Engenharia genética e biossegurança: perspectivas e ... · Maior complexidade = maior necessidade...
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Engenharia genética e biossegurança: perspectivas e aspectos importantes para sua
aplicação em mandioca
Francisco J. L. AragãoEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
TransgênicoTransgênicoGenômica Bioquímica
Genética clássica Bi
olog
ia M
olec
ular
Bios
segu
ranç
a Melhoram
ento
Maior complexidade = maior necessidade de capacitação
Investimento
Legislação
multibrotação
FEC &
Suspenção
SistemasSistemas de de regeneraregeneraççãoão de de mandiocamandioca
Embrigênesissomática
SeleSeleççãoão
Seleção direta
Marcadores
antibióticosHig, kan, geneticina etc.
Seleção positivamanose (MPI)
Marcadores visuaisGus etc, res. herbicidas
Screening
University of Bath, UK
TS
LS
xilemaparênquima
tiloses
PAL-gus
Estudo funcional de promotores
Resposta a estresse (ferimento)
DNA A~2.7 kb
LIR
Rep/AC1
TrAP/AC2
Ren/AC3
CP/AV1
AV2
TA
T
T
G
T
T
TA
AA
AA
A
CCC
C
CC
G
G
G
G
GG
GG
CCC
C
T
CAGAACACCCAAGGGGCCAA GCCCCCTTTAATGTGGTCCCCGCGC
Conserved sequence
hairpin
(+) DNA
Bidirectional promoter
DNA B~2.7 kb
LIR
MPB/BC1
NSP/BV1
Single stranded circularDNA viruses
Transmitido por moscabranca e mecanicamente
WhiteflyWhitefly
DNA-A DNA-Brep
CP
ren
trapBC1 BV1
RCRC
barnase
Local plant cell deathVirus infection
Virus spreadX
Without virus infection No functional Barnase
Barstar
35S!
Barnase 35S!ACp/AVp
Hm35Sp AC1 35S!
Hm35Sp AC2 35S!
Hm35Sp AC3 35S!
RNA antisense
Inst. Tec. Zurich
Componente B defectivoretardamento no aparecimento dossintomas
Replicase mutada e gene defectivo
#1#44 Controle
Simtomas 7 dpi
Plant Molecular Biology 56: 601–611, 2004.
African cassava mosaic virus (ACMV)East African cassava mosaic Cameroon virus (EACMCV) Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV)
Estável (3 anos). Funcional no campo? ACMV e EACMV?Nigéria, Quênia e Uganda.
Valine
N-hydroxyvaline
2-Methyl proponol oxime
Acetone cyanohydrin
Linamarin
UDP-Glucose + Acetone cyanohydrin
Acetone +HCN
CYP79D1CYP79D2
Linamarase
Hydroxynitrile lyase(or spontaneously)
UDPG-glucosyltransferase
PutativeCYP71E
Mandioca acianogênica pela redução da expressão de CYP79D1 e CYP79D2
The Ohio State University
Antisense de CYP79D1 e CYP79D2 isolados de mandioca
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100
4
15.3
5966.6
25.5
6.2
41.729.4
40.5
23.5
11.3
% L
inam
arin
2215 (WT) vs Cab1 transformants
0
1
2
96
98
100
0.44
0.73
0.290.330.26
0.98
% L
inam
arin
2215(WT) vs Cab1 transformants
Inst. Tec. Zurich
K
W
M
L
M
F
V
K
L
K
T
I
K
M
E
E
T
E
E
I
Tetramer (11.2KD)
ß-Turn
Hydrophobic
monomer
MLEELFKKMTEWIEKVIKTMG GMTKIVKEIWETMKKFLEELMR
RMLEELFKKMTEWIEKVIKTMG
MTKIVKEIWETMKKFLEELMR
PG
PG
PG
Monomer
Dimer
Trimer
Tetramer
ß-Turns
Hydrophilic
HydrophilicHydrophobic
Proteína de reserva artificial (ASP1)DEMEGEN INC., U.S. Patent # 5811654, 1998
P WT S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16
1 kb
500 bp
Análises de Southern and northern analysis
11.2 KD
WT P77 Q7 Q12 S5 S11 S13 S16
Folhas
Raízes primárias
11.2 KD
WT P77 Q7 Q12 S5 S11 S13 S16
Westhern blots
Resolução Normativa Nº 5 da CTNBio, de 12 de março de 2008
Dispõe sobre normas para liberação comercial de Organismos Geneticamente Modificados e seus derivados
- informações relativas ao OGM- avaliação de risco à saúde humana e animal- avaliação de risco ao meio ambiente- plano de monitoramento (mínimo de 5 anos)
Recursos Genéticos e Biotecnologia
Arroz e Feijão
Soybean
Milho e Sorgo
Agrobiologia
Agroinsdústria
UNESP-Botucatu
Caracterização Molecular
• Número de insertos, estabilidade• Número de cópias dos elementos genéticos • Integridade dos cassetes de expressão• Presença de DNA adicional (backbone)• Seqüência flanqueadoras no DNA genômico• Seqüência dos elementos inseridos• Marcadores de DNA (eventos específicos)
ahas cds
AC1 seq
AC1 seq
pdk intron
ahas5´
35SCaMV
ahas3´
ocs3´
Nco I (3963)
Xho I (7812)
Xba I (6444)
Xba I (9440)
ahas cds
AC1 seq
AC1 seq
pdk intron
ahas5´
35SCaMV
ahas3´
ocs3´
Nco I (3963)
Fsp I (480)
Xho I (669)
Xho I (7812)
Xba I (732)
Xba I (6444)
Xba I (9440)
E4
...tcagtggaacgaaacgaaagggggatgtgct...
StableGenerations x after crosses
Caracterização da Proteína,Alimento / segurança para alimentação
•Caracterização da proteína e equivalente•Concentração da proteína dos tecidos da planta•Caracterização da proteína purificada como alimento•Alergenicidade? •Toxicidade?
Equivalencia agronômica, Segurança ambiental
• Caracterização agronômica / variações fenotípicas? •Adaptabilidade•Segurança ambiental•Cadeia no meio ambiente
Equivalência de Composição,Equivalência Nutricional
•Amostras de multi-locais, multi-anos, com réplicas de campos•Metabólicos secundários•Processamento em escala piloto, análises de nutrien tes/ antinutrientes (métodos validados)•Confirmação da segurança como alimento•Estudos de alimentação em animais
Crop Trait Developer Regulatory status
Cassava Viral resistance Donald Danforth Plant Sciences Center
---
Cotton Insect resistance Monsanto ---
Maize Drought tolerance Monsanto ---
Crop Trait Developer Regulatory status
Cassava Bio-fortification Gates Foundation ---
Cassava Viral resistance Donald Danforth Plant Sciences Center
---
Cowpea Insect resistance African Agricultural Technology Foundation (AATF)
---
Sorghum Bio-fortification* Africa Harvest ---* Increased levels of pro-vitamin A, vitamin E, iron, zinc, amino acids, and protein
Malawi
Nigeria
Quênia e UgandaCrop Trait Developer Regulatory Status Year
Sorghum Bio-fortification* Africa Harvest--- ---
Cassava Viral resistanceDonald Danforth Plant Sciences Center
Confined field trial 2006
Cotton Insect resistance MonsantoConfined field trial 2007
Corn Insect resistanceKenya Agricultural Research Institute, Syngenta, CIMMYT
Confined field trial 2006
Não é realistico esperar encontrar um ambiente que seja arroz “GM-free” (USA). Pode ser negativo para “Arroz GM, masnão zero-GM”