Efeitos da simpatectomia no miocárdio - incor.usp.br · cDNA ácido desoxirribonucleico...

Maurício Rodrigues Jordão

Efeitos da simpatectomia no miocárdio

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Programa de Cardiologia

Orientador: Prof. Dr. Felix José Alvarez Ramires

São Paulo

2017

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Jordão, Maurício Rodrigues

Efeitos da simpatectomia no miocárdio / Maurício Rodrigues Jordão. -- São

Paulo, 2017.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Cardiologia.

Orientador: Felix José Alvarez Ramires.

Descritores: 1.Simpatectomia 2.Sistema nervoso autônomo 3.Miocárdio

USP/FM/DBD-142/17

DEDICATÓRIA

Á minha família

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Felix José Alvarez Ramires, cardiologista

e amigo, por ter me recebido de braços abertos e ser presente em vários

projetos profissionais além deste. Minha admiração, gratidão e respeito, por

toda sua dedicação e, sobretudo, paciência.

Aos amigos Orlando Ribeiro, Keila Fonseca e Fernanda G. Pessoa por

participar em momentos decisivos deste trabalho que foram fundamentais para

o sucesso desta tese.

À família Cardio Geral, Profa. Dra. Bárbara Maria Ianni, Prof. Dr.

Edmundo Arteaga Fernandez, Prof. Dr. Fábio Fernandes, Dr. André Luiz

Dabarian, Dr. Ricardo Ribeiro Dias, Dr. Luciano Nastari, Dra. Paula Buck,

Roseli Chaves pela acolhida afetuosa, dedicação e momentos felizes que tive o

privilégio de fazer parte durante esses anos.

Ao Prof. Dr. Charles Mady, pelos conselhos científicos e profissionais,

meu respeito e admiração.

À Profa. Dra. Vera Maria Cury Salemi pelo auxílio com os

ecocardiogramas.

À amiga Lucia Maria de Oliveira pelo empenho e trabalho essencial na

disposição final desta tese.

Aos colegas Fernando Zanoni, Rafael Dantas, Leandro E. Souza e

Fernando dos Santos pelo auxílio nos procedimentos experimentais e análises

de dados.

À FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo)

pelo suporte financeiro deste projeto que possibilitou a execução dessa tese.

“A dúvida não é uma condição agradável, mas a certeza é absurda.”

Voltaire

Esta dissertação ou tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento

desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por

Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de

Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de

Biblioteca e Documentação; 2011.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index

Medicus.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ................................................................................................. 11 2.1. Objetivo geral ............................................................................................... 12 2.2. Objetivos específicos ................................................................................... 12

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 13 3.1. Modelo experimental .................................................................................... 14 3.2. Eletrocardiograma ........................................................................................ 17 3.3. Ecocardiograma ........................................................................................... 17 3.4. Avaliação da modulação autonômica cardiovascular ................................... 18 3.5. Teste de esforço máximo aeróbio ................................................................ 19 3.6. Análise da atividade simpática ..................................................................... 20 3.6.1. Receptores β1 e β2 no miocárdio ................................................................. 20 3.6.1.1. Extração do ácido ribonucleico (RNA) .......................................................... 20 3.6.1.2. Tratamento do RNA total com a enzima DNase free .................................... 22 3.6.1.3. Transcrição reversa (síntese de DNA complementar (cDNA)) ...................... 22 3.6.1.4. Reação de RT-PCR ..................................................................................... 23 3.6.2. Catecolaminas periféricas ............................................................................ 25 3.6.3. Catecolaminas miocárdicas .......................................................................... 26 3.6.3.1. Quantificação ............................................................................................... 27 3.7. Análise estrutural ......................................................................................... 27 3.7.1. Tamanho do miócito ..................................................................................... 27 3.8. Análise estatística ........................................................................................ 28

4. RESULTADOS ............................................................................................. 30 4.1. Variáveis eletrocardiográficas ...................................................................... 31 4.2. Variáveis ecocardiograficas .......................................................................... 33 4.3. Análises da modulação autonômica ............................................................. 34 4.4. Análises do teste de esforço máximo aeróbio .............................................. 36 4.5. Receptores β1 e β2 ...................................................................................... 40 4.6. Catecolaminas periféricas ............................................................................ 42 4.7. Catecolaminas miocárdicas .......................................................................... 43 4.8. Tamanho do miócito ..................................................................................... 44

5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 45

6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 54

7. LIMITAÇÕES DO ESTUDO ......................................................................... 56

8. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 58

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C grau Celsius

µg micrograma

µL microlitro

µm micrômetro

AF alta frequência

BF baixa frequência

BIL simpatectomia bilateral

cDNA ácido desoxirribonucleico complementar

CEUA Comitê de ética para uso animal

COBEA Colégio Brasileiro de Estudos com Animais

CT controle

CTA controle com atenolol

DC débito cardíaco

DCT transformada discreta de cosseno

DD diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo

DEPC pirocarbonato de dietila

DHBA dihidroxibenzilamina

DNase desoxiribonuclease

DP IP desvio padrão do intervalo de pulso

DS diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo

DSR denervação simpática renal

EME estimulação da medula espinhal

FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

FC frequência cardíaca

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

FE fração de ejeção

FiO2 fração inspirada de oxigênio

GAPDH gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

HE hematoxilina-eosina

HPLC cromatografia líquida de alta performance

IC insuficiência cardíaca

IP intervalo de pulso

IPM índice de performance miocárdica

M molar

mL mililitro

nM milimolar

NT-proBNP fragmento N-terminal do peptídeo natriurético tipo B

N normalidade

PA pressão arterial

PAD pressão arterial diastólica

PAM pressão arterial média

PAS pressão arterial sistólica

PCR reação em cadeia da polimerase

PET tomografia por emissão de pósitrons

pg picograma

qRT-PCR reação da polimerase em cadeia semi-quantitativa em tempo real

RAβ1 receptores adrenérgicos beta 1

RAβ2 receptores adrenérgicos beta 2

RNA ácido ribonucleico

rpm rotações por minuto

RT-PCR reação da polimerase em cadeia em tempo real

SNA sistema nervoso autônomo

SNC sistema nervoso central

SNS sistema nervoso simpático

TA temperatura ambiente

TRIV tempo de relaxamento isovolumétrico

UFAW Universities Federation for Animal Welfare

UNI simpatectomina unilateral esquerda

UNIA simpatectomina unilateral esquerda com atenolol

VAR IP variância total do intervalo de pulso

VAR PAS variância da pressão arterial sistólica

VE ventrículo esquerdo

VO2 consumo de oxigênio

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 - Animal após procedimento de simpatectomia ....................................... 15

Figura 2 - Desenho do estudo . .............................................................................. 16

Figura 3 - Corte em HE do miócito ilustrando sua medida ..................................... 28

Figura 4 - Frequência cardíaca após 6 semanas ................................................... 32

Figura 5 - Diâmetro sistólico e diastólico final do ventrículo esquerdo ................... 33

Figura 6 - Fração de ejeção do ventrículo esquerdo .............................................. 34

Figura 7 - Variável alta frequência da análise de modulação autonômica ............... 35

Figura 8 - Pressão arterial sistólica e diastólica em repouso ................................. 37

Figura 9 - Frequência cardíaca em repouso .......................................................... 38

Figura 10 - Pressão arterial diastólica e média no pico do esforço .......................... 39

Figura 11 - Frequência cardíaca no pico do esforço ................................................ 40

Figura 12 - Receptores β1 no ápice e na base do VE .............................................. 41

Figura 13 - Receptores β2 no ápice e na base do VE .............................................. 41

Figura 14 - Adrenalina periférica ............................................................................. 42

Figura 15 - Noradrenalina periférica ........................................................................ 43

Tabela 1 - Primers usados para avaliar os receptores β-adrenérgicos ..................... 24

Tabela 2 - Intervalo PR e QTc .................................................................................. 32

Tabela 3 - Variáveis ecocardiográficas ..................................................................... 34

Tabela 4 - Variáveis da modulação autonômica ....................................................... 35

Tabela 5 - Variáveis do teste de esforço máximo aeróbio ......................................... 36

Tabela 6 - Concentração miocárdica de catecolaminas ............................................ 43

Tabela 7 - Valores do tamanho do miócito ................................................................ 44

../../../../../../../Downloads/FGP-Rascunho%2013.doc#_Toc379888588














../Downloads/FGP-Rascunho%2013.doc#_Toc379888594






RESUMO

Jordão MR. Efeitos da simpatectomia no miocárdio [tese]. São Paulo:

Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017.

A simpatectomia é uma modalidade terapêutica ampla e consagrada há

décadas para determinadas patologias. Recentemente, alguns trabalhos

sugerem a aplicação de tal técnica no tratamento da insuficiência cardíaca.

Contudo, seus efeitos fisiológicos cardíacos em modelos experimentais foram

pouco estudados. O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos fisiológicos da

simpatectomia no coração. Para tal, foi utilizado o modelo experimental de

simpatectomia em ratos pela técnica de esclerose do gânglio estrelado por

punção e injeção de álcool absoluto. O estudo avaliou cinco grupos: controle

(15 animais), simpatectomia unilateral esquerda (15 animais), simpatectomia

bilateral (31 animais), simpatectomia unilateral esquerda com atenolol

(15 animais) e atenolol sem simpatectomia (15 animais). Foram avaliadas as

variáveis relacionadas ao sistema nervoso autônomo, como propriedades

cronotrópicas em repouso e ao esforço, modulação autonômica cardiovascular,

catecolaminas miocárdicas e periféricas e receptores beta-adrenérgicos do

miocárdio. Também foram analisados os efeitos na função ventricular e no

tamanho do miócito. As variáveis propostas para análise foram obtidas por

ECG de repouso, ecocardiograma, teste de esforço máximo, frequência

cardíaca ao esforço e variabilidade da FC e da PAS avaliadas no domínio do

tempo e da frequência. As informações do miocárdio quanto a receptores,

catecolaminas miocárdicas, catecolaminas periféricas e tamanho dos miócitos

foram obtidas por PCR, ELISA, HPLC e morfometria do miócito,

respectivamente. Este estudo evidenciou que os animais do grupo bilateral

apresentam maiores níveis de catecolaminas periféricas e, consequentemente,

são mais taquicárdicos e hipertensos. Os achados sugerem a ativação, neste

grupo, de uma via compensatória que pode ter efeitos deletérios.

Descritores: simpatectomia, sistema nervoso autônomo, miocárdio

ABSTRACT

Jordão MR. Sympathectomy effects upon myocardium [thesis]. São Paulo:

“Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017.

Sympathectomy is a therapeutic modality used to treat certain diseases during

decades. Recently, some studies suggest the application of this technique in

the treatment of heart failure. However, its physiological effects upon the heart

have been slightly studied. The objective of this study was to evaluate the

physiological effects of sympathectomy in the heart. For this purpose, we used

the experimental model of sympathectomy in rats by stellate ganglion sclerosis

technique starring puncture and absolute alcohol injection. The study evaluated

five groups of wistar rats: control (15), left unilateral sympathectomy (15),

bilateral sympathectomy (31), left unilateral sympathectomy with atenolol (15)

and atenolol without sympathectomy (15). We assessed variables related to the

autonomic nervous system, such as chronotropic properties at rest and stress,

cardiovascular autonomic modulation, myocardial and peripheral

catecholamines and beta-adrenergic receptors in the myocardium. As well, we

studied the effects on ventricular function and myocyte size. The proposed

variables for analysis were obtained by resting electrocardiogram,

echocardiography, maximal exercise test, heart rate at exercise and heart rate

and systolic blood pressure variability in the time and frequency domain. The

myocardial receptors, myocardial and peripheral catecholamines and myocyte

size were obtained by PCR, ELISA, HPLC and myocyte morphometry,

respectively. This study showed that the animals in the bilateral group had

higher levels of peripheral catecholamine and, consequently, a higher heart rate

and blood pressure. These findings suggest the activation of a compensatory

pathway in the sympathectomy group that may have deleterious effects.

Descriptors: sympathectomy, autonomic nervous system, myocardium

remodeling

1. INTRODUÇÃO

2

Introdução

Uma das primeiras descrições do sistema nervoso autônomo (SNA) foi

feita por Langley no início do século passado, quando o definiu como fibras

nervosas que saíam do sistema nervoso central para os vasos sanguíneos e

vísceras, divididas em sistema simpático (toracolombar) e parassimpático

(craniosacral). Esta separação baseou-se no desenvolvimento embrionário, na

distribuição da inervação para os órgãos-alvo e seus efeitos antagônicos em

resposta a estímulos elétricos e a fármacos como adrenalina, pilocarpina ou

atropina. Os segmentos espinhais de feixes nervosos para diferentes órgãos

foram definidos examinando a resposta orgânica a diferentes estímulos da raiz

ventral. Além disso, sinapses ganglionares foram localizadas por aplicação

tópica de nicotina. Este estudo indicou que os órgãos recebem inervação

simpática e parassimpática e que seus efeitos geralmente se opõem1. Pouco

tempo depois, Walter Cannon2 descreveu o sistema nervoso simpático (SNS)

como o centro regulador da homeostase, mostrando que animais com

estímulos agressores (estressores) respondiam com ativação do SNS, o que

implicava em alterações no suprimento sanguíneo, disponibilidade de açúcar,

alterações na formação do coágulo, mobilizando recursos para um intenso

gasto energético, direcionado a uma resposta de emergência de luta ou fuga.

O SNS tem ampla variedade de ações no sistema cardiovascular,

incluindo elevação da frequência cardíaca (FC), aumento da contratilidade

miocárdica, redução da capacitância venosa e aumento da resistência

vascular. As fibras nervosas simpáticas cardíacas estão localizadas no

epicárdio, seguindo o trajeto das artérias coronárias e representam o principal

componente autonômico dos ventrículos. As fibras parassimpáticas

3

Introdução

acompanham o nervo vago no subendocárdio e, após cruzar o sulco

atrioventricular, distribuem-se predominantemente no miocárdio atrial3. A

inervação simpática ventricular é caracterizada por gradiente da base para o

ápice4, com maior densidade de fibras na base, diminuindo para o ápice de

maneira oposta aos receptores β que invertem esta distribuição5. O fluxo

simpático para o coração e periferia é regulado por reflexos cardiovasculares.

Fibras aferentes levam o impulso ao sistema nervoso central (SNC) por nervos

autonômicos, enquanto impulsos eferentes saem do SNC para diferentes

órgãos, tanto por nervos autonômicos, como somáticos. As principais respostas

reflexas originam-se do arco aórtico e barorreceptores carotídeos (inibição do

SNS), barorreceptores cardiopulmonares (diversos reflexos incluindo o reflexo de

Bezold-Jarisch, inibição do SNS), receptores cardiovasculares polimodais de

baixo limiar (ativação do SNS) e quimiorreceptores periféricos (ativação do SNS).

O efeito da ativação do SNS na periferia é mediado por quatro vias:

1) noradrenalina liberada pelo gânglio estrelado direito que atua no nó sinusal e

atrioventricular, resultando em aumento da freqüência cardíaca e diminuição da

condução atrioventricular, e a noradrenalina liberada pelo gânglio estrelado

esquerdo, atuando no ventrículo esquerdo, com aumento de força de contração

miocárdica e pressão arterial; 2) adrenalina liberada pelo córtex adrenal que

atua no miocárdio e vasos periféricos; 3) efeito direto nos vasos periféricos pela

liberação local de adrenalina e noradrenalina; 4) noradrenalina circulante com

múltiplos locais de ação.

Os neurotransmissores (noradrenalina e adrenalina) ligam-se a

receptores adrenérgicos específicos presentes na membrana celular para

4

Introdução

exercer seus efeitos biológicos. Existem nove subtipos diferentes de receptores

adrenérgicos: três 1-receptores (1A, 1B e 1D), três 2-receptores (2A, 2B

e 2C) e três β-receptores (β1, β2 e β3)6. O miocárdio humano apresenta os três

subtipos de receptores adrenérgicos β. Os subtipos β1 e β2 estão presentes na

proporção de 7:3 e, quando estimulados, aumentam a contratilidade cardíaca

(efeito inotrópico positivo), a frequência cardíaca (efeito cronotrópico positivo), a

capacidade de relaxamento do miocárdio (efeito lusitrópico positivo), como

também a condução de impulsos através do nó atrioventricular (efeito

dromotrópico positivo). Os receptores adrenérgicos β3 estão predominantemente

inativos em condições fisiológicas. Entretanto, sua estimulação parece produzir

efeito inotrópico negativo, antagônico ao estímulo induzido por receptores

adrenérgicos β1 e β2 que envolve a via da enzima óxido nítrico sintase e age

como válvula de segurança durante, estimulação adrenérgica intensa.7

No miocárdio humano, a ativação dos receptores adrenérgicos β1 e β2

é o mecanismo fisiológico mais eficaz para aumentar rapidamente o débito

cardíaco. Receptores adrenérgicos β1 ativam exclusivamente proteínas Gs que

potencializam a ação nos receptores adrenérgicos, enquanto os receptores

adrenérgicos β2 usam as proteínas Gs e também as Gi que minimizam a ação

nos receptores adrenérgicos.8

O miocárdio humano também expressa receptores adrenérgicos 1A e

1B em proporções menores (20%) que os receptores adrenérgicos β,9 com

papel desconhecido em situações fisiológicas. Além disso, os receptores

adrenérgicos 1 são muito numerosos em artérias maiores (aorta, artéria

5

Introdução

pulmonar, vasos mesentéricos e coronárias) e, quando ativados pela noradrenalina

e adrenalina, são os maiores responsáveis pela regulação do fluxo sanguíneo

por vasoconstrição.

Nos últimos 20 anos, diversos estudos, clínicos e experimentais,

demonstraram a participação do SNS em várias doenças cardiovasculares,

como a hipertensão arterial sistêmica, insuficiência cardíaca congestiva,

arritmias cardíacas, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.10 A

ativação do SNS também foi evidenciada em doenças metabólicas como o

diabetes, a obesidade e a síndrome metabólica.11 Na insuficiência renal

crônica, há evidências que caracterizam maior atividade adrenérgica, o que

eleva o perfil de risco cardiovascular nesta população.12 Isto posto,

intervenções terapêuticas focadas na modulação desta hiperatividade

simpática são de fundamental importância no controle e progressão destas

doenças. O melhor exemplo desta afirmação é o uso de β-bloqueadores no

tratamento da insuficiência cardíaca congestiva, desde o final dos anos 90,

após os resultados dos estudos US-Carvedilol,13 CIBIS-II,14 MERIT-HF,15

COPERNICUS16 e CAPRICORN,17 demonstrando a redução significativa da

morbidade e mortalidade nesta condição clinica.

Pela conhecida associação entre SNS e coração, e pelo potencial

benefício de algumas modalidades terapêuticas que visam a esta interação,

exemplificada pelos resultados alcançados com alguns dos β-bloqueadores,

ações intervencionistas no SNS passaram a ser estudadas nas doenças

cardiovasculares.18, 19 Dentre as modalidades terapêuticas, com esta proposta,

destacam-se: sensibilização baroreflexa, estimulação vagal, estimulação da

6

Introdução

medula espinhal, denervação simpática renal (DSR) e denervação simpática

cardíaca (simpatectomia).

A sensibilização, ou terapia de ativação barorreflexa, é feita por

estimulação elétrica dos barorreceptores da carótida e é baseada na ativação

da via aferente deste reflexo, induzindo o sistema nervoso central a reequilibrar

a modulação autonômica do sistema cardiovascular. Os dispositivos funcionam

como um marcapasso e provocam estímulo elétrico nos seios carotídeos

através de eletrodos. Resultados em modelos animais com insuficiência

cardíaca (IC) demonstraram aumento da sobrevida e benefício no

remodelamento cardíaco, o que viabilizou estudos clínicos em IC com fração

de ejeção (FE) reduzida.20 Os resultados em pacientes com hipertensão arterial

sistêmica refratária sugerem, ainda, potencial benefício para pacientes com IC

e FE preservada.21 Zile et al.22 compararam os efeitos desta terapia em

pacientes classe funcional III com FE <35%, com e sem terapia de

ressincronização cardíaca, e evidenciaram benefício na qualidade de vida,

teste de caminhada de 6 minutos, FE, níveis de NT-proBNP e re-hospitalização

nos pacientes sem ressincronização cardíaca. O estudo BeAT-HF (Barostim

Therapy for Heart Failure) está em andamento e pretende avaliar estes potenciais

benefícios, exclusivamente em pacientes sem ressincronização cardíaca.

A estimulação vagal segue um racional parecido com a terapia de

ativação barorreflexa, através de estímulos elétricos diretamente no nervo

vago, tentando corrigir o desequilíbrio autonômico com o aumento do tônus

parassimpático vagal. A estimulação vagal ativa fibras aferentes que causam

diminuição reflexa da atividade simpática eferente. Além disso, modelos

7

Introdução

experimentais demonstraram diminuição da ativação do sistema renina-

angiotensina. A estimulação vagal cervical também promove liberação de óxido

nítrico no coração e benefícios no reflexo inflamatório.23 Resultados clínicos e

experimentais serviram de base para estudos maiores comprovarem a eficácia

desta terapia. O estudo NECTAR-HF (NEural Cardiac TherApy foR Heart Failure)24

foi o primeiro ensaio randomizado, controlado, desenhado para avaliar a

segurança e eficácia da estimulação nervosa vagal do lado direito em

pacientes com IC e disfunção sistólica. Entretanto, esse estudo não mostrou

diferença significativa entre os grupos. O estudo ANTHEM-HF (Autonomic

Neural Regulation Therapy to Enhance Myocardial Function in Heart Failure)25 foi

outro estudo com pacientes portadores de IC crônica e disfunção sistólica

randomizados para estimulação vagal cervical esquerda ou direita. O estudo

mostrou melhora da fração de ejeção ventricular esquerda, sem diferenças

entre lado esquerdo e direito. Houve, também, melhora no teste de caminhada

de 6 minutos, mais evidente no estimulo à direita, e melhora na qualidade de

vida sem diferença entre os lados. O estudo INOVATE-HF (INcrease Of VAgal

TonE in Heart Failure)26 avaliou 707 pacientes com IC e disfunção sistólica

(classe funcional III e FE <40%) e não mostrou benefício da estimulação do nervo

vagal.

A estimulação da medula espinhal (EME), com dispositivos

implantáveis, tem sido utilizada em todo o mundo, durante décadas, para

tratamento de dores e angina refratária. Estudos pré-clínicos com estimulação

da medula espinhal, em modelos experimentais de doença cardíaca,

descreveram efeitos interessantes sobre a fisiologia do sistema nervoso

8

Introdução

autônomo cardíaco com reversão da dilatação do ventrículo esquerdo e

melhora da função cardíaca, além de supressão de arritmias, servindo de base

para estudos clínicos.27 O maior estudo é o Defeat-HF (Determining the

Feasibility of Spinal Cord Neuromodulation for the Treatment of Chronic Heart

Failure),28 ensaio clínico para determinar a segurança e eficácia da EME em

pacientes com insuficiência cardíaca avançada. Este estudo não evidenciou

benefício.

A denervação simpática renal (DSR) foi considerada no cenário de IC e

abordada por alguns estudos. O estudo-piloto OLOMOUC I29 comparou os

efeitos da DSR ao tratamento farmacológico otimizado em 51 pacientes com IC

avançada. Os autores demonstraram que a DSR é segura, não altera a função

renal, melhora a função sistólica do ventrículo esquerdo e reduz a FC média. A

DSR ainda reduziu os volumes ventriculares esquerdos e NT-proBNP. Apesar

dos resultados promissores, esse estudo foi unicêntrico, sem randomização e

nem todos os pacientes tiveram tratamento médico otimizado. O estudo

REACH (Renal Artery Denervation in Chronic Heart Failure)30 teve como objetivo

avaliar os efeitos da DSR em pacientes com IC sistólica e não demonstrou

alterações nas variáveis ecocardiográficas, sugerindo apenas benefício em

sintomas. Nesse mesmo contexto, em andamento, o Symplicity-CHF31 avaliará

a segurança e a eficácia da DSR em pacientes com classe funcional II a III e

FE <40%.

Além dos dispositivos e intervenções percutâneas no SNS, outra

modalidade terapêutica com este mesmo propósito é a intervenção cirúrgica.

Esta foi descrita desde 1880 para o tratamento da espasticidade, epilepsia,

9

Introdução

angina, bócio e hipertensão. Contudo, perdeu impacto na prática clínica após

Leriche32 publicar, em 1932, grave complicação pela infusão de álcool no

espaço subaracnoideo torácico, através da bainha nervosa. A partir da década

de 30, foram desenvolvidas novas técnicas de simpatectomia aberta em nível

esplênico, lombar e torácico para o tratamento de dor, hiperhidrose,

vasculopatias e cardiopatias. Nos anos 80, introduziu-se a simpatectomia

percutânea por radiofrequência, em nível torácico e lombar e, no começo da

década de 90, adotou-se a tecnologia por vídeo, chamada de simpatectomia

toracoscópica assistida por vídeo. Posteriormente, estas técnicas endoscópicas

refinaram-se com incisões mínimas. Atualmente, são indicadas em casos de

hiperhidrose focal patológica, disautonomia dolorosa, em algumas

vasculopatias como Raynaud, doença de Buerger e macroglobulinemia, além

de cardiopatias como a síndrome do QT longo congênito, casos selecionados

de doença arterial coronariana e arritmias. Recentemente, foi testada a

simpatectomia por clipagem do terço inferior do gânglio estrelado esquerdo e

dos nervos torácicos T3-T4 por videotoracoscopia em dez pacientes com IC

classes II e III, comparados com cinco pacientes do grupo controle submetidos

a tratamento clínico. Os resultados sugerem diferença entre os dois grupos

quanto à melhora da classe funcional. Embora não tenha havido diferença no

pico de VO2, nos níveis de BNP e na atividade simpática muscular, os

pacientes do grupo intervenção mostraram melhora estatisticamente

significativa no teste de caminhada de 6 minutos e no questionário de

qualidade de vida. Este estudo levantou questionamentos e possibilidades

interessantes.33

10

Introdução

Contudo, apesar das variadas indicações da simpatectomia por

diferentes técnicas, seus efeitos fisiológicos no miocárdio foram pouco

estudados. Modelos experimentais não patológicos em denervação simpática

miocárdica são escassos.34, 35 Yoshimoto et al.34 estudaram ratos denervados

por gangliectomia bilateral do núcleo estrelado com dois propósitos.

Primeiramente, validar a metodologia e o modelo experimental, o que foi

atingido, demonstrado pela dosagem de noradrenalina que estava

significativamente mais baixa em todas as câmaras cardíacas comparadas com

o grupo sham. O segundo objetivo foi comparar a resposta ao atenolol do

grupo controle com os denervados. Os resultados sugeriram que o efeito

hipotensor do fármaco não é mediado pelo bloqueio do receptor adrenérgico

beta-1 miocárdico.34 Mais recentemente, Jiang et al.35 avaliaram os efeitos da

simpatectomia química com 6-hidroxidopamina na variabilidade da FC,

parâmetros de ECG, ecocardiograma e alterações histológicas em ratos

sadios. Outros efeitos da simpatectomia no miocárdio não foram investigados

em modelos experimentais e têm dados extrapolados da experiência clínica

que, muitas vezes, são controversos. Portanto, face ao andamento dos estudos

clínicos, consideramos fundamental a obtenção de dados da fisiologia do

coração, no cenário da simpatectomia.

2. OBJETIVOS

12

Objetivos

2.1. Objetivo geral

O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos fisiológicos da

simpatectomia no miocárdio em modelo experimental.

2.2. Objetivos específicos

Avaliar a repercussão da simpatectomia unilateral esquerda e bilateral

nos receptores beta do miocárdio, catecolaminas miocárdicas e periféricas,

alterações estruturais e funcionais no miocárdio, além da avaliação da função

autonômica.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

14

Materiais e Métodos

3.1. Modelo experimental

Foram utilizados 91 ratos machos Wistar, com idade de oito semanas,

adquiridos do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo (FMUSP). Esses animais foram mantidos em gaiolas apropriadas

com três animais em cada uma, com ração e água ad libitum e identificados

com chip subcutâneo. O protocolo seguiu as normas de cuidados em

experimento animal definidas pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Estudos com

Animais)36 e UFAW (Universities Federation for Animal Welfare),37 teve aprovação

do Comitê de Ética para Uso Animal (CEUA, 225/12) da FMUSP e obteve

suporte financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP – Processo 2012/02772-8).

Os animais foram divididos em cinco grupos:

1. Controle (CT) - 15 animais

2. Controle com atenolol (CTAT) - 15 animais

3. Simpatectomia unilateral esquerda (UNI) - 15 animais

4. Simpatectomina unilateral esquerda com atenolol (UNIA) - 15

animais

5. Simpatectomia bilateral (BIL) - 31 animais

A simpatectomia foi realizada por meio de ablação química do gânglio

estrelado. Após anestesia geral com isoflurano (3,0% para indução e 1,5% para

manutenção) em oxigênio (FiO2 100%), os ratos foram colocados em decúbito

ventral. O acesso ao gânglio estrelado (esquerdo ou bilateral) foi feito pela

técnica percutânea posterior38 e a gangliectomia química induzida por injeção

15


periganglionar de álcool absoluto. Após a palpação do processo espinhoso da

vértebra C7, localizado entre as duas escápulas, foi inserida uma agulha de

pequeno calibre (25G) acoplada a uma seringa de 1,0 mL no plano sagital

paramediano, avançando-a na direção póstero-anterior do processo espinhoso

da C7. Quando a ponta da agulha perdeu o contato com o corpo vertebral (sinal

que passou a face anterior do corpo vertebral), foi retraída 0,5 mm e injetado

0,2 mL de álcool absoluto. A confirmação clínica da ablação química do gânglio

estrelado foi feita pela observação de ptose palpebral ipsilateral e irreversível

(síndrome de Horner), após recuperação anestésica (figura 1). Os grupos com

atenolol (CTAT e UNIA) receberam a dose de 90 mg/kg/dia, administrado por

gavage uma vez ao dia.39

Figura 1 - Animal após procedimento de simpatectomia por esclerose do gânglio

estrelado esquerdo confirmado por ptose palpebral à esquerda

16


No grupo BIL, devido à mortalidade elevada (77%), os animais que

morreram no procedimento, ou até quatro horas após, foram repostos.

Cada grupo teve uma avaliação eletrocardiográfica, ecocardiográfica,

resposta cardiovascular ao esforço e modulação autonômica com seis

semanas. Logo após, foi realizada a eutanásia e coletado material para o

estudo dos receptores beta do miocárdio (ápice e base do ventrículo esquerdo),

tamanho do miócito e catecolaminas miocárdicas e periféricas (figura 2).

Figura 2 - Desenho do estudo

Os animais sofreram eutanásia sob anestesia com ketamina 50 mg/kg

e xylazina 10 mg/kg. Foi realizada laparotomia mediana, com dissecção e

punção da veia cava e administração de solução com cloreto de potássio (soro

fisiológico 0,9% 80 mL + KCl 19,1% 20 mL), até a parada cardíaca. Após a

eutanásia, cada animal foi colocado em saco leitoso com identificação da

espécie, data e procedência do laboratório e entregue para o descarte, que foi

17


realizado conforme as normas de descarte de material biológico do Biotério do

Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da FMUSP.

3.2 Eletrocardiograma

A avaliação eletrocardiográfica constou da aferição da FC, tempo de

condução atrioventricular (intervalo PR), duração do intervalo QT corrigido

(fórmula Frederica) e ritmo.

O eletrocardiograma foi realizado no aparelho Dixtal - Eletropagina

(eletrocardiógrafo três canais EP-3), conectando-se os eletrodos nas patas

dianteiras e traseiras dos animais, respeitando as referências: braço direito,

braço esquerdo, perna esquerda e perna direita. Foram realizadas as

derivações DI, DII, DIII, aVR, aVL e avF, em ganho de 2N e velocidade 50

mm/s. O papel usado foi o ECG Recording Paper Series 4700AH da Hewlett

Packard. Os animais foram submetidos a este exame anestesiados com uma

combinação de ketamina (50 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) via intraperitoneal.

3.3. Ecocardiograma

Após o ECG, foi realizado o ecocardiograma transtorácico modo M,

bidimensional e Doppler pulsado, utilizando-se o aparelho Acuson, modelo

Sequóia 512, com transdutor de 9 mm e frequência de 13 mHz. O padrão de

contração regional e global foi avaliado, em tempo real, nos cortes paraesternal

longitudinal e transverso do ventrículo esquerdo (VE). As dimensões cardíacas

18


sistólicas e diastólicas foram analisadas pelo modo M. A função ventricular

sistólica foi calculada utilizando-se a medida da fração de ejeção (FE) pelo

método do cubo. Tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) foi avaliado para

a análise da função diastólica, pelo Doppler pulsado, na medida do fluxo de via

de entrada do VE. O índice de performance miocárdica (IPM) foi analisado pela

fórmula: (a – tempo de ejeção) / tempo de ejeção, sendo “a” o intervalo entre o

fechamento e a abertura da valva mitral. Esse índice foi usado para avaliação

da função global do coração. Os animais foram submetidos a este exame sob

efeito da mesma anestesia utilizada para realização do ECG. O exame foi

realizado de acordo com a sua padronização em ratos, sendo considerados

como valores normais os ecocardiogramas dos animais do grupo controle.

3.4. Avaliação da modulação autonômica cardiovascular

A variabilidade da FC e da pressão arterial sistólica (PAS) foi avaliada

no domínio do tempo (variância) e no domínio da frequência, utilizando a

transformada rápida de Fourier. Para obter a mensuração dos registros, foi

inserido um cateter na artéria carótida direita, sob anestesia inalatória, com o

uso de máscara de inalação, com a mistura de 3 litros de oxigênio e 2% de

isoflurano. O animal anestesiado foi colocado em decúbito dorsal e realizada

uma incisão na região do pescoço e dissecada a artéria carótida, próximo da

traqueia, para introdução do cateter (2,5 cm). Este procedimento foi realizado

24 horas antes da data do teste de esforço.

19


A avaliação foi feita imediatamente antes do teste de esforço, sendo

analisados cinco animais aleatoriamente nos grupos CT, CTAT, UNI, UNIA e

sete animais no BIL. Neste método, séries temporais do intervalo de pulso (IP)

e da PAS foram divididas em segmentos de 512 batimentos com sobreposição

de 50%. Um espectro foi obtido para cada um dos segmentos e os

componentes oscilatórios dos espectros foram quantificados em duas faixas de

frequência: baixa frequência (BF 0,20 a 0,75 Hz), representando modulação

simpática e alta frequência (AF 0,75 a 3 Hz), modulação parassimpática. A

potência do espectro foi calculada para cada componente reconhecível nas

faixas de BF e AF, integrando-se os espectros dos componentes por meio do

software Cardioseries 2.4. Os segmentos que apresentaram oscilações muito

lentas (<0,2 Hz) foram considerados não estacionários e descartados do

estudo. A sensibilidade barorreflexa espontânea foi obtida pelo índice ,

analisando a correlação temporal e linear entre o valor absoluto de BF para o

IP e da PAS.40, 41 Com isso, foram avaliadas as variáveis do IP, entre elas o

desvio padrão (DP IP) e a variância do intervalo de pulso (VAR IP). Foi avaliada,

também, a variância da pressão arterial sistólica (VAR PAS) e valores absolutos

da BF e AF.

3.5. Teste de esforço máximo aeróbio

Foram analisadas FC e pressão arterial (PA) ao esforço, utilizando o

teste de esforço máximo aeróbio, além da distância percorrida e o tempo de

exercício.

20


O teste de esforço consistiu em um protocolo escalonado com

incrementos de velocidade de 0,3 km/h a cada 3 minutos, até atingir a

velocidade máxima suportada pelos animais. O critério utilizado para a

determinação da exaustão do animal e interrupção do teste foi o momento em

que o animal não foi mais capaz de correr mediante o incremento de

velocidade da esteira.42

Os animais foram submetidos a treinamento prévio para adaptação por

dois dias. Um dia antes do teste de esforço, os animais tiveram a artéria

carótida canulada por cateter, conforme descrito, para permitir a aferição da PA

e FC imediatamente antes do teste e no pico do esforço.

3.6. Análise da atividade simpática

3.6.1 Receptores β1 e β2 no miocárdio

A expressão gênica dos receptores β1 e β2, no ápice e na base do

coração, separadamente, foi realizada pela técnica da reação em cadeia da

polimerase em tempo real (RT - PCR). Como controle endógeno da reação foi

utilizado o gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e beta-actina.

3.6.1.1. Extração do ácido ribonucleico (RNA)

Para extração do RNA das amostras de tecido do coração foram

utilizados de 50-100 mg de tecido em 1,0 mL de TRIzol® Reagent (Invitrogen TM).

21


O material foi triturado no TRIzol® Reagent, até sua completa homogeneização,

e mantido em temperatura ambiente (TA) por 5 minutos, sendo dado

seguimento ao protocolo descrito na bula do reagente. Após adicionar 0,2 mL

de clorofórmio e agitar vigorosamente com as mãos, durante 15 segundos, a

amostra foi colocada em incubação de 3 minutos em TA. Essa mistura foi

centrifugada a 4°C, a uma velocidade de 12.000 x g, durante 15 minutos. A

parte aquosa foi removida e transferida para outro tubo limpo e estéril.

Acrescentou-se 0,5 mL de álcool isopropanol e foi mantida em incubação em

TA por 10 minutos. Em seguida, centrifugou-se a 12.000 x g, por 10 minutos, a

uma temperatura de 4°C. O sobrenadante foi removido e descartado, ficando

apenas o precipitado, para ser lavado com 1 mL de álcool etílico, agitando o

tubo no vortex e centrifugando por 5 minutos, a uma velocidade de 7.500 x g a

4°C. O sobrenadante foi, então, descartado deixando secar o precipitado

formado no fundo do tubo, sendo em seguida eluído com 30-50 µL de água

tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC). As concentrações das amostras

foram determinadas por meio da leitura em espectrofotômetro no comprimento

de onda de 260/280 nm, utilizando-se o aparelho nanodrop (Thermo Scientific).

A qualidade das mesmas foi verificada por meio de corrida de eletroforese em

gel de agarose. Uma alíquota com 3 µg de RNA de cada amostra foi separada,

para a realização do tratamento e transcrição reversa e o restante das

amostras foi armazenado em freezer -80ºC.

22


3.6.1.2. Tratamento do RNA total com a enzima DNase free

O RNA foi submetido ao tratamento com a enzima Turbo DNA-Free™

da empresa Ambion (The RNA Company). O protocolo do fabricante foi seguido

rigorosamente, utilizando-se a quantidade de 3 µg de RNA. Ao RNA, foram

adicionados 1,2 µL de Turbo DNase Buffer 10X e 1,0 µL de Turbo DNase. As

amostras foram, então, homogeneizadas vigorosamente e incubadas a 37ºC,

durante 30 minutos, no equipamento Thermomixer Comfort (marca Eppendorf).

Ao final da incubação, foi adicionado 1,2 µL do reagente de inativação da

DNase, seguido de incubação por 5 minutos, em TA (25ºC), também no

Thermomixer Comfort (marca Eppendorf). Após o término da incubação, seguiu-

se a centrifugação da amostra a 10.000 x g por 1,5 minuto e o sobrenadante foi

transferido para um novo tubo livre de RNase.

3.6.1.3. Transcrição reversa (síntese de DNA complementar (cDNA))

Para transcrição reversa, foi utilizada a enzima SuperScriptTM II

Reverse Transcriptase (InvitrogenTM). Foram utilizadas duas misturas: Mix 1

contendo 10 µL de RNA tratado (3,0 µg); 0,5 µL de Oligo-(dT)12-18 Primer

(InvitrogenTM) (0,5 µg/µL); 0,5 µL de random primers (InvitrogenTM) (3,0 µg/µL) e

1,0 µL de dNTP (InvitrogenTM) (10 mM); e Mix 2 contendo 4,0 µL de tampão da

enzima (5X); 2,0 µL de DTT (0,1 M); 1,0 µL de RNase OutTM (Recombinant

Ribonuclease Inhibitor-InvitrogenTM) 1,0 µL de SuperScript II.

23


O Mix 1 (12 µL de volume) foi levado ao termociclador, à temperatura de

65°C, por 5 minutos. O programa foi pausado e, então, o Mix 2 (8,0 µL por

amostra) foi acrescentado. O programa foi continuado com as seguintes

ciclagens: 42°C por 2 minutos, 42°C por 50 minutos, 70°C por 15 minutos e

mantido a 4°C por tempo indeterminado, até ser retirado da máquina.

Os cDNAs foram posteriormente armazenados, à temperatura de

-20ºC.

3.6.1.4. Reação de RT-PCR

As reações de PCR em tempo real (RT-PCR) foram feitas em placas de

96 poços, usando reagente Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems

– EUA), conforme descrito pelo fabricante e o equipamento utilizado foi o Step

One Plus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems).

A reação foi preparada com 10,0 µL de Sybr Green; 5,0 µL de cDNA

diluído 1:40 e 5,0 µL de primer (forward e reverse) já diluídos na concentração

determinada previamente, na reação de otimização dos primers, necessária

para uma eficiência de 100%. Essas quantidades foram utilizadas para

elaboração da reação de qRT-PCR em duplicata. O programa para a

amplificação das amostras consiste em uma denaturação inicial de 95ºC por

10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos (denaturação) e

60ºC por 1 minuto (anelamento dos primers e extensão).

24


No final de todas as reações, as curvas de dissociação com

temperaturas crescentes foram analisadas, a fim de verificar a amplificação de

um único produto. As condições da reação foram idênticas às utilizadas para a

construção das curvas de calibração e otimização dos primers. As amostras

foram estudadas em duplicata e, para cada gene do estudo, foram amplificadas

em paralelo as amostras controle cDNA. Todas as reações de PCR,

consideradas para análise, apresentaram eficiência igual ou superior a 95%.

A expressão dos genes escolhidos para este estudo foi normalizada

em relação ao RNA mensageiro dos genes endógenos, GAPDH e beta-actina,

conforme descrito anteriormente,e por Livak et al.,43 em 2001. Os primers

utilizados estão descritos na tabela 1.

Tabela 1 - Primers usados para avaliar os receptores β-adrenérgicos

Primer Seqüências de oligonucleotídeos Tamanho

do produto Referência

RA- β1

Forward 5’CTGCTACAACGACCCCAAGTG3’ 120pb Sato et al. 44

Reverse 5’AACACCCGGAGGTACACGAA 3’

RA- β2

Forward 5’GAGCCACACGGGAATGACA 3’ 133pb Sato et al. 44

Reverse 5’CCAGGACGATAACCGACATGA3’

GAPDH

Forward 5’ATGTATCCGTTGTGGATCTGAC3’ 78pb Bai e Meng 45

Reverse 5’CCTGCTTCACCACCTTCTTG3’

Beta-actina

Forward 5’GTGCTATGTTGCCCTAGACTTCG3’ 175pb Yüzbasioglu et al. 46

Reverse 5’GATGCCACAGGATTCCATACCC3’

25


3.6.2. Catecolaminas periféricas

Para a quantificação da adrenalina e da noradrenalina periféricas, foi

utilizado o kit 3-CAT Research ELISA (ensaio imunoenzimático) da empresa LDN

(Labor Diagnostika Nord), seguindo o protocolo do fabricante.

Os reagentes foram tirados da geladeira e permaneceram em TA,

durante 30 minutos antes do início do protocolo. Foram pipetados 30 µL de

plasma, reagentes padrão e controles nos poços da placa de extração, cada

amostra em duplicata. Em seguida, foram adicionados 50 µL dos reagentes

Assay Buffer e Extraction Buffer em cada poço, sendo a placa então tampada e

levada para incubação e agitação (600 rpm) em TA, durante 1 hora. Após esse

período, foi removido todo o líquido da placa que foi lavada com o reagente

Wash Buffer. Então, 150 µL de Acylation Buffer e 25 µL de Acylation Solution

foram colocados em todos os poços e a placa, mais uma vez, foi levada para

incubação e agitação (600 rpm) em TA, durante 20 minutos. Após essa nova

incubação, o líquido foi removido e a placa lavada mais duas vezes com o

Wash Buffer. Depois desse passo, foram adicionados, em cada poço, 200 µL

de ácido clorídrico e a placa levada para incubação e agitação (600 rpm) em

TA, durante 10 minutos.

A fase de extração estava finalizada e iniciou-se a fase de conversão

enzimática. Em uma nova placa, foram colocados 190 µL de cada amostra

extraída e adicionados 50 µL de Enzyme Solution. A placa foi levada para uma

agitação de 1 minuto e, então, colocada para incubação durante 2 horas em

estufa ajustada à temperatura de 37º C. Após esse período, 75 µL de reagente

26


padrão, controles e amostras foram colocados em outras duas placas, uma de

adrenalina e uma de noradenalina. Então, 50 µL de Antiserum de adrenalina e

noradrenalina foram adicionados em cada poço das placas específicas para

cada uma das catecolaminas e essas placas foram colocadas para nova

incubação, de 15-20 horas, em geladeira.

No dia seguinte a essa incubação, as placas foram retiradas da

geladeira e foram novamente lavadas com Wash Buffer sendo, então,

adicionados 100 µL de Enzyme Conjugate em todos os poços e novamente as

placas foram para incubação e agitação (600 rpm) em TA, durante 30 minutos.

Após uma última lavagem com o Wash Buffer, foram adicionados 100 µL do

reagente Substrate e novamente incubação e agitação (600 rpm) em TA,

durante 30 minutos, porém dessa vez protegidas da luz. Depois desse período

de incubação, foram adicionados 100 µL de Stop Solution. A leitura da

absorbância foi realizada em equipamento próprio no comprimento de luz de

450 nm.

3.6.3. Catecolaminas miocárdicas

As catecolaminas foram extraídas dos fragmentos, através de

maceração (mecânica) em ácido perclórico 0,1 M, concentradas em alumina e

eluídas com solução de ácido acético 0,1 N. Os eluatos foram analisados em

seu conteúdo de catecolaminas através, de cromatografia líquida de alta

performance (HPLC). O resultado final foi expresso em pg de catecolaminas

por mL.

27


3.6.3.1 Quantificação

O tecido cardíaco foi macerado com 100 µL de ácido perclórico 0,1 M e

sonicado por 15 minutos ± 2 minutos, adicionados 50 µL de

dihidroxibenzilamina (DHBA) 10 ng/mL e 250 µL de ácido perclórico 0,1 M e,

então, centrifugado por 15 minutos a 4oC e 3.000 rpm. O sobrenadante foi

transferido para outro microtubo e adicionados 350 µL de tampão Tris 1 M.

Foram adicionados cerca de 10 mg de alumina e procedida a extração das

catecolaminas. As amostras extraídas foram injetadas no HPLC eletroquímico,

conforme instruções do fabricante.

3.7. Análise estrutural

3.7.1. Tamanho do miócito

Após a remoção do coração, o mesmo foi dividido em base, 1/3 médio

e ápice sendo o 1/3 médio fixado em formol a 10% e emblocado em parafina e

o restante conservado em nitrogênio líquido. Os corações em parafina foram

submetidos a cortes transversais em secções de 4 µm, ao nível do equador, de

modo a analisar ventrículo direito e esquerdo. Foram colocados em lâmina

silanizada, para evitar seu descolamento, durante os procedimentos

histológicos. Os cortes do coração foram corados por hematoxilina-eosina (HE).

A quantificação do tamanho do miócito foi realizada, observando-se

sempre cortes longitudinais, onde os núcleos estavam ovais e centralizados. O

diâmetro, então, foi medido em µm com o auxílio de um microscópio óptico,

28


acoplado a um computador com o programa QWIN Image Processing and

Analysis Software (Leica Microsystems Cambridge Ltd.) (figura 3).

Figura 3 - Corte corado em hematoxilina-eosina do miócito ilustrando sua medida

3.8. Análise estatística

Para verificar a associação entre as variáveis qualitativas foi utilizado o

teste exato de Fisher ou teste Qui-quadrado.

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para evidenciar a

normalidade dos dados e, quando a normalidade não foi rejeitada, realizou-se o

teste paramétrico.

O teste t-Student pareado, ou teste de Wilcoxon pareado, foi utilizado

para verificar se houve modificação ao longo do tempo.

O teste ANOVA ou Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar se mais

de dois grupos são iguais. Caso houvesse significância estatística foi utilizado

teste de comparações múltiplas (Tukey nos dados paramétricos e Brunner nos não

29


paramétricos) para verificar quais pares de grupos se diferenciaram. O nível de

significância adotado foi de 5% (p <0,05).

4. RESULTADOS

31

Resultados

Foram incluídos 15 animais em cada grupo. Entretanto, o grupo UNI

teve 13% de mortalidade, ficando com 13 animais; o grupo UNIA teve 7% de

mortalidade, restando 14 animais e o grupo BIL, com 77% de mortalidade

(31 animais operados), terminou com 7 animais. Para cada variável analisada,

foram incluídos todos os sobreviventes, exceto o teste de esforço máximo

aeróbio e a avaliação da modulação autonômica, onde foram incluídos

aleatoriamente apenas 5 animais de cada grupo (CT, CTAT, UNI e UNIA) e

7 animais do grupo BIL, para suprir eventuais óbitos durante a canulação da

carótida.

4.1. Variáveis eletrocardiográficas

Nas variáveis eletrocardiográficas não houve diferença entre os grupos

quanto ao ritmo sinusal (CT: 86%; CTAT: 93%; UNI: 100%; UNIA: 75%; BIL: 85%,

p = 0,5). A frequência cardíaca mostrou diferença somente entre os grupos

CTAT (266 bpm ± 25) x UNI (308 bpm ± 35) com p = 0,0185 (figura 4). Os

intervalos PR e QTc não tiveram diferenças entre os grupos (tabela 2).

32

Resultados

Figura 4 - Frequência cardíaca após 6 semanas

*p = 0,0185 (CTAT vs. UNI).

CT: controle (n: 15); CTAT: controle com atenolol (n: 15); UNI: simpatectomia unilateral

esquerda (n: 13); UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol (n: 14);

BIL: simpatectomia bilateral (n: 7)

Tabela 2 - Intervalo PR e QTc sem diferença entre os grupos

CT CTAT UNI UNIA BIL p

Intervalo PR (ms) 57,20 ± 3,91 59 ± 4,02 57,33 ± 4,10 54,83 ± 7,88 53 ± 6,83 0,06

Intervalo QTc (ms) 207,53 ±

20,01 212,33 ±

33,95 213,50 ±

29,01 206,50 ±

27,33 218 ± 16,01

0,85

CT: controle; CTAT: controle com atenolol; UNI: simpatectomia unilateral esquerda; UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol; BIL: simpatectomia bilateral; ms: milissegundo

33

Resultados

4.2. Variáveis ecocardiográficas

O diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (DS) foi maior no grupo CTAT

(4,8 mm ± 0,6) x UNI (3,8 mm ± 0,7) (p = 0,0059) e CTAT x BIL (3,4 mm ± 0,5)

(p = 0,0001) (figura 5). O diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (DD)

também foi maior no grupo CTAT (8,1 mm ± 0,4) x UNI (7,0 mm ± 0,7)

(p = 0,0001) e CTAT x BIL (7,1 mm ± 0,6) (p = 0,0008) (figura 5). A FE foi menor

no grupo CTAT (76% ± 6) x BIL (87% ± 4) (p = 0,0004), apesar de se manter

normal (figura 6). Não observamos diferença entre os grupos nas variáveis

TRIV (p = 0,4945) e IPM (p = 0,0679) (tabela 3).

Figura 5 - Diâmetro sistólico e diastólico final do ventrículo esquerdo

*p = 0,0059 (CTAT vs. UNI) e **p = 0,0001 (CTAT vs.BIL).

†p = 0,0001 (CTAT vs. UNI) e ††p = 0,0008 (CTAT vs. BIL)

CT: controle (n: 15); CTAT: controle com atenolol (n: 15); UNI: simpatectomia unilateral esquerda (n: 13); UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol (n: 14); BIL: simpatectomia bilateral (n: 7)

34

Resultados

Tabela 3 - Variáveis ecocardiográficas


TRIV (ms) 35,17 ± 8,89 33,38 ± 5,38 34,63 ± 6,48 36,78 ± 8,6 30,86 ± 8,05 0,49

IPM 0,73 ± 0,29 0,88 ± 0,14 0,78 ± 0,22 0,85 ± 0,20 0,62 ± 0,28 0,06

CT: controle (n: 15); CTAT: controle com atenolol (n: 15); UNI: simpatectomia unilateral esquerda (n: 13); UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol (n:14); BIL: simpatectomia bilateral (n: 7); TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico; IPM: índice de performance miocárdica

Figura 6 - Fração de ejeção do ventrículo esquerdo

*p = 0,0004 (CTAT vs. BIL).

CT: controle (n: 15); CTAT: controle com atenolol (n: 15); UNI: simpatectomia unilateral esquerda (n: 13); UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol (n:14); BIL: simpatectomia bilateral (n: 7)

4.3. Análises da modulação autonômica

Na análise da modulação autonômica, não houve diferença entre os

grupos para as variáveis DP IP, VAR IP, VAR PAS, BF e o índice α da BF.

Ainda assim, observamos que a BF e o índice α da BF apresentam p = 0,09 e

p = 0,07, respectivamente, sendo mais expressivos nos grupos com

35

Resultados

simpatectomia sem atenolol (BIL e UNI) (tabela 4). Contudo, a AF apresentou

diferença entre o CT e CTAT, UNIA e BIL (figura 7).

Tabela 4 - Variáveis de modulação autonômica


DP IP 10,39 ± 4,92 9,69 ± 0,96 11,02 ± 5,15 9,82 ± 2,3 9,97 ± 4,68 0,71

VAR IP 127,22 ± 110,98

94,56 ± 18,6 142,7 ± 91,47

100,72 ± 40,68

116,84 ± 127,12 0,69

VAR PAS 44,32 ± 31,27

29,15 ± 5,63 95,52 ± 112,99

30,18 ± 13,52

53,97 ± 29,85 0,11

BF 4,49 ± 3,08 3,48 ± 1,33 7,24 ± 1,81 4,12 ± 2,88 9,92 ± 8,87 0,09

Índice α da BF

1,59 ± 1,42 1,58 ± 0,42 1,03 ± 0,55 2,03 ± 0,55 1,04 ± 0,51 0,07

CT: controle (n: 5); CTAT: controle com atenolol (n: 5); UNI: simpatectomia unilateral esquerda (n: 5); UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol (n: 5); BIL: simpatectomia bilateral (n: 7); DP IP: desvio padrão do intervalo de pulso; VAR IP: variância do intervalo de pulso; VAR PAS: variância

da pressão arterial sistólica; BF: baixa frequência; Índice α da BF: índice da baixa frequência

Figura 7 - Variável alta frequência da análise de modulação autonômica com valores de p significativos em todos os grupos comparados ao CT, exceto UNI


36

Resultados

4.4. Análises do teste de esforço máximo aeróbio

Ao teste de esforço, as variáveis tempo, velocidade máxima atingida e

distância não apresentaram diferenças entre os grupos (tabela 5).

Tabela 5 - Variáveis do teste de esforço máximo aeróbio sem diferença estatística


Tempo (minutos)

9,8 ± 2,7 10,2 ± 1,8 10,0 ± 2,0 8,9 ± 2,4 8,1 ± 1,8 0,32

Velocidade máxima (Km/h)

1,2 ± 0,3 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,3 1,2 ± 0,2 0,33

Distância (Km) 0,13 ± 0,06 0,13 ± 0,04 0,13 ± 0,04 0,11 ± 0,05 0,09 ± 0,03 0,48


Na análise da pressão arterial ao repouso houve diferença entre os

grupos. A PAS foi maior no grupo BIL (144 mmHg ± 8) x UNIA (128 mmHg ± 5)

com p <0,0001 (figura 8). A pressão arterial diastólica (PAD) também foi maior

no grupo BIL (110 mmHg ± 7) x UNIA (94 mmHg ± 5) com p = 0,0016 (figura 8).

Contudo, a pressão arterial média (PAM) não mostrou diferença entre os

grupos (p = 0,06). Comparando o grupo CT com o BIL, a PAS

(CT: 130 mmHg ± 9, p = 0,09) e a PAD (CT: 98 mmHg ± 9, p = 0,37) eram maiores

no grupo BIL, a despeito de não haver diferença estatística entre os dois

grupos.

37

Resultados

Figura 8 - Pressão arterial sistólica e diastólica em repouso

*p <0,0001 (BIL vs. UNIA)

†p = 0,0016 (BIL vs. UNIA)


Na avaliação da FC, imediatamente antes do teste de esforço, o grupo

BIL (421 bpm ± 25) teve maiores valores em relação a todos os grupos, exceto o

UNI (p = 0,9979) (figura 9).

38

Resultados

Figura 9 - Frequência cardíaca em repouso com valores de p significativos em todos os grupos comparados ao BIL, exceto UNI


Na análise das mesmas variáveis, no pico do esforço, observou-se a

PAD maior no grupo BIL x UNIA (p <0,0001; figura 10), o mesmo na PAM BIL x

UNIA (p = 0,0134; figura 10). Comparando o grupo CT com o BIL, a PAD

(CT: 93 mmHg ± 13, p = 0,08) e a PAM (CT: 104 mmHg ± 13, p = 0,08),

apresentaram-se maiores no grupo BIL, a despeito de não haver diferença

estatística entre esses dois grupos. Não houve diferença entre os grupos na

PAS (CT: 124,94 ± 14,6 mmHg; CTAT: 128,16 ± 6,92 mmHg; UNI: 131,74 ±

11,07 mmHg; UNIA: 125,12 ± 9,09 mmHg; BIL: 143,38 ± 10,13 mmHg; p = 0,05),

apesar das médias serem maiores nos grupos simpatectomizados sem atenolol

com valor de p = 0,05.

39

Resultados

Figura 10 - Pressão arterial diastólica e média no pico do esforço

*p <0,0001 (BIL vs. UNIA), † p = 0,0134 (BIL vs. UNIA)


Na avaliação da FC, no pico do esforço, o grupo BIL apresentou

valores maiores, quando comparado a todos os grupos, exceto o UNI

(p = 0,1681; figura 11).

40

Resultados

Figura 11 - Frequência cardíaca no pico do esforço com valores de p significativos em todos os grupos comparados ao BIL exceto UNI


4.5. Receptores β1 e β2

Na análise dos receptores β1 no VE, não houve diferença entre os

grupos no ápice (p = 0,1957), nem na base (p = 0,1183) (figura 12). Observou-se

que, na análise de receptores β2 no ápice do VE, houve maior concentração no

grupo CT x UNIA (p = 0,0086). O mesmo se repetiu na base do VE, com

diferença entre CT x UNIA (p = 0,0183) (figura 13).

41

Resultados

Figura 12 - Receptores β1 no ápice (p = 0,19) e na base (p = 0,11) do VE, sem diferença entre os grupos


Figura 13 - Receptores β2 no ápice,* p = 0,0086 (CT vs. UNIA) e na base, **p = 0,0183 (CT vs. UNIA)


42

Resultados

4.6. Catecolaminas periféricas

Observou-se que a concentração sérica de adrenalina foi maior no

grupo BIL em relação a todos os demais e também maior no grupo CTAT x CT

(p = 0,0011) e UNI x CT (p <0,0001) (figura 14).

Figura 14 - Adrenalina periférica com valores de p em relação ao grupo BIL com os demais


Observou-se que a concentração sérica de noradrenalina também foi

maior no grupo BIL, em relação a todos os demais e, maior, no grupo UNI x

UNIA (p = 0,0063) (figura 15).

43

Resultados

Figura 15 - Noradrenalina periférica com valores de p em relação ao grupo BIL com os demais

* p = 0,0001; +p <0,0001; † p = 0,0027; π p <0,0001; ⱷp = 0,0063. CT: controle (n: 15); CTAT: controle com atenolol (n: 15); UNI: simpatectomia unilateral esquerda (n: 13); UNIA: simpatectomia unilateral esquerda com atenolol (n:14); BIL: simpatectomia bilateral (n: 7)

4.7. Catecolaminas miocárdicas

Na análise da concentração miocárdica de catecolaminas, não houve

diferenças entre os grupos na adrenalina, ou na noradrenalina (tabela 6).

Tabela 6 - Concentração miocárdica de catecolaminas


Adrenalina (ng/mL)

24,3 ± 28,5 28,50 ± 28,2 12,0 ± 0 28,7 ± 31,9 12,0 ± 0 0,20

Noradrenalina (ng/mL)

1046,1 ± 862,9

1018,5 ± 661,6

277,8 ± 316,80

995,3 ± 1119,5

1.078,5 ± 1.485,2

0,09


44

Resultados

4.8. Tamanho do miócito

Na análise do tamanho do miócito, não houve diferença entre os

grupos (tabela 7).

Tabela 7 - Valores do tamanho do miócito


Tamanho do miócito (µm)

11,28 ± 1,92 12,43 ± 1,72 11,33 ± 2,08 12,39 ± 1,98 11,61 ± 1,53 0,25


5. DISCUSSÃO

46

Discussão

Embora existam inúmeras publicações sobre os efeitos da

simpatectomia em modelos animais patológicos (infarto do miocárdio,

taquicardiomiopatia induzida por marca-passo, bandagem da aorta para hipertrofia),

dados em modelos fisiológicos são escassos.34, 35

Neste cenário, optou-se por avaliar a resposta fisiológica deste

procedimento, nas variáveis relacionadas ao sistema nervoso autônomo, como

as propriedades cronotrópicas em repouso e ao esforço, a modulação

autonômica cardiovascular, as catecolaminas miocárdicas e periféricas e os

receptores beta-adrenérgicos do miocárdio. Também foram analisados os

efeitos na função ventricular e no tamanho do miócito.

Em estudo que serviu de base para a simpatectomia na síndrome do

QT longo, Yanovitz et al.47 avaliaram alterações eletrocardiográficas em cães

tanto da simpatectomia por excisão do gânglio estrelado, quanto sua

estimulação por eletrodos. Foi identificado prolongamento do intervalo QT após

simpatectomia direita (20 a 70 ms) e discreta ou nenhuma alteração após

simpatectomia esquerda. Quando realizada a estimulação do gânglio estrelado,

o lado esquerdo respondeu com aumento no intervalo QT (10 a 90 ms) e sem

alterações com o estímulo no lado direito. Já, na avalição do QTc em humanos,

Schwartz et al.48 relataram diminuição no intervalo QTc em média de 39±54

ms, 6 meses após a denervação de pacientes com síndrome do QT longo.

Collura et al.49 não encontraram diferença no intervalo QT, após simpatectomia

esquerda em pacientes com síndrome do QT longo e taquicardia ventricular

polimórfica catecolaminérgica. Considerando o ECG, nossa análise do intervalo

47

Discussão

QT não demonstrou diferenças entre os grupos. Nossos achados,

considerando também a não uniformidade da literatura, nos levam a crer que o

tônus simpático não é o principal fator, isoladamente, a influenciar este

parâmetro do ECG.

Nas análises ecocardiográficas, Jiang et al.35 mostraram aumento nos

volumes sistólico e diastólico com queda na FE no grupo simpatectomia

química em comparação com os ratos do grupo controle. Schlack et al.50

mostraram, em modelo canino, que a simpatectomia esquerda altera

agudamente a contratilidade regional do VE, atrasando a contração e o

relaxamento da área denervada, em comparação com a área não denervada e

levando à disfunção diastólica. O débito cardíaco (DC) e PA foram mantidos.

Esse mesmo grupo repetiu o estudo51 em cães com IC induzida por marca-

passo e mostrou piora expressiva da função diastólica e global do VE, com

queda do DC.

No estudo de Perlini et al.,52 em ratos com bandagem da aorta,

divididos em grupos placebo, simpactectomia química com 6-hidroxidopamina,

propranolol e doxazosina, quando comparados aos animais do grupo controle,

todos os animais tratados ativamente mostraram menos hipertrofia, menos

dilatação de VE e menos congestão pulmonar. No entanto, apenas os ratos

tratados com o -bloqueio e a simpatectomia química tiveram menor grau de

disfunção diastólica e melhor sobrevida nesse estudo. Em humanos, os dados

de Lobato et al.53 não mostram diferenças nas funções sistólica e diastólica

antes e após a simpatectomia por xylocaína unilateral esquerda ou direita em

pacientes sem cardiopatia. Entretanto, Schlack e Dinter54 encontraram

48

Discussão

relaxamento ventricular prejudicado na simpatectomia esquerda, mas as

alterações hemodinâmicas foram compensadas, e o DC foi mantido.

Cruz et al.55 descreveram queda na FE (ainda dentro da normalidade) e alteração

diastólica seis meses após simpatectomia para tratamento de hiperhidrose.

Avaliando exclusivamente a ação do atenolol, Gonzenbach et al.56

descreveram, em humanos, queda da fração de ejeção após quatro semanas

de uso e nenhuma alteração no diâmetro diastólico, enquanto Otterstad et al. 57

observaram aumento no diâmetro diastólico do VE.

Em nosso estudo, encontramos FE mais elevada no grupo BIL,

provavelmente pelo estado hiperdinâmico secundário a maior atividade

simpática periférica corroborada por outros achados (FC, níveis de catecolamina).

A diferença estatística encontrada somente com o grupo CTAT pode ser

atribuída ao efeito inotrópico negativo do beta bloqueador, como no estudo de

Gonzenbach et al.,56 em oposição ao estado hiperdinâmico do grupo BIL.

Encontramos diferenças nos diâmetros em relação ao grupo CTAT,

comparando com UNI e BIL, que também pode ser inferida da mesma forma

que a FE (estado hiperdinâmico x inotropismo negativo) e semelhante aos dados

de Otterstad et al.57 Convém lembrar que não houve diferença das variáveis em

nenhum dos grupos em relação ao grupo CT.

Neste cenário fisiológico, as aferições da FC em repouso, antes do

teste de esforço, mostraram aumento no grupo de simpatectomia bilateral.

Yoshimoto et al.34 descreveram, na simpatectomia bilateral, queda significativa

da FC em relação ao grupo sham. Neste mesmo estudo, quando acrescido o

atenolol, o grupo sham respondeu com bradicardia, enquanto o grupo

49

Discussão

intervenção ficou inalterado. Em nosso estudo, o grupo atenolol apresentou FC

mais baixa, mas sem significância estatística com o grupo controle, mesmo

utilizando as maiores doses de droga encontradas na literatura39. Entretanto,

comparada com o grupo BIL, a diferença é significativa, provavelmente pelos

animais deste último grupo estarem mais taquicárdicos. No grupo UNIA,

quando comparado ao UNI, há menor FC no grupo tratado com atenolol,

mostrando a melhor ação do beta bloqueador somente nos animais

simpatectomizados. Nossos achados sugerem que diante do estímulo

adrenérgico periférico compensatório, o atenolol age melhor, talvez pela maior

densidade de receptores β1 demonstrada em nosso estudo (mesmo sem

significância estatística).

Com relação à PA, no trabalho de Yoshimoto et al.,34 não houve

diferença entre os grupos, mesmo após administração do atenolol. Jiang et al.35

descreveram valores significativamente menores de FC e PAM na

simpatectomia química com 6-hidroxidopamina, comparados com os ratos

controle. Contudo, convém esclarecer que o modelo de simpatectomia química

com 6-hidroxidopamina leva à denervação sistêmica, inclusive renal, pela

infusão peritoneal da droga. Mesmo se os modelos prévios de estudos

isolados, sobre a ação da 6-hidroxidopamina na via simpática renal, sugerirem

pouca alteração hemodinâmica, não há como afirmar a total ausência de

interação entre essas variáveis. No já citado estudo de Perlini et al.52,

comparando a simpatectomia química com 6-hidroxidopamina contra o

propanolol, a doxazosina e o placebo em ratos com hipertrofia de VE por

bandagem da aorta. Tal estudo não encontrou diferenças quanto à FC entre as

50

Discussão

drogas, ou placebo. Os animais bandados tinham PAS e PAD maiores em

relação ao seu controle nas três drogas e inclusive no placebo. No modelo de

simpatectomia química com guanetidina, Julien et al.58 não encontraram

alterações na PA apenas na sua variabilidade, atribuindo a manutenção da PA

à ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona. Em humanos, Lobato

et al.53 não encontraram diferenças entre FC e PA, antes e após a

simpatectomia por xylocaína unilateral esquerda ou direita em pacientes sem

doença cardíaca. Nossos achados mostraram diferença da PA entre os grupos

UNIA e BIL que pode ser inferida pela melhor ação do betabloquador diante do

tônus simpático periférico aumentado, além de aumento de receptores β1

encontrado nos animais submetidos ao procedimento, semelhante aos achados

da FC.

Durante o esforço físico, estudo com cães comparando simpatectomia

direita e esquerda59 demonstrou, no pico do esforço, o lado esquerdo com

maior FC, seguido pelo controle e depois pelo lado direito. Neste mesmo

estudo, o lado esquerdo ficou mais taquicárdico após o procedimento. O lado

direito teve FC mais baixa, após o procedimento no repouso e no pico do

esforço, além de menor capacidade ao exercício. Ao término do estudo, alguns

animais foram submetidos à simpatectomia bilateral e comparados com o

controle, que evidenciou menor FC e menor pressão sistólica intraventricular.

Esses achados são compatíveis com o que seria esperado do ponto de vista

fisiológico, considerando que o gânglio estrelado direito inerva

predominantemente os átrios e estimula o nó sinusal e o átrio-ventricular

(aumentando a FC e diminuindo a condução átrio-ventricular quando estimulado),

51

Discussão

enquanto o gânglio estrelado esquerdo inerva predominantemente os

ventrículos, aumentando a força de contração e, consequentemente, a PA

durante estímulo. Contudo, nosso estudo demonstrou aumento da atividade

simpática nos grupos simpatectomizados e os animais que já eram mais

taquicárdicos ao repouso tiveram incremento da FC ao esforço, permanecendo

o grupo BIL com FC ainda maior. Acreditamos que, a despeito do maior tônus

simpático neste grupo, não houve saturação dos receptores, permitindo o

acréscimo da FC ao esforço. Não houve incremento dos níveis da PA ao

esforço, o que poderia ser justificado pela diminuição do tempo de enchimento

ventricular devido à taquicardia limitando, assim, sua elevação.

Na avaliação da modulação autonômica, Jiang et al.35 encontraram

menor variabilidade da FC tanto no domínio do tempo (SDNN, SDANN e

RMSSD), quanto na frequência (BF, AF e BF/AF), inferindo que os ratos do grupo

simpatectomia química tiveram dominância parassimpática. Nos estudos em

humanos submetidos à simpatectomia bilateral, para tratamento de

hiperhidrose, Cruz et al.60 verificaram aumento da atividade vagal e diminuição

da atividade simpática, quando analisados por Holter, após seis meses do

procedimento. Nossa análise demonstrou aumento da atividade

parassimpática, expresso pela maior atividade da AF nos grupos CTAT, UNIA e

BIL. O β-bloqueador leva ao aumento da atividade parassimpática,61 enquanto

esta ação, no grupo BIL, foi atribuída a uma tentativa compensatória pelo

aumento do tônus simpático periférico.

Quanto à expressão de receptores beta, em publicação avaliando os

efeitos eletrofisiológicos da simpatectomia bilateral em ratos, Xie et al.62

52

Discussão

demonstraram menor expressão de receptores β1 por imunofluorescência do

grupo simpatectomia, em relação ao sham, inferindo downregulation. Em

modelo canino, comparando controle, simpatectomia química com

6-hidroxidopamina e simpatectomia cirúrgica, Valette et al.63 demonstraram

maior expressão de receptores β (upregulation) nas duas modalidades de

simpatectomia (química aumento de 190% e cirúrgica 219%) avaliados por PET.

Achados semelhantes foram publicados por Zhao e Muntz64 com upregulation

de receptores β1, mas não de β2 na simpatectomia química por

6-hidroxidopamina. O tradicionalmente esperado, da regulação dos adreno-

receptores, seria um upregulation com o uso de betabloqueadores (exceto

aqueles com atividade simpatomimética intrínseca que podem levar a downregulation)

relacionado ao grau de seletividade, ou seja, upregulation de receptores β1 e

β2 para os não seletivos e upregulation de receptores β1 para os seletivos.65

Nos casos de tônus simpático cronicamente aumentado, como na IC, o

esperado seria downregulation dos adreno-receptores β. Contudo, nas

situações de isquemia miocárdica, há upregulation desses receptores, apesar

da grande liberação de noradrenalina nesta situação.66 A literatura não é

uniforme na metodologia de dosagem, nem de procedimento da simpatectomia.

Nossos achados sugerem downregulation de β2, e mesmo sem confirmação

estatística, upregulation de β1 no grupo BIL, o que pode inferir questões quanto

à sensibilidade dos receptores às diferentes quantidades de catecolaminas. O

grupo BIL apresentou a maior quantidade de catecolaminas periféricas e

respondeu com maior expressão de receptores β1, enquanto o grupo UNI teve

menor quantidade de catecolaminas periféricas e expressou menos

53

Discussão

receptores β1, o que pode especular relação não linear entre concentração de

catecolaminas e expressão de receptores beta.

No que se refere às catecolaminas, Yoshimoto et al.34 descreveram

queda significativa na expressão de catecolaminas miocárdicas, nas quatro

câmaras cardíacas na simpatectomia bilateral, em relação ao grupo sham.

Entretanto, não foram avaliadas catecolaminas periféricas. Pardini et al.66

verificaram queda da noradrenalina em pelo menos 94% em todas as regiões

do coração, mas não em tecido periférico na simpatectomia cirúrgica. Jiang

et al.35 descreveram queda de 72,7% na noradrenalina miocárdica no VE após

simpatectomia química com 6-hidroxidopamina. Importante achado em nosso

estudo foi o aumento expressivo das catecolaminas periféricas, corroborando a

hipótese de via compensatória simpática extracardíaca, considerando que as

catecolaminas miocárdicas não mostraram diferença entre os grupos.

Há poucos dados relacionados à análise tecidual após simpatectomia

em modelos não patológicos. Jiang et al.35 concluíram que a simpatectomia

química induziu degeneração de cardiomiócitos com necrose e infiltração

inflamatória focal, hiperplasia dos tecidos conectivos intersticiais, além de

deposição de colágeno. Contudo, estes achados podem estar relacionados a

provável efeito tóxico da 6-hidroxidopamina no miócito, como descrito

previamente.67 Nosso estudo analisou, exclusivamente, o tamanho do miócito e

não encontrou diferença. Contudo, a metodologia da morfometria contempla a

seleção de miócitos íntegros para esta medida.

6. CONCLUSÃO

55

Conclusão

Nosso estudo mostrou que, apesar da simpatectomia uni ou bilateral,

ocorre manutenção do tônus simpático evidenciado pelo aumento de FC ao

repouso e sustentada ao esforço, além de maiores valores de PA ao repouso.

Esta resposta ocorre provavelmente por maiores concentrações de

catecolaminas periféricas. Estes achados sugerem a possibilidade de uma via

de compensação simpática extracardíaca. Observamos, ainda, upregulation de

receptores β1 no grupo BIL que pode justificar o aumento à resposta ao maior

nível circulante de catecolaminas, promovendo assim maior FC e PA. Além

disso, esse upregulation pode ter disponibilizado mais receptores β1 para ação

do betabloqueador como observado na melhor resposta nos níveis de PA e FC

no grupo UNIA. Estudos adicionais que superem as limitações da atual

proposta podem auxiliar na confirmação desta tese. Convém aguardar maiores

esclarecimentos do impacto fisiológico da simpatectomia, antes de considerá-la

no cenário clínico.

7. LIMITAÇÕES DO ESTUDO

57

Limitações do estudo

A alta taxa de mortalidade do grupo bilateral limitou a quantidade de

dados disponíveis para a análise. A principal causa de mortalidade no

procedimento deve-se a hematoma, lesão vascular e pneumotórax.68 O uso da

ketamina pode estar associado à estimulação simpática, o que pode interferir

em alguns dos resultados.

A confirmação clínica pela ptose palpebral ipsilateral (síndrome de

Horner) não necessariamente se correlaciona com o grau de denervação

simpática cardíaca, mas indica somente o bloqueio das fibras que atravessam

a parte superior do gânglio estrelado68 e foi o sinal físico utilizado no modelo

que consagrou o método.38 Acreditamos na completa denervação cardíaca,

considerando que o dano da esclerose foi extenso no plexo nervoso e que 90%

dos animais tinham algum grau de paresia no membro superior ipsilateral ao

procedimento. Este fator poderia ser considerado limitante, mas não houve

diferença no desempenho do teste de esforço, comparando com animais

controle nas variáveis tempo, velocidade e distância.

8. REFERÊNCIAS

59

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Efeitos da simpatectomia no miocárdio - incor.usp.br · cDNA ácido desoxirribonucleico...

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