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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA MONOGRAFIA Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR). Elane Maria Camboim Lustosa 2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL

CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

MONOGRAFIA

Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR).

Elane Maria Camboim Lustosa

2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL

CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

MONOGRAFIA

Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR).

Elane Maria Camboim Lustosa Graduanda

Profª. Drª. Marcia Almeida de Melo Orientadora

Patos, PB Abril de 2010

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FICHA CATALOGADA NA BIBLIOTECA SETORIAL DO CAMPUS DE PATOS - UFCG

L972a 2010 Lustosa, Elane Maria Camboim.

Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR) / Elane, Maria Camboim Lustosa. - Patos - PB: CSTR, UFCG, 2010. 41p. Inclui bibliografia. Orientadora: Márcia Almeida de Melo

Monografia (Graduação em Medicina Veterinária) – Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande.

1 – Diagnóstico Laboratorial - Monografia. 2 – Erliquiose – cão. - I – Título.

CDU: 616-074

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL

CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

ELANE MARIA CAMBOIM LUSTOSA Graduanda

Monografia submetida ao curso de Medicina Veterinária como requisito parcial para obtenção do grau de Médica Veterinária

APROVADO EM ....../....../........ MÉDIA: ________

BANCA EXAMINADORA

Profª. Drª. Marcia Almeida de Melo ORIENTADORA

Prof. Dr. Adriano Fernandes Ferreira EXAMINADOR

Profª. Drª. Rosângela Maria Nunes da Silva EXAMINADOR

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“A Deus, meu amor supremo, ao meu pai Diral (in memorian) a quem eu amei e dediquei a minha vida; a minha mãe Salete que tenho um amor imensurável e ao meu noivo Abraão Lyncolly amor da minha vida por tornar meus dias mais felizes, dedico.”

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AGRADECIMENTOS

A Deus pelo seu amor, proteção, misericórdia e bondade sobre mim desde que nasci, por permitir que eu chegasse até aqui, me dando força para suportar as perdas da vida e os obstáculos, não me deixando desistir nem enfraquecer, colocando-me em seus braços, curando minhas feridas, sendo meu amigo nos momentos de aflição em que eu me senti sozinha, colocando em meu caminho pessoas especiais para realizar em mim a sua obra. A ti meu amado Deus, a minha eterna gratidão e adoração.

A meu pai (in memorian) pela sua dedicação a minha vida, por seu amor incondicional aos seus filhos, por todos os esforços sem medida durante sua vida para a nossa criação, por sua vontade de me ver vencer, por todos os ensinamentos deixados em minha memória. Saudades!

À minha mãe por todo amor e dedicação que foram essenciais me servindo de base nos momentos difíceis, contribuindo para o meu crescimento pessoal e por toda sua preocupação em me ver feliz.

Aos meus irmãos Edvânia e Ewerton, meus cunhados Geovannio e Renata, por todo carinho e atenção e força nesta caminhada, me estimulando a seguir em frente e não desistir nas horas difíceis, a todos eles a minha gratidão.

Ao meu grande amor Abraão Lyncolly pela sua presença constante em todos os momentos desde que nos conhecemos, sua dedicação, amor, carinho, cuidado, compreensão, exemplo, que me ensinou o verdadeiro sentido do amor.

A minha família paterna, em especial minha avó Leca que é até hoje a minha referência, e aos meus tios Edilbelto (in memorian), Edilênia, Edmone e Edilpia a quem devo meus verdadeiros valores de vida.

A minha família materna: minha avó Maria José, meus tios Naldo, Antônio, Sebastião, França, Fátima, em especial Lúcia, que sempre me apoiaram e torceram por mim.

À família do meu noivo Lyncolly que considero minha nova família: Diassis e Auxiliadora, meus sogros, a quem tenho grande admiração, meus cunhados Adão, Andrei, Jaciara e Juliermson seu esposo pela amizade, apoio e carinho que sempre tiveram por mim.

A minha orientadora Profª Drª. Marcia Melo e ao seu esposo Prof. Dr. Paulo de Andrade e ao Fauzinho (alegria do laboratório) por todos os ensinamentos profissionais e pessoais, pela amizade, apoio, acolhimento, por terem acreditado na minha capacidade, e por todo exemplo que são para mim. Vocês foram fundamentais em minha vida.

A Tereza Emanulle que foi peça fundamental, trabalhando comigo em todos os momentos deste estudo, partilhando seus conhecimentos, sendo acima de tudo amiga, sem a sua presença não seria possível à realização deste trabalho.

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A toda equipe do laboratório (Aline, Tereza, Expedito, Arthur, Kamila, Gilzane e Maurina), pela amizade construída, pela troca de ensinamentos e por todos os dias em que compartilhamos com alegria trabalhando juntos.

As todas as minhas primas em especial as mais presentes em minha vida Savanna e Clarissa, obrigada por todo apoio e amizade que vocês têm a mim.

A todos os meus colegas de veterinária da turma 2010.1, a cada um em particular pela convivência de cinco anos, formando uma nova família que será guardada no meu coração para sempre, em especial Giulianna que sempre esteve em meu coração e a Gilzane ao verdadeiro laço de amizade que surgiu entre nós, por tudo que ela me ensinou como pessoa e o sentimento sincero que ela extraiu dentro de mim; a Andréa que sempre estudou comigo desde ainda criança mantendo a mesma amizade e consideração; a Siduane e Maurina que me conquistaram com suas amizades.

As minhas amigas Claúdia, Rachel, Karla, Nanita, Verônica, Katyany e Herta que desde sempre estiveram presentes seja por um telefonema ou visita, nunca perdendo o contato, estando nos momentos mais precisos, me escutando, me aconselhando, torcendo sempre por mim.

A todos do Centro Médico Veterinário (Dr. Leonardo, sua esposa Sibele, Drª. Aline, Diná, Rodrigo e Ramon), pela amizade, acolhimento, confiança e ensinamentos contribuindo para a minha vida profissional.

A todos os professores da Medicina Veterinária que deixaram não só ensinamentos profissionais, mas principalmente ensinamentos para vida.

A todos os funcionários que direta ou indiretamente foram essenciais nesta etapa da minha vida, em especial Tereza e Damião.

Ao professor Sérgio pelo apoio na análise estatística, se disponibilizando em todas as vezes que lhe procurava para tirar uma dúvida.

Aos professores Dr. Adriano Ferreira e Drª. Rosângela Maria que participaram da banca examinadora, mesmo não tendo sido meus professores durante o curso teve maior respeito e cuidado na avaliação do meu trabalho.

A todos que participaram desta etapa da minha vida direta e indiretamente me apoiando e acreditando na minha capacidade.

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SUMÁRIO

Pág 1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 14 2.1 Etiologia...................................................................................................... 14 2.2 Histórico...................................................................................................... 14 2.3 Taxonomia.................................................................................................. 15 2.4 Epidemiologia............................................................................................. 16 2.5 Principais espécies que acometem o cão.....................................................

17 2.5.1 Ehrlichia ewingii (EGC)...............................................................

17 2.5.2. Ehrlichia platys (ETC)................................................................ 18 2.5.3. Ehrlichia canis (EMC)................................................................ 18 2.6 Transmissão, clínica e patogenia da infecção por Ehrlichia canis............. 19 2.7 Principais métodos de diagnósticos utilizados na detecção de Ehrlichia... 21 4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................

24 4.1 Local de Execução...................................................................................... 24 4.2 Amostras de Ehrlichias............................................................................... 24 4.3 Esfregaço Sanguíneo................................................................................... 25 4.4 Extração do DNA........................................................................................ 25 4.5 Nested PCR................................................................................................. 26 4.6 Análise Estatística....................................................................................... 27 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 28 7 CONCLUSÃO...................................................................................................... 33 8 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA................................................................... 34

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LISTA DE FIGURAS

Pág Figura 1 - Fotomicrografias de esfregaços de papa leucocitária de sangue de cães positivos na nested PCR para Ehrlichia canis e/ou PCR para Anaplasma platys..........................................................................................................................

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Figura 2 - SepCell:LGC – Reagente para isolamento in vitro de linfócitos.............

25 Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose apresentando os resultados da nested PCR para detecção do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis..................

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LISTA DE TABELAS

Pág Tabela 1. Esquema de classificação antiga e atual das principais espécies do gênero Ehrlichia, Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros........................................................................................................................................

16

Tabela 2. Sequência de primers selecionados para amplificação do fragmento do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia, pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR)...................................................................................................

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Tabela 3. Resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas das amostras do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos cães com sinais de Erliquiose................................................................................................................

28

Tabela 4. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e esfregaço sanguíneo na detecção de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica de hemoparasitoses...........................................................................................................

29

Tabela 5. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de mononucleares (M) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica............

31

Tabela 6. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de granulócitos (G) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.............

31

Tabela 7. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e papa leucocitária (PL) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica...........

31

Tabela 8. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e coágulo de sangue (CS) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica...........

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RESUMO

LUSTOSA, ELANE MARIA CAMBOIM. Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR). Patos, UFCG. 2010, 41 p. (Monografia de conclusão do Curso de Medicina Veterinária).

A erliquiose é uma hemoparasitose distribuída mundialmente e transmitida por carrapatos aos cães. Em cães, tem como agentes etiológicos a Ehrlichia spp. e a Anaplasma platys, que formam corpúsculos de inclusão denominados de mórulas. Em função do baixo custo, a visualização das inclusões em esfregaço sanguíneo é utilizada como diagnóstico de rotina, mas a sensibilidade é baixa. O sangue é utilizado como fonte de ácido desoxirribonucléico (DNA) para a reação em cadeia da polimerase (PCR), mas apesar das espécies infectarem várias células, não há avaliação do uso de frações celulares sanguíneas na tentativa de aumentar a sensibilidade da técnica. Desta forma, este trabalho objetivou avaliar o aumento da sensibilidade da nested PCR no diagnóstico de erliquiose canina com DNA proveniente de diferentes frações sanguíneas. Foram utilizadas amostras de sangue de 22 cães com sintomatologia clínica sugestiva de erliquiose, provenientes da rotina médica dos Hospitais Veterinários da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e do Centro Médico Dr. Leonardo Torres, localizados nos municípios de Recife (PE) e Patos (PB). O DNA foi extraído de sangue total (ST), granulócitos (G), mononucleares (M), papa leucocitária (PL) e coágulo sanguíneo (CS). A amplificação do DNA de Ehrlichia e/ou Anaplasma pela nested PCR de ST foi confirmada em 15/21 (71,4%) amostras, apenas 6/21 (28,5%) foram negativas. Entre os 15 positivos, em 7 (46,4%) foi amplificado DNA de Ehrlichia canis e apenas 1 (6,6%) para Anaplasma platys. Entre as 14 (63,6%) amostras negativas no esfregaço sanguíneo, 8 (57,15%) foram falso negativas, apresentando-se positivas na nested PCR de ST. Em 7 (46,6%) amostras não houve amplificação na segunda reação de PCR, não sendo possível identificar a espécie. Quando o resultado do sangue total foi comparado com os das frações de M e PL, a sensibilidade foi de 42,86% e de 21,43% e 33,33% com as frações de G e C, respectivamente. O sangue total é a melhor fonte de DNA para o diagnóstico de Ehrlichia pela nested PCR. Ressalta-se que essa é a primeira evidência molecular do envolvimento de Anaplasma platys em infecção de cães no Estado da Paraíba.

Palavras-chaves: sangue, riquétsias, diagnóstico molecular, Nordeste, Brasil .

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ABSTRACT

LUSTOSA, ELANE MARIA CAMBOIM. Evaluation of blood cell fractions in the diagnosis of canine ehrlichiosis by nested PCR (Polymerase Chain Reaction). Patos, UFCG. 2010, 41 p. (Monograph of the Course of Veterinary Medicine).

Erlichiosis is a worldwide disease transmitted by ticks to dogs. The disease is caused by Ehrlichia spp. and Anaplasma platys, which form inclusion bodies called morulae. Due to the low cost, the identification of inclusion on blood smear is used as a routine diagnosis, but the sensitivity is low. Blood is used as source of DNA for PCR, but despite leukocytes be infected by different species, there is no evaluation about the use of blood cell fractions in an attempt to increase the sensitivity. Thus, this study aimed to evaluate the nested PCR sensitivity in the diagnosis of canine ehrlichiosis with DNA from different blood cell fractions. The samples were collected from 22 dogs with ehrlichiosis suggestive signs. The animals were treated at the Veterinary Teaching Hospitals, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) and Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), and at the Veterinary Medical Center Dr. Leonardo Torres, in Recife (PE) and Patos (PB). DNA was extracted from whole blood (WB), granulocytes (G), mononuclear cells (M), buffy coat (BCT) and blood clot (BCL). Ehrlichia and / or Anaplasma DNA was amplified in ST in 15/21 (71.4%) samples. Ehrlichia canis DNA was amplified in 7 (46.4%) animals and 1 (6.6%) for Anaplasma platys. Among 14 (63.6%) negative smears samples, 8 (57.15%) were false negative, but presented positive results in ST nested PCR. There was no amplification in the second PCR reaction in 7 (46.6%) samples. When whole blood result was compared with M and BCT fractions, the sensitivities were 42.86% and 21.43%, respectively, and 33.33% to G and C fractions. Whole blood (WB) is the best DNA source for diagnosis of Ehrlichia by nested PCR. It is worth noting that this is the first molecular evidence of the involvement of Anaplasma platys infection in dogs at the State of Paraiba.

Key words: blood, rickettsiae, molecular diagnostic, Northeast, Brazil.

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1 INTRODUÇÃO

A erliquiose é uma enfermidade infecciosa ocorrida em animais domésticos e

silvestres, podendo acometer o homem. Tem como agente etiológico a Ehrlichia spp.,

bactéria gram-negativa, intracelular obrigatória dos leucócitos ou trombócitos.

Trata-se de uma hemoparasitose distribuída no mundo inteiro, principalmente

em países tropicais e subtropicais, transmitida entre os cães com mais freqüência pelo

carrapato Rhipicephalus sanguineus.

A doença se caracteriza por diferentes alterações clínicas e hematológicas,

compreendendo as fases: aguda, subclínica e crônica. Sendo os sinais mais comuns febre,

apatia e anorexia, associados à trombocitopenia, anemia e leucopenia.

O diagnóstico definitivo da erliquiose tem sido baseado na combinação de

sinais clínicos, achados hematológicos e exames laboratoriais. O esfregaço de sangue e

papa leucocitária é a técnica mais utilizada na rotina clínica que identifica mórulas de

Ehrlichia. Essas espécies são de difícil detecção devido à curta parasitemia, que são vistas

com mais freqüência apenas no estágio agudo da doença, podendo induzir resultados falsos

negativos, além de parasitar diversos tipos de células, confundindo a espécie demonstrada,

mesmo tendo predileção por algumas espécies.

Outros métodos, como ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), reação de

imunofluorescência indireta (RIFI), western blothing, cultivo em células, reação em cadeia

da polimerase (PCR) e a reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR), têm sido

utilizados para detectar Ehrlichia spp..

A sorologia é bastante utilizada nos hospitais veterinários, porém testes

sorológicos podem apresentar resultados falsos positivos, devido à presença de anticorpos

que podem permanecer por muito tempo no organismo do animal, mesmo o agente tendo

sido eliminado.

A PCR tem apresentado maior sensibilidade e especificidade quando utilizada

como diagnóstico para Ehrlichia, pois permite determinar a presença de co-infecção por

duas ou mais espécies. No entanto a nested PCR tem melhorado a especificidade e a

eficiência da reação, pois a mesma diferencia as espécies de Ehrlichia spp..

Tecidos como sangue venoso e periférico, medula óssea, baço, fígado, rim e

linfonodos têm sido avaliados em vários estudos na perspectiva de descobrir a melhor

amostra para demonstrar Ehrlichia através de técnicas moleculares.

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Tendo em vista que não existem estudos anteriores que avaliem frações

sanguíneas qualificando a melhor fonte de ácido desoxirribonucléico (DNA) para se

diagnosticar as diferentes espécies de Ehrlichia, e que atualmente técnicas moleculares têm

sido mais eficientes no diagnóstico de erliquiose é que se realizou através deste trabalho

um estudo que avalia o sangue total e suas frações (sangue total, papa leucocitária,

granulócito e coágulo de sangue) pela nested PCR a fim de identificar em qual destas, o

DNA de Ehrlichia pode ser mais facilmente detectado, facilitando assim o diagnóstico da

doença, além de comparar a nested PCR ao esfregaço sanguíneo, confirmando a baixa

sensibilidade da segunda técnica vista em estudos anteriores.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Etiologia

As erliquioses caninas figuram entre as mais graves doenças infecciosas que

acometem os cães, causadas por bactérias do gênero Ehrlichia, principalmente pela espécie

Ehrlichia canis, agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (DUMLER et al.,

2001).

Erlíquias são bactérias gram negativas, organismos cocóides a elipsoidais imóveis,

que podem ser encontradas isoladas ou em colônias denominadas mórulas. Parasitam

obrigatoriamente as células hematopoiéticas maduras ou imaturas, em especial as do

sistema fagocitário mononuclear, tais como monócitos e macrófagos e, para algumas

espécies, em células mielóides, como neutrófilos (DUMLER et al., 2001; BRITO, 2006).

2.2 Histórico

A primeira espécie Rickettsia canis foi descrita em um cão Pastor Alemão, na

Argélia, por Donatien e Lestoquard, em 1935, reclassificada como Ehrlichia canis, em

1945, por Mashkovsky. Primeiro caso de erliquiose canina descrito nas Américas, na

região das Antilhas Holandesas foi descrito em 1957, associado à Babesia canis

(ALMOSNY, 2002; MACHADO, 2004).

A década de 60 foi marcada por uma doença em cães de etiologia desconhecida

caracterizada por hemorragia severa, que recebeu vários nomes, entre eles o de

Pancitopenia tropical canina, abrangendo países como Singapura (1960), Estados Unidos

(1963 e 1969) e Inglaterra (1968); no entanto, esta enfermidade só foi estabelecida como

causada por Ehrlichia canis no final da mesma década (ALMOSNY, 2002; ETTINGER &

FELDMAN, 2004). Somente na década de 1980, com o reconhecimento da erliquiose

como possível doença zoonótica fatal, intensificou-se as pesquisas para caracterização do

organismo e definição da patofisiologia do agente (COHN, 2003; PADDOCK & CHILDS,

2003).

O primeiro caso de erliquiose canina no Brasil foi descrito em Belo Horizonte-MG,

por Costa et al., em 1973, e logo após em várias cidades como Rio de Janeiro-RJ, Santa

Maria-RS e Curitiba-PR (ALMOSNY, 2002). As espécies descritas no Brasil até o

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momento são Ehrlichia canis e Anaplasma platys (AGUIAR et al., 2007; RAMOS et al.,

2009).

2.3 Taxonomia

A erliquiose é uma doença causada por bactérias pertencentes à ordem

Rickettsiales, família Anaplasmataceae e gêneros Ehrlichia e Anaplasma (DUMLER et al.,

2001).

A diferenciação entre as espécies parasitas foi primeiramente baseada no tipo de

célula parasitada, distribuição geográfica e severidade da doença; mais tarde esta

classificação entrou em conflito com o esquema de genogrupos: através dos métodos

moleculares de identificação, três genogrupos foram caraterizados em Ehrlichia canis (I),

Ehrlichia phagocytophila (II) e Ehrlichia sennetsu (III). O genogrupo Ehrlichia canis

inclui Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e a Cowdria ruminantium;

o genogrupo Ehrlichia phagocytophila compreende erlíquias como a Ehrlichia equi,

Ehrlichia platys e o agente da erliquiose granulocítica humana; e o genogrupo Ehrlichia

sennetsu consiste em Ehrlichia risticii e Neorickettsia helminthoeca (ALMOSNY, 2002;

ETTINGER & FELDMAN, 2004).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de seqüenciamentos genéticos de

espécies encontradas em várias regiões do mundo permitiu novos agrupamentos e

classificações taxonômicas das erlíquias (DAGNONE et al., 2001). A classificação foi

então modificada reorganizando o gênero Ehrlichia em outros gêneros, tendo como base

análises do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos parasitos (DUMLER et al., 2001).

Conforme a reclassificação realizada, o genogrupo 1 manteve o nome genérico

Ehrlichia, enquanto membros do genogrupo 2 mudaram de Ehrlichia para Anaplasma, e

membros do genogrupo 3 tornaram-se Neorickettsia (MACHADO, 2004).

As espécies dentro do gênero Ehrlichia foram divididas em formas monocíticas

(Ehrlichia canis, Ehrlichia risticii), granulocíticas (Ehrlichia ewingii e Ehrlichia equi) e

trombocíticas (Anaplasma platys), embora essa divisão demonstre limitações, pois a

infecção por uma espécie pode ocorrer em mais de um tipo celular (COHN, 2003).

A classificação definitiva das erlíquias foi baseada no sequenciamento do gene 16S

do RNA ribossômico (DAGNONE et al., 2001). Algumas espécies do gênero Ehrlichia,

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Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros principais são

demonstradas na Tabela 1 de acordo com a classificação modificada.

Tabela 1. Esquema de classificação antiga e atual das principais espécies do gênero Ehrlichia, Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros.

Fonte: Dagnone et al. (2001); Dumler et al. (2001); Almosny (2002); Quinn et al. (2005); Silva et al. (2009).

2.4 Epidemiologia

As espécies de erlíquias, com exceção dos patógenos humanos Ehrlichia chaffensis

e Ehrlichia sennetsu, são patógenos de animais domésticos e selvagens (QUINN et al,

2005).

A erliquiose é relatada em grande parte das regiões tropicais e subtropicais de todo

o mundo, sua distribuição está relacionada à presença do carrapato vetor, Rhipicephalus

sanguíneus, o carrapato castanho do cão. Esta espécie é de grande importância por ser

cosmopolita, tendo como hospedeiros vertebrados mais comuns os membros da família

Canidae (cães, coiotes, raposa e chacal) (GROVES et al., 1975; DAGNONE et al., 2001;

ETTINGER & FELDMAN, 2004).

Cães de qualquer faixa etária podem ser infectados, porém algumas raças são mais

susceptíveis à doença, incluindo aquelas que vivem em áreas endêmicas e as que são

transportadas para estas regiões (NYINDO et al., 1980; RIKIHISA et al., 1994;

DAGNONE et al., 2001; MYLONAKIS et al., 2004).

Classificação antiga Classificação atual Células Alvo Hospedeiros Principais

Genogrupo I Ehrlichia canis Ehrlichia chaffeensis Ehrlichia ewingii Cowdria ruminatium

Genogrupo II Ehrlichia phagocytophila Ehrlichia equi Erliquiose Granulocítia Humana (EGH) Ehrlichia platys

Genogrupo III Ehrlichia sennetsu Ehrlichia risticii Neorickettia helminthoeca

Ehrlichia canis Ehrlichia chaffeensis Ehrlichia ewingii Ehrlichia ruminatium

Anaplasma phagocytophila Anaplasma phagocytophila Anaplasma phagocytophila

Anaplasma platys

Neorickettsia sennetsu Neorickettsia risticii Neorickettia helminthoeca

Mononucleares Mononucleares Granulócitos Endoteliais

Granulócitos Granulócitos Granulócitos

Plaquetas

Mononucleares Mononucleares Mononucleares

Caninos Humanos Caninos Ruminantes

Ruminantes Equídeos Humanos

Caninos

Humanos Equídeos Cães

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No Brasil, há relatos de várias espécies de carrapatos parasitando os cães, no

entanto, a ocorrência dessas espécies é resultante das características epidemiológicas

particulares de cada região e do ambiente em que são criados, pois a maioria dos carrapatos

encontrados em cães urbanos pertence à espécie Rhipicephalus sanguíneus. Já os cães

criados em áreas rurais ou suburbanas, podem ser infestados por várias espécies de

carrapatos, pertencentes ao gênero Amblyoma (LABRUNA & PEREIRA, 2001).

O gênero Ehrlichia atualmente compreende cinco espécies válidas: Ehrlichia

canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e Ehrlichia ruminantium

(DUMLER et al., 2001).

2.5 Principais espécies que acometem o cão

Três principais espécies estão envolvidas na ocorrência da erliquiose canina: a

Ehrlichia ewingii agente etiológico da Erliquiose Granulocítica Canina (EGC), a

Anaplasma platys causador da Erliquiose Trombocítica Canina (ETC), e a Ehrlichia canis

determinante da Erliquiose Monocítica Canina (EMC) (HARVEY et al., 1978; FRENCH

et al., 1983; ALMOSNY, 2002).

2.5.1 Ehrlichia ewingii

Infecta granulócitos (neutrófilos e eosinófilos) e é um dos dois agentes

erliquiais conhecidos por causar infecção granulocítica em cães. É supostamente

transmitida pelo carrapato Amblyomma americanus e certamente pelo Rhipicephalus

sanguineus (GOLDMAN et al., 1998; DAGNONE et al., 2001; ALMOSNY, 2002).

Foi relatada em 1985, como causadora da erliquiose granulocítica canina, após

a observação da mórula em granulócitos de cães com poliartrite aguda (ALMOSNY,

2002).

A EGC produz uma infecção subclínica causando febre, anormalidades

hematológicas (trombocitopenia, neutropenia e linfocitose) entre 18 e 24 dias de infecção,

além de causar claudicação e edema articular, podendo ser uma doença moderada a grave

(STOCKHAM et al., 1990; EGENVALL et al, 1997; ALMOSNY, 2002).

Através da análise da seqüência do gene 16S RNA ribossômico, a Ehrlichia

ewingii apresenta grande semelhança genética com o Anaplasma phagocytophilum agente

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da erliquiose granulocítica humana e com a Ehrlichia phagocytophila (ANDERSON et al.,

1991; CHEN et al., 1994; CHAE et al., 2000).

Testes laboratoriais revelaram a possibilidade de co-infecção de Ehrlichia

ewingii, Ehrlichia equi e Ehrlichia canis ou ocorrência de reação cruzada entre elas em

testes diagnósticos (STOCKHAM et al., 1990).

2.5.2 Anaplasma platys

O agente etiológico da erliquiose trombocítica canina é a Anaplasma platys

(HARVEY et al., 1978; FRENCH et al., 1983). De acordo com Hoskins (1991) Anaplasma

platys multiplica-se apenas em plaquetas de cães; no entanto Dagnone et al. (2001)

informou que essa Rickettsia infecta as plaquetas do cão, podendo eventualmente infectar

também os leucócitos.

Suspeita-se que Anaplasma platys seja transmitida entre cães, principalmente

pelo Rhipicephalus sanguineus, pois infecções concomitantes de Ehrlichia canis e

Ehrlichia platys são comuns (HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 2002; SANOGO et al.,

2003).

Os cães acometidos pela Anaplasma platys apresentam sinais clínicos após um

período de incubação de 8 a 15 dias, apresentando sinais digestivos e distúrbios

hemostáticos, (BEUAFILS, 1999 apud DAGNONE et al., 2001).

A ETC, também é conhecida como trombocitopenia cíclica canina por

apresentar trombocitopenia cíclica com parasitemia inicial, que tendem a ocorrer

periodicamente em intervalos de uma a duas semanas (DAGNONE, et al., 2001). Nos dias

em que ocorre plaquetopenia, as inclusões não são observadas; essa trombocitopenia tende

a agravar com a evolução do quadro e o número de plaquetas parasitadas diminui durante o

ciclo (HARVEY et al., 1978; HIBLLER et al., 1986; SWANGO et al., 1989; ALMOSNY,

2002).

2.5.3 Ehrlichia canis (EMC)

A Ehrlichia canis é o agente erliquial mais comum da erliquiose monocítica canina,

e a espécie que causa a doença com maior severidade parasitando monócitos (ALMOSNY,

2002). O risco de transmissão de Ehrlichia canis numa área pode ser estimado pela

prevalência de infecções ativas e passadas em cães (BOWMAN et al., 2009). A erliquiose

tem transmissão focal e a distribuição global varia de acordo com a densidade da

Page 20: Elane Monografia Corrigida 2 (PDF)

19

população e a distribuição do carrapato vetor. A expansão das populações de carrapatos

pode introduzir a doença em áreas antes livres ou de endemicidade muito baixa

(NICHOLSON et al., 2010). A infeccção por Ehrlichia canis é prevalente em um grande

número de países em todo o mundo, em especial nas regiões temperadas e tropicais, com

índices de infecção entre cães variando de menos de 5% a quase 70% (STICH et al., 2008).

Com exceção de Ehrlichia canis, cães não são considerados reservatórios primários

para patógenos riquetsiais transmitidos por carrapatos. Ao contrário, cães e seres humanos

são hospedeiros acidentais e podem ser infectados através da picada de um ixodídeo

(NICHOLSON et al., 2010). A Ehrlichia canis é transmitida pelo carrapato no estágio

adulto ou de ninfa, que por sua vez se infectou em estágios anteriores, em outro cão ou em

algum animal silvestre. A transmissão transovariana garante a infecção das larvas, que é

mantida ao longo das mudanças estadiais (COMER et al., 2001).

2.6 Transmissão, clínica e patogenia da infecção por Ehrlichia canis

O parasitismo do carrapato Rhipicephalus sanguineus pela Ehrlichia canis é

garantido por transmissão transestadial, podendo a doença ser transmitida pelos três

estágios: larva, ninfa e adulto (GROVES et al., 1975; DAGNONE, 2001; BREMER et al.,

2005). As larvas e ninfas se infectam através da ingestão de leucócitos infectados em um

cão na fase aguda da doença (SMITH et al., 1976; LEWIS et al., 1977). No carrapato, as

erlíquias se disseminam por hemócitos do intestino para a glândula salivar e durante a

alimentação, os carrapatos inoculam a secreção salivar contaminada com erlíquias no

interior do ambiente de alimentação no hospedeiro (SMITH et al., 1976).

As erlíquias se replicam nos fagossomos das células mononucleares fagocíticas

do hospedeiro, propagando-se para o baço, fígado e linfonodos (McDADE, 1990),

evoluindo de corpúsculos elementares para corpúsculos iniciais até a formação de mórulas

(NYINDO et al., 1971). As células infectadas são transportadas especialmente ao pulmão,

rins e meninges, aderindo ao endotélio vascular e induzindo o aparecimento de vasculite e

infecção do tecido subendotelial (SIMPSON, 1974).

As manifestações mais comuns causadas por Ehrlichia canis são anemia,

leucopenia, trombocitopenia, febre e emaciação (BICHARD & SHERDING, 1998). Os

sinais clínicos variam com a severidade da infecção, a resposta imunológica do hospedeiro,

os órgãos atingidos, a espécie de erlíquia envolvida e a presença de co-infecção com outras

Page 21: Elane Monografia Corrigida 2 (PDF)

20

erlíquias ou outros microorganismos transmitidos pelo mesmo vetor (DAGNONE et al.,

2001). A infecção por Ehrlichia canis pode progredir às fases aguda, subclínica e crônica

(QUINN et al, 2005).

A fase aguda é iniciada com um processo de hipertermia, após incubação de 5 a

15 dias, variando entre os animais a intensidade do pico febril, assim como também a

gravidade dos sinais (ALMOSNY, 2002). Nesta fase, os sinais clínicos são inespecíficos

incluindo febre, secreção ocular e nasal, anorexia, depressão, perda de peso,

linfadenopatia, vasculite, tremores musculares e poliartrite (BELLAH et al., 1986).

O quadro agudo da doença dura de duas a quatro semanas; ocorre bacteremia e

as principais alterações hematológicas são anemia, trombocitopenia e leucopenia

observada em poucos animais nessa fase (GREENE & HARVEY, 1984; ANDEREG &

PASSOS, 1999; ALMOSNY, 2002; NAKAGHI et al., 2008). A trombocitopenia que se

desenvolve durante essa fase é devido o decréscimo da meia vida das plaquetas circulantes,

que ocorre por alterações imunomediadas (ALMOSNY, 2002). Os cães infectados se

recuperam espontaneamente, podendo entrar numa fase assintomática ou subclínica,

permanecendo com o agente por longos períodos (HARRUS et al., 1997b).

Na fase subclínica, são observados elevados títulos de anticorpos, com

alterações hematológicas mais discretas (ANDEREG & PASSOS, 1999; NAKAGHI et al.,

2008). Estudos relatam que cerca de 50% dos cães que desenvolvem a fase subclínica, a

anemia regride e a contagem de plaquetas retorna ao valor normal (ALMOSNY, 2002).

Algumas complicações podem ser encontradas nesta fase como depressão,

hemorragias, edema de membros, perda de apetite, palidez de mucosas, uveíte e cegueira

(WOODY & HOSKINS, 1991).

Cães imunocompetentes podem eliminar o parasita ou, ocasionalmente,

desenvolvem a fase crônica da doença, caracterizada por supressão medular, sangramentos

por mucosas e conjuntivas e alta letalidade (HARRUS et al., 1997b). O sistema imune do

hospedeiro não consegue debelar a infecção e apresenta alterações clínicas e laboratoriais

mais severas (ANDEREG & PASSOS, 1999; NAKAGHI et al., 2008).

Os sintomas mais comuns da doença crônica são depressão, apatia, perda de

peso crônica e emaciação, mucosas pálidas, febre, edema periférico, equimoses e epistaxe,

podendo ocorrer infecções secundárias como pneumonia, glomerulonefrite, insuficiência

renal, artrite, polimiosite e ataxia (HARRUS et al., 1997a).

Page 22: Elane Monografia Corrigida 2 (PDF)

21

Os achados hematológicos na fase crônica são similares aos da fase aguda

sendo observados monocitose, linfocitose e trombocitopenia persistente associados à

anemia arregenerativa (ALMOSNY, 2002). A trombocitopenia é o achado mais freqüente

em cães experimentalmente e naturalmente infectados (OLIVEIRA et al., 2000;

NAKAGHI, et al. 2004), estando associada principalmente à fase crônica devido ao

decréscimo da hematopoiese, que ocorre por carência de megacariócitos (ALMOSNY,

2002). A leucopenia está presente na fase crônica e a pancitopenia pode ocorrer em casos

avançados desta fase, devido à hipoplasia de todas as células precursoras (MEINKOTH,

1989; HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 2002).

2.7 Principais métodos de diagnósticos utilizados na detecção de Ehrlichia.

A combinação de sinais clínicos e hematológicos é rotineiramente empregada

para levantar a suspeita diagnóstica de erliquiose, porém os sinais apresentados pelos

animais são confusos e variáveis, obrigando ao uso de exames laboratoriais para firmar um

diagnóstico definitivo (WANER et al., 2001; COHN, 2003).

Algumas técnicas têm sido utilizadas para um diagnóstico definitivo, como

pesquisa de inclusões em esfregaços sanguíneos e papas de leucócitos, cultivo celular,

sorologia pela imunofluorescência indireta (IFI), ensaio de imunoadsorção enzimática

(ELISA), western blotting e, mais recentemente, técnicas moleculares como a reação em

cadeia da polimerase (PCR) (IQBAL & RIKIHISA, 1994; TAKAHIRA et al., 2003;

DAGNONE et al., 2003; MYLONAKIS et al., 2004; MORAIS et al., 2004).

O método de rotina é feito normalmente pela demonstração microscópica direta

de inclusões intracitoplasmáticas, mais conhecidas como mórulas, em células

mononucleares sanguíneas, a partir de preparações coradas de esfregaço sanguíneo ou da

papa leucocitária (WOODY & HOSKINS, 1991). As espécies de erlíquias são encontradas

em granulócitos ou em plaquetas dos esfregaços sanguíneos de animais nos estágios

iniciais da doença. Aquelas espécies que têm por alvo monócitos estão presentes com

menor freqüência nos esfregaços sanguíneos (QUINN et al, 2005). A detecção de mórulas

de Ehrlichia canis não é freqüente; exceto durante a fase aguda da infecção, dificilmente as

mórulas são encontradas em esfregaços sanguíneos corados (HIBBLER et al., 1986;

OLIVEIRA at al., 2000; OLICHESKI et al., 2002; LEITE & RIBEIRO, 2003; NAKAGHI

et al., 2004; 2008; RAMOS et al., 2009). De fato, Mylonakis et al. (2003), comparando

Page 23: Elane Monografia Corrigida 2 (PDF)

22

diagnóstico direto para Ehrlichia canis a partir de diferentes tecidos como sangue

periférico (SP) capa leucocitária (CL), aspirados de medula óssea (MO) e linfonodo (LN),

concluíram que o diagnóstico a partir de SP é o que apresenta a menor sensibilidade (8%)

quando comparado a CL (66%), MO (34%) e LN (60,9%), desencorajando a utilização

dessa técnica para diagnóstico. A técnica não é eficaz devido também à constante flutuação

da parasitemia durante o curso da enfermidade (ELIAS, 1992). Corpúsculos iniciais,

mórulas e inclusões intraplaquetárias sugestivos para Ehrlichia canis e/ou Anaplasma

platys podem ser vistos na Figura 1.

Figura 1. Fotomicrografias de esfregaços de papa leucocitária de sangue de cães positivos na nested PCR para Ehrlichia canis e/ou PCR para Anaplasma platys. Foto A morfologia compatível com corpúsculos iniciais, B com mórulas de Ehrlichia canis, C com inclusões intraplaquetárias. Fonte: D’agnone (2006).

As técnicas sorológicas podem ser empregadas como testes confirmatórios de

diagnóstico para infecções por rickettsias (EGENVALL et al., 1998; COHN, 2003);

entretanto, apesar de apresentarem alta sensibilidade, esses testes podem levar a resultados

falsos positivos, pois os anticorpos específicos podem permanecer por bastante tempo após

o tratamento e cura (RIKIHISA et al., 1994; NAKAGHI et al., 2008; AQUINO, 2009).

Existem reações cruzadas em exames sorológicos dentro do mesmo grupo, e

potencialmente entre genogrupos, dificultando a determinação inequívoca do agente

Page 24: Elane Monografia Corrigida 2 (PDF)

23

etiológico. Os testes sorológicos também não são capazes de distinguir entre infecção

aguda e exposição prévia (RIKIHISA et al., 1994; SUKASAWAT et al., 2000).

Técnicas moleculares de diagnóstico reconhecidamente mais sensível, como a

PCR e a nested PCR, têm sido empregadas para o diagnóstico de Ehrlichia canis

(AGUIRRE et al, 2008; NAKAGHI et al. 2008; BANETH et al., 2009; KLEDMANEE et

al., 2009; MYLONAKIS et al., 2009; RAMOS et al., 2009).

A padronização da PCR é essencial para que esta possa ser usada como

diagnóstico seguro (ROTONDANO, 2007), pois se trata de uma reação que multiplica um

trecho específico do DNA utilizando primers que, por definição, são pequenos segmentos

de nucleotídeos capazes de se ligar em áreas conservadas de DNA do organismo testado,

amplificando uma região do mesmo e, dessa forma, permitindo sua identificação (COHN

et al., 2003). A nested PCR é uma segunda reação que utiliza o produto da amplificação da

primeira reação, obtendo assim, um produto menor que o da primeira amplificação. Uma

análise comparativa entre a PCR (gene dsb) e a nested PCR (16S RNA ribossômico),

realizada em amostras sangüíneas de cães infectados por Ehrlichia canis, demonstrou que

as duas técnicas são adequadas ao diagnóstico da EMC; no entanto, a nested PCR é até

agora a única capaz de diferenciar as espécies de Ehrlichia spp. (NAKAGHI et al., 2004).

A presença de DNA de Ehrlichia canis em cães infectados foi inicialmente

demonstrada pela PCR de sangue, medula óssea, baço, fígado, rim e linfonodos (IQBAL &

RIKIHISA, 1994; HARRUS et al., 1998; 2004; MYLONAKIS et al., 2004). Infecções

experimentais indicaram que o baço foi o local de maior probabilidade de encontrar

Ehrlichia canis durante a fase subclínica da EMC, apoiando a hipótese de que os

organismos são mais facilmente encontrados nos órgãos do que no sangue periférico.

Entretanto, o estudo não avaliou cães na fase aguda nem no início da fase sub-clínica, fases

estas em que se encontram em geral, os cães que recebem atendimento nos hospitais e

clínicas veterinárias (HARRUS et al., 1998; NEITZ & TOMAS, 1938)

No entanto, Gal et al. (2008) ressaltaram que informações comparativas sobre a

propagação e a presença de Ehrlichia canis por PCR em diferentes órgãos são limitadas e

que a comparação é difícil devido: a) diferenças na infecção natural e experimental, b)

diferentes fases da doença, c) metodologia de amostragem, d) natureza dos tecidos

avaliados.

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24

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local de Execução

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular do

Semiárido, da Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária no Centro de Saúde e

Tecnologia Rural da Universidade Federal de Campina Grande, Campus Patos - PB.

4.2 Amostras de ehrlichias

Foram coletadas 24 amostras, oriundas dos Hospitais Veterinários da

Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), na cidade de Patos - PB e da

Universidade Rural de Pernambuco (UFRPE), na cidade do Recife – PE, além do Centro

Médico Veterinário Dr. Leonardo Torres – CMVLT, Patos – PB, a partir de cães com

sintomatologia, parasitologia e/ou hematologia positiva ou sugestiva para erliquiose ou

apenas com presença de carrapatos.

As amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica, obtendo de cada

animal 4 ml utilizando citrato de sódio (4%) e 1 ml sem o anticoagulante ambos para

extração do DNA.

As frações obtidas foram sangue total (ST), papa leucocitária (PL),

mononucleares (M), granulócitos (G), e coágulo de sangue (CS).

Para obtenção do ST e da PL foi utilizado uma parte da amostra com citrato,

sendo a PL centrifugada a 10000 rotações por 15 minutos; no restante da amostra com

anticoagulante foi adicionado reagente para isolamento in vitro de linfócitos1, segundo as

recomendações do fabricante, para obtenção de mononucleares e granulócitos(Figura 2). O

coágulo sanguíneo foi obtido a partir da amostra sem citrato.

1 Sep Cell®, LGC Biotecnologia

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25

Figura 2 - Reagente para isolamento in vitro de linfócitos. Fonte: Sep Cell: LGC Biotecnologia.

4.3 Esfregaço Sanguíneo

Os esfregaços sanguíneos foram obtidos de amostras de 22 animais, corados

pelo Panótico rápido®2 e observados em microscópio (100X, objetiva de imersão em óleo)

para visualização de estruturas compatíveis com mórulas.

4.4 Extração do DNA

O DNA analisado foi extraído de amostras de ST (200µl), PL (50 µl), M (50

µl), G (100 µl) e CS (50 µl) utilizando-se um kit comercial3, seguindo as instruções do

fabricante.

Foram realizadas extrações de DNA em 21 amostras de ST, 20 de PL, 19 de M,

19 de G e 17 de CS, que foram utilizadas na nested PCR para a amplificação do fragmento

do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis e Anaplasma platys.

2 LaborClin, Brasil 3 Invisorb ® Spin Blood kit Midi; INVITEK

Page 27: Elane Monografia Corrigida 2 (PDF)

26

4.5 Nested PCR

A amplificação do DNA das amostras foi realizada no Laboratório de

Diagnóstico Molecular, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo,

Brasil, utilizando a técnica de nested PCR.

Para a primeira reação de PCR foi usado cerca de 0,5-1,0 µg do DNA genômico

e os pares de primers sense e antisense EHO descristos na Tabela 2 (BULLA et al., 2004).

Cada reação de PCR continha uma mistura de reação tampão 1X (50 µM KCl, 20 mM

Tris-HCl (pH 8,4), 0,1% Triton X-100), 1,75 mM de MgCl2, 0,2 mM dNTP's, 1 µM de

primers PCR, 0,625 U Taq DNA polimerase e água ultrapura autoclavada para um volume

final de 25 µL. O esquema de amplificação foi o seguinte: uma etapa inicial de

desnaturação a 94 °C por 10 minutos seguidos de 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 60

segundos, anelamento a 60 °C por 60 segundos e extensão a 72 °C por 60 segundos, com

uma etapa final a 72 °C por 4 minutos antes de cair para 4 °C.

A segunda reação de PCR foi idêntica ao primeiro PCR com exceção do DNA

molde e primers utilizados. O molde para a segunda reação de nested PCR foi uma alíquota

de 1,0 µL de reação positiva inicial e os primers utilizados também descristos na Tabela 2

foram os seguintes: EHCA sense / EHCA antisense específicos para Ehrlichia canis

(BULLA et al., 2004) e sense EHPL / EHPL antisense específico para Anaplasma platys

(João Pessoa Araújo Jr., comunicação pessoal). Para cada lote de PCR, água ultra-pura

autoclavada foi utilizada como molde e agiu como um controle negativo. Também dentro

de cada execução da PCR, o DNA genômico de um caso confirmado de Ehrlichia canis e

Anaplasma platys foi utilizado como controle positivo. Após a conclusão da segunda etapa

da PCR, 10µl do produto da reação foi separado em gel de agarose a 1,5% com brometo de

etídio adicionados em Tris-Borato EDTA (TBE), a 90 volts por aproximadamente 1 hora,

para a visualização pela eletroforese.

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27

Tabela 2. Sequencia de primers selecionados para a amplificação do fragmento do gene 16S RNAr de Ehrlichia pela nested PCR.

Fonte: *Bula et al., 2004/**João Pessoa Araújo Jr., comunicação pessoal.

Primer Agente etiológico

Seqüência de Primer 5’-3’

Pares de base (pb)

De-a (pb)

EHO sense E. spp AGAACGAACGCTGGCGGCAAGCC*

EHO antisense E. spp CGTATTACCGCGGCTGCTGGC* 478 pb 13 – 490

EHCA sense E. canis CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGC*

EHCA

antisense

E. canis TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT* 389 pb 58 – 446

EHPL sense A. platys TTTTTGTCGTAGCTTGCTATGATA**

EHPL antisense A. platys TGTGGGTACCGTCATTATCTTCCCCA** 384 pb 49 – 432

4.6 Análise Estatística

Os resultados do esfregaço sanguíneo e nested PCR utilizando papa leucocitária

(PL), mononucleares (M), granulócitos (G) e coágulo sanguíneo (CS) foram comparados

com os resultados da nested PCR utilizando sangue total (ST), que foi considerado o teste

padrão-ouro. Foi calculado sensibilidade e indicador Kappa, utilizando o programa Dag

Stat (MACKINNON, 2000). O teste de hipótese foi feito com o teste de McNemar, com

um nível de significância de 5%. Os valores de referência do Kappa foram interpretados da

senguinte forma: (<0) nenhuma concordância, (0-0.19) concordância pobre, (0.20-039)

concordância fraca, (0.40-0.59) concordância moderada, (0.60-0.79) concordância

substancial, (0.80-1.00) concordância quase perfeita (LANDIS & KOCK, 1977)

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28

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas

estão detalhados na Tabela 3 para as 24 amostras coletadas.

Tabela 3. Resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas das amostras do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos cães com sinais de Erliquiose.

* não foi feito

Na pesquisa feita em esfregaços sanguíneos, das 22 amostras analisadas 8

(36,3%) apresentaram mórulas ou inclusões para Ehrlichia, sendo a positividade

confirmada pela nested PCR de ST. Todos os animais positivos no esfregaço sanguíneo

amplificaram DNA para Erlichia ou Anaplasma em pelo menos uma fração das amostras

na nested PCR.

Vários autores relatam a baixa sensibilidade do diagnóstico pelo esfregaço

sanguíneo (NAKAGHI et al., 2008; RAMOS, 2009; UENO et al., 2009). Neste trabalho, a

sensibilidade foi baixa (46,6%), porém maior do que a observada por Meneses et al. (2008)

Nº de identicação do animal

Esfregaço sanguíneo (E. spp.)

PCR Sangue total

(ST)

PCR Granulócitos

(G)

PCR Mononucleares

(M)

PCR Papa de leucócitos

(PL)

PCR Coágulo

sanguíneo (C)

01 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo *

02 Negativo Ehrlichiacanis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis *

03 Negativo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo

04 Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis *

05 Negativo Negativo * * Negativo Negativo

06 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo *

07 Negativo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo *

08 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

09 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo *

10 Negativo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis * Ehrlichia canis

11 Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis *

12 Positivo Ehrlichia canis * * Ehrlichia canis/ Anaplasma platys

Anaplasma platys

13 Positivo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Negativo

14 Negativo Anaplasma platys Negativo Negativo Negativo Anaplasma platys

15 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

16 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo

17 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

18 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

19 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo

20 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo

21 Negativo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Negativo

22 * * * * * Negativo

23 * * * * * Ehrlichia canis

24 Positivo * * * * Ehrlichiacanis

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29

em Salvador e região metropolitana (5,33% para Ehrlichia canis), por Ramos et al. (2009)

em Recife-PE (9% e 21% para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, respectivamente) e por

Nakaghi et al. (2008), em Jaboticabal, SP (3,3%). A alta sensibilidade da PCR foi relatada

por Mcbride et al. (1996) e Wen et al. (1997).

Das 14 (63,6%) amostras negativas no esfregaço sanguíneo, 8 (57,15%) foram

falso negativas, apresentando-se positivas na nested PCR de ST. Ramos et al. (2009)

observou uma proporção maior de falso negativos no exame direto em relação à nested

PCR para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, concordando com os resultados encontrados

no presente trabalho. O teste Kappa indicou concordância fraca entre a presença de

mórulas em esfregaços sanguíneos e a nested PCR, mostrando uma diferença significativa

(p = 0,0133) para o esfregaço sanguíneo como demonstrado na Tabela 4. Todas as

amostras negativas na nested PCR de ST foram negativas no esfregaço sanguíneo, podendo

ser justificados pela subjetividade do exame direto, devido a curta duração de parasitemia e

da pouca sensibilidade da técnica como método de diagnóstico da infecção (MENESES, et

al., 2008).

Tabela 4. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e esfregaço sanguíneo na detecção de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica de hemoparasitoses.

PCR (ST) Esfregaço sanguíneo

Total Positivo Negativo

Positivo 7 8 15

Negativo 0 6 6

Total 7 14 21

Qui - quadrado de McNemar (p = 0, 0133) Kappa = 0, 3333

A amplificação do DNA de Ehrlichia e/ou Anaplasma pela nested PCR de ST

foi confirmada em 15/21 (71,4%) amostras, apenas 6/21 (28,5%) foram negativas, como

demonstradas na Figura 3.

Dos 15 animais positivos, em 7 (46,4%) foi amplificado DNA de Ehrlichia

canis e apenas 1 (6,6%) para Anaplasma platys. No estudo feito por Ramos et al. (2009),

32% (32/100) dos animais analisados pela nested PCR apresentavam-se infectados por

Ehrlichia canis e Anaplasma platys. Esta última não é o principal agente etiológico de

erliquiose no Brasil, ao contrário do observado no Chile, que tem como agente etiológico

principal a Anaplasma platys (ABARCA et al., 2007).

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30

Figura 3. Eletroforese em gel de agarose (1,5%) apresentando os resultados da nested PCR para detecção do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis. Caneleta 1: marcador de pares de base (pb) 100pb; canaleta 2 a 5: amostras de DNA extraído a partir de sangue total de animais com suspeita clínica de erliquiose; canaleta 6: controle positivo; caneleta 7: controle negativo da reação de PCR; caneleta 8: controle negativo da reação de nested. Fonte: Laboratório de Diagnóstico Molecular – UNESP, campus de Botucatu.

Em 7 (46,6%) amostras não houve amplificação na segunda reação de PCR, não

sendo possível identificar a espécie. Isto pode ter ocorrido em função da infecção destes

animais por outra espécie que não possa ser identificada com os primers utilizados para

Ehrlichia canis e Anaplasma platys, como a Ehrlichia chaffeensis, já que em cinco desses

animais havia mórulas no esfregaço de sangue.

Foram positivas para Ehrlichia canis 3/19 (15,8%) amostras de G, 6/19 (31,6%)

amostras de M, 6/20 (30%) amostras de PL e 3/17 (17,6%) amostras de CS.

Anaplasma platys foi confirmado apenas em 2/17 (11,7%) amostras de CS. Um

animal apresentou co-infecção de Ehrlichia canis e Anaplasma platys. Este resultado pode

ser justificado pelo fato de que a Anaplasma platys infecta preferencialmente plaquetas,

podendo sugerir que o CS é a melhor amostra para se identificar esta espécie.

Onze animais foram submetidos à PCR de todas as frações (ST, G, M, PL, CS), em

7 (76,6%) a espécie identificada foi Ehrlichia Canis, com 2 (18,1%) animais positivos por

CN

CN

CP

AMOSTRAS

PM

500 pb

400 pb

389 pb

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31

fração (ST, M e PL). Entre os 11 animais, em apenas 1 (9%) foi diagnosticada Anaplasma

platys nas frações de ST e CS.

Através do teste qui- quadrado de McNemar foi avaliado a sensibilidade diagnóstica

das frações (G, M, PL, CS) comparada ao ST. Quando os resultados do sangue total foram

comparados com os das frações de M e PL, a sensibilidade foi de 42,86% e com as frações

de G e CS foi de 21,43% e 33,33%, respectivamente.

Pelo teste kappa, as frações M, PL e CS apresentaram concordância fraca

comparado ao ST (Tabelas 5, 6, 7 e 8) e concordância pobre com a fração de G. Houve

significância estatística entre todos os testes.

Tabela 5. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de mononucleares (M) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.

PCR (ST) PCR (M)

Total Positivo Negativo

Positivo 6 8 14

Negativo 0 5 5

Total 6 13 19

Qui - quadrado de McNemar (p = 0, 0133) Kappa = 0, 2830

Tabela 6. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de granulócitos (G) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.

PCR (ST) PCR (G)

Total Positivo Negativo

Positivo 3 11 14

Negativo 0 5 5

Total 3 16 19

Qui - quadrado McNemar (p = 0,0026) Kappa = 0, 1255

Tabela 7. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e papa leucocitária (PL) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.

PCR (ST) PCR (PL)

Total Positivo

Negativo

Positivo 6 8 14

Negativo 0 6 6

Total 6 14 20

Qui - quadrado McNemar (p = 0, 0133) Kappa = 0, 3103

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32

Tabela 8. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e coágulo de sangue (CS) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.

PCR (ST) PCR (CS)

Total Positivo Negativo

Positivo 3 6 9

Negativo 0 5 5

Total 3 11 14

Qui - quadrado McNemar (p = 0, 0412) Kappa = 0, 2632

Estes resultados indicam uma maior sensibilidade diagnóstica da amostra de ST

em relação às outras frações analisadas. A sensibilidade foi superior aos resultados

encontrados por Nakaghi et al. (2008) que detectou pela mesma técnica 53,3% de amostras

positivas para Ehrlichia canis utilizando sangue circulante. A maior sensibilidade do

sangue total comparada às demais frações deve-se a presença de riquetsias livres no plasma

(LI & WINSLOW, 2003).

A co-infecção ocorrida em uma das amostras foi proveniente de Patos-PB, sendo o

primeiro relato de identificação por técnicas moleculares de Anaplasma platys no Estado

da Paraíba.

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7 CONCLUSÃO

O sangue total (ST) é a melhor fonte de ácido desoxirribonucleico (DNA) para o

diagnóstico de Ehrlichia pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR),

entretanto uma análise com um maior número de amostras ainda é necessária para avaliar

se o coágulo é mais sensível para identificar Anaplasma platys.

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