EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS DE ... · de TCM e óleo de peixe em...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE CLINICA MEDICA

BIANCA BELLIZZI DE ALMEIDA

EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE

TRIGLICERÍDEOS DE CADEIA MÉDIA E ÓLEO DE PEIXE NA

ESTEATOSE HEPÁTICA E ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS

PELA DIETA HIPERLIPÍDICA TERMOLIZADA EM RATOS

Ribeirão Preto

2014

BIANCA BELLIZZI DE ALMEIDA

EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE

TRIGLICERÍDEOS DE CADEIA MÉDIA E ÓLEO DE PEIXE NA

ESTEATOSE HEPÁTICA E ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS

PELA DIETA HIPERLIPÍDICA TERMOLIZADA EM RATOS

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título

de Doutor em Ciências Médicas.

Área de concentração: Investigação Biomédica

Orientador: Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Jr.

Versão Corrigida

(versão original encontra-se disponível na Secretaria de Pós-Graduação

da Clínica Médica)

Ribeirão Preto

2014

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho,

por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo

ou pesquisa, desde que citada a fonte.

FICHA CATALOGRÁFICA

Almeida, Bianca Bellizzi

Efeitos metabólicos da combinação de triglicerídeos de cadeia média e óleo de peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela dieta hiperlipídica termolizada em ratos

142p.: il.; 30 cm

Tese de doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Clínica Médica.

Orientador: Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Jr.

1. Dieta hiperlipídica termolizada. 2. esteatose hepática não alcoólica. 3.estresse oxidativo.

4. óleo de peixe. 5. óleo de TCM. 6.ratos.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome: Bianca Bellizzi de Almeida.

Título: Efeitos metabólicos da combinação de triglicerídeos de cadeia média e óleo de

peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela dieta hiperlipídica

termolizada em ratos.

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em

Ciências Médicas.

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr.___________________________________________Instituição:_______________

Julgamento:___________________________ Assinatura:___________________________









Dedicatória

Dedico este trabalho aos meus pais, Marco Antônio e Maria Teresa, meu irmão

Marco Aurélio, meus avós, Mário, Marilene, Benedito e Benedita (in memorian)

e à minha bisavó Julieta (in memorian).

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus por me dar força e inspiração para seguir em

busca dos meus sonhos.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Jr. pela confiança e por estes

10 anos de aprendizado e de amizade.

As queridas Laura Barreto, Paula P. Ovídio, Lívia Simões, Lilian Eslaine ,

Renata Lataro, Valdecir Blefari, pelo auxílio no experimento, nas análises e pela

amizade.

Aos amigos Gabriela Castro, Izabel Leme, Patricia Contri, Cecilia Helena

Mattos, Mirele Mialich, Monique Pichi , Helena Vassimon, Stela, Ronaldo,

pelo auxilio, pelos conselhos e pela amizade.

Aos técnicos do Biotério de Clínica Médica, Adalberto Verceze, Maurício

Arantes e Roni Charles pela dedicação.

Ao departamento de Clínica Médica pela oportunidade de realizar este estudo.

Ao Émerson, da Secretaria de Pós-Graduação da Clínica Médica pela atenção

disponibilizada.

Aos meus pais, irmão e familiares pelo amor e apoio incondicionais.

As minhas queridas amigas Ana Paula Sanches, Mariana Mathias, Thaís de

Oliveira, Paula Valéria Domingues, Paula Campos, Danielle Marques e Daphne

Leonardi Carvalho pelo carinho, apoio e todos estes anos de amizade.

Ao Carlos Eduardo por seu amor, apoio e incentivo durante todos estes anos.

A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste

trabalho.

Epígrafe

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de

água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.

Madre Teresa de Calcutá

Resumo

ALMEIDA, B.B. Efeitos metabólicos da combinação de triglicerídeos de

cadeia média e óleo de peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo

induzidos pela dieta hiperlipídica termolizada em ratos. 2014. 142f. Tese

(Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2014.

Introdução: Os efeitos metabólicos do uso combinado dos triglicerídeos de cadeia

média (TCM) e do óleo de peixe (OP) na esteatose hepática ainda não estão

totalmente esclarecidos. Objetivo: O presente estudo teve o objetivo de verificar os

efeitos da combinação dos TCMs e OP na esteatose hepática e estresse oxidativo

induzidos pela dieta hiperlipídica (HL+) termolizada em ratos. Material e Métodos:

Foram utilizados no total 50 ratos machos da linhagem Wistar. O grupo Controle

(n=10) recebeu a dieta controle. Os grupos HL+ receberam a dieta contendo 50% de

gordura animal (GA) termolizada e 50% de ração. A adaptação às dietas HL+ foi

realizada durante 5 dias. Os grupos HL+GA, HL+TCM, HL+OP e HL+TCM/OP (n=10)

receberam a dieta HL+ com 50% de lipídios (gordura animal termolizada) durante 30

dias. Após este período, os grupos HL+TCM, HL+OP e HL+OP/TCM receberam as

dietas HL+ adicionadas de óleo de TCM (OTCM), OP e OTCM + OP,

respectivamente, durante 20 dias. As análises realizadas foram a gordura hepática

total, frações lipídicas hepáticas e séricas, glicemia, vitamina E e retinol séricos,

glutationa reduzida (GSH) e malondialdeído (MDA) sérico e hepático e

aminotransferases séricas. Resultados: Os grupos HL+ apresentaram acúmulo

significativo de gordura total e triglicerídeos hepáticos, exceto o HL+OP. Apenas o

grupo HL+TCM não apresentou acúmulo significativo de colesterol total hepático

(CT). Este mesmo grupo apresentou valores maiores de CT e HDLcol séricos e

menor razão triglicerídeos/HDLcol. Os valores séricos de aminotransferases foram

significativamente maiores nos grupos que receberam os OTCM e/ou OP. A

peroxidação lipídica (LPO) hepática foi maior foi nos grupos HL+, exceto o HL+TCM.

Apenas o grupo HL+GA apresentou maior LPO sérica. Verificou-se que a GSH foi

maior nos grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM, a vitamina E sérica foi menor nos

grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM e o retinol sérico foi maior nos grupos HL+GA

e HL+TCM. Conclusões: As alterações séricas não refletiram as alterações

hepáticas em relação aos lipídios, estresse oxidativo e antioxidantes. O uso do óleo

de TCM e óleo de peixe em associação na dieta HL+ resultou em efeito negativo

devido ao maior acúmulo de gordura hepática tanto na forma de triglicerídeos quanto

de colesterol, maior peroxidação lipídica hepática e menor vitamina E sérica.

Palavras-chave: dieta hiperlipídica termolizada, esteatose hepática não

alcoólica, estresse oxidativo, óleo de peixe, óleo de TCM, ratos.

Abstract

ALMEIDA, B.B. Metabolic effects of combined use of medium chain

triglycerides and fish oil on hepatic steatosis and oxidative stress induced by

high fat thermolyzed diet in rats. 2014. 142f. Tese (Doutorado) - Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014.

Introduction: The metabolic effects of combined use of medium chain triglycerides

(MCT) and fish oil (FO) on non alcoholic hepatic steatosis are not fully understood.

Objective: The aim of this study was to investigate the effects of the combination of

MCT and FO on hepatic steatosis and oxidative stress induced by high fat (HF+)

thermolyzed diet in rats. Methodology: Fifty wistar male rats were studied. The

Control group (n = 10) received the standard diet. The HF+ groups received diet with

50% of thermolyzed animal fat (AF) and 50% of ration. Five days were dedicated for

adaptation to high-fat diets. The groups HF+AF, HF+MCT, HF+FO and HF+MCT/FO (n

= 10) received HF+ diet with 50% thermolyzed fat during 30 days. After this period,

the groups HF+MCT, HF+FO and HF+MCT/FO received HF+ diets with MCT oil

(MCTO), FO and MCTO + OP, respectively, during 20 days. Analysis of total liver fat,

liver and serum lipid fractions, serum glucose, vitamin E and retinol, serum and liver

reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA), and serum

aminotransferases (AST and ALT) were performed. Results: The groups HF+

showed higher total fat and triglycerides, except HF+FO. Only HF+MCT group didn´t

have higher liver total colesterol (TC). This same group had higher serum TC and

HDLcol and lower triglycerides/HDLcol ratio. The groups fed with MCTO and/or FO

had higher serum aminotransferase. Liver lipid peroxidation (LPO) was higher in HF+

groups, except HF+MCT. Serum LPO was higher in HF+AF. The hepatic GSH was

higher in the groups HF+AF, HF+MCT and HF+MCT/FO, serum vitamin E was lower

in groups HF+AF, HF+FO and HF+MCT/FO, and serum retinol was higher in groups

HF+AF and HF+MCT. Conclusions: Lipids, oxidative stress and antioxidant serum

and liver alterations didn’t correspond. The association of MCTO with FO in HF+ diet

resulted in a negative effect when it concerns liver fat, triglyceride and cholesterol

accumulation, higher liver lipid peroxidation and lower serum vitamin E.

Key-words: high fat thermolyzed diet, non alcoholic hepatic steatosis, oxidative

stress, fish oil, MCT oil, rats.

Lista de Figuras

Figura 1: Prevalência de NAFLD no grupo de risco (%)...........................................24

Figura 2: Mecanismos de progressão da NAFLD à NASH ...................................... 30

Figura 3. Valores de vitamina E dos óleos de TCM e peixe e da gordura animal

(nmol/mL) ......................................................................................... ........................ 62

Figura 4. Evolução semanal do peso dos animais (g) .............................................. 64

Figura 5. Ingestão alimentar semanal dos animais (g) ............................................. 67

Figura 6. Ingestão energética semanal dos animais (g) ........................................... 68

Figura 7. Percentual de gordura hepática (%) .......................................................... 75

Lista de Quadros Quadro 1. Composição das dietas experimentais (g/100g) ..................................... 45

Quadro 2. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%) .............. 46

Quadro 3. Composição percentual em ácidos graxos dos óleos de peixe, TCM e

gordura animal .......................................................................................................... 58

Quadro 4. Índice de peroxibilidade (IP) dos óleos de TCM e peixe e gordura

animal utilizados na dieta.......................................................................................... 60

Lista de Tabelas

Tabela 1. Peso inicial, peso final e ganho de peso dos animais durante todo

experimento (g) ........................................................................................................ 65

Tabela 2. Ingestão alimentar diária (g/dia), ingestão energética diária (Kcal/dia),

ganho de peso diário (g/dia) e taxa de eficiência da dieta (TED) ............................ 70

Tabela 3. Peso hepático, peso do tecido adiposo epididimal e retroperitonial e razões

em relação ao peso corporal (g) ............................................................................... 72

Tabela 4. Caracterização de gordura hepática pelos valores de gordura total (g

gordura/g tecido), colesterol total e triglicerídeos hepáticos (g/g tecido)

........................................................................................................................... .........74

Tabela 5. Valores séricos de glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de

alta densidade (HDLcolesterol) (mg/dL), e razão triglicerídeos/HDLcolesterol

....................................................................................................................................77

Tabela 6. Concentrações médias sérica e hepática de proteína (g/mL) ................. 79

Tabela 7. Concentrações médias séricas de aspartato aminotransferase (AST) e

alanina aminotransferase (ALT) (U/L) e razão AST/ALT

................................................................................................................................... 81

Tabela 8. Valores séricos (nmol/g proteína) e hepáticos (mol/g proteína) de

malondialdeído (MDA) ........................................................................................... ... 83

Tabela 9. Componentes do sistema antioxidante, valores de glutationa reduzida

(GSH) sérica e hepática (mol/g proteína), vitamina E e retinol séricos (mol/L) e

razão vitaminaE/Colesterol (mol/mg)

................................................................................................................................... 85

Lista de Siglas

AA – Ácido araquidônico

AGs – Ácidos graxos

AGEs - Produtos finais de glicação avançada, advanced glycation end products.

ALEs - Produtos finais de lipoxidação avançada, advanced lipoxidation end products

AGLs - Ácidos graxos livres

AGMIs - Ácidos graxos monoinsaturados

AGPIs – Ácidos graxos poli-insaturados

AGPI-n-3 – Ácidos graxos poli-insaturados ômega -3

AGSs – Ácidos graxos saturados

AGSCMs – Ácidos graxos de cadeia média

ALT – Alanina aminotransferase

AST – Aspartato aminotransferase.

CT – Colesterol total

DHA – Ácido Docosahexaenóico.

DMT2 - Diabetes melittus tipo 2

EPA – Ácido Eicosapentaenóico.

EROs - Espécies reativas ao oxigênio

GA – Gordura animal

GSH - Glutationa reduzida

HDL - Lipoproteína de elevada densidade

HL+ - Hiperlipídica

IP - Índice de peroxibilidade

LDL – Lipoproteína de baixa densidade

MDA - malondialdeído

n-3 – Ômega 3

n-6 – Ômega -6

NAFL - Esteatose hepática não alcoólica, do inglês Nonalcoholic fatty liver

NAFLD - Doença hepática gordurosa não alcoólica, do inglês Nonalcoholic fatty liver

disease.

NASH - Esteato-hepatite não alcoólica, do inglês Nonalcoholic steatohepatitis.

OP – Óleo de peixe

PPAR-α – Receptores ativados por proliferadores de peroxissomo- alfa, do inglês

Peroxisome proliferator-activated receptor - α.

RAGE - Receptores para os produtos de glicação avançada, do inglês receptors for

advanced glycation end products)

RE - Retículo endoplasmático

RI – Resistência à insulina

SM - Síndrome metabólica

SRATBs – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

SREBP-1c - Proteína 1c ligadora do elemento responsivo ao esterol, do inglês

Sterol regulatory element-binding protein-1c

TCLs – Triglicerídeos de cadeia longa

TCMs – Triglicerídeos de cadeia média

TED - Taxa de eficiência da dieta

TG – Triglicerídeos

TGF- - Fator de transformação do crescimento - , do inglês transforming growth

factor beta.

TNF-α – Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor necrosis factor - .

VLDL - Lipoproteína de muito baixa densidade, do inglês Very-low-density lipoprotein

Lista de ácidos graxos

C8:0 Ácido Caprílico

C10:0 Ácido Cáprico

C14:0 Ácido Mirístico

C16:0 Ácido Palmítico

C18:0 Ácido Esteárico

C23:0 Ácido Tricosanóico

C16:1 Ácido Palmitoléico

C18:1n9c Ácido Oléico

C22:1n9 Ácido Erúcico

C18:2n6c Ácido Linoléico

C20:3n6 Ácido di-homo-linolênico

C20:4n6 Ácido Araquidônico

C18:3n3 Ácido α-linolênico

C20:3n3 Ácido Eicosatrienóico

C20:5n3 Ácido Eicosapentaenóico

C22:6n-3 Ácido Docosahexaenóico

Sumário

Resumo

Abstract

Lista de Figuras

Lista de Quadros

Lista de Tabelas

Lista de Siglas

Lista de ácidos graxos

1. Introdução ..................................................................................................... 22

1.1.Dieta Hiperlipídica e NAFLD .................................................................... 31

1.2.Dietoterapia na NAFLD ............................................................................ 34

1.3.Uso dos óleos de peixe e triglicerídeos de cadeia média na NAFLD ....... 36

2. Justificativa .................................................................................................... 39

3. Objetivos ....................................................................................................... 41

3.1.Objetivo geral .......................................................................................... 41

3.2.Objetivos específicos ............................................................................... 41

4. Materiais e métodos ...................................................................................... 43

4.1.Animais e dieta ........................................................................................ 43

Quadro 2. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%) ....................... 46

4.2.Análises ................................................................................................... 47

4.2.1. Determinação da gordura hepática total ............................................... 47

4.2.2. Determinação de ácidos graxos dos óleos e gordura das dietas

experimentais .................................................................................................... 48

4.2.3. Determinação de colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG) hepáticos e

Séricos . ............................................................................................................ 49

4.2.4. Determinação do colesterol total........................................................... 49

4.2.5. Determinação de triglicerídeos ............................................................. 49

4.2.6. Determinação da proteína sérica e hepática ......................................... 50

4.2.7. Determinação da glicemia .................................................................... 50

4.2.8. Determinação da HDL colesterol .......................................................... 51

4.2.9. Determinação da peroxidação lipídica sérica e hepática ...................... 51

4.2.10. Determinação de glutationa reduzida (GSH) hepática e sérica ............. 52

4.2.11. Determinação de retinol sérico e da vitamina E sérica e dos óleos e

gordura das dietas experimentais ...................................................................... 53

4.2.12. Determinação das concentrações séricas das aminotransferases

aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT)................ 53

4.3.Cálculos ................................................................................................... 54

4.3.1. Cálculo da taxa de eficiência da dieta (TED) ........................................ 54

4.3.2. Cálculo do índice de peroxibilidade da dieta ......................................... 54

4.3.3. Cálculo da razão entre triglicerídeos e HDLcolesterol séricos ................... 55

4.3.4. Cálculo da razão entre vitamina E e colesterol ..................................... 55

4.4.Análise estatística .................................................................................... 55

5. Resultados .................................................................................................... 57

5.1.Composição dos óleos de TCM e peixe e gordura animal ....................... 57

5.1.1. Perfil de ácidos graxos dos óleos de TCM e peixe e gordura animal .... 57

5.1.2. Índice de peroxibilidade dos óleos de TCM e peixe e gordura animal ... 59

5.1.3. Vitamina E dos óleos de TCM e peixe e gordura animal ...................... 61

5.2.Crescimento dos animais ......................................................................... 63

5.3.Ingestão alimentar dos animais ............................................................... 66

5.4.Ganho de peso, ingestão alimentar e energética diários e taxa de

eficiência da dieta .......................................................................................... 69

5.5.Peso hepático, peso do tecido adiposo epididimal e retroperitonial, e

razões em relação ao peso corporal .............................................................. 71

5.6.Gordura hepática total, gordura hepática percentual e concentração das

frações lipídicas hepáticas ............................................................................. 73

5.7.Concentração sérica de glicose, triglicerídeos, colesterol total, HDL

colesterol séricos e razão triglicerídeos/HDLcolesterol .................................. 76

5.8.Proteína total sérica e hepática ................................................................ 78

5.9.Concentração sérica das aminotransferases ........................................... 80

5.10. Peroxidação lipídica sérica e hepática ............................................... 82

5.11. Sistema antioxidante sérico e hepático ............................................. 84

6. Discussão ...................................................................................................... 87

7. Conclusões .................................................................................................... 99

Apêndice ................................................................................................................ 115

Apêndice A - Evolução do peso semanal dos animais (g). .......................... 115

Apêndice B - Ingestão alimentar semanal dos animais (g). ......................... 116

Apêndice C - Ingestão de energia semanal dos animais (g). ....................... 117

Anexo..................................................................................................................... 119

Anexo I - Certificado comissão de ética em experimentação animal. ........... 119

Artigo científico ...................................................................................................... 121

21

Introdução

22

1. Introdução

A esteatose hepática não alcoólica (NAFL, do inglês Nonalcoholic fatty liver) é

caracterizada pelo acúmulo de lipídios na forma de triglicerídeos (TG) no fígado de

indivíduos sem história significativa de ingestão de álcool e exclusão de outras

causas de doença hepática como drogas, toxinas e hepatite C (ZIVKOVIC;

GERMAN; SANYAL, 2007; CHALASANI et al, 2012). A doença hepática gordurosa

não alcoólica (NAFLD, do inglês Nonalcoholic fatty liver disease) representa um

amplo espectro desde a esteatose, esteatohepatite não alcoólica (NASH, do inglês

Nonalcoholic steatohepatitis) até cirrose. A NASH é caracterizada pela presença de

inflamação, fibrose e tem potencial de progredir para cirrose (FIERBINTEANU-

BRATICEVIC et al, 2011).

A NAFLD se tornou uma das causas mais comuns de doença hepática e a

prevalência da doença vem crescendo proporcionalmente ao aumento da ingestão

de gordura saturada, obesidade e síndrome metabólica (SM) (NSEIR; HELLOU;

ASSY, 2014).

A prevalência da NAFLD na população em geral varia de 6,3 a 33% e

apresenta uma média estimada de 20%, sendo que a prevalência da NASH é

estimada em 3 a 5%. A variabilidade dos percentuais de prevalência da NAFLD e

NASH encontrados nos estudos sofre influência da população estudada e do método

diagnóstico utilizado (ultrassonografia, ressonância magnética ou histologia

hepática). A prevalência de cirrose em indivíduos com NASH na população em

geral não é conhecida (CHALASANI et al, 2012).

No Brasil, um estudo realizado com pacientes atendidos em centros médicos

de referência para doenças hepáticas, utilizando o método diagnóstico histológico,

descreve a prevalência de 41,9% de esteatose isolada, 31,1% de NASH e 27% de

NASH e fibrose em um total de 1280 pacientes com NAFLD (COTRIM et al, 2011).

Na população caracterizada como grupo de risco para a NAFLD, devido a

presença de doenças crônicas como obesidade, diabetes e dislipidemia, a

prevalência é maior. Nos pacientes com NAFLD 90% possuem pelo menos uma

característica da SM e 33% possuem a SM (DUVNJAK et al, 2009). A prevalência da

23

NAFLD é maior que 90% em indivíduos com obesidade, varia de 69 a 87% em

indivíduos com diabetes melittus tipo 2 (DMT2), é estimada em 50% em indivíduos

com dislipidemia (CHALASANI et al, 2012). Assim, a NAFLD é descrita na literatura

como uma manifestação da SM (TACER; ROZMAN, 2011). A prevalência da NAFLD

no grupo de risco é ilustrada na Figura 1, a seguir:

24

90%

80%

50%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Obesidade DM tipo 2 DLP

Pre

valê

ncia

de N

AF

LD

no

gru

po

de

risco

(%

)

NAFLD

Figura 1. Prevalência de NAFLD no grupo de risco (%). Barras largas verticais representam a prevalência. Fonte: CHALASANI et al, 2012.

25

O acúmulo de gordura visceral na obesidade é associado a doenças

cardiovasculares, e também é considerado fator de risco para o desenvolvimento da

NAFLD e da NASH (TAKAKI; KAWAI; YAMAMOTO, 2013).

A progressão da fibrose pode ocorrer em 10% a 15% dos pacientes com

NASH e a cirrose em 15% a 25% (BRUNT; TINIAKOS, 2010). Os fatores de risco

associados à progressão para fibrose são idade maior que 45 anos, obesidade,

diabetes e índice AST/ALT > 1 (ANGULO et al, 1999).

A maioria dos pacientes com NAFLD é assintomática. As alterações

bioquímicas que podem ocorrer são elevação nos níveis séricos de

aminotransferases (AST, ALT) e de gamaglutamiltransferase (GGT). A forte

associação com a resistência à insulina (RI) faz com que comumente seja

observada hiperglicemia, elevação da insulina e intolerância à glicose. Alteração no

lipidograma também pode ser observada com hipertrigliceridemia e/ou

hipercolesterolemia (GRATTAGLIANO et al, 2007).

Apesar de níveis elevados das aminotransferases sugerirem a presença da

NASH, há baixa relação entre os níveis plasmáticos de enzimas hepáticas e os

achados na biópsia hepática (LOMONACO et al, 2013).

O método padrão ouro para o diagnóstico da NAFLD é a biópsia hepática.

Esse método permite identificar a presença de inflamação, degeneração baloniforme

e fibrose, permitindo diagnóstico diferencial entre esteatose pura e NASH. A biópsia

permite avaliar o grau de infiltração de lipídios no tecido hepático (GRATTAGLIANO

et al, 2007). No entanto, métodos menos invasivos como a ultrassonografia,

ressonância magnética ou tomografia computadorizada, permitem a identificação da

distribuição dos depósitos de lipídios no fígado todo, sendo que os dois últimos

permitem também a quantificação do total de gordura hepática (NARCISO-

SCHIAVON et al, 2010; MOORE, 2010).

A proposta para utilização de parâmetros bioquímicos não invasivos no

diagnóstico da NASH e fibrose na NAFLD ainda está em experimentação, mas os

estudos são bastante promissores para utilização destas ferramentas na prática

clínica. A NASH tem como forte preditor a presença da SM. O NAFLD fibrose score

utiliza os parâmetros como idade, IMC, hiperglicemia, contagem de plaquetas,

26

albumina e razão AST/ALT para identificar a fibrose avançada e/ou cirrose

(CHALASANI et al, 2012).

O primeiro estágio da doença é caracterizado pela esteatose hepática pura,

definida pelo acúmulo de gordura predominantemente macrovesicular e presença de

esteatose visível em mais de 5% dos hepatócitos (SANYAL et al, 2011). A presença

da inflamação associada à esteatose caracteriza o segundo estágio da doença. A

NASH é caracterizada pelos estágios mais graves 3 e 4. No terceiro estágio, a

esteatose é associada ao dano hepatocelular com degeneração em balonização do

hepatócito. A presença da esteatose associada à fibrose sinusoidal e corpúsculo de

Mallory caracteriza o quarto estágio da doença (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL,

2007)

A patogênese da NAFLD e os mecanismos que levam à NASH, fibrose e

dano do hepatócito não estão completamente esclarecidos, mas pode-se afirmar

que há uma combinação de fatores ambientais, genéticos e metabólicos que

resultam na progressão da doença (TORRES et al, 2012; BASARANOGLU;

SENTÜRK, 2013).

O mecanismo de patogênese da NAFLD foi proposto em 1998 por Day e

James e consiste na teoria dos dois hits (DAY; JAMES, 1998). O primeiro hit ou

gatilho é dado pelo acúmulo hepático de lipídios que predispõe à ocorrência do

segundo hit (GENTILE; PAGLIASSOTTI, 2008). O segundo hit é caracterizado pelo

estresse oxidativo, peroxidação lipídica, disfunção mitocondrial e produção de

citocinas pró-inflamatórias e é responsável pela progressão à NASH, pois contribui

para a inflamação, fibrose e morte celular (TESSARI et al, 2009).

Atualmente, tem sido reconhecida a hepatotoxicidade dos AGs livres (AGLs)

que atuam na progressão da esteatose à NASH, pois estão diretamente associados

ao aumento do estresse oxidativo, ativação das vias inflamatórias e dano ao

hepatócito (DOWMAN; TOMLINSON; NEWSOME, 2010).

A progressão da NASH à cirrose é representada pelo terceiro hit que envolve

a morte celular e inadequada proliferação dos hepatócitos que resultam no

desenvolvimento da fibrose e recrutamento de células do sistema imune (JOU;

CHOI; DIEHL, 2008).

Os efeitos da dieta, regulação das vias metabólicas por hormônios e fatores

de transcrição desempenham um importante papel na NAFLD, sendo que a RI é

27

considerada um fator chave no desenvolvimento da NAFLD e da NASH (ZIVKOVIC;

GERMAN; SANYAL, 2007).

As vias metabólicas que influenciam o conteúdo hepático de gordura

englobam a síntese e eliminação de lipídios. Na síntese de lipídios estão envolvidos

os processos da lipogênese de novo e de esterificação de TG. A eliminação de

lipídios envolve a lipólise no tecido adiposo, oxidação de ácidos graxos (AGs) e

secreção de TG no fígado pela lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL, do

inglês Very-low-density lipoprotein) (FERRAMOSCA; ZARA, 2014). Segundo

Donnely et al (2005), o aumento do fluxo hepático de AGLs provenientes do tecido

adiposo tem uma contribuição de 60% para o acúmulo hepático de lipídios, sendo

26% atribuída à lipogênese de novo hepática e 15% à dieta.

O aumento da ingestão de gordura e frutose na dieta contribui para o acúmulo

hepático de lipídios (BASARANOGLU; BASARANOGLU; SENTÜRK, 2013). A

ingestão alimentar excessiva em energia provenientes tanto de carboidratos como

de gordura pode levar ao aumento crônico da glicemia, AGLs e na concentração de

insulina e contribui para a resistência na ação da insulina na captação de glicose

pelo tecido adiposo e muscular e na supressão da hidrólise de TG no tecido adiposo

(ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007).

A relação da esteatose hepática como causa ou consequência das alterações

metabólicas que resultam na redução da sensibilidade à insulina ainda não está

estabelecida (LOMONACO et al, 2013). Estudos sugerem que o mecanismo de

patogênese da NAFLD é associado a RI e DMT2 em um ciclo em que uma pode

promover ou exacerbar a outra (CUSI, 2009; LOMONACO et al, 2011).

A resistência periférica à insulina resulta em menor supressão da lipólise no

tecido adiposo promovendo aumento do fluxo hepático de AGLs (ZIVKOVIC;

GERMAN; SANYAL, 2007). A hiperglicemia pode resultar em aumento da captação

hepática de glicose, pois não depende da insulina (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL,

2007). No fígado, a insulina estimula a lipogênese de novo resultando no aumento

da síntese hepática de AGs por ativação do fator de transcrição da

Proteína 1c ligadora do elemento responsivo ao esterol (SREBP-1c, do inglês sterol

regulatory element-binding protein-1c) (TESSARI, et al, 2009; GEELEN et al, 1995).

O acúmulo hepático de AGLs promove aumento na lipogênese hepática também por

estímulo à SREBP1-c, resultando no aumento da síntese de TG (TESSARI, et al,

28

2009). Portanto, o aumento da glicemia e do fluxo de AGLs contribuem para o

acúmulo de gordura hepática (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007).

Nos indivíduos com NAFLD e NASH o aumento da secreção hepática de

lipídios via VLDL pode estar prejudicado ou é insuficiente para evitar o acúmulo de

gordura no fígado (CHARLTON et al, 2002). Portanto, o acúmulo de gordura

hepática ocorre quando a taxa de síntese de TG excede a capacidade da

síntese/secreção da VLDL, resultando na esteatose (JOU; CHOI; DIEHL, 2008).

A progressão à NASH tem como fatores atuantes o estresse oxidativo,

disfunção mitocondrial, peroxidação lipídica e atividade das citocinas pró-

inflamatórias (RAHIMI; LANDAVERDE, 2013).

Em condições fisiológicas, a oxidação mitocondrial de AGs resulta na

produção das espécies reativas ao oxigênio (EROs), como o superóxido, peróxido

de hidrogênio e radical hidroxila (BASARANOGLU; BASARANOGLU; SENTÜRK,

2013). O aumento dos AGLs resulta em aumento da-oxidação mitocondrial e

sobrecarga na cadeia transportadora de elétrons, provocando aumento da produção

das EROs (LOMONACO et al, 2013).

O estresse oxidativo é caracterizado pelo desequilíbrio provocado pelo

aumento da produção das EROs e redução dos antioxidantes que resulta na

peroxidação lipídica de ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs), membranas

celulares, membranas mitocondriais e DNA (BASARANOGLU; BASARANOGLU;

SENTÜRK, 2013).

A disfunção mitocondrial está associada à NASH (SANYAL et al, 2001). A

peroxidação lipídica da membrana mitocondrial hepática é responsável por alterar a

função da organela, bem como a cadeia respiratória e a produção de genes

mitocondriais, produzindo assim um ciclo de geração de EROS (TESSARI, et al,

2009). Em contrapartida, verifica-se aumento da oxidação extramitocondrial de AGLs

nos microssomos e peroxissomos, resultando em aumento da produção das EROS

e predispondo ao estresse oxidativo (MOORE, 2010; JOU; CHOI; DIEHL, 2008).

Os produtos da peroxidação lipídica, como o malondialdeído (MDA), levam ao

aumento da produção de citocinas e recrutamento de células inflamatórias para o

fígado (MOORE, 2010). A inflamação e ativação das células estreladas hepáticas

levam à produção de colágeno e fibrose (MOORE, 2010).

29

Outros fatores como o estresse do retículo endoplasmático (RE) e a razão

adiponectina/leptina estão associados à progressão à NASH, pois resultam em

estímulo pró-inflamatório e indução da RI (DARA; JI; KAPLOWITZ, 2011; TAKAKI;

KAWAI; YAMAMOTO, 2013). Os mecanismos de progressão à NASH estão

apresentados na Figura 2.

30

Figura 2: Mecanismos de progressão da NAFLD à NASH. (1) Resistência à insulina no tecido adiposo: No contexto da síndrome metabólica e/ou diabetes melittus tipo 2 a

resistência à ação da insulina resulta em aumento da lipólise no tecido adiposo e aumento do fluxo hepático de AGL que associada à hiperinsulinemia e hiperglicemia, estimula a excessiva síntese hepática de ácidos graxos saturados e de triglicerídeos. (2) Esteatose: A

exacerbada resistência à insulina estimula a secreção de VLDL e a -oxidação mitocondrial. A esteatose pode estar associada à dislipidemia (aumento de triglicerídeos e redução do HDLcolesterol). (3) Esteatohepatite: o aumento do fluxo de AGLs sobrecarrega a mitocôndria e a cadeia respiratória entra em colapso, resultando na produção de metabólitos tóxicos, ativação das vias inflamatórias e lipotoxicidade do hepatócito que favorecem a inflamação e necrose crônicas (4) Fibrose: a ativação dos macrófagos e das células estreladas hepáticas determinam a resposta fibrogênica e a potencial progressão à cirrose. Neste contexto, a redução da adiponectina plasmática favorece a promoção da esteatose e fibrose, pela síntese de triglicerídeos e ativação das células estreladas hepáticas, respectivamente. AGL, AGs livres; HDL-C, lipoproteína de elevada densidade; CEH, células estreladas hepáticas; NAFLD: doença hepática gordurosa não alcoólica; NAFL, esteatose hepática não alcoólica; NASH, esteatohepatite não alcoólica; IG: Intolerância à glicose; DMT2, diabetes melittus tipo 2. Adaptado de CUSI, 2009.

31

1.1. Dieta Hiperlipídica e NAFLD

A dieta hiperlipídica (HL+) é amplamente utilizada para indução da NAFLD em

modelos experimentais, pois reflete a histopatologia e patofisiologia observada em

humanos (NAKAMURA; TERAUCHI, 2013). Os resultados podem variar no grau de

esteatose, inflamação e fibrose de acordo com a linhagem de roedor utilizada, o

percentual de lipídios e composição da dieta, e a duração do experimento (KANURI;

BERGHEIM, 2013).

O mecanismo de indução da NAFL e progressão à NASH pela dieta HL+

consiste em favorecer o acúmulo hepático de lipídios, estresse oxidativo, ativação

das vias inflamatórias e dano ao hepatócito (AHMED, REDGRAVE; OATES, 2009;

FAN; QIAO, 2009).

O excesso de gordura na dieta promove o aumento do fluxo hepático de

lipídios e resulta em estímulo à síntese de novo de AGs e à síntese de TG por

ativação da SREBP-1c (JUMP, 2011). O aumento do diacilglicerol, intermediário na

síntese de TG, promove dano lipotóxico dos hepatócitos (SCHUPPAN;

SCHATTENBERG, 2013). O excesso de lipídios sobrecarrega a mitocôndria e

resulta na redução da oxidação de AGs e da eficiência da cadeia respiratória

mitocondrial e consequente aumento da produção de EROS (VIAL et al, 2011).

O perfil de AGs da dieta influencia a indução da esteatose hepática. As dietas

HL+ deficientes em ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) favorecem

o desenvolvimento da esteatose hepática devido à ação destes AGs na inibição da

síntese de lipídios (FERRAMOSCA; ZARA, 2014).

A dieta rica em ácidos graxos saturados (AGSs) é associada ao aumento de

lipídios no fígado, elevação da insulina no plasma, indução da RI, alteração na

função mitocondrial e estímulo inflamatório e, portanto, são associados à progressão

à NASH (TESSARI et al, 2009). O aumento dos AGLs favorece o acúmulo hepático

de lipídios, em especial os AGSs, que são associados à disfunção hepática

resultantes da disfunção mitocondrial, estresse do RE, estresse oxidativo e apoptose

(CUSI, 2009; FERRAMOSCA; ZARA, 2014). O uso da gordura animal (GA) na dieta

HL+ foi associado ao estresse do RE e à resposta inflamatória, resultando em um

maior efeito deletério na RI e esteatose hepática em relação aos animais

32

alimentados com óleo de soja (ZHAO et al, 2013). A indução do dano hepático e

redução da capacidade de proliferação dos hepatócitos foram associadas ao

aumento da razão hepática de AGSs em relação aos insaturados no fígado

esteatótico de modelos animais (GENTILE; PAGLIASSOTTI, 2008).

Recentemente, foram descritos os efeitos da ingestão dietética de colesterol

na NAFLD e NASH (CARVALHANA; MACHADO; CORTEZ-PINTO, 2012). O

aumento da ingestão dietética de colesterol resulta em desequilíbrio entre a síntese

e oxidação dos AGs (SCHUPPAN; SCHATTENBERG, 2013). O estudo de Ichimura

et al (2014) descreve a indução da NASH caracterizada pela esteatose com maior

acúmulo de TG, inflamação, balonização do hepatócito, fibrose e progressão à

cirrose com a adição de colesterol à dieta HL+. Neste mesmo estudo, a adição do

colesterol na dieta foi associada à supressão da atividade da carnitina palmitoil

transferase (ICHIMURA, et al, 2014). O acúmulo do colesterol livre é associado ao

estresse do RE por alterar a razão colesterol livre/fosfolipídios na membrana,

alterando a fluidez e, consequentemente, a função da organela (TAKAKI; KAWAI;

YAMAMOTO, 2013). Os AGLs e colesterol livre provenientes da dieta induzem o

estresse do RE e estresse oxidativo resultando na inflamação e fibrogênese

hepática (TAKAKI; KAWAI; YAMAMOTO, 2013)

Em modelos animais, a progressão da esteatose para NASH é marcada pelo

aumento da peroxidação lipídica (TESSARI et al, 2009). Em pacientes com NASH a

elevada ingestão de AGSs foi associada à redução da razão glutationa

reduzida/oxidada, evidenciando um efeito pró-oxidante (MACHADO et al, 2008). A

redução das vitaminas antioxidantes é associada ao aumento da peroxidação

lipídica, estresse oxidativo e pode contribuir para o dano hepatocelular, inflamação e

fibrose (LOGUERCIO et al, 2001).

O processamento térmico das gorduras resulta na produção de compostos

como os produtos da peroxidação lipídica, produtos finais de glicação e de

lipoxidação avançada (AGEs/ALEs, do inglês advanced glycation/lipoxidation end

products) que apresentam propriedades pró-oxidantes e pró-inflamatórias e atuam

como fonte de estresse oxidativo exógeno (LUCI et al, 2007; VISTOLI et al, 2013).

A ingestão de elevado conteúdo de AGEs/ALEs, provenientes da dieta HL+

submetida ao aquecimento, está associada ao desenvolvimento da RI e DMT2 com

33

sintomas de maior proporção que o observado após a ingestão de dieta HL+ sem

aquecimento (ASSIS et al, 2009).

A interação dos AGEs com os receptores para os produtos de glicação

avançada (RAGE, do inglês receptors for advanced glycation end products) das

células hepáticas resulta em aumento da produção das EROs, citocinas pró-

inflamatórias e proliferação e ativação das células estreladas hepáticas, e desta

forma contribui para a progressão da NAFLD e piora da fibrose hepática (SANTOS

et al, 2013).

O estudo de Patel et al (2012) demonstrou que os AGES dietéticos são

capazes de promover a inflamação hepática, independentemente da esteatose,

contribuindo assim para a progressão da NAFL à NASH.

34

1.2. Dietoterapia na NAFLD

O estudo de Musso et al (2003) descreve que os pacientes com NASH

apresentam aumento da ingestão de AGSs, colesterol e redução da ingestão de

AGPIs, fibras e antioxidantes como as vitaminas C e E. Os hábitos alimentares

caracterizados neste mesmo estudo podem promover o desenvolvimento da NASH

por alterações no metabolismo pós-prandial de TG, na sensibilidade à insulina, na

modulação do acúmulo hepático de lipídios e da atividade antioxidante (MUSSO et

al, 2003).

O tratamento da NAFLD é baseado em modificações no estilo de vida.

Hábitos alimentares saudáveis e atividade física são consideradas as medidas mais

eficazes de tratamento de pacientes com NAFLD (CHALASANI et al, 2012). Os alvos

da terapia são basicamente a RI e o estresse oxidativo (PAREKH; ANANIA, 2007).

Além da melhora da doença hepática, o tratamento visa o controle de fatores

metabólicos e melhora das comorbidades associadas à NAFLD como obesidade,

hiperlipidemia, RI e DMT2 (CHALASANI et al, 2012).

A perda de peso promove melhora do acúmulo de lipídios e da NASH, no

entanto, deve ser lenta e gradual. A rápida perda de peso resulta em maior

mobilização de TG do tecido adiposo e aumento dos AGL, que pode promover maior

progressão da doença (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007).

A restrição calórica é benéfica na perda de peso, redução da esteatose e

melhora da RI (RAHIMI; LANDAVERDE, 2013). Em um período de 6 meses à 1 ano,

a perda de peso de 3-5% promove melhora na esteatose, já a melhora da

esteatohepatite requer uma maior perda de peso de 7 a 10% (RAHIMI;

LANDAVERDE, 2013; CHALASANI et al, 2012). A perda de peso maior que 10% é

necessária para melhora da necroinflamação hepática (CHALASANI et al, 2012).

A composição da dieta em macronutrientes se mostra tão importante quanto a

perda de peso, mas ainda são necessários mais estudos para se determinar a exata

composição da dieta ideal para o tratamento na NAFLD (ASRIH; JORNAYVAZ,

2014).

No entanto, a recomendação de redução da ingestão de gordura,

principalmente em AGSs e carboidratos simples, é baseada em evidências da

35

influência do perfil lipídico e de carboidratos da dieta no desenvolvimento da NAFLD

e progressão à NASH (ASRIH; JORNAYVAZ, 2014).

A redução da ingestão de carboidratos associada à restrição calórica tem

efeito positivo na redução dos TG hepáticos e na melhora da sensibilidade à insulina

(KIRK et al, 2009). A ingestão de carboidratos simples, como a frutose, deve ser

limitada devido à sua associação com progressão à NASH (ZIVKOVIC; GERMAN;

SANYAL, 2007).

No estudo de Westerbacka et al (2005) a redução do percentual de lipídios na

dieta promoveu a redução do conteúdo hepático de gordura em indivíduos obesos e

não diabéticos, independente da perda de peso. Neste mesmo estudo, a redução da

esteatose hepática foi associada às alterações na concentração da insulina em

jejum (WESTERBACKA et al, 2005).

A ingestão da gordura saturada em pacientes com NAFLD deve ser mantida

em torno de 7% a 10% do valor calórico total da dieta para melhora da RI

(ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007). Em dietas com baixo teor de AGSs (6%) foi

observado efeito prejudicial nos lipídios sanguíneos devido à redução tanto da

lipoproteína de baixa densidade (LDL) como da lipoproteína de elevada densidade

(HDL) e aumento dos TG (OLIVEIRA et al, 2005).

Os ácidos graxos monoinsaturados (AGMIs) são associados à melhora do

perfil lipídico sérico, redução da glicemia e aumento da HDL em pacientes com

diabetes melittus, quando o aumento da ingestão é realizado por substituição dos

AGSs e carboidratos e portanto pode ser benéfico para pacientes com NAFLD

(JULIUS, 2003; FAN; CAO, 2013).

Estudos mostram que a suplementação dos AGPI-n3 é favorável na redução

da esteatose hepática e melhora do perfil metabólico na NAFLD (BOUZIANAS;

BOUZIANA; HATZITOLIOS, 2013; BARGUT et al, 2014). No entanto, mais

pesquisas são necessárias para estabelecer a dose, duração do tratamento e os

efeitos na gordura hepática, inflamação e fibrose, e ainda é prematura a

recomendação da suplementação dos AGPI n-3 para o tratamento da NAFLD/NASH

(CHALASANI et al, 2012). O aumento da ingestão de n-3 deve ser obtido com o

aumento do consumo de peixes como salmão, sardinha e atum (SCORLETTI;

BYRNE, 2013).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Westerbacka%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15741262


36

1.3. Uso dos óleos de peixe e triglicerídeos de cadeia média na NAFLD

Os efeitos do uso dos óleos de peixe (OP) e triglicerídeos de cadeia média

(TCMs) no tratamento da NAFLD ainda não estão totalmente esclarecidos.

A utilização dos TCMs no tratamento da NAFLD foi inicialmente baseada na

premissa de que os ácidos graxos saturados de cadeia média (AGSCMs) são

preferencialmente oxidados, pois não requerem a carnitina palmitoil transferase para

o transporte intramitocondrial (SHINOHARA et al, 2005). Portanto, os AGSCMs

seriam utilizados em substituição aos AGCL na tentativa de prevenir o bloqueio da -

oxidação de AGs na NAFLD (LIEBER et al, 2007, 2008).

No entanto, os estudos que utilizam os TCMs na dieta HL+ apresentam

resultados controversos. A dieta HL+ adicionada de TCM resultou no favorecimento

à esteatose hepática nos estudos de Geelen et al, (1995) e Wein, et al (2009). O

estudo de Lieber et al (2008) demonstra a redução da esteatose hepática e da

peroxidação lipídica somente com o uso dos TCMs como única fonte lipídica na

dieta, sendo que, quando associado aos triglicerídeos de cadeia longa (TCLs) na

dieta HL+ parece promover a hepatotoxicidade devido ao maior acúmulo hepático de

lipídios, aumento da peroxidação lipídica e da produção de TNF-.

Em estudos com animais, a deficiência de AGs essenciais está associada à

esteatose (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007). Os AGPI n-3 (ácido

docosahexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA)) regulam a expressão

de genes que são favoráveis à prevenção do acúmulo de lipídios no fígado, pois

promovem estímulo à oxidação dos AGs por ligação e ativação dos Receptores

ativados por proliferadores de peroxissomo - α (PPAR-, do inglês Peroxisome

proliferator-activated receptor – alfa) e redução da síntese de AGs e TG por inibição

do SREBP1-c (CLARKE, 2001; JUMP, 2011; PETTINELLI et al, 2011).

Há evidências de que a suplementação do ômega-3 (n-3) promove melhora

no perfil lipídico sérico, melhora da sensibilidade à insulina, redução da esteatose,

inflamação e dano hepático em modelos animais e humanos com NAFLD

(BOUZIANAS; BOUZIANA; HATZITOLIOS, 2013; BARGUT et al, 2014). O uso do

óleo de peixe em elevado percentual na dieta HL+ foi associado à melhora da

sensibilidade à insulina, melhora da atividade mitocondrial, estímulo da -oxidação,

inibição da lipogênese hepática, redução da esteatose e estresse oxidativo

37

(LIONETTI et al, 2014). No estudo de Popescu (2013), o uso do EPA e DHA na dieta

HL+ resultou em redução da peroxidação lipídica, mas não houve melhora da lesão

hepática, caracterizada pela degeneração granular e vacuolar do hepatócito. Neste

mesmo estudo, histologia hepática normal somente foi observada com a redução do

percentual de lipídios da dieta (POPESCU, 2013).

No entanto, estudos demonstraram que a suplementação da dieta HL+ com os

AGPI-n3 está associada ao aumento da peroxidação lipídica e redução de

antioxidantes (KRAVCHENKO et al, 2013; SAITO; NAKATSUGAWA, 1994; SEALLS

et al, 2008). O estudo de Castro et al (2012) demonstra que o uso do óleo de peixe

promoveu o aumento da tolerância à glicose, mas a longo prazo foi associado a um

efeito negativo devido ao aumento da peroxidação lipídica e dano ao DNA dos

hepatócitos.

Os efeitos do uso do óleo de TCM ou óleo de peixe na dieta HL+ no

desenvolvimento da esteatose hepática e estresse oxidativo foram verificados em

um estudo anterior (ALMEIDA, 2011). Neste mesmo estudo, os TCMs foram

associados a um efeito negativo no desenvolvimento da esteatose hepática devido

ao exacerbado acúmulo de TG no fígado, no entanto, verificou-se o aumento da

defesa antioxidante hepática. Em contrapartida, o uso do óleo de peixe na dieta HL+

foi associado ao aumento significativo da peroxidação lipídica hepática e os

benefícios dos AGPI n-3 na redução da gordura hepática foram limitados (ALMEIDA,

2011).

Neste sentido, a combinação do óleo de TCM e óleo de peixe parece uma

alternativa promissora para contrabalancear os efeitos negativos e positivos da

administração isolada dos TCMs e dos AGPI-n3.

A NAFLD é uma doença de alta prevalência cujo tratamento ainda não está

estabelecido. O presente estudo visa verificar os efeitos metabólicos da combinação

de TCM e óleo de peixe na busca de uma possível alternativa para o tratamento da

esteatose hepática.

38

Justificativa

39

2. Justificativa

Os efeitos metabólicos do uso combinado dos triglicerídeos de cadeia média

e do óleo de peixe no tratamento da esteatose hepática ainda não estão totalmente

esclarecidos.

40

Objetivos

41

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

Verificar os efeitos da combinação de triglicerídeos de cadeia média e óleo de

peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela dieta hiperlipídica

termolizada em ratos.

3.2. Objetivos Específicos

Avaliar o efeito da dieta hiperlipídica com triglicerídeos de cadeia média

e óleo de peixe nos lipídios hepáticos e séricos, através da gordura

total hepática e frações lipídicas hepáticas e séricas


e óleo de peixe na glicemia.


e óleo de peixe no sistema antioxidante através da determinação de

vitamina E, glutationa reduzida e no estresse oxidativo através da

peroxidação lipídica


e óleo de peixe na lesão hepática através das aminotransferases

séricas (AST e ALT).

42

Materiais

e

Métodos

43

4. Materiais e Métodos

4.1. Animais e dieta

No total, foram utilizados 50 ratos machos da linhagem Wistar com peso médio

de 60 gramas provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

– Universidade de São Paulo. Os ratos foram alojados em gaiolas individuais e

mantidos à temperatura de 25C num ciclo claro-escuro de 12 horas. A limpeza das

gaiolas e a pesagem dos animais foram realizadas semanalmente. As dietas foram

pesadas e repostas três vezes na semana. A distribuição dos animais foi realizada

aleatoriamente em cinco grupos. Os animais receberam água e dieta à vontade

durante 60 dias.

A dieta controle utilizada no estudo consistiu de ração comercial para ratos

(Nuvilab), contendo por peso 22% de proteína, 57% de carboidratos, 4% de lipídios,

9% de cinzas, com 3,5 Kcal/g (FREITAS, 2011). A dieta HL+ foi obtida de uma

mistura na proporção de 50% de ração moída e 50% de gordura animal (banha)

(Sadia) termolizada, adaptada de Almeida et al (2011) e Leonardi et al (2010). O

aquecimento da gordura animal foi realizado durante 30 minutos à 180ºC, adaptado

de Assis et al (2009).

A dieta do grupo Controle (C) consistiu da ração moída. A dieta HL+ utilizada

para a indução da esteatose nos animais foi composta por 50% de lipídios

provenientes da gordura animal termolizada e 50% da ração moída. As dietas dos

grupos HL+OP e HL+TCM continham 25% de gordura animal termolizada e 25% dos

respectivos óleos (óleo de peixe (Campestre) e óleo de TCM (Support) e do grupo

HL+OP/TCM continha 25% de gordura animal termolizada, 15% de óleo de TCM e

10% de óleo de peixe.

A composição das dietas experimentais consumidas pelos animais é

apresentada nos Quadros 1 e 2.

O grupo Controle (n=10) recebeu a dieta controle durante todo experimento. A

adaptação à dieta controle foi realizada durante os primeiros 3 dias. Os grupos

HL+GA (n=10), HL+TCM (n=10), HL+OP (n=10) e HL+TCM/OP (n=10) receberam as

44

dietas HL+. A adaptação dos animais à dieta HL+ foi realizada durante 5 dias com o

aumento gradual do conteúdo de lipídios. Inicialmente os animais receberam as

dietas experimentais adicionadas à dieta controle na proporção de 1:1

(Experimental:Controle), e posteriormente, na proporção 2:1. Após o período de

adaptação foi ofertada a dieta HL+ com 50% de lipídios contendo somente a GA

termolizada para todos os grupos HL+ durante 30 dias. Em seguida, animais

receberam as dietas HL+ de diferentes composições (GA termolizada somente,

adicionada de óleo de TCM e/ou óleo de peixe) durante 20 dias. A adição dos óleos

à dieta foi realizada progressivamente durante 5 dias, para adaptação dos animais.

Inicialmente os animais receberam as dietas experimentais HL+ contendo GA

termolizada e as dietas HL+ adicionadas dos diferentes tipos de óleos na proporção

de 1:1 (HL+Óleos:HL+GA), e posteriormente, na proporção 2:1. Após este período de

adaptação os animais receberam as dietas com a GA termolizada adicionada dos

respectivos óleos na proporção total das dietas experimentais.

Ao fim do experimento os animais foram eutanasiados por decaptação. O

sangue, o fígado e o tecido adiposo foram coletados para as análises histológicas e

bioquímicas. O sangue foi prontamente centrifugado a 3500 rpm, à 4°C durante 15

minutos para obtenção do soro. O fígado, o tecido adiposo epididimal e

retroperitoneal foram removidos, pesados e prontamente congelados em nitrogênio

líquido. As amostras foram armazenadas a -40ºC para posteriores análises

bioquímicas.

45

Quadro 1. Composição das dietas experimentais (g/100g).

Ingredientes

(g/100g)

Dieta

controle

Dieta

gordura

animal

termolizada

50%

Dietas gordura animal

termolizada + óleos

Óleo de

TCM

Óleo

de

peixe

Óleo de

TCM +

peixe

Ração 100 50 50 50 50

Óleo de TCM 0 0 25 0 15

Óleo de peixe 0 0 0 25 10

Gordura animal 0 50 25 25 25

BHT 0 0,01 0,01 0,01 0,01

BHT – di-terc-butil metil fenol.

46

Quadro 2. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%)

Nutriente (%) Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM

Proteína (%) 22 11 11 11 11

Carboidrato (%) 57 28,5 28,5 28,5 28,5

Lipídio (%) 4 52 52 52 52

Valor calórico (Kcal)* 350 625 625 625 625

Energia lipídios (%)* 10,3 74,9 74,9 74,9 74,9

FREITAS, 2011. *O Fator de Atwater de 9Kcal/g foi utilizado para o cálculo de energia dos óleos e gordura animal utilizados na dieta (ZOU et al, 2007).

47

4.2. Análises

4.2.1. Determinação da gordura hepática total

A determinação da gordura hepática total foi realizada de acordo com o método

proposto por Bligh e Dyer (1959).

O tecido hepático (500mg) foi homogeneizado com 0,8mL de água destilada, em

tubos de 10mL e em seguida foi adicionado 2mL de metanol e 1 mL de clorofórmio.

As amostras foram submetidas à agitação em vórtex por 1 minuto. Posteriormente

foram adicionados 1mL de água e 1 mL de clorofórmio e submetidos a nova

agitação por 2 minutos e então as amostras foram centrifugadas à 1000rpm por 5

minutos, para separação do clorofórmio da fase aquosa. A fase inferior (clorofórmio),

aproximadamente 1,3mL, foi transferida para um tubo de ensaio contendo 1g de

sulfato de sódio anidro para remoção dos traços de água. A alíquota de 0,5mL da

fase de clorofórmio livre de água foi transferida para um béquer, previamente

pesado, e levado a estufa, com circulação forçada de ar, na temperatura de 50ºC

para evaporação de todo o clorofórmio e nova pesagem do béquer.

O cálculo foi obtido através da diferença das pesagens do béquer, em relação à

massa inicial do tecido utilizado.

48

4.2.2. Determinação de ácidos graxos dos óleos e gordura das dietas

experimentais

Os AGs dos óleos e gordura da dieta experimental foram determinados por

cromatografia gasosa (SHIMADZU, GC-2014), equipado com auto-injetor AOC-20i,

com coluna capilar Supelcowax de 30m de comprimento, 0,25mm de diâmetro

interno e 0,25µm de espessura de filme. O gás Hélio foi utilizado como carreador,

com fluxo de 1,6ml/min. O ar sintético foi utilizado para a ionização em chama com

detecção a 250ºC. As injeções foram realizadas em modo splitless.

A determinação dos AGs dos óleos e gordura das dietas utilizadas foi adaptada

de Andreoli et al (2007) através da extração com hexano.

Inicialmente, 50L de amostra foram hidrolisados, em um tubo fechado, com

1,0mL da solução de KOH e metanol 0,5M a 100ºC durante 5 minutos.

Posteriormente foram esterificados com a adição de 400L da solução de HCl e

metanol (4:1 v/v) e novamente aquecidos a 100ºC durante 15 minutos. As amostras

foram resfriadas e então, adicionado 2 mL de água para a extração dos AGs

estereificados com o uso do hexano na proporção 2x3mL. A fase orgânica

(sobrenadante) obtida foi passada em um funil contendo Na2SO4, anidro, para sofrer

evaporação, e posteriormente foi redissolvida em 500L de CHCl3, para a análise

no GC.

A determinação dos AGs foi realizada através de um padrão externo (Supelco 37

Component FAME Mix).

49

4.2.3. Determinação de colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG)

hepáticos e séricos

As frações lipídicas foram dosadas no fígado após a extração da gordura total

pelo método de Bligh e Dyer (1959) e posteriormente foram determinados por kits

comerciais utilizados para análise em soro, conforme descrito a seguir.

4.2.4. Determinação do colesterol total

O CT foi determinado pelo método colorimétrico enzimático através de kits

comerciais da Labtest (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). Os ésteres de colesterol

foram hidrolisados pela colesterol esterase a AGs e a colesterol livre, que foi então

oxidado pela colesterol oxidase a colest-4-en-ona e a peróxido de hidrogênio. O

fenol e a 4-aminoantipirina foram oxidados, na presença da peroxidase e peróxido

de hidrogênio, formando a antipirilquinonimina com absortividade máxima à 500nm,

com intensidade da cor vermelha formada na reação final diretamente proporcional à

concentração do colesterol na amostra. No procedimento foi adicionado 1mL de

reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução foi incubada em

banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a 500nm. A

concentração de colesterol total das amostras foi dada a partir de um padrão

conhecido de colesterol.

4.2.5. Determinação de triglicerídeos

A determinação dos TG hepáticos foi realizada pela metodologia colorimétrica

enzimática através de kits comerciais da Labtest (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). A

hidrólise dos triglicerídeos foi realizada pela lipase da lipoproteína, liberando o

glicerol, que foi convertido em glicerol-3-fosfato, pela gliceroquinase. O glicerol-3-

fosfato foi então oxidado à dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio na presença da

50

glicerolfosfato oxidase. Posteriormente foi realizada uma reação de acoplamento

entre peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e 4-clorofenol, catalizada pela

peroxidase, produzindo uma quinoneimina com absorbância máxima em 505nm,

sendo que a intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à

concentração dos triglicerídeos da amostra. No procedimento, foi adicionado 1mL de

reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução foi incubada em

banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a 505nm. A

concentração de triglicerídeos das amostras foi dada a partir de um padrão

conhecido de triglicerídeos.

4.2.6. Determinação da proteína sérica e hepática

A determinação da proteína sérica e hepática foi realizada através kits

comerciais, pelo método de Biureto (Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG, Brasil).

A determinação da proteína hepática foi realizada no homogenato de fígado, cerca

de 50mg de tecido, diluídos em 0,5mL de água, para posterior análise. Os íons

Cobre em meio alcalino (Reagente de Biureto) reagiram com as ligações peptídicas

das proteínas séricas formando cor púrpura, com absorbância máxima em 545nm,

sendo proporcional à concentração de proteína da amostra. No procedimento, foram

adicionados 500µL de reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução

foi incubada em banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a

545nm. A concentração de proteínas totais das amostras foi dada a partir de um

padrão conhecido de proteínas totais.

4.2.7. Determinação da glicemia

A glicemia dos animais foi determinada em até 8 horas após a eutanásia dos

animais a partir do soro utilizando-se o kit para dosagem de Glicose PAP Liquiform

Labtest ®, no qual a glicose oxidase catalisa uma reação, formando peróxido de

hidrogênio que reage com 4-aminoantipirina e fenol em reação oxidativa, tendo

51

como produto uma antipirilquinonimina vermelha, cuja intensidade da cor é

proporcional a concentração de glicose na amostra de soro. No procedimento foi

adicionado 1mL de reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução foi

incubada em banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a

505nm. A concentração de glicemia das amostras foi dada a partir de um padrão

conhecido de glicose.

4.2.8. Determinação da HDL colesterol

Para a determinação do HDL colesterol sanguíneo através da precipitação

seletiva de lipoproteinas de baixa e muito baixa densidade (LDL e VLDL), foi

utilizado a combinação de dois kits, o Colesterol HDL Labtest ® e Colesterol

Liquiform Labtest ®. Em 100µL de amostra foram adicionados 100µL de precipitante

de lipoproteínas de baixa e muito baixa densidade (LDL e VLDL). Essas amostras

foram agitadas em vórtex por 30 segundos e então centrifugadas a 4000rpm por 15

minutos. Foram retirados 50µL do sobrenadante e adicionados a 500µL de reagente

de cor de colesterol. Em seguida essa solução foi incubada em banho Maria a 37ºC

por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a 500nm. A concentração de HDL das

amostras foi dada a partir de um padrão conhecido de HDL.

4.2.9. Determinação da peroxidação lipídica sérica e hepática

Esta análise foi feita de acordo com o método proposto por Gerard-Monnier et

al (1998), com algumas adaptações. Para a dosagem de MDA no soro foram

utilizados 200μl de amostra. A determinação do MDA no fígado foi realizada com a

alíquota de 200l retirada do homogenato de fígado (200mg de tecido em 1L de

tampão fosfato). A este foi adicionado 650μl de solução de 10mM de 1-metil-

fenilindol em acetonitrila e metanol (2:1, v/v) e 150μl de HCL puro (37%). Logo após,

as amostras foram agitados em vórtex e incubados em banho-maria a 45ºC por 40

minutos. Após o banho, houve resfriamento das amostras em gelo e em seguida os

52

eppendorfs foram centrifugados a 4000rpm por 10 minutos. Do sobrenadante foi

feita a leitura de absorbância com comprimento de onda de 586nm. A concentração

de MDA foi calculada comparando-a a uma curva de 1,1,3,3- tetrametoxipropano

(TMP) hidrolisado.

4.2.10. Determinação de glutationa reduzida (GSH) hepática e sérica

A dosagem de Glutationa Reduzida (GSH) foi realizada no tecido hepático de

acordo com o método descrito por Sedlak e Lindsay (1968). Cerca de 100mg da

amostra do tecido foi homogeneizada em um Potter com 4,0 mL de tampão EDTA

(0,02M), sob gelo. Uma alíquota de 2,5 mL deste homogenato foi retirada, para a

mistura a 2,0 mL de água deionizada e 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 50%. A

reação dura cerca de 15minutos, posteriormente a amostra foi centrifugada por 15

minutos (4000 rpm a temperatura ambiente). Após a centrifugação foi retirado 1,0

mL do sobrenadante e adicionado 2,0 mL de tampão TRIS (0,4M, pH 8,9) e 0,05 mL

de DTNB (ácido ditionitrobenzóico) (0,01M em metanol). A leitura foi feita no

comprimento de onda de 412 nm, 5 minutos após a adição do DTNB, contra um

branco com EDTA (0,02M) em lugar do sobrenadante. A concentração foi calculada

utilizando-se uma curva padrão de GSH em EDTA (0,02M).

A GSH foi dosada por meio de uma alíquota de 25L de soro com a adição de

1mL do tampão Tris-EDTA para a realização da primeira leitura no comprimento de

onda de 412nm, obtendo-se A1. Posteriormente, 25L do DTNB foi adicionado à

esta solução e após 15 minutos de reação a temperatura ambiente, foi realizada a

segunda leitura, obtendo-se A2, contra um branco de DTNB. Após a subtração dos

valores obtidos A2-A1, a concentração na amostra foi calculada utilizando-se, uma

curva padrão de GSH, expressa em mmol/L, conforme método descrito por Costa;

Dos Santos; Lima (2006).

53

4.2.11. Determinação de retinol sérico e da vitamina E sérica e dos

óleos e gordura das dietas experimentais

As análises hepáticas de vitamina E (-tocoferol) e de retinol foram realizadas

por HPLC, segundo método adaptado de Arnaud et al (1991). Para as análises foi

utilizado um cromatógrafo Shimadzu modelo LC-20AT; coluna tipo C-18 (150 x

4,6mm - 5µm); detector UV-visível modelo SPD-20A; fase móvel composta por

acetonitrila:diclorometano:metanol 7:2:1; velocidade de fluxo de 1,0 mL/min e

detecção em 292 nm e 352 nm para α-tocoferol e retinol, respectivamente. As

concentrações foram determinadas por meio do uso de padrão externo e os

resultados foram expressos em µmol/L de soro/plasma.

Cerca de 200mg de óleo/gordura ou 200L de soro foram homogeneizados

com 400L de etanol absoluto. Posteriormente foi adicionado 400L de n-hexano

para extração. As amostras sofreram agitação em vórtex por 1 minuto, para posterior

centrifugação (3000rpm durante 10 min). O sobrenadante foi retirado, cerca de

200L, e seco ao fluxo de nitrogênio. A ressuspensão do resíduo seco foi realizada

com 200L da fase móvel e 20mL foram injetados no cromatógrafo.

4.2.12. Determinação das concentrações séricas das aminotransferases

aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase

(ALT)

As concentrações das aminotransferases séricas foram avaliadas com o uso

de kits comerciais Labtest. O método foi descrito por uma transferência de

agrupamentos amina de α-aminoácidos para α-cetoácidos, formando, glutamato e

oxaloacetato ou o piruvato, que são medidos pela formação de hidrazona, com a

característica de cor intensa em meio alcalino. No procedimento 250L de substrato

foi incubado em Banho Maria à 37°C durante 2 minutos. Em seguida, foi adicionado

50µL de amostra e a solução foi incubada em Banho Maria à 37ºC por exatamente

30 minutos (ALT) e por exatamente 1 hora (AST). Foi adicionado 250L do reagente

e a solução foi mantida à temperatura ambiente durante 20 minutos, posteriormente,

54

foi adicionado 2,5mL de NaOH e após 5 minutos à temperatura ambiente foi

realizada a leitura a 505nm. A concentração de AST ou ALT das amostras foi obtida

a partir da curva de calibração nas concentrações de zero, 28, 57, 97 e 150

Unidades/mL de um padrão conhecido de ALT, ou nas concentrações de zero, 24,

61,114 e 190 Unidades/mL de um padrão conhecido de AST.

4.3. Cálculos

4.3.1. Cálculo da taxa de eficiência da dieta (TED)

A TED expressa a eficiência da dieta em propiciar ganho de peso e é

calculada de acordo com a fórmula apresentada abaixo (KANG; AHN; LEE, 2005):

TED = [média ganho de peso diário (g)/média de consumo de dieta diário (g)]

4.3.2. Cálculo do índice de peroxibilidade da dieta

O índice de peroxibilidade (IP) da dieta foi calculado conforme descreve

Pamplona et al (1998) a partir dos dados obtidos na determinação do perfil de AGs

das dietas experimentais, com base no grau de insaturação dos AGs. A fórmula

utilizada para o cálculo é descrita a seguir:

IP = (% monoenóicos x 0,025) + (% dienóicos x 1) + (% trienóicos x 2) + (%

tetraenóicos x 4) + (pentaenóicos x 6) + (hexaenóico x 8).

55

4.3.3. Cálculo da razão entre triglicerídeos e HDLcolesterol séricos

A razão triglicerídeos/HDLcolesterol foi calculada como preditor da resistência

a insulina, conforme proposto por Fan et al (2011).

4.3.4. Cálculo da razão entre vitamina E e colesterol

A razão vitamina E/colesterol foi calculada conforme descrito por Ford et al

(2006).

4.4. Análise Estatística

A comparação entre os grupos experimentais foi realizada pela análise de

variância one-way (ANOVA) com pós-teste de Tukey, considerando p <0,05 como

nível de significância. As variáveis são apresentadas como média ± desvio padrão.

56

Resultados

57

5. Resultados

5.1. Composição dos óleos de TCM e peixe e gordura animal

5.1.1. Perfil de ácidos graxos dos óleos de TCM e peixe e gordura animal

O perfil de AGs dos óleos de TCM e peixe e da GA são apresentados no

Quadro 3.

A GA é rica em ácido oléico, principal representante dos AGMIs. Os AGSs,

principalmente os ácidos palmítico e esteárico, também estão presentes em elevado

percentual. A GA é rica em ômega 6 (n-6), sendo que o ácido linoléico é o principal

representante dos AGPIs.

O óleo de peixe é rico em AGPI n-3, sendo o EPA e DHA os principais

representantes, que contribuem para a baixa razão n-6/n-3. O perfil de AGs do óleo

de peixe revelou um elevado percentual de ácido palmítico, o que contribuiu para o

elevado percentual de AGSs.

O óleo de TCM é composto principalmente pelos AGSCMs (caprílico e

cáprico), com cadeia de 8 e 10 carbonos, respectivamente. A análise dos AGs do

óleo de TCM apresentou valores mínimos de AGs com insaturações.

A maior razão entre AGSs e AGPIs foi encontrada na GA, seguida do óleo de

peixe. Estima-se que esta razão seja elevada no óleo de TCM devido ao mínimo

conteúdo de AGPIs.

58

Quadro 3. Composição percentual em ácidos graxos dos óleos de peixe, TCM e gordura animal (%).

Ácido Graxo Estrutura

Óleos Gordura* animal Peixe TCM

Ácidos graxos saturados

Ácido caprílico C8:0 <0,05 52,02 <0,05

Ácido cáprico C10:0 <0,05 35 <0,05

Ácido mirístico C14:0 7,31 12,78 1,4

Ácido palmítico C16:0 22,28 <0,05 24,53

Ácido esteárico C18:0 4,81 <0,05 10,07

Ácido tricosanóico C23:0 0,75 <0,05 <0,05

∑AGS

35,15 99,8 36

Ácidos graxos monoinsaturados

Ácido palmitoléico C16:1 7,54 <0,05 2,39

Ácido oléico C18:1n9 10,36 <0,05 43,23

Ácido erúcico C22:1n9 1,42 <0,05 <0,05

∑AGMI

19,32 - 45,61

Ácidos graxos poli-insaturados

Ácidos graxos n-6

Ácido linoléico C18:2n6 11,31 <0,05 16,54

Ácido Di-homo-linolênico C20:3n6

<0,05 0,53

Ácido araquidônico C20:4n6 0,46 <0,05 <0,05

∑n-6

11,77 - 17,07

Ácidos graxos n-3

Ácido α-linolênico C18:3n3 1,91 <0,05 <0,05

Ácido eicosatrienóico C20:3n3 0,22 <0,05 <0,05

Ácido eicosapentaenóico C20:5n3 15,05 <0,05 <0,05

Ácido docosahexaenóico C22:6n-3 12,6 <0,05 <0,05

∑n-3

29,78 - <0,05

∑AGPI

41,55 - 17,07

Razão n-6/n-3

0,4 - -

Razão ∑AGS/∑AGPI

0,85 - 2,03

Outros ácidos graxos 4,2 0,2 1,32

*Perfil de ácidos graxos da gordura animal sem tratamento térmico. ∑: somatória; AGS: ácidos graxos saturados; AGMI: ácidos graxos monoinsaturados; AGPI: ácidos graxos poli-insaturados; n-3: ácidos graxos ômega-3; n-6: ácidos graxos ômega-6.

59

5.1.2. Índice de peroxibilidade dos óleos de TCM e peixe e gordura

animal

O IP dos óleos de TCM e de peixe e da GA são apresentados no Quadro 4.

O cálculo do IP é realizado de acordo com o grau de insaturações dos AGs. O

óleo de peixe é composto por elevado percentual dos AGPIs EPA e DHA, o que

contribuiu para elevado IP encontrado. A GA apresentou baixo IP provavelmente por

apresentar elevado percentual de AGS e AGMI. Em relação ao óleo de TCM,

estima-se que o IP seja mínimo, já que é composto por AGSs e apresenta um

percentual mínimo de insaturações.

60

Quadro 4. Índice de peroxibilidade (IP) dos óleos de TCM e peixe e da gordura animal utilizados na dieta.

Óleo de Peixe

Óleo de

TCM*

Gordura**

Animal

Índice de peroxibilidade 208,99 ─ 18,74

*Devido à presença de quantidades mínimas de AGs com insaturações não foi possível realizar o cálculo do índice de peroxibilidade do óleo de TCM. **Índice de peroxibilidade da gordura animal sem tratamento térmico. IP = (% monoenóicos x 0,025) + (% dienóicos x 1) + (% trienóicos x 2) + (% tetraenóicos x 4) + (pentaenóicos x 6) + (hexaenóico x 8).

61

5.1.3. Vitamina E dos óleos de TCM e peixe e gordura animal

O teor de vitamina E dos óleos de TCM e de peixe e da GA são apresentados

na Figura 3.

O óleo de peixe apresenta elevado teor de vitamina E, seguido do óleo de

TCM e da GA, em ordem decrescente de concentração.

62

Figura 3. Valores de vitamina E dos óleos de TCM e peixe e da gordura animal (nmol/mL). *Valores de vitamina E da gordura animal sem tratamento térmico. Barras

largas verticais representam a média, barras finas representam os desvios-padrões. ap<0,001 vs Gordura Animal. bp<0,001 vs óleo de TCM.

63

5.2. Crescimento dos animais

O peso inicial dos animais não apresentou diferença estatística. A evolução

do peso semanal dos animais evidenciou um menor ganho de peso nos grupos que

foram alimentados com as dietas HL+ a partir da terceira semana, comparados ao

grupo Controle. Na sétima semana o grupo HL+OP apresentou peso reduzido em

relação ao HL+GA. Na oitava semana, somente os grupos que receberam os óleos

(HL+TCM, HL+OP e HL+OP/TCM) apresentaram peso menor que o Controle. Apenas

o grupo que recebeu o óleo de peixe (HL+OP) apresentou menor peso final,

comparado ao Controle. Os dados são apresentados na Figura 4 e na Tabela 1.

O calculo do ganho de peso (Δ) revelou um menor ganho de peso total no

grupo HL+OP, em relação ao grupo Controle. Os dados são apresentados na Tabela

1. As médias de peso observadas semanalmente durante o experimento são

apresentadas no Apêndice A.

64

Figura 4. Evolução semanal do peso dos animais (g). Os pontos representam valores médios de ganho de peso, as barras verticais em cada ponto expressam os desvios-padrões. ap<0,05 vs Controle. bp<0,01 vs HL+GA. (♦)Controle, (■)HL+GA, ( )HL+OP, (><)HL+TCM, (>|<)HL+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA

50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

65

Tabela 1. Peso inicial, peso final e ganho de peso dos animais durante todo experimento (g).

Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM

Peso corporal inicial (g) 70,00±6,88 68,29±6,16 62±8,45 64,86±5,08 70,33±7,44

Peso corporal final (g) 402,57±74,47 371,14±45,72 335±34,11 310,29±34,49a 324,83±88,47

(Δ) Ganho de peso (g) 332,57±70,32 302,86±41,83 273±36,74 245,43±30,01a 254,5±84,22

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

66

5.3. Ingestão alimentar dos animais

Na Figura 5 são apresentados os dados sobre a ingestão alimentar semanal

dos animais durante o experimento. A ingestão de dieta semanal dos animais foi

calculada a partir da média obtida em 3 dias de consumo. A partir da primeira

semana do experimento verifica-se uma redução da ingestão alimentar nos animais

que receberam as dietas HL+. Na sétima semana, o grupo alimentado com óleo de

peixe somente, apresentou uma redução significativa da ingestão alimentar,

comparado tanto ao Controle, quanto ao grupo HL+GA. Na última semana, não

verificou-se diferença significativa na ingestão alimentar entre os grupos

experimentais. As médias de ingestão alimentar por semana são apresentadas no

Apêndice B.

A ingestão energética semanal dos animais é apresentada na Figura 6. Na

primeira semana, os animais alimentados com as dietas HL+ dos grupos HL+OP,

HL+TCM HL+OP/TCM apresentaram maior ingestão de energia em relação ao

Controle. Durante o experimento, a ingestão energética dos grupos HL+ foi

semelhante ao Controle. Somente na sétima semana, verificou-se redução da

ingestão enérgetica nos grupos alimentados com óleo de peixe (HL+OP e

HL+OP/TCM). Nas últimas semanas do experimento a ingestão energética foi

normalizada, sendo que não se verificou diferença estatística. As médias de

ingestão energética por semana são apresentadas no Apêndice C.

67

Figura 5. Ingestão alimentar semanal dos animais (g). Os pontos representam valores médios de ingestão alimentar, as barras verticais em cada ponto expressam os desvios-padrões. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs Controle. cp<0,05 vs HL+GA. (♦ )Controle, (■)HL+GA, ( )HL+OP, (><)HL+TCM, (>|<)HL+OP/TCM. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta

Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

68

Figura 6. Ingestão energética semanal dos animais (g). Os pontos representam valores médios de ingestão energética, as barras verticais em cada ponto expressam os desvios-padrões. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,001 vs HL+OP. bp<0,01 vs HL+TCM. cp<0,05 vs HL+OP/TCM. (♦ )Controle, (■)HL+GA, ()HL+OP, (><)HL+TCM, (>|<)HL+OP/TCM. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2:

Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

69

5.4. Ganho de peso, ingestão alimentar e energética diários e taxa de

eficiência da dieta

A quantidade de dieta ingerida por dia foi significativamente menor nos grupos

alimentados com as dietas HL+. No entanto, não houve diferença estatística da

ingestão energética nestes grupos HL+, em relação ao grupo Controle. O ganho de

peso por dia dos grupos HL+ foi semelhante ao Controle, com exceção do grupo

HL+OP/TCM, que apresentou menor ganho de peso diário. A TED, que expressa a

eficiência da dieta em propiciar ganho de peso, foi maior nos grupos HL+. Os dados

são apresentados na Tabela 2.

70

Tabela 2. Ingestão alimentar diária (g/dia), ingestão energética diária (Kcal/dia), ganho de peso diário (g/dia) e taxa de eficiência da dieta.


Ingestão de dieta (g/dia) 11,72±2,92 6,48±1,24a 6,23±1,25a 5,88±0,84a 5,67±1,58a

Ingestão energética (Kcal/dia) 41,01±10,21 40,51±7,77 38,93±7,79 36,73±5,28 35,46±9,90

Ganho de peso (g/dia) 5,54±1,17 5,18±0,68 4,61±0,67 4,13±0,76 3,91±2,04b

Taxa de eficiência da dieta 0,42±0,11 0,76±0,05a 0,71±0,05a 0,67±0,08a 0,69±0,14a

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle. bp<0,05 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

71

5.5. Peso hepático, peso do tecido adiposo epididimal e retroperitonial,

e razões em relação ao peso corporal

Os dados sobre peso hepático e do tecido adiposo são apresentados na

Tabela 3. O peso hepático foi significativamente maior apenas no grupo HL+GA,

comparado aos grupos Controle, HL+TCM e HL+OP/TCM. A razão peso

hepático/corporal revela maior peso hepático em relação ao peso corporal tanto no

grupo HL+GA quanto no grupo HL+OP, comparados ao Controle. No grupo HL+GA

verificou-se maior peso de tecido adiposo epididimal, comparado ao Controle e

HL+TCM. O mesmo é observado quando o peso do tecido adiposo epididimal é

ajustado pelo peso corporal. Em relação ao peso do tecido adiposo retroperitoneal,

verifica-se maiores valores nos grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM. Os valores

do peso do tecido adiposo retroperitoneal ajustado pelo peso corporal revelam que

também há diferença estatística no grupo HL+OP em relação ao Controle.

72

Tabela 3. Peso hepático, peso tecido adiposo epididimal e retroperitonial, e razões em relação ao peso corporal (g).


Peso hepático (g) 9,41±1,99 14,05±3,22a,b 10,25±1,93 11,05±2,54 10,25±2,26

Razão peso hepático/corporal (%) 2,33±0,11 3,76±0,50c 3,08±0,59 3,53±0,46c 3,29±0,94

Tecido adiposo epididimal (g) 4,47±1,63 7,90±2,46a,d 4,60±1,59 5,13±1,39 5,64±2,96

Tecido adiposo retroperitoneal (g) 3,82±1,88 9,91±2,69c 7,38±1,47c 6,75±1,93 8,07±4,08c

Razão peso tecido adiposo epididimal/corporal (%) 1,12±0,44 2,09±0,45c,d 1,35±0,35 1,64±0,30 1,67±0,47

Razão peso tecido retroperitoneal/corporal (%) 0,93±0,44 2,64±0,46c 2,20±0,31c 2,15±0,42c 2,38±0,54c

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. bp<0,05 vs HL+TCM e HL+OP/TCM. cp<0,001 vs Controle. dp<0,05 vs HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

73

5.6. Gordura hepática total, gordura hepática percentual e

concentração das frações lipídicas hepáticas

A gordura total hepática e gordura hepática percentual (Tabela 4 e Figura 7)

foram significativamente maiores nos grupos que receberam as dietas HL+, com

exceção do grupo HL+OP. O CT hepático apresentou maiores valores nos grupos

HL+GA, HL

+OP e HL

+OP/TCM. Os valores de TG hepático foram maiores nos grupos

HL+, no entanto o grupo HL+OP não apresentou diferença significativa.

74

Tabela 4. Caracterização de gordura hepática pelos valores de gordura total (g gordura/g tecido), colesterol total e

triglicerídeos hepáticos (g/g tecido).


Gordura total hepática (g gordura/g tecido) 0,05±0,01 0,21±0,06a,b 0,16±0,04a 0,11±0,04 0,17±0,06a

Colesterol total hepático (g/g tecido) 2,72±0,17 5,36±1,96c 3,49±0,66 5,38±2,47c 5,28±1,52c

Triglicerídeos hepático (g/g tecido) 3,36±1,65 74,42±29,93a,d 64,85±39,67a 36,91±15,93e 68,52±29,13a

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle. bp<0,001 vs HL+OP. cp<0,05 vs Controle. dp<0,05 vs HL+TCM e HL+OP/TCM. ep<0,05 vs HL+GA. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

75

Figura 7. Percentual de gordura hepática (%). Barras largas verticais representam a média, barras finas representam os desvios-padrões. ap<0,001 vs Controle. bp<0,001 vs HL+OP. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

76

5.7. Concentração sérica de glicose, triglicerídeos, colesterol total, HDL

colesterol séricos e razão triglicerídeos/HDLcolesterol

Os valores séricos de glicose e TG não apresentaram diferença significativa.

Verificou-se que o CT sérico foi maior no grupo HL+TCM. Neste mesmo grupo,

verificou-se maior valor da HDL colesterol, em relação aos grupos Controle e

HL+OP/TCM. A razão triglicerídeos/HDL colesterol foi menor no grupo HL+TCM,

comparado ao grupo HL+OP/TCM. Os dados são apresentados na Tabela 5.

77

Tabela 5. Valores séricos de glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDLcolesterol) (mg/dL), e razão triglicerídeos/HDLcolesterol.


Glicose (mg/dL) 75,78±8,25 89,31±17,97 70,66±17,30 87,62±21,67 81,37±7,48

Triglicerídeos (mg/dL) 61,03±11,00 80,26±19,31 69,94±8,87 82,85±21,09 92,6±54,89

Colesterol total (mg/dL) 67,35±18,81 81,26±11,20 114,80±22,50a 82,07±17,88 67,43±26,13

HDL colesterol (mg/dL) 45,44±8,77 51,46±9,06 64,90±11,62b 57,62±12,43 44,65±8,68

Razão triglicerídeos/HDLcolesterol 1,56±0,36 1,56±0,29 1,06±0,19c 1,53±0,51 2,10±1,05

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle, HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM. bp<0,001 vs Controle e HL+OP/TCM. cp<0,01 vs HL+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

78

5.8. Proteína total sérica e hepática

Os valores de proteína total sérica não apresentaram diferença significativa.

No entanto, ao observar os valores hepáticos, verifica-se menor proteína total nos

grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM, em relação ao Controle. Os dados são

apresentados na Tabela 6.

79

Tabela 6. Concentrações médias sérica e hepática de proteína (g/mL).


Proteína total sérica (g/mL) 0,079±0,011 0,074±0,010 0,075±0,004 0,075±0,008 0,077±0,009

Proteína total hepática (g/mL) 0,023±0,005 0,019±0,002a 0,018±0,003a 0,021±0,004 0,017±0,002a

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ -

5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5

dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura

animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe

ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de

peixe e 15% de óleo de TCM.

80

5.9. Concentração sérica das aminotransferases

As concentrações séricas de AST e ALT e a razão AST/ALT são

apresentadas na Tabela 7. Os grupos HL+TCM e HL+OP/TCM apresentaram valores

séricos maiores de AST (comparado ao grupo HL+GA) e o grupo HL+OP apresentou

valor sérico maior de ALT, quando comparado aos grupos HL+GA e HL+TCM. A

razão AST/ALT foi menor nos animais alimentados com a dieta HL+ adicionada

somente de óleo de peixe (HL+OP).

81

Tabela 7. Concentrações médias séricas de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) (U/L) e razão AST/ALT.


AST (U/L) 77,8±18,88 66,00±8,72 85,48±12,76a 83,18±9,49 88,06±14,22a

ALT (U/L) 30,57±18,17 24,50±6,09 30,21±5,69 43,53±9,16b 34,57±4,07

AST/ALT 2,42±1,18 2,84±0,99 2,91±0,71 1,90±0,65c 2,40±0,59

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs HL+GA. bp<0,05 HL+GA e HL+TCM. cp<0,05 HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

82

5.10. Peroxidação lipídica sérica e hepática

Os valores de MDA como marcador da peroxidação lipídica são apresentados

na Tabela 8. O grupo HL+GA apresentou valor significativamente maior de MDA

sérico em relação aos grupos HL+TCM e HL+OP/TCM. Os grupos que receberam as

dietas HL+ apresentaram valores significativamente maiores da peroxidação lipídica

hepática em relação ao Controle, com exceção do grupo HL+TCM.

83

Tabela 8. Valores séricos (nmol/g proteína) e hepáticos (mol/g proteína) de malondialdeído (MDA).


MDA sérico (nmol/g proteína) 85,80±24,16 104,23±29,19a 65,29±6,28 86,70±23,01 59,36±14,95

MDA hepático (mol/g proteína) 11,46±1,83 50,92±20,12b 16,66±9,07c 64,05±20,11b 54,23±8,75b

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs HL+TCM e HL+OP/TCM. bp<0,001 vs Controle. cp<0,001 vs HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM. MDA: Malondialdeído.

84

5.11. Sistema antioxidante sérico e hepático

Os parâmetros do sistema antioxidante sérico e hepático são apresentados

na Tabela 9. Apesar das concentrações de GSH sérico não apresentarem diferenças

significativas entre os grupos, verificou-se maiores valores de GSH hepático nos

grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM. Valores significativamente menores de

vitamina E sérica foram observados nos grupos HL+GA, HL+OP em relação ao

Controle e ao grupo HL+TCM. No grupo HL+OP/TCM o menor valor de vitamina E

sérica apresentou diferença significativa somente em relação ao grupo HL+TCM. O

cálculo da vitamina E ajustado pelo colesterol foi significativamente menor nos

grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM, em relação ao Controle. A concentração do

retinol sérico foi significativamente maior nos grupos HL+GA e HL+TCM.

85

Tabela 9. Componentes do sistema antioxidante, valores de glutationa reduzida (GSH) sérica e hepáticamol/g proteína),

vitamina E e retinol séricos (mol/L) e razão vitaminaE/colesterol (mol/mg).


GSH sérico (mol/g proteína) 4,03±1,44 5,7±1,69 5,38±1,54 5,23±1,54 3,69±1,39

GSH hepático (µmol/g proteína) 395,32±90,42 553,59±81,42a 532,51±79,21a 448,91±94,52 524,82±73,08a

Vitamina E sérico (µmol/L) 5,24±2,04 1,77±0,70a,b 8,39±3,73 0,67±0,20a,b 2,09±1,84b

Razão vitamina E/colesterol (mol/mg) 0,79±0,16 0,17±0,13c 0,77±0,36 0,08±0,02c 0,24±0,15c

Retinol sérico (µmol/L) 0,36±0,08 0,96±0,41a 0,86±0,31a 0,79±0,32 0,80±0,42

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs HL+TCM. cp<0,001 vs Controle e HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

86

Discussão

87

6. Discussão

A GA termolizada utilizada no presente estudo implica na ingestão de

compostos que favorecem o estresse oxidativo. O aquecimento da GA a elevadas

temperaturas resulta na produção de compostos tóxicos como os produtos da

peroxidação lipídica, produtos finais de glicação avançada e lipoxidação e, portanto,

a ingestão da dieta HL+ termolizada implica no fornecimento exógeno destes

compostos (ASSIS et al, 2009; SHANGARI et al, 2007).

A análise do perfil de AGs da GA utilizada na dieta dos animais apresentou

elevado percentual de AGSs (ácidos palmítico e esteárico), AGMIs (ácido oléico),

AGPI n-6 (ácido linoléico), com elevada razão ∑AGS/∑AGPI, mas foi realizada antes

do processamento térmico. O aquecimento da gordura promove oxidação da cadeia

lipídica e pode resultar em alterações na composição em AGs. Segundo Gabriel,

Alexander e Valli (1976), o processamento térmico da GA promove uma redução da

concentração de ácido linoléico (1,4%) e aumento das concentrações de ácido

palmítico (28,1%) e esteárico (18,6%). Este mesmo estudo relata que a ingestão da

GA termolizada pode resultar em alterações na composição hepática de AGs, como

a redução das concentrações de ácidos oléico, ácido araquidônico e linoléico, e

aumento dos níveis de ácido palmítico e palmitoléico (GABRIEL, ALEXANDER;

VALLI, 1976).

Os óleos de Peixe e de TCM utilizados nas dietas não foram submetidos ao

processamento térmico e a composição em AGs encontrada no presente estudo

apresenta-se de acordo com o esperado, conforme descrito a seguir.

O óleo de peixe é rico em EPA e DHA, o que contribui para o elevado

percentual de AGPIs, elevado IP e baixa razão n-6/n-3 (OTTO et al, 1991; LOPEZ et

al, 2008). A elevada concentração de ácido palmítico no óleo de peixe contribuiu

para elevado percentual de AGSs. O uso de peixes com elevado percentual de

gordura corporal para extração do óleo e o uso do óleo de peixe não refinado nos

estudos em geral são fatores que contribuem para o elevado percentual de AGSs

(VENTURA; WOOLLETT; SPADY, 1989, PICKOVA, 2009). O conteúdo de colesterol

no óleo de peixe não está descrito na literatura, no entanto, espera-se que o valor do

colesterol no óleo seja maior que o encontrado na matéria-prima, que varia de

88

68,2mg, 87mg e 142mg em 100g de peixes como atum, salmão e sardinha,

respectivamente, devido à extração da fração lipídica (TACO, 2011; USDA, 2009).

O óleo de TCM utilizado no presente estudo é composto em maiores

percentuais pelos AGs caprílico e cáprico com cadeia de 8 e 10 carbonos,

respectivamente, e está de acordo com o encontrado nos estudos de Wollin et al

(2004), Tholstrup et al (2004) e You et al (2008). No entanto, a análise de AGs do

óleo de TCM revelou percentual de ácido mirístico maior que o valor encontrado em

outros estudos (WOLLIN et al, 2004; CATER; HELLER; DENKE, 1997). Os

percentuais de AGs essenciais n-6 e n-3 no óleo de TCM são mínimos (FLOYD,

1999). Estima-se um mínimo IP no óleo de TCM, pois apresenta valores mínimos de

AGs com insaturações.

A introdução à dieta HL+ foi associada à redução da ingestão alimentar, que

também ocorreu nos períodos de adaptação com aumento gradual de lipídios na

dieta. As dietas HL+ apresentaram maior TED em propiciar o ganho de peso devido

à elevada densidade calórica. Nos cálculos dos valores diários, a redução da

ingestão alimentar resultou em manutenção da ingestão energética. Os valores

apresentados por semana também revelam que a redução da ingestão alimentar nos

grupos HL+ não foi associada à redução de energia durante o experimento.

Outros estudos também observaram a redução da ingestão alimentar em

animais alimentados com dietas HL+ (LEONARDI et al, 2010; CATON et al, 2009). A

redução da ingestão alimentar é associada à manutenção da ingestão energética e

manutenção do peso dos animais que consomem dieta HL+ (SINITSKAYA et al,

2007; LARTER; YEH, 2008). O estudo de Benani et al (2012), realizado com

animais, demonstra o efeito anorexígeno da dieta HL+ e controle da homeostase

energética corporal.

A sétima semana corresponde ao período de introdução das dietas contendo

os óleos utilizados no experimento. A introdução da dieta contendo óleo de peixe foi

realizada de forma gradual, no entanto, resultou em maior redução da ingestão

alimentar no grupo HL+OP. Neste mesmo período, verificou-se redução da ingestão

de energia nos grupos que receberam o óleo de peixe (HL+OP e HL+OP/TCM). O

estudo de Buettner et al (2006) também verificou a redução da ingestão alimentar

associada ao uso do óleo de peixe na dieta dos animais. Segundo Cintra et al (2012)

89

dietas ricas em AGPIs são associadas à redução da inflamação no hipotálamo e

contribuem para redução da ingestão alimentar e do peso corporal.

O peso inicial dos animais não apresentou diferença estatística. Durante o

experimento foi observado que os grupos HL+ apresentaram menor peso em relação

ao Controle a partir da terceira semana, no entanto, somente o grupo HL+OP

apresentou menor ganho de peso total e menor peso final e o grupo HL+OP/TCM

apresentou menor ganho de peso por dia. O uso óleo de peixe na dieta HL+

promoveu redução na ingestão alimentar e energética, o que provavelmente

contribuiu para as alterações no ganho de peso verificadas nos grupos HL+OP e

HL+OP/TCM.

O peso do tecido adiposo retroperitonial foi maior em todos os animais que

receberam as dietas HL+, mas somente o grupo HL+GA apresentou maior peso do

tecido adiposo epididimal. O uso dos óleos de peixe e óleo de TCM na dieta dos

animais não resultou em valores significativamente maiores do tecido adiposo

epididimal nos animais dos grupos HL+TCM, HL+OP, HL+OP/TCM.

No estudo de Assis et al (2009) a GA termolizada não resultou em diferença

significativa no acúmulo de tecido adiposo epididimal em relação aos animais

alimentados com a GA sem processamento térmico. O efeito positivo observado no

presente estudo devido ao menor peso do tecido adiposo epididimal dos grupos

alimentados com os óleos de TCM e/ou peixe pode ser resultante de seus efeitos

metabólicos.

Os TCMs são rapidamente absorvidos e são associados à supressão do

acúmulo de tecido adiposo (TAKEUCHI et al, 2008). O estudo de Han et al (2003)

observou que o menor conteúdo de gordura abdominal nos animais que consumiram

o óleo de TCM na dieta HL+ está associado a inibição da expressão de genes

adipogênicos no tecido adiposo. A oxidação dos TCMs resulta em menor liberação

de energia (8,3Kcal/g) que os TCLs (LAVAU; HASHIM, 1978) e pode influenciar o

acúmulo de gordura corporal. Takeuchi et al (2008) relata que a redução do tecido

adiposo pode estar associada à influência dos TCMs no aumento do gasto

energético.

90

No entanto, os estudos são controversos em associar o uso dos TCMs à

redução de gordura corporal e perda de peso (BEERMANN et al, 2003; ROYNETTE

et al, 2008). A ingestão excessiva dos TCMs pode resultar em aumento da

lipogênese de novo hepática e contrabalancear os efeitos no aumento do gasto

energético e redução da gordura corporal (SHINOHARA et al, 2005).

A suplementação do n-3 é associada à redução da hiperplasia e hipertrofia do

tecido adiposo (QUEIROZ et al, 2009). O estudo de Jelinek et al (2013) descreve a

redução do tecido adiposo epididimal em animais alimentados com óleo de peixe na

dieta HL+. Os mecanismos descritos são por modulação no metabolismo devido ao

estímulo à -oxidação por indução do PPAR- em resposta aos AGPI n-3 e controle

na diferenciação e proliferação das células adiposas (HENSLER et al, 2011).

No entanto, os resultados ainda são controversos, conforme demonstrado no

estudo de Taltavull et al (2014) em que foi verificado aumento da gordura abdominal

em animais alimentados com óleo de peixe na dieta HL+. Os resultados obtidos

utilizando-se o óleo de peixe podem variar conforme o modelo experimental e a dieta

resultando em aumento ou redução do tecido adiposo (SARASWATHI et al, 2007).

No presente estudo, os animais alimentados com dietas contendo óleo de peixe

apresentaram menor ganho de peso em decorrência de menor ingestão alimentar e,

portanto, o menor ganho de gordura corporal também pode ser resultante das

alterações na ingestão energética.

Estudos que descrevem a influência da associação dos óleos de peixe e TCM

no tecido adiposo são raros na literatura. O estudo de Dulloo et al (1995) realizado

com uma mistura de lipídios de diferentes fontes (entre outros, banha, óleo de coco

e óleo de peixe) descreve aumento da gordura corporal quando o óleo de peixe foi

utilizado isolado ou na mistura de lipídios, mas a dieta rica em TCMs resultou em

redução da gordura corporal. No presente estudo, o efeito positivo foi mantido, pois

não se verificou diferença significativa no peso do tecido adiposo quando os óleos

de TCM e peixe foram utilizados isolados ou em associação.

A dieta HL+ utilizada neste estudo contendo 50% de lipídios foi eficiente em

induzir esteatose hepática, pois os grupos HL+ apresentaram percentual de gordura

hepática acima de 20 à 40%. O acúmulo de gordura hepática que excede 5% a 10%

do peso tecidual, na ausência de consumo excessivo de álcool ou outra doença

91

hepática, é definido como NAFL (VARELA-REY et al, 2009; VANNI et al, 2010)

Segundo Hijona et al (2010), a quantificação bioquímica de gordura hepática

apresenta forte relação com a classificação histológica da esteatose hepática

proposta por Kleiner e Brunt (2005).

No presente estudo, a indução da esteatose é resultante da excessiva

ingestão de gordura termolizada pela dieta HL+. O aumento da gordura hepática em

animais alimentados com a dieta HL+ é esperado, conforme já descrito por Picchi et

al (2011) e Leonardi et al (2010). O estudo de Luci et al (2007) descreve a

associação da ingestão de gordura submetida ao processamento térmico e estímulo

da síntese de TG e colesterol no fígado via SREBP 1c no desenvolvimento da

esteatose hepática.

Entre os grupos que consumiram dietas HL+ com diferentes composições em

AGs, verificou-se diferenças no acúmulo de gordura e frações lipídicas hepáticas. Os

grupos HL+GA e HL+OP/TCM foram caracterizados pelo acúmulo de gordura total,

TG e CT hepáticos. O grupo HL+TCM apresentou acúmulo de gordura hepática na

forma de TG. A gordura total hepática no grupo HL+OP não foi significativamente

maior, mas este grupo apresentou maior valor de CT hepático.

No grupo HL+OP, o maior peso hepático não foi associado ao maior acúmulo

de gordura e apenas este grupo não apresentou valor significativamente menor de

proteína hepática. Outros estudos descrevem a hepatomegalia em animais

alimentados com óleo de peixe, que pode estar associada à indução da proliferação

e aumento do volume dos peroxissomos e também à indução da hiperplasia das

células hepáticas (OTTO et al, 1991; BUETTNER et al, 2006).

A adição de óleo de peixe na dieta dos animais resultou em efeito benéfico

devido aos menores valores de gordura total e TG hepáticos. Estudos descrevem

efeitos benéficos do óleo de peixe na redução da esteatose e TG hepáticos

(SARASWATHI et al, 2007; BARGUT et al, 2014). O EPA e DHA presentes no óleo

de peixe são associados à redução da esteatose hepática, pois promovem uma

modulação no metabolismo de lipídios. Os AGPI n-3 estão associados à redução da

síntese hepática de TG por inibição do SREBP-1c e aumento da _oxidação de

lipídios por ativação do PPAR- (POPESCU, 2013; SVEGLIATI-BARONI et al, 2006;

LEVY; CLORE; STEVENS, 2004).

92

Apesar do efeito benéfico devido aos menores valores de TG, o grupo que

recebeu o óleo de peixe apresentou elevado conteúdo hepático de colesterol. Os

peixes marinhos apresentam valores de colesterol de até 142mg/100g, como o

encontrado na sardinha e espera-se que no óleo de peixe este valor seja maior, já

que se trata da fração lipídica do alimento (TACO, 2011; USDA, 2009). Segundo

Saraswathi et al (2007), os AGPIs n-3 promovem aumento da captação hepática do

HDL colesterol, o que também pode contribuir para o aumento do CT hepático.

O óleo de TCM foi associado a maiores valores de gordura total e TG

hepáticos, mas verificou-se efeito benéfico devido ao menor acúmulo hepático de

CT. O teor de óleo de TCM utilizado na dieta do presente estudo (25%) foi maior que

o utilizado em estudo anterior (15%) (ALMEIDA, 2011) e verificou-se prevenção do

acúmulo excessivo de TG, mas não resultou em valor significativamente menor de

gordura hepática. Segundo o estudo de Ronis et al (2013), os benefícios dos TCMs

na redução da esteatose hepática são proporcionais à sua concentração na dieta. O

estudo de Lieber et al (2008) descreve que o uso dos TCMs é benéfico na redução

da esteatose quando utilizados como única fonte de gordura na dieta ou com a

restrição da ingestão de dieta.

O efeito benéfico dos TCMs na redução na esteatose hepática é resultante da

prevenção da inibição da -oxidação de AGs (LIEBER et al, 2007; LIEBER et al,

2008). Os TCMs são hidrolisados à AGSCMs e rapidamente absorvidos pelo trato

intestinal (AOYAMA; NOSAKA; KASAI, 2007). O transporte dos AGSCMs, ligados à

albumina, ocorre diretamente para o fígado pela veia porta (GEELEN et al, 1995;

AOYAMA; NOSAKA; KASAI, 2007). No fígado, os AGSCMs vão sofrer a _oxidação,

que não depende do transporte mitocondrial pela carnitina palmitoil transferase-1 e,

portanto, são oxidados preferencialmente (SHINOHARA et al, 2005).

No entanto, quando os TCMs são ofertados em excesso, a _oxidação

mitocondrial ocorre extensivamente levando à elevada produção de Acetil CoA. Uma

parte da Acetil CoA produzida em excesso é substrato para a produção de AGs

através da síntese de novo (BACH; BABAYAN, 1982; GEELEN et al, 1995). Os

TCMs também podem favorecer o acúmulo hepático de lipídios devido à menor

inibição de enzimas lipogênicas, resultando em aumento da síntese e esterificação

de AGs (CHANEZ et al, 1991; FOUFELLE et al, 1992). Além dos fatores já citados,

93

a deficiência de AGs n-3 das dietas contendo os TCMs também pode favorecer o

acúmulo hepático de lipídios (TANAKA et al, 2010).

Os estudos, em geral, não avaliam alterações no colesterol hepático

associado ao uso dos TCMs nas dietas HL+ (RONIS et al, 2013; LIEBER et al, 2008;

SHINOHARA et al, 2005). O estudo de Geelen et al (1995) descreve a redução do

CT hepático associado ao uso dos TCMs na dieta HL+ contendo 1% de óleo de

milho e 15% de óleo de TCM. Em estudo anterior, realizado com menor quantidade

de TCM (15%) na dieta HL+ rica em colesterol verificou-se acúmulo de colesterol

hepático (ALMEIDA, 2011). A utilização dos TCMs em maior percentual na dieta

(25%) no presente estudo, provavelmente resultou em efeito benéfico devido ao

menor acúmulo do colesterol hepático.

O uso do óleo de TCM e óleo de peixe associados resultou em um efeito

negativo, pois verificou-se maior acúmulo de gordura hepática tanto na forma de

colesterol quanto de TG. Há escassez de dados que descrevem o tratamento da

esteatose com o óleo de peixe e TCM em associação na dieta. O estudo de

Carpentier et al (2008) descreve a redução da esteatose hepática após a injeção de

uma mistura de lipídios (TCM e óleo de peixe na proporção 4:1, respectivamente)

em animais com deficiência de n- 3.

No presente estudo, a proporção dos óleos de peixe e TCM utilizados em

associação na dieta HL+ (15% de óleo de TCM e 10% de óleo de peixe) não resultou

em efeitos benéficos, pois prevaleceram os efeitos negativos observados com o uso

dos óleos de forma isolada.

As alterações séricas não refletiram as alterações hepáticas encontradas. Os

grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM não apresentaram alterações significativas

nos valores séricos de glicemia, CT, TG, HDL colesterol e razão TG/HDL. Somente o

grupo HL+TCM apresentou maiores valores séricos de CT, HDL colesterol e menor

razão TG/HDL colesterol.

A dieta HL+ contendo somente GA termolizada não resultou em alterações

significativas nos parâmetros séricos de glicemia e frações lipídicas. O estudo de

Assis et al (2009), que utilizou GA termolizada, também não observou alteração

significativa na glicemia e lipídios séricos (CT e HDL), no entanto, outros parâmetros

como teste de tolerância à glicose e à insulina, e os níveis séricos de ácidos graxos

94

livres apresentaram-se alterados. No presente estudo, não foram realizadas as

análises para constatar estas alterações.

Os grupos alimentados com óleo de peixe não apresentaram alterações

séricas significativas de colesterol. Segundo Saraswathi et al (2007), a redução do

colesterol sérico e hepático resultante do uso do óleo de peixe na dieta está

associada ao acúmulo no tecido adiposo. No presente estudo, os valores séricos de

CT não apresentaram valores significativamente maiores, mas verificou-se acúmulo

hepático de colesterol nos grupos HL+OP e HL+OP/TCM. O conteúdo de colesterol

não foi dosado no tecido adiposo dos animais.

No grupo HL+TCM, verificou-se efeito benéfico devido ao maior valor de HDL

colesterol e menor razão TG/HDL com a adição de óleo de TCM, somente, na dieta

HL+. Segundo o estudo de Fan et al (2011) a razão TG/HDL colesterol pode ser

utilizada como preditor da RI, em que baixos níveis de HDL colesterol e TG elevados

são fatores de risco para a RI.

Os TCMs apresentam efeitos favoráveis na redução dos TG séricos e,

segundo Hayes (2000), o aumento do CT provavelmente está associado à

hiperlipidemias. No entanto, o estudo de Tholstrup et al (2004), verificou o efeito

hiperlipemiante dos TCMs resultando em aumento sérico dos TG, CT e LDL

colesterol em homens normolipidêmicos. Os resultados encontrados nos estudos

são controversos devido às diferentes fontes lipídicas que compõem as dietas HL+

para avaliar os efeitos do uso dos TCMs (THOLSTRUP et al, 2004). No presente

estudo, o valor significativamente maior do HDL colesterol provavelmente contribuiu

para maiores valores de CT sérico nos animais que consumiram o óleo de TCM.

Embora os valores séricos de TG nos grupos que receberam a dieta contendo TCM

não se modificaram, observou-se acúmulo de TG no fígado.

Os maiores valores séricos de aminotransferases, como marcadores de lesão

hepática, foram verificados nos animais que receberam as dietas HL+ que continham

o óleo de TCM e/ou óleo de peixe (grupos HL+TCM, HL+OP e HL+OP/TCM). A

indução da lesão hepática foi descrita por Carmiel-Haggai, Cederbaum e Nieto

(2004) em ratos obesos alimentados com a dieta HL+ que desenvolveram

esteatohepatite e fibrose associada ao aumento da ALT, TGF, TNF- e marcadores

de estresse oxidativo. Estudos mostram que os AGEs, presentes na dieta HL+

95

termolizada, estão associados à inflamação e fibrose, contribuindo para a

progressão da NAFLD (SANTOS et al, 2013; PATEL et al (2012).

A menor razão AST/ALT poderia indicar menor progressão da doença

hepática no grupo HL+OP, mas este mesmo grupo apresentou maior valor de ALT.

Indivíduos com esteatose hepática podem apresentar aumento discreto ou

moderado das enzimas hepáticas AST e/ou ALT e a razão AST/ALT tende a

aumentar com o desenvolvimento de fibrose (ANGULO, 2002).

Por outro lado, não há marcadores bioquímicos específicos para a NASH e

indivíduos podem apresentar a doença hepática avançada sem alteração das

aminotransferases (GRATTAGLIANO et al, 2007). Os dados histológicos são de

suma importância para confirmação dos resultados encontrados já que o método

padrão ouro para a avaliação da progressão da doença é a biópsia hepática (CAVE

et al, 2007).

O uso da dieta HL+ termolizada resultou em maior peroxidação lipídica sérica

e hepática no grupo HL+GA. O estudo de Assis et al (2009) verificou aumento de

AGLs associado ao aumento da peroxidação lipídica no fígado dos animais que

receberam GA termolizada.

Nos grupos HL+OP e HL+OP/TCM os valores séricos não seguiram a mesma

tendência que os valores hepáticos. Verificou-se maiores valores de MDA hepático,

enquanto os valores séricos não apresentaram diferença significativa nestes grupos.

Somente o uso do óleo de TCM na dieta do grupo HL+TCM resultou em menor

peroxidação lipídica hepática, sendo que os valores séricos também não

apresentaram alteração significativa.

Os óleos utilizados neste estudo apresentam diferentes composições em AGs

que contribuem de modos distintos para a peroxidação lipídica. O aumento da

peroxidação lipídica hepática, evidenciada pelos níveis de MDA foi observado pelo

estudo de Garrel et al (2012), em animais que receberam dietas suplementadas com

EPA e DHA, sem alterações significativas nas enzimas antioxidantes. O óleo de

peixe é composto por AGPIs (EPA e DHA) e apresenta elevado IP (Tabela 1 e 2). O

estudo de Sugihara et al (1994), verificou a suscetibilidade dos AGPIs à peroxidação

lipídica em cultura de hepátocitos de ratos e revelou que a taxa de produção de

96

MDA é proporcional ao grau de insaturação: DHA> EPA> AA>-linolênico>

linoléico> oléico.

O uso dos TCMs resultou em efeito protetor no fígado de ratos com a

redução da peroxidação lipídica e aumento de antioxidantes, como a GSH, quando

utilizado na dieta do estudo de Sengupta e Ghosh (2011). A composição em AGs do

óleo de TCM apresenta grau mínimo de insaturações, pois é composto

principalmente por AGSCMs (ácidos cáprico e caprílico) (Tabelas 1 e 2).

Os relatos da literatura sobre o estresse oxidativo e sistema antioxidante em

estudos que utilizam o óleo de peixe e TCM em associação na dieta são escassos.

O estudo de Goulet et al (2010) demonstrou que em pacientes que receberam dieta

parenteral, contendo emulsão lipídica à base de óleo de oliva, óleo de peixe e TCM

não apresentaram alterações significativas nos valores séricos de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRATBs), marcadores da peroxidação lipídica.

No entanto, no presente estudo, quando o óleo de peixe e o óleo de TCM

foram utilizados em associação verificou-se efeito predominante do óleo de peixe em

promover maior peroxidação lipídica hepática.

A GSH sérica não apresentou alteração significativa. No entanto, foi

observado maior GSH hepática nos grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM. Nos

grupos HL+GA e HL+OP verificou-se menores valores de vitamina E sérica. Quando

o óleo de TCM e o óleo de peixe foram administrados em associação a vitamina E

sérica somente apresentou diferença significativa no calculo da razão vitE/colesterol,

que revelou valores significativamente menores nos grupos HL+OP/TCM, HL+GA e

HL+OP.

Nos grupos HL+GA e HL+OP/TCM, os maiores valores hepáticos de GSH

possivelmente refletem aumento da síntese do antioxidante no fígado em resposta à

maior peroxidação lipídica. O estudo de Andreoli et al (2010), descreve que o

aumento da GSH hepática não foi suficiente para neutralizar a progressão da

peroxidação lipídica induzida pela esteatose hepática. Neste mesmo estudo

verificou-se que o estresse oxidativo resultou em redução de outros antioxidantes.

A utilização preferencial da vitamina E como antioxidante foi verificada nos

grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM. Apesar de rico em vitamina E, a adição do

óleo de peixe na dieta resultou em menores valores séricos da vitamina

97

provavelmente devido ao elevado IP do óleo e à sua suscetibilidade à peroxidação

lipídica. As dietas ricas em AGPIs promovem redução da biodisponibilidade do -

tocoferol que é utilizado como antioxidante em decorrência da peroxidação lipídica

no trato gastrointestinal (VILLAVERDE et al, 2008). No presente estudo, as dietas

HL+ com óleo de peixe foram associadas à depleção de antioxidantes.

No grupo HL+TCM o valor elevado de GSH é provavelmente devido à

preservação do antioxidante em decorrência da menor peroxidação lipídica hepática.

Neste mesmo grupo, a vitamina E sérica provavelmente também foi preservada

como antioxidante. Além disso, valores maiores de vitamina E sérica podem estar

associados ao uso dos TCMs na dieta dos animais do grupo HL+TCM. O estudo de

Gallo-Torres, Ludorf e Brin (1978) demonstrou que a absorção intestinal de vitamina

E é maior quando solubilizada em TCMs. A preservação da vitamina E sérica

provavelmente contribuiu para a preservação da GSH. A GSH é utilizada na

regeneração da vitamina E por meio da redução do radical tocoferol (VALKO et al,

2007) e desta forma pode influenciar a sua concentração.

A dieta HL+ pode ter contribuído para os valores significativamente maiores de

retinol sérico encontrado nos animais dos grupos HL+GA e HL+TCM. O aumento da

absorção e transporte do retinol no enterócito associada à dieta HL+ foi observada

por Suruga et al (2005) e Goda; Yasutake; Takase (1994). A vitamina E é utilizada

preferencialmente como proteção da ação oxidativa às cadeias lipídicas e desta

forma a absorção da vitamina A é favorecida (MOURÃO et al, 2005). O retinol

esterificado é estocado no fígado e conforme a necessidade são hidrolisados e

transportados para a circulação por meio da proteína ligadora do retinol (EROGLU;

HARRISON, 2013).

Por outro lado, a redução dos valores séricos e hepáticos de retinol está

associada à progressão da NAFLD, pois resulta da ativação das células estreladas

hepáticas e progressão à fibrose (CHAVES et al, 2014). No presente estudo, os

grupos alimentados com óleo de peixe (HL+OP e HL+OP/TCM) não apresentaram

maiores valores de retinol sérico e neste sentido, poderia indicar maior progressão

da doença hepática. No entanto, a análise histológica seria necessária para

confirmar esta hipótese.

98

Conclusões

99

7. Conclusões

A dieta HL+ termolizada com 50% de lipídios administrada por um período de

60 dias foi eficiente na indução da esteatose hepática nos animais.

O uso das fontes lipídicas óleo de peixe e óleo de TCM nas proporções

utilizadas nas dietas influenciou de diferentes modos o acúmulo hepático de lipídios

e o estresse oxidativo. A adição de 25% de óleo de peixe na dieta dos animais

resultou em efeito benéfico devido aos menores valores de gordura total e TG

hepáticos, mas verificou-se acúmulo de colesterol, maior peroxidação lipídica

hepática e depleção de Vitamina E sérica. Apesar do acúmulo significativo de

gordura hepática, o óleo de TCM (25%) foi associado à prevenção do acúmulo

excessivo de TG, menor acúmulo de colesterol, à menor peroxidação lipídica

hepática e maiores valores de antioxidantes.

No entanto, quando o óleo de TCM e óleo de peixe foram utilizados em

associação na proporção de 15% e 10%, respectivamente, verificou-se efeito

negativo devido ao acúmulo de gordura hepática tanto na forma de TG quanto de

colesterol, maior peroxidação lipídica hepática e, consequentemente, maior valor de

GSH e menor de vitamina E.

As alterações séricas em relação às frações lipídicas, peroxidação lipídica e

antioxidantes não refletiram as alterações hepáticas encontradas. Portanto, as

dosagens apenas no soro podem não refletir as alterações metabólicas que ocorrem

no fígado. Os resultados encontrados no presente estudo servem de alerta para os

riscos da suplementação de fontes lipídicas associadas (óleo de peixe + óleo de

TCM), uma vez que os estudos realizados em humanos ainda são escassos.

As perspectivas de estudos futuros são avaliar as alterações metabólicas da

dieta HL+ contendo o óleo de peixe e óleo de TCM em associação com diferentes

proporções para verificar se a alteração dos percentuais na dieta poderia ter

influência no acúmulo de lipídios e estresse oxidativo hepáticos.

100

Referências

Bibliográficas

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114

Apêndice

115

Apêndice

Apêndice A - Evolução do peso semanal dos animais (g).

Apêndice A. Evolução do peso semanal dos animais (g).


Início 69±6,83 67,5±5,32 63,5±8,18 65,8±4,59 68,1±6,49

Semana 1 125,7±20,00 126,7±10,77 124,8±12,34 129,1±6,19 126,8±20,57

Semana 2 192,6±19,13 166,7±24,32 165,8±10,29 169,8±23,86 166,6±32,58

Semana 3 251,1±15,77 201,2±39,35a 211±15,33a 211,7±27,17a 202,1±40,80a

Semana 4 312,6±21,77 240,1±34,96a 252,1±30,54a 245,2±43,95a 250,5±55,10a

Semana 5 363,5±40,50 281,11±42,61a 282,56±53,87a 282,33±38,44a 285±70,32a

Semana 6 386,88±62,44 314,89±41,24 304,11±32,27a 301,22±41,25a 303,56±83,45a

Semana 7 416,29±62,32 346,33±42,12a 291,44±31,36a 266,11±34,20a,b 301,86±62,06a

Semana 8 439±83,01 379,22±48,10 325,33±37,71a 304,89±37,49a 342,43±75,37a

Semana 9 402,57±74,47 378,56±43,46 340±37,16 314,22±47,42a 336,71±86,66

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. bp<0,01 vs HL+GA. Análise estatística. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal. HL+OP e HL+TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

116

Apêndice B - Ingestão alimentar semanal dos animais (g).

Apêndice B: Ingestão alimentar semanal dos animais (g).


Início 14,77±4,78 18,2± 3,05 14,73±1,45 16,17±3,92 16,03±2,76

Semana 1 24,35±6,91 17,3 ± 3,29a 19,25±1,82a 18,93±0,91a 17,95±3,79a

Semana 2 25,55±3,22 15,83±2,62b 15,40±1,89b 15,1±3,03b 14,73±4,32b

Semana 3 25,85±3,67 15,10±3,19b 16,48±2,57b 14,78±2,74b 15,55±4,34b

Semana 4 31,78±5,53 15,25±4,70b 15,63±2,36b 14,3±2,91b 15,85±4,97b

Semana 5 35,35±9,84 15,63±3,51b 16,35±3,58

b 15,08±3,91

b 17,05±4,98

b

Semana 6 41,5±6,85 15,22±2,53b 11,58±2,29b 12,50±3,46b 13,03±6,40b

Semana 7 38,31±6,85 14,67±3,21b 10,81±5,75b 6,22±4,27b,c 9,03±6,72b

Semana 8 29,53±17,10 15,42±3,75a 16,71±7,40 14,1± 6,66a 13,22±8,81a

Semana 9 24,42±13,97 16,12±2,11 17,91±4,52 16,34±7,03 13,76±7,05

Resultados expressos em média ± DP. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs Controle. cp<0,05 vs HL+GA. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

117

Apêndice C - Ingestão de energia semanal dos animais (g).

Apêndice C: Ingestão de energia semanal dos animais (g).


Semana 1 85,23±24,18 108,13±20,57 120,31±11,39a 118,28±5,66a 112,19±23,71b

Semana 2 89,42±11,28 98,91±16,36 96,25±11,84 94,38±18,95 92,03±27,00

Semana 3 90,48±12,84 94,38±19,93 102,97±16,06 92,34±17,14 97,19±27,14

Semana 4 111,21±19,37 95,31±29,37 97,66±14,77 89,38±18,22 99,06±31,06

Semana 5 123,73±34,43 97,66±21,94 102,19±22,37 94,22±24,41 106,56±31,10

Semana 6 116,20±64,79 85,63±33,57 65,16±26,59 70,31±32,04 73,28±45,65

Semana 7 107,28±60,37 82,50±34,63 60,78±40,05 35,00±28,02a 45,16±44,05b

Semana 8 93,01±65,20 86,72±37,65 73,13±63,03 88,13±41,65 57,81±60,09

Semana 9 76,91±53,44 90,68±34,21 100,73±44,30 102,14±43,94 60,21±54,96

Resultados expressos em média ± DP. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,01 vs Controle. bp<0,05 vs Controle. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.

118

Anexo

119

Anexo

Anexo I - Certificado Comissão de Ética em Experimentação Animal.

120

Artigo Científico

121

Artigo científico

EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS DE

CADEIA MÉDIA E ÓLEO DE PEIXE NA ESTEATOSE HEPÁTICA E

ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS PELA DIETA HIPERLIPÍDICA

TERMOLIZADA EM RATOS

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO, UNIVERSIDADE DE SÃO

PAULO, RIBEIRÃO PRETO, BRASIL.

BIANCA B. DE ALMEIDA*; LAURA P. BARRETO; PAULA P. OVÍDIO*; LIVIA

M. C. S. AMBROSIO*; ALCEU A. JORDÃO**

*Mestre; **Doutor

Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo

Autor para correspondência:

Alceu A. Jordão

[email protected]

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av.

Bandeirantes, 3900, 14049-900 Ribeirão Preto, SP, Brasil. Telefone: 55 16 3602 45 64;

Fax: 55 16 3633 15 86.

Número de palavras: 6.700

Número de figuras: 2

Número de tabelas: 5

Submissão de material suplementar online: não

Running title: Effects of combined use of medium chain triglycerides and fish oil on

hepatic steatosis and oxidative stress

122

Resumo

Introdução: Os efeitos metabólicos do uso combinado dos triglicerídeos de cadeia

média (TCMs) e do óleo de peixe (OP) na esteatose hepática ainda não estão totalmente

esclarecidos. Objetivo: O presente estudo teve o objetivo de verificar os efeitos da

combinação dos TCMs e OP na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela

dieta hiperlipídica (HL+) termolizada em ratos. Material e Métodos: Foram utilizados

no total 50 ratos machos da linhagem Wistar. O grupo Controle (n=10) recebeu a dieta

controle. Os grupos HL+ receberam a dieta contendo 50% de gordura animal (GA)

termolizada e 50% de ração. A adaptação às dietas HL+ foi realizada durante 5 dias. Os

grupos HL+GA, HL

+TCM, HL

+OP e HL

+TCM/OP (n=10) receberam a dieta HL

+ com

50% de lipídios durante 30 dias. Após este período, os grupos HL+TCM, HL

+OP e

HL+OP/TCM receberam as dietas HL

+ adicionadas de óleo de TCM (OTCM), OP e

OTCM + OP, respectivamente, durante 20 dias. As análises realizadas foram a gordura

hepática total, frações lipídicas hepáticas e séricas, glicemia, vitamina E e retinol

séricos, glutationa reduzida (GSH) e malondialdeído (MDA) séricos e hepáticos, e

aminotransferases séricas. Resultados: Os grupos HL+ apresentaram acúmulo

significativo de gordura total e triglicerídeos hepáticos, exceto o HL+OP. Apenas o

grupo HL+TCM não apresentou acúmulo significativo de CT hepático (CT). Este

mesmo grupo apresentou valores maiores de CT e HDLcol séricos e menor razão

triglicerídeos/HDLcol. Os valores séricos de aminotransferases foram significativamente

maiores nos grupos que receberam os OTCM e/ou OP. A peroxidação lipídica (LPO)

hepática foi maior foi nos grupos HL+, exceto o HL

+TCM. Apenas o grupo HL

+GA

apresentou maior LPO sérica. Verificou-se que a GSH foi maior nos grupos HL+GA,

HL+TCM e HL

+OP/TCM, vitamina E sérica foi menor nos grupos HL

+GA, HL

+OP e

HL+OP/TCM e o retinol sérico foi maior nos grupos HL

+GA e HL

+TCM. Conclusões:

As alterações séricas não corresponderam às alterações hepáticas em relação aos

lipídios, estresse oxidativo e antioxidantes. O uso do óleo de TCM e óleo de peixe

associados na dieta HL+ resultou em efeito negativo devido ao maior acúmulo de

gordura hepática tanto na forma de triglicerídeos quanto de colesterol, maior

peroxidação lipídica hepática e menor valor de vitamina E sérica.

Palavras-chave: dieta hiperlipídica termolizada, esteatose hepática não

alcoólica, estresse oxidativo, óleo de peixe, óleo de TCM, ratos.

Introdução

A Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) se tornou uma das causas

mais comuns de doença hepática e a prevalência da doença vem crescendo

proporcionalmente ao aumento da ingestão de gordura saturada, obesidade e síndrome

metabólica (SM) (1).

A prevalência da NAFLD na população em geral varia de 6,3 a 33% com média

estimada em 20% e da Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é estimada em 3 a 5%. A

prevalência de cirrose em indivíduos com NASH na população em geral não é

conhecida (2).

123

Os efeitos da dieta, regulação das vias metabólicas por hormônios e fatores de

transcrição desempenham um importante papel na doença, sendo que a resistência à

insulina (RI) é considerada um fator chave no desenvolvimento da NAFLD e da NASH

(3).

O mecanismo de patogênese da NAFLD foi proposto em 1998 por Day e James

e consiste na teoria dos dois hits (4). O primeiro hit ou gatilho é dado pelo acúmulo

hepático de lipídios que predispõe à ocorrência do segundo hit (2). O segundo hit é

caracterizado pelo estresse oxidativo, peroxidação lipídica, disfunção mitocondrial e

produção de citocinas pró-inflamatórias e é responsável pela progressão à NASH, pois

contribui para a inflamação, fibrose e morte celular (5).

Atualmente, tem sido reconhecido a hepatotoxicidade dos ácidos graxos livres

(AGL) que atuam na progressão da esteatose à NASH, pois estão diretamente

associados ao aumento do estresse oxidativo, ativação das vias inflamatórias e dano ao

hepatócito (6).

A dieta rica em ácidos graxos saturados (AGSs) é associada ao aumento de

lipídios no fígado, elevação da insulina no plasma, indução da RI, alteração na função

mitocondrial e estímulo inflamatório por ativação de receptores nucleares e, portanto,

são associados à progressão á NASH (5).

O processamento térmico das gorduras resulta na produção de compostos como

os produtos da peroxidação lipídica, produtos finais de glicação e de lipoxidação

avançada (AGEs/ALEs, do inglês advanced glycation/lipoxidation end products) que

apresentam propriedades pró-oxidantes e pró-inflamatórias e atuam como fonte de

estresse oxidativo exógeno (7,8).

As dietas hiperlipídicas submetidas ao aquecimento que apresentam elevado

conteúdo de AGEs estão associados ao desenvolvimento da RI e DMT2 com sintomas

de maior proporção que as dietas hiperlipídicas sem aquecimento (9).

O tratamento da NAFLD não é descrito em um guia. As modificações do estilo

de vida baseada em hábitos alimentares saudáveis e atividade física são consideradas as

medidas mais eficazes de tratamento de pacientes com NAFLD (2).

Há evidências de que a suplementação do ômega-3 promove melhora no perfil

lipídico sérico, melhora da sensibilidade à insulina, redução da esteatose, inflamação e

dano hepático em modelos animais e humanos com NAFLD (10,11).

No entanto, estudos demonstraram que a suplementação com os AGPI-n3 está

associada ao aumento da peroxidação lipídica e redução de antioxidantes (12,13,14,15).

124

Os TCMs seriam utilizados no tratamento da NAFLD em substituição aos ácidos

graxos de cadeia longa (AGCL) na tentativa de prevenir o bloqueio da -oxidação de

AGs (16,17), pois não requerem a carnitina palmitoil transferase para o transporte

intramitocondrial (18).

No entanto, os estudos que utilizam os TCMs na dieta hiperlipídica apresentam

resultados controversos. O uso do TCM na dieta hiperlipídica resultou no favorecimento

à esteatose hepática e aumento da defesa antioxidante (19,20,21). A redução da

esteatose hepática somente foi observada com o uso dos TCMs como única fonte de

lipídios na dieta (17).

Neste sentido, a combinação dos óleos de TCM e peixe na dieta parece uma

alternativa promissora para contra balancear os efeitos negativos e positivos da

administração isolada dos TCMs e dos AGPI-n3.

A NAFLD é uma doença de alta prevalência cujo tratamento ainda não está

estabelecido. O presente estudo visa verificar os efeitos metabólicos da combinação

entre os triglicerídeos de cadeia média e óleo de peixe na busca de uma possível

alternativa para o tratamento da esteatose hepática.

Materiais e Métodos

O estudo teve aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A dieta

hiperlipídica utilizada para a indução da esteatose nos animais foi composta por 50% de

lipídios provenientes da gordura animal termolizada (aquecimento durante 30 minutos à

180°C, adaptado de Assis et al (2009) (9) e 50% da ração padrão moída. As dietas dos

grupos HL+OP e HL

+TCM continham 25% de gordura animal termolizada e 25% dos

respectivos óleos (óleo de peixe e óleo de TCM) e do grupo HL+OP/TCM continha 25%

de gordura animal termolizada, 15% de óleo de TCM e 10% de óleo de peixe. A

composição centesimal das dietas é apresentada no quadro 1.

No total, foram utilizados 50 ratos machos da linhagem Wistar com peso médio

de 60 gramas distribuídos aleatoriamente em 5 grupos. Os animais receberam água e

dieta à vontade durante 60 dias. O grupo Controle (n=10) recebeu a dieta controle

durante todo experimento. A adaptação dos animais às dietas hiperlipídicas foi realizada

durante 5 dias com o aumento gradual do conteúdo de lipídios. Os grupos HL+GA

(n=10), HL+TCM (n=10), HL

+OP (n=10) e HL

+TCM/OP (n=10) receberam as dietas

hiperlipídicas com 50% de lipídios contendo somente a gordura animal durante 30 dias.

125

Após este período, os grupos HL+TCM, HL+OP e HL

+OP/TCM receberam as dietas

hiperlipídicas com adição de óleo de TCM, óleo de peixe ou óleo de TCM + peixe

durante 20 dias. Ao fim do experimento os animais foram eutanasiados e foram

coletados o sangue, fígado e tecido adiposo epididimal e retroperitonial.

A determinação dos AGs dos óleos e gordura das dietas utilizadas foi adaptada

de Andreoli et al (2007) através da extração com hexano (22). A determinação da

gordura hepática total foi realizada de acordo com o método proposto por Bligh e Dyer,

1959 (23). As frações lipídicas de Colesterol Total (CT) e triglicerídeos (TG) foram

dosadas no fígado após a extração da gordura total por kits comerciais como utilizado

na análise em soro (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). A determinação da proteína sérica

e hepática, glicemia, HDL colesterol e aminotransferases séricas também foram

realizadas por kits comerciais (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil).

A medida da peroxidação lipídica sérica e hepática foi realizada de acordo com o

método proposto por Gerard-Monnier et al, 1998 (24), com algumas adaptações. A

dosagem de glutationa reduzida (GSH) foi realizada no tecido hepático de acordo com o

método descrito por Sedlak e Lindsay, 1968 (25). A glutationa reduzida sérica foi

dosada conforme método descrito por Costa; Dos Santos; Lima, 2006 (26). As análises

hepáticas de vitamina E (-tocoferol) e de retinol foram realizadas por HPLC, segundo

método adaptado de Arnaud et al, 1991 (27).

A taxa de eficiência da dieta (TED) foi calculada de acordo com Kang; Ahn;

Lee, 2005 (28), sendo obtido pela razão entre a média de ganho de peso e de consumo

de dieta diários. O índice de peroxibilidade (IP) da dieta foi calculado conforme

descreve Pamplona et al, 1998 (29) com base no grau de insaturação dos AGs. A razão

triglicerídeos/HDLcolesterol foi calculada como preditor da RI, conforme proposto por

Fan et al, 2011 (30). A razão vitamina E/colesterol foi calculada conforme descrito por

Ford et al, 2006 (31).

As variáveis são apresentadas como média ± desvio padrão. A comparação entre

os grupos experimentais foi realizada pela análise de variância one-way (ANOVA) com

pós-teste de Tukey, considerando p <0,05 como nível de significância.

Resultados

A composição percentual de AGs dos óleos e gordura utilizados na dieta é

apresentada no quadro 2. O óleo de peixe apresentou um elevado IP. O teor de Vitamina

126

E no óleo de peixe é elevado (107,63±1,35nmol/mL), seguido do óleo de TCM

(63,17±2,22 nmol/mL), e da gordura animal (27,07±1,72 nmol/mL).

O crescimento dos animais alimentados com as dietas hiperlipídicas foi menor a

partir da terceira semana do experimento, sendo que o grupo HL+OP apresentou menor

peso final e menor ganho de peso total. A redução da ingestão alimentar dos animais

alimentados com as dietas HL+ foi observada desde a primeira semana. A redução da

ingestão energética foi observada somente nos grupos HL+OP e HL

+OP/TCM na sétima

semana. A TED foi maior nos grupos HL+. Os dados são apresentados nas Figuras 1 e 2.

O maior peso hepático em relação ao peso corporal foi verificado somente nos

grupos HL+GA e HL

+OP. A gordura total e triglicerídeos hepáticos foi maior nos

grupos HL+, com exceção do grupo HL

+OP. Os grupos HL

+GA, HL

+OP e HL

+OP/TCM

apresentaram maior acúmulo de CT hepático. Verificou-se menores valores de proteína

total hepática nos grupos HL+GA, HL

+TCM e HL

+OP/TCM em relação ao Controle. Os

dados são apresentados na Tabela 1.

Os valores séricos de glicose, triglicerídeos e proteína não apresentaram

diferença significativa. O grupo HL+TCM apresentou maior valor de CT sérico, HDL

colesterol e menor razão triglicerídeos/HDL colesterol. A AST sérica foi maior nos

grupos HL+TCM e HL

+OP/TCM. No grupo HL

+OP verificou-se o maior valor de ALT

e menor razão AST/ALT (Tabela 2).

O grupo HL+GA apresentou maior MDA sérico em relação aos grupos HL

+TCM

e HL+OP/TCM. Os grupos que receberam as dietas hiperlipídicas apresentaram maior

peroxidação lipídica hepática em relação ao Controle, com exceção do grupo HL+TCM.

Apesar das concentrações de GSH sérico não apresentarem alterações significativas,

verificou-se maiores valores de GSH hepático nos grupos HL+GA, HL

+TCM e

HL+OP/TCM. A vitamina E sérica foi significativamente menor nos grupos HL

+GA,

HL+OP em relação ao Controle e HL

+TCM. O grupo HL

+OP/TCM somente apresentou

diferença significativa de vitamina E em relação ao grupo HL+TCM. O cálculo da

vitamina E ajustado pelo colesterol também foi significativamente menor nestes grupos,

em relação ao Controle. A concentração do retinol sérico foi significativamente maior

nos grupos HL+GA e HL

+TCM. Os dados são apresentados na Tabela 3.

Discussão

A redução da ingestão alimentar também foi observada por outros estudos em

animais que consomem dietas hiperlipídicas (32,33). As dietas HL+ apresentam elevada

127

densidade calórica e por esse motivo a redução da ingestão de dieta resultou na

manutenção da ingestão energética durante o experimento e não se verificou diferença

significativa no ganho de peso total e peso final dos animais dos grupos HL+, exceto o

grupo HL+OP. Conforme também observado por Buettner et al, 2006 (34), a redução da

ingestão alimentar no grupo HL+OP foi associada à introdução do óleo de peixe na dieta

na sétima semana do experimento, resultando em menor peso no grupo HL+OP (VS C e

HL+GA).

O aumento da gordura hepática em animais alimentados com a dieta

hiperlipídica é descrito por Picchi et al, 2011 e Leonardi et al, 2010 (35, 32). O estudo

de Luci et al, 2007 descreve a associação da ingestão de gordura submetida ao

processamento térmico e estímulo da síntese de TG e colesterol no fígado via SREBP

1c no desenvolvimento da esteatose hepática (7). No presente estudo, a dieta

hiperlipídica contendo 50% de lipídios foi eficiente em induzir a esteatose hepática, pois

os grupos HL+ apresentaram percentual de gordura hepática acima de 20 a 40%. O

acúmulo de gordura hepática que excede 5 a 10% do peso tecidual, na ausência de

consumo excessivo de álcool ou outra doença hepática, é definida como esteatose

hepática não alcoólica (36, 37). Segundo Hijona et al, 2010, a quantificação bioquímica

de gordura hepática apresenta boa relação com a classificação histológica de esteatose

hepática proposta por Kleiner e Brunt, 2005 (38,39).

A adição dos óleos de TCM e/ou peixe na dieta HL+ promoveu diferentes

alterações no acúmulo hepático de lipídios. O maior peso hepático no grupo HL+OP não

foi associado ao acúmulo significativo de gordura hepática e apenas este grupo não

apresentou menores valores de proteína hepática. Outros estudos descrevem a

hepatomegalia em animais alimentados com óleo de peixe, que pode estar associada à

indução da proliferação e aumento do volume dos peroxissomos e também à indução da

hiperplasia das células hepáticas (40,34). A adição de óleo de peixe na dieta dos animais

resultou em efeito benéfico, pois resultou em menor gordura total e triglicerídeos,

apesar do acúmulo de CT hepático. Estudos descrevem efeitos benéficos do óleo de

peixe na redução da esteatose e triglicerídeos hepáticos (41,11). O EPA e DHA

presentes no óleo de peixe são associados à redução da esteatose hepática, pois

promovem uma modulação no metabolismo de lipídios. Os AGPI n-3 estão associados à

redução da síntese hepática de triglicerídeos por inibição da SREPB-1c e aumento da

_oxidação de lipídios por ativação do PPAR-(42,43,44). O elevado conteúdo

hepático de colesterol pode ser consequência da elevada concentração no óleo de peixe.

128

O conteúdo de colesterol no óleo de peixe não está descrito na literatura, no entanto,

espera-se que o valor do colesterol no óleo seja maior que o encontrado na matéria-

prima, que varia de 68,2mg, 87mg e 142mg em 100g de peixes como atum, salmão e

sardinha, respectivamente, devido à extração da fração lipídica (45,46).

O acúmulo da gordura hepática associada ao excessivo aumento de triglicerídeos

e acúmulo do colesterol hepáticos com o uso dos TCMs foi observado em um estudo

anterior (21). No presente estudo, o maior percentual do óleo de TCM utilizado na dieta

resultou na prevenção do acúmulo excessivo de triglicerídeos e menor acúmulo de CT,

no entanto, ainda verificou-se o significativo acúmulo de gordura hepática. Segundo o

estudo de Ronis et al, 2013, os benefícios dos TCMs na redução da esteatose hepática

são proporcionais à sua concentração na dieta (47). O estudo de Lieber et al, 2008

descreve que o uso dos TCMs são benéficos na redução da esteatose quando utilizados

como única fonte de gordura na dieta ou quando a ingestão de dieta é restringida (17).

No entanto, quando os TCMs são ofertados em excesso, a _oxidação mitocondrial

ocorre extensivamente levando à elevada produção de Acetil CoA. Uma parte da Acetil

CoA produzida em excesso é substrato para a produção de AGs através da síntese de

novo (48,19). Os TCMs também podem favorecer o acúmulo hepático de lipídios

devido à menor inibição de enzimas lipogênicas, resultando em aumento da síntese e

esterificação de AGs (49,50). Além dos fatores já citados, a deficiência de AGs n-3 das

dietas contendo os TCMs também pode favorecer o acúmulo hepático de lipídios (51).

A redução do CT hepático também é descrita pelo estudo de Geelen et al, 1995, que

utiliza a dieta hiperlipídica com maior proporção de TCMs, sendo 1% de óleo de milho

e 15% de óleo de TCM (19).

Há escassez de dados que descrevem o tratamento da esteatose com o óleo de

peixe e TCM associados na dieta. O estudo de Carpentier et al, 2008 descreve a redução

da esteatose hepática após a injeção de uma mistura de lipídios (TCM e óleo de peixe na

proporção 4:1, respectivamente) em animais com deficiência de n- 3 (52). No presente

estudo, a proporção dos óleos de peixe e TCM utilizados em associação na dieta HL+

(15% de óleo de TCM e 10% de óleo de peixe) não resultou em efeitos benéficos, pois

prevaleceram os efeitos negativos observados com o uso dos óleos de forma isolada.

As alterações séricas não refletiram as alterações hepáticas encontradas. Os

valores séricos de lipídios não apresentaram alteração significativa, mas verificou-se

acúmulo hepático. Somente verificou-se efeito benéfico devido ao maior valor de HDL

colesterol e menor razão triglicerídeos/HDL com adição de óleo de TCM, somente, na

129

dieta hiperlipídica. Segundo o estudo de Fan et al, 2011 a razão triglicerídeos/HDL

colesterol pode ser utilizada como um preditor da RI, em que baixos níveis de HDL

colesterol e triglicerídeos elevados são fatores de risco para a RI (30).

Indivíduos com esteatose hepática podem apresentar um aumento discreto ou

moderado das enzimas hepáticas AST e/ou ALT e a razão AST/ALT tende a aumentar

com o desenvolvimento de fibrose (53). Estudos mostram que os AGEs, presentes na

dieta HL+ termolizada, estão associados à inflamação e fibrose, contribuindo para a

progressão da NAFLD (54,55). No presente estudo, os valores significativamente

maiores de aminotransferases, como marcadores de dano hepático, foram verificados

nos animais que receberam as dietas hiperlipídicas que continham os óleos. A menor

razão AST/ALT, poderia indicar uma menor progressão da doença hepática no grupo

HL+OP, mas o uso isolado do óleo de peixe resultou em maior ALT.

No entanto, no presente estudo, faltam dados histológicos para confirmação

destes resultados já que o método padrão ouro para a avaliação da progressão da doença

é a histologia hepática (56).

Assim como a gordura hepática, verificou-se diferentes alterações no estresse

oxidativo com o uso dos óleos de TCM e de peixe na dieta HL+. A peroxidação lipídica

sérica não refletiu a maior peroxidação lipídica hepática. Verificou-se maior MDA

hepático nos grupos HL+OP e HL

+OP/TCM enquanto os valores séricos não foram

significativamente maiores. O aumento da peroxidação lipídica hepática, evidenciada

pelos níveis de MDA foi observado pelo estudo de Garrel et al, 2012, em animais que

receberam dietas suplementadas com EPA e DHA, sem alterações significativas nas

enzimas antioxidantes (57). O uso do óleo de TCM na dieta do grupo HL+TCM resultou

em uma proteção à peroxidação lipídica hepática. O uso dos triglicerídeos de cadeia

média resultou em um efeito protetor no fígado de ratos com a redução da peroxidação

lipídica e aumento de enzimas antioxidantes, como a GSH, quando utilizado na dieta do

estudo de Sengupta e Ghosh, 2011 (58).

Os óleos utilizados neste estudo apresentam diferentes composições em AGs que

contribuem de modos distintos para a peroxidação lipídica. O óleo de peixe é composto

por ácidos graxos poli-insaturados (EPA e DHA) e apresenta elevado IP. O estudo de

Sugihara et al, 1994, verificou a suceptibilidade dos AGPIs à peroxidação lipídica em

cultura de hepátocitos de ratos e revelou que a taxa de produção de MDA é proporcional

ao grau de insaturação: DHA> EPA> AA>-linolênico> linoléico> oléico (59). A

130

composição em AGs do óleo de TCM apresentou grau mínimo de insaturações, pois é

composto principalmente por ácidos graxos saturados de cadeia média com 8 e 10

carbonos (ácidos cáprico e caprílico). Os percentuais de AGs essenciais n-6 e n-3 no

óleo de TCM são mínimos (60) e estima-se um mínimo IP, pois apresenta valores

mínimos de AGs com insaturações.

Os relatos da literatura sobre o estresse oxidativo e sistema antioxidante em

estudos que utilizam o óleo de peixe e TCM associados na dieta são escassos. No

entanto, no presente estudo, quando o óleo de peixe e o óleo de TCM foram utilizados

em associação verificou-se o efeito predominante do óleo de peixe em promover maior

peroxidação lipídica hepática.

O uso dos TCMs na dieta do grupo HL+TCM foi associado à proteção à

peroxidação lipídica, e consequente preservação do sistema antioxidante. A GSH

hepática e a vitamina E sérica apresentaram valores significativamente maiores e

provavelmente foram preservados como antioxidantes. Além disso, valores maiores de

Vitamina E sérica podem estar associados ao uso dos TCMs na dieta dos animais do

grupo HL+TCM. O estudo de Gallo-Torres, Ludorf e Brin, 1978, demonstrou que a

absorção intestinal de vitamina E é maior quando solubilizada em TCMs (61). A GSH é

utilizada na regeneração da vitamina E por meio da redução do radical tocoferol (62) e,

portanto, a preservação da vitamina E pode ter contribuído para a preservação da GSH.

Apesar de rico em vitamina E, a adição do óleo de peixe na dieta resultou em

menores valores séricos da vitamina provavelmente devido ao elevado IP do óleo e à

sua influência na peroxidação lipídica. Dietas ricas em AGPI promovem uma redução

da biodisponibilidade do -tocoferol que é utilizado como antioxidante em decorrência

da peroxidação lipídica no trato gastrointestinal (63).

A dieta hiperlipídica pode ter contribuído para valores significativamente

maiores do retinol sérico nos grupos HL+GA e HL

+TCM. O aumento da absorção e

transporte do retinol no enterócito associada à dieta hiperlipídica foi observada por

Suruga et al, 2005 e Goda; Yasutake; Takase, 1994 (64,65). A vitamina E é utilizada

preferencialmente como proteção da ação oxidativa às cadeias lipídicas e desta forma a

absorção da vitamina A é favorecida (66). Por outro lado, a redução dos níveis séricos e

hepáticos de retinol está associada à progressão da NAFLD, pois resulta da ativação das

células estreladas hepáticas e progressão à fibrose (67). No presente estudo, os grupos

alimentados com óleo de peixe (HL+OP e HL

+OP/TCM) não apresentaram maiores

valores de retinol sérico e neste sentido, poderia indicar uma maior progressão da

131

doença hepática. No entanto, a análise histológica seria necessária para confirmar esta

hipótese.

Como conclusão, o uso de diversas fontes lipídicas na dieta influenciou de

diferentes modos o acúmulo hepático de lipídios e o estresse oxidativo. A adição de

óleo de peixe na dieta dos animais resultou em efeito benéfico devido ao menor

acúmulo de gordura total e triglicerídeos hepáticos, mas verificou-se maior acúmulo de

CT e maior peroxidação lipídica hepática. Apesar do acúmulo significativo de gordura

hepática, o óleo de TCM foi associado à prevenção do acúmulo excessivo de

triglicerídeos, ao menor acúmulo de colesterol e à menor peroxidação lipídica hepática.

O uso do óleo de TCM e óleo de peixe em associação resultou em efeito negativo

devido ao acúmulo de gordura hepática tanto na forma de triglicerídeos quanto de

colesterol e à maior peroxidação lipídica hepática. As alterações séricas em relação às

frações lipídicas, peroxidação lipídica e antioxidantes não refletiram as alterações

hepáticas encontradas e, portanto, as dosagens apenas no soro podem não representar as

alterações metabólicas que ocorrem no fígado. Os resultados encontrados no presente

estudo servem de alerta para os riscos da suplementação destas fontes lipídicas

associadas (óleo de peixe + óleo de TCM), já que os estudos realizados em humanos

ainda são escassos.

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137

Quadro 1. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%)

Nutriente (%) Controle HL+GA HL

+TCM HL

+OP HL

+OP/TCM

Proteína (%) 22 11 11 11 11

Carboidrato (%) 57 28,5 28,5 28,5 28,5

Lipídeo (%) 4 52 52 52 52

Valor calórico (Kcal)* 350 625 625 625 625

Energia lipídios (%)* 10,3 74,9 74,9 74,9 74,9

FREITAS, 2011 (68). *O Fator de Atwater de 9Kcal/g foi utilizado para o cálculo de energia dos óleos e gordura animal utilizados na dieta (ZOU et al, 2007) (69).

138

Quadro 2. Composição percentual em ácidos graxos dos óleos de peixe,

TCM e gordura animal (%) e índice de peroxibilidade (IP).

Ácido Graxo Estrutura

Óleos Gordura*

Animal Peixe TCM

Ácidos graxos saturados

Ácido caprílico C8:0 <0,05 52,02 <0,05

Ácido cáprico C10:0 <0,05 35 <0,05

Ácido mirístico C14:0 7,31 12,78 1,4

Ácido palmítico C16:0 22,28 <0,05 24,53

Ácido esteárico C18:0 4,81 <0,05 10,07

Ácido tricosanóico C23:0 0,75 <0,05 <0,05

∑AGS

35,15 99,8 36

Ácidos graxos monoinsaturados

Ácido palmitoléico C16:1 7,54 <0,05 2,39

Ácido oléico C18:1n9c 10,36 <0,05 43,23

Ácido erúcico C22:1n9 1,42 <0,05 <0,05

∑AGMI

19,32 - 45,61

Ácidos graxos poli-insaturados

Ácidos graxos n-6

Ácido linoléico C18:2n6c 11,31 <0,05 16,54

Ácido Di-homo-linolênico C20:3n6

<0,05 0,53

Ácido araquidônico C20:4n6 0,46 <0,05 <0,05

∑n-6

11,77 - 17,07

Ácidos graxos n-3

Ácido α-linolênico C18:3n3 1,91 <0,05 <0,05

Ácido eicosatrienóico C20:3n3 0,22 <0,05 <0,05

Ácido eicosapentaenóico C20:5n3 15,05 <0,05 <0,05

Ácido docosahexaenóico C22:6n-3 12,6 <0,05 <0,05

∑n-3

29,78 - <0,05

∑AGPI

41,55 - 17,07

Razão n-6/n-3

0,4 - -

Razão ∑AGS/∑AGPI

0,85 - 2,03

Outros ácidos graxos 4,2 0,2 1,32

IP

208,99 - 18,74**

*Perfil de AGs da gordura animal sem tratamento térmico. **Índice de

peroxibilidade da gordura animal sem tratamento térmico. IP = (%

monoenóicos x 0,025) + (% dienóicos x 1) + (% trienóicos x 2) + (%

tetraenóicos x 4) + (pentaenóicos x 6) + (hexaenóico x 8). Devido à presença

de quantidades mínimas de AGs com insaturações não foi possível realizar o

cálculo do índice de peroxibilidade do óleo de TCM. ∑: somatória; AGS:

AGs saturados; AGMI: AGs monoinsaturados; AGPI: AGs poli-insaturados;

n-3: AGs ômega-3; n-6: AGs ômega-6.

Figura 1. A: Evolução semanal do peso dos animais (g): ap<0,05 vs Controle. bp<0,01 vs HL+GA. B: Ingestão alimentar

semanal dos animais (g): ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs Controle. cp<0,05 vs HL+GA. C:Ingestão energética semanal dos

animais (Kcal):ap<0,001 vs HL

+OP.

bp<0,01 vs HL

+TCM.

cp<0,05 vs HL

+OP/TCM.

Controle: Dieta Controle. HL+GA:

50% GA. HL+OP e HL+TCM: 25% GA e 25% OP ou TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.

Figura 2. Taxa de eficiência da dieta (TED) em propiciar o ganho de peso. Barras largas verticais representam a média, barras finas representam os desvios-padrões. ap<0,001 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta

HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL

+GA 50% - 30 dias. Semana 6:

Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos -

20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: 50% GA. HL

+OP e HL

+TCM: 25% GA e

25% OP ou TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.

141

Tabela 1. Peso hepático, razão peso hepático/corporal, caracterização de gordura hepática pelos valores de gordura total e valor percentual de gordura hepática, valores de colesterol total e triglicerídeos hepáticos.

Controle HL+GA HL

+TCM HL

+OP HL

+OP/TCM

Peso hepático (g) 9,41±1,99 14,05±3,22a,b

10,25±1,93 11,05±2,54 10,25±2,26

Razão peso hepático/corporal (%) 2,33±0,11 3,76±0,50c 3,08±0,59 3,53±0,46

c 3,29±0,94

Gordura total hepática (g gordura/g tecido) 0,05±0,01 0,21±0,06c,d

0,16±0,04c 0,11±0,04 1,17±0,06

c

Percentual de gordura hepática (%) 9,90±1,71 40,85±14,19c,d

31,38±8,46c 21,63±6,54 32,70±14,08

c

Colesterol total hepático (g/g tecido) 2,72±0,17 5,36±1,96a 3,49±0,66 5,38±2,47

a 5,28±1,52

a

Triglicerídeos hepático (g/g tecido) 3,36±1,65 74,42±29,93c,b

64,85±39,67c 36,91±15,93 68,52±29,13

c

Proteína total hepática (g/mL) 0,023±0,005 0,019±0,002a 0,018±0,003

a 0,021±0,004 0,017±0,002

a

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle.

bp<0,05 vs HL

+TCM e HL

+OP/TCM.

cp<0,001 vs Controle.

dp<0,001 vs HL

+OP. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL

+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta

Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento

óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: 50% GA. HL

+OP e HL

+TCM: 25% GA e 25% OP ou TCM, respectivamente.

HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.

142

Tabela 2. Valores séricos de glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de alta densidade, razão

triglicerídeos/HDLcolesterol, concentrações médias séricas de aspartato aminotransferase e alanina

aminotransferase apresentadas pelos grupos e razão AST/ALT e concentrações médias séricas de proteína.

Controle HL+GA HL

+TCM HL

+OP HL

+OP/TCM

Glicose (mg/dL) 75,78±8,25 89,31±17,97 70,66±17,30 87,62±21,67 81,37±7,48

Triglicerídeos (mg/dL) 61,03±11,00 80,26±19,31 69,94±8,87 82,85±21,09 92,6±54,89

Colesterol total (mg/dL) 67,35±18,81 81,26±11,20 114,80±22,50a 82,07±17,88 67,43±26,13

HDL colesterol (mg/dL) 45,44±8,77 51,46±9,06 64,90±11,62b 57,62±12,43 44,65±8,68

Razão triglicerídeos/HDLcolesterol 1,56±0,36 1,56±0,29 1,06±0,19c 1,53±0,51 2,10±1,05

Proteína total sérica (g/mL) 0,079±0,011 0,074±0,010 0,075±0,004 0,075±0,008 0,077±0,009

AST (U/L) 77,8±18,88 66,00±8,72 85,48±12,76d 83,18±9,49 88,06±14,22

d

ALT (U/L) 30,57±18,17 24,50±6,09 30,21±5,69 43,53±9,16e 34,57±4,07

AST/ALT 2,42±1,18 2,84±0,99 2,91±0,71 1,90±0,65f 2,40±0,59

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle, HL

+GA, HL

+OP e HL

+OP/TCM.

bp<0,001 vs

Controle e HL+OP/TCM.

cp<0,01 vs HL

+OP/TCM.

dp<0,05 vs HL

+GA.

ep<0,05 HL

+GA e HL

+TCM.

fp<0,05

HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL

+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta

Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7:

Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: 50% GA. HL

+OP e HL

+TCM: 25% GA e

25% OP ou TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.

143

Tabela 3. Componentes do sistema antioxidante, valores de glutationa reduzida e malondialdeído (MDA) séricos e hepáticos, vitamina E e retinol séricos e razão vitamina E/colesterol.

Controle HL+GA HL

+TCM HL

+OP HL

+OP/TCM

GSH sérico (mol/g proteína) 4,03±1,44 5,7±1,69 5,38±1,54 5,23±1,54 3,69±1,39

GSH hepático (µmol/g proteína) 395,32±90,42 553,59±81,42a 532,51±79,21

a 448,91±94,52 524,82±73,08

a

Vitamina E sérico (µmol/L) 5,24±2,04 1,77±0,70a,b

8,39±3,73 0,67±0,20a,b

2,09±1,84b

Razão vitamina E/colesterol (mol/mg) 0,79±0,16 0,17±0,13c 0,77±0,36 0,08±0,02

c 0,24±0,15

c

Retinol sérico (µmol/L) 0,36±0,08 0,96±0,41a 0,86±0,31

a 0,79±0,32 0,80±0,42

MDA sérico (nmol/g proteína) 85,80±24,16 104,23±29,19d 65,29±6,28 86,70±23,01 59,36±14,95

MDA hepático (mol/g proteína) 11,46±1,83 50,92±20,12e 16,66±9,07

f 64,05±20,11

e 54,23±8,75

e

Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle.

bp<0,001 vs HL

+TCM.

cp<0,001 vs Controle e HL

+TCM.

dp<0,05

vs HL+TCM e HL

+OP/TCM.

ep<0,001 vs Controle.

fp<0,001 vs HL

+GA, HL

+OP e HL

+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3

dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL

+GA 50% - 30 dias. Semana 6:

Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle.

HL+GA: 50% GA. HL

+OP e HL

+TCM: 25% GA e 25% OP ou TCM, respectivamente. HL

+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e

15% TCM. MDA: Malondialdeído.

EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS DE ... · de TCM e óleo de peixe em...

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