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JACQUES MATONE

EFEITOS DO ETIL-PIRUVATO NO TRATAMENTO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA DA LESÃO PULMONAR NA PANCREATITE

AGUDA NECROSANTE INDUZIDA EM RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

SÃO PAULO

2011

JACQUES MATONE

EFEITOS DO ETIL-PIRUVATO NO TRATAMENTO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA DA LESÃO PULMONAR NA PANCREATITE

AGUDA NECROSANTE INDUZIDA EM RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Alberto Goldenberg

Co-orientador: Dr. Franz Robert Apodaca-Torrez

SÃO PAULO

2011

Matone, Jacques

Efeitos do etil-piruvato no tratamento da resposta inflamatória da lesão pulmonar na pancreatite aguda necrosante induzida em ratos. / Jacques Matone - São Paulo, 2011.

xix, 79f.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Gastroenterologia Cirúrgica.

Título em inglês: Effects of ethyl-pyruvate in the inflammatory response of lung injury in experimental acute pancreatitis in rats

1. Pancreatite aguda necrosante. 2. Ratos. 3. Piruvato. 4. Inflamação.

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRURGIA

DISCIPLINA DE GASTROENTEROLOGIA CIRÚRGICA

Chefe do Departamento de Cirurgia:

Profa. Dra. Lydia Masako Ferreira

Coordenador do Curso de Pós-graduação:

Prof. Dr. Delcio Matos

iv

Jacques Matone

Efeitos do etil-piruvato no tratamento da resposta inflamatória da lesão pulmonar na pancreatite aguda necrosante induzida em ratos.

Presidente da banca: Prof. Dr. Alberto Goldenberg – UNIFESP

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Adriano Miziara Gonzalez - UNIFESP

Profa. Dra. Ana Iochabel Soares Moretti - FMUSP

Prof. Dr. André de Moricz - FCMSCSP

Prof. Dr. Eliézer Silva – HIAE / UNIFESP

Prof. Dr. José Francisco de Mattos Farah – IAMSPE / UNIFESP

Prof. Dr. Tércio de Campos – FCMSCSP / FMUSP

v

Dedicatória

A Deus, por me permitir compartilhar com minha família e amigos

momentos tão especiais na minha vida, como este…

Ao meu Pai, por me ensinar como um Homem correto deve ser. Pelo

exemplo que pretendo seguir durante toda a minha vida. Pelo apoio em tudo o

que faço. Pelo amor em qualquer circunstância. Pelos conselhos sábios e sempre

sinceros. Por ter proporcionado e orientado meu caminho até este momento…

À minha Mãe, por ter me dado sempre mais do que podia. Por sua

dedicação e seu eterno amor incondicional. Pela sua alegria de viver e confiança

em todas as minhas ações. Por ter me dado a vida e cuidado dela desde então…

À minha esposa Ckarmit, a quem eu Amo. Por ser a maior

companheira do mundo. Pela sua compreensão, determinação e inteligência.

Pela grande melhora na minha vida, desde o dia que a conheci. Por ser uma

ótima mãe e por ter nos dado a maior dádiva que é nosso filho.

Ao meu filho Patrick, que me abastece de energia a cada sorriso

e que me surpreende a cada dia, quando eu achava que não era possível

felicidade maior.

vi

Agradecimento Especial

O desenvolvimento deste trabalho contou com o suporte financeiro oferecido

pelo Programa de Pós-Graduação da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica

da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina.

vii

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Alberto Goldenberg, pela orientação e pela paciência. Pela confiança

e oportunidade de me ensinar os princípios de um médico íntegro e de sucesso.

Ao Prof. Dr. Delcio Matos, pelo acolhimento, ensino e incentivo. Por mostrar o

real valor da dedicação pela Ciência. Pela oportunidade de desfrutar de sua

privilegiada inteligência.

Ao Prof. Dr. Gaspar de Jesus Lopes Filho, por ter me ensinado os primeiros

passos da vida acadêmica e pelo apoio na Disciplina de Gastroenterologia

Cirúrgica da UNIFESP.

Ao Prof. Dr. Saul Goldenberg, pela oportunidade de vivenciar a vida de um

Grande Pesquisador e sua intensa dedicação à vida científica. Pelos muitos

ensinamentos durante minha participação da Acta Cirúrgica Brasileira.

Ao Prof. Dr. Fernando Augusto Mardiros Herbella Fernandes, por seu brilhantismo

acadêmico e amizade em todos estes anos de Escola Paulista de Medicina.

Aos Profs. Drs. Edson José Lobo, José Francisco de Mattos Farah, Sarhan

Sidney Saad, José Carlos del Grande, Milton Scalabrini, Antonio Figueira (in

memoriam) e demais professores da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica da

UNIFESP, pelos ensinamentos, amizade e pelo auxílio em minha formação

cirúrgica.

À Dra. Ana Iochabel Moretti, pela ajuda fundamental da realização desta tese.

Pelos ensinamentos do modelo experimental. Pela dedicação e honestidade. Pelo

exemplo de como uma verdadeira pesquisadora trabalha com amor e afinco.

Ao Prof. Dr. Heraldo Possolo de Souza, Prof. Dr. Irineu Tadeu Velasco, do

Laboratório de Emergências Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade

de São Paulo, pelo acolhimento em seu avançado e renomado laboratório de

pesquisas.

viii

Aos meus colegas e mais que tudo amigos: Prof. Dr. Su Bong Kim, Prof. Dr.

Adriano Miziara Gonzalez, Prof. Dr. Marcelo de Moura Linhares, Dr. Elesiário

Marques Caetano, Dr. Celso Cukier, pelo exemplo, ensinamentos e pela

agradável convivência na vida universitária.

Ao Dr. Franz Robert Apodaca-Torrez, pela amizade e co-orientação neste estudo.

Ao Prof. Dr. Constantino José Fernandes Júnior, pela idéia inicial deste estudo.

Ao Dr. Antonio Luiz de Vasconcellos Macedo, pelos preciosos ensinamentos de

uma medicina de alto padrão e de excelência. Por sua ilibada conduta ética. Pela

oportunidade de acompanhar a dedicação absoluta de um Grande Cirurgião.

Ao Dr. Marcos Belotto, pela parceria e determinação na busca de nossos

objetivos e conquistas

Ao Dr. Wagner Marcondes, pelos conselhos, inteligência e amizade. Pela

confiança e pelos bons momentos que passamos nestes últimos 15 anos.

À Profa. Dra. Thaís Minetti, pelo auxílio no estudo estatístico e análise dos

resultados.

A todos os funcionários e amigos do Laboratório de Investigação Médica

(LIM/51) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo, pelo apoio e profissionalismo.

Aos colegas e amigos da Unidade Perdizes-Higienópolis do Hospital Israelita

Albert Einstein pelo companheirismo e pelo espírito de inovação e de trabalho

em equipe.

A todos os colegas da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica da Escola

Paulista de Medicina – UNIFESP, pelo intenso e prazeroso convívio durante

todos estes anos.

À Diretoria e equipe médica do Hospital Samaritano, Hospital Israelita Albert

Einstein e Hospital Paulistano, pelo ótimo ambiente de trabalho que me

incentivou e possibilitou alcançar este momento.

ix

À equipe do Programa de Pós-graduação da Disciplina de Gastroenterologia

Cirúrgica, em especial à Mônica Noleto e Claudia Joanete, pelo suporte e

dedicação.

À gloriosa Escola Paulista de Medicina, pela honra de fazer parte desta família,

desde o primeiro ano da faculdade.

x

"Rir é arriscar parecer tolo... Chorar é arriscar parecer sentimental...

Tentar alcançar alguém é arriscar envolvimento... Expor sentimentos é arriscar rejeição...

Expor seus sonhos perante a multidão é arriscar parecer ridículo...

Amar é arriscar não ser amado de volta... Seguir adiante face a probabilidades irresistíveis,

é arriscar ao fracasso... E APENAS UMA PESSOA QUE CORRE RISCOS É LIVRE."

(Alexander Lowem)

xi

SUMÁRIO

Dedicatória...................................................................................................... v Agradecimentos.............................................................................................. vi Listas.............................................................................................................. xiii Resumo........................................................................................................... xix 1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 1 1.2 Objetivo..................................................................................................... 8 2. MÉTODOS.................................................................................................. 9 2.1 Amostra..................................................................................................... 10 2.2 Indução da pancreatite.............................................................................. 11 2.3 Delineamento do estudo........................................................................... 15 2.3.1 Tratamento com Etil-piruvato................................................................. 16 2.3.2 Grupos………………………………………………….…………………...… 16 2.4 Análise bioquímica………………….………………………………………..… 18 2.4.1 Quantificação de Citocinas………………..……………………………....... 19 2.4.2 Malondialdeído (MDA) ou TBARS….......………………………………..... 20 2.4.3 Quantificação da produção de NO - Óxido Nítrico………….……………. 20 2.4.4 Dosagem de Mieloperoxidase (MPO)..............………………....………... 20 2.4.5 Zimografia - Atividade de Metaloproteinases, MMPs 2 e 9 no Pulmão.. 21 2.4.6 Western Blotting – Expressão Protéica de HSP70……...……....…..….. 22 2.5 Análise de Sobrevivência.......................................................................... 22 2.6 Análise estatística..................................................................................... 23 3. RESULTADOS........................................................................................... 24 3.1 Análise dos parâmetros bioquímicos........................................................ 26 3.1.1 Interleucina-1......................................................................................... 26 3.1.2 Interleucina-6………………………………………………………………..... 27 3.1.3 Interleucina-10……………………………………………………………...... 28 3.1.4 Fator de necrose tumoral (TNF)…........……………...………………….... 29 3.1.5 Malondialdeído - Peroxidação lipídica (MDA)……...…………………….. 30 3.1.6 Óxido Nítrico………………………………………………………………….. 31

xii

3.1.7 Mieloperoxidase (MPO)……...…………………………………………….... 32 3.1.8 Metaloproteinase 2 (MMP-2)…..........……………………………………... 33 3.1.9 Metaloproteinase 9 (MMP-9)…...…………………………………………... 34 3.1.10 Proteína de choque térmico – HSP 70…………………………………... 36 3.2 Análise descritiva............................................……………………………... 37 3.3 Análise de sobrevivência.......................................................................... 37 4. DISCUSSÃO............................................................................................... 39 5. CONCLUSÃO............................................................................................. 57 6. ANEXOS..................................................................................................... 59 7. REFERÊNCIAS.......................................................................................... 66 Abstract Bibliografia consultada

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Fórmula orgânica do Etil-piruvato................................................. 5

Figura 2 – Mecanismo de Ação do etil-piruvato na redução do quadro inflamatório sistêmico da sepse..................................................... 6

Figura 3 – Amostra da linhagem Wistar.......................................................... 11

Figura 4 – Anatomia pancreática do rato........................................................ 12

Figura 5 – Ducto pancreático cateterizado por punção trans-duodenal..... 13

Figura 6 – Anatomia cirúrgica do procedimento............................................ 14

Figura 7 – Solução de etil-piruvato.................................................................. 16

Figura 8 – Coleta de parênquima pulmonar para estudo inflamatório........ 17

Figura 9 – Infusão do taurocolato de sódio após clampeamento do ducto biliar com desenvolvimento imediato de necrose pancreática.. 18

Figura 10 – Necrose pancreática evidenciada no momento da eutanásia... 25

Figura 11 – Boxplot da concentração de IL-1 nos grupos CT e EP.............. 26

Figura 12 – Boxplot da concentração de IL-6 nos grupos CT e EP Zimografia de MMP-2 e MMP-9..................................................... 27

Figura 13 – Boxplot da concentração de IL-10 nos grupos CT e EP Zimografia da HSP-70.................................................................... 28

Figura 14 – Boxplot da concentração de TNF nos grupos CT e EP............. 29

Figura 15 – Boxplot da concentração de MDA nos grupos CT e EP............ 30

Figura 16 – Boxplot da concentração de nitrito nos grupos CT e EP........... 31

Figura 17 – Boxplot da concentração de MPO nos grupos CT e EP........... 32

Figura 18 – Boxplot da concentração de MMP-2 nos grupos CT e EP........ 33

Figura 19 – Atividade de MMP-2 em gel de zimografia ou membrana de Western Blot..................................................................................... 34

Figura 20 – Boxplot da concentração de MMP-9 nos grupos CT e EP........ 35

Figura 21 – Atividade de MMP-9 em gel de zimografia ou membrana de Western Blot..................................................................................... 35

Figura 22 – Boxplot da concentração de HSP 70 nos grupos CT e EP........ 36

Figura 23 – Atividade de HSP 70 em gel de zimografia ou membrana de Western Blot..................................................................................... 37

Figura 24 – Curva de Kaplan-Meier para dados de óbitos............................. 38

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Análise descritiva dos valores de IL-1........................................ 26

Tabela 2 – Análise descritiva dos valores de IL-6......................................... 27

Tabela 3 – Análise descritiva dos valores de IL-10...................................... 28

Tabela 4 – Análise descritiva dos valores de TNF....................................... 29

Tabela 5 – Análise descritiva dos valores de MDA...................................... 30

Tabela 6 – Análise descritiva dos valores de Óxido Nítrico........................ 31

Tabela 7 – Análise descritiva dos valores de MPO...................................... 32

Tabela 8 – Análise descritiva dos valores de MMP-2.................................. 33

Tabela 9 – Análise descritiva dos valores de MMP-9.................................. 34

Tabela 10 – Análise descritiva dos valores de HSP 70................................. 36

Tabela 11 – Comparação das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, em dez dias, de acordo com os grupos de animais................... 38

xv

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Critérios da SIRS.......................................................................... 2

Quadro 2 – Resumo dos efeitos farmacológicos do etil-piruvato................ 5

Quadro 3 – Resultados de estudos experimentais recentes do Etil-piruvato sobre distintas condições clínicas induzidas.............. 44

Quadro 4 – Correlação da IL-6 com o grau de severidade e prognóstico da pancreatite aguda.................................................................... 47

Quadro 5 – Efeitos protetores da HSP70 na pancreatite aguda................. 54

xvi

LISTA DE SÍMBOLOS

°C graus Celsius < menor que g grama Kg kilograma mg miligrama min minuto ml mililitro mM milimolar mm3 milímetros cúbicos mmHg milímetros de mercúrio NaCl cloreto de sódio nm nanômetro nM nanomolar U unidade µM micromolar

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATP Adenosina trifosfatada Ca2+ íon cálcio COX ciclooxigenase CT Controle DC Célula dendrítica DO Densidade óptica dp Desvio padrão ELISA Ensaio imunoenzimático EP etil-piruvato EPM Escola Paulista de Medicina EROS Espécies reativas de oxigênio et al. e outros H2O2 Peróxido de hidrogênio HC-FMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo HCl Ácido clorídrico HMGB-1 High Mobility Group Box-1 HSPs Heat Shock Proteins - proteínas ativadas por choque térmico IL Interleucina IMOS Insuficiência de múltiplos órgãos e sistemas Ipm Inspirações por minuto LIM Laboratório de Investigação Médica LPA Lesão pulmonar aguda LPS Lipopolissacarídeo MDA Malondialdeído MEC Matriz extracelular Mg2+ íon magnésio MMP Metaloproteinase de matriz MPO Mieloperoxidase NaCl Cloreto de sódio NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintetase

xviii

PA Pancreatite aguda Pb Pares de bases PBS Phosphate-buffered saline - tampão salina fosfato pCO2 Pressão parcial de Dióxido de carbono pH Co-logarítimo da concentração hidrogeniônica de uma solução PMN Polimorfonuclear PMSF Phenylmethylsufonil fluoride SDRA Acute Respiratory Distress Syndrome - síndrome do

desconforto respiratório agudo SDS Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel electrophoresis -

eletroforese em gel de poliacrilamida, tendo como agente denaturante sulfato dodecil sódico

SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome - síndrome da resposta inflamatória sistêmica

TBARS Thiobarbituric Reactive Substances - substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico

TBST Tris-Buffered Saline Tween 20 - tampão salina Tris-HCl suplementado com Tween 20

TEMED Tetrametiletilenonodiamino TGF Transforming Growth Factor TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinases - inibidor tecidual de

metaloproteinases TNF Tumor Necrosis Factor - fator de necrose tumoral tPA Ativador tecidual de plasminogênio UNIFESP Universidade Federal de São Paulo Zn2+ íon zinco

xix

RESUMO

MATONE J. Efeitos do etil-piruvato no tratamento da resposta inflamatória da lesão pulmonar na pancreatite aguda necrosante induzida em ratos. [tese]. São Paulo: Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo; 2011.

INTRODUÇÃO: A pancreatite aguda necrosante é caracterizada por alterações hemodinâmicas e resposta inflamatória sistêmica. A lesão pulmonar aguda é a principal causa da alta morbi-mortalidade relacionada à afecção, sendo decorrente da cascata inflamatória sistêmica subsequente à lesão pancreática. O etil-piruvato, com seu papel fundamental no metabolismo intermediário com importante ação de redução de radicais livres e espécies reativas ao oxigênio, vem sendo utilizado em estudos científicos como agente antiinflamatório. OBJETIVO: Avaliar o efeito da solução de etil-piruvato na resposta inflamatória pulmonar e sua influência na letalidade da pancreatite aguda necrosante. MÉTODOS: Foram utilizados 40 ratos Wistar machos, com peso entre 270 e 330 gramas. A pancreatite aguda foi induzida pela injeção intraductal de taurocolato de sódio a 2,5% na dose de 0,1 ml/100g de solução. Os animais foram distribuídos em dois grupos de 10: grupo Controle - CT (tratados com solução de ringer simples - 50 mg/Kg/dose por via intraperitoneal) e grupo EP (tratados com 50 mg/Kg/dose de solução de 40mM ringer etil-piruvato, por via intraperitoneal), após 3 e 6 horas da indução da PA. Após 8 horas da indução, foram submetidos à eutanásia para coleta de parênquima pulmonar para análise bioquímica, composta por: interleucinas, mieloperoxidase (MPO), malondialdeído (MDA), óxido nítrico, metaloproteinases e proteínas de choque térmico. Na segunda etapa do experimento, outros 20 animais foram aleatoriamente alocados em dois grupos de 10 (CT e EP), seguindo a mesma sequência de tratamento, para análise de sobrevivência, em 10 dias. Na análise estatística, utilizou-se utilizou-se o teste t de Student com significância para p<0,05. RESULTADOS: Os níveis de MDA, MPO com índice de infiltração neutrofílica, proteínas de choque térmico e óxido nítrico no tecido pulmonar não sofreram alterações significantes. Entre as citocinas, os níveis de IL-1B, IL-10 e TNF-a não foram diferentes entre os grupos. A dosagem de IL-6 apresentou redução significante no grupo tratado com o EP. Da mesma forma, a dosagem de MMP-2 foi significantemente reduzida no grupo tratado pelo EP. A MMP-9 não teve alterações significantes. Na análise de sobrevivência, o grupo EP apresentou sobrevivência significantemente maior. CONCLUSÕES: O etil-piruvato reduziu a resposta inflamatória pulmonar e aumentou a sobrevivência dos animais.

Descritores: 1. Pancreatite aguda necrosante. 2. Ratos. 3. Piruvato, 4. Inflamação.

1. INTRODUÇÃO

Introdução

2

Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e tratamento, a

pancreatite aguda necrosante continua sendo um desafio para os cirurgiões,

clínicos, intensivistas e radiologistas, sendo sua incidência estimada em 10% a

20% de todas as pancreatites, com índices de mortalidade entre 10% a 25%

(Tonsi et al., 2009). Apesar de seu reconhecimento anatomopatológico desde

1889 e diversas tentativas de explicação etiopatogênica da doença desde então,

a doença permanece bastante controversa em todos os seus aspectos. A

abordagem inicial é determinante para a evolução do quadro clínico.

Em cerca de 80% dos casos, a pancreatite aguda é leve e ocorre

resolução do quadro sem o desenvolvimento de necrose pancreática. Todavia,

parte dos casos apresenta complicações associadas, com altos índices de

morbidade e mortalidade. A incidência de quadros de pancreatite aguda

necrosante manteve-se estável nos últimos anos, apesar dos avanços da

medicina atual (Frossard et al., 2008).

A definição e classificação da gravidade do quadro de PA estão

relacionadas à presença da Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica

(SIRS) persistente e/ou falência orgânica associada (Bollen et al., 2008). O

quadro de SIRS é definido pela presença de dois ou mais critérios por 48 horas

(Quadro 1).

Quadro 1 – SIRS: dois ou mais critérios presentes, por 48 horas

− Freqüência cardíaca > 90 bpm

− Temperatura retal <36°C ou > 38°C

− Leucócitos < 4.000 ou > 12.000 / mm3

− Freqüência respiratória > 20 ipm

− pCO2 > 32 mmHg

Diversas classificações e parâmetros têm sido utilizados para os critérios de gravidade do quadro: Ransom, Apache II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation), SOFA (Sequential Organ Failure Assesment),

Introdução

3

MODS (Multiple Organ Dysfunction Score) e escala de Marshall de falência orgânica (Tonsi et al., 2009), além dos critérios de Atlanta (Bradley, 1994; Bollen et al., 2008).

A Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA), decorrente desta resposta inflamatória sistêmica, é a principal causa de óbito na pancreatite aguda grave (Muhs et al., 2003). Estima-se que cerca de 75% dos casos de PA apresentem comprometimento pulmonar, desde disfunção ventilatória leve, até insuficiência ventilatória grave (de Campos et al., 2008). Assim, a identificação precoce e reversão da lesão pulmonar aguda (LPA) é de grande importância clínica.

O comprometimento sistêmico da doença é resultado do estresse oxidativo e da indução de citoquinas pró-inflamatórias, sendo as principais: interleucina-1b, interleucina-6 e o fator de necrose tumoral (Norman et al., 1995, 1997; Norman, 1998). Os mediadores inflamatórios promovem uma resposta sistêmica inflamatória, muitas vezes associada à falência orgânica e, inicialmente, na ausência de infecção (Lindkvist et al., 2004). A infecção ocorre em cerca de 30% a 40% dos casos de pancreatite necrosante, resultando em aumento significativo da letalidade (Beger et al., 1997; Tonsi et al., 2009).

A partir do desencadeamento da resposta inflamatória no pâncreas, células e mediadores pró-inflamatórios, tais como neutrófilos, metaloproteinases (MMP) e interleucinas são responsáveis pela disseminação da inflamação para outros órgãos. As MMPs apresentam papel fundamental na resposta inflamatória pulmonar (Muhs et al., 2003). Esta cascata inflamatória é a principal responsável pela alta morbi-mortalidade do quadro de pancreatite aguda necrosante (Frossard et al., 2008; Tonsi et al., 2009).

Mais recentemente, a dosagem de metaloproteinases, proteínas de choque térmico (Heat Shock protein), dosagem da mieloperoxidase com análise de infiltração neutrofílica, dosagem de óxido nítrico pelo seu papel no aumento da permeabilidade vascular e estudo de peroxidação lipídica pela dosagem do malondialdeído em tecido pulmonar tem sido preconizados para avaliação de resposta inflamatória aguda pulmonar na pancreatite aguda necrosante experimental (de Campos et al., 2008; Moretti et al., 2009).

Introdução

4

Apesar de muitos estudos sobre esta doença, não há tratamento

específico para a pancreatite aguda necrosante. Assim, o suporte clínico torna-

se o único recurso a ser empregado (Yadav, Lowenfels, 2006). Nas formas leves

da doença, além do tratamento do fator etiológico, a terapia de suporte inclui

reposição volêmica, analgésicos, oxigenoterapia e medicação sintomática, além

de jejum oral para repouso glandular (Tonsi et al., 2009). Os episódios de

pancreatite aguda necrosante, no entanto, devem receber abordagem

terapêutica por equipe multidisciplinar, sendo em alguns casos, indicada a

abordagem cirúrgica. Apesar dos esforços em instituir-se o tratamento mais

apropriado, os índices de letalidade dos quadros severos não foram alterados

significantemente, nas últimas duas décadas (Tonsi et al., 2009). A reposição

volêmica e monitorização intensiva, suporte nutricional e controle da necrose

pancreática são fundamentais.

O tratamento específico da cascata inflamatória, evitando-se o

desenvolvimento da SIRS tem sido motivo de estudos experimentais prévios. As

principais substâncias estudadas foram: análogos da somatostatina (Salem et

al., 2003), inibidores da bomba de prótons (Montagnini et al., 1995), solução

hipertônica - NaCl 7.5% (Yada-langui et al., 2000; Machado et al., 2006; Moretti

et al., 2009), antioxidantes (Abdo et al., 1998), inibidores da ciclo-oxigenase (de

Almeida et al., 2006, Matheus et al., 2007), octreotide (Cavallini, Frulloni, 2001),

antiproteases (Seta et al., 2004), antagonistas do receptor do fator de ativação

plaquetário (Jancar et al., 1995; Souza et al., 2001, Johnson et al., 2001),

pentoxifilina (Michetti et al., 2003; de Campos et al., 2008, Matheus et al., 2009)

e as estatinas (Almeida et al., 2008).

O etil-piruvato (Figura 1), produto da reação de catalização da enzima

piruvato-quinase na via glicolítica, é um antioxidante intracelular endógeno e

redutor de radicais livres. Em condições anaeróbias, o piruvato produzido é

reduzido para formar lactato e oxidado formando adenina nicotinamida

dinucleotideo (NAD). Em condições aeróbias, o piruvato é oxidado para formar

acetil coenzima-A. Desse modo, o piruvato tem importante papel no metabolismo

intermediário (Fink MP et al., 2007).

Introdução

5

Figura 1 – Fórmula orgânica do Etil-piruvato.

Kao e Fink (2010) revisaram os estudos com o etil-piruvato no

controle de diversas condições clínicas, incluindo a SIRS decorrente do quadro

de sepse. O quadro 2 mostra os efeitos farmacológicos do etil-piruvato,

evidenciados em pesquisas prévias. A figura 2 explica o mecanismo de ação do

EP no controle e modulação da cascata inflamatória resultante da inflamação

sistêmica séptica.

Quadro 2 – Resumo dos efeitos farmacológicos do etil-piruvato (Kao, Fink, 2010)

EFEITO FARMACOLÓGICO MECANISMO PROPOSTO

Inibição da lesão celular mediada por redução

• Redutor de H2O2

Inibição da inflamação • Diminuição do NF-kB

Citoproteção • Aumento da produção de ATP • Redutor de EROs

Inibição da apoptose • Redutor de EROs

Inibição do crescimento de célula tumoral

• Aumento da apoptose de células tumorais • Melhora da imunidade anti-neoplásica

Introdução

6

Figura 2 – Mecanismo de ação do etil-piruvato na redução do quadro inflamatório sistêmico da sepse (Shang et al., 2009).

Poucos estudos avaliaram os efeitos do etil-piruvato na pancreatite

aguda. Yang et al. (2004) observaram melhora do quadro inflamatório no

parênquima pancreático e no lavado bronco-alveolar. Cheng et al. (2007)

demonstraram redução da proteína HMGB-1, que é um mediador inflamatório

tardio de alta letalidade, no grupo tratado com solução de etil-piruvato.

Observaram também melhora da sobrevida e dos níveis séricos de interleucinas

1 e 6, além do TNF. Yang et al. (2008) mostraram redução do processo

inflamatório decorrente da pancreatite aguda necrosante, com redução do

HMGB-1 e melhora histológica de tecido pulmonar. Outros dois estudos

MACRÓFAGOHMGB1

ETIL‐PIRUVATO

LPS

ENTERÓCITOS

CÉLULA ENDOTELIAL

MACRÓFAGO

↑ Permeabilidade vascular

Translocação bacteriana

↑ adesão de neutrófilos

Regulação de

fibrinólise

↑NO

IL1‐B

TNF

IL‐6

IL‐8

Introdução

7

evidenciaram efeitos benéficos do EP no parênquima hepático e em mucosa

intestinal de ratos submetidos à indução de pancreatite aguda (Yang et al.,

2009; Luan et al., 2010)

Neste contexto, suspeitou-se que o tratamento com o etil-piruvato

possa reduzir a resposta inflamatória da lesão pulmonar aguda que ocorre na

pancreatite aguda necrosante. Não foi encontrada publicação com análise

abrangente do efeito do EP na resposta inflamatória da lesão pulmonar,

decorrente de pancreatite aguda necrosante.

Introdução

8

1.1 Objetivo

Estudar os efeitos da solução de etil-piruvato no tratamento da

resposta inflamatória da lesão pulmonar aguda e sua influência na letalidade da

pancreatite aguda necrosante induzida em ratos.

2. MÉTODOS

Métodos

10

A pesquisa foi realizada em parceria entre o Programa de Pós-

graduação em Gastroenterologia Cirúrgica da UNIFESP e a Disciplina de

Medicina de Urgência da USP (Laboratório LIM51 – FMUSP), para utilização de

seu avançado laboratório experimental e técnica já reconhecida de análise

bioquímica e de biologia molecular.

O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (Anexo 1).

2.1 Amostra

Foram utilizados 80 ratos neste estudo. A padronização do

procedimento cirúrgico foi realizada inicialmente, e alguns animais morreram no

período peri-operatório, sendo então excluídos da pesquisa. Deste total, foram

incluídos no estudo 40 ratos machos Wistar pesando entre 270 e 330g (Figura

3), com idade aproximada de três meses, provenientes do biotério central da

Universidade de São Paulo.

Os animais de experimentação eram submetidos aos procedimentos

propostos no laboratório LIM 51, da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo, obedecendo às normas técnicas e direitos internacionais de pesquisa

em animais, do Comitê de Ética do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

Os animais foram mantidos em gaiolas com até quatro animais cada,

em temperatura ambiente, com acesso a ração específica e água, ad libitum.

Foram deixados no ambiente de experimentação por período de sete dias, para

melhor aclimatação e redução de fatores de estresse. Permaneceram em jejum

oral por 12 horas previamente ao procedimento cirúrgico. Os procedimentos

cirúrgicos foram realizados de forma asséptica e sob anestesia geral.

Métodos

11

Figura 3 – Amostra da linhagem Wistar, peso entre 270g e 330g.

2.2 Indução de pancreatite

Os ratos foram anestesiados com infusão intraperitoneal de cloridrato

de cetamina (Parke-Daves) na dose de 10 mg/Kg de peso e xilasina (Bayer), um

agonista α2-adrenérgico com propriedades sedativas e analgésicas, na dose de

8 mg/Kg de peso (Kohn et al., 1997). Foram mantidos sob respiração

espontânea e posicionados cuidadosamente sob prancha cirúrgica. Realizou-se

tricotomia seguida de antissepsia com solução de álcool iodado e assepsia com

campos cirúrgicos específicos ao procedimento.

Métodos

12

Realizava-se laparotomia mediana longitudinal e exteriorizava-se o

arco duodenal para identificação do parênquima pancreático e da papila

duodenal, conforme mostra a figura 4. O ducto biliar do rato era então

cateterizado através da parede duodenal utilizando-se um tubo de polietileno PE-

50 (Biotecno) (Figuras 5 e 6). A pancreatite aguda foi induzida pela injeção

retrógrada de 0,1 ml/100g de solução de taurocolato de sódio (Sigma-Aldrich©

Co., Saint Louis, MO, EUA) a 2,5%, com clampeamento proximal do ducto bílio-

pancreático para evitar refluxo intra-hepático da substância injetada. Ao término

da infusão, o cateter era retirado e o orifício duodenal de cateterização era ocluído

com sutura sero-muscular de nylon 5-0. A parede abdominal e a pele foram

suturadas com Mononylon 4-0. Os animais eram colocados novamente nas

gaiolas com oferta hídrica ad libitum e observados.

Figura 4 – Anatomia pancreática do Rato (modificado de Waynforth e Flecknell, 2004).

Métodos

13

Figura 5 – Ducto pancreático cateterizado por punção trans-duodenal.

Métodos

14

Figura 6 – Anatomia cirúrgica do procedimento - 1.ducto hepático; 2. Pinça ocluindo ducto hepático; 3. Ducto bilio-pancreático; 4. Agulha de punção, inserida através da duodenotomia; 5. Fio de reparo em parede duodenal (Modificado de Tonini et al., 1993).

Métodos

15

2.3 Delineamento do Estudo

40 RATOS, 3 MESES, 270‐330 GRAMAS, MACHOS, WISTAR

Observação para análise de sobrevivência

por 10 dias

GRUPO EP (n=20) TRATAMENTO

RINGER‐ETIL‐PIRUVATO

GRUPO CT (n=20) CONTROLE

RINGER‐SIMPLES

INFUSÃO INTRAPERITONEAL de EP ou RINGER SIMPLES após 3h da indução – 50 mg/kg/dose

2 HORAS APÓS

EUTANÁSIA APÓS COLETA DE PARÊNQUIMA PULMONAR

ANESTESIA COM CETAMINA E XILAZINA +

ANTISSEPSIA

CONGELAMENTO DE MATERIAL PARA ESTUDO

INFLAMATÓRIO

INDUÇÃO DE PANCREATITE AGUDA NECROSANTE TAUROCOLATO DE SÓDIO 2,5%, INTRA‐

PANCREÁTICO

SEGUNDA INFUSÃO INTRAPERITONEAL APÓS 6 HORAS DA INDUÇÃO

Métodos

16

2.3.1 Tratamento com Etil-piruvato

A solução de etil-piruvato (Figura 7) era preparada dissolvendo-se

este composto em solução de Ringer simples, comercialmente disponível. A

solução preparada resultante era composta por: 28mM de etil-piruvato, 130 mM

NaCl, 4 mM KCl, 2,7 mM CaCl2 e ph=7,0.

Figura 7 – Solução de etil-piruvato (Sigma-Aldrich© Co.,Saint Louis, MO, EUA).

2.3.2 Grupos

Os animais foram, inicialmente, distribuídos em dois grupos

uniformes, aleatoriamente, cada um contendo 10 animais. O grupo EP recebeu o

tratamento com a solução de Ringer-etil-piruvato, enquanto que o grupo CT

sendo o grupo controle, recebeu mesma dosagem de solução de Ringer

simples. Os animais do Grupo EP foram submetidos à infusão intraperitoneal

com solução de Ringer etil-piruvato 28 mM, 50 mg/kg/dose em bolus, iniciado

três horas após a indução da pancreatite aguda, repetindo a mesma dose após

Métodos

17

três horas. Os animais do Grupo CT, receberam infusão intraperitoneal de

solução de Ringer-simples em dose e intervalos idênticos, também seguindo à

indução da pancreatite aguda.

Duas horas após o término do período de tratamento, os animais foram

novamente anestesiados e com o mesmo preparo do procedimento inicial, foram

submetidos à laparotomia e toracotomia, para coleta do parênquima pulmonar a

ser analisado (Figura 8). Constatava-se a necrose pancreática induzida (Figura 9).

Realizou-se secção dos grandes vasos abdominais (aorta e cava

inferior). Os animais foram perfundidos com solução fisiológica (NaCl 0,9%), pelo

ventrículo direito, utilizando-se um jelco 22 G (0,9 x 25 mm). Os pulmões eram

removidos imediatamente e congelados para avaliação inflamatória tecidual.

Figura 8 – Coleta de parênquima pulmonar para estudo inflamatório.

Métodos

18

Figura 9 – Infusão do taurocolato de sódio após clampeamento do ducto biliar com desenvolvimento imediato de necrose pancreática.

Os animais foram submetidos à eutanásia com aprofundamento da

anestesia pela superdosagem de cetamina e xilazina intra-cardíaco, após a

remoção do pulmão.

2.4 Análise bioquímica

Foram estudados os seguintes parâmetros bioquímicos, com o

objetivo de avaliar o efeito do etil-piruvato na resposta inflamatória pulmonar da

pancreatite aguda:

− A relação no tecido pulmonar dos níveis de citocinas;

− Efeitos do EP na taxa de peroxidação lipídica pela dosagem do

malondialdeído (MDA)

− Avaliação do óxido nítrico pulmonar

Métodos

19

− Grau de resposta inflamatória em órgão alvo (pulmão) e se há redução com o

uso de solução de etil-pruvato, pela dosagem da mieloperoxidase como

índice de infiltração neutrofílica no tecido pulmonar;

− A alteração da resposta inflamatória nos animais tratados com solução de etil-

piruvato, analisando a expressão e a atividade da metaloproteinase 2 e 9 no

tecido pulmonar por zimografia;

− Modulação na expressão da HSP 70 no pulmão, pelo método de Western-

blotting com uso de solução de etil-piruvato.

2.4.1 Quantificação de Citocinas

As citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 foram dosadas a partir de

homogenato de tecido pulmonar. Aproximadamente 100 mg de tecido foram

homogeneizados em 1ml de solução de RIPA (100mM de Tris-HCl pH 7.5, 1%

de desoxicolato de sódio, 1% de NP40, 150mM de NaCl, 0,1% de SDS). O

material foi centrifugado a 4.000g por 20 minutos. As medidas foram

normalizadas pela concentração de proteínas na solução (Método de Bradford–

Biorad). As dosagens foram feitas por ELISA, com kit da R&D Systems

(Minneapolis, MN, USA). Placas de 96 poços foram adsorvidas com anticorpo de

captura monoclonal anti-citocina de rato, diluído em PBS por 12 horas. Em

seguida, as placas foram lavadas com solução de PBS contendo 0,05% de

Tween 20. Os sítios inespecíficos foram bloqueados com PBS contendo 1% de

BSA (soro albumina bovina – Sigma) por uma hora. A placa foi lavada para

remoção da solução de bloqueio. Em seguida, as amostras e os padrões foram

colocados nos respectivos poços e incubados por duas horas. Ao final do

período, as placas foram lavadas. Adicionou-se o anticorpo de detecção,

conjugado a peroxidase, e incubou-se por duas horas. As placas foram lavadas

novamente. Ao final das lavagens, adicionou-se o substrato da peroxidase,

tetrametilbenzidina, deixando reagir por 15 a 20 minutos. A reação peroxidase-

tetrametilbenzidina, gerou cor azul. Ao final da incubação, adicionou-se solução

de parada (H2SO4 – 2N), obtendo-se coloração amarela. As citocinas foram

quantificadas pela leitura da absorbância (450nm) e os resultados foram

Métodos

20

expressos em picogramas de antígeno por miligrama de proteína. Os resultados

representam a média de 10 animais por grupo.

2.4.2 Malondialdeído (MDA) ou TBARS

A quantificação do malondialdeído foi utilizada para determinar a taxa

de peroxidação lipídica. Fragmentos de 100 mg do tecido pulmonar foram

pulverizados em nitrogênio líquido e homogeneizados em 1 ml de KCl 1,15%. O

material permaneceu sob agitação, a 4°C durante uma hora. Em seguida, as

amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 20 minutos a 4°C, coletando-se

o sobrenadante. Para a reação, adicionou-se a 100 µl de amostra, 100 µl SDS

(duodecil sulfato de sódio) a 8,1%, 750 µl de ácido acético a 20%, e 750 µl de

ácido tiobarbitúrico (TBA) a 0,8%. A mistura foi aquecida a 95°C por 40 minutos.

A solução foi centrifugada e medida a absorbância a 532 nm. Os resultados

representam a média de 10 animais por grupo experimental.

2.4.3 Quantificação da produção de NO – Óxido Nítrico

A produção de NO foi quantificada pela reação de Griess. O método

de detecção foi baseado na reação do nitrito com reagente de Griess produzindo

uma reação colorimétrica que foi detectada por absorbância com leitura em

comprimento de onda de 595nm. Para a reação de nitrato, reagiu-se 50 ml da

amostra ou padrão (ou de diluente, para o branco), da solução de trabalho

(solução A: 1% de sulfanilamida em ácido fosfórico a 5%; solução B: 0,1% de

naftil-etilenodiamina em água destilada; misturadas partes iguais das soluções A

e B). Incubou-se por 10 minutos a temperatura ambiente.

2.4.4 Dosagem de Mieloperoxidase (MPO)

A dosagem de mieloperoxidase foi utilizada como índice de infiltração

neutrofílica no tecido pulmonar. Aproximadamente 50 mg de tecido foram

pulverizados em nitrogênio líquido e homogeneizados em 1 ml de solução

contendo tampão MOPS a 10 mM e hexa-decilbrometo (HTAB) 5 mg/ml. Em

seguida, os homogenatos foram centrifugados a 5.000 rpm por 20 minutos a 4ºC

Métodos

21

e o sobrenadante coletado. A reação de MPO consistiu em reagir 20µl da amostra

com 20µl de tetrametilbenzidina 16 mM em DMSO e 140ul de NaPP (80mM

NaH2PO4-H2O, 80 mM Na2HPO4-7 H2O, pH 5.5). Após cinco minutos

adicionou-se 20ul H2O2 a 0,03% em NaPP. Fez-se a leitura óptica em 570 nm.

Os resultados representam a média de 10 animais por grupo experimental.

2.4.5 Zimografia - Atividade de Metaloproteinases, MMPs 2 e 9 no Pulmão

Fragmentos de pulmão pesando, aproximadamente 100 mg, foram

pulverizados em nitrogênio líquido. O material foi homogeneizado em tampão de

lise Triton X-100 (1% Triton X-100, 10% glicerol, 135mM NaCl, 20mM Tris pH

8,0) e centrifugado a 14.000g por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi

coletado, e a concentração de proteínas quantificada pelo método de Bradford

(Bio-Rad). Dez microgramas de proteína foram acrescidas de tampão de

amostra (2% de SDS, 60mM Tris pH 6.8, 30% de glicerol e 0,01% de azul de

bromofenol) e carregadas em gel 10% de poliacrilamida contendo 0,2% de

gelatina. Após a eletroforese, o gel foi lavado em 10 mM de Tris (pH 8.0)

contendo 2.5% de Triton X-100, para remoção do SDS e renaturação das

proteínas. Em seguida, o gel foi incubado em solução tampão reveladora do gel

(50mM de Tris pH 8.8, 5 mM CaCl2, 0,02% NaN3) por 20 horas a 37°C apenas

na solução reveladora. Depois da revelação, o gel foi corado com Coomassie

Brilliant Blue R-250 (Amersham) por quatro horas. Em seguida, foi descorado

em solução de 40% de metanol e 10% de ácido acético glacial em água

destilada. As metaloproteinases foram identificadas como bandas claras de lise

em fundo azul. Nas amostras controles e tratadas, a expressão das proteínas

analisadas foi comparada por densitometria de gel, utilizando-se o programa de

domínio público “Image J”, criado por Wayne Rasband do National Institutes of

Mental Health, NIH, USA. Os resultados representam a média de quatro animais

por grupo experimental observadas nos zimogramas.

Métodos

22

2.4.6 Western Blotting – Expressão Protéica de HSP70

Aproximadamente 100 mg de tecido foram pulverizadas em nitrogênio

líquido. O material foi homogeneizado em tampão de lise RIPA (100 mM de Tris-

HCl pH 7.5, 1% de desoxicolato de sódio, 1% de NP40, 150mM de NaCl, 0.1%

SDS) acrescido de inibidores de proteases (1 mg/ml pepstatina A, 100mM

PMSF). Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 14.000g por 10 minutos

a 4ºC. O sobrenadante foi coletado, e a concentração de proteínas foi

quantificada pelo método de Bradford (Bio-Rad). Quarenta microgramas de

proteínas de cada amostra foram acrescidas de tampão de amostra (2% SDS,

60mM Tris pH 6.8, 5% de mercaptoetanol, e 0,01% de azul de bromofenol) e

submetidas à eletroforese em um sistema SDS-PAGE, gel 10% de poliacrilamida

(1.5M Tris-HCl, 10% SDS, 30% bisacrilamida, 10% de persulfato de amônia e

TEMED). Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana

de nitrocelulose (Bio-Rad) em aparelho semi-dry transfer (Bio-Rad). As

membranas foram incubadas em solução de bloqueio 5% de leite desnatado em

tampão TBST (50 mM de tampão Tris, pH 8,0, 100mM NaCl, 1% Tween 20) por

uma hora a temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas em TBST e

incubadas com o anticorpo primário anti-HSP70 (Santa Cruz Biotecnology)

“overnight” a 4ºC. Posteriormente, as membranas foram incubadas em solução

contendo anticorpo secundário conjugado a peroxidase (1:1000) (Santa Cruz,

Biotecnology) e expostas ao sistema de detecção Super Signal (Pierce). A

expressão da proteína foi comparada por densitometria de gel, utilizando-se o

programa de domínio público “Image J”, criado por Wayne Rasband do National

Institutes of Mental Health, NIH, USA. Os resultados representam a média de

cinco animais por grupo.

2.5 Análise de sobrevivência

Foram utilizados 20 animais para este segmento da pesquisa.

Induziu-se pancreatite aguda em todos e aleatoriamente, os animais foram

Métodos

23

alocados em dois grupos de dez animais cada. Um grupo recebeu tratamento

com ringer-simples e o outro recebeu solução de ringer etil-piruvato.

Os animais foram mantidos em gaiolas e receberam hidratação oral e

ração padronizada, ad libitum. Foram observados durante o período de dez dias,

sem nenhuma intervenção. Foi anotado tempo de sobrevivência em relação à

indução da pancreatite nos dois grupos.

2.6 Análise estatística

Diferenças entre médias de dados contínuos foram testadas

utilizando-se os testes t de Student para amostras independentes (t).

As curvas de sobrevivência para dados de óbitos foram geradas a

partir do método de Kaplan-Meier. As comparações das curvas de sobrevivência

foram realizadas pelo teste de log-rank.

Todas as pré-suposições dos testes foram verificadas.

A probabilidade (p) menor que 0,05 foi considerada para indicar

significância estatística; todos os testes foram bicaudados. Noventa e cinco por

cento de intervalo de confiança (IC) foram calculados em relação a diferença

entre as médias. Toda a análise foi calculada segundo o pacote estatístico

SPSS (Statistical Package for the Social Science) 13.0 para Windows.

3. RESULTADOS

Resultados

25

Os procedimentos cirúrgicos tiveram duração de 20 minutos, em

média. Foi possível identificar a indução da pancreatite aguda necrosante em

todos os animais submetidos à infusão do taurocolato de sódio intra-pancreático.

O aspecto macroscópico do pâncreas observado no momento da re-laparotomia,

realizada após a indução da pancreatite e o tratamento nos dois grupos,

mostrou alterações significativas, como áreas de necrose, focos hemorrágicos e

saponificação de tecido adiposo em todos os grupos.

A figura 10 mostra a pancreatite aguda necrosante induzida pelo

taurocolato de sódio.

Figura 10 – Necrose pancreática evidenciada no momento da eutanásia.

Resultados

26

Os seguintes resultados são provenientes da comparação entre os

dois grupos: o grupo que recebeu ringer-etil-piruvato (EP) e o grupo controle

(CT), que recebeu ringer-simples.

3.1 Análise dos parâmetros bioquímicos

3.1.1 IL-1

A tabela 1 mostra a análise descritiva dos valores de IL-1, após o

tratamento com ringer-etil-piruvato ou ringer-simples. A figura 11 ilustra estes

valores.

Tabela 1 – Análise descritiva dos valores de IL-1

Grupo Média Desvio-padrão Mediana Mínimo Máximo

CT 86,50 95,18 48,99 29,04 348,19

EP 76,25 41,01 63,72 46,29 187,62

Figura 11 – Boxplot da concentração de IL-1 nos grupos CT e EP.

Resultados

27

Não houve diferença significante entre as médias de IL-1 obtidas

pelos grupos CT e EP: t(18)= 0,31; 95%IC= -58,61 a 79,11; p= 0,758.

3.1.2 IL-6



valores.



CT 57,18 38,88 45,65 20,45 155,25

EP 28,54 11,51 29,48 12,39 49,90


A IL-6 estava significantemente mais baixa nos ratos do grupo EP do

que nos controles: t(18)= 2,23; 95%IC= 1,70 a 55,58; p= 0,038.

Resultados

28

3.1.3 IL-10



valores.



CT 265,70 240,02 181,32 112,49 886,29

EP 148,70 63,23 141,77 60,75 272,46


Não houve diferença significante entre as médias de IL-10 obtidas


Resultados

29

3.1.4 TNF

A tabela 4 mostra a análise descritiva dos valores de TNF, após o


valores.

Tabela 4 – Análise descritiva dos valores de TNF


CT 67,10 79,61 33,64 24,05 283,83

EP 31,95 10,91 28,27 21,22 56,70

Figura 14 – Boxplot da concentração de TNF nos grupos CT e EP.

Não houve diferença significante entre as médias de TNF obtidas


Resultados

30

3.1.5 MDA

A tabela 5 mostra a análise descritiva dos valores de MDA, após o


valores.

Tabela 5 – Análise descritiva dos valores de MDA


CT 0,02 0,02 0,02 0,00 0,07

EP 0,01 0,01 0,01 0,01 0,03

Figura 15 – Boxplot da concentração de MDA nos grupos CT e EP.

Não houve diferença significante entre as médias de MDA obtidas

pelos grupos CT e EP: t(18)= 1,31; 95%IC= 0,00 a 0,02; p= 0,206.

Resultados

31

3.1.6 Óxido nítrico

A tabela 6 mostra a análise descritiva dos valores de nitrito, após o


valores.

Tabela 6 – Análise descritiva dos valores de Óxido Nítrico


CT 2,22 1,88 1,69 0,38 5,83

EP 4,94 4,36 4,56 0,52 12,35

Figura 16 – Boxplot da concentração de nitrito nos grupos CT e EP.

Não houve diferença significante entre as médias de óxido nítrico

obtidas pelos grupos CT e EP: t(18)= -1,81; 95%IC= -5,87 a 0,44; p= 0,088.

Resultados

32

3.1.7 Mieloperoxidase (MPO)

A tabela 7 mostra a análise descritiva dos valores de MPO, após o


valores.

Tabela 7 – Análise descritiva dos valores de MPO


CT 1,89 3,00 0,78 0,25 10,07

EP 0,48 0,43 0,27 0,07 1,22

Figura 17 – Boxplot da concentração de MPO nos grupos CT e EP.

Não houve diferença significante entre as médias de MPO obtidas


Resultados

33

3.1.8 MMP-2

A tabela 8 mostra a análise descritiva dos valores de MMP-2, após o


valores.

Tabela 8 – Análise descritiva dos valores de MMP-2


CT 25278,80 3086,35 26087,00 20183,00 28528,00

EP 16998,80 2238,73 17100,00 13493,00 19184,00

Figura 18 – Boxplot da concentração de MMP-2 nos grupos CT e EP.

Resultados

34

A figura 19 mostra a atividade de MMP-2 em gel de zimografia.

Figura 19 – Atividade de MMP-2 em gel de zimografia.

A MMP-2 estava significantemente mais baixa nos ratos do grupo EP

do que nos controles: t(8)= 4,86; 95%IC= 4347,95 a 12212,05; p= 0,001.

3.1.9 MMP-9

A tabela 9 mostra a análise descritiva dos valores de MMP-9, após o


valores.

Tabela 9 – Análise descritiva dos valores de MMP-9


CT 21345,80 4021,21 19566,00 17105,00 26120,00

EP 18760,60 8179,36 20477,00 9243,00 29200,00

EPCT

Resultados

35

Figura 20 – Boxplot da concentração de MMP-9 nos grupos CT e EP.

A figura 21 mostra a atividade de MMP-9 em gel de zimografia.

Figura 21 – Atividade de MMP-9 em gel de zimografia.

Não houve diferença significante entre as médias de MMP-9 obtidas


CT EP

Resultados

36

3.1.10 HSP 70

A tabela 10 mostra a análise descritiva dos valores de HSP 70, após o


valores.

Tabela 10 – Análise descritiva dos valores de HSP 70


CT 21736,40 3480,73 21326,00 18984,00 27638,00

EP 22959,20 3233,67 22125,00 19778,00 28414,00

Figura 22 – Boxplot da concentração de HSP 70 nos grupos CT e EP.

Resultados

37

A figura 23 mostra a atividade de HSP 70 em membrana de Western

Blot.

Figura 23 – Atividade de HSP 70 em membrana de Western Blot

Não houve diferença significante entre as médias de HSP 70 obtidas

pelos grupos CT e EP: t(8)= -0,58; 95%IC= -6122,40 a 3676,80; p= 0,581.

3.2 Análise Descritiva

Os dados da análise descritiva dos parâmetros bioquímicos

estudados, após o tratamento com ringer-etil-piruvato ou ringer-simples e a

tabela da comparação entre as dosagens dos parâmetros bioquímicos dos

animais do grupo CT e EP, segundo teste t de Student para amostras

independentes, encontram-se no anexo 2.

3.3 Análise de sobrevivência

Para esta parte do estudo, foram selecionados 10 animais do grupo

CT e 10 do grupo EP.

Estes animais foram submetidos à pancreatite aguda induzida, mas

não ao estudo bioquímico.

CT EP

Resultados

38

Todos os ratos do grupo que não receberam EP foram a óbito,

naturalmente em, no máximo, três dias (mediana = 2 dias), ao passo que os que

receberam EP demoraram até dez dias para morrer (mediana = 7,5). A figura 24

representa a curva de Kaplan-Meier para os dados de óbitos.

Figura 24 – Curva de Kaplan-Meier para dados de óbitos.

A tabela 11 mostra a comparação das curvas de sobrevivência de

Kaplan-Meier para os grupos CT e EP. Para estas comparações o teste da

igualdade de distribuição de sobrevivência log rank foi utilizado.

Tabela 11 – Comparação das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, em dez

dias, de acordo com os grupos de animais

Grupo Freqüência (%) X2 GL P

CT 100 11,23 1 0,001*

EP 100

Os animais do grupo controle foram a óbito significantemente mais

rápido do que os do grupo EP.

4. DISCUSSÃO

Discussão

40

A pancreatite aguda necrosante é uma doença multi-sistêmica com

comprometimento de outros órgãos, além do pâncreas, como fígado, intestinos e

o pulmão, este último em até 75% dos casos (Yang et al., 2004). A lesão

pulmonar aguda resultante do surto de pancreatite aguda necrosante representa

uma condição muito importante, cuja patogênese é ainda, pouco compreendida.

A resposta inflamatória exacerbada pode progredir com deficiência de

oxigenação tecidual e falência cardiovascular hiperdinâmica (Beal, Cerra, 1994).

Sendo a Insuficiência de múltiplos órgãos e sistemas (IMOS) a principal causa

da alta mortalidade da pancreatite aguda necrosante em unidades de terapia

intensiva, a atenuação da SIRS por meio de antagonismo ou remoção de

potenciais mediadores inflamatórios tem atraído grande interesse em

investigações científicas, como importante estratégia de suporte na prevenção

da falência orgânica.

Para analisar os efeitos do etil-piruvato na lesão pulmonar aguda,

utilizamos parâmetros laboratoriais já consagrados na literatura, como dosagem

de citocinas inflamatórias, metaloproteinases, proteínas de choque térmico,

peroxidação lipídica e mieloperoxidase (de Campos et al., 2008; Moretti et al.,

2009), além de curva de sobrevivência.

Modelo Experimental

Modelos experimentais de pancreatite aguda simulando o quadro

clínico em humanos têm sido propostos com o objetivo de entender o complexo

mecanismo da fisiopatologia e o estudo de estratégias terapêuticas específicas.

Vários modelos foram propostos até o momento, invasivos e não-invasivos.

O modelo ideal deve conter as seguintes características: ser facilmente

reprodutível, com a possibilidade de variar o grau de gravidade do quadro de um

modo padronizado de acordo com o objetivo do estudo proposto. Sua morfologia

e fisiopatologia devem ser similares ao evento em humanos (Su et al., 2006).

Este modelo de PA foi escolhido por ser relativamente simples, rápido e

bastante utilizado para o estudo das complicações abdominais e extra-abdominais

da PA e seu tratamento. Mais ainda, comprovou-se que este modelo de PA causa

lesão pulmonar aguda (Wittel et al., 2008; Moretti et al., 2009).

Discussão

41

A infusão retrograda de sais biliares no ducto bílio-pancreático produz

pancreatite aguda severa (Moretti et al., 2009). O grau de necrose pancreática

pode ser manipulado pela pressão de infusão ou pela concentração de sais biliares

da solução infundida. A PA necrosante é desenvolvida após uma a duas horas da

infusão do taurocolato, e caracteriza-se por edema, necrose e hemorragia. O

principal composto padronizado para este modelo é o taurocolato de sódio.

Infusão de 1-2ml/kg de 2%, 3%, 4% e 5%, induz PA necrosante com letalidade de

24 horas de 0%, 0%, 10% e 60%, respectivamente (Wittel et al., 2008).

O taurocolato de sódio é um sal biliar sintético e a injeção ductal

retrógrada simula os eventos que antecedem o desenvolvimento da pancreatite

biliar, que é a forma de pancreatite mais comumente encontrada na prática

clínica (Bilchik et al., 1990). É método útil para estudo dos efeitos sistêmicos,

sendo modelo efetivo e reprodutível, podendo ser utilizado para estudo de

pseudocisto pancreático, abscesso pancreático e de adiponecrose (Goldenberg

et al., 2007; Apodaca-Torrez et al., 2007). A infusão retrógrada de taurocolato na

concentração de 2,5% provoca destruição da membrana das células ductais e

desenvolve-se uma pancreatite necro-hemorrágica, com importantes efeitos

sistêmicos e letalidade de cerca de 60-90% em 72 horas (Moretti et al., 2009).

Neste estudo, realizamos a indução da pancreatite aguda com infusão

manual, lentamente, em até um minuto. Não foi utilizada bomba de infusão. Em

relação à infusão retrógrada manual do taurocolato de sódio, Sassatani (2008)

evidenciou que em comparação com o uso de bomba de infusão, a infusão

retrógrada manual determina pressão média quatro vezes maior que a obtida

com bomba de infusão. No entanto, a diferença de pressão não determinou

alterações na maioria dos parâmetros hemodinâmicos, laboratoriais e histológicos

nos grupos estudados.

Etil-piruvato

Diferentes substâncias com potencial de reduzir ou bloquear a

resposta inflamatória sistêmica da pancreatite aguda necrosante têm sido

estudadas (Almeida et al., 2006; de Campos et al., 2008; Moretti et al., 2009).

Discussão

42

Pesquisas clínicas e experimentais têm sido realizadas com o objetivo de

elucidar e minimizar os efeitos locais e sistêmicos envolvidos na PA. A busca

pela substância capaz de bloquear a cascata inflamatória da PA e redução da

LPA motivou esta pesquisa.

O etil-piruvato, além de seu papel no metabolismo intermediário,

apresenta propriedade de redutor de espécie reativa de oxigênio (EROS),

principalmente o peróxido de hidrogênio. Este, com seu poder oxidativo, pode

lesar numerosos constituintes intracelulares, como lipídeos, proteínas e ácidos

nucléicos. Devido a esta habilidade de reduzir EROs, o piruvato vem sendo

estudado extensivamente, como agente cito-protetor (Kao, Fink, 2010).

O reconhecimento do piruvato como depurador de espécies reativas

ao oxigênio suscitou investigações para o uso terapêutico desta substância no

tratamento de diversas patologias mediadas por agentes redutores-

dependentes. Estudos prévios evidenciaram o papel do piruvato na preservação

renal em ratos portadores de insuficiência renal mediada por radicais livres

(Salahudeen et al., 1991). Também notou-se melhora da lesão tecidual e

disfunção orgânica após tratamento de choque hemorrágico com soluções de

etil-piruvato (Mongan et al., 2002).

Como soluções aquosas de piruvato são instáveis, por tratar-se de

forma aniônica de ácido mono-carboxílico, há necessidade de uma associação

para maior estabilidade para uso clínico-experimental (Fink, 2007). O etil-

piruvato é um éster, formado pela condensação do ácido pirúvico com o etanol.

É adicionado à solução de cloreto de sódio, cloreto de potássio e de cálcio,

denominada solução de Ringer etil-piruvato. Esta associação mostrou-se mais

estável podendo ser empregada em estudos científicos.

Desde a publicação de Sims et al., em 2001, o etil-piruvato tem sido

cada vez mais estudado. As pesquisas científicas incluem aplicações do piruvato

em quadros de: disfunção miocárdica (Bünger et al., 1989), intestinal (Cicalese et

al., 1999) e hepática (Sileri et al., 2001), em modelos de lesão por isquemia-

reperfusão. Outros efeitos favoráveis foram documentados em modelo de catarata

(Gupta et al., 2002; Kalakonda et al., 2004; Zhao et al., 2000), acidente vascular

Discussão

43

cerebral (Lee et al., 2001), pancreatite aguda (Shang et al., 2009), choque

hemorrágico (Mongan et al., 2002), retinopatia e glaucoma (Yoo et al., 2004).

Esta solução de Ringer etil-piruvato mostrou melhora estrutural e

funcional na lesão da mucosa intestinal causada por isquemia mesentérica e

reperfusão em ratos (Sims et al., 2001). Outro estudo revelou que o etil-piruvato

apresentou melhores resultados do que o piruvato em estudo in vitro de lesão

tecidual mediada por agentes redutores (Varma et al., 1998). Tawardrous et al.,

compararam os efeitos de ressuscitação volêmica de modelo experimental de

choque hemorrágico, com solução de Ringer etil-piruvato em substituição ao

Ringer – lactato. O emprego do etil-piruvato resultou em significativa redução na

hiper-permeabilidade da mucosa ileal. Outro estudo realizado por Yang et al.

(2002) revelou aumento significante da sobrevida em modelo experimental de

ressuscitação de choque hemorrágico, com redução na ativação de fatores pró-

inflamatórios e fatores nucleares em fígado e mucosa colônica de murinos, além da

queda na expressão de genes pró-inflamatórios como óxido nítrico-sintase, fator de

necrose tumoral (TNF), ciclooxigenase-2 e interleucina-6 (IL-6) no fígado, mucosa

ileal e colônica. Estes achados sugerem um papel antiinflamatório do etil-piruvato.

Conforme os trabalhos de Uchiyama et al. (2003), Cheng et al. (2007)

e Yang et al. (2009), utilizamos a dose de 50mg/kg/dose do etil-piruvato, por ter

demonstrado melhor efeito quando comparados a outras dosagens.

Utilizamos a via intraperitoneal para infusão do EP pela maior

facilidade técnica e difícil manutenção de via de acesso endovenosa no rato,

durante as 6 horas necessárias. Esta via de administração já está consagrada

em pesquisas recentes (Yang et al., 2004 e 2009; Shang et al., 2009).

Os momentos após a indução da pancreatite da infusão do tratamento

com a solução do EP não estão definidos em estudos anteriores. Há variações

desde após 1 hora até 48 horas (Yang et al., 2004 e 2009; Cheng et al., 2007;

Shang et al., 2009). Optou-se, neste estudo, em realizar experimento para

avaliação do etil-piruvato de curta duração, mimetizando um possível uso na

prática clínica, logo depois de confirmado o diagnóstico de PA.

O quadro 3 resume os efeitos observados pelo uso do etil-piruvato em

estudos experimentais publicados em revistas científicas renomadas, desde 2001.

Discussão

44

Quadro 3 – Resultados de estudos experimentais recentes do Etil-piruvato

sobre distintas condições clínicas induzidas (Kao, Fink, 2010).

Espécie Condição Efeito do tratamento com EP Referência Rato Isquemia/reperfusão

mesentérica Preservação histológica da mucosa ileal

Sims et al., 2001

Camundongo Choque hemorrágico Redução da expressão de IL-6 Yang et al., 2002 Rato Choque hemorrágico Preservação da barreira da

mucosa intestinal Tawadrous et al., 2002

Rato Choque séptico Redução de IL-6 no plasma Venkataraman et al., 2002

Camundongo Peritonite bacteriana Melhora de sobrevida Ulloa et al., 2002 Camundongo Endotoxemia Preservação da barreira da

mucosa intestinal Sappington et al., 2003

Camundongo Pancreatite necrosante Melhora da lesão pulmonar aguda

Yang et al., 2004

Camundongo Lesão alcoólica Melhora da necrose hepática Yang R et al., 2003 Camundongo Ligadura do ducto

biliar comum Melhora da lesão hepática Yang et al., 2004

Camundongo Isquemia e reperfusão mesentérica

Preservação da barreira da mucosa intestinal

Uchiyama et al., 2003

Rato Isquemia e reperfusão cardíaca

Preservação da função miocárdica

Woo et al., 2004

Camundongo Isquemia e reperfusão hepática

Inibição da apoptose de hepatócitos

Tsung et al., 2005

Porco Choque hemorrágico Melhora na hipo-perfusão esplâncnica

Tenhunen et al., 2003

Porco Choque hemorrágico Sem efeito terapêutico Mulier et al., 2005 Porco Choque hemorrágico Sem efeito terapêutico Anderson et al., 2006 Rato Acidente vascular

cerebral Melhora da disfunção neurológica

Yu et al., 2005

Rato Choque hemorrágico Preservação de tecido cerebral viável

Kim et al., 2005

Camundongo Lesão neuronal induzida

Redução da morte celular neuronal

Cho et al., 2006

Camundongo Peritonite bacteriana Preservação da função renal Dear et al., 2005 Camundongo Peritonite bacteriana Preservação da função renal Miyaji et al., 2003 Porco Endotoxemia Melhora na lesão pulmonar

aguda Hauser et al., 2005

Rato Peritonite bacteriana Inibição da peroxidação lipídica Li et al., 2006 Rato Queimadura cutânea Melhora na lesão hepática e

renal Wang et al., 2006

Camundongo Manipulação cirúrgica intestinal

Melhora do íleo pós-operatório Harada et al., 2005

Rato Queimadura cutânea Preservação da função de células T

Dong et al., 2005

Discussão

45

O EP apresenta reconhecida ação antiinflamatória demonstrada por

Yang et al. (2002) em modelo experimental de choque hemorrágico, com

modulação da ativação de fator de transcrição pró-inflamatória NF-kB, assim

como expressão de proteínas pró-inflamatórias: TNF, IL-6, ciclooxigenase

(COX-2) e óxido nítrico. Venkataraman et al. (2002) mostraram redução de

níveis de IL-6 e óxido nítrico, além de aumento de IL-10, em modelo

experimental de choque séptico.

Estudos sobre os efeitos do etil-piruvato na pancreatite aguda são

escassos. Em pesquisa no MedLine, encontramos somente os seguintes artigos:

− Yang et al. (2004) – modelo de PA com deficiência de colina; infusão

intraperitoneal de EP; mostrou redução na translocação bacteriana e lavado

bronco-alveolar no grupo tratado pelo etil piruvato. Houve melhora na

sobrevivência dos ratos do grupo EP.

− Cheng et al. (2007) - em modelo experimental de pancreatite aguda em ratos

com taurocolato de sódio, com infusão endovenosa de etil-piruvato;

demonstrou redução da proteína HMGB-1 no grupo tratado com solução de

etil-piruvato. Observou também melhora da sobrevida e dos níveis séricos de

interleucinas 1 e 6, além do TNF.

− Yang et al. (2008) – em modelo experimental de pancreatite aguda em ratos

com taurocolato de sódio, com infusão endovenosa de etil-piruvato 12, 18h e

30 horas após a indução da pancreatite aguda – analisou histologia pulmonar

e acometimento pulmonar pela relação do peso úmido e peso seco do tecido

pulmonar; mostrou redução do processo inflamatório decorrente da

pancreatite aguda necrosante em ratos, com redução do HMGB-1; analisou

enzimas séricas com benefícios ao EP e melhora da sobrevivência deste

grupo em comparação ao grupo controle.

− Yang et al. (2009) – modelo de PA em ratos com deficiência de colina;

realizou infusão intraperitoneal de etil-piruvato; demonstrou melhora do TNF e

fator de transcrição NFKB no fígado dos ratos.

− Luan et al. (2010) – modelo experimental em ratos de taurocolato de sódio

verificou melhora na lesão de mucosa intestinal no grupo tratado com solução

de EP.

Discussão

46

Interleucinas

Citocinas são proteínas de baixo peso molecular, produzidas por

inúmeras células inflamatórias. São mais de trinta tipos diferentes, com

propriedades distintas e, às vezes, opostas (Norman, 1998). Uma vez

produzidas, as citocinas tem o poder de amplificação de sua produção, com

resultante efeito em cascata.

Reconhece-se que os níveis teciduais são os responsáveis pela

grande parte dos efeitos biológicos das citocinas (Norman, 1998). Portanto,

neste estudo, para análise da resposta inflamatória da LPA, as dosagens das

citocinas foram realizadas no parênquima pulmonar. Optou-se pela dosagem

das interleucinas TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10. Estas estão, sabidamente, elevadas

em paciente com PA (de Beaux et al., 1996a).

As concentrações séricas das citocinas apresentaram maior valor

preditivo de gravidade da PA, falência orgânica e mortalidade geral, em

comparação com os critérios de Ransom e escore de APACHE (Pezzilli et al.,

1995; Norman, 1998).

IL-1β

Apresenta reconhecida ação no aumento da resposta inflamatória da

pancreatite aguda pela indução de apoptose da célula acinar (Norman, 1998).

Pode causar lesão tecidual, quando infundida experimentalmente (Granger,

Remick, 2005) e também pode ser induzida em resposta ao stress oxidativo (Fu

et al., 1997, Dugernier et al., 2003).

Mostrou-se inalterada estatisticamente, quando comparados grupo EP

e grupo CT, neste estudo. Seus níveis teciduais parecem estar intimamente

ligados com a curva do TNF-α, que também não se alterou com o uso do EP.

IL-6

A interleucina 6 é uma citoquina importante na síntese de proteínas

de fase aguda e é utilizada como marcador da gravidade do quadro durante

resposta sistêmica inflamatória e sepse (Remick et al., 2002). Estudos prévios

Discussão

47

documentaram que a IL-6 está aumentada em modelos experimentais de

pancreatite aguda (Norman et al., 1995, 1997). Além disso, os miofibroblastos

peri-acinares também secretam IL-6 (Shimada et al., 2002). Um estudo prévio de

Fu et al. (1997) reportou que parte da produção excessiva de IL-6 ocorre como

resposta ao estresse oxidativo, assim como ocorre na IL-1b.

Neste estudo, a interleucina 6 teve seus níveis significantemente

reduzidos no grupo que recebeu o tratamento com a solução de Ringer-etil-

piruvato. Estudos recentes sugerem que a IL-6 pode mediar a lesão orgânica.

Sua inibição poderia resultar em redução da resposta inflamatória sistêmica e

potencial complicação com insuficiência múltipa de órgãos. Poderia representar

papel importante na menor letalidade encontrada na curva de sobrevivência. A

correlação da IL-6 com o cenário clínico da pancreatite aguda foi demonstrada

em diversos trabalhos científicos (Quadro 4).

Quadro 4 – Correlação da IL-6 com o grau de gravidade e prognóstico da

pancreatite aguda (Granger, Remick, 2005)

N° Pacientes Comentários 38 IL-6 foi marcador mais preciso de gravidade de pancreatite aguda em

comparação B2-microglobulina e proteína C-reativa (Pezzilli et al., 1995) 22 IL-6 maior em grupo com pancreatite aguda (De Beaux et al., 1996a) 58 IL-6 teve maior predição prognóstica que a proteína C-reativa (De Beaux

et al., 1996b) 91 IL-6 foi mais indicativo de gravidade da pancreatite aguda biliar,

comparada à proteína C-reativa (Pezzilli et al., 1998) 80 IL-6 e Lipase utilizadas no diagnóstico e prognóstico da pancreatite aguda

na sala de emergência (Pezzilli et al., 1999) 50 IL-6 foi o melhor indicador de prognóstico em estágios iniciais de

pancreatite aguda comparada ao IL-8, TNF-α e IL-1b (Chen et al., 1999) 32 Melhor prognóstico com aumento da relação IL-10/IL-6 (Simovic et al., 1999) 43 IL-6,IL-8 e IL-10 são marcadores precoces; IL-6 mantém-se elevada nas

formas severas (Berney et al., 1999) 51 IL-6 elevada em lesão orgânica à distância, na pancreatite aguda (Mayer

et al., 2000) 16 Supressão de IL-6 é importante para terapia da pancreatite aguda

necrosante (Hirota et al., 2000) 48 IL-6 e pró-calcitonina estão elevados em necrose infectada, úteis para

triagem de possível benefício com antibioticoterapia (Riché et al., 2003) 36 IL-6 – IL-8 – TNF – utilizadas para distinção de pancreatite leve e severa,

em fase inicial (Pooran et al., 2003)

Discussão

48

IL-10

Tem sido descrito como um inibidor de citocinas pró-inflamatórias,

atuando como uma citocina antiinflamatória (Granger, Remick, 2005). Desta

forma, a infusão exógena de IL-10 experimental pode bloquear a resposta

inflamatória. Chen et al., em 1999, demonstraram que os níveis de IL-10

apresentavam significante importância prognóstica, em pacientes com pancreatite

aguda.

Neste estudo, não houve diferença significante entre as médias de IL-

10 obtidas pelos grupos CT e EP (p= 0,153). Não foi possível constatar um

efeito antiinflamatório pela modulação da IL-10 pelo EP.

TNF-α

Inicialmente descrito como uma citocina que induz a necrose tumoral,

o TNF-α causa lesão tecidual, em estudos experimentais (Granger, Remick,

2005). O controle de seus níveis séricos é bastante preciso, motivo pelo qual

altos níveis não são vistos em quadros de pancreatite aguda.

Sua presença em dosagens séricas não tem relação com sua

capacidade de desenvolver disfunção orgânica e SIRS (Norman, 1998). Assim,

sua dosagem no parênquima pulmonar apresenta maior precisão, para o estudo

da lesão pulmonar aguda.

Ainda assim, não encontramos alterações significativas na

comparação dos dois grupos deste estudo. Acreditamos que por tratar-se de

experimento agudo, o período de elevação e curva do TNF-α poderia não ter

sido afetado pelo uso precoce do etil-piruvato.

Malondialdeído (MDA)

A peroxidação lipídica é um importante indicador do estresse

oxidativo. O malondialdeído (MDA) resultante da oxidação dos lípides que

compõe as membranas celulares é um dos produtos da peroxidação lipídica e

sua dosagem representa um índice de estresse oxidativo de forma comparativa.

Discussão

49

Já foi demonstrado previamente por Leung e Chan (2009), que os

níveis de MDA estão aumentados durante o estresse oxidativo que ocorre na

pancreatite aguda induzida em ratos.

No presente estudo, não foi demonstrado efeito significativo do etil-

piruvato na dosagem da MDA e, consequentemente, na peroxidação lipídica. O

taurocolato de sódio poderia, presumidamente produzir outros tipos de radicais

livres, os quais não seriam afetados pelo efeito redutor do EP.

Óxido Nítrico (NO)

O óxido nítrico é o neurotransmissor não-adrenérgico que regula a

pressão sangüínea no endotélio vascular, pelo relaxamento da musculatura lisa.

Durante a resposta inflamatória, há ativação de macrófagos e aumento da

produção de NOS e de óxido nítrico, um dos componentes tóxicos produzidos por

células fagocitárias para defesa contra patógenos (Fang, 1999). Todavia, o

excesso de produção do NO durante o episódio de pancreatite aguda necrosante

pode levar à ativação da cascata inflamatória, com inibição da respiração celular,

nitrosilação e nitração de proteínas, resultando na morte celular por necrose e

apoptose (Chvanov et al., 2005; Flodstrom, 2001; Qui et al., 2001). Em condições

normais, o NO protege contra a apoptose celular (Vodovotz et al., 2004).

A superprodução das espécies reativas de oxigênio na pancreatite

aguda promove o dano oxidativo, tanto no pâncreas como em órgãos à distância.

A produção de NO em maior quantidade pode ter efeitos nocivos

sobre a circulação pulmonar em quadros de intensa inflamação, como a SDRA

(Sittipunt et al., 2001) e outras condições como a lesão pulmonar aguda

decorrente da pancreatite aguda. O pulmão é especialmente vulnerável à ação

de espécies reativas ao oxigênio por apresentar a maior superfície endotelial

entre todos os órgãos (Rahman, MacNee, 1999). O estresse oxidativo é

proposto como causa essencial na progressão da destruição do parênquima

pancreático (Dryden et al., 2005). Recentemente, o papel do óxido nítrico

durante o episódio de pancreatite aguda necrosante foi reportado, muito

relacionado com a lesão pulmonar concomitante (Ang, 2009).

Discussão

50

A redução medicamentosa dos níveis de óxido nítrico circulante torna-

se importante ferramenta na inibição da cascata inflamatória da pancreatite aguda

necrosante. Neste contexto, o tratamento com substâncias redutoras de oxigênio

reativo tem sido proposto para a lesão pulmonar decorrente de pancreatite aguda

(Yang et al., 2010). Suspeitou-se que os efeitos antiinflamatórios e antioxidantes

do etil-piruvato poderiam reduzir a dosagem do óxido nítrico.

Neste estudo, não se evidenciou alteração na dosagem de NO, entre

os dois grupos comparados. Não houve diferença significante entre as médias

de óxido nítrico obtidas pelos grupos CT e EP (p= 0,088).

Dosagem de Mieloperoxidase (MPO)

A ativação de leucócitos, incluindo neutrófilos, tem importante

participação na patogênese da pancreatite aguda e lesão pulmonar associada.

Após estímulo, neutrófilos são recrutados e ativam a produção de nicotinamida-

adenosina-dinucleotideo fosfato oxidase, produzindo peróxido de hidrogênio.

Ocorre lesão celular decorrente da infiltração neutrofílica pela formação de

espécies reativas de oxigênio e liberação de enzimas proteolíticas de grânulos

neutrofílicos (Chooklin et al., 2009).

A mieloperoxidase (MPO) é uma heme-enzima que quando associada

ao peróxido de hidrogênio, torna-se tóxica para algumas células, como células

tumorais, eritrócitos, leucócitos e microorganismos. Níveis elevados de MPO

indicam ativação de neutrófilos e do índice de infiltração neutrofílica nos tecidos

(Breckwoldt et al., 2008; El Kebir et al., 2008).

A MPO tem alterações mínimas nos rins, fígado e pâncreas durante o

episódio de peritonite experimental. As principais alterações são evidenciadas

no parênquima pulmonar (Yao et al., 2003). A lesão pulmonar resultante do

processo inflamatório que ocorre na pancreatite aguda resulta em elevação da

atividade da mieloperoxidase, demonstrando um seqüestro neutrofílico e

consequente liberação de diversos mediadores inflamatórios.

O etil-piruvato, com sua reconhecida ação antiinflamatória poderia

influir na atividade da MPO com melhora das complicações pulmonares, fator

fundamental na gravidade clínica associada à pancreatite aguda necrosante.

Discussão

51

No entanto, neste estudo, não foi possível identificar com significância,

efeitos benéficos do EP na pancreatite aguda necrosante. Não houve diferença

significante entre as médias de MPO obtidas pelos grupos CT e EP (p=0,160).

Metaloproteinases

As metaloproteinases são enzimas importantes para diversos

fenômenos tais como remodelamento da matriz extracelular (MEC), proliferação

celular, migração, invasão, angiogênese. A maioria desses processos é

regulada por um delicado equilíbrio entre metaloproteinases e os inibidores

dessas enzimas (TIMPs) (Moretti et al., 2009).

As MMPs 2 (gelatinase B) e 9 (gelatinase A) são especialmente

importantes na infiltração tecidual pelos polimorfonucleares durante a inflamação,

degradando componentes da membrana basal vascular, como colágeno tipo IV,

além de fibronectina e gelatina. A MMP-2 pode clivar o colágeno tipo I, enquanto

que a MMP-9 digere os colágenos tipo I, II e V (Keck et al., 2002).

A produção e secreção das metaloproteinases pode ser modulada

pela ação de citocinas: a IL-10 inibe a produção de MMP-2 e MMP-9, além de

induzir a produção de TIMPs. A IL-1 e TNF-α aumentam a produção e a

secreção das MMPs (Muhs et al., 2001 e 2003).

Os níveis de metaloproteinases estão elevados na pancreatite aguda

(Wen et al., 2009). Mikami et al. (2009) evidenciaram que a redução dos níveis

de metaloproteinase reduz a quantidade de grânulos de neutrófilos

polimorfonucleares, melhorando a disfunção da barreira intestinal presente na

pancreatite aguda. Desta forma, há redução da translocação bacteriana e

consequente diminuição do processo inflamatório e infeccioso extra-pancreático

(Mikami et al., 2009).

Durante a fase inflamatória sistêmica da lesão pulmonar, há

agressão da membrana basal com deposição de matriz extracelular composta

por fibrinogênio, fibronectina e colágeno. As metaloproteinases representam os

principais mediadores fisiológicos da degradação da MEC. Quando produzidas

em excesso, podem destruir a MEC e estimular o processo inflamatório (Corbel

et al., 2000).

Discussão

52

Zervos et al. (1999) observaram aumento da sobrevida após

administração de inibidor de MMP em tumor pancreático induzido

experimentalmente, com redução local e metastática da lesão tumoral. Deste

modo, os relatos indicam que inibidores de MMP têm aplicabilidade no

tratamento neoplásico. No entanto, há pouca investigação no papel das MMP

para tratamento de pancreatite aguda. Muhs et al. (2003) demonstraram um

papel fundamental das metaloproteinases na evolução da lesão local e

progressão à órgãos distantes após episódio de pancreatite aguda. A inibição da

atividade das metaloproteinases pode influenciar o desfecho biológico.

Em busca realizada no Medline, não encontramos nenhum estudo

avaliando efeitos do etil-piruvato na atividade das metaloproteinases na

pancreatite aguda. Neste estudo, evidenciamos uma redução significante de

MMP-2 no grupo que recebeu o tratamento com EP (p<0,01). Apesar de não ter

havido diferença significativa em relação à MMP-9, a alteração encontrada pode

explicar uma redução do processo inflamatório sistêmico, e consequentemente,

justificar a redução da letalidade no grupo de tratamento com EP.

Proteínas ativadas por choque térmico ou por estresse (HSP)

As proteínas ativadas por choque térmico (Heat Shock Proteins ou

“stress proteins”) são expressas em resposta ao estresse, mas funcionam como

chaperonas moleculares e atuam sobre o dobramento, transporte intracelular,

translocação, degradação e montagem de proteínas (Rakonczay et al., 2003).

Sua expressão pode ser induzida por uma variedade de estresses fisiológicos

incluindo temperatura, radicais livres derivados de oxigênio, endotoxinas, íons

de metais pesados, aminoácidos, infecções, inflamação e autoimunidade

(Bhagat et al., 2000 e 2002; Millar et al., 2003; McCormick et al., 2003).

Em sua maioria, as HSPs exercem um efeito protetor contra o dano

celular. Em condições adversas, o estresse celular pode lesar ou desnaturar as

proteínas celulares. As HSPs reconhecem esta situação, ligam-se às proteínas

lesadas, estabilizam e recuperam estas, prevenindo a destruição protéica

irreversível (Scorzone et al., 1987).

Discussão

53

O efeito protetor associado ao aumento da expressão das HSPs foi

demonstrado em diferentes modelos experimentais como sepse (Villar et al.,

1994), lesão de isquemia e reperfusão cardíaca (Marber et al., 1995) e lesão

pulmonar (Durand et al., 2000) e tem sido relacionado à diminuição das citocinas

pró-inflamatórias (Wischmeyer, 2002).

Na pancreatite aguda os níveis de HSP pancreática foram observados

por diferentes autores (Wagner et al., 1996; Bhagat et al., 2002; Weber et al.,

2000). Na PA induzida em ratos, com diferentes agentes como a ceruleína, CCK e

arginina, observa-se um aumento na expressão de HSP70 (Wagner et al., 1996)

enquanto há uma diminuição nos níveis da HSP60 (Bhagat et al., 2002). Visto que

a PA induz um processo inflamatório sistêmico, acredita-se que as HSPs também

sejam ativadas em sítios extrapancreáticos. Os mecanismos pelos quais as HSPs

promovem proteção contra os danos associados a pancreatite aguda não são

bem entendidos, mas podem estar relacionados a diminuição dos níveis de

moléculas pró-inflamatórias, aumento da resistência a necrose e a apoptose ou

efeitos antioxidantes (Rakonczay et al., 2003).

A família da HSP70 tem sido a mais investigada na literatura, por ser

a única forma induzível termicamente da família. A estrutura e função das HSPs

estão bem documentadas no miocárdio (Latchman, 2001). No entanto, poucos

estudos avaliaram o pâncreas.

Em estudo prévio, Lee et al. (2001) induziram a produção de HSP

após imersão aquosa e verificaram melhora importante na pancreatite aguda

induzida, considerando parâmetros de lesão acinar aguda, como edema

pancreático, amilase sérica e necrose pancreática. Estudos experimentais com

inibidores da síntese de HPS70 revelaram maior gravidade do quadro de

pancreatite aguda, demonstrando o papel protetor destas proteínas contra a

lesão celular (Bhagat et al., 2002).

Os efeitos protetores das HSP70 na pancreatite aguda ainda são

pouco compreendidos. As principais teorias são sintetizadas no quadro 5

(Frossard et al., 2001; Rakonczay et al., 2003; Bhagat et al., 2002):

Discussão

54

Quadro 5 – Efeitos protetores da HSP70 na pancreatite aguda

Taxas elevadas de expressão HSP72 foram evidenciadas no tecido

pulmonar logo apos a indução de pancreatite aguda com infusão intraductal de

taurocolato de sódio (Folch, 2000). Esta expressão foi identificada no epitélio

brônquico, macrófagos alveolares, infiltração neutrofílica e vasos sanguíneos.

Foi sugerido que a indução da HSP72 é mediada pela infiltração de neutrófilos

no parênquima pulmonar (Rakonczay et al., 2003).

Frossard et al. (2008) reportaram que a HSP70 pode ter um papel

protetor na pancreatite aguda induzida por ceruleína mediante a prevenção na

ativação da enzima digestiva intra-pancreática. O tratamento com hipertermia

poderia ativar a formação destas proteínas de choque, reduzindo a ativação

enzimática da pancreatite aguda. Tashiro et al. (2002) demonstraram maior

proteção pelas HSPs contra a pancreatite induzida por arginina, nos pacientes

submetidos a hipertermia. Devido ao seu fator protetor, sugeriu-se que uma

indução provocada de HSP por métodos térmicos ou não-térmicos poderia trazer

benefícios clínicos aos pacientes em quadros de pancreatite aguda. No entanto,

sabe-se que as HSPs são produzidas em situações desfavoráveis e até o

momento não foi possível regular sua síntese sem ocasionar efeitos colaterais.

Por sua natureza, as HSP tornaram-se potenciais alvos farmacológicos

para proteção contra o dano pancreático, inclusive em humanos. A busca por

drogas não-tóxicas que possam ativar a resposta por choque térmico no

tratamento da pancreatite aguda é motivo de pesquisas. O etil-piruvato, com

seus efeitos antiinflamatórios conhecidos poderia, hipoteticamente, elevar a

• Aumento da resistência celular a apoptose e necrose

• Redução dos níveis de citocinas inflamatórias

• Efeitos antioxidantes

• Bloqueio das alterações intracelulares que geram ativação de zimogênio e da pancreatite – redução da ativação do tripsinogênio intra-acinar

• Inibição da elevação da ceruleína na concentração intracelular de cálcio

Discussão

55

expressão destas proteínas de choque, levando a uma redução do processo

inflamatório sistêmico resultante da inflamação pancreática. Não foi encontrado

em pesquisa no MedLine, qualquer estudo avaliando efeitos do EP nas

proteínas de choque térmico.

Neste estudo, de curta duração, não houve diferença significante

entre as médias de HSP70 obtidas pelos grupos CT e EP (p= 0,581). Talvez em

estudos de duração mais prolongada, seja possível detectar diferenças

significantes das HSP na pancreatite experimental.

Curva de sobrevivência

Shang et al. (2009) demonstraram melhora importante da letalidade da

lesão pulmonar aguda resultante de resposta sistêmica inflamatória, em modelo

de infusão de LPS de E. coli, intra-traqueal, no grupo de ratos tratado com o etil-

piruvato. Este efeito foi somente observado nos grupos de infusão precoce do

EP (0,12 e 24 horas). Não houve diferença no grupo de infusão de EP após 48

horas da indução do quadro séptico. Ulloa et al. (2002) demonstraram melhora

da sobrevida quando o EP era administrado 30 minutos antes da indução do

modelo de sepse e SIRS. Meduri et al. (1995) observaram níveis elevados de

citocinas inflamatórias no grupo que evoluiu para óbito, em comparação com os

de maior sobrevida, revelando o papel crítico destas citocinas na letalidade.

Venkataraman et al. (2002) reportaram aumento de sobrevida e redução da IL-6

circulante, em modelo de sepse abdominal tratada com EP.

Nesta pesquisa, houve significante redução da letalidade no grupo

que recebeu o tratamento com o etil-piruvato (p<0,01). Durante o período

observacional de dez dias, todos os animais do grupo controle foram à óbito até

o terceiro dia, conforme já esperado pela definição do modelo experimental com

a dose utilizada do taurocolato de sódio. No entanto, os animais do grupo

tratado com EP apresentaram somente 30% de letalidade nos três dias iniciais,

e após dez dias, todos os animais evoluíram para óbito e constatou-se

pancreatite aguda necrosante em todas as autópsias realizadas no pós-mortem.

Cheng et al. (2007) também evidenciaram que o tratamento com o EP protegeu

Discussão

56

significantemente contra a letalidade da pancreatite aguda necrosante induzida

em ratos em modelo similar de taurocolato de sódio. Houve também melhora da

lesão e disfunção orgânica nestes animais.

Considerações Finais

Este estudo traz importante colaboração na busca de um tratamento

específico para a forma necrosante da pancreatite aguda, associada à lesão

pulmonar. Até o presente momento, não há estudos publicados com tão extensa

avaliação de parâmetros inflamatórios pulmonares, após o uso do etil-piruvato.

As dosagens de citocinas pulmonares, bem como a pesquisa de HSP e

metaloproteinases para avaliar efeitos do EP são de originalidade única.

Os resultados de nossa pesquisa apontam para um papel

antiinflamatório do etil-piruvato, com redução significativa de IL-6 e MMP-2.

Observamos também um significativo aumento da sobrevivência nos animais

tratados com a solução de EP, provavelmente decorrente desta ação

antiinflamatória e oxidante.

Os estudos experimentais citados previamente sugerem a

propriedade do EP em aumento de sobrevida e melhora na lesão orgânica em

modelos experimentais em diversas condições clínicas, conforme já reportado.

No entanto, por tratar-se de estudo experimental, não há certeza de correlação

em estudos clínicos em humanos. O EP está classificado pelo FDA (Food and

Drug Administration) como droga segura. Há necessidade de estudos clínicos

controlados e randomizados para avaliar os efeitos do EP na prática clínica,

visto que os estudos experimentais apresentam resultados favoráveis.

5. CONCLUSÃO

Conclusão

58

− A solução de etil-piruvato reduziu significantemente a produção da

interleucina-6 e diminuiu a atividade da metaloproteinase-2

pulmonar;

− Houve redução significante da letalidade da pancreatite aguda

necrosante induzida em ratos.

6. ANEXOS

Anexos

60

Anexo 1 – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

Anexos

61

Anexos

62

Anexo 2 – Análise dos parâmetros bioquímicos

Análise descritiva dos parâmetros bioquímicos após tratamento com Ringer-Etil-Piruvato ou Ringer-Simples

Parâmetros bioquímicos N Média Desvio-padrão Mediana Mínimo Máximo

CT

IL-1 10 86,50 95,18 48,99 29,04 348,19

IL-6 10 57,18 38,88 45,65 20,45 155,25

IL-10 10 265,70 240,02 181,32 112,49 886,29

MDA 10 0,02 0,02 0,02 0,00 0,07

Nitrito 10 2,22 1,88 1,69 0,38 5,83

MPO 10 1,89 3,00 0,78 0,25 10,07

TNF 10 67,10 79,61 33,64 24,05 283,83

MMP-2 5 25278,80 3086,35 26087,00 20183,00 28528,00

MMP-9 5 21345,80 4021,21 19566,00 17105,00 26120,00

HSP 70 5 21736,40 3480,73 21326,00 18984,00 27638,00

EP

IL-1 10 76,25 41,01 63,72 46,29 187,62

IL-6 10 28,54 11,51 29,48 12,39 49,90

IL-10 10 148,70 63,23 141,77 60,75 272,46

MDA 10 0,01 0,01 0,01 0,01 0,03

Nitrito 10 4,94 4,36 4,56 0,52 12,35

MPO 10 0,48 0,43 0,27 0,07 1,22

TNF 10 31,95 10,91 28,27 21,22 56,70

MMP-2 5 16998,80 2238,73 17100,00 13493,00 19184,00

MMP-9 5 18760,60 8179,36 20477,00 9243,00 29200,00

HSP 70 5 22959,20 3233,67 22125,00 19778,00 28414,00

Anexos

63

Comparação entre as dosagens dos parâmetros bioquímicos dos animais do grupo CT e EP, segundo teste t de Student para amostras independentes

Parâmetros bioquímicos t DF 95% IC (diferença) P

IL-1 0,31 18 -58,61 a 79,11 0,758

IL-6 2,23 18 1,70 a 55,58 0,038*

IL-10 1,49 18 -47,91 a 281,90 0,153

MDA 1,31 18 0,00 a 0,02 0,206

Nitrito -1,81 18 -5,87 a 0,44 0,088

MPO 1,47 18 -0,61 a 3,41 0,160

TNF 1,38 18 -18,23 a 88,54 0,183

MMP-2 4,86 8 4347,95 a 12212,05 0,001*

MMP-9 0,63 8 -6814,25 a 11984,65 0,544

HSP 70 -0,58 8 -6122,40 a 3676,80 0,581

Anexos

64

Dados das análises laboratoriais nos diferentes parâmetros analisados. Comparativo entre os grupos etil-piruvato e grupo controle

Identificação Grupo IL-1 IL-6 IL-10 MDA Nitrito MPO TNF MMP-2 MMP-9 HSP 70 A1 EP 33,33 192,40 44,51 0,00 5,83 0,78 31,13 26087,0 26120,0 21401,0 A2 EP 29,04 113,02 25,50 0,01 2,12 0,44 36,14 26237,0 17105,0 19333,0 A3 EP 74,17 124,49 20,45 0,01 0,93 0,29 28,51 25359,0 19566,0 27638,0 A4 EP 100,19 397,93 64,79 0,01 0,62 2,21 81,95 20183,0 18810,0 21326,0 A5 EP 348,19 886,29 155,25 0,02 0,38 10,07 283,83 28528,0 25128,0 18984,0 A6 EP 94,95 351,11 82,91 0,02 0,85 2,73 88,81 A7 EP 45,99 112,49 41,81 0,02 2,06 0,88 40,66 A8 EP 47,45 185,24 52,16 0,03 4,98 0,77 24,05 A9 EP 50,54 177,39 46,79 0,03 1,31 0,25 30,91 A10 EP 41,13 116,66 37,60 0,07 3,14 0,43 25,03 A11 CT 63,03 90,02 40,23 0,01 5,14 0,07 29,86 16553,0 29200,0 22571,0 A12 CT 67,47 109,45 35,45 0,01 1,05 1,22 40,42 18664,0 22992,0 28414,0 B1 CT 46,29 185,06 30,25 0,01 1,87 0,19 26,68 17100,0 11891,0 22125,0 B2 CT 64,42 184,61 28,71 0,01 0,52 0,76 34,04 19184,0 20477,0 21908,0 B3 CT 187,62 272,46 49,90 0,01 4,14 0,25 56,70 13493,0 9243,0 19778,0 B4 CT 65,67 196,41 30,81 0,01 6,38 0,20 24,60 B5 CT 93,94 119,04 12,39 0,01 0,78 0,48 21,22 B6 CT 54,97 60,75 21,66 0,02 12,15 0,15 24,23 B7 CT 58,10 104,74 20,56 0,02 12,35 1,21 38,57 B8 CT 60,96 164,50 15,42 0,03 4,98 0,29 23,15

Anexos

65

Letalidade comparativa entre os dois grupos, em seguimento observacional de dez dias

Dia pós-operatório Grupo etil-piruvato (mortes por dia)

Grupo Controle (mortes por dia)

1 1 3

2 0 4

3 2 3

4 1

5 0

6 0

7 1

8 2

9 2

10 1

7. REFERÊNCIAS

Referências

67

Abdo EE, Machado MC, Coelho AM, Sampietre SN, Leite KR, Molan NA. Antioxidative effect of N2-mercaptopropionylglycine (N2-MPG) in experimental acute pancreatitis. Rev Hosp Clin Fac Med São Paulo. 1998;53(4):169-73.

Almeida JL, Jukemura J, Coelho AM, Patzina RA, Machado MC, Cunha JE. Inhibition of cyclooxygenase-2 in experimental severe acute pancreatitis. Clinics. 2006;61(4):301-6.

Almeida JL, Sampietre SN, Coelho AM, Molan NA, Machado MC, Cunha JE, Jukemura J. Statin pretreatment in experimental acute pancreatitis. JOP. 2008;9(4):431-9.

Anderson A, Fenhammar J, Frithiof R, Sollevi A, Hjelmqvist H. Haemodynamic and metabolic effects of resuscitation with Ringer’s ethyl pyruvate in the acute phase of porcine endotoxaemic shock. Acta Anaesthesiol Scand. 2006; 50: 1198-206.

Ang AD, Adhikari S, Ng SW, Bhatia M. Expression of nitric oxide synthase isoforms and nitric oxide production in acute pancreatitis and associated lung injury. Pancreatology. 2009;9:150-9.

Apodaca-Torrez FR, Goldenberg A, Lobo EJ, Farah JFM, Triviño T, Frasson Montero E, et al. Evaluation of the Effects of Noniodinized and Iodinized Ionic Contrast Media and Gadoteric Acid in Acute Necrotizing Pancreatitis: Experimental Study in Rabbits. Pancreas. 2007;35:41-4.

Beal AL, Cerra FB. Multiple organ failure syndrome in the 1990s. Systemic inflammatory response and organ dysfunction. JAMA. 1994;19;271(3):226-33.

Beger HG, Rau B, Mayer J, Pralle U. Natural course of acute pancreatitis. World J Surg. 1997;21(2):130-5.

Berney T, Gasche Y, Robert J, Jenny A, Mensi N, Grau G, Vermeulen B, Morel P. Serum profiles of interleukin-6, interleukin-8, and interleukin-10 in patients with severe and mild acute pancreatitis. Pancreas. 1999;18(4):371-7.

Bhagat L, Singh VP, Hietaranta AJ, Agrawal S, Steer ML, Saluja AK: Heat shock protein 70 prevents secretagogue-induced cell injury in the pancreas by preventing intracellular trypsinogen activation. J Clin Invest. 2000;106:81-9.

Bhagat L, Singh VP, Song AM, van Acker GJ, Agrawal S, Steer ML, Saluja AK: Thermal stressinduced HSP70 mediates protection against intrapancreatic trypsinogen activation and acute pancreatitis in rats. Gastroenterology. 2002;122:156-65.

Bilchik AJ, Leach SD, Zucker KA, Modlin IM. Experimental models of acute pancreatitis. Journal of Surgical Research. 1990;48:639-47.

Bollen TL, van Santvoort HC, Besselink MG, van Leeuwen MS, Horvath KD, Freeny PC, Gooszen HG. The Atlanta Classification of acute pancreatitis revisited. British Journal of Surgery. 2008;95:6-21.

Referências

68

Bradley EL 3rd. A clinically based classification system for acute pancreatitis. Summary of the International Symposium on Acute Pancreatitis, Atlanta. Arch Surg. 1994; 128:586-90.

Breckwoldt MO, Chen JW, Stangenberg L, Aikawa E, Rodriguez E, Qiu S, Moskowitz MA, Weissleder R. Tracking the inflammatory response in stroke in vivo by sensing the enzyme myeloperoxidase. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;25(47):18584-9.

Bünger R, Mallet RT, Hartman DA. Pyruvate-enhanced phosphorylation potential and inotropism in normoxic and postischemic isolated working heart. Near-complete prevention of reperfusion contractile failure. Eur J Biochem. 1989;180(1):221-33.

Cavallini G, Frulloni L. Somatostatin and octreotide in acute pancreatitis: the never-ending story. Dig Liver Dis. 2001;33:192-201.

Chen CC, Wang SS, Lee FY, Chang FY, Lee SD. Proinflammatory cytokines in early assessment of the prognosis of acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 1999;94(1):213-8.

Cheng BQ, Liu CT, Li WJ, Fan W, Zhong N, Zhang Y, Jia XQ, Zhang SZ. Ethyl pyruvate improves survival and ameliorates distant organ injury in rats with severe acute pancreatitis. Pancreas. 2007;35(3):256-61.

Cho IH, Kim SW, Kim JB, Kim TK, Lee KW, Han PL, Lee JK. Ethyl pyruvate attenuates kainic acid-induced neuronal cell death in the mouse hippocampus. J Neurosci Res. 2006;84(7):1505-11.

Chooklin S, Pereyaslov A, Bihalskyy I. Pathogenic role of myeloperoxidase in acute pancreatitis. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2009;8(6):627-31.

Chvanov M, Petersen OH, Tepikin A. Free radicals and the pancreatic acinar cells: role in physiology and pathology. Phil Trans R Soc. 2005;360:2273-84.

Cicalese L, Subbotin V, Rastellini C, Stanko RT, Rao AS, Fung JJ. Preservation injury and acute rejection of rat intestinal grafts: protection afforded by pyruvate. J Gastrointest Surg. 1999;3(5):549-54.

Corbel M, Boichot E, Lagente V. Role of gelatinases MMP-2 and MMP-9 in tissue remodeling following acute lung injury. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2000;33:749-54.

de Almeida JL, Jukemura J, Sampietre SN, Patzina RA, da Cunha JE, Machado MC. Effect of hyperthermia on experimental acute pancreatitis. Arq Gastroenterol. 2006;43(4): 316-20.

de Beaux AC, Ross JA, Maingay JP, Fearon KC, Carter DC. Proinflammatory cytokine release by peripheral blood mononuclear cells from patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 1996a;83(8):1071-5.

Referências

69

de Beaux AC, Goldie AS, Ross JA, Carter DC, Fearon KC. Serum concentrations of inflammatory mediators related to organ failure in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 1996b;83(8):349-53.

de Campos T, Deree J, Martins JO, Loomis WH, Shenvi E, Putnam JG, Coimbra R. Pentoxifylline attenuates pulmonary inflammation and neutrophil activation in experimental acute pancreatitis. Pancreas. 2008;37(1):42-9.

Dear JW, Kobayashi H, Jo SK et al. Dendrimer-enhanced MRI as a diagnostic and prognostic biomarker of sepsis-induced acute renal failure in aged mice. Kidney Int. 2005; 67: 2159-67.

Dong YQ, Yao YM, Wei P et al. Effects of ethyl pyruvate on cell-mediated immune function in rats with delayed resuscitation after burn injury. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue 2005;17:12-5.

Dryden GW, Deaciuc I, Arteel G and McClain CJ. Clinical implications of oxidative stress and antioxidant therapy. Current Gastroenterology reports. 2005;7(4):308.

Dugernier TL, Laterre PF, Wittebole X, Roeseler J, Latinne D, Reynaert MS, Pugin J: Compartmentalization of the inflammatory response during acute pancreatitis: correlation with local and systemic complications. Am J Respir Crit Care Med. 2003;168:148-57.

Durand P, Bachelet M, Brunet F, Richard MJ, Dhainaut JF, Dall'Ava J, Polla BS: Inducibility of the 70 kD heat shock protein in peripheral blood monocytes is decreased in human acute respiratory distress syndrome and recovers over time. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161:286-92.

El Kebir D, József L, Pan W, Filep JG. Myeloperoxidase delays neutrophil apoptosis through CD11b/CD18 integrins and prolongs inflammation. Circ Res. 2008;15;(4):352-9.

Fang FC. Nitric oxide and infection. Edited by Fang FC. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers; 1999.

Fink MP. Ethyl pyruvate: a nvel anti-inflammatory agent. J Intern Med 2007;261:349-62.

Flodstrom M, Horwitz MS, Maday A, Balakrishna D, Rodriguez E, Sarvetnick N. A critical role for inducible nitric oxide synthase in host survival following Coxsackivirus B4 infection. Virology. 2001;28:205-15.

Folch E, Closa D, Neco P, Solé S, Planas A, Gelpí E, Roselló-Catafau J. Pancreatitis induces HSP72 in the lung: role of neutrophils and xanthine oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 2000;14;273:1078-83

Frossard JL, Steer ML, Pastor CM. Acute Pancreatitis. Lancet. 2008;12:143-52.

Referências

70

Fu K, Sarras MP Jr, De Lisle RC, Andrews GK. Expression of oxidative stress-responsive genes and cytokine genes during caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol. 1997;273:696-705.

Goldenberg A, Romeo AC, Moreira MB, Apodaca FR, Linhares MM, Matone J. Experimental model of severe acute pancreatitis in rabbits. Acta Cir Bras. 2007;22(5):366-71.

Granger J, Remick D. Acute pancreatitis: models, markers and mediators. Shock. 2005;24:45-51.

Gupta SK, Mohanty I, Trivedi D, Tandon R, Srivastava S, Joshi S. Pyruvate inhibits galactosemic changes in cultured cat lens epithelial cells. Ophthalmic Res. 2002;34(1):23-8.

Harada T, Moore BA, Yang R, Cruz RJ Jr, Delude RL, Fink MP. Ethyl pyruvate ameliorates ileus induced by bowel manipulation in mice. Surgery. 2005;138:530-7.

Hauser B, Kick J, Asfar P, et al. Ethyl pyruvate improves systemic and hepato-splanchnic hemodynamics and prevents lipid peroxidation in a porcine model of resuscitated hyperdynamic endotoxemia. Crit Care Med. 2005;33:2034-42.

Hirota M, Nozawa F, Okabe A, Shibata M, Beppu T, Shimada S, Egami H, Yamaguchi Y, Ikei S, Okajima K, Okamoto K, Ogawa M. Relationship between plasma cytokine concentration and multiple organ failure in patients with acute pancreatitis. Pancreas. 2000;21(2):141-6.

Jancar S, Abdo EE, Sampietre SN, Kwasniewski F, Coelho AM, Bonizzia A, Machado MC. Effect of PAF antagonists on cerulein-induced pancreatitis. J Lipid Mediat Cell Signal. 1995;11(1):41-9.

Johnson CD, Kingsnorth AN, Imrie CW, McMahon MJ, Neoptolemos JP, McKay C, et al. Double blind, randomised, placebo controlled study of a platelet activating factor antagonist, lexipafant, in the treatment and prevention of organ failure in predicted severe acute pancreatitis. Gut 2001;48:62-9.

Kalakonda S, Hegde KR, Varma SD. Ophthalmoscopic and morphogenetic changes in rat lens induced by galactose: attenuation by pyruvate. Diabetes Obes Metab. 2004;6(3):216-22.

Kao KK, Fink MP. The biochemical basis for the anti-inflammatory and cytoprotective actions of ethyl pyruvate and related compounds. Biochem Pharmacol. 2010;80(2):151-9.

Keck T, Balcom JHT, Fernandez-del Castillo C, Antoniu BA, Warshaw AL: Matrix metalloproteinase-9 promotes neutrophil migration and alveolar capillary leakage in pancreatitis-associated lung injury in the rat. Gastroenterology. 2002;122:188-201.

Kim JB, Yu YM, Kim SW, Lee JK. Anti-inflammatory mechanism is involved in ethyl pyruvate-mediated efficacious neuroprotection in the postischemic brain. Brain Res. 2005;1060:188-92.

Referências

71

Kohn DF, Wixson SK, White WJ, Benson GJ. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 1st ed. San Diego: Academic Press; 1997.

Latchman DS. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res. 2001;51(4):637-46.

Lee PP, Hwang JJ, Mead L, Ip MM. Functional role of matrix metalloproteinases in mammary epithelial cell development. J Cell Physiol. 2001;188:75-88.

Leung PS, Chan YC. Role of oxidative stress in pancreatic inflammation. Antioxid Redox Signal. 2009;11(1):135-65.

Li K, Wu CT, Qiu XH. Effect of ethyl pyruvate on peroxidation injury of intestinal mucosa in rats with severe abdominal infection. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xué. 2006;18:154-6.

Lindkvist B, Appelros S, Manjer J, Borgström A. Trends in incidence of acute pancreatitis in a Swedish population: is there really an increase? Clin Gastroenterol Hepatol. 2004;2(9):831-7.

Luan ZG, Zhang H, Ma XC, Zhang C, Guo RX. Role of high-mobility group box 1 protein in the pathogenesis of intestinal barrier injury in rats with severe acute pancreatitis. Pancreas. 2010;39(2):216-23.

Machado MC, Coelho AM, Pontieri V, Sampietre SN, Molan NA, Soriano F, et al. Local and systemic effects of hypertonic solution (NaCl 7.5%) in experimental acute pancreatitis. Pancreas. 2006;32:80-6.

Marber MS, Mestril R, Chi SH, Sayen MR, Yellon DM, Dillmann WH: Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury. J Clin Invest 1995;95:1446-56.

Matheus AS, Coelho AM, Jukemura J, Sampietre SN, Patzina RA, Cunha JE, Machado MC. Effect of inhibition of prostaglandin E2 production on pancreatic infection in experimental acute pancreatitis. HPB. 2007;9(5):392-7.

Matheus AS, Coelho AM, Sampietre SN, Jukemura J, Patzina RA, Cunha JE, Machado MC. Do the effects of pentoxifylline on inflammation process and pancreatic infection justify its use in acute pancreatitis? Pancreatology. 2009,9(5):687-93.

Mayer J, Rau B, Gansauge F, Beger HG. Inflammatory mediators in human acute pancreatitis: clinical and pathophysiology implications. Gut. 2000;47(4):546-52.

McCormick PH, Chen G, Tlerney S, Kelly CJ, Bouchier-Hayes DJ: Clinically relevant thermal preconditioning attenuates ischemia-reperfusion injury. J Surg Res. 2003;109:24-30.

Referências

72

Meduri GU, Kohler G, Headley S, Tolley E, Stentz F, Postlethwaite A.Inflammatory cytokines in the BAL of patients with ARDS. Persistent elevation over time predicts poor outcome.Chest. 1995;108(5):1303-14.

Michetti C, Coimbra R, Hoyt DB, Loomis W, Junger W, Wolf P. Pentoxifylline reduces acute lung injury in chronic endotoxemia. J Surg Res. 2003;115(1):92-9.

Mikami Y, Dobschütz EV, Sommer O, Wellner U, Unno M, Hopt U, Keck T. Matrix metalloproteinase-9 derived from polymorphonuclear neutrophils increases gut barrier dysfunction and bacterial translocation in rat severe acute pancreatitis. Surgery. 2009;145(2):147-56.

Millar DG, Garza KM, Odermatt B, Elford AR, Ono N, Li Z, Ohashi PS: Hsp70 promotes antigen-presenting cell function and converts T-cell tolerance to autoimmunity in vivo. Nat Med 2003;9:1469-76.

Miyaji T, Hu X, Yuen PST et al. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 2003;64:1620-31.

Mongan PD, Capacchione J, West S, Karaian J, Dubois D, Keneally R, Sharma P.Pyruvate improves redox status and decreases indicators of hepatic apoptosis during hemorrhagic shock in swine. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002;283(4):H1634-44.

Montagnini AL, Kubrusly MS, Coelho AM, Molan NAT, Cunha JE, Machado MCC, Pinotti HW. Efeito do omeprazol sobre o conteúdo pancreático de enzimas em ratos. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 1995;50(5):272-5.

Moretti AI, Rios EC, Soriano FG, de Souza HP, Abatepaulo F, Barbeiro DF, Velasco IT. Acute pancreatitis: hypertonic saline solution increases heat shock proteins 70 and 90 and reduces neutrophil infilttation in lung injury. Pancreas. 2009;38(5):507-14.

Muhs BE, Patel S, Yee H, Marcus S, Shamamian P: Increased matrix metalloproteinase expression and activation following experimental acute pancreatitis. J Surg Res. 2001;101:21-8.

Muhs BE, Patel S, Yee H, Marcus S, Shamamian P: Inhibition of matrix metalloproteinases reduces local and distant organ injury following experimental acute pancreatitis. J Surg Res. 2003;109:110-17.

Mulier KE, Beilman GJ, Conroy MJ, Taylor JH, Skarda DE, Hammer BE. Ringer’s ethyl pyruvate in hemorrhagic shock and resuscitation does not improve early hemodynamics or tissue energetics. Shock. 2005;23:248-52.

Norman JG, Fink GW, Denham W, Yang J, Carter G, Sexton C, Falkner J, Gower WR, Franz MG. Tissue-specific cytokine production during experimental acute pancreatitis. A probable mechanism for distant organ dysfunction. Dig Dis Sci. 1997;42(8):1783-8.

Referências

73

Norman JG, Fink GW, Franz MG. Acute pancreatitis induces intrapancreatic tumor necrosis factor gene expression. Arch Surg. 1995;130(9):966-70.

Norman JG. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. Am J Surg. 1998;175(1):76-83.

Pezzilli R, Billi P, Miniero R, Fiocchi M, Cappelletti O, Morselli-Labate AM, Barakat B, Sprovieri G, Miglioli M. Serum interleukin-6, interleukin-8, and beta 2-microglobulin in early assessment of severity of acute pancreatitis. Comparison with serum C-reactive protein. Dig Dis Sci. 1995;40(11):2341-8.

Pezzilli R, Morselli-Labate AM, Barakat B, Fiocchi M, Cappelletti O. Is the association of serum lipase with beta2-microglobulin or C-reactive protein useful for establishing the diagnosis and prognosis of patients with acute pancreatitis? Clin Chem Lab Med. 1998;36(12):963-7.

Pezzilli R, Morselli-Labate AM, Miniero R, Barakat B, Fiocchi M, Cappelletti O.Simultaneous serum assays of lipase and interleukin-6 for early diagnosis and prognosis of acute pancreatitis. Clin Chem. 1999;45(10):1762-7.

Pooran N, Indaram A, Singh P, Bank S. Cytokines (IL-6, IL-8, TNF): early and reliable predictors of severe acute pancreatitis. J Clin Gastroenterol. 2003;37(3):263-6.

Qui B, Mei QB, Ma JJ, Korsten MA. Susceptibility to cerulein-induced pancreatitis in inducible nitric oxide synthase-deficient mice. Pâncreas. 2001;23:89-93.

Rahman I, MacNee W. Lung glutathione and oxidative stress: implications in cigarette smoke-induced airway disease. Am J Physiol. 1999;277(1):1067-88.

Rakonczay Z Jr., Takacs T, Boros I, Lonovics J. Heat shock proteins and the pancreas. J Cell Physiol. 2003;195:383-91.

Remick DG, Bolgos GR, Siddiqui J, Shin J, Nemzek JA. Six at six: interleukin-6 measured 6 h after the initiation of sepsis predicts mortality over 3 days. Shock. 2002;17(6):463-7.

Riché FC, Cholley BP, Laisné MJ, Vicaut E, Panis YH, Lajeunie EJ, Boudiaf M, Valleur PD. Inflammatory cytokines, C reactive protein, and procalcitonin as early predictors of necrosis infection in acute necrotizing pancreatitis. Surgery. 2003;133(3):257-62.

Salahudeen AK, Clark EC, Nath KA. Hydrogen peroxide-induced renal injury. A protective role for pyruvate in vitro and in vivo. J Clin Invest. 1991;88(6):1886-93.

Salem MZ, Cunha JE, Coelho AM, Sampietre SN, Machado MC, Penteado S, Abdo EE. Effects of octreotide pretreatment in experimental acute pancreatitis. Pancreatology. 2003;3(2):164-8.

Referências

74

Sappington PL, Fink ME, Yang R, Delude RL, Fink MP. Ethyl pyruvate provides durable protection against inflammation-induced intestinal epithelial barrier dysfunction. Shock. 2003;20(6):521-8.

Sassatani AS. Análise da influência de pressão ductal retrógrada na pancreatite aguda experimental. Tese (Mestrado) São Paulo: Faculdade de Ciências Medicas da Santa Casa de São Paulo; 2008.

Scorzone KA, Panniers R, Rowlands AG, Henshaw EC. Phosphorylation of eukariotic initiation factor 2 during physiological stresses that affect protein synthesis. J BiolChem. 1987;262:14538-43.

Seta T, Noguchi Y, Shimada T, Shikata S, Fukui T. Treatment of acute pancreatitis with protease inhibitors: a meta-analysis. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2004;16:1287-93.

Shang GH, Lin DJ, Xiao W, Jia CQ, Li Y, Wang AH, Dong L. Ethyl pyruvate reduces mortality in an endotoxin-induced severe acute lung injury mouse model. Respir Res. 2009;2;10:91.

Shimada M, Andoh A, Hata K, Tasaki K, Araki Y, Fujiyama Y, Bamba T. IL-6 secretion by human pancreatic periacinar myofibroblasts in response to inflammatory mediators. J Immunol. 2002;15;168(2):861-8.

Sileri P, Schena S, Morini S, Rastellini C, Pham S, Benedetti E, Cicalese L. Pyruvate inhibits hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Transplantation. 2001;15;72(1):27-30.

Simovic MO, Bonham MJ, Abu-Zidan FM, Windsor JA. Anti-inflammatory cytokine response and clinical outcome in acute pancreatitis. Crit Care Med. 1999;27(12):2662-5.

Sims CA, Wattanasirichaigoon S, Menconi MJ, Ajami AM, Fink MP. Ringer’s ethyl pyruvate solution ameliorates ischemia/reperfusion-induced intestinal mucosal injury in rats. Crit Care Med. 2001;29:1513-8.

Sittipunt C, Steinberg KP, Ruzinski JT, Myles C, Zhu S, Goodman RB, et al. Nitric oxide and nitrotyrosine in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 2001;163(2):503-10.

Souza LJ, Sampietre SN, Assis RS, Knowles CH, Leite KR, Jancar S, Monteiro Cunha JEM, Machado MC. Effect of platelet-activating factor antagonists (BN-52021, WEB-2170, and BB-882) on bacterial translocation in acute pancreatitis. J Gastrointest Surg. 2001;5(4):364-70.

Su KH, Cuthbertson C, Christophi C. Review of experimental animal models of acute pancreatitis. HPB (Oxford). 2006;8(4):264-86.

Tashiro M, Ernst SA, Edwards J, Williams JA. Hyperthermia induces multiple pancreatic heat shock proteins and protects against subsequent arginine-induced acute pancreatitis in rats. Digestion. 2002;65(2):118-26.

Referências

75

Tawadrous ZS, Delude RL, Fink MP. Resuscitation from hemorrhagic shock with Ringer’s ethyl pyruvate solution improves survival and ameliorates intestinal mucosal hyperpermeability in rats. Shock 2002;17:473-7.

Tenhunen JJ, Martikainen TJ, Uusaro A, Ruokonen E.Dopexamine reverses colonic but not gastric mucosal perfusion defects in lethal endotoxin shock. Br J Anaesth. 2003;91(6):878-85.

Tonini KC, Speranzini MB, Neves MM, Rodrigues C and Goldenberg S. Pancreatite necro-hemorrágica induzida por taurocolato de sódio: estudos das lesões anátomo-patológicas em ratos. Acta Cir Bras. 1993;8(3):96-103.

Tonsi AF, Bacchion M, Crippa S, Malleo G, Bassi C. Acute pancreatitis at the beginning of the 21st century: the state of the art. World J Gastroenterol. 2009;15(24):2945-59.

Tsung A, Kaizu T, Nakao A et al. Ethyl pyruvate ameliorates liver ischemia-reperfusion injury by decreasing hepatic necrosis and apoptosis. Transplantation. 2005;27:196-204.

Uchiyama T, Delude RL, Fink MP. Dose-dependent effects of ethyl pyruvate in mice subjected to mesenteric ischemia and reperfusion. Intensive Care Med. 2003;29:2050-8.

Ulloa L, Ochani M, Yang H et al. Ethyl pyruvate prevents lethality in mice with established lethal sepsis and systemic inflammation. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:12351-6.

Varma SD, Devamanoharan PS, Ali AH. Prevention of intracellular oxidative stress to lens by pyruvate and its ester. Free Radic Res. 1998;28(2):131-5.

Venkataraman R, Kellum JA, Song M, Fink MP. Resuscitation with Ringer's ethyl pyruvate solution prolongs survival and modulates plasma cytokine and nitrite/nitrate concentrations in a rat model of lipopolysaccharide-induced shock. Shock. 2002;18(6):507-12.

Villar J, Ribeiro SP, Mullen JB, Kuliszewski M, Post M, Slutsky AS: Induction of the heat shock response reduces mortality rate and organ damage in a sepsis-induced acute lung injury model. Crit Care Med. 1994;22:914-21.

Vodovotz Y, Kim PK, Bagci EZ, Ermentrout GB, Chow CC, Bahar I and Billiar TR. Inflammatory modulation of hepatocyte apoptosos by nitric oxide: in vitro, in vivo and in silico studies. Curr Mol Med. 2004;4:753-62.

Wagner AC, Weber H, Jonas L, Nizze H, Strowski M, Fiedler F, Printz H, Steffen H, Goke B: Hyperthermia induces heat shock protein expression and protection against cerulein-induced pancreatitis in rats. Gastroenterology. 1996;111:1333-42.

Wang WJ, Yao YM, Xian LM, Dong N, Yu Y. Effect of treatment with ethyl pyruvate on multiple organ dysfunction and mortality following delayed resuscitation after burn injury in rat. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue 2006;18:132-5.

Referências

76

Waynforth HB, Flecknell PA. Experimental and Surgical Technique in the Rat. 2nd ed. San Diego: Elsevier Academic Press; 2004.

Weber H, Wagner AC, Jonas L, Merkord J, Hofken T, Nizze H, Leitzmann P, Goke B, Schuff-Werner P: Heat shock response is associated with protection against acute interstitial pancreatitis in rats. Dig Dis Sci. 2000;45:2252-64.

Wen T, Liu L, Xiong GZ. Matrix metalloproteinase levels in acute aortic dissection, acute pancreatitis and other abdominal pain. Emerg Med J. 2009;26(10):715-8.

Wischmeyer PE. Glutamine and heat shock protein expression. Nutrition. 2002;18:225-8.

Wittel UA, Wiech T, Chakraborty S, Boss B, Lauch R, Batra SK, Hopt UT. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 2008;36(2):9-21.

Woo YJ, Taylor MD, Cohen JE et al. Ethyl pyruvate preserves cardiac function and attenuates infarct size following prolonged myocardial ischemia. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004;127:1262-9.

Yada-Langui MM, Coimbra R, Lancellotti C, Mimica I, Garcia C, Correia N Jr, et al. Hypertonic saline and pentoxifylline prevent lung injury and bacterial translocation after hemorrhagic shock. Shock. 2000;14:594-8.

Yadav D, Lowenfels AB. Trends in the epidemiology of the first attack of acute pancreatitis: a systematic review. Pancreas. 2006;33(4):323-30.

Yang R, Gallo DJ, Baust JJ et al. Ethyl pyruvate modulates inflammatory gene expression in mice subjected to hemorrhagic shock. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002; 283:212-22.

Yang R, Shaufl AL, Killeen ME, Fink MP. Ethyl pyruvate ameliorates liver injury secondary to severe acute pancreatitis. J Surg Res. 2009;153(2):302-9.

Yang R, Uchiyama T, Alber SM, Han X, Watkins SK, Delude RL, Fink MP. Ethyl pyruvate ameliorates distant organ injury in a murine model of acute necrotizing pancreatitis. Crit Care Med. 2004;32(7):1453-9.

Yang T, Mao YF, Liu SQ, Hou J, Cai ZY, Hu JY, Ni X, Deng XM, Zhu XY. Protective effects of the free radical scavenger edaravone on acute pancreatitis-associated lung injury. Eur J Pharmacol. 2010;630(1-3):152-7.

Yang ZY, Ling Y, Yin T, Tao J, Xiong JX, Wu HS, Wang CY. Delayed ethyl pyruvate therapy attenuates experimental severe acute pancreatitis via reduced serum high mobility group box 1 levels in rats. World J Gastroenterol. 2008;28;14(28):4546-50.

Yao V, McCauley R, Cooper D, Platell C, Hall JC. Myeloperoxidase response to peritonitis in an experimental model. ANZ J Surg. 2003;73(12):1052-6.

Referências

77

Yoo MH, Lee JY, Lee SE, Koh JY, Yoon YH. Protection by pyruvate of rat retinal cells against zinc toxicity in vitro, and pressure-induced ischemia in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45(5):1523-30.

Yu YM, Kim JB, Lee KW, Kim SY, Han PL, Lee JK. Inhibition of the cerebral ischemic injury by ethyl pyruvate with a wide therapeutic window. Stroke. 2005; 36: 2238-43.

Zervos EE, Shafii AE, Rosemurgy AS. Matrix metalloproteinase (MMP) inhibition selectively decreases type II MMP activity in a murine model of pancreatic cancer. J Surg Res. 1999;81:65.

Zhao W, Devamanoharan PS, Henein M, Ali AH, Varma SD. Diabetes-induced biochemical changes in rat lens: attenuation of cataractogenesis by pyruvate. Diabetes Obes Metab. 2000;2(3):165-74.

ABSTRACT MATONE J. Effects of ethyl-pyruvate in inflammatory response of acute lung injury in experimental acute pancreatitis in rats [thesis]. São Paulo: Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo; 2010. INTRODUCTION: Severe acute pancreatitis (AP) is characterized by hemodynamic alterations and systemic inflammatory response leading to a high mortality rate. In AP the inappropriate activation of pancreatic enzymes plays an important role in pancreas autodigestion and in the inflammatory mechanisms responsible for the systemic response of the disease. Ethyl-pyruvate, a novel anti-inflammatory agent, simple derivative of endogenous metabolite, has been shown to improve survival and/or ameliorate organ dysfunction in a wide variety of preclinical models of critical illnesses, such as severe sepsis, acute respiratory distress syndrome and stroke. It was hypothesized that the EP could diminish the systemic response and acute lung injury associated to necrotizing acute pancreatitis. PURPOSE: The aim of the present study was to evaluate if the ethyl-pyruvate solution could reduce mortality in AP and/or diminish the acute lung injury. METHODS: 40 male rats, weighing between 270 to 330 grams were operated. An experimental model of severe AP by injection of 0,1ml/100g of 2.5% sodium taurocholate into the bilio-pancreatic duct was utilized. The rats were divided into 2 groups of 10 animals each: CT - control (treatment with 50ml/kg of Ringer’s solution, intraperitoneal) and EP (treatment with 50ml/kg of Ringer ethyl-pyruvate solution, intra-peritoneal), 3 hours following AP induction. After 6 hours, a new infusion of the treatment solution was performed in each group. Two hours later, the animals were killed and the pulmonary parenchyma was resected for biomolecular analysis, consisting of: interleukin, myeloperoxidase, MDA, nitric oxide, metalloproteinases and heat shock protein. In the second part of the experiment, another, 20 rats were randomly divided into EP and CT groups, in order to evaluate a survival comparison between the two groups. RESULTS: There were no significant differences in IL-1B,IL-10, MMP-9, HSP70, nitric oxide, MPO, MDA (lipidic peroxidation) concerning both groups. The levels of IL-6 were significantly diminished in the EP group. Furthermore, the MMP-2 levels were also reduced in the EP group. (p<0,05). The animals from the EP treatment groups had improved survival, when compared to control group. (p<0.05). CONCLUSIONS: The ethyl-pyruvate diminishes acute lung injury inflammatory response in acute pancreatitis and ameliorates survival when compared to control group, in the experimental model of necrotizing acute pancreatitis. Key words: 1. Acute necrotizing pancreatitis, 2. Rats. 3. Pyruvate. 4. Inflammation.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

Kaliste E. The Welfare of Laboratory Animals. 1st ed. Dordrecht: Springer; 2007.

List of Journals Indexed in Index Medicus. Abreviatura dos títulos dos periódicos.

Rother ET, Braga MER. Como elaborar sua tese: estrutura e referências. São Paulo: [s.n.], 2005. 122p.

Stedman TL. Stedman’s Medical Dictionary. 2nd ed. Boston: Lippincott Williams & Wilkins; 2004.

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