ELAINE FERNANDA DA SILVA
112
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CONTRIBUIÇÃO DO NÚCLEO PRÉ ÓPTICO MEDIANO E DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS A1 NO DESENVOLVIMENTO DA HIPERTENSÃO ARTERIAL ELAINE FERNANDA DA SILVA GOIÂNIA – GO 2013
Transcript of ELAINE FERNANDA DA SILVA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
CONTRIBUIÇÃO DO NÚCLEO PRÉ ÓPTICO MEDIANO E
DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS A1 NO
DESENVOLVIMENTO DA HIPERTENSÃO ARTERIAL
ELAINE FERNANDA DA SILVA
GOIÂNIA – GO
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) GPT/BC/UFG
S586c
Silva, Elaine Fernanda.
Contribuição do núcleo pré óptico mediano e dos neurônios noradrenérgicos A1 no desenvolvimento da hipertensão arterial [manuscrito] / Elaine Fernanda da Silva. – 2013.
xix, 110f. : il., figs, tabs. Orientador: Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Ciências Biológicas, 2013. Bibliografia.
Inclui lista de figuras, tabelas, abreviaturas e siglas. Apêndices. 1. Hipertensão arterial. 2. Neurônios A1. 3. Hipernatremia. I.
Título.
CDU: 616.12-008.331.1
ELAINE FERNANDA DA SILVA
CONTRIBUIÇÃO DO NÚCLEO PRÉ ÓPTICO MEDIANO E
DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS A1 NO
DESENVOLVIMENTO DA HIPERTENSÃO ARTERIAL
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Biologia do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Goiás como requisito para a obtenção
do título de Mestre em Biologia.
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino
Departamento de Ciências Fisiológicas – Universidade Federal de
Goiás
GOIÂNIA – GO
2013
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ x ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Elaine Fernanda da Silva
E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ ]Sim [ x ] Não
Vínculo empregatício do autor: Bolsista
Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Sigla: Capes
País: Brasil UF: GO CNPJ: 00889834/0001-08
Título: Contribuição do Núcleo Pré Óptico Mediano e dos Neurônios Noradrenérgicos A1 no Desenvolvimento da Hipertensão Arterial
Palavras-chave: Núcleo Pré Óptico Mediano; Neurônios A1; CVLM; Hipertensão; Hipernatremia
Título em outra língua: Contribution of the Median Preoptic Nucleus and A1 Noradrenergic Neurons in the Development of Hypertension
Palavras-chave em outra língua: Median Preoptic Nucleus; A1 Neurons; CVLM; Hypertension; Hypernatremia
Área de concentração: Biologia Celular
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 28/02/2013
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós Graduação em Biologia
Orientador (a): Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino
E-mail: [email protected]
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1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.
CONTRIBUIÇÃO DO NÚCLEO PRÉ ÓPTICO MEDIANO E
DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS A1 NO
DESENVOLVIMENTO DA HIPERTENSÃO ARTERIAL
Presidente da Banca:
Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino
Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Goiás.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Élson Alves Costa.
Prof. Adjunto do Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Goiás.
Profª. Drª. Débora Simões de Almeida Colombari
Profª. Adjunta do Departamento de Fisiologia e Patologia, Universidade Estadual Paulista
Júlio de Mesquita Filho.
Prof. Dr. Cirano José Ulhoa
Prof. Adjunto do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal
de Goiás.
Prof. Dr. Diego Basile Colugnati
Prof. Adjunto do Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Goiás.
A meus pais,
Carlos Fernandes Silva
Rosa Gonçalves Silva
A meu irmão,
Leandro Fernandes Silva
Obrigada pela confiança demonstrada e apoio incondicional.
“As nuvens mudam sempre de posição, mas são sempre nuvens no céu. Assim
devemos ser todos os dias, mutantes, porém leais [ao que aprendemos].”
Paulo Beleki
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Gustavo Rodrigues Pedrino pela oportunidade oferecida. Obrigada
pelo voto de confiança e pela forma como conduziu a orientação, o que contribuiu
significativamente para o meu crescimento e amadurecimento na carreira
acadêmica.
Às alunas do Laboratório de Fisiologia Autonômica e Cardíaca pela
amizade e companheirismo. Obrigada Aliane, Nathalia Odinha, Yara, Ludmila,
Aline, Marina e Rúbia pelos momentos únicos que vivemos juntas e pelas várias
gargalhadas compartilhadas. Obrigada pela oportunidade de conhecê-las. Pelo
apoio nos períodos de dificuldade, pela cumplicidade e pela paciência. Cada uma
seguirá seu caminho, porém, particularmente, aonde quer que eu vá sempre me
lembrarei de todas vocês com imenso carinho e amor.
Aos amigos James e Vanessa Amaral, os quais costumo definir como
anjos. Anjos que Deus colocou em minha vida. Se anjos existem, acho que
devem ser como vocês, seres humildes, sábios e dispostos a ajudar. Obrigada
pelo incentivo, pela confiança e pelos sábios conselhos.
Aos professores do Departamento de Ciências Fisiológicas, em especial ao
Prof. Élson Alves Costa, por quem tenho muito respeito e admiração. Obrigada
pelos vários ensinamentos e pelas discussões sobre Ciência, os quais sempre
levarei comigo.
A todos os colegas pós graduandos e aos funcionários da secretaria da pós
graduação, em especial à Laís, Iziara e Gleice, pela atenção e apoio.
Às minhas tias Neuza e Nilza e à prima Camila pelo incentivo, carinho e
confiança. Pessoas que de modo digno e simples conduzem suas vidas, sendo
exemplos a serem seguidos.
“A admiração é filha da ignorância, porque ninguém se
admira senão das coisas que ignora, principalmente se são
grandes; e mãe da ciência, porque admirados os homens
das coisas que ignoram, inquirem e investigam as causas
delas até as alcançar, e isto é o que se chama ciência.”
Padre António Vieira
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 9
2.1 Objetivo Geral.............................................................................................. 10
2.2 Objetivos Específicos................................................................................... 10
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................ 11
3.1 Modelos experimentais................................................................................ 12
3.2 Lesão dos grupamentos neuronais noradrenérgicos A1............................. 12
3.3 Registro da pressão arterial média e frequência cardíaca nos animais
não anestesiados........................................................................................ 13
3.4 Teste de baroreflexo e quimioreflexo........................................................... 13
3.5. Infusão de salina hipertônica....................................................................... 14
3.6. Registro da pressão arterial média e da frequência cardíaca nos animais
anestesiados................................................................................................ 14
3.7. Registro do fluxo sanguíneo renal e aórtico e da condutância vascular
renal e aórtica nos animais anestesiados.................................................... 14
3.8. Dot Blot........................................................................................................ 15
3.9. Nanoinjeções no MnPO.............................................................................. 16
3.10. Histologia.................................................................................................... 16
3.11. Análise estatística..................................................................................... 18
4. RESULTADOS................................................................................................ 19
4.1. Envolvimento da neurotransmissão adrenérgica no Núcleo Pré Óptico
Mediano sobre os parâmetros cardiovasculares em ratos normotensos e
espontaneamente hipertensos........................................................................... 20
4.2. Participação dos neurônios noradrenérgicos A1 na regulação da pressão
arterial em ratos normotensos e espontaneamente hipertensos ...................... 25
4.2.1. Lesão dos neurônios catecolaminérgicos bulbares induzida por
nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-DβH na CVLM.....................
25
4.2.2. Efeito da lesão da região CVLM sobre a PAM e FC basais em
ratos não anestesiados........................................................................ 33
4.2.3. Efeito da lesão da região CVLM sobre a PAM, FC, FSR e CVR
basais em ratos não anestesiados....................................................... 34
4.2.4. Análise da lesão dos neurônios noradrenérgicos A1 sobre o
baroreflexo........................................................................................... 36
4.2.5. Análise da lesão dos neurônios noradrenérgicos A1 sobre o
quimioreflexo........................................................................................ 38
4.2.6. Participação do grupamento noradrenérgico A1 na resposta
pressora induzida por hipernatremia aguda......................................... 39
5. DISCUSSÃO..................................................................................................... 45
6. CONCLUSÃO.................................................................................................. 52
7. REFERÊNCIAS............................................................................................... 54
APÊNDICE
1. Artigo
1.1. A1 NORADRENERGIC NEURONS LESIONS REDUCE NATRIURESIS
AND HYPERTENSIVE RESPONSES TO HYPERNATREMIA
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Valores basais médios ± EPM da pressão arterial média (PAM),
frequência cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo
aórtico (FSA), condutância vascular renal (CVR) e condutância vascular
aórtica (CVA) dos ratos normotensos (NT) e espontaneamente
hipertensos (SHR) que receberam nanoinjeções no MnPO......................
21
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Desenho de secções coronais do bulbo de ratos extraído do atlas de
Paxinos e Watson (1998) mostrando a localização do Núcleo do Trato
Solitário (NTS) e das regiões Caudoventrolateral (CVLM) e
Rostroventrolateral (RVLM) do bulbo representadas pelos círculos; CC
(canal central); 4º V (4º Ventrículo)...........................................................
4
Figura 2 Desenho esquemático de um corte sagital do encéfalo de rato
modificado a partir do atlas de Paxinos e Watson (1998) mostrando as
aferências do Núcleo do Trato Solitário (NTS) e da região
Caudoventrolateral (CVLM) do bulbo para o Núcleo Pré Óptico Mediano
(MnPO); OVLT (Órgão Vasculoso da Lâmina Terminal); SFO (Órgão
Subfornical).................................................................................................
6
Figura 3 Corte coronal mostrando um típico centro de nanoinjeção de fentolamina
e soro fisiológico no MnPO (seta); ca (comissura anterior)........................
20
Figura 4 Traçado típico das alterações na pressão arterial pulsátil (PAP), fluxo
sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA) e na frequência
cardíaca (FC), induzidas por nanoinjeção de veículo (Soro Fisiológico;
0,15 M) e fentolamina (6,3 mM) no MnPO de ratos normotensos (A) e
espontaneamente hipertensos (B). A linha tracejada representa o
momento das nanoinjeções.......................................................................
22
Figura 5 Média ± EPM das variações na pressão arterial média (Δ PAM; A),
frequência cardíaca (Δ FC; B), fluxo sanguíneo renal (Δ% FSR; C),
fluxo sanguíneo aórtico (Δ% FSA; D), condutância vascular renal
(Δ%CVR; E) e condutância vascular aórtica (Δ%CVA; F), devido a
nanoinjeções de soro fisiológico (0,15 M) e fentolamina (6,3 mM) no
MnPO em ratos normotensos (NT) e hipertensos (SHR). † diferente do
soro, * diferente da fentolamina no normotenso; p < 0,05.........................
23
Figura 6 Verificação histológica dos grupamentos catecolaminérgicos A2 (NTS),
A1 (CVLM) e C1 (RVLM) dos ratos normotensos que receberam
nanoinjeções bilaterais de saporina (grupo sham) ou saporina-anti-DH
na região CVLM. Fotomicrografia de cortes coronais (40m) do bulbo
corados por técnicas de imunoistoquímica. As setas indicam marcação
neuronal catecolaminérgica.......................................................................
27
Figura 7 Média EPM do número de células TH positivas localizadas nas
regiões caudoventrolateral (CVLM; A1) e rostroventrolateral (RVLM; C1)
e na superfície dorsal (NTS; A2 e C2) do bulbo dos animais
normotensos que receberam nanoinjeções de saporina-anti-DH (lesão
A1) ou de apenas saporina (sham) na região CVLM (A). Podemos
perceber que a nanoinjeção de saporina-anti-DH promoveu reduções
significantes no número de células TH positivas do grupamento A1
(redução 81%), entretanto não houve alterações nos grupamentos A2
e C2 (redução < 0%) e C1 (redução 10%; B). † diferente do controle;
p < 0,05......................................................................................................
28
Figura 8 Verificação histológica dos grupamentos catecolaminérgicos A2
(NTS), A1 (CVLM) e C1 (RVLM) dos ratos espontaneamente
hipertensos que receberam nanoinjeções bilaterais de saporina (grupo
sham) ou saporina-anti-DH na região CVLM. Fotomicrografia de
cortes coronais (40m) do bulbo corados por técnicas de
imunoistoquímica. As setas indicam marcação neuronal
catecolaminérgica...................................................................................
30
Figura 9 Média EPM do número de células TH positivas localizadas nas
regiões caudoventrolateral (CVLM; A1) e rostroventrolateral (RVLM; C1)
e na superfície dorsal (NTS; A2 e C2) do bulbo dos SHRs que
receberam nanoinjeções de saporina-anti-DH (lesão A1) ou de apenas
saporina (sham) na região CVLM (A). Podemos perceber que as
nanoinjeções de saporina-anti-DH promoveram reduções significantes
no número de células TH positivas do grupamento A1 (redução 75%),
entretanto não houve alterações nos grupamentos A2 e C2 (redução
11% e < 0%, respectivamente) e C1 (redução 6%; B). † diferente do
controle; p < 0,05.......................................................................................
31
Figura 10 Observação da expressão da enzima TH pela técnica de Dot Blot no
MnPO e córtex dos ratos normotensos (A) e espontaneamente
hipertensos (B) que receberam nanoinjeções bilaterais de saporina
(grupo sham) ou saporina-anti-DH na região CVLM. As marcações na
membrana de nitrocelulose representam os níveis da enzima TH.
Fotografia de um corte coronal do cérebro mostrando a retirada de
massa tecidual do MnPO (círculo) e do córtex (seta; C)...........................
32
Figura 11 Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência
cardíaca (FC; B) nos animais normotensos não anestesiados. †
diferente do controle; p < 0,05...................................................................
33
Figura 12 Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência
cardíaca (FC; B) nos animais hipertensos não anestesiados. p < 0,05....
34
Figura 13 Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A), frequência cardíaca
(FC; B), fluxo sanguíneo renal (FSR; C) e condutância vascular renal
(CVR; D) nos animais normotensos anestesiados. p < 0,05.....................
35
Figura 14 Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A), frequência cardíaca
(FC; B), fluxo sanguíneo renal (FSR; C) e condutância vascular renal
(CVR; D) nos animais hipertensos anestesiados. p < 0,05.......................
36
Figura 15 Índice do baroreflexo dos animais normotensos expresso pela razão
entre as variações da FC e PAM. p < 0,05................................................
37
Figura 16 Índice do baroreflexo dos SHRs expresso pela razão entre as variações
da FC e PAM. † diferente do controle. p < 0,05.........................................
37
Figura 17 Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e da
frequência cardíaca (FC; B) dos animais normotensos no teste de
quimioreflexo. p < 0,05..............................................................................
38
Figura 18 Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e da
frequência cardíaca (FC; B) dos animais hipertensos no teste de
quimioreflexo. † diferente do controle; p < 0,05.........................................
39
Figura 19 Traçado típico das alterações provocadas na PAP (pressão arterial
pulsátil), PAM (pressão arterial média) e FC (frequência cardíaca)
induzidas por infusão de salina hipertônica (3M) em ratos normotensos
sham (A) e lesionados (B) não anestesiados............................................
40
Figura 20 Média EPM das variações da pressão arterial média ( PAM; A) e da
frequência cardíaca ( FC; B) dos ratos normotensos em resposta à
infusão de solução salina hipertônica (traço vertical em preto no tempo
0), submetidos à nanoinjeção do complexo saporina-anti-DH (lesão
A1; n=11) ou saporina (sham; n=8) na região CVLM. * diferente do
tempo 0; † diferente do sham, ambos p < 0,05..........................................
41
Figura 21
Traçado típico das alterações provocadas na PAP (pressão arterial
pulsátil), PAM (pressão arterial média) e FC (frequência cardíaca)
induzidas por infusão de salina hipertônica (3 M) em ratos hipertensos
sham (A) e lesionados (B) não anestesiados............................................
43
Figura 22 Média EPM das variações da pressão arterial média ( PAM; A) e da
frequência cardíaca ( FC; B) dos ratos hipertensos em resposta à
infusão de solução salina hipertônica (traço vertical em preto no tempo
0), submetidos à nanoinjeção do complexo saporina-anti-DH (lesão
A1; n=6) ou saporina (sham; n=6) na região CVLM. * diferente do tempo
0; ambos p < 0,05......................................................................................
44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4º V
Ang II
ANP
AP5
bpm
ca
CC
CVLM
CVA
CVR
DATASUS
DβH
EPM
FC
FSA
FSR
GABA
mmHG
MnPO
Quarto Ventrículo
Angiotensina II
Peptídeo Natriurético Atrial
Ácido D, L-2-amino-5-fosfonopentanoico
batimentos por minuto
comissura anterior
Canal Central
Região Caudoventrolateral do Bulbo
Condutância Vascular Aórtica
Condutância Vascular Renal
Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde
Dopamina-β-Hidroxilase
Erro Padrão da Média
Frequência Cardíaca
Fluxo Sanguíneo Aórtico
Fluxo Sanguíneo Renal
Ácido Gama-Aminobutírico
milímetros de Mercúrio
Núcleo Pré Óptico Mediano
Na+
NaCl
NMDA
NT
NTS
OVLT
Sódio
Cloreto de Sódio
N-metil D-Aspartato
Normotenso
Núcleo do Trato Solitário
Órgão Vasculoso da Lâmina Terminal
PA
PAM
PAP
PAP
PVN
Pressão Arterial
Pressão Arterial Média
Pressão Arterial Pulsátil
Pressão Arterial Pulsátil
Núcleo Paraventricular do Hipotálamo
RVLM
SB
SH
SHR
SNC
SOF
SON
SUS
TH
UFG
VLM
Região Rostroventrolateral do Bulbo
Sensibilidade Baroceptora
Salina Hipertônica
Ratos Espontaneamente Hipertensos
Sistema Nervoso Central
Órgão Subfornical
Núcleo Supra Óptico
Sistema Único de Saúde
Tirosina Hidroxilase
Universidade Federal de Goiás
Região Ventrolateral do Bulbo
RESUMO
Neurônios noradrenérgicos da região caudoventrolateral do bulbo (CVLM;
grupamento A1) estão envolvidos na regulação cardiovascular e do volume
circulante. Estes neurônios recebem informações provenientes dos
baroreceptores arteriais e de receptores cardiopulmonares de volume. Ademais,
os neurônios A1 estão reciprocamente ligados com regiões hipotalâmicas
envolvidas com o controle cardiovascular, incluindo o Núcleo Pré Óptico Mediano
(MnPO). O presente estudo buscou determinar a participação da
neurotransmissão adrenérgica no MnPO e dos neurônios do grupamento
noradrenérgico A1 sobre os parâmetros cardiovasculares em ratos normotensos
(NT) e espontaneamente hipertensos (SHR). Ratos Wistar e SHR receberam
nanoinjeções de Fentolamina (6,3 mM; antagonista α adrenérgico; 100 nL) no
MnPO e tiveram os valores de pressão arterial média (PAM), frequencia cardíaca
(FC), fluxo sanguíneo renal (FSR) e aórtico (FSA) e condutância vascular renal
(CVR) e aórtica (CVA) registrados. Em outros experimentos, os animais
receberam nanoinjeções (100 nL) bilaterais de saporina-anti-dopamina-β-
hidroxilase (0,105 ng.nL-1) na região da CVLM. Esses ratos tiveram os parâmetros
cardiovasculares basais registrados. Foram submetidos aos testes de baroreflexo
e à infusão intravenosa de salina hipertônica (SH). Por fim, amostras teciduais do
MnPO e do córtex destes animais foram retiradas para a detecção dos níveis da
enzima tirosina hidroxilase (TH) no MnPO. Os resultados obtidos demonstraram
que o bloqueio da neurotransmissão adrenérgica no MnPO resultou em queda da
PAM dos ratos hipertensos (-14,3 ± 6 mmHg) e aumento na CVR e CVA (9,6 ± 1,9
% do basal e 9,8 ± 3,4 % do basal, respectivamente). A lesão provocada por
nanoinjeções de saporina-anti-DβH na região CVLM ocasionou uma redução de
81% dos neurônios A1 nos ratos normotensos e 75% nos hipertensos.
Observamos uma redução nos níveis da enzima TH no MnPO dos animais com
lesão de A1. A lesão dos neurônios A1 e a consequente diminuição nos níveis de
TH no MnPO não provocaram reduções na PAM dos ratos normotensos (114 ±
1,9 mmHg, n=11) e hipertensos (170,3 ± 7,8 mmHg, n=7). Os valores basais da
FC dos ratos NT revelaram a ocorrência de taquicardia (396,0 ± 13,4 bpm),
porém, esse aumento na FC não foi provocado por alterações no reflexo
baroceptor. Ademais, a infusão de SH nos animais NT sham provocou uma
sustentada resposta pressora (36 ± 3 e 11 ± 1,8 mmHg em relação ao basal, 10 e
90 minutos após a infusão SH, respectivamente). Enquanto nos ratos NT
submetidos à lesão do grupamento noradrenérgico A1, a infusão de SH promoveu
uma resposta pressora atenuada (18 ± 1,4 em relação ao basal, 10 minutos após
SH), retornando posteriormente aos valores basais (3 ± 1,4 mmHg em relação ao
basal, 70 minutos após SH). Nos SHRs, a infusão de SH provocou aumento
transitórios (<20 min) na PA de ratos sham (19 ± 2,9 mmHg em relação ao basal,
10 minutos após a infusão SH) e lesionados (12 ± 1,5 mmHg em relação ao basal,
10 minutos após a infusão SH). Em conjunto, os resultados obtidos no presente
trabalho evidenciam a importância da neurotransmissão adrenérgica no MnPO na
manutenção da hipertensão arterial nos SHR. Ademais, a inervação adrenérgica
proveniente do grupamento A1 parece não estar relacionada com a hipertensão
arterial observada nestes animais. Entretanto, os resultados evidenciam a
participação dos neurônios A1 na hipertensão arterial induzida pela sobrecarga de
Na+ em ratos NT.
Palavras chave: Núcleo Pré Óptico Mediano; Neurônios A1; CVLM; Hipertensão;
Hipernatremia.
ABSTRACT
Noradrenergic neurons of the caudoventrolateral medulla (CVLM; grouping
A1) are involved in cardiovascular regulation and of the fluids. These neurons
receive information from arterial baroreceptors and cardiopulmonary volume
receptors. Furthermore, A1 neurons are reciprocally connected with hypothalamic
regions involved in cardiovascular control, including the Median Preoptic Nucleus
(MnPO). The present study sought to determine the involvement of the MnPO and
A1 noradrenergic neurons on cardiovascular parameters in normotensive (NT) and
hypertensive rats (SHR). Wistar and SHR rats received nano-injections of
Phentolamine (6.3 Mm; α-adrenergic antagonist; 100 nL) in MnPO and had mean
arterial pressure (MAP), heart rate (HR), aortic (ABF) and renal blood flow (RBF)
and aortic (AVC) and renal vascular conductance (RVC) registered. In another
experiments, the rats received nano-injections (100 nL) bilateral saporin-anti-
dopamine-β-hydroxylase (0.105 ng.nL-1) in the region of the CVLM. These rats
had cardiovascular parameters registered and were submitted to baroreflex and
hypertonic saline (HS) infusion. Finally, samples from these animals were
removed MnPO for detecting levels of the enzyme tyrosine hydroxylase (TH) in
MnPO. The results demonstrated that adrenergic neurotransmission in MnPO
blocking resulted in decrease in the MAP of SHR (-14.7 ± 6 mmHg) and increased
in the RVC and AVC (9,6 ± 1,9 % do basal e 9,8 ± 3,4 % do basal, respectively).
The lesion caused by nanoinjections of anti-DβH-saporin in the region CVLM
resulted in A1 neurons reduction by 81% in normotensive rats and 75% in the
hypertensive. We observed a reduction in levels of the enzyme TH in MnPO in
animals with lesions of A1. The lesion of neurons A1 and the consequent
decrease in the levels of TH in the MnPO did not cause reductions in MAP of
normotensive rats (114 ± 1.9 mmHg) and hypertensive (170.3 ± 7.8 mmHg). The
baseline HR of NT rats revealed the occurrence of tachycardia (396.0 ± 13.4
bpm), however, the increase in HR was not caused by changes in the
baroreceptor reflex. The infusion of HS, in NT animals sham, caused a sustained
pressor response (36 ± 3 and 11 ± 1.8 mmHg from baseline, at 10 and 90 min
after HS, respectively). In NT rats treated with anti-DH-saporin, the infusion of HS
caused an attenuated pressor response (18 ± 1.4 baseline, at 10 min after HS),
followed by a return to baseline (3 ± 1.4 mmHg from baseline, at 70 min after HS).
In SHRs, the HS infusion caused transient increased (<20 min) in the PA of sham
(19 ± 2.9 mmHg baseline, at 10 min after HS) and lesioned rats (12 ± 1.5 mmHg
baseline, at 10 min after HS). Together, the results show the importance of
adrenergic neurotransmission in the MnPO in blood pressure maintenance in
SHR. Furthermore, the adrenergic innervation from the grouping A1 seems to be
no related with hypertension observed in these animals. However, the data
indicate the involvement of neurons A1 in hypertension induced by sodium
overload in NT rats.
Keywords: Median Preoptic Nucleus; Neurons A1; CVLM; Hypertension;
Hypernatremia.
1
Introdução
2
A hipertensão arterial, caracterizada como uma patologia silenciosa e
crônica, representa um dos principais problemas mundiais de saúde pública.
Segundo a International Society of Hypertension (2012), em 2000 o número global
estimado de adultos vivendo com pressão arterial elevada era de 972 milhões. A
expectativa é de que esta patologia aumente consideravelmente nos próximos
anos e atinja 1,56 bilhões de indivíduos até 2025. Fatores associados ao estilo de
vida, como o sedentarismo, dieta rica em sal, consumo de tabaco, além do
envelhecimento da população, são razões que contribuem para a incidência desta
patologia.
No Brasil, estima-se que a hipertensão arterial essencial atinja
aproximadamente 23,3% da população brasileira (Ministério da Saúde do Brasil,
2012). Dados do Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde
(DATASUS, 2010) do Ministério da Saúde do Brasil indicam que as doenças
relacionadas ao sistema cardiovascular são as principais causas de mortalidade
da população brasileira. Em 2008, estas doenças foram responsáveis por 339.256
mortes, representando 31,8% do total geral dos óbitos no Brasil (DATASUS,
2010). Além do mais, neste mesmo ano, estas doenças causaram 1.096.888
internações hospitalares pelo Sistema Único de Saúde (SUS), o que resultou em
gastos aproximados de 1.627.311.414,94 reais, representando 14% do total geral
de gastos com internação pelo SUS (DATASUS, 2010).
A ontogênese da hipertensão arterial essencial não encontra-se totalmente
elucidada. No entanto, evidências sugerem um componente de origem
neurogênica (Lundin et al., 1984; Herzig et al., 1991; Sato et al., 2001). De fato, o
sistema nervoso central (SNC) está envolvido no controle da pressão arterial,
sendo sua participação muito discutida na patogênese da hipertensão.
A pressão arterial (PA) é rigorosamente regulada por variáveis
hemodinâmicas como o débito cardíaco e a resistência vascular periférica total.
Por meio de alterações destes parâmetros hemodinâmicos, o SNC exerce sua
função na modulação da pressão arterial. Dentre os principais moduladores
destacam-se os baroreceptores arteriais, os quais têm um papel crucial no
controle a curto prazo da pressão arterial. Neurônios dos baroreceptores
promovem aferências para o SNC, desencadeando ações inibitórias sobre as
3
descargas simpáticas, o que contribui na regulação da PA. Ademais,
quimioreceptores periféricos ativados por hipóxia e hipercapnia provocam um
aumento generalizado da atividade das eferências simpáticas quimiossensíveis
através de modulação central.
Com o desenvolvimento de novas técnicas experimentais, tornou-se
possível demonstrar a participação do sistema nervoso autonômico na
fisiopatologia da hipertensão arterial. Técnicas eletrofisiológicas e neuroquímicas
suscitaram evidências da ativação simpática sobre o coração, rins e vasos na
hipertensão essencial. Em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), estudos
demonstraram aumento da atividade do nervo simpático renal com concomitante
aumento na pressão arterial média (Judy & Farrell, 1979; Lundin et al., 1984).
Além disso, King e colaboradores (2008) demonstraram aumento na
concentração plasmática de noradrenalina, indicando hiperatividade simpática nos
ratos submetidos ao tratamento com de angiotensina II (Ang II) e Sal. Em
conjunto, estes resultados sugerem a participação direta do sistema nervoso
simpático no desenvolvimento e manutenção do estado hipertensivo em
diferentes modelos de hipertensão experimental.
Vias recíprocas entre o núcleo do trato solitário (NTS), a região
ventrolateral do bulbo (VLM) e o grupamento neuronal A5 no tronco encefálico,
além de várias áreas prosencefálicas, incluindo o núcleo paraventricular do
hipotálamo (PVN), o núcleo da estria terminal, o núcleo pré óptico mediano
(MnPO) e o núcleo central da amígdala, representam o substrato anatômico
envolvido na regulação cardiovascular (Guyenet, 1990).
Neurônios contidos na região VLM do bulbo também desempenham
importante papel na modulação cardiovascular. A porção rostral da região
ventrolateral (Figura 1) é ocasionalmente conhecida como área pressora devido a
largas elevações na pressão arterial desencadeada por aplicações de drogas
excitatórias (Guertzenstein, 1973; Allen et al., 1988; Andreatta et al., 1988; Sakai
& Dampney 1990). Dentre os diferentes tipos celulares, o grupamento neuronal
adrenérgico C1 da região rostroventrolateral do bulbo (RVLM) está envolvida com
as funções vasomotoras (McAllen, 1986), projetando-se diretamente sobre os
4
neurônios pré-ganglionares simpáticos localizados na coluna intermédio lateral da
medula espinhal (Ross et al., 1981; Tucker et al., 1987).
Figura 1. Desenho de secções coronais do bulbo de ratos extraído do atlas de Paxinos e Watson
(1998) mostrando a localização do Núcleo do Trato Solitário (NTS) e das regiões
Caudoventrolateral (CVLM) e Rostroventrolateral (RVLM) do bulbo representadas pelos círculos.
Siglas: CC (canal central); 4º V (4º Ventrículo).
A porção caudoventrolateral (CVLM; Figura 1) é referida por muitos autores
como área depressora devido à ocorrência de hipotensão causada por
microinjeções locais de substâncias excitatórias (Feldberg & Guertzenstein, 1976;
Guertzenstein & Lopes, 1984; Willette et al., 1987). Os neurônios da região CVLM
encontram-se espalhados ao longo de uma grande área no eixo rostrocaudal,
entre a região RVLM e a medula espinhal (Ross et al., 1985; Ruggiero et al.,
1994). Ademais, esta região apresenta ao menos duas populações celulares
distintas envolvidas com a regulação cardiovascular: os neurônios GABAérgicos e
os neurônios noradrenérgicos A1.
Os neurônios GABAérgicos da região CVLM promovem uma inibição tônica
dos neurônios vasomotores da região RVLM (Granata et al., 1986). Lesões ou
inativação desses neurônios ocasionam em hipertensão arterial fulminante devido
ao aumento da atividade simpática sobre os vasos e coração (Cravo et al., 1991;
5
Blessing et al., 1982). A estimulação química desses neurônios provoca
vasodilatação renal e mesentérica e bradicardia, resultando em hipotensão devido
à redução na atividade simpática (Blessing & Reis, 1982; Blessing & Reis, 1983;
Cravo et al., 1991; Willette et al., 1987).
A segunda população neuronal da região CVLM, demonstrada
originalmente por Dahlstroem & Fuxe (1964; apoud Cravo et al., 2011), é
constituída por células catecolaminérgicas. Estas células formam o grupamento
noradrenérgico A1. Várias evidências experimentais têm demonstrado a
importância dos neurônios A1 na integração dos mecanismos envolvidos na
regulação da pressão arterial e do volume circulante (Pedrino et al., 2006; Pedrino
et al., 2008). Estudos utilizando a expressão de genes de ativação imediata
demonstraram que os neurônios noradrenérgicos do grupamento A1 são ativados
por aumentos da osmolaridade ou do volume plasmático (Hochstenbach &
Ciriello, 1995; Buller et al., 1999; Howe et al., 2004; Godino et al., 2005).
Corroborando com estes resultados, a administração subcutânea, intraperitoneal
ou intravenosa de salina hipertônica aumenta a expressão de Fos no grupo A1,
indicando ativação neuronal (Hochstenbach & Ciriello, 1995; Howe et al., 2004).
Estudos demonstraram que lesões específicas do grupamento
noradrenérgico A1 abole a simpatoinibição e vasodilatação renal induzidas pela
sobrecarga de sódio em ratos anestesiados (Pedrino et al., 2008; Pedrino et al.,
2006). Estes resultados demonstraram a participação destes neurônios no
controle da atividade simpática e da pressão arterial em situações de aumento da
concentração plasmática de sódio e alterações no volume circulante.
Trabalhos neuroanatômicos demonstraram que células noradrenérgicas A1
e A2 (localizadas no NTS) recebem informações provenientes dos baroreceptores
arteriais e de receptores cardiopulmonares de volume (Day & Sibbald, 1990; Day
et al.,1992). Estes neurônios estão reciprocamente ligados com regiões
hipotalâmicas envolvidas com a regulação cardiovascular, hidroeletrolítica e
neuroendócrina, incluindo o núcleo pré óptico mediano (MnPO), o núcleo supra
óptico (SON), o órgão subfornical (SFO) e o núcleo paraventricular do hipotálamo
(PVN; Saper et al., 1983; Tucker et al., 1987; Ciriello 2013; Figura 2).
6
Figura 2. Desenho esquemático de um corte sagital do encéfalo de rato modificado a partir do
atlas de Paxinos e Watson (1998) mostrando as aferências do Núcleo do Trato Solitário (NTS) e
da região Caudoventrolateral (CVLM) do bulbo para o Núcleo Pré Óptico Mediano (MnPO). Siglas:
OVLT (Órgão Vasculoso da Lâmina Terminal); SFO (Órgão Subfornical).
Evidências experimentais demonstraram que os neurônios noradrenérgico
A1 representam uma das principais fontes da inervação noradrenérgica
encontrada no MnPO (Day et al., 1980; Tucker et al., 1987). A ativação elétrica
do grupamento A1 aumenta a liberação de noradrenalina no MnPO (Fernandez-
Galaz et al., 1994). Ademais, Tucker et at. (1987) evidenciaram que cerca de 80%
dos neurônios noradrenérgicos da região CVLM (grupamento A1) se projetam
para o PVN e o MnPO.
Corroborando esses dados, estudos de eletrofisiologia in vivo
demonstraram que as projeções dos neurônios noradrenérgicos A1 para regiões
hipotalâmicas possuem um caráter predominantemente excitatório (Day et al.,
1984; Kannan et al., 1984; Day & Sibbald, 1988; Day & Sibbald, 1989; Tanaka et
al., 1992; Saphier, 1993; Tanaka et al., 1997). Tanaka e colaboradores (1992)
demonstraram que a estimulação elétrica da região onde estão localizados os
neurônios A1 promove excitação mediada por adrenoceptores 1 e 2 de
neurônios localizados no MnPO.
7
Uma vez ativados, os neurônios do MnPO podem modular respostas
autonômicas e cardiovasculares a partir, principalmente, de suas projeções sobre
os neurônios do PVN. De fato, estudos eletrofisiológicos identificaram que
neurônios do MnPO que se projetavam sobre o PVN tinham sua atividade basal
aumentada em decorrência da infusão intravenosa de soluções hiperosmóticas
(Tanaka et al., 1995) ou de Ang II (Stocker & Toney 2005). Ademais, Yasuda e
colaboradores (2000) evidenciaram que o aumento da atividade simpática renal
induzida pela estimulação elétrica do MnPO foi reduzido por nanoinjeções
bilateral de lidocaína (anestésico local) no PVN.
Apesar da importância do MnPO nestas respostas vegetativas,
surpreendentemente, poucos estudos buscaram determinar a importância deste
núcleo no desenvolvimento da hipertensão arterial. Yamaguchi & Watanabe
(2004) demonstraram que nanoinjeções de um agonista não seletivo dos
receptores glutamatérgicos ((+)-1-aminociclopentano-trans-1,3-ácido
dicarboxílico) no MnPO produzem aumento na pressão arterial, frequência
cardíaca e na concentração plasmática de vasopressina.
Tanaka e colaboradores (1995) demonstraram aumento da atividade
espontânea dos neurônios localizados no MnPO em SHR. Ademais, em estudos
recentes Ployngam & Collister (2007 e 2008) demonstraram que a lesão
eletrolítica ou química do MnPO reduziu a hipertensão arterial em ratos
espontaneamente hipertensos.
Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a inibição do
MnPO por nanoinjeções de muscimol (agonista GABAérgico) promove queda da
pressão arterial em ratos das linhagens Wistar e SHR (Silveira et al., 2012). Foi
verificado uma resposta hipotensora significativamente maior nos animais
hipertensos, onde também observamos aumento da condutância vascular renal
indicando queda da atividade simpática renal. Estes dados apontam evidências
da participação do MnPO nas vias neuronais envolvidas no controle da pressão
arterial, indicando também sua participação na manutenção da hipertensão em
ratos com hipertensão genética. No entanto, os neurotransmissores excitatórios
envolvidos na hiperatividade do MnPO ainda não foram determinados.
8
Diante do exposto é lícito supor que as projeções excitatórias provenientes
dos neurônios noradrenérgicos bulbares A1 poderiam contribuir para o aumento
da atividade nos neurônios do MnPO, o que resultaria em aumento da atividade
simpática e consequente hipertensão arterial. Assim, o presente trabalho buscou
determinar o envolvimento do MnPO e dos neurônios noradrenérgicos A1 na
fisiopatologia da hipertensão arterial. Ademais, procuramos verificar o
envolvimento dos neurônios A1 na resposta pressora à hipernatremia aguda, visto
que aumentos na osmolaridade plasmática e na concentração de Na+ podem
contribuir para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, inclusive a
hipertensão.
9
Objetivos
10
2.1. Objetivo Geral:
Determinar a participação da neurotransmissão adrenérgica no MnPO e
dos neurônios do grupamento noradrenérgico A1 sobre os parâmetros
cardiovasculares em animais normotensos e espontaneamente hipertensos
(SHR).
2.2. Objetivos Específicos:
Determinar o efeito do bloqueio da neurotransmissão adrenérgica no MnPO
sobre as variações da pressão arterial, frequência cardíaca e fluxo
sanguíneo renal e aórtico em ratos normotensos e SHR.
Determinar os efeitos de lesões específicas no grupamento noradrenérgico
A1 e consequentes variações na pressão arterial e na frequência cardíaca
em ratos normotensos e SHR não anestesiados.
Determinar os efeitos de lesões específicas no grupamento noradrenérgico
A1 sobre as variações na pressão arterial, na frequência cardíaca e no
fluxo sanguíneo renal em ratos normotensos e SHR anestesiados.
Determinar os efeitos de lesões específicas no grupamento noradrenérgico
A1 sobre as respostas cardiovasculares induzidas por hipernatremia aguda
em ratos normotensos e SHR não anestesiados.
11
Materiais e Métodos
12
3.1. Modelos experimentais
Os experimentos foram realizados utilizando ratos machos (280-340 g) das
linhagens Wistar e SHR, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal
de Goiás (UFG). Os animais foram mantidos em salas climatizadas (temperatura
22-24°C) e tiveram acessos ad libitum à água e ração. Todos os protocolos
experimentais foram aprovados pelo comitê de ética da UFG (n°172/09).
3.2. Lesão dos grupamentos neuronais noradrenérgicos A1
Para a realização das lesões específicas nos neurônios noradrenérgicos da
região CVLM, os animais foram anestesiados com halotano 2% (Tanohalo;
Cristália, Itapira, SP, Brasil) em O2 e posicionados em decúbito ventral em um
aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA). A
musculatura da nuca foi rebatida, expondo o osso occipital e a membrana atlanto-
occipital. O osso occipital foi removido com o auxílio de um osteomo e a dura-
máter rebatida, expondo assim o calamus scriptorius, o qual foi tomado como
ponto de referência para a obtenção das coordenadas estereotáxicas. As
coordenadas estereotáxicas utilizadas foram obtidas e modificadas a partir do
Atlas de Paxinos & Watson (1998).
Para lesionar o grupamento noradrenérgico A1 foram realizadas duas
nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-dopamina-β-hidroxilase (saporina-anti-
DβH) na região CVLM, a partir das seguintes coordenadas:
Nos grupos experimentais as nanoinjeções de saporina-anti-DβH
(Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, EUA) foram realizadas na
concentração de 0,105 ng.nL-1 na região CVLM. Estudos demonstraram que esta
concentração promove lesões mais eficientes nos neurônios noradrenérgicos
presentes na região da injeção (Pedrino et al., 2006; Pedrino et al., 2008) . No
Antero-Posterior = 0,3 mm rostral e 0,3 mm caudal ao calamus scripitoris
Latero-Medial = 2,0 mm lateral ao calamus scripitoris
Dorso-Ventral = 2,0 mm ventral à superfície dorsal
13
grupo controle foram realizadas nanoinjeções equimolares de saporina (0,021
ng.nL-1; Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, EUA).
As nanoinjeções foram realizadas utilizando micropipetas de vidro
acopladas a uma seringa, por meio de cânulas, formando um sistema de
nanoinjeção sob pressão. O volume injetado (100 nL) foi controlado pelo
deslocamento do menisco da solução na micropipeta através de um microscópio
cirúrgico constituído por uma lente ocular com retículo calibrado. Em seguida, os
animais foram suturados e receberam doses profiláticas de antibiótico (penicilina,
60.000 IU.kg-1, i.m.; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para o estabelecimento
completo da lesão, os ratos foram colocados em gaiolas individuais e mantidos
com água e ração ad libitum por um período mínimo de 15 dias.
3.3. Registro da pressão arterial média e frequência cardíaca nos animais
não anestesiados
Os animais foram submetidos à canulação crônica após o período de
estabelecimento da lesão. Para isso, foram anestesiados com halotano (2% em
O2) e submetidos ao procedimento cirúrgico para a implantação de cânulas na
veia femoral direita e na aorta abdominal através da artéria femoral direita. Em
seguida, as cânulas foram exteriorizadas entre as escápulas e os animais
suturados. No dia seguinte à cirurgia, foi realizado o registro da pressão arterial
média e frequência cardíaca dos animais acordados por meio da conexão da
cânula arterial a um transdutor de pressão (BP-100, iWorx Systems, Inc., Dover,
NH, EUA).
3.4. Teste de Baroreflexo e Quimioreflexo
Foram realizados os testes de baroreflexo e quimioreflexo nos animais não
anestesiados. O teste de baroreflexo foi feito por meio de infusões intravenosas
de doses crescentes de fenilefrina (1g, 1,5 g e 2 g; agonista 1
noradrenérgico; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O teste de quimioreflexo foi
realizado pela infusão intravenosa de cianeto de potássio (40 g; Sigma-Aldrich,
14
St. Louis, MO, EUA). Todas as drogas foram infundidas na veia femoral em bolus
de 0,1 mL.
3.5. Infusão de salina hipertônica
No dia seguinte aos testes de baroreflexo e quimioreflexo, os animais
foram submetidos ao registro basal de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC) por 30 minutos. Em seguida, os ratos receberam infusão
intravenosa de solução salina hipertônica (SH; NaCl 3M, 1,8 mL ∙ kg-1 de massa
corporal; em 1 minuto; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e tiveram os
parâmetros cardiovasculares registrados por 90 minutos após a infusão.
3.6. Registro da pressão arterial média e da frequência cardíaca nos
animais anestesiados
Nos registros com animais anestesiados a PAP (pressão arterial pulsátil) foi
obtida conectando a cânula arterial a um transdutor de pressão (BP-100, iWorx
Systems, Inc., Dover, NH, EUA) acoplado a um amplificador (DA100c, BioPac
Systems, Inc., Goleta, CA, EUA). Os dados foram digitalizados em uma
freqüência de 1000 amostras.s-1 utilizando um conversor analógico digital
(MP150, BioPac Systems, Inc., Goleta, CA, EUA). A PAM foi calculada a partir da
integral do sinal da PAP (Acqknowledge, v3.7.3.; BioPac Systems, Inc., Goleta,
CA, EUA). A FC foi calculada como frequência instantânea do sinal de PAP
(Acqknowledge, v3.7.3.; BioPac Systems, Inc., Goleta, CA, EUA).
3.7. Registro do fluxo sanguíneo renal e aórtico e da condutância
vascular renal e aórtica nos animais anestesiados
O fluxo sanguíneo renal (FSR) e aórtico (FSA) foram registrados por
fluxometria de tempo de trânsito como descrito por Welch e colaboradores (1995).
Para isso, sondas em miniatura foram conectadas a um fluxômetro T206
(Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY, EUA) que permite determinar o fluxo em
valores absolutos (mL.min-1). Os sinais obtidos foram enviados ao sistema de
15
aquisição e análise de dados MP150 (Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, EUA). Os
dados foram digitalizados em uma frequência de 200 amostras por segundo. As
variações do FSR e do FSA foram calculadas como a razão percentual em
relação ao valor basal (%FSR e %FSA, respectivamente), de acordo com as
fórmulas:
A condutância vascular renal (CVR) e aórtica (CVA) foram obtidas pela
razão entre o FSR ou FSA e a PAM, respectivamente. As variações da CVR e
CVA foram calculadas como variação percentual em relação ao valor basal
(%CVR e %CVA, respectivamente), utilizando-se as seguintes fórmulas:
3.8. Dot Blot
Para a detecção da enzima tirosina hidroxilase (TH) no Núcleo Pré Óptico
Mediano (MnPO), amostras teciduais do córtex (região controle) e do MnPO dos
encéfalos dos animais injetados com saporina-anti-DβH ou saporina foram
retiradas e utilizadas para a realização da técnica de Dot blot (Zangger et al.,
2013). Aproximadamente 100 mg de amostras foram maceradas em tampão Tris-
HCl 50 mM em pH 7,5. Posteriormente foram centrifugadas a 12.000g/4oC por 5
minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e a concentração de
proteínas foi estimada utilizando a metodologia de Bradford (1976). As amostras
foram normalizadas para que a mesma quantidade de proteínas fosse aplicada
em cada blot.
As amostras foram colocadas em membranas de nitrocelulose. As
membranas foram bloqueadas com BSA 0,5% (em PBST 0,05%) por 30 minutos.
Em seguida foram incubadas para detecção da proteína tirosina hidroxilase
utilizando o anticorpo primário anti-tirosina-hidroxilase feito em camundongo
%FSR = FSRfinal-FSRbasal . 100 FSRbasal
%FSA = FSAfinal-FSAbasal . 100 FSAbasal
%CVR = CVRfinal-CVRbasal . 100 CVRbasal
%CVA = CVAfinal-CVAbasal . 100 CVAbasal
16
(1:2000; ImmunoStar, Inc., Hudson, WI, EUA). Posteriormente, a membrana foi
lavada com PBST e incubada com o anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de
camundongo (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) obtido em cavalo.
A revelação foi realizada utilizando NBT/BCP.
3.9. Nanoinjeções no MnPO
Para verificação da participação MnPO na regulação dos parâmetros
cardiovasculares, nanoinjeções de soro fisiológico (NaCl 0,15 M; Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, EUA) e fentolamina (6,3 mM; antagonista α adrenérgico não
seletivo; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foram realizadas nessa região a
partir das seguintes coordenadas estereotáxicas:
As nanoinjeções foram realizadas utilizando micropipetas de vidro
acopladas a uma seringa, por meio de cânulas, formando um sistema de
nanoinjeção sob pressão. O volume injetado foi controlado pelo deslocamento do
menisco da solução na micropipeta através de um microscópio cirúrgico
constituído por uma lente ocular com retículo calibrado. O volume nanoinjetado foi
de 100 nL. Para a posterior confirmação histológica do sítio de nanoinjeção, foi
nanoinjetado o corante de azul de Evans (4% em NaCl 0,15 M; 100 nL; Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, EUA) nas mesmas coordenadas estereotáxicas.
3.10. Histologia
Ao final dos experimentos, os animais foram perfundidos com soro
fisiológico (NaCl 0,15 M) seguido de solução de paraformaldeído (4%; Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para tanto, o coração foi exposto e uma cânula,
acoplada a uma bomba de perfusão, foi introduzida na aorta ascendente.
Posteriormente, o encéfalo foi retirado e fixado em solução de paraformaldeído
Antero-Posterior = 0,4 mm rostral ao bregma
Latero-Medial = 0,0 mm lateral ao seio sagital venoso
Dorso-Ventral = 7,2 mm ventral ao seio sagital venoso
17
(4%). Utilizando um micrótomo de congelamento (Leica, Wetzlar, Alemanha), as
regiões bulbares e hipotalâmicas foram seccionadas em cortes coronais de 40 m
de espessura.
Para a determinação da lesão do grupamento neuronal A1, os cortes foram
processados em técnicas de imunoistoquímica para a detecção da enzima tirosina
hidroxilase (TH; Pedrino et al., 2008; Pedrino et al., 2012). No dia do ensaio, os
cortes obtidos foram lavados em solução de tampão fosfato de potássio 0,02 M
(KPBS; LabSynth, Diadema, SP, Brasil) por 30 minutos. Em seguida, os cortes
foram pré-incubados com peróxido de hidrogênio 3% (Sigma-Aldrich, ST. Louis,
MO, EUA) por 15 minutos para a depleção da ação das enzimas peroxidases
endógenas. Posteriormente, os cortes foram incubados com soro normal de
cavalo a 2% (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) por 30 minutos
para o bloqueio dos sítios inespecíficos de ligação.
Após a pré-incubação, os cortes foram incubados a 4° C em solução
contendo anticorpo primário anti-tirosina-hidroxilase feito em camundongo
(1:2000; ImmunoStar, Inc., Hudson, WI, EUA), Triton X 10% (Sigma-Aldrich, ST.
Louis, MO, EUA) e soro normal de cavalo 2% (Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA, EUA) por 24 horas.
Posteriormente, os cortes foram novamente lavados em tampão KPBS 0,02
M e incubados com o anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de camundongo
(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) obtido em cavalo, numa diluição
1:2000 por 1 hora. Em seguida, uma terceira incubação ocorreu em uma solução
contendo o conjugado avidina-biotina-peroxidase (ABC Kit Standard; Vector
Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) na mesma diluição por um período de 1
hora. Por fim, os cortes foram incubados em uma solução contendo DAB
(peroxidase substrate kit DAB; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) e
peróxido de hidrogênio (reação de precipitação do DAB). A reação foi
interrompida após dois minutos com lavagens sucessivas em tampão KPBS 0,02
M.
Os cortes tratados foram montados em lâminas de vidro. Após secos,
foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (70%, 95% e 100%;
LabSynth, Diadema, SP, Brasil) e diafanizados com xilol (100%; LabSynth,
18
Diadema, SP, Brasil). Os cortes foram, então, recobertos com lamínulas, usando
uma resina histológica (DPX; BDH Laboratory Supplies, Inglaterra).
As lâminas histológicas foram analisadas em campo claro (aumento de 200
X) utilizando um microscópio óptico acoplado a um sistema digital de aquisição de
imagens. Foi realizada a análise quantitativa das células imuno-positivas para TH
da região CVLM, como descrito por Pedrino et al., 2006. Como critério de
contagem celular, somente as células onde foi possível identificar o corpo celular
e pelo menos uma ramificação (dentrito ou axônio) foram consideradas.
Para a determinação dos sítios de nanoinjeção no MnPO, os cortes obtidos
desta região hipotalâmica foram corados para determinação da presença de
corpos celulares pela técnica do vermelho neutro a 1%. Posteriormente, os cortes
foram montados em lâminas de vidro. Após secos, foram desidratados em
concentrações crescentes de etanol e diafanizados em xilol (LabSynth, Diadema,
SP, Brasil). Os cortes foram recobertos com lamínula, usando uma resina
histológica (DPX; BDH Laboratory Supplies, Inglaterra). Ao final, as lâminas
histológicas foram analisadas por microscopia óptica de campo claro para a
avaliação da localização e extensão das nanoinjeções de azul de Evans.
3.11. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas nos softwares GraphPad Prism
(v5.01; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA) e GB Stat (Dynamic
Microsystems, Inc., Silver Spring, MD, EUA) . Os valores foram expressos como
média ± erro padrão da média (EPM). Para a análise dos valores basais foi
utilizado o teste t não pareado. As comparações entre os grupos e os dados de
contagem celular foram analisados através de ANOVA de uma via, seguida pelo
teste de Newman–Keuls, nos casos em que o f atingiu o valor crítico. As
variações cardiovasculares induzidas por infusão de salina hipertônica foram
analisadas por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Newman–Keuls, nos
casos em que o f atingiu o valor crítico. Assumiu-se nível de significância p < 0,05.
19
Resultados
20
4.1. Envolvimento da neurotransmissão adrenérgica no Núcleo Pré
Óptico Mediano sobre os parâmetros cardiovasculares em ratos
normotensos e espontaneamente hipertensos
A figura 3 contém uma fotomicrografia de um caso típico onde se visualiza
a marcação com azul de Evans da região onde ocorreram as nanoinjeções de
soro fisiológico (grupo controle) e fentolamina (grupo experimental). Apenas os
resultados obtidos em experimentos em que a nanoinjeção de azul de Evans
esteve confinada no MnPO foram considerados para análise.
Figura 3. Corte coronal mostrando um típico centro de nanoinjeção de fentolamina e soro
fisiológico no MnPO (seta); ca (comissura anterior).
Na tabela 1 estão representados os valores basais médios da PAM,
FC, FSR, FSA, CVR e CVA dos ratos que receberam nanoinjeções no MnPO.
21
Tabela 1. Valores basais médios ± EPM da pressão arterial média (PAM), frequência
cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA), condutância
vascular renal (CVR) e condutância vascular aórtica (CVA) dos ratos normotensos (NT) e
espontaneamente hipertensos (SHR) que receberam nanoinjeções no MnPO.
Grupo N PAM
(mmHg)
FC
(bpm)
FSR
(ml/min)
FSA
(ml/min)
CVR
ml/(min*mmHg)
CVA
ml/(min*mmHg)
NT 7 114 ± 2,5 402 ± 17,9 3,3 ± 0,5 17,3 ± 3,5 0,028 ± 0,004 0,149 ± 0,025
SHR 6 144 ± 3,6 376 ± 11,7 2,9 ± 0,5 19,1 ± 3,8 0,020 ± 0,003 0,137 ± 0,028
Como esperado as nanoinjeções de soro fisiológico nos animais
normotensos (n=7) não provocaram alterações na PAM, FC, FSR, FSA, CVR e
CVA. As médias ± EPM das variações destes parâmetros cardiovasculares foram
respectivamente: -0,3 ± 0,5 mmHg; -03 ± 0,3 bpm; -0,3 ± 0,3 % do basal; 2,8 ± 2,5
% do basal; -0,3 ± 0,5 % do basal; 2,3 ± 3,3 % do basal (Figuras 4 e 5).
As nanoinjeções de soro fisiológico nos SHRs (n=6) também não
provocaram alterações na PAM, FC, FSR, FSA, CVR e CVA (-0,6 ± 0,6 mmHg; -
0,5 ± 0,8 bpm; 2,2 ± 1,2 % do basal; -0,2 ± 0,4 % do basal; 2,6 ± 1,5 % do basal;
0,4 ± 0,4 % do basal; respectivamente; Figuras 4 e 5).
As nanoinjeções de fentolamina nos ratos normotensos (n=7) resultaram
em queda no FSA (-7,3 ± 2 % do basal; Figuras 4 e 5). No entanto, não ocorreram
alterações significativas na PAM, FC, FSR, CVR e CVA (-7,7 ± 1,1 mmHg; 2,3 ±
3,4; -7,2 ± 2,1 % do basal; -0,4 ± 1,6 % do basal; -0,1 ± 0,5 % do basal;
respectivamente; Figuras 4 e 5).
Nos SHRs, as nanoinjeções de fentolamina (n=6) ocasionaram queda
significativa na PAM (-14,3 ± 6 mmHg; Figura 4 e 5) e aumento na CVR e CVA
(9,6 ± 1,9 % do basal e 9,8 ± 3,4 % do basal, respectivamente; Figura 4). No
entanto, não ocorreram alterações no na FC, FSR e FSA (-7 ± 4,4 bpm; -1,7 ± 4,1
e -4,3 ± 3,3, respectivamente; Figuras 4 e 5).
22
Figura 4. Traçado típico das alterações na pressão arterial pulsátil (PAP), fluxo sanguíneo renal
(FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA) e na frequência cardíaca (FC), induzidas por nanoinjeção de
veículo (Soro Fisiológico; 0,15 M) e fentolamina (6,3 mM) no MnPO de ratos normotensos (A) e
espontaneamente hipertensos (B). A linha tracejada representa o momento das nanoinjeções.
23
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
†
A
P
AM
(m
mH
g)
-20
-15
-10
-5
0
5
10B
F
C (
bp
m)
-15
-10
-5
0
5
10
C
F
SR
(%
em
re
laç
ão
ao
ba
sa
l)
-15
-10
-5
0
5
10
†
D
FS
A (
% e
m r
ela
çã
o a
o
ba
sa
l)
-5
0
5
10
15
20
†*
E
C
VR
(%
em
re
laç
ão
ao
ba
sa
l)
-5
0
5
10
15
20
†*
F
C
VA
(%
em
re
laç
ão
ao
ba
sa
l)
N ormotensos (n=7) S H R (n=6)
Sa lin a 0 ,15M F e n to lam in a 6 ,3m M Salin a 0 ,15M
Sa lin a 0 ,15M Sa lin a 0 ,15M
Sa lin a 0 ,15MSa lin a 0 ,15M
F e n to lam in a 6 ,3m M
F e n to lam in a 6 ,3m MF e n to lam in a 6 ,3m M
F e n to lam in a 6 ,3m MF e n to lam in a 6 ,3m M
Figura 5. Média ± EPM das variações na pressão arterial média (Δ PAM; A), frequência
cardíaca (Δ FC; B), fluxo sanguíneo renal (Δ% FSR; C), fluxo sanguíneo aórtico (Δ% FSA; D),
condutância vascular renal (Δ%CVR; E) e condutância vascular aórtica (Δ%CVA; F), devido a
nanoinjeções de soro fisiológico (0,15 M) e fentolamina (6,3 mM) no MnPO em ratos normotensos
(NT) e hipertensos (SHR). † diferente do soro, * diferente da fentolamina no normotenso; p < 0,05.
24
Para confirmação de uma resposta restrita do SNC às nanoinjeções de
fentolamina, realizamos infusões intravenosas equimolares do antagonista
adrenérgico nos animais hipertensos (n=4), as quais não provocaram alterações
na PAM, FC, FSR, FSA, CVR e CVA (-1,2 ± 0,9 mmHg; 2,2 ± 1,1 bpm; -7,0 ± 4,8%
do basal; -1,0 ± 2,1% do basal; -6,1 ± 5,6% do basal; 1,0 ± 2,9% do basal,
respectivamente).
25
4.2. Participação dos neurônios noradrenérgicos A1 na regulação da
pressão arterial em ratos normotensos e espontaneamente
hipertensos
4.2.1. Lesão dos neurônios catecolaminérgicos bulbares induzida por
nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-DβH na CVLM
A análise qualitativa evidenciou que as nanoinjeções bilaterais de saporina-
anti-DH na região CVLM, promoveram diminuição dos neurônios TH-positivos
localizados nesta região (grupamento noradrenérgico A1; Figura 6) em ratos
normotensos. Após a confirmação qualitativa da lesão catecolaminérgica foi
realizada a quantificação desta lesão. Para isto, todas as células que tiveram
marcação positiva para TH encontradas na região ventrolateral (VLM) e na
superfície dorsal do bulbo (NTS) entre aproximadamente 1900 m caudal e 1900
m rostral ao óbex foram contadas (Figura 7).
Nos animais que receberam nanoinjeções de saporina (n=11) o número de
células TH positivas encontrado na região onde estão localizados os neurônios
noradrenérgicos A1 (entre 200 e 1900 m caudal ao óbex; Tucker et al., 1987) foi
em média de 25 células por corte (Figura 7 A). O número de neurônios
adrenérgicos C1 localizados entre 200 caudal e 1900 m rostral ao óbex (Tucker
et al., 1987) foi em média de 42 células por corte (Figura 7 A). Em relação ao
NTS, foi evidenciado que na região que compreende do óbex à 1900 m caudal
(grupamento A2; Tucker et al., 1987), o número de células TH-positivas por corte,
foi em média de 15 células (Figura 7 A). E na região que compreende do óbex à
1900 m rostral (grupamento C2; Tucker et al., 1987), foi encontrado em média 12
células por corte (Figura 7 A).
Nos animais submetidos à nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-DβH na
região CVLM (n=11), foi observado uma drástica redução no número de neurônios
TH positivos nesta região quando comparado ao controle. Na região da CVLM,
onde estão localizados os neurônios do grupamento noradrenérgico A1 (de 200 a
1900 m caudal ao óbex), o número de células TH positivas observado foi em
média de 4 células por corte, o que representa uma redução aproximada de 81%
26
quando comparado ao grupo controle (Figura 7 A e B). Em relação aos neurônios
adrenérgicos C1 localizados entre 200 caudal e 1900 m rostral ao óbex, o
número de células TH positivas observadas foi de aproximadamente 38 por corte,
apontando uma discreta redução de 10% em relação ao grupo controle (Figura 7
A e B). A contagem neuronal no NTS evidenciou que as nanoinjeções bilaterais
de saporina-anti-DβH não produziu alterações no número de células TH-positivas
localizadas no grupamento A2 e C2 (15 e 13 células por corte, respectivamente;
Figura 7 A e B).
Em conjunto, estes resultados demonstraram que as nanoinjeções de
saporina-anti-DH na CVLM promoveram reduções nos números de neurônios TH
positivos localizados nesta região (Figura 7 B). Além disso, não foram observadas
alterações significativas no número destas células localizadas no NTS
(grupamentos A2 e C2 0%; Figura 7 B), e na região RVLM (grupamento C1
10%; Figura 7 B).
27
Figura 6. Verificação histológica dos grupamentos catecolaminérgicos A2 (NTS), A1 (CVLM) e C1
(RVLM) dos ratos normotensos que receberam nanoinjeções bilaterais de saporina (grupo sham)
ou saporina-anti-DH na região CVLM. Fotomicrografia de cortes coronais (40m) do bulbo
corados por técnicas de imunoistoquímica. As setas indicam marcação neuronal
catecolaminérgica.
28
Figura 7. Média EPM do número de células TH positivas localizadas nas regiões
caudoventrolateral (CVLM; A1) e rostroventrolateral (RVLM; C1) e na superfície dorsal (NTS; A2
e C2) do bulbo dos animais normotensos que receberam nanoinjeções de saporina-anti-DH
(lesão A1) ou de apenas saporina (sham) na região CVLM (A). Podemos perceber que a
nanoinjeção de saporina-anti-DH promoveu reduções significantes no número de células TH
positivas do grupamento A1 (redução 81%), entretanto não houve alterações nos grupamentos
A2 e C2 (redução < 0%) e C1 (redução 10%; B). † diferente do controle; p < 0,05.
29
Assim como nos ratos normotensos, as nanoinjeções bilaterais de
saporina-anti-DβH ocasionaram uma redução dos neurônios positivos à tirosina
hidroxilase (TH) na região CVLM (Figuras 8 e 9) dos SHRs.
Nos ratos hipertensos nanoinjetados com saporina (n=8) o número de
células TH positivas encontradas na região onde estão localizados os neurônios
noradrenérgicos A1 (entre 200 e 1900 m caudal ao óbex; Tucker et al., 1987) foi
em média de 20 células por corte (Figura 9 A). O número de neurônios
adrenérgicos C1 localizados entre 200 caudal e 1900 m rostral ao óbex foi em
média de 48 células por corte (Figura 9 A). Em relação ao NTS, foi evidenciado
que na região que compreende do óbex à 1900 m caudal (grupamento A2), o
número de células TH positivas por corte foi em média de 18 células (Figura 9 A).
E na região que compreende do óbex à 1900 m rostral (grupamento C2; Tucker
et al., 1987), foi encontrado em média 10 células por corte (Figura 9 A).
Nos animais hipertensos submetidos à nanoinjeções bilaterais de saporina-
anti-DβH na região CVLM (n=7), foi observado uma drástica redução no número
de neurônios TH positivos quando comparado ao controle. Na região da CLVM
onde encontra-se o grupamento noradrenérgico A1, o número de células TH
positivas observado foi em média de 5 células por corte, o que representa uma
redução aproximada de 75% quando comparado ao grupo controle (Figura 9 A e
B). Em relação aos neurônios adrenérgicos C1, o número de células TH positivas
observadas foi de aproximadamente 45 por corte (Figura 9 A e B). A contagem
neuronal no NTS evidenciou que as nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-DβH
na região da CVLM não promoveram alterações significantes no número de
células TH-positivas localizadas no grupamento A2 e C2 (16 e 9 células por corte,
respectivamente; Figura 9 A e B).
Estes resultados demonstram que as nanoinjeções de saporina-anti-DH
na CVLM promoveram reduções no número de neurônios TH positivos localizados
nesta região (grupamento A1 75; Figura 9 B). Além disso, não foram
observadas diferenças estatísticas no número destas células localizadas no NTS
(grupamento A2 11%; grupamento C2 0%; Figura 9 B), e na região RVLM
(grupamento C1 6%; Figura 9 B).
30
Figura 8. Verificação histológica dos grupamentos catecolaminérgicos A2 (NTS), A1 (CVLM) e
C1 (RVLM) dos ratos espontaneamente hipertensos que receberam nanoinjeções bilaterais de
saporina (grupo sham) ou saporina-anti-DH na região CVLM. Fotomicrografia de cortes
coronais (40m) do bulbo corados por técnicas de imunoistoquímica. As setas indicam marcação
neuronal catecolaminérgica.
31
Figura 9. Média EPM do número de células TH positivas localizadas nas regiões
caudoventrolateral (CVLM; A1) e rostroventrolateral (RVLM; C1) e na superfície dorsal (NTS; A2
e C2) do bulbo dos SHRs que receberam nanoinjeções de saporina-anti-DH (lesão A1) ou de
apenas saporina (sham) na região CVLM (A). Podemos perceber que as nanoinjeções de
saporina-anti-DH promoveram reduções significantes no número de células TH positivas do
grupamento A1 (redução 75%), entretanto não houve alterações nos grupamentos A2 e C2
(redução 11% e < 0%, respectivamente) e C1 (redução 6%; B). † diferente do controle; p <
0,05.
32
Para confirmarmos a redução na síntese de noradrenalina pelas
terminações nervosas localizadas no MnPO devido a lesão do grupamento A1, foi
realizada a técnica de Dot Blot de amostras retiradas do MnPO. Os resultados
obtidos demonstraram que as nanoinjeções de saporina-anti-DβH na região
CVLM promoveram reduções nos níveis de tirosina hidroxilase no MnPO dos
animais normotensos (Figura 10 A) e hipertensos (Figura 10 B) quando
comparado aos seus respectivos grupos sham (nanoinjeções de saporina; Figura
10 A e B). O córtex cerebral foi utilizado como região controle, onde não foram
evidenciadas alterações nos grupos sham e experimentais (Figura 10 A e B). Os
resultados evidenciam que a lesão dos aferentes noradrenérgicos A1 para o
MnPO foi efetiva em promover alterações na neurotransmissão noradrenérgica
neste núcleo.
Figura 10. Observação da expressão da enzima TH pela técnica de Dot Blot no MnPO e córtex
dos ratos normotensos (A) e espontaneamente hipertensos (B) que receberam nanoinjeções
bilaterais de saporina (grupo sham) ou saporina-anti-DH na região CVLM. As marcações na
membrana de nitrocelulose representam os níveis da enzima TH. Fotografia de um corte coronal
do cérebro mostrando a retirada de massa tecidual do MnPO (círculo) e do córtex (seta; C).
C
33
80
90
100
110
120
A
PA
M (
mm
Hg
)
300
320
340
360
380
400
420 †
BF
C (
bp
m)
S ham (8) Lesão A1 (11)
4.2.2. Efeito da lesão da região CVLM sobre a PAM e FC basais em ratos
não anestesiados
Como podemos observar não foram evidenciadas alterações significativas
nos valores basais de PAM dos animais normotensos com lesão A1 (114 ± 1,9
mmHg; n=11; Figura 11) quando comparada aos valores obtidos nos animais
controle (112,4 ± 2,1 mmHg; n=8; Figura 11). Porém, houve alterações
significativas nos valores basais de FC entre os animais normotensos controles e
lesionados (343,9 ± 8,4 bpm, n=8 e 396,0 ± 13,4 bpm, n=11, respectivamente;
Figura 11).
Figura 11: Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca (FC; B) nos
animais normotensos não anestesiados. † diferente do controle; p < 0,05.
Nos gráficos da figura 12 estão expressas as médias ± EPM da PAM e da
FC basais registradas nos animais espontaneamente hipertensos não
anestesiados. Não observamos alterações significativas nos valores basais de
PAM dos animais com lesão A1 (170,3 ± 8,0 mmHg; n=8; Figura 12) quando
comparado aos SHRs não lesionados (157,4 ± 6,3 mmHg; n=8; Figura 12).
Também não houve alterações significativas nos valores basais de FC entre os
animais hipertensos controles (389,2 ± 8,9 bpm; n=8; Figura 12) e lesionados
(395,4 ± 20,5 bpm; n=8; Figura 12).
34
140
150
160
170
180
A
PA
M (
mm
Hg
)
300
320
340
360
380
400
420
B
FC
(b
pm
)
S ham (8) Lesão A1 (8)
Figura 12: Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca (FC; B) nos
animais hipertensos não anestesiados. p < 0,05.
4.2.3 Efeito da lesão da região CVLM sobre a PAM, FC, FSR e CVR basais
em ratos anestesiados
As médias ± EPM da PAM (113 ± 2,7 mmHg sham; 119 ± 5,1 mmHg
lesionado), FC (399 ± 23,9 bpm sham; 439 ± 17,9 bpm lesionado), FSR (3,8 ± 0,7
ml/min sham; 5,3 ± 1,1 ml/min lesionado) e CVR (33,3 ± 5,6 ml/min*mmHg sham;
44,9 ± 9,8 ml/min*mmHg lesionado) do grupo normotenso sham (n=5) e com
lesão de A1 (n=4) estão expressas nos gráficos da figura 13. Como podemos
observar, não houve diferenças estatísticas entre os grupos nos parâmetros
cardiovasculares analisados.
35
80
100
120
140
n = 28
*
AP
AM
(m
mH
g)
300
350
400
450
500
n = 28
*
B
FC
(b
pm
)
0
2
4
6
8
n = 28
*
C
FS
R (
ml
/ m
in)
0
10
20
30
40
50
60
n = 28
*
D
CV
R (
ml
/ m
in*m
mH
g)
Sham (n=5) Lesão A 1 (n=4)
Figura 13. Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A), frequência cardíaca (FC; B), fluxo
sanguíneo renal (FSR; C) e condutância vascular renal (CVR; D) nos animais normotensos
anestesiados. p < 0,05.
Na figura 14 encontram-se os gráficos das médias ± EPM da PAM (164 ±
7,8 mmHg sham; 167 ± 1,9 mmHg lesionado), FC (390 ± 11,5 bpm sham; 369 ± 5
bpm lesionado), FSR (2,9 ± 0,4 ml/min sham; 3,5 ± 0,7 ml/min lesionado) e CVR
(17,9 ± 2,6 ml/min*mmHg sham; 20,8 ± 4,2 ml/min*mmHg lesionado) do grupo
hipertenso sham (n=7) e com lesão de A1 (n=4) Como podemos observar, não
houve diferenças estatísticas entre os grupos nas variáveis cardiovasculares
analisadas.
36
140
150
160
170
180
n = 28
*
PA
M (
mm
Hg
)
A
300
350
400
450
n = 28
*
FC
(b
pm
)
B
0
2
4
6
n = 28
*FS
R (
ml
/ m
in)
C
0
10
20
30
n = 28
*
CR
(m
l /
min
*mm
Hg
)
D
Sham (n=7) Lesão A 1 (n=4)
Figura 14. Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A), frequência cardíaca (FC; B), fluxo
sanguíneo renal (FSR; C) e condutância vascular renal (CVR; D) nos animais hipertensos
anestesiados. p < 0,05.
4.2.4 Análise da lesão dos neurônios noradrenérgicos A1 sobre o
baroreflexo
O índice de baroreflexo não apresentou diferença significativa na análise
da razão entre as variações da FC e PAM dos animais normotensos sham (-2,10
± 0,07 bpm/mmHg; n=8; Figura 15) e lesionados (-2,16 ± 0,02 bpm/mmHg; n=7;
Figura 15), evidenciando a preservação da sensibilidade baroceptora (SB).
37
-3
-2
-1
0
n = 28
*
SB
(
bp
m /
mm
Hg
)
S ham (n=8) Lesão A1 (n=7)
S ham (n=5) Lesão A1 (n=6)
-2
-1
0
*
†
SB
(
bp
m /
mm
Hg
)
Figura 15. Índice do baroreflexo dos animais normotensos expresso pela razão entre as variações
da FC e PAM. p < 0,05.
A análise do índice de baroreflexo dos SHRs apresentou diferença
significativa entre os animais controles (-1,52 ± 0,10 bpm/mmHg; n=5; Figura 16)
e lesionados (-1,23 ± 0,02 bpm/mmHg; n=6; Figura 16).
Figura 16. Índice do baroreflexo dos SHRs expresso pela razão entre as variações da FC e PAM.
† diferente do controle. p < 0,05.
38
0
20
40
60
80
n = 28
*
B
P
AM
(m
mH
g)
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
n = 28
*
C
FC
(b
pm
)
S ham (n=8) Lesão A1 (n=7)
4.2.5 Análise da lesão dos neurônios noradrenérgicos A1 sobre o
quimioreflexo
Nos gráficos da figura 17 encontram-se as médias ± EPM das variações na
PAM e FC registradas durante o teste de quimioreflexo nos ratos normotensos.
Não foram observadas alterações significativas nas variações da PAM e FC nos
animais lesionados (69 ± 5,3 mmHg e -220 ± 33,4 bpm, respectivamente; n=7;
Figura 17) e sham (63 ± 5,1 mmHg e -198 ± 21,2 bpm, respectivamente; n=8;
Figura 17), demonstrando a integridade do quimioreflexo.
Figura 17: Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca
(FC; B) dos animais normotensos no teste de quimioreflexo. p < 0,05.
As médias ± EPM das variações na PAM e FC registradas durante o teste
de quimioreflexo dos animais hipertensos estão expressas nos gráficos da figura
18. Não foram observadas alterações significativas nas variações de PAM nos
ratos lesionados (72 ± 5,9 mmHg; n=6; Figura 18) e sham (76 ± 3,1 mmHg; n=5;
Figura 18). No entanto, foi encontrada diferença nas variações de FC entre os
grupos (-253 ± 33,4 bpm lesionado; -126 ± 14,7 bpm sham; Figura 18), indicando
aumento da bradicardia reflexa à ativação dos quimiorreceptores.
39
0
20
40
60
80
100
n = 28
A
P
AM
(m
mH
g)
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
n = 28
*
†
B
F
C (
bp
m)
S ham (n=5) Lesão A1 (n=6)
Figura 18: Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca
(FC; B) dos animais hipertensos no teste de quimioreflexo. † diferente do controle; p < 0,05.
4.2.6 Participação do grupamento noradrenérgico A1 na resposta pressora
induzida por hipernatremia aguda
Os resultados obtidos nos animais normotensos nanoinjetados com
saporina (n=8), demonstraram que a infusão de salina hipertônica (NaCl 3M)
provocou uma sustentada resposta pressora (36 ± 3 e 11 ± 1,8 mmHg em relação
ao basal, 10 e 90 minutos após a infusão SH, respectivamente; Figura 19 A e 20
A). A sobrecarga de sódio promoveu uma redução inicial na FC (-38 ± 10,3 bpm
em relação ao basal, 10 minutos após SH; Figura 19 A e 20 B), seguido por um
retorno aproximado aos valores basais (31 ± 6 bpm em relação ao basal, 90
minutos após SH; Figura 19 A e 20 B).
Nos animais normotensos submetidos à lesão do grupamento
noradrenérgico A1 (n=11), a infusão de solução salina hipertônica promoveu uma
resposta pressora atenuada (18 ± 1,4 em relação ao basal, 10 minutos após SH,
respectivamente; Figura 19 B e 20 A), retornando posteriormente aos valores
basais (3 ± 1,4 mmHg em relação ao basal, 70 minutos após SH; Figura 19 B e 20
A). Em relação à FC, a sobrecarga de sódio provocou bradicardia acentuada (-61
± 9,5 bpm em relação ao basal, 10 minutos após SH; Figura 19 B e 20 B) seguida
por um retorno aos valores basais (2 ± 6,9 bpm em relação ao basal, 90 minutos
após SH; Figura 19 B e 20 B).
40
Comparando os dois grupos podemos perceber que a resposta pressora
após a infusão de salina hipertônica foi significativamente menor nos animais com
lesão do grupamento A1 e que a sobrecarga de sódio promoveu uma bradicardia
mais acentuada neste grupo.
Figura 19. Traçado típico das alterações provocadas na PAP (pressão arterial pulsátil), PAM
(pressão arterial média) e FC (frequência cardíaca) induzidas por infusão de Salina Hipertônica (3
M) em ratos normotensos sham (A) e lesionados (B) não anestesiados.
41
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
10
20
30
40
*†
*†
*† *† *† *†
*
*
*
** *
†
** *
††
A
T em po
P
AM
(m
mH
g)
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-80
-60
-40
-20
0
20
40
**
*
*†
B
T empo
F
C (
bp
m)
S ham (n=8) Lesão A1 (n=11)
Figura 20. Média EPM das variações da pressão arterial média ( PAM; A) e da frequência
cardíaca ( FC; B) dos ratos normotensos em resposta à infusão de solução salina hipertônica
(traço vertical em preto no tempo 0), submetidos à nanoinjeção do complexo saporina-anti-DH
(lesão A1; n=11) ou saporina (sham; n=8) na região CVLM. * diferente do tempo 0; † diferente do
sham, ambos p < 0,05.
42
Nos SHRs, os resultados demonstraram que a infusão de salina hipertônica
provocou aumento transitórios (<20 min) na pressão arterial de ratos controles (19
± 2,9 mmHg em relação ao basal, 10 minutos após a infusão SH; n = 6; Figuras
21 A e 22 A) e lesionados (12 ± 1,5 mmHg em relação ao basal, 10 minutos após
a infusão SH; n = 6; Figura 21 B e 22 A).
A sobrecarga de sódio promoveu uma redução inicial na FC dos animais
hipertensos sham (-38 ± 4,4 bpm em relação ao basal, 10 minutos após SH;
Figura 21 A e 22 B), seguido por um retorno aos valores basais (-18 ± 7,9 bpm em
relação ao basal, 50 minutos após SH; Figura 21 A e 22 B). Resultados similares
também foram observados nos ratos lesionados, bradicardia reflexa (-47 ± 8 bpm
em relação ao basal, 10 minutos após SH; Figura 21 B e 22 B) e retorno ao basal
(-16 ± 11 bpm em relação ao basal, 50 minutos após SH; Figura 21 B e 22 B).
Podemos perceber que a infusão de salina hipertônica provocou aumento
na pressão arterial e redução na frequência cardíaca dos SHRs sham e
lesionados.
43
Figura 21. Traçado típico das alterações provocadas na PAP (pressão arterial pulsátil), PAM
(pressão arterial média) e FC (frequência cardíaca) induzidas por infusão de salina hipertônica (3
M) em ratos hipertensos sham (A) e lesionados (B) não anestesiados.
44
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
10
20
30
*
*
A
T empo
P
AM
(m
mH
g)
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-80
-60
-40
-20
0
20
40
*
*
B
T empo
F
C (
bm
p)
S ham (n=6) Lesão A1 (n=6)
Figura 22. Média EPM das variações da pressão arterial média ( PAM; A) e da frequência
cardíaca ( FC; B) dos ratos hipertensos em resposta à infusão de solução salina hipertônica
(traço vertical em preto no tempo 0), submetidos à nanoinjeção do complexo saporina-anti-DH
(lesão A1; n=6) ou saporina (sham; n=6) na região CVLM. * diferente do tempo 0; ambos p < 0,05.
45
Discussão
46
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o bloqueio da
neurotransmissão adrenérgica no MnPO resultou em queda da PAM de ratos
espontaneamente hipertensos, evidenciando o envolvimento do MnPO nas vias
neuronais responsáveis pelo desenvolvimento da hipertensão arterial neste
modelo experimental. Esses dados indicam uma modulação tônica dos
neurotransmissores adrenérgicos sobre o MnPO, uma vez que o bloqueio
adrenérgico, por meio de nanoinjeções de fentolamina, promoveu queda na PA.
Contudo, a inervação noradrenérgica proveniente do grupamento A1 para o
MnPO parece não estar relacionada com a hipertensão arterial observada nestes
animais, visto que a lesão provocada nos neurônios A1 (diminuição de
aproximadamente 75% no número de células) não ocasionou reduções nos níveis
de PA em SHR. Ademais, os resultados sugerem a participação do grupamento
neuronal A1 na resposta pressora induzida por sobrecarga de sódio em animais
normotensos, evidenciando o envolvimento destes neurônios nas vias centrais
atuantes na regulação cardiovascular e do volume circulante.
Nas últimas décadas, estudos vêm demonstrando a participação da
neurotransmissão adrenérgica no MnPO nas vias neuro-humorais envolvidas com
a regulação do volume circulante. Bealer (2000) demonstrou que a expansão
isotônica do volume circulante levou à liberação de noradrenalina no MnPO.
Ademais, Pedrino e colaborares (2009) mostraram que o bloqueio dos
adrenoceptores 1 e 2 no MnPO aboliu a vasodilatação renal induzida por
infusão de salina hipertônica.
Apesar de já demonstrado a participação do MnPO no controle
neurovegetativo, poucos estudos investigaram a sua contribuição direta na
modulação da PA. Em um estudo recente, Llewellyn e colaboradores (2011)
demonstraram que a ativação do MnPO por N-metil-D-aspartato (agonista seletivo
dos receptores glutamatérgicos) aumentou a PA, a FC e a atividade simpática
renal em ratos normotensos anestesiados, respostas que foram atenuadas após a
nanoinjeção de AP5, um antagonista de receptores glutamatérgicos, no PVN. Em
consonância com esses resultados, estudos recentes de nosso laboratório
demonstraram que a inibição do MnPO por nanoinjeções de muscimol (agonista
GABAérgico) promove queda da pressão arterial em ratos normotensos e
47
hipertensos (Silveira et al., 2012), sendo esta resposta hipotensora
significativamente maior nos animais hipertensos. Ademais, o presente trabalho
evidenciou que o bloqueio da neurotransmissão adrenérgica no MnPO reduz a
pressão arterial nos SHRs. Estes resultados indicam a participação desta
neurotransmissão nas vias neuronais envolvidas no desenvolvimento da
hipertensão arterial em SHR.
Evidências neuroanatômicas indicam que o MnPO recebe aferências de
neurônios catecolaminérgicos do NTS (grupamento A2) e da região ventrolateral
do bulbo (grupamentos A1 e C1; Saper et al., 1983; Tucker et al., 1987). Estas
regiões são conhecidas por seu envolvimento com a modulação cardiovascular.
Tanaka e colaboradores (1992) evidenciaram que estímulos elétricos da região
onde estão localizados os neurônios A1, aumentam a atividade dos neurônios do
MnPO que se projetam para o PVN. Esta resposta excitatória foi bloqueada por
fentolamina (antagonista α-adrenoceptor não seletivo), mas não por timolol
(antagonista β-adrenoceptor não seletivo), sugerindo que a região A1 atua
aumentando a atividade dos neurônios do MnPO por ativação dos receptores α-
adrenérgicos.
Uma vez identificada a importância da neurotransmissão adrenérgica no
MnPO na manutenção da hipertensão arterial nos SHRs e tendo em vista que os
neurônios do grupamento A1 representam uma importante fonte de aferências
noradrenérgicas para este núcleo, buscamos avaliar a participação do
grupamento A1 no desenvolvimento da hipertensão arterial. O presente estudo
mostrou que as nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-DβH na CVLM
provocaram diminuição acentuada na população de células noradrenérgicas nesta
região. Entretanto, não encontramos alterações nos valores basais de PAM em
ratos normotensos e espontaneamente hipertensos.
Nossos dados demonstram que as nanoinjeções de saporina-anti-DβH
provocaram uma redução de 81% dos neurônios A1 nos ratos normotensos e
75% nos hipertensos, não afetando demais grupamentos catecolaminérgicos
bulbares (grupos A2/C2 e C1), indicando uma especificidade populacional na
lesão. Além disso, a lesão de A1 ocasionou uma redução nos níveis da enzima
48
tirosina hidroxilase no MnPO, evidenciando alterações na neurotransmissão
noradrenérgica no neste núcleo.
A realização de lesões em regiões específicas do sistema nervoso central é
uma técnica muito utilizada em estudos de neurociências (Cantuti-Castelvetri et
al., 2010; Wu et al., 2012). Estas lesões específicas permitem determinar a função
desempenhada por uma região de interesse. A saporina é uma toxina capaz de
bloquear a subunidade ribossomal 60s, impedindo a síntese protéica,
ocasionando, consequentemente, a morte celular. Devido ao seu elevado peso
molecular (32kDa), esta toxina não é endocitada isoladamente pelas células. A
associação a anticorpos permitem a endocitose da saporina e, ao mesmo tempo,
conferi especificidade a uma determinada população neuronal. A saporina quando
associada ao anticorpo monoclonal contra a enzima dopamina-β-hidroxilase
(DβH), forma o complexo saporina-anti-DβH, o qual é utilizado em lesões
específicas de neurônios catecolaminérgicos. O complexo saporina-anti-DβH é
internalizado pelas células, por um processo de reciclagem vesicular, ao ligar-se à
enzima DβH quando esta é liberada na fenda sináptica por exocitose (Picklo et al.,
1994).
De acordo com Wrenn e colaboradores (1996), células TH positivas não
foram encontradas nove meses após injeções intracerebroventriculares de
saporina-anti-DβH. Corroborando esse achado, aproximadamente 90% da
depleção noradrenérgica induzida por saporina-anti-DβH permaneceu
praticamente inalterada 40 semanas após a lesão (Coradazzi et al., 2010). Estes
dados indicam um efeito irreversível desta imunotoxina.
Resultados obtidos em estudos recentes com nanoinjeções de saporina-
anti-DβH na CVLM, mostraram uma redução de aproximadamente 79% e 62%
dos neurônios noradrenérgicos desta região (Pedrino et al., 2006; Pedrino et al.,
2008). Em outro trabalho, cerca de 70% dos neurônios noradrenérgicos A2 foram
reduzidos por nanoinjeções de saporina-anti-DβH no NTS (Pedrino et al., 2012).
Estes resultados, juntamente com os dados encontrados no presente trabalho,
mostram a efetividade da saporina-anti-DβH em lesionar células
catecolaminérgicas localizadas no sítio de nanoinjeção.
49
Nosso trabalho mostrou que a lesão provocada no grupamento
noradrenérgico A1 não ocasionou redução nos valores basais de pressão arterial
média em ratos normotensos e espontaneamente hipertensos, indicando
inicialmente o não envolvimento do grupamento A1 na gênese da hipertensão
arterial em SHR. Como mencionado anteriormente, estudos neuroanatômicos
demonstram que além do grupamento A1, os neurônios noradrenérgicos A2
projetam-se para o MnPO, podendo ser esta projeção catecolaminérgica a
responsável pela excitação do MnPO e consequente desenvolvimento do estado
hipertensivo nos SHRs. De fato evidências experimentais indicam o envolvimento
do NTS na gênese da hipertensão em SHRs. Freiria-Oliveira e colaboradores
(2013) demonstraram que microinjeções do vetor AAV2-CBA-MIF no NTS,
resultando na expressão do fator inibitório de migração de macrófago, promoveu
significativa queda nos níveis da PA em ratos espontaneamente hipertensos.
Ademais, estudos demonstraram que lesões eletrolíticas no NTS comissural
reduziram a PA para níveis normotensos em SHR, entretanto não alterou os
valores de PA em ratos normotensos Wistar-Kyoto e Wistar (Sato et al., 2001;
Sato et al., 2003 ). Assim é lícito supor a participação do NTS na manutenção do
estado hipertensivo em SHR e que os níveis elevados de PA nos animais com
lesão de A1 sejam mantidos, por meio de projeções bulbares advindas do
grupamento neuronal A2, as quais manteriam a excitação catecolaminérgica
sobre o MnPO.
Uma vez verificado que a lesão de A1 não promoveu redução na PA dos
animais e como ainda não encontra-se totalmente esclarecido a participação
deste grupamento neuronal nos ajustes cardiovasculares induzidos por alterações
na osmolaridade plasmática, buscamos determinar o envolvimento dos neurônios
A1 nas alterações do volume circulante provocada por sobrecarga de sódio. O
presente estudo indicou que a lesão dos neurônios noradrenérgicos A1 atenua a
resposta pressora induzida por hipernatremia aguda em ratos Wistar não
anestesiados. Estes resultados corroboram o envolvimento destes neurônios nas
vias neuronais de regulação do fluido corporal e do compartimento extracelular.
O íon sódio é o principal determinante da osmolaridade e do volume do
compartimento extracelular. Variações na concentração de Na+ pode causar um
50
fluxo osmótico entre os compartimentos intra e extracelular, podendo alterar o
volume, metabolismo e função celular (Strange, 1993).
Aumentos na osmolaridade promovem ajustes cardiovasculares,
endócrinos e anatômicos que buscam restaurar o equilíbrio hidroeletrolítico. Como
observado em outros estudos, nos animais normotensos sem lesão do
grupamento A1, a infusão da salina hipertônica resultou em um aumento da
pressão arterial (Weiss et al., 1996; Costa et al., 2009; Pedrino et al., 2005;
Pedrino et al., 2006). Além do aumento da PA, evidências experimentais sugerem
que a infusão de SH promove vasodilatação renal e distintas alterações regionais
na atividade simpática (Pedrino et al., 2006; May et al., 2000; Nishida et al., 1998;
Weiss et al., 1996). Em ratos anestesiados, foi demonstrado aumento da atividade
do nervo lombar e redução das descargas simpáticas sobre nervos renais e
esplânicos após a infusão de salina hipertônica (Weiss et al., 1996). Ademais,
estudos demonstraram que a infusão de salina hipertônica promoveu natriurese,
secreção do peptídeo natriurético atrial (ANP) e redução na liberação de
vasopressina (Bealer et al., 1983; Bealer et al., 1988; Antunes-Rodrigues et al.,
1992; Morris & Alexander, 19889).
Respostas a alterações no volume e na osmolaridade plasmática são, em
parte, estimuladas por neurônios osmosensitivos do SNC capazes de detectar a
hiperosmolaridade dos fluidos corporais e ativar circuitos adequados (Bourque,
2008). O Órgão Vasculoso da Lâmina Terminal (OVLT) e o Órgão Subfornical
(SFO) são núcleos prosencefálicos desprovidos da barreira hematoencefálica.
Estudos propõem a ativação dos neurônios destas regiões em resposta à
hipernatremia (Stocker et al., 2008). Trabalhos sugerem um aumento dos reflexos
simpáticos e da excitabilidade dos neurônios da região RVLM provocados por
aumento na concentração de Na+ (Adams et al., 2009; Stocker et al., 2010).
Ademais, pesquisadores postulam que um aumento na osmolaridade ou na
concentração plasmática de Na+ poderiam resultar em uma elevação da atividade
simpática, o que implicaria no desenvolvimento de doenças cardiovasculares,
inclusive a hipertensão arterial (Stocker et al., 2008; Toney & Stocker 2010).
Acredita-se que os neurônios A1 estejam envolvidos com uma resposta
humoral e autonômica à hipernatremia. Pedrino e colaboradores (2006 e 2008)
51
demonstraram que a sobrecarga de sódio, em ratos anestesiados com lesão de
A1, aboliu a vasodilatação renal, mecanismo importante para a excreção deste
íon. Estudos neuroanatômicos mostraram que neurônios A1 projetam
densamente para as regiões parvocelulares e magnocelulares do PVN
(Cunningham e Sawchenko, 1988). A porção parvocelular projeta-se para a região
RVLM, enquanto a porção magnocelular está envolvida na secreção de
vasopressina. Portanto, os neurônios A1 podem estar envolvidos na regulação
neuronal e humoral em resposta à hipernatremia aguda. Assim é lícito supor que
a lesão dos neurônios A1 nos animais normotensos poderia reduzir a secreção de
vasopressina e a resposta simpática, o que resultaria em uma diminuição da
resposta pressora induzida pela hipernatremia.
Em relação aos animais SHRs observamos que a hipertensão induzida
pela infusão de salina hipertônica foi semelhante entre os ratos controles e com
lesão do grupamento neuronal A1. Ademais, verificamos que esta resposta
pressora foi reduzida quando comparado aos animais normotensos. Uma vez que
os valores basais de pressão arterial nos SHRs são mais elevados, podemos
sugerir que este fator poderia contribuir para o menor aumento da pressão arterial
induzido pela hipernatremia nestes animais.
Em conjunto, os resultados obtidos neste estudo sugerem a participação do
SNC no desenvolvimento da hipertensão arterial e nos ajustes cardiovasculares
induzidos por alterações no volume circulante. Especificamente evidenciamos a
participação do MnPO nas vias neuronais envolvidas no desenvolvimento da
hipertensão observada nos SHRs, sugerindo uma modulação tônica mediada por
neurotransmissores adrenérgicos neste núcleo. Ademais, os resultados obtidos
demonstram a participação do grupamento noradrenérgico A1 da região CVLM
nas vias neurais responsáveis pela restauração do equilíbrio hidroeletrolítico
durante alterações na composição do fluido extracelular e na osmolaridade
plasmática.
52
Conclusão
53
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o bloqueio
adrenérgico do MnPO promove mudanças significativas nos parâmetros
cardiovasculares de ratos espontaneamente hipertensos e reforçam as evidências
de seu envolvimento no desenvolvimento da hipertensão arterial. Ademais, os
resultados indicam a não participação do grupamento noradrenérgico A1 na
gênese da hipertensão arterial em SHR, uma vez que a lesão no grupo A1 e as
alterações na inervação destes neurônios para o MnPO não foram suficientes
para provocar reduções nos níveis de pressão arterial nestes animais. Mostramos
também que a lesão dos neurônios noradrenérgicos A1 atenua a resposta
pressora induzida por hipernatremia aguda em ratos normotensos não
anestesiados, sugerindo o envolvimento destes neurônios nas vias neuronais de
regulação do volume circulante.
54
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64
Apêndice
65
1. ARTIGO
1.1. A1 NORADRENERGIC NEURONS LESIONS REDUCE
NATRIURESIS AND HYPERTENSIVE RESPONSES TO
HYPERNATREMIA
66
A1 NORADRENERGIC NEURONS LESIONS REDUCE NATRIURESIS AND
HYPERTENSIVE RESPONSES TO HYPERNATREMIA IN UNANESTHETIZED
RATS
Elaine Fernanda da Silva1, André Henrique Freiria-Oliveira1, Paulo César
Ghedini1, Carlos Henrique de Castro1, Luiz Artur Mendes Bataus1, Diego Basile
Colugnati1, Daniel Alves Rosa1, Sergio L. D. Cravo2, Gustavo Rodrigues Pedrino1
Corresponding author:
Gustavo Rodrigues Pedrino
Department of Physiological Science
Universidade Federal de Goiás
Estrada do Campus, s/n. Zip code: 74001-970. PO: 131. Goiânia - GO
Phone/Fax: +55-62-3521-1774
e-mail: [email protected] / [email protected]
Authors’ affiliation:
1Department of Physiological Sciences, Biological Sciences Institute, Federal
University of Goiás – GO, Brazil
2Department of Physiology, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de
São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
Short title: A1 noradrenergic neurons and body fluid homeostasis
Keywords: A1 Neurons; CVLM; Hypernatremia; Hypertonic Saline; Pressor
Response
67
Abstract
Noradrenergic neurons in the caudal ventrolateral medulla (CVLM; A1 group)
contribute to the cardiovascular regulation. The present study sought to determine
the effects of specific lesions of these neurons on the cardiovascular responses
induced by hypertonic saline (HS) infusion in unanesthetized rats. Male Wistar rats
(280-340 g) received nanoinjections of antidopamine-β-hydroxylase-saporin (A1
lesion, 0.105 ng.nL-1) or free saporin (0.021 ng.nL-1) into the CVLM. Two weeks
later, the rats were anesthetized (2% halothane in O2). Femoral artery and vein
were catheterized and led subcutaneously to exit between the scapulae. In the
following day animals were submitted to infusion of HS (3 M NaCl, 1.8 ml ∙ kg,
b.wt., over 1 min, over 1 min). In sham-group (n=8), the HS induced a sustained
pressor response (35 ± 3.6 and 11 ± 1.8 mmHg from baseline, at 10 and 90 min
after HS infusion, respectively). In anti-DH-saporin treated rats (n=11), HS
pressor response was smaller after 10 min (18 ± 1.4 mmHg), returning to baseline
values (2 ± 1.6 mmHg, 90 min after HS infusion). Moreover, the natriuresis
response induced by HS was reduced in lesioned group after 60 min of the
challenge (196 ± 5.5 mM, A1 lesion; 262 ± 7.6 mM, sham-group). In addition, A1-
lesioned rats excreted only 47% of sodium 90 min after HS infusion, while sham
animals excreted 80% of sodium. Immunohistochemical analysis indicates that
microinjections of anti-DH-saporin produced a large destruction of A1 cell group
in the CVLM. These results suggest that medullary noradrenergic A1 neurons are
part of the excitatory neural pathways regulating the hypertensive and natriuretic
responses to acute changes in the composition of the body fluid.
68
Introduction
Sodium (Na+) cation stands out as the principal ion for determining the
osmolarity and volume of the extracellular compartment due to its concentration
and reduced permeability through the plasmatic cell membrane. Variations in the
concentration of this ion can cause an osmotic flux between the intra- and
extracellular compartments. This flux can be felt by all of the perfused tissues and
may alter the volume, metabolism, and cellular function [1].
The central nervous system (CNS) can detect variations in the volume,
tonicity, and composition of the extracellular compartment through various
peripheral and central receptors [2–5]. Once detected by the CNS, these
variations trigger a set of responses for reestablishing the physiological conditions.
In mammals, a slight increase of 1-2% in the plasma osmolarity or a reduction of
8-10% in the extracellular compartment volume is enough to induce water intake
[6,7]. As for the vegetative adjustments, an increase in plasma sodium
concentration stimulates the reduction in sympathetic renal nerve activity [8–12],
renal vasodilation [3,11,13–17], thereby resulting in natriuresis [18–21], and
diuresis [2,22]. Humoral responses also contribute to the regulation of osmolarity
through the inhibition of renin [23], secretion of atrial natriuretic peptides
(ANP)[24–28], oxytocin (OT) [29–32] and vasopressin [32].
Experimental evidences have shown the importance of A1 noradrenergic
neurons, localized in caudal ventrolateral medulla (CVLM), in the regulation of
cardiovascular and circulating volume [12,17,33]. Studies using the gene
expression of immediate activation showed that A1 neuronal group is activated by
increase in osmolarity or plasmatic volume [34–37]. Moreover, it has been showed
an important role of A1 noradrenergic neurons on renal vasodilatation and
sympathoinhibition induced by hypernatremia [12,17].
Neuroanatomical studies have demonstrated that the A1 noradrenergic
neurons receive information from the baroreceptors and cardiopulmonary
receptors [38–40]. These neurons are reciprocally connected with hypothalamic
structures involved in cardiovascular, hydroelectrolytic and neuroendocrine
regulation [41–48]. Thus, A1 neurons projections to diencephalic regions represent
an important link in the neural circuits that participate in body fluid homeostasis.
Therefore, in the present study, we sought to determine the hypothesis that
A1 neuronal group may be involved in the cardiovascular and renal responses
induced by acute hypernatremia in unanesthetized rats. For this, we used anti-
dopamine beta hydroxylase (DβH)–saporin to cause the lesion of noradrenergic
neurons in the CVLM region and measured the effects of these lesions on pressor
response and renal excretion induced by hypertonic saline (HS) infusion.
69
Results
Lesion of the medullary catecholaminergic neurons induced through
nanoinjections of anti-DβH–saporin into the CVLM
TH-positive neurons are found within the ventrolateral medulla (VLM) and
the nucleus of the solitary tract (NTS) from positions approximately 1900 μm
caudal to 1900 μm rostral to the obex (Figures 1 and 2). In the saporin-treated
animals (sham; n=8), tyrosine hydroxylase (TH)-positive neurons in the VLM
between 200 μm and 1900 μm caudal to the obex averaged approximately 25 cells
per section (A1 neurons). In rats treated with bilateral nanoinjections of anti-DβH-
saporin into the CVLM (n=11), the number of TH-positive neurons caudal to the
obex was reduced to approximately four cells per section. In this region, which
encompasses the area of the A1 noradrenergic neurons, the number of TH-
positive neurons was reduced by 81% compared to the saporin treated animals
(Figure 1 and 2).
Nanoinjections of anti-DβH–saporin within the CVLM did not reduced the
number of TH-immunopositive cells in the region located from 200 μm caudal to
1900 μm rostral to the obex (the region encompassing the C1 cell group), to
approximately 10% (Figures 1 and 2). In the TH-positive cells in the A2 and C2 cell
groups in the NTS (localized between 1900 μm caudal to 1900 μm rostral to the
obex), we did not find significant changes in the number of TH-immunopositive
cells (reduction of 0%; Figures 1 and 2).
The Dot Blot technique, performed with samples median preoptic nucleus
(MnPO) showed that the nanoinjections of anti-DβH-saporin in CVLM caused
reduction of TH levels in MnPO (Figure 3), thereby demonstrating that the lesion of
A1 noradrenergic afferents to MnPO was effective in the alteration of
noradrenergic neurotransmission in this nucleus.
Analysis of the medullary catecholaminergic neurons lesion on the baroreflex and
chemoreflex
The baseline values of body weight (b.wt.), mean pressure arterial (MPA)
and heart rate (HR) are shown in Table 1. Anti-DβH-saporin treated rats presented
high basal levels in heart rate. Other values were similar in sham and A1-lesioned
rats.
The functionality of the baroreceptor reflexes was evaluated by infusion of
phenylephrine, express by index of baroreflex in Figure 4 A. As observed there
was no found differences between sham (-2.1 ± 0.07 bpm ∙ mmHg-1; n=8; Figure 4
70
A) and A1-lesioned (-2.1 ± 0.02 bpm ∙ mmHg-1; n=7; Figure 4 A) animals, showing
the preservation of cardiac baroreceptor sensitivity.
In the Figure 4 B and C are mean ± S.E.M. of changes in MAP and HR
recorded during chemoreflex test. There were no statistical differences in changes
of MAP and HR in A1-lesioned (69 ± 5.3 mmHg and -220 ± 33.4 beats.min-1,
respectively; n=7) and sham (63 ± 5.1 mmHg and -198 ± 21.2 beats.min-1,
respectively; n=8) rats induced by KCN infusion, showing the integrity of
chemoreflex response.
Effects of destruction of the medullary catecholaminergic neurons on the changes
in MAP and HR induced by HS infusion
The infusion of HS, in sham animals, caused a sustained pressor response
(36 ± 3 and 11 ± 1.8 mmHg from baseline, at 10 and 90 min after HS, respectively;
n=8; Figures 5 A and 6 A). In anti-DH-saporin treated rats, the infusion of HS
caused an attenuated pressor response (18 ± 1.4 and 2 ± 1.6 mmHg from
baseline, at 10 and 90 min after HS, respectively; n=11; Figure 5 B and 6 A). The
sodium overload triggered an initial bradycardia in both groups (-38 ± 10.3
beats.min-1, at 10 min after HS, sham group; -61 ± 9,5 beats.min-1 from baseline,
at 10 min after HS, lesioned group; Figures 5 and 6 B). In both HR returns to basal
values 90 min after HS (31 ± 6.0 beats.min-1, sham group; 0 ± 7.5 beats.min-1 from
baseline, lesioned group; Figures 5 and 6 B).
Effects of HS infusion on plasma sodium and blood hemoglobin concentrations
The plasma sodium and hemoglobin concentration changes induced by HS
infusion were determined in sham and A1-lesioned rats. Plasma sodium
concentrations basal were similar in sham (140.8 ± 0.5 mM; n = 6; Figure 7 A) and
A1-lesioned rats (140.6 ± 0.3 mM; n = 6; Figure 7 A). The plasma sodium levels
increased similarly after HS infusion in both groups (146.7 ± 0.9 mM and 146.9 ±
0.5 mM in sham and A1-lesioned rats, respectively, 10 min after infusion; Figure 7
A). However, in anti-DH-saporin treated animals the sodium concentration
remains higher (144.9 ± 0.6 mM and 144.4 ± 0.6 mM; 60 and 90 min after infusion;
Figure 7 A) when compared with sham group (142.8 ± 0.6 mM and 142.3 ± 0.5
mM; 60 and 90 min after infusion; Figure 7 A). There was increased in the blood
hemoglobin concentrations in A1-lesioned rats 90 min after HS infusion (103.3 ±
1.6% and 98.8 ± 1.2% in A1-lesioned and sham rats, respectively; Figure 7 B)
indicating a reduction of extracellular volume.
71
Effects of HS infusion on urinary excretion
The HS infusion caused increased in urinary volume in sham (3.85 ± 0.2 ml,
90 min after HS infusion, n=6; Figure 8 A) and anti-DβH-saporin treated rats (4.38
± 0.2 ml, 90 min after HS infusion, n=6; Figure 8 A). The A1-lesioned rats show
less sodium in urine (212.09 ± 7.1 mM, 90 min after HS infusion; Figure 8 B) and
less cumulative urinary sodium (0.90 ± 0.05 mmol, 90 min after HS infusion;
Figure 8 C), when compared with sham group (292.0 ± 6.8 mM, 90 min after HS
infusion; 1.12 ± 0.07 mmol, 90 min after HS infusion, respectively; Figure 8 B and
C). The data of sodium balance showed that lesioned rats excreted only 47% of
sodium infused with HS, while sham animals excreted 80% of sodium (Figure 8
D). Overall results indicate a lower capacity of A1-lesioned rats to excrete sodium.
Discussion
Previous studies have indicated that A1 noradrenergic neurons are involved
in the regulation of body fluid homeostasis [12,17,33]. However, the participation
of these neurons in the regulatory mechanisms induced by changes of volume or
composition of extracellular compartment is yet to be fully clarified. The present
study provides new key observations: In A1-lesioned rats hipernatremia attenuates
the pressor response. Moreover, lesion of A1 noradrenergic neurons slows down
the mechanisms of sodium excretion induced for acute hypernatremia in
unanesthetized rats. These results strengthen the importance of A1 neurons in the
CVLM as part of neural pathways involved in the regulation of composition and
volume of the extracellular compartment. To our knowledge, there is only no other
study that demonstrated important role of A1 noradrenergic lesion on hypertension
and renal sodium excretion induced by hypernatremia in unanesthetized rats.
The present study demonstrates that nanoinjections of anti-DβH–saporin
into the CVLM produce an extensive depletion of the catecholaminergic cell
population. Our data indicate that bilateral nanoinjections of anti-DβH–saporin
induced a marked loss (81%) of TH-containing neurons within 1.9 mm caudal to
the óbex, hence assuming a massive lesion of the A1 catecholaminergic cell group
[48]. In addition, there were no significant changes in catecholaminergic neurons
localized in RVLM (C1 group; 10%) and NTS (A2 group; 0%) regions, indicating
specificity in lesion of the A1 neuronal grouping.
Previous reports support the assertion that the loss of immunoreactivity is
indicative of neuronal death [17,49,50]. The mechanism of specific internalization
of the conjugated anti-DβH–saporin determines that only cells synthesizing DβH
can take up the conjugated toxin. It is postulated that, in catecholaminergic
neurons, the somatodendritic exocytosis of catecholamines resulted in the
exposure of DβH and therefore the possible internalization of the anti-DβH-saporin
72
complex via their soma and/or dendrites. It is unlikely that the noradrenergic
neurons survived, since saporin acts by blocking ribosomal unit 60s to inhibit
protein synthesis.
According to Wrenn et al. [51], TH or DβH-cells were not found 9 months
after intracerebroventricular injections of anti-DβH–saporin. This implies the
irreversible effects of this substance. Similar results were obtained in recent study
in which nanoinjection of anti-DβH–saporin into the CVLM depleted approximately
79% of A1 noradrenergic neurons within this region [17]. Furthermore, in the
present study the lesion of A1 neurons revealed a decrease in levels of TH
enzyme in MnPO, indicating a reduction of levels of TH in MnPO. These results
indicate the efficacy of anti-DβH-saporin in selective destruction of noradrenergic
neurons.
Empirical evidences had shown the involvement of A1 neurons in the
cardiovascular regulation. However, the result shows that A1 lesion and decrease
in levels of TH in MnPO did not change baseline levels of mean arterial pressure.
These results are in agreement with Pedrino et al. [12,17], who also reported
unaltered baseline values of MAP between sham and A1-lesioned rats.
Studies have also reported an important role of baroreceptors and
chemoreceptors in the responses induced by changes in extracellular volume and
composition [10,26,52]. Previous studies demonstrated that the hypertension
induced by HS was significantly higher in rats submitted to sinoaortic denervation
[10]. We found changes in MAP induced by HS infusion in A1-lesioned animals.
However, this pressor response to HS cannot be explained by changes in the
baroreflex or chemoreflex, once there was preservation of sensibility baroreflex
and chemoreflex response.
Several studies have been attempted to establish the effects of HS infusion
on cardiovascular and renal parameters. The HS infusion causes an increase in
plasma osmolality resulting an increase in lumbar sympathetic nerve activity,
vasopressin release and increase in blood pressure [10, 32, 15, 17]. Meanwhile,
attenuated increased in MAP and slightly increased in urinary volume in anti-DβH-
saporin treated rats were observed. These results can be associated with a lower
capacity of these A1-lesioned rats in releasing vasopressin. Indeed, anatomical
studies have shown that medullary noradrenergic neurons receive sensory
information from baro and cardiopulmonary receptors [38–40]. Information about
the circulating volume is processed and transmitted to hypothalamic centers
involved in the regulation of osmolarity. Saphier [46] used extracellular recordings
of neurons in the PVN to demonstrate electrical stimulation of regions where the
A1 neurons excited most of the magnocellular oxytocin and vasopressin excreting
neurons in this nucleus. These results suggest that A1 neurons may be involved in
the regulation humoral in the response to acute hipernatremia.
73
Our results demonstrate that A1-lesioned rats showed a slower sodium
excretion induced by HS infusion. Studies have shown increased in release of
ANP and OT and reduction in renal sympathetic nerve activity, induced by acute
changes in circulating volume [9,10,32,35,46]. Recent studies showed that A1
lesion prevented the vasodilatation[17] and renal sympathoinhibition induced by
HS infusion[12]. In addition, some experiments showed that A1 lesioned animals
have a potentiated sodium intake after extracellular dehydration33. Consistent with
these reports, the present data suggested slower sodium excretion in A1-lesioned
rats.
Taken together, the results obtained in this study are consistent with the
hypothesis that the A1 noradrenergic neurons activated by peripheral afferents are
part of the central pathways modulating the adjustments induced by acute
changes in plasma sodium concentration. Thus, these noradrenergic neurons are
integral parts of the pathways involved in response to hypernatremia, and
dysfunctions in these cells result in the inefficient functioning of these adjustments,
which could contribute to the genesis and aggravation of various pathological
states, among which we highlight hypertension and diseases related to renal
sodium retention, such as cirrhosis and cardiac failure.
Methods
Animals
All experiments were conduct on adult male Wistar rats (280-340 g). They
were obtained from the central animal house of the Federal University of Goiás.
Experimental procedures were designed with strict adherence to the National
Health Institute Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals as approved
by the Ethics Committee, Federal University of Goiás (protocol number 172/09).
Nanoinjections of anti-DβH-saporin or saporin into CVLM
Animals were anaesthetized with halothane (2%; Cristália Ltda, Itapira, SP,
Brazil) in O2 and mounted prone in a stereotaxic apparatus (David Kopf
Instruments, Tujunga, CA, USA) with the incisor bar 11 mm below the interaural
line. After partial removal of the occipital bone, the meninges covering the dorsal
surface of the brainstem were cut and retracted, and the calamus scriptorius was
visualized. Nanoinjections of anti-DβH-saporin (0.105 ng.nL-1; Advanced Targeting
Systems, San Diego, CA, USA) or an equimolar dose of saporin (0.021 ng.nL-1;
Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, USA) were made bilaterally at two
74
levels of the CVLM. For all nanoinjections into CVLM, a glass micropipette was
positioned as follows: 0.3 mm rostral and 0.3 mm caudal from the calamus
scriptorius, 2.0 mm lateral from the mid-line and 2.0 mm ventral from the dorsal
surface. These co-ordinates are based on the region of the CVLM comprising the
A1 group[48]. After nanoinjections, the micropipette was left in place for 3 min.
Then the incision was closed and the animals were placed on a heated pad to
maintain body temperature during recovery. A prophylactic antibiotic dose
(penicillin, 60.000 IU kg-1, i.m. Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) was injected
after the surgery. Animals were studied 15 days after microinjections into the
CVLM.
Surgical procedures
The rats were anesthetized with 2% halothane (Cristália Ltda, Itapira, SP,
Brazil) in O2. The right femoral artery was cannulated for blood pressure recording.
The right femoral vein was catheterized for drug administration (phenylephrine and
potassium cyanide) and infusion of hypertonic saline (HS). The cannulas were led
subcutaneously to exit between the scapulae.
Recording of arterial pressure and heart rate
To record arterial pressure, the arterial catheter was connected to a
pressure transducer attached to a bridge amplifier (ETH-200; CB Sciences, Dover,
NH, USA). Pulsatile pressure was recorded continuously with a PowerLab System
(ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). MAP and HR were determined
from the pulsatile signal with Chart software (version 5.5.6; ADInstruments,
Colorado Springs, CO, USA).
Baroreflex and Chemoreflex Tests
A day after surgery, animals were subjected to baroreflex and chemoreflex
tests through infusion of phenylephrine (1 g, 1,5 g e 2 g; adrenergic agonist;
Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) and potassium cyanide (40 g; Sigma-Aldrich,
St Louis, MO, USA), respectively. All injections were performed at least 5 minutes
between each one, or until cardiovascular parameters return to baseline.
Infusion of hypertonic saline and blood sampling
In order to increase plasma sodium concentration, HS (3 M NaCl, 1.8 ml ∙
kg, b.wt., over 1 min) was infused through the femoral vein cannula. After infusion
of HS the cardiovascular parameters were recorded for 90 min. Blood samples
75
(0.20 ml each) were withdrawn from the arterial cannula 5 min before and 10, 30,
60 and 90 min after HS. After the sample was collected, an equal volume of sterile
0.15 M NaCl was injected to reduce changes in extracellular fluid volume due to
sampling. The blood hemoglobin concentration was measured immediately with a
kit from Sigma (Drabkin’s reagent, kit 525; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).
The rest of the sample was centrifuged for 5 min at 6000 g. The plasma was
removed and stored at -20°C. Plasma sodium concentration in the blood was
measured with a flame photometer (model DM6, Digimed, São Paulo, SP, Brazil).
Urine Analysis
Rats with A1 lesion or sham were housed in metabolic cages with free
access to water only for 48 h before tests. On the day of the urinary excretion test,
all animals received a suprapubic massage to induce micturition. Then after 5 min,
HS solution was infused and urine samples were collected in polypropylene tubes
to measure urinary volume at 30, 60 and 90 min. The concentration of sodium in
the urine was measured with a flame photometer (model DM6, Digimed, São
Paulo, Brazil). The amount of sodium in the urine was determined by the product
of urine volume and sodium concentration. The urinary balance was calculated as
the difference between the amount infused and the amount excreted. During the
experiments animals had no access to water and food.
Perfusion, fixation and tissue collection
At the end of the experiments, the animals were profoundly anesthetized
and perfused through the heart with saline (0.15 M NaCl) followed by a solution of
4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in 0.2 M sodium
phosphate buffer (500 ml at pH 7.4).The brain was removed and post fixed in 4%
paraformaldehyde solution for 1–2 h, then cryoprotected in 30% sucrose solution.
Coronal sections of 40 μm of the brainstem were collected (in 4 serially adjacent
sets) and stored in 0.02 M potassium phosphate-buffered saline (KPBS, Sigma;
pH 7.4).
Immunohistochemistry
Each fourth brainstem section was processed for immunohistochemical
detection of TH. The sections were pre-incubated for 15 min in 3% hydrogen
peroxide in 0.02 M KPBS followed by a 30 min incubation in 2% normal horse
serum (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) in 0.02 m KPBS. The
sections were incubated overnight at 4°C with mouse monoclonal antibody
76
(1:2000 dilution, ImmunoStar, Inc., Hudson, WI, USA) with 2% normal horse
serum and Triton X 10%, followed by a 1 h incubation with biotinylated horse
antimouse IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA; 1:2000 dilution
with Triton X 10%). After these incubations, the sections were processed with the
avidin–biotin procedure, using Elite Vectastain reagents (Vector Laboratories Inc.,
Burlingame, CA, USA). Diaminobenzidine (DAB; Vector Laboratories Inc.,
Burlingame, CA, USA) was used to produce a brown cytoplasmic TH reaction
product. Sections were mounted on slides, dehydrated in a series of alcohols,
cleared in xylene, and coverslipped.
Cell counting
Counts of neurons were performed in every fourth medulla oblongata
section (40 of each 160 μm). All immunolabelled neuron in the ventrolateral
medulla (VLM; A1/C1) and nucleus of the solitary tract (NTS; A2/C2) were counted
bilaterally in order to quantify the extent of the anti-DβH–saporin-induced lesion.
Neurons were counted at x200 magnification with a Nikon light microscope.
Dot Blot
Approximately 100 mg of MnPO and cortex brain samples were macerated
in Tris-HCl 50 mM pH 7.5. Sample were centrifuged at 12.000/4oC for 5 minutes.
The supernatant was transferred to another tube and protein concentration was
estimated using the method of Bradford [53]. Fifty µg of each sample were
transferred to nitrocellulose membrane. After a 1 h blocking step in 5% powdered
milk diluted in TBS 0.05% with Tween 20, the membrane was incubated overnight
at 4°C with TH mouse monoclonal antibody (1:5000 in 1% milk TBS-Tween
20; Immuno Star Inc., Hudson, WI, USA). Following 4 washes of 15 min at RT, the
membrane was incubated for 1 h with an anti-mouse coupled to phosphatase
(1:2000 in 1% milk TBS-Tween20), washed again 4× and finally revealed by
BCIP/NBT solution (Amresco LLC, Solon, OH, USA).
Data analysis
The effects of treatment with anti-DβH–saporin or saporin on the number of
catecholaminergic medullary neurons are presented as means ± S.E. Cell
countings for every section were compared by one-way ANOVA. Also, total cell
counting for A1, C1, A2 and C2 regions were calculated and compared between
groups by unpaired Student´s t-test. Cardiovascular and renal responses, and
plasma sodium and blood hemoglobin concentrations data were analyzed by two-
77
way analysis of variance followed by the Fisher LSD test. The differences of
baseline levels (Table 1) between groups were analyzed by the unpaired Student’s
t-test. A value of P < 0.05 was considered to denote a significant difference.
Acknowledgements
This work was supported by Coordenadoria de Aperfeiçoamento em
Pesquisa (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq; #477832/2010-5) and Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado de Goiás (FAPEG; #200910267000352).
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Figure Legends
Figure 1. Medullary catecholaminergic neurons. Photomicrographs taken at 3
levels of the medulla showing TH-immunoreactive cells in the NTS (A2
noradrenergic neurons), CVLM (A1 noradrenergic neurons) and RVLM (C1
adrenergic neurons) in rats nanoinjected with unconjugated saporin (sham) or anti-
DβH-saporin. Arrows indicate TH-positive cells. Scale bar 50 µm.
Figure 2. Lesion of A1 noradrenergic neurons with nanoinjections of anti-
DβH-saporin into the CVLM. Number and average (mean ± S.E.M.) of TH-
positive cells in 40 µm-thick sections from the dorsal (A) and the ventrolateral
medulla (B). Sections were taken from 1.9 mm rostral to the obex to 1.9 mm
caudal to the obex in animals submitted to A1 lesions or sham. Bilateral
nanoinjections of anti-DbH-saporin into the CVLM produced a loss of TH-
containing neurons in this area (A1 group, loss = 81%), in the RVLM (C1 group,
loss = 10%) in the NTS (A2/C2 groups, loss = 0%). † compared with sham, p <
0,05.
82
Figure 3. Photomicrography of the nitrocellulose membrane whith marking
to TH in MnPO and cortex. Molecular analysis of noradrenergic
neurotransmission of A1 group of region CVLM for MnPO with marking to TH
(circle) by technique of Dot Blot, in sham and anti-DβH-saporin treated rats.
Photomicrographs of a coronal section of brain showing withdrawal of the tissue
mass of MnPO (circle) and of cortex (arrows; B).
Figure 4. Baroreceptor sensitivity and chemoreflex response. Index of
baroreflex (A) express by reason between changes of heart rate (HR) and mean
arterial pressure (MAP) induced by phenyleprine infusion in sham and A1-
lesioned rats. Changes in MAP (B) and HR (C) caused by potassium cyanide
infusion.
Figure 5. Typical examples. Digitized record of cardiovascular responses
induced by hypertonic saline infusion in sham (A) and A1-lesioned rats (B). Arterial
blood pressure (ABP), mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR).
Figure 6. Effects of A1 noradrenergic neurons lesions on cardiovascular
responses induced by hypernatremia. Effects of infusion of hypertonic saline (3
M NaCl, 1.8 ml.Kg-1 body weight) on mean arterial pressure (MAP; A) and heart
rate (HR; B) in sham and A1-lesioned rats. The bars indicate the moment of
hypertonic saline infusion. *compared with baseline; † compared with sham in the
same time point, both p < 0,05.
Figure 7. Plasma sodium and blood hemoglobin concentrations. Mean ±
S.E.M. of plasma sodium (A) and blood hemoglobin concentration (B) in baseline
and in response to HS infusion in sham and A1-lesioned rats. * different of
baseline; † different of sham in the same time point., both p < 0,05.
Figure 8. Effects of A1 noradrenergic neurons lesions on renal responses
induced by hypernatremia. Effects of infusion of hypertonic saline (3 M NaCl, 1.8
ml.Kg-1 body weight) on cumulative urinary volume (A), sodium concentration (B),
cumulative urinary sodium (C) and sodium balance (D) in sham and A1-lesioned
rats. Error bars indicate S.E.M. *compared with baseline; † compared with sham in
the same time point., both p < 0,05.
83
Tables
Table 1. Baseline values for body weight, MAP and HR in sham and A1 lesioned
rats.
Values are means ± S.E. BW, body weight; MAP, mean arterial pressure; and HR,
heart rate. † compared with sham. p < 0,05.
Group BW (g) MAP (mmHg) HR (beats.min-1)
Sham 323 ± 5.7 112.4 ± 2.1 343.0 ± 8.4
A1 Lesion 318 ± 7.4 114.0 ± 1.9 396.0 ± 13.4 †
84
Figure 1
85
Figure 2
86
Figure 3
87
Figure 4
88
Figure 5
89
Figure 6
90
Figure 7
91
Figure 8
