EFEITOS DO EXTRATO DE Allium cepa L E S-METILCISTEÍNA NA ...
52
VALÉRIA MILENA DANTAS DE CASTRO EFEITOS DO EXTRATO DE Allium cepa L. E S-METILCISTEÍNA NA MORFOLOGIA DO DUODENO DE RATOS COM DIABETES INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal-RN 2019
Transcript of EFEITOS DO EXTRATO DE Allium cepa L E S-METILCISTEÍNA NA ...
VALÉRIA MILENA DANTAS DE CASTRO
EFEITOS DO EXTRATO DE Allium cepa L. E S-METILCISTEÍNA NA MORFOLOGIA
DO DUODENO DE RATOS COM DIABETES INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Biologia
Estrutural e Funcional da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte.
Natal-RN
2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
EFEITOS DO EXTRATO DE Allium cepa L. E S-METILCISTEÍNA NA MORFOLOGIA
DO DUODENO DE RATOS COM DIABETES INDUZIDOS POR ESTREPTOZOTOCINA
ORIENTADOR
Naisandra Bezerra da Silva Farias
CO-ORIENTADOR
Fernando Vagner Lobo Ladd
Natal-RN
2019
DEDICATÓRIA
A minha mãe Lúcia por ser meu porto seguro
e pelo seu amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente a Deus por ter propiciado essa oportunidade de conhecimento
e por me fortalecer em todos os momentos difíceis.
A minha família, especialmente minha mãe Maria Lúcia, minha vó Olindina, minha
irmã Franciele e seu esposo Silvio por todo apoio durante essa jornada.
Ao meu esposo Valdeir pela compreensão nos momentos de minha ausência e pelo
suporte durante todo este percurso.
Ao meu primo João e sua esposa Márcia por terem me acolhido em sua residência no
início do mestrado, foi de fundamental importância.
A minha madrinha Alba pela força e incentivo nos estudos.
Ao Departamento de Morfologia/UFRN e ao Programa de Pós-graduação em Biologia
Estrutural e Funcional pelo fornecimento de toda infraestrutura necessária para realização dessa
pesquisa.
Ao grupo de pesquisa diabetes experimental do Departamento de Morfologia da UFRN
pelas contribuições na execução deste trabalho e pelas contribuições intelectuais, em especial a
Lycianne e o Prof. Bento Abreu.
A minha orientadora Naisandra por ter me apresentado o mundo cientifico e por ter me
guiado neste período de muito aprendizado, repassando seus conhecimentos com sabedoria e
amor.
Ao meu coorientador Fernando Ladd pela contribuição enriquecedora na metodologia
deste trabalho.
A equipe técnica do laboratório de técnicas histológicas pelo suporte no processamento
das amostras, Socorro, Sara, Melyna e Hudson.
Aos colegas de turma de mestrado que se tornaram amigos Elayne, Marielly, Raíssa e
Silvano por proporcionar momentos de descontração durante essa árdua jornada.
A minha amiga Janiely Cruz que mesmo distante sempre se fez presente emanando sua
força positiva.
A todos que contribuíram de forma direta ou indireta na realização deste sonho, minha
eterna gratidão.
“A persistência é o caminho do êxito”
Charles Chaplin
RESUMO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma epidemia mundial com estimativa de aumento para as
próximas décadas. É uma desordem metabólica que pode ocorrer de diferentes formas, sendo o
DM1 o foco deste estudo. Caracterizada por ser uma doença autoimune desencadeada pela
destruição autoimune das células β pancreáticas com consequente déficit de insulina. A
hiperglicemia gerada pela falta deste hormônio leva a hiperglicemia que por sua vez acarreta
diversos danos para tecidos e órgãos, comprometendo a qualidade de vida do paciente. Tendo
em vista está problemática, objetiva-se com esse estudo avaliar os possíveis efeitos atenuantes
ou reversores do extrato de Allium cepa l e S-metilcisteína nas alterações morfológicas
duodenais decorrentes do DM1. Para isto foram utilizados 35 ratos machos Wistars, com idade
de 90 dias e pesando entre 250 a 300 g. A amostra foi dividida em quatro grupos: C (controle),
D (diabético sem tratamento), DSM (diabético tratado com S-metilcisteína) e DAC (diabético
tratado com extrato de Allium cepa L). O período experimental durou trinta dias. Após isso foi
realizada a eutanásia para retirada das amostras. Estas foram fixadas em paraformoldeído 4%
para seguir o processamento histológico de rotina com coloração em HE e subsequente análises
morfométricas e estereológicas para se determinar o volume duodenal pelo princípio de
Cavalieri, proporção ocupada pelas camadas do duodeno pelo princípio de Delesse, e o volume
absoluto. Também foi realizada a coleta do sangue para analisar a glicemia e o perfil de
citocinas pro-inflamatórias (IL-1B e IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) presentes no soro. Os
tratamentos utilizados reduziram a glicemia, polidipsia e polifagia nos grupos DSM, DAC
comparado ao grupo D, no entanto não foi benéfico na perda de peso. Quanto ao aumento do
volume de referência de parede, densidade de volume por subcamada e valor absoluto do
duodeno nos grupos diabéticos, o S-metilcisteína teve melhor efeito reduzindo os danos
causados pelo DM1. Já na análise de citocinas o extrato teve uma redução não significativa das
citocinas pro-inflamatórias IL-1B e IL-6, enquanto que o s-metilcisteína reforçou a atividade
anti-inflamatória da IL-10. A partir dos resultados conclui-se que os tratamentos foram capazes
de reduzir a glicemia, polidipsia, polifagia e reverter em parte as alterações morfológicas,
relacionadas principalmente a mucosa e submucosa, e atuar positivamente no perfil de citocinas
IL10 presentes no soro. Com isso pode se concluir que a intervenção terapêutica com Allium
cepa L e principalmente com o S-metilcisteína pode funcionar como uma alternativa ou
coadjuvante no tratamento do diabetes tendo benefícios tanto a nível pré-clínico como a nível
tecidual duodenal.
Palavras chave: Diabetes Mellitus tipo 1, produtos naturais, estereologia, citocinas, duodeno.
ABSTRACT
Diabetes Mellitus (DM) is a worldwide epidemic with an estimated increase for the coming
decades. It is a metabolic disorder that can occur in different ways, with DM1 being the focus
of this study. Characterized as being an autoimmune disease triggered by the autoimmune
destruction of pancreatic β cells with consequent insulin deficit. The hyperglycemia generated
by the lack of this hormone leads to hyperglycemia that in turn causes several damages to tissues
and organs, compromising the quality of life of the patient. In view of this problem, the
objective of this study is to evaluate the possible attenuating or reversing effects of the extract
of Allium cepa 1 and S-methylcysteine on the duodenal morphological alterations due to DM1.
For this purpose 35 male Wistars rats, aged 90 days and weighing between 250 and 300 g were
used. The sample was divided into four groups: C (control), D (diabetic without treatment),
DSM (diabetic treated with S-methylcysteine) and DAC (diabetic treated with Allium cepa L
extract). The experimental period lasted thirty days. After that, euthanasia was performed to
remove the samples. These were fixed in 4% paraformoldehyde to follow routine histological
processing with HE staining and subsequent morphometric and stereological analyzes to
determine the duodenal volume by the Cavalieri principle, the proportion occupied by the layers
of the duodenum by the Delesse principle, and the absolute volume. Blood collection was also
performed to analyze glycemia and the profile of pro-inflammatory (IL-1B and IL-6) and anti-
inflammatory (IL-10) cytokines present in serum. The treatments used reduced blood glucose,
polydipsia and polyphagia in the DSM and CAD groups compared to group D, but it was not
beneficial in weight loss. As for the increase in wall reference volume, volume density per
sublayer and absolute value of the duodenum in the diabetic groups, S-methylcysteine had a
better effect reducing the damage caused by DM1. In the cytokine analysis the extract had a
non-significant reduction of the pro-inflammatory cytokines IL-1B and IL-6, whereas s-
methylcysteine reinforced the anti-inflammatory activity of IL-10. From the results, it was
concluded that the treatments were able to reduce glycemia, polydipsia, polyphagia and
partially reverse the morphological alterations, mainly related to the mucosa and submucosa,
and to act positively on the IL10 cytokine profile present in the serum. Thus, it can be concluded
that the therapeutic intervention with Allium cepa L and mainly with S-methylcysteine can
function as an alternative or adjuvant in the treatment of diabetes having benefits both pre-
clinical and duodenal tissue level.
Key words: Diabetes Mellitus type 1, natural products, stereology, cytokines, duodenum.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Taxonomia e representação do Allium cepa L. (cebola). ........................................ 18
Figura 2- Representação gráfica do aminoácido S-metilcisteina. Imagem bidimensional (A);
Imagem tridimensional (B). ...................................................................................................... 20
Figura 3- Representação da distribuição dos animais nos grupos experimentais ................... 23
Figura 4 Esquema da produção do extrato metanólico de Allium cepa l. ............................... 24
Figura 5-Etapas do período experimental incluindo o tempo de ambientação, indução do
DM1, intervenção terapêutica (Allium cepa L e S-metilcisteína) e eutanásia. ........................ 25
Figura 6-Amostragem Uniforme Sistemática e Aleatória ou SURS (BROWN, 2017). ......... 27
Figura 7 Secções transversais do duodeno coradas em HE. .................................................... 31
Figura 8 Volume de referência de parede, lúmen e volume total do duodeno em mm3 dos
grupos ....................................................................................................................................... 32
Figura 9- Densidade de volume (Vv) segundo o princípio de Delesse ................................... 33
Figura 10: Gráfico representando o volume absoluto da mucosa, submucosa e muscular
respectivamente em (mm3). ..................................................................................................... 34
Figura 11- – Dados de citocinas presentes no soro dos grupos experimentais. ...................... 35
Tabela 1- Dados pré-clínicos.. ................................................................................................. 30
LISTA DE ABREVIATURAS
AGEs- Produtos finais de glicação avançada
DM- Diabetes Mellitus
DM1- Diabetes Mellitus tipo 1
DM2- Diabetes mellitus tipo 2
GLUT-4 – Transportador de glicose
HE- Hematoxilina -eosina
IL-10- Interleucina 10
IL-1β- Interleucina 1β
IL-6- Interleucina 6
STZ- Estreptozotocina
SURS- Amostragem aleatória uniforme e sistemática
Vref- Volume de referencia
Vtot- Volume total
Vv- Densidade de volume
β- Beta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 13
1.1 DIABETES MELLITUS ....................................................................................................... 13
1.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO DUODENO ............................................................... 15
1.3 ALTERAÇÕES INTESTINAIS DECORRENTES DO DIABETES MELLITUS .............. 16
1.4 DIABETES MELLITUS E A UTILIZAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS ..................... 17
1.4.1 ALLIUM CEPA L ...................................................................................................................... 18
1.4.2 S-METILCISTEÍNA .................................................................................................................. 19
1.5 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA .............................................................................................. 20
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 22
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 22
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 22
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 23
3.1 MATERIAIS ............................................................................................................................... 23
3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ............................................................................................. 25
3.3 PARÂMETROS PRÉ-CLÍNICOS .............................................................................................. 26
3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO ....................................................................................... 26
3.5 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA .................................................................................................. 28
3.5.1 VOLUME DE REFERÊNCIA (CAVALIERI) ................................................................................ 28
3.5.2 DENSIDADE DE VOLUME (DELESSE) ..................................................................................... 28
3.5.3 VOLUME ABSOLUTO ............................................................................................................. 28
3.6 PERFIL DE CITOCINAS ........................................................................................................... 29
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................................................... 29
4 RESULTADOS ....................................................................................................................... 30
4.1 DADOS PRÉ-CLÍNICOS ........................................................................................................... 30
4. 2 ANÁLISE QUALITATIVA HISTOLOGICA ........................................................................... 31
4.3 ESTEREOLOGIA ....................................................................................................................... 31
4.3.1 VOLUME DE REFERÊNCIA (CAVALIERI) ................................................................................ 32
4.3.2 DENSIDADE DE VOLUME (DELESSE) .................................................................................... 32
4.3.3 VOLUME ABSOLUTO ............................................................................................................. 33
4.4 CITOCINAS ............................................................................................................................ 34
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 36
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 41
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 42
ANEXO A- APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA ......................................................... 51
ANEXO B – TABELA DE NUMEROS ALEATÓRIOS ....................................................... 52
13
1 INTRODUÇÃO
Estimativas mundiais vêm mostrando que o número de pessoas com Diabetes Mellitus
(DM) tende a aumentar nos próximos anos (FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DE
DIABETES, 2017). Já é sabido que a longo prazo está desordem leva ao desenvolvimento de
diversas complicações em órgãos e tecidos (MACHADO et al., 2017; SBD, 2017). O DM é um
problema de saúde pública tendo em vista a forma como a qual afeta a vida dos pacientes bem
como a necessidade de altos investimentos destinados todos os anos para tratamento da mesma.
Dentre os sistemas orgânicos afetados por esta doença o trato gastrointestinal é
prejudicado desde a região oral até a região retal. Tais alterações são tanto a nível morfológico
quanto a nível funcional (WOLOSIN et al., 2000; SHAKIL et al., 2008; KRISHANAN et al.,
2013). Alguns estudos fazem uma associação entre intestino delgado e DM pressupondo que
esta doença esteja relacionada a desordens intestinais onde a conexão entre disbiose e
inflamação contribui para o desenvolvimento do quadro de DM (SANIAL, 2013).
Diante disso a escolha do duodeno como objeto de estudo se baseia pela sua importância
funcional para o organismo. Tendo em vista a gravidade desta desordem metabólica e levando
em consideração os danos e complicações associadas é importante a busca por terapias
alternativas ou coadjuvantes para a mesma. A utilização de produtos naturais a base de plantas
para este fim é uma excelente escolha pelo fato de que o risco de efeitos colaterais é reduzido.
Além disso a cebola- Allium cepa l é bem conhecida e bastante consumida na culinária mundial.
O Allium cepa L é uma planta rica em organosulfurados como o S-metilcisteína que
confere a esta planta propriedades hipoglicemiantes. Seu potencial na redução da glicemia
sanguínea já foi demostrado (AKASH et al., 2014). Sendo assim objetiva-se que neste trabalho
os tratamentos com o extrato de Allium cepa l e seu aminoácido S-metilcisteína possam além
de atuar na redução da glicemia também atenuar ou reverter as alterações morfológicas
causadas no duodeno pelo DM1.
1.1 DIABETES MELLITUS
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença crônica onde o organismo não produz ou não
consegue utilizar de forma adequada a insulina. Este mal pode se manifestar de diferentes
14
formas como o Diabetes Mellitus Tipo I (DM1), Diabetes Mellitus tipo II (DM2) e Diabetes
Gestacional, sendo o DM1 foco deste estudo. O DM1 é uma desordem heterogênea que na
maioria das vezes ocorre entre a infância e adolescência, sendo caracterizada pela destruição
autoimune das células beta (β) pancreáticas com consequentemente déficit na produção de
insulina (SBD, 2017; ALMAHFOODH et al., 2017).
O DM é considerado uma epidemia mundial com variações de incidência, onde os países
em desenvolvimento são os mais afetados, possivelmente devido ao estilo de vida adotado pela
população (SBD, 2014-2015). Estimativas mundiais mostram que no ano de 2017 cerca de 425
milhões de pessoas viviam com diabetes e que em 2045 esse número possa chegar a 629 milhões
de pessoas, um aumento de 48% de casos (FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DE
DIABETES, 2017).
Dentre os tipos de DM, o DM2 é mais prevalente, porém o DM1 no Brasil vem
aumentando, afetando principalmente crianças e adolescentes. Os casos de DM1 compreendem
cerca de 5 a 10% de todos os casos do diabetes em todo o mundo (MAAHS et al., 2010; SBD,
2014-2015;). Esse aumento se dá pela contribuição de diversos fatores como influencia
ambiental, genética, idade, peso ao nascer e microbiota intestinal (MANUWALD et al., 2017).
O DM é uma doença sistêmica que afeta a saúde do indivíduo em vários aspectos, desde
o nível de organização celular até o nível sistêmico. Tal desordem prejudica a qualidade de
vida do paciente levando em consideração as esferas do bem-estar físico, emocional e social
(NANSEL et al., 2008). Além disso alterações hormonais, imaturidade e resistência na
aceitação da doença são fatores comuns aos adolescentes com DM1 o que dificulta o controle
da glicose sanguínea, maximizando os danos que o DM1 traz para os pacientes (COSTA e
VIEIRA, 2015).
As alterações metabólicas decorrentes do DM, a longo prazo, podem levar a uma
variedade de complicações em órgãos e tecidos causando retinopatia, neuropatia periférica,
problemas circulatórios, secura na pele dentre outros já relatados na literatura (MACHADO et
al., 2017; SBD, 2017). No trato gastrointestinal, alguns estudos mostram anormalidades na
absorção de nutrientes, mudanças de microbiota e inflamação (KNIP e SILJANDER, 2016;
VELLA e CAMILLERI, 2017; LEE. et al., 2017; WEN e DUFFY, 2017).
A presença de inflamação de baixo grau mediada pelo estresse oxidativo nessa
desordem tem um papel central nessa doença. Citocinas com atividade pro inflamatória como
IL-1β e 1l-6 tem seus níveis aumentados no DM (UGOCHUKWU e FIGGERS, 2007). Se
15
tratando do DM1 este por sua vez é predominantemente uma doença inflamatória, em que
ocorre a destruição das células produtoras de insulina via reação autoimune mediado por
citocinas. A hiperglicemia propiciada por esta reação estimula o aumento de citocinas pro
inflamatórias no sangue através de mecanismos oxidativos (AROKOYO et al., 2018). Tal
inflamação causada pelo DM é sistêmica podendo levar a danos em diversos órgãos como
pulmão, coração, fígado e intestino (LIU et al., 2015).
1.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO DUODENO
O duodeno é a parte proximal e mais larga do intestino delgado. Iniciando no piloro do
estômago, o duodeno termina na junção duodenojejunal1. Suas principais funções é transporte,
digestão e absorção de nutrientes (ZHÃO et al., 2002).
Conforme descrito por Tortora e Derrickson, (2016) em termos de organização tecidual
o duodeno é composto por quatro camadas:
Túnica mucosa: ou revestimento interno, composta por uma 1º camada de epitélio
cúbico com microvilosidades que estar em contato direto com o conteúdo luminal, 2º uma
camada de tecido conjunto (lâmina própria), e 3º uma fina camada de musculo liso;
Tela submucosa: consiste de tecido conjuntivo areolar que liga a mucosa à muscular.
Esta camada é bastante vascularizada e recebe moléculas de alimentos absorvidos. Há a
presença de uma rede de neurônios denominada de plexo submucoso;
Túnica muscular: consiste de tecido muscular liso, que se organiza em duas lâminas:
uma camada interna de fibras circulares e uma camada externa de fibras longitudinais. As
contrações involuntárias deste tecido contribuem para fragmentar alimentos e mistura-los em
secreções. Nesta camada também há a presenta de um plexo de neurônios- plexo mioenterico;
Túnica serosa: estar suspensa na cavidade abdominal. É uma membrana composta de
tecido conjuntivo e epitélio pavimentoso simples (mesotélio). Também denominada de
peritônio visceral.
O intestino como um todo sofre diversas alterações morfológicas na vida pós-natal. As
alterações morfológicas ocorrem na mucosa intestinal sob diferentes condições fisiológicas e
patológicas, tais danos vêm sendo estudadas utilizando roedores como modelo experimental
1 Altas. Disponível em: <https://www.proteinatlas.org/learn/dictionary/normal/duodenum+1> Acesso em
18/03/2019.
16
(VIGUEIRAS et al., 1999). No DM diversas alterações que afetam a morfologia do intestino
delgado (duodeno) já foram descritas, estas estão relatadas a seguir.
1.3 ALTERAÇÕES INTESTINAIS DECORRENTES DO DIABETES MELLITUS
No trato gastrointestinal o DM pode causar danos desde a cavidade oral até a região
anorretal. E essas complicações incluem sintomas de disfagia, saciedade precoce, refluxo, dor
abdominal, náuseas, vômitos, gastroparesia (retenção gástrica), disfunções colorretais e
intestinais (como peristaltismo anormal que resulta em constipação ou incontinência fecal)
(WOLOSIN et al., 2000; SHAKIL et al., 2008; KRISHANAN et al., 2013).
Tais anormalidades têm sido vistas tanto em roedores quanto em pacientes portadores
do DM1. Além desses sintomas já evidenciados, alguns estudos vêm mostrando alterações a
nível morfológico que ocorrem no trato gastrointestinal no contexto de DM1 (PELLEGRINI et
al., 2017).
Dentre essas alterações morfológicas no DM está o aumento da área de superfície de
absorção e aumento no número de células caliciformes por vilos (DIANI et al., 1976). Quanto
a função sensorial motora, esta também é prejudicada em todo o trato gastrointestinal em
pacientes com diabetes (ZHAO et al., 2006). p
Complicações morfométricas e biomecânicas por todo o intestino delgado associadas a
hiperglicemia foram visualizadas, havendo uma menor abertura do lúmen no duodeno e maior
no jejuno e íleo em animais diabéticos comparados com animais saudáveis (SHA et al., 2006).
Mudanças nas propriedades e na espessura tecidual também já foram relatadas gerando
deformidades intestinais (ZHÃO et al., 2017)
Somado a esses danos morfológicos, a presença de inflamação crônica no intestino
delgado de ratos com DM2 já foi observada histologicamente com a presença de infiltrado de
linfócitos na mucosa intestinal, bem como em biopsias duodenais de humanos onde há a
presença de macrófagos e positividade para marcação de genes VEGF e TNF-α mostrando
também um perfil inflamatório ((LOU et., 2014; PELLEGRINI et al., 2017).
Diversas alterações morfológicas relacionadas ao DM vêm sendo atribuída a vias
bioquímicas de estresse oxidativo (BHOR et al., 2004). Dentre essas vias a produção aumentada
de Produtos Finais de Glicação Avançada (AGE) ganhou destaque (CHEN et al., 2012). Sendo
17
estes produtos resultantes de reações aminocarbonilo de natureza não-enzimática, que ocorrem
aceleradamente no estado hiperglicêmico do diabetes. Essas moléculas são consideradas
potenciais mediadores patogênicos das complicações diabéticas, sendo capazes de modificar,
as propriedades químicas e funcionais das mais diversas estruturas biológicas (BARBOSA et
al., 2008).
1.4 DIABETES MELLITUS E A UTILIZAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS
O emprego de plantas medicinais no tratamento de doenças ocorre desde muito tempo.
As civilizações antigas já conheciam o potencial terapêutico das plantas e as cultivavam,
repassando o conhecimento de geração a geração. Com o surgimento da medicina estes saberes
foram desvalorizados, porém atualmente a ciência e as políticas de saúde têm buscado
restabelecer esta relação entre a população e a utilização de plantas medicinais. Uma medida
importante para isso é a implantação pelo Ministério da Saúde de uma Política Nacional de
Plantas Medicinais e Fitoterápicos (FEIJÓ et al., 2012).
Muitas experiências com o uso de vegetais para o tratamento do diabetes têm sido
realizadas. Várias plantas medicinais e suas preparações foram apontadas por atuar em pontos
importantes do metabolismo glicídico. Grande parte destes mecanismos de ação incluem a
inibição da α-glucosidase e da formação de AGEs, o aumento da expressão de GLUT-4 e
atividade antioxidante (GOVERNA et al., 2018). Sendo os AGEs implicados nas complicações
associadas ao diabetes (CHEN et al., 2012).
Variadas espécies de plantas têm sido utilizadas experimentalmente como medida
terapêutica dos sintomas da DM. Essas plantas representam mais de 725 gêneros em 183
famílias, estendendo-se a algas marinhas e fungos. A maioria desses vegetais utilizados como
antidiabéticos ao serem avaliados apresentam atividade hipoglicemiante e constituintes que
podem ser utilizados como modelos para novos agentes hipoglicemiantes (NEGRI, 2005).
Dentre as diversas plantas utilizadas no Brasil com propriedades anti-diabéticas está a
Cebola - Allium cepa l utilizada neste estudo (SANTOS et al., 2012). As propriedades bioativas
desses vegetais atuam de diferentes maneiras no DM, estimulando a secreção de insulina,
inibindo a degradação de insulina, reduzindo a resistência à insulina como também prevenindo
o estresse oxidativo nas células β pancreáticas (SANTOS e VILANOVA, 2017).
18
1.4.1 ALLIUM CEPA L
Em termos botânicos a cebola - Allium cepa L. é uma planta herbácea, bulbosa
pertencente ao gênero Allium, família Amaryllidaceae (Figura 1). É composta por 89% de água,
1,5% de proteína e vitaminas (B1, B2 e C), juntamente com potássio e selênio. É rica em dois
grupos químicos que conferem benefícios a saúde humana, os flavonoides e os sulfóxidos de
cisteína. Dentre os flavonoides temos as antocianinas que conferem coloração vermelha/roxa
às cebolas e as quercetinas que dão a coloração amarelada (GRIFFITHS et al., 2002; TESHIKA
et al., 2018).
Allium cepa L é cultivada em praticamente todo o mundo, popularmente conhecida
como cebola, cebola egípcia, cebola comum dentre outros. Sendo a palavra cebola derivada da
palavra latina unio, que significa único ou um porque a planta cebola produz apenas um bulbo.
Além de ser utilizada como um tempero essencial, esta planta tem sido usada para tratar diversas
doenças. Sendo farmacologicamente, reconhecida como antiasmática, agente antihipertensivo,
antihiperglicêmico e antioxidante (TESHIKA et al, 2018;AKASH et al., 2014).
Figura 1- Taxonomia e representação do Allium cepa L. (cebola). Fonte: Catalogue of Life. Disponível em: <
http://www.catalogueoflife.org/col/details/species/id/b5100f6a18b47c8b2d8398e3b4571cd4> Acesso em:
05/08/2018.
É considerada uma erva medicinal antidiabética cujo extrato tem demostrado efeito
terapêutico em ratos diabéticos induzidos tanto por aloxano como por estreptozotocina
reduzindo a lipogênese e aumentando o catabolismo. Além disso, também melhora a
19
dislipidemia e sensibilidade à insulina (GAUTAM et al., 2015). Dentre outros efeitos benéficos
do extrato da cebola estão o efeito protetor cardíaco reduzindo o estresse oxidativo, bem como
atuando na atividade antiplaquetária e antitrombótica (PRADEEP e SRINIVASAN, 2017).
Dentre os vários compostos químicos presentes na cebola alguns destes já foram
isolados e testados, mostrando que é uma planta com grande variedade de compostos químicos
com diversas funções biológicas (AKASH et al., 2014). A Allium cepa L. desempenha sua
atividade antidiabética através de diversas ações farmacológicas conferidas à muitos
constituintes ativos como, a quercetina que é responsável pela inibição da α-glicosidase,
juntamente com a rutina, aumentam a translocação do GLUT-4, captação da glicose e sequestro
de radicais livres pelos sulfóxidos de L-cisteína e alipropilo (GOVERNA et al., 2018).
A cebola é rica em flavonoides e organosulfurados como o S-metilcisteína, que tem
efeito benéfico no DM (ALMEIDA e SUYENAGA, 2009; LEMOS, 2018). Seus compostos
quercentina e s-metilcisteína são os principais responsáveis pelo efeito antidiabético que ajuda
a diminuir o nível de glicose no sangue, de lipídios séricos e do estresse oxidativo, aumentando
a atividade de enzimas antioxidantes bem como a secreção de insulina (AKASH et al., 2014).
1.4.2 S-METILCISTEÍNA
O aminoácido S-metilcisteína tem sua estrutura química composta pela formula
C 4 H 9 NO 2 S, com peso molecular de 135,181 g / mol e didaticamente pode ser visualizado
tanto na forma bidimensional quanto tridimensional demostrados na Figura 2 A e B
respectivamente (PUBCHEM, 2018).
20
Figura 2- Representação gráfica do aminoácido S-metilcisteina. Imagem bidimensional (A); Imagem
tridimensional (B). Fonte: PUBCHEM. Banco de dados de química aberta. Disponível em: <
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/S-Methyl-L-cysteine#section=Top > Acesso em: 07/08/2018.
É um composto hidrofílico formado naturalmente em plantas do gênero Allium como a
cebola e o alho. A suplementação experimental com este composto tem reduzido a
hiperglicemia, hiperlipidemia e estresse oxidativo em ratos diabéticos. Sendo seus efeitos
comparado com o metformina, uma droga anti-hiperglicêmica utilizada no tratamento de DM2
(YIN et al., 2007, SENTHILKUMAR et al., 2013).
Esse sulfóxido tem sido comparado como um análogo a glibenclamida e insulina, drogas
estas que são amplamente utilizadas para controle glicêmico em pacientes diabéticos (PERERA
e LI, 2012). Em um experimento com ratos wistar, submetidos à suplementação deste
composto, por oito semanas, observou-se melhoria de resistência à insulina enquanto houve
redução nos efeitos adversos da síndrome metabólica, inflamação e estresse oxidativo
(THOMAS et al., 2015).
Além dos efeitos benéficos para o tratamento de diabetes esse composto também tem
mostrado comportamento neuroprotetor, efeito anti-carcinogênico e cardiovasculares
(ESCUDERO et al., 2016; CASTILLEJO et al., 2017).
1.5 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA
O estudo quantitativo de imagens histológicas é um dos pilares da investigação
biológica e biomédica. A quantificação de estruturas por parâmetros morfológicos pode ser
relevante para avaliação de um tecido, e com a introdução da estereologia esse campo tem tido
um grande avanço, fornecendo informações valiosas sobre o que possa estar ocorrendo em
células e tecidos (GEUNA e RINCON, 2015).
A estereologia se trata de uma ciência de amostragem e estimativa tridimensional, que
propicia uma quantificação precisa de quase todas as quantidades estruturais de um tecido a
partir de uma imagem bidimensional (GUNDERSEN ET AL., 2013). Esta ferramenta permite
uma melhor compreensão entre forma e função, bem como ajuda a entender melhor as
alterações, adaptações e, mais importante, as doenças (KIPP et al., 2016).
21
Esta técnica de quantificação já vem sendo aplicada para estimativa de volume de
diversas estruturas e nos mais diversos órgãos em experimentos com animais. No intestino
delgado alguns estudos já foram realizados utilizando o princípio estereológico para estimativa
de volume e contagem de células tanto em camundongos quanto em ratos (HANSEN et al.,
2017; WISMANN et al., 2018).
Assim, este trabalho é o pioneiro no que concerne a avaliação dos danos morfológicos
que ocorrem no duodeno de ratos com diabetes mediante a terapia (Allium cepa l e S-
metilcisteína) por meio de analise estereológica.
22
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar por parâmetros e estereológicos os possíveis efeitos do extrato de Allium cepa
L e seu aminoacido isolado S-metilcisteína na morfologia do duodeno de ratos com diabetes
induzidos por estreptozotocina.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar parâmetros pré-clínicos de glicose, peso, consumo de agua e ração;
• Mensurar com aplicação do princípio de Cavalieri o volume de parede, volume de lúmen
e volume total em mm3;
• Mensurar em porcentagem a proporção ocupada pelas subcamadas de mucosa,
submucosa e musculares na parede do duodeno;
• Mensurar o volume absoluto através da relação entre volume de referência e densidade
de volume em mm3;
• Quantificar as citocinas anti-inflamatórias e pro-inflamatórias do soro;
• Inferir se as intervenções utilizadas tiveram efeitos atenuantes ou reversores nos
aspectos morfológicos e estereológicos e dados pré-clínicos.
23
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
Foi utilizado como modelo animal o Rattus norvegicus da linhagem Wistar pertencente
a classe mammalia, ordem rodentia, família Muridae e gênero Rattus (SANTOS, 2002). Os
animais foram provenientes do Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, após aprovação prévia pela Comissão de Ética no Uso de
Animais CEUA-UFRN sob o protocolo 018/2017 (Anexo -A). O experimento foi realizado no
biotério experimental do Departamento de Morfologia/UFRN com a utilização de um total de
35 ratos machos com 90 dias de idade e pesando cerca de 250-300 g.
Os animais permaneceram alojados em caixas de polipropileno providas de bebedouro
e comedouro durante o período de ambientação de uma semana. Foram alocados 4 animais por
caixa, mantidas em condições controladas de temperatura (24±2°C) e de iluminação (ciclo de
12 horas claro/ 12 horas escuro) e receberam ração e água ad libitum. Os animais foram
distribuídos em 4 grupos conforme mostra a (Figura 3). No início do estudo, o grupo controle
ficou com 8 animais normais, sem diabetes, enquanto os outros grupos tinham 9 animais tendo
em vista que é comum ocorrer morte dos animais portadores de diabetes neste modelo
experimental (DIRICE et al., 2009).
Figura 3- Representação da distribuição dos animais nos grupos experimentais com o número amostral inicial de
35 animais e amostra final após morte de dois animais no grupo DMST e um animal no grupo DMAC.
24
- C: Animais não diabéticos;
- D: animais com diabetes experimental não tratados;
-DSM: animais com diabetes experimental tratados com s-metilcisteína;
- DAC: animais com diabetes experimental tratados com Allium cepa L.
O preparo do extrato metanólico do Allium cepa L. foi realizado no Laboratório de
Pesquisa em Matéria Médica (LAPEMM) do Departamento de Medicamentos da Faculdade de
Farmácia da UFBA. Após obtenção comercial do Allium cepa L., a amostra foi descascada,
cortada e extraída por maceração em 3 balões de 1000ml, permanecendo com álcool metílico
99,8% (CH3OH) por 7 dias. Após a filtragem, o extrato foi concentrado por evaporação, sob
pressão reduzida, no evaporador rotatório. O processo foi repetido por três vezes. O extrato
metanólico do Allium cepa L., após secagem na estufa, foi mantido em -20°C até sua utilização
e seu rendimento foi de 4,8%. O extrato metanolico foi padronizado, utilizando-
se Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), quando foi evidenciado o pico
característico de quercetina, estimando-se sua concentração, no extrato, em 1,97% (Figura 4).
A S-metilcisteína, com 99% de pureza ((R)-2-Amino-3-(methylmercapto) propionic
acid, SMLC) foi obtida comercialmente da Sigma-Aldrich®. O extrato de Allium cepa L. e a s-
metilcisteína utilizados nos tratamentos in vivo foram solubilizadas em solução salina estéril,
nas concentrações definidas para o experimento.
Figura 4 Esquema da produção do extrato metanólico de Allium cepa l.
25
3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Os grupos de animais, com exceção do grupo controle composto por animais
normoglicêmicos, passaram por um processo de indução de DM1 por via intraperitoneal, com
a utilização da estreptozotocina (STZ, 50mg/kg) dissolvida a 10 mmol/L solução citrato de
sódio (pH 4,5) (CARVALHO; FERREIRA, 2003). A STZ é um composto sintetizado
naturalmente pela bactéria do solo streptomyces acromogenes apresentando um grande espectro
de propriedades antibacterianas, sendo análogo da glicose citotóxica (ELEAZU et al., 2013). O
resultado de sua ação é que os animais se tornam acometidos pela deficiência de insulina,
hiperglicemia, polidipsia e poliúria, todos eles sinais característicos do DM1 humano. Esta
substância também funciona na indução de DM2 o que vai mudar é seu protocolo e dosagem
(GRAHAM et al., 2011; FURMAN, 2015).
Após 5 dias da indução do diabetes, a glicemia de todos os animais experimentais foi
mensurada por meio de um glicosímetro portátil (ONETOUCH, Ultra®) e os animais que
exibiram glicemia ≥250 mg/dl foram considerados diabéticos. Uma semana após a indução do
diabetes se deu início da intervenção terapêutica por um período de 30 dias consecutivos com
extrato de Allium cepa L. na dose de 400 mg/kg ou s-metilcisteína na dose de 200mg/kg,
administrados por gavagem (v.o) (AKASH et al., 2014). Completado os 30 dias de tratamento,
24 horas após a última administração dos extratos, os animais foram eutanasiados com uma
dose letal de isoflurano para remoção das amostras (Figura 4).
Figura 5-Etapas do período experimental incluindo o tempo de ambientação, indução do DM1, intervenção
terapêutica (Allium cepa L e S-metilcisteína) e eutanásia.
26
3.3 PARÂMETROS PRÉ-CLÍNICOS
Durante o período de experimentação animal foi realizado a mensuração dos parâmetros
pré-clínicos indicadores do DM1. Níveis de glicose sanguínea e peso dos animais foram
quantificada no início e fim do experimento. Enquanto o consumo de água e ração foram
quantificados diariamente.
3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Após a eutanásia dos animais foi feita a coleta padronizada dos 5cm iniciais do intestino
delgado que corresponde ao duodeno. Subsequentemente, após fixação em paraformoldeído
4%, foi realizada a secção seriada de modo que cada fragmento rendesse 10 anéis de 5
milímetros. Após isso, a partir de uma Amostragem Aleatória Uniforme e Sistemática – SURS
se obteve uma fração de ½, selecionando 5 anéis duodenais por unidade amostral, (Figura 5 A).
Em seguida o material foi alocado em caceteres e imersos em álcool 70% para seguir o
processamento histológico de rotina e coloração em Hematoxilina-eosina – HE.
As lâminas confeccionadas, foram submetidas a captura de imagens utilizando um
microscópio óptico (Nikon Ni-U) com câmera acoplada (Nikon DS-Ri1), conectados a um
computador com software NIS instalado. As imagens foram capturadas com a utilização das
objetivas de 2x e 4x. O aumento menor foi utilizado para estimativa de Volume de referência
(Vref) de parede, de lúmen e Volume Total, segundo o princípio de Cavalieri, (Figura 5 B). Já
o aumento maior foi feito para estimar a Densidade de Volume (Vv) das subcamadas mucosa,
submucosa e musculares da parede duodenal, sendo realizadas 4 fotos por secção histológica,
de acordo com o princípio de Delesse, (Figura 5 C). Após a captura das imagens foi sobreposto
um sistema teste quadrático para contagem de pontos que tocassem na região de interesse.
27
Figura 6-Amostragem Uniforme Sistemática e Aleatória ou SURS (BROWN, 2017). Esquema representativo para obtenção de secções histológicas do duodeno (A). Captura
de imagens e aplicação de sistema teste no aumento de 2x (B). Captura de quatro imagens e aplicação de sistema teste por secção histológica no aumento de 4x (C). No aumento
de 2x foi sobreposto dois sistemas testes diferenciados pela cor, onde na parede foi contado apenas os pontos verdes, enquanto na região do lúmen foi contado ambos os pontos
para estimativa de Vref seguindo o princípio de Cavalieri. No aumento de 4x foi sobreposto um sistema teste para estimativa de proporção de musculares e mucosa seguindo o
princípio de Delesse (MANDARIM-DE-LACERDA, 2003)
28
3.5 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA
3.5.1 VOLUME DE REFERÊNCIA (CAVALIERI)
Para a estimativa de Volume de Referência (Vref) de Parede e de Lumén do duodeno,
seguindo o princípio de Cavalieri, foi utilizada a seguinte formula:
Vref= Σp x (a/p) x t x f-1 x f-1
Onde Σp é o somatório de pontos que tocam a região de interesse (Parede ou Lúmen),
a/p é a área por ponto do sistema teste quadrático que foi aplicado demostrado na Figura 3C, t
é a espessura da secção em µ2, f-1 é o inverso da fração que foi utilizada para amostragem do
órgão na clivagem e na microtomia respectivamente (GUNDERSEN et al., 2013).
Após isso, a partir da soma do Vref de parede e Vref de lúmen se obteve o volume total
Vtot como demostrado na formula a seguir:
Vtot= Vref parede + Vref de lúmen
3.5.2 DENSIDADE DE VOLUME (DELESSE)
Seguindo o princípio de Delesse foi estimado a Densidade de Volume (Vv) por
subcamadas. Foi feito para mucosa, submucosa e musculares tendo em vista que a serosa não
era perceptível em algumas das secções histológicas. Para isto se utilizou a formula a seguir:
Vv= ∑p subcamada
∑p parede
onde ∑𝐩 é o somatório de pontos que tocam a região de interesse e a subcamada neste
caso pode ser mucosa ou muscular (MANDARIM-DE-LACERDA, 2003). Essa fração foi feita
para estimar à proporção que cada camada ocupa em relação ao total que é a parede composta
por mucosa, submucosa, musculares e serosa.
3.5.3 VOLUME ABSOLUTO
29
Após a aplicação dos princípios de Cavalieri e Delesse foi possível obter o volume
absoluto por regiões de interesse, das camadas mucosa, submucosa e musculares. Para isto se
utilizou a seguinte formula:
Vab= Vv x Vref de parede
onde Vab é o volume absoluto obtido através da multiplicação do Vv (densidade de
volume de mucosa, submucosa ou muscular) pelo Vref de parede.
3.6 PERFIL DE CITOCINAS
Para avaliação das citocinas, IL1β, IL6 e IL10 foi coletado o soro dos animais
experimentais sendo os níveis de citocinas mensurados utilizando o protocolo de Painel de
Esferas Magnéticas multiplex de alta Sensibilidade (Milliplex® for Luminex MAP Rat
Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel, Santa Clara, USA) de acordo com as instruções do
fabricante, e foi realizada no departamento de imunologia na UFBA. As amostras foram
analisadas no Luminex 100/200 e os dados foram coletados usando o software Luminex
xPONENT® (v. 3.1) (Luminex, Santa Clara, USA).
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média (SEM) e analisados através
do Software Minitab 18®. As variáveis pré-clínicas e estereológicas foram submetidas a teste
de normalidade Anderson-Darling e como todos apresentaram uma distribuição normal foram
submetidos a análise de variância de uma via ANOVA ONE WAY seguida de post hoc teste de
Tukey. Diferenças entre grupos foram consideradas significativas quando (p ≤ 0,05).
30
4 RESULTADOS
4.1 DADOS PRÉ-CLÍNICOS
Após a indução do DM1 com estreptozotocina observou-se o surgimento dos sinais
típicos da síndrome metabólica como: hiperglicemia, perda de peso, polidipsia e polifagia
como mostrado na (Tabela 1). Os níveis glicêmicos nos grupos D, DAC e DSM se mantiveram
elevados até o termino do período experimental quando comparados com o grupo C. Ambos o
extrato e o aminoácido causaram significativa redução na glicemia quando comparados ao
grupo D, animais diabéticos sem tratamento.
Houve uma notável perda de peso ao longo do período experimental nos grupos D, DAC
e DSM quando comparados com o grupo C. A intervenção terapêutica utilizada não foi capaz
de prevenir essa perda de peso tendo em vista que os tratamentos DAC e DSM apresentaram
valores de peso inferiores ao grupo D.
Quanto a ingestão de água houve um aumento de consumo da mesma, onde apenas o
tratamento com extrato causou uma redução quando comparado aos animais diabéticos sem
tratamento. Já no quesito de consumo de ração este também teve seus níveis aumentados nos
animais diabéticos tratados e não tratados e tanto o extrato quanto o aminoácido foram capazes
de promover uma redução significativa quando comparado ao grupo diabético sem tratamento.
C D DAC DSM
Glicemia (d/mg) 120,63 700,4* 566,2 *# 524,5*#†
Peso i (g) 211,24 269,38 * 249,17 * 246,11 *
Peso f (g) 283,1 223,13 * 177,86 *# 192,78 *
Água i (ml) 37, 88 136* 136,7* 125,3*
Água f (ml) 31,8 220,5* 181,1*# 193,2*
Ração i (g) 25,8 30,5 28,8 27,22
Ração f (g) 19,3 42,8* 37,2*# 37,4#*
Tabela 1- Dados pré-clínicos. (C: Grupo controle, D: Grupo diabético não tratado, DAC: Grupo diabético tratado
com extrato de Allium cepa L., e DSM: Grupo diabético tratado com S-metilcisteína). Diferença significativa
sinalizada pelos símbolos * p ≤ 0,05 vs grupo C. # vs grupo D. † vs grupo DAC. Início do período experimental
(i). Fim do período experimental (f).
31
4. 2 ANÁLISE QUALITATIVA HISTOLOGICA
O duodeno é um órgão com parede e lúmen. Sua parede é composta pelas camadas de
mucosa, submucosa, musculares (circular e longitudinal) e serosa. Nas imagens obtidas no
experimento podemos observar que a organização dessas camadas mantevem-se preservadas e
que a depender do grupo experimental foram evidenciadas alterações morfológicas quando
comparadas ao grupo controle.
Visualmente é perceptível o aumento de mucosa nos grupos D, DAC, DSM, nos
quadrantes superiores, versus o grupo C (Figura 6), identificada pelo colchete. Contudo a
camada mucosa que mais se assemelha à do grupo C é aquela presente no grupo DSM. Nos
quadrantes inferiores, com as musculares e submucosa identificados com setas e asteriscos
respectivamente, percebe-se uma redução na submucosa e musculares dos grupos D, DAC e
DSM quando comparadas ao grupo C, sendo a submucosa do grupo DSM mais semelhante à
do grupo controle.
Figura 7 Secções transversais do duodeno coradas em HE. Aumentos de 4x, para quadrantes superiores e 10x
para quadrantes inferiores. Escala de barra de 500 µ nos quadrantes superiores e de 100 µ nos quadrantes inferiores
respectivamente. (Colchete) Mucosa, (*) Submucosa, (Seta) Musculares.
4.3 ESTEREOLOGIA
32
4.3.1 VOLUME DE REFERÊNCIA (CAVALIERI)
As medidas de volume de referência mensurados de acordo com o princípio de Cavalieri
para parede, lúmen e volume total do duodeno estão detalhadas na (Figura 7). De modo geral o
gráfico indica um aumento da parede, e volume total do duodeno nos grupos D, DAC e DSM.
O aumento do volume de parede nos grupos D, DAC e DSM foram 81,1%, 55% e 48%
respectivamente versus o grupo C. Quanto ao lúmen este teve seu volume reduzido em 29,4%,
25,2% e 47% nos grupos D, DAC e DSM versus o grupo C não tendo significância estatística.
No volume total onde é feita a soma dos dois valores anteriores o aumento de volume foi de
86,1%, 52,7% e 38,8% nos grupos D, DAC e DSM.
Figura 8 Volume de referência de parede, lúmen e volume total do duodeno em mm3 dos grupos (C: Grupo
controle, D: Grupo diabético não tratado, DAC: Grupo diabético tratado com extrato de Allium cepa L., e DSM:
Grupo diabético tratado com S-metilcisteína. Letras diferentes denotam diferença significativa. Parede (p< 0,05
vs grupo C), Lúmen (p >0,05) e Total (p <0,05).
4.3.2 DENSIDADE DE VOLUME (DELESSE)
Na Densidade de Volume (Vv) onde temos a proporção ocupada por cada subcamada
em relação a parede em porcentagem, se observou uma ampliação significativa da mucosa nos
grupos D, DAC, DSM em relação ao grupo C. Enquanto que nas camadas de submucosa e
musculares houve uma redução significativa nos mesmos grupos.
33
Figura 9- Densidade de volume (Vv) segundo o princípio de Delesse mostrando uma relação de proporção
ocupada pelas camadas da mucosa, submucosa e musculares em relação ao volume total do duodeno.
4.3.3 VOLUME ABSOLUTO
Quanto ao volume absoluto obtido pela relação entre Vref e Vv foi evidenciado como
no dado anterior de densidade, um aumento significativo da mucosa nos grupos D, DAC, DSM.
Esse aumento em porcentagem foi de 110%, 78% e 68%, respectivamente em D, DAC e DSM
em relação ao controle. Mesmo com esse aumento da mucosa, os grupos tratados obtiveram
menor volume em relação ao grupo diabético, apesar dessa diferença não ser significativa. As
demais camadas avaliadas, submucosa e musculares não apresentaram valores com diferença
significativa.
C D
DAC DSM
Mucosa
Submucosa
Muscular18,3%
10,4%
71,2%
12,6%
6,3%
81,1%
13,5%
5,1%
81,3%
12,6%
6,4%
81,0%
34
Figura 10: Gráfico representando o volume absoluto da mucosa, submucosa e muscular respectivamente em
(mm3). A diferença estatística está indicada pelo (*). Mucosa: P < 0,05; Submucosa: P > 0,05. Muscular: P > 0,05.
4.4 CITOCINAS
Todas as análises do perfil de citocinas estão detalhadas na figura 10. O perfil de
citocinas pro-inflamatórias IL-1B e IL-6 tiveram seus níveis elevados nos grupos com diabetes
tratados ou não com produtos naturais. Os níveis de IL-1B foram significativamente maiores
nos grupos D, DAC e DSM quando comparados com o C, no entanto o grupo DAC teve uma
leve redução quando comparado ao grupo D sem significância estatística (Figura 10A). Já a
segunda interleucina avaliada IL-6 também teve aumento em seus níveis nos grupos diabéticos,
porém esse aumento não foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo C (Figura
10B).
Com relação ao perfil da interleucina IL-10 que é uma citocina considerada anti-
inflamatória houve um aumento significativo nos grupos com diabetes comparado ao grupo
controle. Dentre os grupos o DSM teve maior elevação desta citocina tendo este grupo um
aumento significativo quando comparado ao demais grupos experimentais (Figura 10C).
35
Figura 11- – Dados de citocinas presentes no soro dos grupos experimentais. A) IL-1B (P * <0,05 vs C); B) IL-6
Não houve diferença entre os grupos (P > 0,05); D). C) IL-10 (P <0,05 * vs C, # vs D e † vs DAC);
36
6 DISCUSSÃO
Semelhante a estudos anteriores os animais que receberam a estreptozotocina tiveram
seus níveis de glicose sanguínea elevados desde a indução do DM1 até o fim do período
experimental (DAVIDSON et al., 2011; OLIVEIRA et al, 2019). Tanto o extrato de Alium cepa
L quanto o s-metilcisteína tiveram efeitos atenuantes neste parâmetro sendo capaz de reduzir os
níveis de glicose sanguínea quando comparado os grupos que receberam terapia com o grupo
diabético sem tratamento. Esses dados corroboram com os resultados apresentados nos estudos
de Lee et al (2013) com suco de cebolas maduras no tratamento de animais diabéticos induzidos
por estreptozotocina e com o estudo de Thomas et al (2015) onde houve queda na glicemia
relacionada ao efeito do s-metilcisteína em animais com resistência à insulina.
Como esperado em relação a massa corporal, houve uma redução de peso nos animais
induzidos por estreptozotocina comparado com o grupo controle (NORGAAD et al., 2018). Em
um modelo de diabetes induzido por espretozotocina com resistência à insulina e tratados com
o pó da cebola Allium cepa L. também houve uma perda de peso significativa nos animais
diabéticos versus os animais saudáveis. Porém diferentemente desse estudo a suplementação
com o pó da cebola foi capaz de reduzir levemente essa perda de peso, sendo este efeito
dependente da dose (ISLAM et al., 2008). Nesse trabalho não houve diferença significativa
entre os grupos diabéticos tratados e não tratados, sendo nos grupos tratados evidenciada
aumento da perda de peso em relação ao grupo C e ainda em relação ao grupo D.
Diferente dos dados observados no presente estudo, Campos et al (2015) utilizando o
extrato de Allium cepa L. em concentração de (40 g / 100 ml/d) em animais pesando em média
223 g por um período de 30 dias, verificou que houve redução significativa na perda de peso.
Como também o encontrado por Ojienh et al. (2003) que mostrou uma redução significativa na
perda de peso com uso das concentrações 0,4 e 0,6g/100g. Com isso levando em consideração
que o efeito reversor na perda de peso propiciada pelo Allium cepa l é maior quando a dose é
maior, e que a dose utilizada neste estudo foi de 400 mg/kg sendo inferior as demais
apresentadas infere-se que seria necessário uma dose mais alta para se ter um efeito melhor
neste parâmetro.
Os índices de consumo de água e ração neste estudo corresponderam aos demais estudos
já existentes na literatura indicando polidipsia e polifagia, um aumento no consumo de água e
ração por parte dos animais diabéticos induzidos por estreptozotocina comparados com os
37
animais normais (CARVALHO et al., 2018). No presente estudo ambas as terapias utilizadas
obtiveram uma leve redução quando comparado ao grupo diabético sem tratamento.
Diferentemente do achado apresentado aqui, Bang et al (2009) em seu estudo com
suplementação de pó da cebola na dieta de animais com diabetes induzido por estreptozotocina
não teve nenhum efeito positivo para esse parâmetro.
Quanto ao efeito do S-metilcisteína no ensaio de Yin et al (2007) não obteve efeitos
reversores do s-metilcisteína nos parâmetros de peso corporal, ingestão de água e ração
utilizando várias concentrações do aminoácido. Já quanto a glicemia assim como no nosso
estudo o s-metilcisteína foi capaz de reduzi-la levemente corroborando com resultados descritos
acima.
Essas disparidades encontradas nos estudos anteriormente possivelmente sejam
explicadas pelas variáveis no protocolo de cada estudo. Modo de preparo da terapia (pó,
extrato), dosagens utilizadas e duração de tratamento. Tais fatores podem estar atuando na
modulação desses resultados.
Quanto aos dados de morfologia foi possível observar o aumento do volume de
referência total do duodeno de ratos diabéticos induzido por estreptozotocina, assim como
encontrado na literatura em jejuno de ratos na mesma condição patológica quando comparado
com animais saudáveis (ROSA et al., 2015). Neste parâmetro avaliado tanto o extrato de Allium
cepa l quanto o s-metilcisteína tiveram efeitos positivos, sendo o aminoácido isolado mais
eficiente na reversão do aumento deste volume, apresentando valores considerados
estatisticamente iguais aos animais saudáveis. Tal efeito possivelmente seja explicado pela
atuação positiva do aminoácido s-metilcisteína no estresse oxidativo, que no DM ocorre de
forma exacerbada, e que tem sido apontado como causa para as alterações estruturais e
funcionais teciduais (THOMAS et al., 2015).
Atualmente vem sendo feita uma associação entre dano morfológico nos tecidos com
vias bioquímicas de estresse oxidativo que no diabetes ocorre de forma acentuada. Esse
processo ocorre quando há um desbalanço no estado redox da célula danificando assim
biomoléculas vitais a fisiologia celular como: DNA, proteínas e lipídios. A mucosa intestinal é
um ambiente bastante vulnerável a esse estresse, isso devido a exposição ao conteúdo luminal,
com detritos oxidados, metabolitos da própria flora bacteriana, ácidos biliares e salivares
(BHOR et al., 2004).
38
Esses dados de aumento de volume se contrapõem ao que ocorre com o peso corporal
dos animais tendo em vista que há uma perda significativa de sua massa (ROSA et al., 2015).
Assim como para outros órgãos já avaliados como rim e fígado no DM, no duodeno há uma
hiperplasia ou hipertrofia celular que resulta em aumento em seu tamanho (ADEDARA et al.,
2015). Algumas hipóteses para explicação desse fato no intestino é que no DM1 há uma
dificuldade na captação de glicose para os tecidos mediante a falta de insulina para estimular
essa captação. Sendo assim, talvez essa mudança quantitativa na morfologia do duodeno seja
uma forma compensatória que o organismo encontra de aumentar sua área de absorção de modo
que consiga absorver e adquirir uma maior quantidade de glicose (MAYHEW e CARSON
1989).
O aumento do volume total do duodeno se dá principalmente pelo aumento significativo
da parede duodenal. Este efeito inicialmente foi explicado como uma resposta hiperplásica e
hipertrófica adaptativa do epitélio que reveste a mucosa intestinal (ZOUBI et al., 1985; ROSA
et al., 2015). Nestes casos citados acima nenhum estudo avaliou o efeito fitoterápico do Allium
cepa l ou de seu aminoácido s-metilcisteína, no entanto esse estudo fornece dados que mostram
a eficiência do uso de produtos naturais (extrato Allium cepa l e s-metilcisteína) reduzindo as
alterações provavelmente hiperplásicas na mucosa do duodeno e consequentemente no volume
total duodenal.
Avaliando-se separadamente as subcamadas da parede do duodeno também foi possível
observar que o aumento do volume total da mesma se deu principalmente pelo aumento
proeminente da mucosa corroborando com estudos morfométricos em ratos diabéticos
(THOMAS et al., 2015). Esta remodelação tecidual no intestino delgado já vem sendo descrita
no DM, além do aumento de volume de parede já se observou também um aumento do lúmen,
rigidez e alterações nas propriedades elásticas do tecido foram encontradas, porém apesar de
não identificar a causa pressupõe-se que seja relacionada ao estresse oxidativo (ZHÃO et al.,
2003).
O aumento na produção de produtos finais de glicação avançadas (AGEs) é uma das
vias de estresse oxidativo que vem sendo considerada como importante precursor de alterações
teciduais no DM. Essas moléculas são ligações não-enzimáticas que ocorrem entre grupos
aminocarbonilo de forma acelerada no estado hiperglicêmico são capazes de modificar as mais
diversas estruturas biológicas (BARBOSA et., 2008; CHEN et al., 2012). As mesmas já foram
correlacionadas com a hiperglicemia tendo em vista que em estudos com controle da glicose
sanguínea com insulina, as alterações não ocorreram (JØRGENSEN ET AL., 2001).
39
A diminuição da submucosa vista nesse estudo nos animais diabéticos tratados e não
tratados com a terapia também corrobora com os dados já existentes (ROSA et al., 2015). A
glicação proteica está ligada a hiperglicemia, onde no tecido conjuntivo pode ocorrer
principalmente com as proteínas de colágeno (SADOWSKA-BARTOSZ e BARTOSZ, 2015).
Tendo em vista que a submucosa é constituída de tecido conjuntivo principalmente, pode se
atribuir o mecanismo de glicação avançada como preditor da diminuição dessa camada.
No volume absoluto por subcamadas, a mucosa permanece aumentada acentuadamente.
No entanto nas camadas musculares e submucosa não houve diferença significativa entre os
grupos. Resultado semelhante ao encontrado por Jørgensen et al (2001) em analises de
espessura em mm das subcamadas do jejuno e íleo em ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina e tratados com insulina.
A polifagia gerada pelo DM1 leva ao desenvolvimento hiperplásico da mucosa
intestinal. Somado a isso tem-se que a inervação intestinal que participa na cinetica de regulação
da proliferação celular e apoptose, mantem a homeostase entre esses processos. No entanto com
a neuropatia diabética há prejuízos nessa regulação o que contribui ainda mais para o aumento
do volume da mucosa (ZANONI e PEREIRA, 2008).
Os danos morfológicos vistos até então no DM experimental estão ligados a
hiperglicemia tendo em vista que em um estudo com utilização da insulo-terapia convencional
essas alterações são diminuídas quando comparado o grupo tratado com insulina versus o grupo
diabético não tratado. A partir de uma análise estereológica realizada por MAYHEW et al.
(1989) foi visto um aumento de volume de mucosa, submucosa e muscular assim como nos
nossos achados para volume absoluto.
O intestino delgado em estado hiperglicêmico tem um aumento tanto no seu peso como
também no seu comprimento total. Dado que supostamente está ligado a hiperplasia tendo em
vista que o aumento celular leva ao aumento no volume da parede intestinal, e
consequentemente este órgão tenderá a pesar mais (ISAH e MOSOLA, 2017).
Nesse estudo evidenciou-se que o grupo tratado com s-metilcisteína apresentou melhor
morfologia da mucosa e submucosa quando comparado aos grupos diabético sem tratamento e
diabético tratado com Allium cepa L. Sendo a utilização desse aminoácido, uma alternativa para
estudos relacionados às complicações do DM e suas futuras terapias.
40
Com relação a expressão de citocinas nesse estudo observou-se o aumento de citocinas
pro-inflamatórias no estado hiperglicêmico assim como evidenciado por Uluisik e Keskin,
2017. Em um trabalho executado por DOGAN et al., 2006, com crianças portadoras de DM1
foi relatado que as citocinas pro-inflamatórias IL-1B e IL-6 apresentam no soro um aumento
significativo indicando um estado de inflamação crônica. Os grupos D, DAC e DSM também
apresentaram aumento do nível dessas citocinas.
Apesar da intervenção não ter sido capaz de reduzir significativamente os níveis de
citocinas pró-inflamatórias, os níveis de IL-10 (citocina anti-inflamatória) teve um grande
aumento no grupo DSM, indicando que o s-metilcisteína possa atuar modulando uma resposta
anti-inflamatória como indicado Thomas et al. (2015).
Esses achados reforçam a ideia de que mecanismos imunológicos estão envolvidos não
apenas na etiologia do DM1, mas também no seu quadro patológico, onde há um desequilíbrio
entre citocinas com atividades pro-inflamatórias e anti-inflamatórias (FIDAN et al., 2005). Esse
desbalanço tem sido associado ao estresse oxidativo que leva a sinalização inflamatória
caracterizada pela produção anormal de citocina pro-inflamatórias possivelmente gerando
danos na sinalização da insulina (SAMARGHANDIAN et al., 2017).
41
7 CONCLUSÃO
A intervenção tanto com extrato de Allium cepa l. quanto com S-metilsisteína teve um
efeito atenuante na redução da glicemia;
Em relação ao peso corporal não se constatou-se efeito positivo, já em relação a
polifagia e polidipsia teve um leve efeito quando comparado aos animais diabéticos sem
tratamento;
Quanto ao volume de referência de parede, lúmen e volume total tanto o Allium cepa l
quanto o S-metilcisteina foram capazes de atenuar o aumento no volume, sendo o aminoácido
mais eficiente;
Em relação a proporção ocupada pelas camadas de (mucosa, submucosa e muscular), se
observou o aumento de mucosa nos grupos diabéticos tratados ou não, e uma redução na
submucosa e muscular;
Quanto ao volume absoluto, se confirmou o aumento significativo de mucosa e o s-
metilcisteína também teve melhor efeito para este parâmetro;
Houve um aumento de citocinas pro-inflamatórias nos grupos diabéticos bem como um
aumento de citocina anti-inflamatória principalmente no grupo tratado com S-metilcisteína;
A partir disso conclui-se que dentre as terapias utilizadas, o S-metilcisteína teve
melhores efeitos na redução dos danos causados pelo DM1, abrindo perspectivas para novos
estudos na busca por terapias alternativas no tratamento do DM e suas complicações associadas.
42
REFERÊNCIAS
ADEDARA, I. A; AWOGBINDIN, I. O; ANAMELECHI, J. P; & FAROMBI, E. O. Garcinia
kola seed ameliorates renal, hepatic, and testicular oxidative damage in streptozotocin-induced
diabetic rats. Pharmaceutical biology, v. 53, n. 5, p. 695-704, 2015.
AKASH, Um. S. H; REHMAN, K; CHEN, S. Spice plant Allium cepa: Dietary supplement for
treatment of type 2 diabetes mellitus. Nutrition, v. 30, n. 10, p. 1128-1137, 2014.
ALMAHFOODHl, D; ALABBOOD, M; ALALI, A; MANSOUR, A. Epidemiology of type 1
diabetes mellitus in Basrah, Southern Iraq: A retrospective study. diabetes research and
clinical practice, v. 133, p. 104-108, 2017.
BANG, M; KIM, H. A; & CHO, Y. J. Alterations in the blood glucose, serum lipids and renal
oxidative stress in diabetic rats by supplementation of onion (Allium cepa. Linn). Nutrition
research and practice, v. 3, n. 3, p. 242-246, 2009.
BARBOSA, J. H. P; OLIVEIRA, S. L; SEARA, L. T. O papel dos produtos finais da glicação
avançada (AGEs) no desencadeamento das complicações vasculares do diabetes. Arq Bras
Endocrinol Metab, v. 52, p. 6, 2008.
BHOR, V. M; RAGHURAM, N; SIVAKAMI, S. Oxidative damage and altered antioxidant
enzyme activities in the small intestine of streptozotocin-induced diabetic rats. The
international journal of biochemistry & cell biology, v. 36, n. 1, p. 89-97, 2004.
BROWN, D. L. Practical stereology applications for the pathologist. Veterinary pathology, v.
54, n. 3, p. 358-368, 2017.
CARVALHO, A. C. B; DINIZ, M. F. F. M.; MUKHERJEE, R. A. Estudos da atividade
antidiabética de algumas plantas de uso popular contra o diabetes no Brasil. Ver Bras Farm,
v. 86, n. 1, p. 11-16, 2005.
CASTILLEJO, N; GÓMEZ, P. A.; AGUAYO, E et al. Microwave Heating Modelling of a
Green Smoothie. Effects on Glucoraphanin, Sulforaphane and S− Methyl Cysteine Sulphoxide
Changes during Storage. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2017.
Catalogue of Life. Disponível em: <
http://www.catalogueoflife.org/col/details/species/id/b5100f6a18b47c8b2d8398e3b4571cd
4> Acesso em: 05/08/2018.
43
CHEN, P; ZHAO, J; GREGERSEN, H. Up-regulated expression of advanced glycation end-
products and their receptor in the small intestine and colon of diabetic rats. Digestive diseases
and sciences, v. 57, n. 1, p. 48-57, 2012.
COSTA, L. M. F. C; VIEIRA, S. E. Quality of life of adolescents with type 1 diabetes. Clinics,
v. 70, n. 3, p. 173-179, 2015.
DAMASCENO, D. C; NETTO, A. O; IESSI, I. L et al. Debora Cristina et al. Streptozotocin-
induced diabetes models: pathophysiological mechanisms and fetal outcomes. Bio Med
research international, v. 2014, 2014.
DEEDS, M. C; ANDERSON, J. M., ARMSTRONG, A. S; GASTINEAU, D. A; HIDDINGA,
H. J; JAHANGIR, A; ... & KUDVA, Y. C. Single dose streptozotocin-induced diabetes:
considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory animals, v. 45, n.
3, p. 131-140, 2011.
DIANI, A. R; GERRITSEN, G. C; STOMSTA, S; & MURRAY, P. A study of the
morphological changes in the small intestine of the spontaneously diabetic Chinese
hamster. Diabetologia, v. 12, n. 2, p. 101-109, 1976.
DIRICE, E; SANLIOGLU, AD, KAHRAMAN, S; OZTURK, S; BALCI, MK, OMER, A; ...
& SANLIOGLU, S. Adenovirus-Mediated TRAIL Gene (Ad5hTRAIL) Delivery into
Pancreatic Islets Prolongs Normoglycemia in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Terapia
genética humana, v. 20, n. 10, p. 1177-1189, 2009.
DOGAN, Y., AKARSU, S., USTUNDAG, B., YILMAZ, E., & GURGOZE, M. K. Serum IL-
1β, IL-2, and IL-6 in insulin-dependent diabetic children. Mediators of inflammation, 2006.
ELEAZU, C. O., ELEAZU, K. C., CHUKWUMA, S et al. Review of the mechanism of cell
death resulting from streptozotocin challenge in experimental animals, its practical use and
potential risk to humans. Journalof Diabetes & Metabolic Disorders, v. 12, n. 1, p. 60, 2013.
ESCUDERO, G. E., MARTINI, N., JORI, K et al. Biological activities of Zn (II)-S-methyl-
cysteine complex as antiradical, inhibitor of acid phosphatase enzyme and in vivo
antidepressant effects. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry, v. 31, n. 6, p.
1625-1631, 2016.
FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DE DIABETES. Disponível em:
<https://www.idf.org/aboutdiabetes/what-is-diabetes/facts-figures.html> Acesso em:
09/07/2018.
44
FEIJÓ, A. M., BUENO, M. E. N., CEOLIN, T et al. Plantas medicinais utilizadas por idosos
com diagnóstico de Diabetes mellitus no tratamento dos sintomas da doença. Embrapa Clima
Temperado-Artigo em periódico indexado (ALICE), 2012.
FIDAN, I., YÜKSEL, S., KALKANCI, A., IMIR, T., & KUSTIMUR, S. Evaluation of the
natural killer cytotoxicity and the levels of cytokines in rats with type I diabetes
mellitus. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, n. 8, p. 883-887, 2005.
FURMAN, B. L. Modelos diabéticos induzidos por estreptozotocina em camundongos e
ratos. Protocolos atuais em farmacologia , v. 70, n. 1, p. 5,47. 1-5,47. 20 de 2015.
GAJDOSIK, A., GAJDOSIKOVA, A., STEFEK, M., NAVAROVA, J., & HOZOVA, R.
Streptozotocin-induced experimental diabetes in male Wistar rats. General physiology and
biophysics, v. 18, p. 54-62, 1999.
GAUTAM, S; PAL, S; MAURYA, R; SRIVASTAVA, A. K. Ethanolic extract of allium cepa
stimulates glucose transporter typ 4-mediated glucose uptake by the activation of insulin
signaling. Planta medica, v. 81, n. 03, p. 208-214, 2015.
GEUNA, Stefano; HERRERA-RINCON, Celia. Update on stereology for light
microscopy. Cell and tissue research, v. 360, n. 1, p. 5-12, 2015.
GOVERNA, P., BAINI, G., BORGONETTI, V., CETTOLIN, G., GIACHETTI, D.,
MAGNANO, AR, & BIAGI, M. Phytotherapy in the Management of Diabetes: A Review.
Moléculas, v. 23, n. 1, p. 105, 2018.
GRAHAM, M. L., JANECEK, J. L., KITTREDGE, J. A., HERING, B. J., & SCHUURMAN,
H. J. The streptozotocin-induced diabetic nude mouse model: differences between animals from
different sources. Comparative medicine, v. 61, n. 4, p. 356-360, 2011.
GRIFFITHS, G., TRUEMAN, L., CROWTHER, T., THOMAS, B. e SMITH, B. Onions—A
Global Benefit to Health. Phytotherapy research, 16 (7), 603-615.2002.
GUNDERSEN, H. J. G., MIRABILE, R., BROWN, D., & BOYCE, R. W. Stereological
principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. In: Haschek and Rousseaux's
Handbook of Toxicologic Pathology (Third Edition). 2013. p. 215-286.
HAMILTON, P.W e ALLEN, D.C. Morfometria em histopatologia. J. Pathol., 175: 369-379.
1995.
45
HANSEN, C. F., VRANG, N., SANGILD, P. T., & JELSING, J. Novel insight into the
distribution of L-cells in the rat intestinal tract. American journal of translational research,
v. 5, n. 3, p. 347, 2013.
HSIA, T. C; YIN, M. C. s‐Ethyl Cysteine and s‐Methyl Cysteine Protect Human Bronchial
Epithelial Cells Against Hydrogen Peroxide Induced Injury. Journal of food science, v. 80, n.
9, 2015.
ISAH, M. B; MASOLA, B. Effect of oleanolic acid on small intestine morphology and
enzymes of glutamine metabolism in diabetic rats. Revista internacional de fisiologia,
fisiopatologia e farmacologia, v. 9, n. 5, p. 128, 2017.
JØRGENSEN, C. S., AHRENSBERG, J. M., GREGERSEN, H., & FLYVBERG, A. Tension–
strain relations and morphometry of rat small intestine in experimental diabetes. Digestive
diseases and sciences, v. 46, n. 5, p. 960-967, 2001.
JØRGENSEN, C. S., AHRENSBERG, J. M., GREGERSEN, H., & FLYVBERG, A. Tension–
strain relations and morphometry of rat small intestine in experimental diabetes. Digestive
diseases and sciences, v. 46, n. 5, p. 960-967, 2001.
KIPP, M; KIESSLING, M. C; HOCHSTRASSER, T; ROGGENKAMP, C; SCHIMITZ, C.
Design-based stereology for evaluation of histological parameters. Journal of Molecular
Neuroscience, v. 61, n. 3, p. 325-342, 2016.
KNIP, M; SILJANDER, H. O papel da microbiota intestinal no diabetes mellitus tipo 1. Nature
Reviews Endocrinology, v. 12, n. 3, p. 154-167, 2016.
KRISHANAN, B; BABU, S; WALKER, J; WALKER, A. B; PAPPACHAN, JM.
Complicações gastrointestinais do diabetes mellitus. World jornal of diabetes, v. 4, n. 3, p. 51,
2013.
LEE, S. H., RHEE, M., KIM, J. W., & YOON, K. H. Generation of Insulin-Expressing Cells
in Mouse Small Intestine by Pdx1, MafA, and BETA2/NeuroD. Diabetes & Metabolism
Journal, v. 41, n. 5, p. 405-416, 2017.
Lou, J., Zhou, H., Li, C., Hu, L., Lu, X., Li, J., ... & Xu, M. ABCA1 and ABCG1 expression in
the small intestine of type 2 diabetic rats. Laboratory medicine, v. 45, n. 1, p. 17-24, 2014.
MAAS D. M, WEST, N.A, LAWRENCE, J. N et al. Epidemiology of Type 1 Diabetes.
Endocrinol Metab Clin North Am. 2010.
46
MACHADO, D., COELHO, A., PAULA, A., FERREIRA, M. M et al. Prevalência de Lesões
de Cárie de Doentes com Diabetes Mellitus Tipo 1 Tratados com Múltiplas Administrações de
Insulina e de Indivíduos sem Diabetes. Acta Medica Portuguesa, v. 30, n. 5, 2017.
MANDARIM-DE-LACERDA, C. A. Stereological tools in biomedical research. Anais da
Academia brasileira de Ciências, v. 75, n. 4, p. 469-486, 2003.
MANUWALD, U., HEINKE, P., SALZSIEDER, E et al, Incidence trends of type 1 diabetes
before and after the reunification in children up to 14 years of age in Saxony, Eastern
Germany. Plos one, v. 12, n. 9, p. e0183665, 2017.
MARCOS, R; MONTEIRO, R. A. F; ROCHA, E. The use of design‐based stereology to
evaluate volumes and numbers in the liver: a review with practical guidelines. Journal of
anatomy, v. 220, n. 4, p. 303-317, 2012.
MAYHEW, T. M.; CARSON, FIONA L. Mechanisms of adaptation in rat small intestine:
regional differences in quantitative morphology during normal growth and experimental
hypertrophy. Journal of anatomy, v. 164, p. 189, 1989.
MAYHEW, TM; CARSON, FL; SHARMA, AK Small intestinal morphology in experimental
diabetic rats: a stereological study on the effects of an aldose reductase inhibitor (ponalrestat)
given with or without conventional insulin therapy. Diabetologia , v. 32, n. 9, p. 649-654,
1989.
NANSEL, T. R., WEISBERG J. B., WYSOCKI, T., LAFFEL, L., ANDERSON, B. Quality of
life in children with Type 1 diabetes: a comparison of general and diabetes‐specific measures
and support for a unitary diabetes quality‐of‐life construct. Diabetic Medicine, v. 25, n. 11, p.
1316-1323, 2008.
NEGRI, G. Diabetes melito: plantas e princípios ativos naturais hipoglicemiantes. Revista
Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 41, n. 2, p. 121-142, 2005.
OLIVEIRA, A. R. ; SILVA, F. S. ; BORTOLIN, R. H. ; MARQUES, D. E. S. ; RAMOS, G.
V. ; MARQUETI, R. C. ; SILVA, N. B. ; MEDEIROS, K. C. P. ; CORREA, M. A. ; LIMA, J.
P. M. S. ; REZENDE, A. A. ; ACKERMANN, P. ; ABREU, B. J. ; VIEIRA, W. H. B. . Effect
of photobiomodulation and exercise on early remodeling of the Achilles tendon in
streptozotocin-induced diabetic rats. PLoS One, v. 4, p. e021164, 2019.
PELLGRINI, S., SORDO, V., BOLLA, A. M., SAITA, D., FERRARESE, R., CANDUCCI,
F., ... & BARERA, G. Duodenal mucosa of patients with type 1 diabetes shows distinctive
inflammatory profile and microbiota. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism,
v. 102, n. 5, p. 1468-1477, 2017.
47
PERERA, P. K; LI, Y. Functional herbal food ingredients used in type 2 diabetes
mellitus. Pharmacognosy reviews, v. 6, n. 11, p. 37, 2012.
PRADEEP, S. R.; SRINIVASAN, K. Alleviation of Cardiac Damage by Dietary Fenugreek
(Trigonellafoenum-graecum) Seeds is Potentiated by Onion (Allium cepa) in Experimental
Diabetic Rats via Blocking Renin–Angiotensin System. Cardiovascular Toxicology, p. 1-11,
2017.
PUBCHEM. Banco de dados de química aberta. Disponível em: <
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/S-Methyl-L-cysteine#section=Top > Acesso em:
07/08/2018.
RODRIGUES, M. L. C; MOTTA, M. E. F. A. Mechanisms and factors associated with
gastrointestinal symptoms in patients with diabetes mellitus. Jornal de pediatria, v. 88, n. 1,
p. 17-24, 2012.
SADOWSKA-BARTOSZ, Izabela; BARTOSZ, Grzegorz. Prevention of protein glycation by
natural compounds. Molecules, v. 20, n. 2, p. 3309-3334, 2015.
SAMARGHANDIAN, S; BORJI, A; FARKHONDEH, T. Attenuation of Oxidative Stress and
Inflammation by Portulaca oleracea in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Journal of
Evidence-Based Complementary & Alternative Medicine, v. 22, n. 4, p. 562-566, 2017.
SANTOS, B. F. Criação e manejo de ratos. Editora Fiocruz, Rio de Janeiro, 2002.
SANTOS, K. A, VILANOVA, C. M. Estudo etnobotânico de plantas medicinais utilizadas
como hipoglicemiantes por usuários do Programa de Fitoterapia da Universidade Federal do
Maranhão, Brasil. Scientia Plena, v. 13, n. 3, 2017.
SANTOS, M. M.; NUNES, M. G. S.; MARTINS, R. D. Uso empírico de plantas medicinais
para tratamento de diabetes. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 2, p. 327-334,
2012.
SANYAL, Debmalya. Diabetes is predominantly an intestinal disease. Indian journal of
endocrinology and metabolism, v. 17, n. Suppl1, p. S64, 2013.
SARAVANAN, C., SCHUMACHER, V., BROWN, D., DUNSTAN, R., GALARNEAU, J. R.,
ODIN, M., & MISHRA, S. Tissue-based Image Analysis. Toxicologic pathology, v. 45, n. 7,
p. 983-1003, 2017.
48
SENTHILKUMAR, G. P., THOMAS, S., SIVARAMAN, K., SANKAR, P et al. Study the
effect of s-methyl L-cysteine on lipid metabolism in an experimental model of diet induced
obesity. Journal of clinical and diagnostic research: JCDR, v. 7, n. 11, p. 2449, 2013.
SHA, H., ZHAO, J. B., ZHANG, Z. Y., ZHOU, S. P., TONG, X. L., ZHUANG, F. Y., &
GREGERSEN, H. Effect of Kaiyu Qingwei Jianji on the morphometry and residual strain
distribution of small intestine in experimental diabetic rats. World Journal of
Gastroenterology: WJG, v. 12, n. 44, p. 7149, 2006.
SHAKIL, A; IGREJA, R.J; RAO, S. S. Complicações gastrointestinais da diabetes. Médico de
família americano, v. 77, n. 12, 2008.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE SIABETES. Disponível em:
<http://www.diabetes.org.br/publico/ > Acesso em: 02/11/1017.
SZKUDELSKI, T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat
pancreas. Physiological research, v. 50, n. 6, p. 537-546, 2001.
TESHIKA, J. D, ZAAKARIYYAH, A M, TOORABALLY, Z, ZENGIN, G., RENGASAMY,
K R, PANDIAN, SK, e MAHOMOODALLY, F M. Traditional and modern uses of onion bulb
(Allium cepa L.): A systematic review. Critical reviews in food science and nutrition, n. just
accepted, p. 1-75, 2018.
THOMAS, S., SENTHILKUMAR, G. P., SIVARAMAN, K., BOBBY, Z.,
PANEERSELVAM, S., & HARICHANDRAKUMAR, K. T. Effect of s-methyl-L-cysteine on
oxidative stress, inflammation and insulin resistance in male Wistar rats fed with high fructose
diet. Iranian journal of medical sciences, v. 40, n. 1, p. 45, 2015.
TORTORA, G. J. Corpo Humano: fundamentos de anatomia e fisiologia. 4. ed. Porto
Alegre: Artmed Editora; 2000.
TSCHANZ, Stefan A.; BURRI, Peter Hermann; WEIBEL, Ewald Rudolf. A simple tool for
stereological assessment of digital images: the STEPanizer. Journalofmicroscopy, v. 243, n.
1, p. 47-59, 2011.
ULUISIK, D; KESKIN, E. Os efeitos da coenzima Q10 em marcadores de inflamação em ratos
diabéticos induzidos por estreptozotocina. Acta Scientiae Veterinariae, v. 45, p. 1-5 de 2017.
UPADHYAY, Ravi Kant. Nutraceutical, pharmaceutical and therapeutic uses of Allium cepa:
A review. International Journal of Green Pharmacy (IJGP), v. 10, n. 1, 2016.
49
VELLA, A; CAMILLERI, M. O Tracto Gastrointestinal como Integrador de Resposta
Mecânica e Hormonal à Ingestão de Nutrientes. Diabetes, v. 66, n. 11, p. 2729-2737, 2017.
WEN, Li; DUFFY, Andrew. Factors Influencing the Gut Microbiota, Inflammation, and Type
2 Diabetes. The Journal of Nutrition, p. jn240754, 2017.
WISMANN, P., PEDERSEN, S. L., HANSEN, G., MANNERSTEDT, K., PEDERSEN, P. J.,
JEPPESEN, P. B., ... & JELSING, J Novel GLP-1/GLP-2 co-agonists display marked effects
on gut volume and improves glycemic control in mice. Physiology & behavior, 2018.
WOLOSIN, J. D; FACP M. D; EDELMAN, S.V. Diabetes e Tracto gastrointestinal. Diabetes
Clínicas, V. 18, N. 4. 2000.
YIN, M. C., HSU, C. C., CHIANG, P. F et al. Antiinflammatory and antifibrogenic effects of
s‐ethyl cysteine and s‐methyl cysteine in the kidney of diabetic mice. Molecular nutrition &
food research, v. 51, n. 5, p. 572-579, 2007.
ZANONI, Jacqueline, N; PEREIRA, R. V. F. Cell proliferation of the ileum intestinal mucosa
of diabetic rats treated with ascorbic acid. Biocell, v. 32, n. 2, p. 163-168, 2008.
ZHAO, J. B., FRØKJÆR, J. B., DREWES, A. M., & EJSKJAER, N. Upper gastrointestinal
sensory-motor dysfunction in diabetes mellitus. World journal of gastroenterology: WJG, v.
12, n. 18, p. 2846, 2006.
ZOUBI, S. A.; MAYHEW, T. M.; SPARROW, R. A. The small intestine in experimental
diabetes: cellular adaptation in crypts and villi at different longitudinal sites. Virchows Archiv,
v. 426, n. 5, p. 501-507, 1995
Liu, H., Ou, S., Xiao, X., Zhu, Y. e Zhou, S. Diabetes Worsens Ischemia-Reperfusion Brain
Injury in Rats Through GSK-3b. A revista americana de ciências médicas , v. 350, n. 3,
p. 204-211, 2015.
UGOCHUKWU, Ngozi H .; FIGGERS, Cynthia L. A restrição calórica inibe a regulação
positiva das citocinas inflamatórias e do TNF-α e ativa a IL-10 e a haptoglobina no plasma de
ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. O Jornal de bioquímica nutricional , v. 18,
n. 2, p. 120-126, 2007.
AROKOYO, D. S., OYEYIPO, I. P., DU PLESSIS, S. S., CHEGOU, N. N., & ABOUA, Y. G.
Modulation of Inflammatory Cytokines and Islet Morphology as Therapeutic Mechanisms of
50
Basella alba in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Toxicological research, v. 34, n. 4, p.
325, 2018.
VIGUERAS, R. M., ROJAS-CASTANEDA, J., HERNANDEZ, R., REYES, G., &
ALVAREZ, C. Histological characteristics of the intestinal mucosa of the rat during the first
year of life. Laboratory animals, v. 33, n. 4, p. 393-400, 1999.
TORTORA, G. J.; DERRICKSON, B. Princípios de anatomia e fisiologia. 14 Edição. Rio de
Janeiro. Guanabara Koogan,2016.
51
ANEXO A- APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
52
ANEXO B – TABELA DE NUMEROS ALEATÓRIOS
