre),paraevitarsujaroucontaminararoupa.
Cabelo,quandocomprido,devidamenteapanhadoparaevitarasuaigniçãonachamaouacontaminaçãoquímicaoubiológica.
Sapatosfechadossãorecomendados,poisosabertosnãoprotegemdeeventuaisrespingosquepossamcair.
ProteçãodosolhosepelenuaaquandodautilizaçãodeUV
Luvasdescartáveissãoexigíveisquandosemanipulamcertosreagentesoumicrorganismos.
Édesaconselhadoousodejoias,emespecialanéisepulseirasqueimpedemoadequadousodasluvas.
Comer,beber,mascarpastilhaselásticas,aplicarcosméticoséproibidonolaboratório,paraqueeventuaiscontaminaçõesnãosejamdirigidasparazonasnãoprotegidas.Roerasunhas,lápis,canetasededosnabocaigualmenteproibido,pelasmesmasrazões.
Osestudantesdevemconhecerecompreenderbemotrabalhoafazer.Umaboaprogramaçãoémeiocaminhoparaumaboaexecução.Odocentedeveráserquestionadosemprequesurjamdúvidassobreosprocedimentosaseguir.
Asmãosdevemsersemprelavadasantesdeiniciarotrabalhoedepoisdeconcluídaaexperimentação,paraquecontaminantesnãosejamintroduzidosnemtransportadosparaforadolaboratório.
Asbancadasdetrabalhodevemsersemprelimpasesanitarizadascomálcoolantesdoiníciodotrabalhoedepoisdesteconcluído.Nãoseconheceoqueoutrosestudantespossamterdeixadonolaboratório,nemsepretendedeixarcontaminaçõesparaquemvieraseguir.
Riscosfísicos
UFogo
Identificaralocalizaçãodochuveiro,dosextintoresedosbaldesdeareia.
Identificaralocalizaçãodosquadroselétricosedatorneirageraldogás.
Aquecerprodutosaaltastemperaturaspodeprovocarqueimaduras.
Assoluçõesaquecidasnomicro-ondas,emespecialasagaroses,podemficarsobreaquecidaseentraremebuliçãoexplosivaapósagitação,provocandoqueimadurasgraves.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 4
Bicos de gás e lamparinas
Conhecercomosedeveacenderobicodegás.
Nuncaabandonarumbicooulamparinaacesa.Evitarmovimentá-losquandoacesos.
Flamejarosinstrumentoseostuboscomcuidadoparaevitarformaçãodeaerossóis.
Nãousarmaterialfacilmenteinflamávelnasproximidadesdachama(atençãoaoálcool).
Autoclave
Evitarexposiçãoaosvaporesdaautoclaveaquandodasuaabertura.Podemprovocarqueimaduras.
Usarluvasisolantespararemovermateriaisdaautoclave
Vidros partidos e material cortante
Osvidrospartidosdeverãoserremovidoscomauxíliodepinçaouluvas,nuncacomasmãosdesprotegidas.
Nãocolocarvidrospartidosnolixocomum.
Seapropriadorecolherparadescontaminação.
Usarlâminascortantescomauxíliodepinçasouluvas.
Equipamento elétrico e de eletroforese
Verificaroscaboselétricosdosequipamentosenuncausarcabosdefeituosos.
Evitarousodematerialelétricopróximodeágua.
Desligaroequipamento(botãoOFF)antesdeoligaràcorrente.Nuncaligaroudesligarumaparelhodeeletroforesesemantescortaracorrente(botãoOFF).
Nuncaabrirumatinadeeletroforesesemantesdesligaracorrenteelétrica.
Transiluminador de UV
AousarotransiluminadordeUV,nuncaoligueantesdebaixaratampaprotetora.
Desliguealuzantesdelevantaratampaeremoverogel.
RiscosquímicosPrestaratençãoàsnotasdosprotocolossobreosriscosassociadosaalgunsreagenteseseguirasinstruçõesdodocente.
Nuncapipetaràboca.Usarpipetadoresmecânicos.
Osrestosdeprodutosquímicosnãodevemserrejeitadosparaoesgoto.
Localizarochuveiroeosistemadelavagemdeolhos.
Aroupaatingidaporreagentesquímicosdeveráserdeimediatoremovidaeapeleemcontactoserabundantementelavada.
Nãoremoverprodutosquímicosdolaboratório.
Algunsreagentesquímicosausarnasexperiênciastêmassociadosriscosparticulares.Ousodereagentesemsoluçãooupré-misturadosreduzoníveldeexposiçãoeotempodasuautilização.Aquantidademanipuladaétambémimportante.Algunsreagentescomriscosespecíficosautilizarnassessõeslaboratoriais:
Acrilamidaebis-acrilamida–Mutagénico,carcinogénicoeneurotóxicoquandoinaladoouingerido.Usarapenassoluçõespreviamentepreparadasecomluvas.
Persulfatodeamónio–Oxidantepotente.Manterafastadodemateriaiscombustíveisedefontesdecalor.
Clorofórmio–Potentesolventeorgânico
DTT(Ditiotreitol)-Provocairritaçãonosolhos,pele,membranasdasmucosasetratorespiratório.
Etanol–Inflamável.
Brometodeetídio(soluções)–Mutagénico.Usarluvas.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 5
SDS(laurilsulfatodesódio)–Irritantedosolhosedapele.
Ácidosebasesconcentrados–Corrosivos.Provocamqueimadurasaocontacto.
RiscosbiológicosDesinfetaraáreadetrabalhoantesedepoisdemanipularmicrorganismos.
Usarlixíviadiluída(10%dehipocloritodesódio)paradescontaminaráreaseinstrumentoseventualmentecontaminados.
Evitarasmãosnabocaounosolhos.
Flamejarcuidadosamenteinstrumentosetubosparaevitaraformaçãodeaerossóis.
Nãoremovermicrorganismosdolaboratório.
TratartodasasamostrasdeDNA,plasmídeosebactériascomomaterialcontaminado.
Rejeitarasculturaseoutromaterialcontaminadonotabuleiroparaautoclavar.
Nãojuntarmaterialnãocontaminadonotabuleiroparaautoclavar.
Nãorejeitarnolixocomumoquequerquesejaquetenhacontactadobactérias.
Sebemqueosmicrorganismosausarnaexperimentação(E.coli)nãocoloquemriscosbiológicosparticularesdeveter-sesempreemmentequesãocriadascondiçõesdecrescimentodosmesmos.Orisconaturalmenteaumentacomaquantidadedebactériaseoutrosmicrorganismos,eventualmentepatogénicos,podemcontaminarasculturaseseramplificados.
PlaneamentoNãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.
ProcedimentosgeraisTodososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodosriscosassociadosàmanipulação,numaperspetivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréautilizaçãodobomsensodooperadornostrabalhosarealizar.
Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 6
REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraçãodorelatóriofinalouparaaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosduranteaexecuçãodotrabalhoexperimentalfacilitarãoaaprendizagemeainterpretaçãodosresultadosobtidos,emespecialquandoestessãoinesperados.
Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjetivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresuscetíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintessecções:
Título Identificadordoconteúdodorelatório
Resumo Pequenotextodequeconstemosobjetivosalmejadoseasconclusõesobtidas
Objetivo Razãodeserdotrabalhorealizado
Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciaempreendida
Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho
Materialereagentes Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado
Protocoloexperimental
Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito
Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos
Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos
Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjetivo,decorrentedosresultadosobtidos
Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas
Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho
Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdassecçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo
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TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMLABORATÓRIODEMICROBIOLOGIAAodesenvolvimentodostrabalhosemBiotecnologiaéfundamentalrecorreràstécnicasprópriasdaMicrobiologiaparaamanipulação,crescimentoemanutençãodebactériaseoutroshospedeirosdeDNAsrecombinantes.
Osmicrorganismossãoubíquos.Podemencontrar-senosolo,noar,naágua,nacomida,nosesgotosenassuperfíciescorporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladoànossavolta,onossoambienteestárepletodemicrorganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismoénecessáriosepararestaspopulaçõesmistas,deformaamanipularnolaboratórioaschamadasculturaspuras,culturasdeumaúnicaestirpe.Apesardofornecimentodeestirpesbacterianaspurasparaarealizaçãodostrabalhos,asculturaspodemvirasercontaminadas.
Paraisolareestudarosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealgunsequipamentoslaboratoriaisbásicosedaaplicaçãodetécnicasespecíficasusandomateriaisparticulares.Naspráticasqueaplicaremosnodecursodestadisciplina,ter-se-áderecorreràstécnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacomutilizaçãodosequipamentosemateriaisespecíficosqueseindicam:
Equipamento Autoclaveedispositivosdefiltraçãoestéril
Ansaseagulhas.PipetasemicropipetasBanhosdeáguaeestufasFrigoríficoFluxolaminar(conveniente)
Materiais ÁguadestiladadequalidadeMeiosdecultura(bactérias)LíquidoSemissólidoSólidoTubosparaculturaPlacasdePetri
MeiosdeculturaAsobrevivênciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrienteseconvenientescondiçõesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenasnecessitamdesubstânciasolúveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaçãoenzimáticadeoutrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluçãocontendoestesnutrientesédesignadacomomeiodecultura.Emgeral,osmeiosdeculturasãolíquidos,semissólidosousólidos.Ummeiolíquidosemagentesolidificanteédesignadoporcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,originaummeiosólidoousemissólido.Oagaréumextratodealgasmarinhas,umcarbohidratocomplexoquecontemmaioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarémuitoadequadocomoagentesolidificanteporqueseliquefazacercade100ºCesolidificaa40ºC.Devidoaestaspropriedades,osmicrorganismos,emespecialospatogénicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37ºCsemreceiosdeliquefaçãodomeiosolidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraçãodeagardaordemdos1,5a1,8%.Umaconcentraçãoinferiora1%resultanummeiosemissólido.
Paraalémdasnecessidadesnutritivas,váriosoutrosfatoresambientaisprecisamdesercontroladosparaosucessodaculturadosmicrorganismos,comosejamopH,atemperatura,oambientegasosoouapressãoosmótica.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 8
EsterilizaçãoAesterilizaçãoéumdospontos-chaveparaosucessodotrabalhoemmicrobiologia.Paratrabalharemcondiçõesdeesterilidadeéfundamentalousodematerialestérileaaplicaçãodetécnicasadequadas.Aesterilizaçãoéprocessopeloqualsãoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistécnicasparaaesterilizaçãoderotinaemlaboratóriosãoasseguintes:
Calor Calorseco(arquente)
160ºCa180ºCdurante1/2horaa3horasMaterialdevidroemvazioCalorhúmido(vapor)Circulaçãodevapora100ºC.Esterilizaçãointermitente(soluçõestermolábeis)Autoclave.Vaporsobpressão,temperaturasacimados100ºC(meiosdecultura,soluções
termo-estáveis)Filtração Membranasfiltrantescomporosde0,05µma0.8µm
RemoçãodemicrorganismosdesoluçõestermolábeisporfiltraçãoProdutosquímicos Óxidodeetileno
MaterialdeplásticoBeta-propiolactonaTecidosvivos,materiaisbiológicos
TubosdeculturaePlacasdePetriTubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplásticoconstituemosprincipaissuportesparaodesenvolvimentodasculturasdemicrorganismos.Ummeionutritivoadequadonaformadecaldonutritivooudeagaréusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetriapenasseusameiosólido.Umambienteestérilépreservadonostubosdeculturaporváriostiposdetampas.Historicamenteéorolhãodealgodão,desenvolvidoporSchroederevonDuschnoséculodezanove.Hojeemdia,amaiorpartedoslaboratóriosusamtampasemformademanga,emmetalouplásticoresistenteaocalor.Avantagemdestastampasresidenofactodenãoexigiremtantotrabalhonasuapreparaçãoeseremmaisfacilmenteremovidasereintroduzidasnostubosduranteamanipulação.Mantem-se,contudo,apráticadeprotegerumadasextremidadesdaspipetascomrolhãodealgodãocardado(hidrófobo).
AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfícieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.Sãocompostasporumabasecircularinferior,ondeécolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoeligeiramentemaiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetrideváriasdimensõesparadiferentesexigênciaslaboratoriais.Narotinasãousadasplacasdecercade10cmdediâmetro.Omeionutritivoestéril,contendoagar,numvolumede15a20mLévertidonasplacasquandoaindaquenteapósfusãodoagaredeixadoarrefeceratemperaturainferiora40ºC.Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassãoincubadasemposiçãoinvertidaparaevitarqueasgotasdecondensação,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,tombemsobreasuperfíciedoagar.
InstrumentosparatransferênciadeculturasExisteanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasdearmazenamentoamanutençãoparaculturasdeanálise.Éoprocessodesubculturaquetemdenecessariamenteserefetuadocomtécnicaestérilparaevitarpotenciaiscontaminaçõesdassubculturas.
Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprópriosparaamanipulação,sãoinstrumentosmuitoduráveisdefácilutilização.Sãofacilmenteesterilizáveisnomomentodasuautilizaçãoporincineraçãoàchama,numaposiçãoquaseverticalatéometalficaraorubro.Importarádepoisdeixararrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismosambientaisviáveiséinferior.Depoisdearrefecidos,paranãoinativarosmicrorganismosatransferir,podemserusadaspara"picar"umaculturasólidaoulíquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeveráserdeimediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada.
Aspipetassãooutrosdosinstrumentosdetransferênciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Sãocalibradasepermitematransferênciadequantidadesdeculturaslíquidaspreestabelecidas.Sãodevidroouplástico,comumaextremidadeafiladaeoutraparaaaspiraçãoeexpulsãodolíquidoquecontenham.Podemseresterilizadasporcalorsecoouhúmido,conformeotipodematerialdequesãoconstituídas.Apesardetradicionalmentesereminstrumentospara"pipetaràboca"éproibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliaresmecânicosdisponíveisparaoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidadelargadapipeta.
AspipetasPasteur,tubosdevidronãograduadoscomumadasextremidadesafiladassãotambémdeusomuitofrequenteemtrabalhosdemicrobiologia,tambémpelasuafacilidadedeesterilizaçãoextemporânea.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 9
CâmarasdeculturaDascondiçõesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevanteséasuatemperaturaótimadecrescimento.Asestufassãousadasparaamanutençãodatemperaturaótimadosmicrorganismosemcrescimentoduranteoperíododecultura.Sãocâmarasemqueatemperaturaambienteinteriorécontroladaportermóstato,paraqueamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamemgeralumsistemadecirculaçãodearaquecidoe,paraevitaradesidrataçãodosmeiosemincubação,deverãocontertambémumafontedevapordeágua(umrecipientecomáguanoseuinterior,quandonãovenhampreparadasparaoefeitodeorigem).
Osbanhosdeágua(banho-maria)comáguaatemperaturacontroladaportermóstatoconstituemoutrodosinstrumentosfrequentementeempreguesparaacriaçãodascondiçõesdetemperaturaótimadecrescimentodosmicrorganismos.Oíntimocontactodaáguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemosmicrorganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrápidaeeficaztransferênciadocalor.Alémdisso,osbanhoscomagitaçãofacilitamtambémoarejamentodasculturas,degrandeimportânciaparaocrescimentodosmicrorganismosaeróbios.Adesvantagemdobanhodeáguaresidenofactodesópoderserusadoparaasculturasemmeiolíquido,aocontráriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolíquidocomoemmeiosólido.
FrigoríficoOfrigoríficoéoutradaspeçasfundamentaisemlaboratóriodemicrobiologia.Oambientedebaixatemperaturaquedisponibilizaédamaiorrelevânciaparaamanutençãoearmazenamentodasculturascelularesemfasedenãocrescimentoentreosperíodosdesubculturaeparaaconservaçãodosmeiosesterilizadoseoutrosreagentes.Tambémassoluçõesecompostostermolábeistêmperíodosdeconservaçãomaisalargadosquandoarmazenadosabaixastemperaturas.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 10
MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃOEsterilizaçãoéumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremàsuperfícieounointeriordeummaterial,podendoseralcançadopelaexposiçãodomaterialaagentesletaisfísicosouquímicosou,nocasodoslíquidos,pelaseparaçãomecânicadosorganismosatravésdefiltrações.Existemmuitasformasdeesterilizarmateriaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomodadisponibilidadedemeiosdetrabalho.
Anoçãodeesterilidade(estéril=infecundo)encontra-sefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia(ausênciadesepsis=putrefação)eadedesinfeção(livrardainfeção).Estessignificadosliteraiscorrespondem,defacto,àsnoçõestécnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimo-nosaesterilizaçãoquandosepretendeimpedirapropagaçãodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambientedesprovidodemicrorganismoseadesinfeçãoquandoseaplicamtécnicasdestinadasaeliminarmicrorganismospotencialmentepatogénicosparaooperador.
Destasnoções,aaprofundarnoexercíciodaexperimentaçãoquesedesenvolveránadisciplina,importaconsideraremparticularastécnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaçãodemicrorganismosviáveis:aesterilização.
A.EsterilizaçãoporcalorhúmidoOaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaéaautoclave,comumprincípiodefuncionamentoidênticoàspanelasdepressãodomésticas.Asautoclavesdelaboratóriooperamnormalmentesobumapressãode1,02Baraumatemperaturade121ºC.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem15-30minutos,sendoavariaçãodotempodeesterilizaçãodevidaàrelaçãosuperfície/volumedosmateriaisaseremesterilizados.
Temperatura
Osendósporosdasbactériassãoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiçãopodeserconseguidaseforaplicadovaporsobrepressão.Umatemperaturade121ºCofereceumaboamargemdesegurançaseformantidaduranteumespaçodetempoapropriado.
Humidade
Acoagulaçãodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehámedidaqueestaéremovidaatemperaturanecessáriaparahavercoagulaçãoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecidoficarámais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposiçãoparaaesterilização,quenasituaçãoextremadeesterilizaçãoemcalorsecoseráde170ºCduranteumahora.Emconclusão,vaporexcessivamentequenteperdealgumadasuaeficáciacomoagenteletalparaalémdepoderserlesivoparaosmateriaisaseremtratados.
Pressão
Apressão,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisónãoexercequalquerefeitonaesterilização,sendoútilapenasparaelevaratemperaturadovaporacimados100°C.
Tempo
Otempoénecessárioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaseremesterilizados.Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaçãosãoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosnãosãotodosinativadosdeumavez.Avelocidadedemorteéumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidadedetempodeexposiçãoaoagenteletal,umaproporçãoqueéconstanteparaumadadapopulação.Normalmentedemora11a12minutosa121°C(calorhúmido)paraeliminarosendósporosdasbactériastermofílicas,osagentesmaisresistentesnasmanipulaçõesdodia-a-dia.
Purga
Oarrelativamentefrionacâmaradeesterilizaçãoémuitomaispesadoqueovaporàtemperaturadeesterilização.Senãoforpermitidaasaídadoarcria-seumaestratificaçãonaautoclavequeconduzaumafaltadeuniformizaçãodastemperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsãolentosamisturar-se,asdiferençasdetemperaturaentrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooarporvapordeágua(purga).
Natureza do carregamento
Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremmaistempodeesterilização,sendopreferívelesterilizarpequenosvolumesdecadavez(émaiseficazesterilizar5balõesdeumlitroqueumbalãodecincolitros).Osfrascosdevemsertapadoscomalgodãooupapel.Sefornecessáriousartampasroscadas,estasdevemirpoucoapertadas
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 11
paraaautoclavedemodoapermitiremasaídadeareentradadevaporeanãocriaçãodegrandesdiferenciaisdepressãoquepodemlevaraorebentamentodosfrascosnaautoclave.
B.EsterilizaçãoporcalorsecoOcalorsecoéusadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaissólidostermo-estáveisealgunscomponentesdemeiosoualimentosqueficariamimprópriosseexpostosaovapor.Trata-setambémdeumdosmétodosdeesterilizaçãomaisusadosedemuitofácilaplicação.Oequipamentoindispensáveléapenasumaestufadealtatemperatura(160-200ºC).Paraalémdeterdesertidaemcontaaresistênciatérmicadosmateriaisaesterilizarporestatécnica,aoutraprecauçãoaconsiderarprende-secomaminimizaçãodapossibilidadedecontaminaressesmateriaisdepoisdaesterilização.
C.EsterilizaçãoporgasesOincrementodousodematerialdeplásticodeutilizaçãoúnicacomoseringas,caixasdePetri,tubosdecultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaçãoqueusagasestóxicosparaaeliminaçãodosmicrorganismosdemateriaistermosensíveis.Aaplicaçãodestatécnicarequerautilizaçãodeequipamentosprópriosqueforcemacirculaçãodogástóxicoatravésdetodasassuperfíciesdosmateriais,oqueatornadedifícilutilizaçãoemlaboratóriosdetiponãoindustrial.
Oóxidodeetilenoéogásusadocommaiorfrequêncianestetipodeesterilizações.Estegás,aocontráriodemuitosprodutosquímicostóxicos,époucocorrosivoenãoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendofacilmenteremovidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperíodosdeexposiçãoparaseobteraesterilização(váriashoras),areatividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposdeplásticoseanecessidadedeequipamentosprópriosedisponibilidadedogás.
D.RadiaçõesAlgunsprocessoscomerciaisusamasradiaçõesparaaesterilizaçãoafriodecertosmateriaiscomoprodutosfarmacêuticos,porexemplo.Radiaçõesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgamaproduzidosapartirdecobalto-60oucésio-139ederaioscatódicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresdeeletrõessãoasmaisutilizadas.
Airradiaçãocomluzultravioletanãoéumaformamuitosatisfatóriadeesterilizaçãodadaasuafracacapacidadedepenetraçãonosmateriaiseprodutosaesterilizar.É,contudo,deutilizaçãofrequentenadiminuiçãodoníveldecontaminaçãodeespaçosconfinados,comosalasestéreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteúteistambémparaareduçãodainfecciosidadeviraldevidoàsalteraçõesinduzidasnomaterialgenéticodaspartículasviraisexpostas.
E.FiltraçãoestérilOprincipalmétodoparaaesterilizaçãodelíquidosquecontenhamcomponentestermosensíveiscomovitaminas,proteínaseantibióticos,porexemplo,éafiltração.Tradicionalmenteosmicrobiologistasesterilizavamestesprodutosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomáceasefibrasdeasbesto,previamenteesterilizadosemautoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstituídosporfiltrosdeacetatodeceluloseoupolicarbonatosnosquaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraçõescomelevadosgrausdeprecisão.Existematualmentedisponíveisnomercadofiltrosdeváriosporosecapacidadesfiltrantes.Osmaisfrequentese,porisso,maisacessíveissãofiltrosdeporosde0,45µmou0,2µmdediâmetro,queretêmosmicrorganismospresentesnassoluções.
Paraesterilizarumasoluçãoporfiltração,nãohámaisquepassaressasoluçãoatravésdeumdestesfiltrospelaaplicaçãodeumapressãopositivanolíquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefaçãodoarnocontentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatécnicarequerarecolhadofiltradoemcondiçõesdeassepsiaparaimpediracontaminaçãodolíquidoesterilizado.
Salvorarasexceções,afiltraçãoestérilnãoretémaspartículasvirais.Nãopodendoserconsideradocomométodode"esterilizaçãodevírus".Afiltraçãoestérilémesmoumatécnicafrequentementeusadaemvirologiaparaapurificaçãodesuspensõesviraisporeliminaçãodebactériaspotencialmentecontaminantes.
F.DesinfetanteseantissépticosMúltiplosreagentesquímicossãodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaçãodemicrorganismos.Osprodutosusadosna"limpeza"deutensíliosdiversos,frequentementedemasiadotóxicosparaserusadosdiretamentenoHomem,sãochamadosdedesinfetantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmoobjetivodeeliminareventuaismicrorganismos,sãoantissépticos.Particularmenteeficazemuitoútilnolaboratório,paraeliminaçãodevírusemicrorganismoséasoluçãodehipocloritodesódio(lixívia)comquesetratamosmateriaisdelaboratórioapósexposiçãoaagentesinfeciosos.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 12
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS
1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES
Introdução
Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadedosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetaseparaumraciocíniooperacionaltantodasdiluiçõesexpressascomopotênciasde10comonaformadeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.
Material e reagentes
¾ Soluçãoconcentradadeazul-de-metileno¾ Sorofisiológico(salino)¾ Micropipetasdiversas¾ Tubosdeensaio¾ Espectrofotómetro
Procedimento (por grupo)
Diluições decimais
1. Marquemicrotubos(de1a10)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Solvente(mL) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Corante(μL) 1500 150
Soluçãoprecedente(μL) 150 150 150 150 150 150 150
Diluição(10P
xP)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,usandoa
mesmacuvete).6. Elaboreumgráficocomosresultadosobtidos
Diluições centesimais
7. Marque8microtubos(de1a8)8. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Solvente(mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Corante(μL) 5000 50
Soluçãoprecedente(μL) 50 50 50 50 50 -
Diluição(10P
xP)
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 13
9. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.10. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos11. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,usandoa
mesmacuvete).12. Elaboreumgráficocomosresultadosobtidos
Diluições de três em três
1. Marque12tubosdeensaio(de1a12)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Solvente(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
Corante(mL) 5,0 2,5
Soluçãoprecedente(mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Diluição(10P
xP)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõespreparadasa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,
usandoamesmacuvete).6. Elaboreumgráficocomosresultadosobtidos.
TPC
Diluições milesimais
Estabeleçaoprotocoloparaarealizaçãodeumexercícioidênticoaosanteriores,mascomdiluiçõesmilesimais.
Diluição única
Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenocomoprocederiaparaapreparaçãode5mLdecadaumadasseguintesdiluições:¾ Diluiçãode5x10P
2P
¾ Diluiçãode5x10P
-2P
Preparação de soluções
Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:
¾ NaOH0,1N¾ SOB4BHB2B0,1N¾ NaCl0,1M¾ NaCl100mM¾ Glicerol10%(fórmulaCB3BHB8BOB3B)¾ Glucose10%(fórmulaCB6BHB12BOB6B)¾ Etanol70%(fórmulaCB2BHB6BOB2B)
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 14
Registo de observações e Resultados
PIPETAGENS E DILUIÇÕES
Operador: Data: ____/____/____
Diluiçõesdecimais
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1
2
3
4
5
6
7
8
Diluiçõescentesimais
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1
2
3
4
5
6
7
8
Diluiçõesdetrêsemtrês
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1
2
3
4
5
6
7
8
9
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Gráficos
Notas:
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 16
SOLUÇÕES
Operador: Data: ____/____/____
Componentes Peso/volume
Diluição
5X10P
2P
Diluição
5X10P
-2P
NaOH0,1N(100mL)
SOB4BHB2B0,1N(100mL)
NaCl0,1M(100mL)
NaCl100mM(100mL)
Glicerol10%(100mL)
Glucose10%(100mL)
Etanol70%(100mL)
Notas:
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 17
3. VERIFICAÇÃOECALIBRAÇÃODEPIPETAS
Introdução
Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Autilizaçãofrequentedaspipetasdisponíveisnolaboratórioporestudantessemexperiêncialevaautilizaçõesincorretasdonderesultaquealgunsdosvolumesindicadosnosvisoresnãocoincidamcomasquantidadesmedidas.Nestecontextoéimportanteconheceraformadecalibraraspipetasausar.
Material e reagentes
¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos,coposdeboémia¾ Balançadeprecisão
Procedimento (por grupo)
Ajustedevolume(5µL)
1. Utilizeumapipetade20µL2. Ajusteoindicadordevolumeaos5µL3. Pipete,nabalança,paratubocalibrado5µL4. Observeopesoindicado5. Sesuperioraos5mg,reduzaovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.6. Seinferioraos5mg,aumenteovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.7. Quandoaquantidadedeáguadestiladapesadaforde5mg,anoteaindicaçãodevolumeque,napipeta,
correspondeaos5µL.
Ajustedevolume(50µL)
1. Utilizeumapipetade200µL2. Repitaospassosdoprocedimentoanterior(de1.a7.)paraamassade50mg(correspondentea50µL)
Ajustedevolume(500µL)
1. Utilizeumapipetade1000µL2. Repitaospassosdoprocedimentoinicial(de1.a7.)paraamassade500mg(correspondentea500µL)
Calibraçãodepipeta(200µL)
1. Meça,nabalança,umvolumede10µLparacopotarado.Anoteopeso2. Repitamaisduasvezesestadeterminação3. Repitaospontos1e2paraosvolumesde20µL;50µL;100µL;150µLe200µL4. Façamédiasdecadaconjuntodetrêspesagenshomólogas5. Desenheográficodecalibraçãodapipeta,fazendocorresponderosvolumesindicadosnovisorcomospesos
avaliados.
NB
Osprocedimentosparaoutrosvolumesououtraspipetassãoidênticos.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 18
REGISTO DE OBSERVAÇÕES E RESULTADOS
CALIBRAÇÃODEPIPETAS
Operador: Data: ____/____/____
Calibraçãodepipeta20µL
Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações
1µL
2µL
5µL
10µL
15µL
20µL
Calibraçãodepipeta200µL
Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações
10µL
20µL
50µL
100µL
150µL
200µL
Calibraçãodepipeta1000 µL
Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações
50µL
100µL
200µL
500µL
750µL
1000µL
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Calibraçãodepipeta
Notas:
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 20
4. CULTURADEBACTÉRIARECOMBINANTE(E.COLI)
Material e Reagentes
¾ Bactériarecombinante
¾ LB10X:¾ Bacto-triptona 100g¾ Extratodelevedura 50g¾ NaCl 100g¾ H2Odestiladaaté 1000mL
pH7,5.¾ Autoclavar.Conservarestérila4°C.¾ Diluirextemporâneaeesterilmentea1:10comáguaestéril.¾ Ampicilina1000X
50mg/mLemágua.¾ Esterilizarporfiltração,conservara–20°C
Protocolo Experimental
1. Preparar50mLdemeioLB1Xcontendoampicilina(50μg/mL).2. Inocularcombactériacontendooplasmídeoapreparar.3. Incubar37°Cduranteumanoitesobagitação.4. Registarocrescimentodabactéria
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 21
5. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-LISEALCALINA
Material e Reagentes
¾ Bactériarecombinante
¾ LB1Xcomampicilina.¾ Lisozima(pó)¾ Isopropanol¾ 5MNaCl¾ Etanolpuroe70%¾ TEpH8,0
10mMTris-HClpH8,01mMEDTA)
¾ Pronase20mg/mLemáguaAuto-digeridadurante2horasa37°C.Conservara–20ºC
¾ PronaseMix:Pronase 50µL10%SDS 86µlH2O 860µl
¾ RNAseA10mg/mLem:10mMTris-HClpH7,515mMNaClIncubadapor15minutosa100°Cearrefecimentolento.Conservara–20ºC
¾ RNAsemix:RNAseA 40µlTEpH8,0 10mL
¾ SoluçãoI:25mMTris-HClpH8,050mMGlucose10mMEDTA
¾ SoluçãoII:0,2NNaOH1%SDS
¾ SoluçãoIII:5MKOAc 60mLAc.acéticoglacial 11,5mLH2Odestilada 28,5mLpH4,8
¾ Fenol:clorofórmio:Fenoldestilado 50mLClorofórmio 50mLAlcoolisoamílico 1mL8-hidroxiquinoleína 0,1gTEpH8,0 15mL
(usarapenasafaseorgânica,decoramarela,nãoagitar)
Protocolo Experimental
1. Usar20mLdeculturasaturadadebactériarecombinante.
2. Centrifugar4.000XGdurante15minutosa4°C.3. Lavarosedimentodebactériascom5mLdeLB.4. Decantareescorrerosobrenadante.5. Ressuspenderosedimentocom2mLdeSoluçãoI.6. Adicionar10mgdelisozima.Misturar.7. Repousar10minutosàtemperaturaambiente.8. Adicionar4mLdeSoluçãoII.9. Misturarporinversão.10. Repousar10minutosnogelo.11. Adicionar3mLdeSoluçãoIII.12. Misturar.Repousar10minutosnogelo.13. Centrifugar7.000XGdurante30minutosa4°C.14. Filtrarosobrenadanteporgazehidrófila.15. Adicionar0,6volumesdeisopropanol.16. Repousar10minutosàtemperaturaambiente.17. Centrifugar7.000XGdurante30minutos.18. Decantar.
19. Lavaroprecipitadocometanola70%.20. Lavaroprecipitadocometanola96%.21. Secaroprecipitado.22. Dissolvercom500μLdeRNAse-mix.23. Incubara37°Cdurante60minutos.24. Adicionar100μLdePronase-mix.25. Incubara37°Cdurante30minutos.26. Extrair2vezescomfenol:clorofórmio(igual
volume).27. Tomarafaseaquosa,seminterfase.28. Adicionar0,04vol.de5MNaCl(24µL)e2vol.de
etanolpuro(1,2mL).29. Precipitarduranteumanoitea–20ºC.30. RecuperarDNAplasmídicoporcentrifugação
(7.000XGdurante30minutos).31. Dissolvercom50μLdeTEpH8,0.32. Avaliaraconcentraçãodeumaalíquotaporleitura
daDOa260nm(50µg/mL=1UDO)
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 22
6. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-MINIPREP
Material e Reagentes
(mesmosdatécnicadaLiseAlcalina)
Protocolo Experimental
1. Inocular5mLdeLBcomcadacolóniaaanalisar.2. Incubara37ºCduranteumanoitecomagitação.3. Pipetar2x1,5mLdesuspensãoparadoismicrotubos,damesmacultura4. Centrifugar1minutonamicrocentrífuga.(sobrenadantetransparente)5. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante.6. Ressuspenderosedimentodoprimeirotubocom100μLdeSoluçãoI,homogeneizandocomamicropipeta7. Transferirasuspensãoparaosegundotuboeressuspenderosedimento,homogeneizandocomamicropipeta8. Adicionar200μLdeSoluçãoII9. Misturarporinversão.10. Adicionar150μLdeSoluçãoIII11. Misturarporinversão12. AgitarfortementeàmãoparapartirDNAcromossomal.13. Centrifugar5minutosnamicrocentrífuga.14. Pipetar400μLdesobrenadantelímpido(seminterfacenemprecipitadosobrenadante).15. Adicionar250μLdeisopropanol.16. Repousar10minutosàtemperaturaambiente.17. Centrifugar20minutosnamicrocentrífuga.18. Decantar.19. Lavaroprecipitadocometanolpuro.20. Centrifugar5minutosnamicrocentrífuga,seosedimentotiversidodescoladodotuboounãoforvisível.21. Decantar,escorreresecar.22. Dissolvercom50μLdeRNAse-mixouTE23. Incubara37°Cdurante30minutos.24. Usar10μLparadigestãocomenzimaderestrição25. Conservarremanescentecongeladoa-20ºCemtubodevidamentemarcado
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 23
7. DIGESTÃOCOMENZIMASDERESTRIÇÃO
Material e Reagentes
¾ SoluçãodeDNAaanalisar¾ Enzimasderestrição:
BamHI(10U/µL)EcoRI(20U/µL)SalI(20U/µL)
¾ Fenol:clorofórmio¾ Tampãodeenzima10X(dofabricante)
Exemplodetampão:- 1MKOAc- 250mMTris/Acetato,pH7,6- 100mMMgOAc- 5mMb-Mercaptoetanol- 100μg/mLBSA
Protocolo Experimental
1. Emmicrotubo,adicionarsequencialmente:a. HB2BOestéril 20,5µL (ad.25µLfinal)1b. SoluçãodeDNA 1µL (1µg)c. T.enzima10X 2,5µL (1Xfinal)d. Soluçãodeenzima 1µL (10Unidades)
2. Misturarnovortex.3. Centrifugarbrevementeparalevartudoparaofundodotubo.4. Incubara37°Cdurante1hora.5. Desproteinizarpelofenol:clorofórmio:
a. Adicionar25µLdefenol:clorofórmio.b. Misturarbem.c. Centrifugar1minutonamicrocentrífuga.d. Pipetarfaseaquosaparanovotubo.
6. Tomar10µLparaanáliseemgel.
1 A quantidade de água a adicionar dependerá do volume de solução de DNA e será a necessária para completar os 25 µL
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 24
8. ANÁLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE
Material e Reagentes
¾ SoluçãodeDNAaanalisar¾ DNAmarcador:lambdaXBstEII¾ TBE10X
890mMTris890mMÁcidobórico20mMEDTApH8,0
¾ AgarosemédiaoubaixaEEO(SigmaTipoIIouV)¾ Brometodeetídio10mg/mL¾ Dye-DNAs(IndicadordeMigração):
25%Ficoll4000,25%OrangeG
Protocolo Experimental
1. Preparaçãodogela. Prepararomoldeparaogel(comopenteinserido)b. Pesaraagarosenecessáriaparabalãoapropriadoaovolumefinal(marcarnobalãoovolumefinal
pretendido)c. Fundiraagarose(0,7%)emcercade90%volumefinal,comáguadestiladad. Arrefeceracercade50°C.e. Adicionar5%deTBE10X(0,5Xfinal).f. Adicionar0,005%Brometodeetídio(0,5µg/mLfinal)g. Completarovolumefinalcomáguadestiladah. Misturareverternomoldei. Deixarsolidificar
2. Colocarogelnoaparelho,“apenas”submersoemTBE0,5X.3. AplicarasamostrasdeDNAcontendo10a20%deDye-DNAs.4. AplicarumaamostradeDNAmarcador(0,5a1µg)5. Procederàseparaçãoeletroforética(75V),atéconvenientemigração.6. VisualizarnotransiluminadorsobluzUV(300a320nm).7. Observarogel8. Registarasbandas(desenhar)9. Fotografarogelcomfiltrovermelhodegelatina.
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9. PREPARAÇÃODEBACTÉRIASCOMPETENTES
Material e Reagentes
¾ E.ColiXL1B
¾ LB10X¾ Tetraciclina1000X:
12,5mg/mLem50%etanol.Conservara–20°C.¾ 100mMCaClB2B(filtraçãoestéril)¾ Glicerol50%(v/v)(filtraçãoestéril)
Protocolo Experimental
1. Inocular10mLdeLB1X(Tetraciclinaopcional)comcolóniadeE.coliXL1B(ouequivalente).2. Incubara37°Csobforteagitação,duranteumanoite.3. Usar2mLdaculturasaturadaparainocular10mLdeLBpré-aquecidoa37°C.4. Incubara37°Csobforteagitaçãoaté0,2UDOa600nm(cercade2X10P
7Pbactérias/mL)-2a4horas.2
5. Arrefeceros10mLdaculturadurante20minutos,embanhodegelo.6. Centrifugar3.000XGdurante15minutosa4°C.7. Decantar.8. Ressuspenderosedimentodebactériasem5mLde100mMCaClB2B.9. Repousar20minutosnogelo.10. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4°C.11. Decantar.12. Ressuspenderosedimentodebactériascom2mLde100mMCaClB2B.13. Adicionar20%deglicerola50%(10%final)14. Repartiralíquotasde500µLpormicrotubos15. Repousardurante1horaa4ºC16. Conservarcongeladoa-80ºC17. Testaraeficáciadetransformaçãocom50µLdebactériascompetentes3
2 Dadas as limitações de tempo, dever-se-á utilizar a suspensão bacteriana fornecida e iniciar o processo a partir do ponto 5) do protocolo. 3 As bactérias competentes poderão ser usadas, sem congelação, imediatamente antes da adição do glicerol.
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10. TRANSFORMAÇÃO
Material e Reagentes
¾ Bactériascompetentes¾ SoluçãodeDNAsplasmídico(pDNA)¾ LB10X¾ Ampicilina1000X¾ PlacasdeAgar/LB/Amp:
Bacto-Agar 7.5gLB10X 50mLHB2BOaté 500mL
Autoclavar,Deixararrefecera50ºC.Adicionar500μLdeAmpicilina1000X.Repartirdeimediatopelasplacasdepetri.
Protocolo Experimental
1. Pipetarparaummicrotubo5µLdesoluçãodepDNA.2. Pipetarparaoutromicrotubo5µLdesoluçãodepDNAdiluídaa1:100.3. Adicionar50µLdebactériascompetentesacadatubo.4. Homogeneizarnovortex.5. Repousar10minutosnogelo.6. Incubara37°Cdurante5minutos.7. Adicionar1mLdemeioLBpré-aquecido(semantibiótico).8. Incubara37°Cdurante1hora.9. Centrifugar1minutonamicrocentrífuga(sobrenadantelímpido).10. Decantar.11. Ressuspenderasbactériasem200µLdemeioLB.12. EspalharuniformementesobreplacadepetricomAgar/LB/Ampatésecar.13. Incubara37°Cemestufaduranteumanoite.14. Observarcrescimento.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 27
11. SELEÇÃODERECOMBINANTESDepoisdeefetuadoumatransformação,váriostiposdebactériaspodemsurgirnaplacadepetri.SendoapenasinteressantesasbactériastransformadascomoDNApretendido,énecessárioeliminareventuaiscontaminantesnãorelacionados,bactériasnãotransformadasoutransformadascomoutrosDNAs
Material e Reagentes
¾ Placasdepetricomcolóniastransformadasisoladas¾ Tubosdeensaiocom5mLdeLB/Amp¾ Palitosesterilizados
Protocolo Experimental
1. Identificarumadúziadecolóniasnaplacacomasbactériastransformadas2. Marcarostubosdeensaioparaidentificaçãodasbactériasaanalisar3. Picarcadacolóniaindividualmentecomumpalito(Nãoremoveratotalidadedacolónia)4. Mergulharopalitonorespetivotubodeensaio5. Incubara37°Cemestufaduranteumanoite,sobagitação.6. Observaraturvaçãodasuspensãobacteriana.7. Tomardecadacultura1,5mLparatuboeppendorf8. ExtrairoDNAplasmídicopelatécnicadaMINIPREP9. Analisarpeloprocessoadequado
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12. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–INDUÇÃODAEXPRESSÃOApartirdecolóniadebactériatransformada,queexprimaumaproteínarecombinante,extraireanalisaremgeldeeletroforeseosperfisproteicosdabactériainduzidaenãoinduzida.
OsubclonepCS938.15éumsistemadeexpressãoemE.coliquecontemasequênciadogeneB646LinseridaajusantedopromotorLacZealinhadacomocodãodeiniciaçãoATG.Estesistemainduzidocomumanálogodalactose,oIPTG,sintetizaumaproteínacompesomolecularcorrespondenteàp73fundidacomaenzimaGalactosidase(170KDa).
Material e Reagentes
- Bactériarecombinante(pCS938.15)- LB/Amp- IPTG100mM
Protocolo experimental
1. RessuscitarculturadebactériarecombinanteemmeiodeculturaLB/Amp/Agar(sólido)2. Expandirumacolóniaem10mLdemeioLB/Amp(líquido)3. Incubar37ºC,sobagitação,duranteumanoite4. Adicionar4mLdeLB/AMPpré-aquecidoa2erlenmeyersesterilizados5. Inocular1mLdeculturabacterianaacadaerlenmeyer6. Adicionaraumdostubos(INDUZIDO)50µLdeIPTG100mM7. Incubarasduasculturasa37ºCdurante30minutos,sobagitação8. Tomar,decadacultura,para2microtubos,1mLdesuspensão(4tubos)
a. Centrifugar2minutosb. Decantarerejeitarsobrenadantesc. Congelar-20ºCumtubodebactériainduzidaeoutrodebactérianãoinduzida
9. Ressuspenderossedimentosdosoutrostuboscom1,5mLdesalinoa. AvaliareregistaraDOa550nm
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13. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–PAGE
Material e Reagentes
¾ Extratosdebactériarecombinante(pCS938.15)comexpressãoinduzidaenãoinduzida
¾ Acrilamidaa50%(esterilizadaporfiltração)¾ Bisacrilamidaa1,25%¾ Tris1,5MpH8.8¾ Tris1,5MpH6.8¾ SDS10%¾ TEMED10%¾ Persulfatodeamónio10%(extemporâneo)¾ TampãoLaemmli10X:
Tris250mMGlicina1,92MSDS1%pH8.3
¾ Tampãodeeléctrodos:T.Laemmli1X
¾ Tampãodeamostra(2X):Tris125mMpH6.8SDS4%Glicerol20%BME10%Azuldebromofenol0,2%
¾ Soluçãodecoloração:AzuldeCoomassie0,2%Metanol50%Ácidoacéticoglacial10%
¾ SoluçãodediferenciaçãoMetanol10%Ácidoacéticoglacial10%
Protocolo Experimental
Preparação do gel
1. Montaromoldeparaogel2. Preparargeldeseparação–10%acrilamida(emerlenmeyer):
a. Acrilamida50% 12mL4b. Bisacrilamida1,25% 9mLc. Tris1,5MpH8.8 15mLd. SDS10% 600μLe. H2O 22,8mLf. TEMED10% 300μLg. Persulfatodeamónioa10% 300μL
3. Homogeneizarsemintroduzirmuitoar.Verternomolde.4. Adicionarpequenovolumedeáguanasuperfíciedogel(semmisturar)5. Deixarpolimerizar(20a30min)6. Preparargelde“stacking”(emerlenmeyer):
a. Acrilamida50% 750μLb. Bisacrilamida1,25% 800μLc. Tris1,5MpH6.8 625μLd. SDS10% 75μLe. H2O 5,1mLf. TEMED10% 75μLg. Persulfatodeamónioa10% 75μL
7. Removeraáguasobrenadantedogeldeseparação8. Colocaropente.Verterogeldestackingnomolde9. Deixarpolimerizar(10a20minutos)
4 Se as soluções disponíveis de acrilamida e bisacrilamida não tiverem as concentrações que se indicam, as quantidades a usar deverão ser calculadas por forma a que seja usada a mesma quantidade relativa da substância. A compensação do volume final dever-se-á fazer na quantidade de água a usar.
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 30
Electroforese
1. Montarogelnatinadeeletroforese2. Encherascâmarasdoselétrodoscomotampãodeeletroforese3. Prepararasamostrasdeproteínas:4. Medir,paramicrotubo,50μLdesoluçãodeproteína5. Adicionar50μLdetampãodeamostra6. Homogeneizar7. Incubarembanhodeáguaferventedurante10minutos8. Aplicar50μLdeamostraporpoçodogel,registandoalocalizaçãodecadaamostra9. Ligaracorrenteelétrica(70volts)atéaoindicadordemigraçãoseposicionarnofimdogel(5horas)10. Desmontarosistemarecuperandoogel
Coloração das proteínas
1. Mergulharogelemabundantesoluçãodecoloração2. Corardurante30minutoscomagitação3. Passarogelparasoluçãodediferenciação.4. Mergulharemabundantesoluçãodediferenciação5. Diferenciarcomagitaçãoatécontrasteconveniente(mudarsoluçãoquandonecessário)6. Observaremtransiluminadordovisível7. Registarosresultados(desenharasbandas).Fotografar
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 31
14. CROMATOGRAFIADEEXCLUSÃOMOLECULAR
Material e Reagentes
¾ Amostradeproteínaatestar(1mg/mL)¾ Colunadecromatografiade30cmX1cm¾ Agarlavado¾ Sorofisiológico(SF)¾ Microtuboseppendorf¾ Azidadesódio10%
Procedimento experimental
1. Prepararacoluna:a. HomogeneizarasuspensãodeagarlavadocomSFb. Compipetainvertidaencheracoluna(~20cm),semdeixarsecarasuperfície
2. LavaracolunacomtrêsvolumesdeSF3. DeixarescoaraquasetotalidadedoSFsobrenadante(nãodeixarsecar)4. Aplicar2mLdeamostradeproteína5. Deixarescoaraquasetotalidadedaamostra(nãodeixarsecar)6. CarregaracolunacomSFpermanente7. Armazenar,senecessário,sobSFcontendoazidadesódioa0,02%8. Recolheramostrasde1,5mL(20tubos).Marcarmicrotubos9. Revelarapresençadaproteínanasfraçõesrecolhidaspelatécnicade“Dot-Blot”10. LeraDOdetodasasamostrasrecolhidasa280nm.Registar11. Avaliaraconcentraçãoproteicadecadaamostra12. Estabeleceremgráficoacurvadaeluiçãodaproteína
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 32
Registo de observações e Resultados
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR
Operador: Data: ____/____/____
Gráficos
Notas:
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 33
15. DOTBLOT(PROTEÍNAS)
Material e Reagentes
¾ Amostradeproteínaatestaro Lisozima10mg/ml
¾ Papeldefiltro3MM¾ Soluçãocorantedeproteínas
o AzuldeCoomassie0,2%o Metanol50%o Ácidoacéticoglacial10%
¾ Soluçãodiferenciadorao Metanol50%o Ácidoacético10%
Procedimento experimental
1. Preparardiluiçõesdaamostra 1 2 3 4 5 6
Solução de proteína 30 μl Diluição anteriro - 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl SF - 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl
Concentração proteica (mg/ml) RESULTADO (+/-)
2. Cortarfragmentodepapel3MM2X5cm3. Marcarposiçõesdaamostracomlápisdecarvão(distânciasde0,5cm)4. Aplicar2 μldecadadiluiçãodeamostra,emsequência5. Deixarsecaraoar6. Prepararcoranteediferenciador
a. 10mldecoranteemplacadepetrib. 2X10mldediferenciadorem2placasdepetri
7. Colocaropapelnasoluçãocorante8. Corardurante5minutoscomagitaçãointermitente9. Descorardurante2X5minutoscomagitaçãointermitente10. Analisareregistarosresultados
Observações
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 34
ANEXOS
EnzimasdeRestriçãoCaracterísticasdasenzimasderestriçãodisponíveisparaarealizaçãodostrabalhoslaboratoriais.
UBamH I
5´...G^GATCC...3´
3´...CCTAG^G...5´
Origem:BacillusamyloliquefaciensH
ReaçãoEnzimática:¾ 150mMNaCl¾ 10mMTris-HCl¾ 10mMMgCl2¾ 1mMdithiothreitol¾ 100µg/mLBSA.¾ pH7.9¾ Incubaçãoa37°C.
Inativaçãopelocalor:Não
UEco RI
5´...G^AATTC...3´
3´...CTTAA^G...5´
Origem:E.coliRY13
ReaçãoEnzimática:¾ 50mMNaCl¾ 100mMTris-HCl¾ 10mMMgCl2¾ 0.025%TritonX-100¾ pH7.5¾ Incubaçãoa37°C
Inativaçãopelocalor:65°CX20minutos
USal I
5´...G^TCGAC...3´
3´...CAGCT^G...5´
Origem:StreptomycesalbusG
ReaçãoEnzimática:¾ 150mMNaCl¾ 10mMTris-HCl¾ 10mMMgCl2¾ 1mMdithiothreitol¾ 100µg/mLBSA¾ pH7.9¾ Incubaçãoa37°C.
Inativaçãopelocalor:65°CX20minutos
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Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 35
TabelaPeriódica
CarlosSinogas