EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO SOBRE A PLASTICIDADE ... · Por todos os desafios e sugestões que...

i

FRANCISCO PAULINO DUBIELA

EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO SOBRE A

PLASTICIDADE HIPOCAMPAL:

a importância dos receptores AMPA

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina como parte dos

requisitos para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

SÃO PAULO

2012

ii

Dubiela, Francisco Paulino Efeitos da Privação de Sono sobre a Plasticidade Hipocampal: a importância dos receptores AMPA/ Francisco Paulino Dubiela – São Paulo, 2012. xxi, 110 f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia. Título em inglês: Effects of sleep deprivation on hippocampal plasticity: the relevance of AMPA receptors 1. privação de sono 2. receptores AMPA 3. memória 4. hipocampo.

i

FRANCISCO PAULINO DUBIELA

EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO SOBRE A

PLASTICIDADE HIPOCAMPAL:

a importância dos receptores AMPA

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina como parte dos

requisitos para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

Orientadora: Profa. Dra. Débora Cristina Hipólide

Co- Orientador: Prof. Dr. Claudio Marcos Teixeira de Queiroz


SÃO PAULO

2012

ii


ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGIA

Chefe do departamento: Profa. Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni

Coordenador do curso de pós-graduação: Profa. Dra. Vânia D’Almeida

iii

Esta tese de doutoramento foi realizada no Departamento de

Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, com o apoio financeiro das fundações:

FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo,

bolsa de doutoramento, processo n°: 2007/53176-8.

CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,

bolsa de doutoramento, processo n° 142594/2007-5.

CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior, bolsa de doutorado sanduiche no exterior, processo n° 1324-09-8.

AFIP – Associação Fundo de Incentivo a Pesquisa.

iv

À minha família, que cresce a cada dia!

v

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Débora Cristina Hipólide, por sua orientação dedicada e amizade

constante. Por dar o impulso inicial de minha carreira científica e auxiliar na

conclusão dessa etapa tão importante.

Ao Prof. Dr. Claudio Marcos Teixeira de Queiroz, pela co-orientação e

motivação. Por todos os desafios e sugestões que tornaram esse trabalho

possível.

Ao Prof. Dr. Sergio Tufik, por acreditar e apoiar incondicionalmente meu

potencial.

Ao Prof. Dr. Pierre Hervé Luppi, por seu acolhimento e atenção em seu

laboratório. Por seu espírito sagaz e carisma contagiante.

Ao Prof. Dr. Damien Gervasoni, pelo suporte, confiança e perseverança. Por

sua amizade e profissionalismo.

Aos Prof. Dr. Jackson Bittencourt e a Profa. Dra. Luciane Sita, por sua

recepção e atenção em seu laboratório.

À Profa. Dra. Maria Gabriela Menezes de Oliveira, pelos conselhos valiosos

nos momentos cruciais desse trabalho.

vi

À Dra. Juliana Carlota, por sua valiosa colaboração nesse estudo e em outros

tantos experimentos.

Aos membros participantes da banca de qualificação e defesa.

Aos amigos e colegas do Departamento de Psicobiologia, que compartilharam

os sonhos, angústias e desafios das neurociências.

Aos técnicos José Bernardo da Costa e Danilo Carlos Machado pelo auxílio

dos experimentos farmacológicos deste estudo.

Às técnicas Joelcimar Martins da Silva e Diva Lima, pela valiosa ajuda na

realização dos experimentos neuroquímicos e moleculares.

Às secretárias do Departamento de Psicobiologia, Nereide Lourdes Garcia,

Mara Vianna e Jacqueline Wetzl, por se dedicarem à resolução dos assuntos

burocráticos da minha pós graduação.

À Leticia Lobo Luppi, por sua imensa e carinhosa asa em terras

desconhecidas.

À minha esposa, Larissa Zeggio, meu primeiro e último amor, que trouxe

bonança nos mares revoltos desse trabalho.

vii

Aos meus pais, Valdir Luiz Dubiela e Ana Yara Paulino, pelo amor incondicional

e amparo constante.

Aos meus irmãos, Joana, Pablo, Rafael, Suiá e Felipe, pelo apoio moral.

À minha sogra, Maria Teresa Zeggio, pela convivência agradável e por apoiar a

realização de novos projetos de vida.

Aos ratos, que involuntariamente permitiram que esse trabalho fosse realizado.

Ao CNPq, à FAPESP, à CAPES e à AFIP pelo apoio financeiro.

A você, que lê esta tese.

viii

Do you see the way that tree bends?

Does it inspire?

Leaning out to catch the sun’s rays

A lesson to be applied

I remember when I swore I knew everything

Let's say knowledge is a tree and it's growing up just like me

I'm so light the wind it shakes

I'm so high the sky I scrape

I'm so light I hold just one breath and go back to my nest

Sleep with innocence...

Present Tense/ Up my Tree

Eddie Vedder

ix

Dubiela, FP. Efeitos da Privação de Sono sobre a Plasticidade Hipocampal: a

importância dos receptores AMPA (tese de doutoramento). Universidade

Federal de São Paulo, 2012.

1. RESUMO

Diversos estudos mostram que a falta de sono interfere na formação de novas

memórias, especialmente as dependentes do hipocampo. Em consonância, há

trabalhos que mostram que a privação de sono (PS) interfere sobre o ritmo teta

hipocampal (4 a 12 Hz), mas não há dados consistentes sobre seus efeitos

durante a aprendizagem de tarefas de memóra. Há evidências indiretas que

sugerem o envolvimento de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo

AMPA, que constituem um fator essencial tanto para a aprendizagem de

tarefas como para a plasticidade hipocampal. Tratamentos com fármacos que

atuam sobre os receptores AMPA têm se mostrado eficazes na prevenção de

prejuízos de memória induzidos por patologias neurais, bem como na

modulação do ritmo teta hipocampal. Portanto, o objetivo do presente estudo

foi investigar o envolvimento dos receptores AMPA hipocampais sobre os

prejuízos de memória de ratos, induzidos pela privação de sono. Na primeira

etapa, foram realizadas análises da marcação autorradiográfica de receptores

AMPA e da transcrição da subunidade GluR1 após a privação de sono, bem

como experimentos farmacológicos com potenciador (aniracetam) e

antagonista (GYKI 52466) de receptores AMPA, com o propósito de prevenir os

x

prejuízos apresentados por ratos privados de sono na tarefa de esquiva

inibitória. Na segunda etapa, foi realizada a caracterização do ritmo teta

hipocampal e seus subtitpos (teta tipo 1 e tipo 2) durante uma tarefa de

reconhecimento de objetos em após PS. Na primeira etapa, foi observado uma

diminuição da marcação autorradiográfica de receptores AMPA

especificamente na formação hipocampal de ratos privados de sono por 96 h,

que se normaliza com uma recuperação de sono por 24 h. Por outro lado, não

foram encontradas alterações na hibridização in situ da subunidade GluR1

hipocampal. Dados de experimentos farmacológicos mostraram que a

administração aguda de aniracetam (100 mg/kg) foi eficaz na prevenção de

prejuízo de desempenho de esquiva inibitória de ratos privados de sono, ao

passo que tratamentos agudo e crônico com GYKI 52466 não surtiram efeito.

Na segunda etapa, ratos com implantes de eletrodos na formação hipocampal

desempenharam uma tarefa de reconhecimento de objetos após PS de 72 h, e

apresentaram prejuízo nessa condição. A análise da potência do ritmo teta

hipocampal mostrou que o ritmo teta tipo 2 está reduzido durante o treino da

tarefa, e que se normaliza na ocorrência do teste após a recuperação de sono.

A partir dos dados obtidos nas duas etapas, conclui-se que: 1) a privação de

sono reduz a marcação de receptores AMPA hipocampais, por meio de

modificações pós-transcricionais de suas subunidades, e que a recuperação de

sono normaliza esse efeito; 2) o potenciador aniracetam previne o prejuízo de

memória de ratos privados de sono na tarefa de esquiva inibitória; 3) a privação

de sono modifica o ritmo teta hipocampal durante a aprendizagem de uma

tarefa de reconhecimento de objetos, e sugere a participação dos receptores

AMPA hipocampais nessa condição.

xi

Palavras-chave: privação de sono, receptores AMPA, memória, hipocampo.

xii

Dubiela, FP. Effects of sleep deprivation on hippocampal plasticity: the

relevance of AMPA receptors (P.h.D. thesis). Universidade Federal de São

Paulo, 2012.

ABSTRACT

Several studies have shown that lack of sleep influences formation of new

memories, specially hippocampus dependent ones. In addition, reports have

shown that sleep deprivation (SD) disturbs hippocampal theta rhythm (4-12 Hz),

but there is no consistent data regarding its effects on task learning. There is a

body of indirect evidence suggesting the involvement of glutamatergic

ionotropic AMPA receptors, which represent an essential factor both for task

learning as for hippocampal plasticity. Pharmacological treatment with drugs

acting on AMPA receptors has been regarded as an useful therapy to prevent

memory deficits induced by neural pathologies and to modulate hippocampal

theta rhythm. Therefore, the objective of the present study was to investigate

AMPA receptors involvement on memory deficits of rats induced by SD. The

first part relayed on analyses of AMPA receptor binding and GluR1 subunit

transcription after SD, and pharmacological experiments with a potentiator

(aniracetam) and an antagonist (GYKI 52466) of AMPA receptors in order to

prevent SD induced deficits in an inhibitory avoidance task. In the second part,

the hippocampal theta rhythm and its components (type 1 and type 2 theta)

xiii

were studied during an object recognition task after SD. Results from the first

part showed AMPA receptor binding reduction specifically on hippocampal

areas after 96 h SD, which are normalized after 24 h sleep recovery. No

changes were found in GluR1 subunit transcription within the hippocampus of

sleep deprived rats. Pharmacological results displayed an efficacious effect of

acute aniracetam treatment (100 mg/kg) in order to prevent SD induced

performance deficit in the inhibitory avoidance task, while both acute and

chronic treatments with GYKI 52466 were devoid of any mnesic effect. In the

second part, rats with electrodes implants in the hippocampal formation

performed an object recognition task after 72 h SD, and displayed a

performance deficit in this condition. Power spectrum analyses of the

hippocampal theta rhythm showed a reduction of type 2 theta during learning,

which is normalized after sleep recovery in between sessions of the task.

Altogether data from the two parts one conclude that 1) sleep deprivation

reduces hippocampal AMPA receptor binding, through post transcriptional

mechanisms, which is normalized after sleep recovery; 2) AMPA potentiator

aniracetam prevents memory deficit of sleep deprived rats in the inhibitory

avoidance task; 3) sleep deprivation changes hippocampal theta rhythm during

task learning, with potential involvement of AMPA receptors of the hippocampal

formation.

Keywords: sleep deprivation, AMPA receptors, memory, hippocampus.

xiv

ÍNDICE

1. RESUMO ............................................................................................................ IIX

1.1. Lista de Abreviaturas..................................................................................XVII

1.2. Lista de Figuras.........................................................................................XVIII

1.3. Lista de Tabelas..........................................................................................XXI

2. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1

2.1. Perda de Sono e de Memória ........................................................................ 1

2.2. A Privação de Sono e os Receptores AMPA ................................................. 6

2.3. Modulação Farmacológica de Receptores AMPA ........................................ 11

2.4. Receptores AMPA e o Ritmo Teta Hipocampal ........................................... 14

2.5. Justificativa .................................................................................................. 18

3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 20

4. PRIMEIRA ETAPA: AVALIAÇÃO NEUROQUÍMICA E FARMACOLÓGICA DOS

RECEPTORES AMPA NA FORMAÇÃO DE MEMÓRIAS EM RATOS PRIVADOS DE

SONO ......................................................................................................................... 22

4.1. Experimento 1: Efeitos da Privação e Recuperação de Sono na marcação

de [3H]AMPA e hibridização in situ de GluR1 ...................................................... 22

4.1.1. Experimento 1-1: Autorradiografia de Receptores AMPA após Privação e

Recuperação de Sono ........................................................................................ 22

4.1.2. Experimento 1-2: Hibridização in Situ da Subunidade GluR1 após Privação

e Recuperação de Sono...................................................................................... 27

xv

4.2. Experimento 2 – Efeitos da Administração de Potenciador e Antagonista

de receptores AMPA no desempenho de Esquiva Inibitória de Ratos Privados de

Sono 30

4.2.1. Experimento 2-1: Efeitos da Administração Aguda de Aniracetam em

Ratos Privados de Sono...................................................................................... 33

4.2.3. Experimento 2-2: Efeitos da Administração Aguda de GYKI 52466 em


4.2.4. Experimento 2-3: Efeitos da Administração Crônica de GYKI 52466 em


4.3. RESULTADOS ........................................................................................ 37

4.3.1. Experimento 1-1: Autorradiografia de Receptores AMPA após Privação e

Recuperação de Sono ........................................................................................ 37

4.3.2. Experimento 1-2: Hibridização in Situ da Subunidade GluR1 após Privação

e Recuperação de Sono...................................................................................... 39

4.3.3. Experimento 2-1: Efeitos da Administração Aguda de Aniracetam em


4.3.4. Experimento 2-2: Efeitos da Administração Aguda de GYKI 52466 em


4.3.5. Experimento 2-3: Efeitos da Administração Crônica de GYKI 52466 em


4.4. DISCUSSÃO PARCIAL ........................................................................... 44

4.5. Experimento Complementar: Efeitos da Administração Intra-Hipocampal

de Aniracetam em Ratos Privados de Sono no Condicionamento de Medo ........ 50

4.5.1. Resultados .............................................................................................. 57

4.5.2. Discussão do Experimento Complementar .............................................. 59

xvi

5. SEGUNDA ETAPA: AVALIAÇÃO DO RITMO TETA HIPOCAMPAL DE RATOS

PRIVADOS DE SONO DURANTE A TAREFA DE RECONHECIMENTO DE

OBJETOS .................................................................................................................. 61

5.1. Metodologia Geral ................................................................................... 61

5.1.1. Experimento 1 – Efeitos da Privação de Sono na Tarefa de

Reconhecimento de Objetos ............................................................................... 66

5.1.2. Experimento 2 – Análise da Potência de Ritmo Teta Hipocampal durante

uma Tarefa de Reconhecimento de Objetos em Ratos Privados de Sono .......... 70

5.2. RESULTADOS ........................................................................................ 75


Reconhecimento de Objetos ............................................................................... 75

5.2.2. Experimento 2 – Análise da Potência de Ritmo Teta Hipocampal durante

uma Tarefa de Reconhecimento de Objetos em Ratos Privados de Sono .......... 81

5.3. DISCUSSÃO PARCIAL ........................................................................... 85

6. DISCUSSÃO GERAL ......................................................................................... 89

7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 95

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 96

9. ANEXO ............................................................................................................. 108

xvii

1.1. LISTA DE ABREVIATURAS

Aniracetam – (1-(4-metoxibenzoil)-2-pirrolidinona

AMPA – ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico

ANOVA – Análise de Variância

EEG – eletroencefalografia

GYKI 52466 – (1-(4-aminofenil)-4-metil-7,8-metilenedioxi-5H-2,3-

benzodiazepina

i.p. – intraperitoneal

LTP – Long term potentiation (potenciação de longa duração)

NMDA – N-metil-D-aspartato

PS – Privação de sono

REM – rapid eye movements (movimentos rápidos dos olhos)

SOL – Sono de ondas lentas

SP – Sono paradoxal

xviii

1.2. LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Atenuação do prejuízo de esquiva inibitória de ratos privados de sono porde

sono por 96 h após recuperação por 24 h.......................................................................6

Figura 2: Privação de sono por meio do método da plataforma múltipla

modificada.....................................................................................................................25

Figura 3: Desenho esquemático do experimento 1.......................................................26

Figura 4: Aparato de esquiva inibitória..........................................................................32

Figura 5: Desenho esquemático do experimento 2-1....................................................33



Figura 8: Imagens computadorizadas da marcação de [3H]AMPA em animais controle,

privado de sono e recuperado de sono.........................................................................38

Figura 9: Imagem computadorizada da hibridização in situ da subunidade GluR1 na

formação hipocampal de um animal controle................................................................40

Figura 10: Latência de passagem de ratos privados de sono tratados com aniracetam

na tarefa de esquiva inibitória........................................................................................41

Figura 11: Latência de passagem de ratos privados tratados agudamente com GYKI

52466 na tarefa de esquiva inibitória.............................................................................42

Figura 12: Latência de passagem de ratos privados tratados cronicamente com GYKI

52466 na tarefa de esquiva inibitória.............................................................................43

Figura 13: Desenho experimental do experimento complementar................................53

Figura 14: Desenho experimental da tarefa de condicionamento clássico de medo....55

Figura 15: Localização histológica de implante de cânula no hipocampo dorsal..........56

Figura 16: Tempo médio por minuto de congelamento de animais privados de sono

tratados com injeção intrahipocampal de aniracetam durante o treino de

condicionamento de medo............................................................................................57

xix

Fig 17: Tempo médio por minuto de congelamento de animais privados de sono

tratados com injeção intrahipocampal de aniracetam durante o teste de

condicionamento de medo ao contexto.........................................................................58

Fig 18: Tempo médio por minuto de congelamento de animais privados de sono

tratados com injeção intrahipocampal de aniracetam durante o teste de

condicionamento de medo ao som................................................................................59

Figura 19: A e C: exemplos de arranjos de eletrodos implantados no córtex S1 (matriz

de 8x2 eletrodos) e no hipocampo (matriz de 4x4 eletrodos); B: amostra da localização

do posicionamento dos eletrodos por reconstrução histológica na formação

hipocampal; D: diagrama contendo agrupamentos de estados do ciclo sono-vigília

(QW: vigília quieta, AE: vigília ativa, SWS: sono de ondas lentas, REM: sono

paradoxal, IS: sono intermediário, WT: movimento de vibrissas), baseados nas

análises de componente das razão 1 (r1, 0.5-20/0.5-55 Hz) e razão 2 (r2, 0.5-4.5/0.5-9

Hz) dos valores obtidos do espectro de frequência de potenciais de campo locais por

segundo.........................................................................................................................65

Figura 20: Acima, desenho experimental da tarefa de reconhecimento de objetos;

abaixo, exemplos de objetos utilizados na tarefa com diferentes formas e texturas....67

Figura 21: A e B: amostras de registros de disparos neuronais e potenciais de campo

locais com visualização simultânea do comportamento do animal; C: desenho

experimental do estudo. Animais foram habituados á arena de registro 2 h antes da

primeira sessão da tarefa de reconhecimento de

objetos...........................................................................................................................68

Figura 22: Registro de potenciais de campo locais hipocampais durante uma sessão

da tarefa de reconhecimento de objetos. A: trecho de registro de um canal localizado

na formação hipocampal. B: espectrograma do canal ao longo da sessão (note a

predominância de ritmo teta hipocampal na faixa de 4 a 12 Hz). C: animal exposto aos

objetos da tarefa de reconhecimento............................................................................71

xx

Figura 23: Razão entre pico e média de faixa de frequências do ritmo teta hipocampal

(4-12 Hz). Os canais hipocampais (numerados de 16 a 32) de cada animal foram

analisados para seleção daquele com maior valor de pico (em vermelho) e menor valor

de média (em azul)........................................................................................................72

Figura 24: Localização histológica do posicionamento dos canais selecionados para

cada animal...................................................................................................................73

Figura 25: Tempo relativo de exploração de objetos idênticos durante a sessão 1 da

tarefa de reconhecimento de objetos, em condição controle (A) e após privação de

sono por 72 h (B)...........................................................................................................76

Figura 26: Tempo total de exploração dos objetos durante a sessão 1 da tarefa em

condição controle (CT) e após privação de sono por 72 h (PS)....................................76

Figura 27: Tempo relativo de exploração de objetos durante a sessão 2 da tarefa de

reconhecimento de objetos, em condição controle (A) e após privação de sono por 72

h (B)..............................................................................................................................77

Figura 28: Tempo total de exploração dos objetos durante a sessão 2 da tarefa em

condição controle (CT) e após privação de sono por 72 horas (PS).............................77

Figura 29: Efeitos da privação de sono no ciclo sono-vigília durante intervalo de 4

horas entre sessões da tarefa de reconhecimento de objetos......................................79

Figura 30: Efeitos da privação de sono em parâmetros específicos dos estados de

sono. A: número de episódios de sono paradoxal (SP); B: duração média de episódio

de SP; C: número de episódios de sono de ondas lentas (SOL); D: duração média de

episódio de SOL............................................................................................................80

Figura 31: Espectro de potência normalizado do registro hipocampal durante as duas

sessões da tarefa de reconhecimento de objetos.........................................................82

Figura 32: Efeitos da privação de sono sobre potência normalizada de teta total (4-12

Hz, A), teta 1 (8-12 Hz, B), e teta 2 (4-8 Hz, C).............................................................83

Figura 33: Pico de frequência de ritmo teta hipocampal nas condições controle (CT) e

privação de sono por 72 horas (PS) na tarefa de reconhecimento de objetos.............84

xxi

1.3. LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Marcação de [3H]AMPA após 96 horas de privação de sono e recuperação

de 24 horas....................................................................................................................59

Tabela 2: Hibridização in situ da subunidade GluR1 após 96 horas de privação de

sono e recuperação de 24 horas...................................................................................60

1

2. INTRODUÇÃO

2.1. Perda de Sono e de Memória

O sono é um estado recorrente e dinâmico que compõe, em conjunto

com a vigília, a base do ritmo circadiano dos animais, representado pelo ciclo

sono-vigília (Marques e Menna Barreto, 2003). Com a descoberta das

oscilações elétricas cerebrais, descritas pela primeira vez por Hans Berger em

humanos (1929), o ciclo sono-vigília em mamíferos se divide três fases

principais, definidas por características eletrofisiológicos únicas (Siegel, 2008):

a vigília, com predomínio de dessincronia de ondas corticais de baixa amplitude

e alta frequência; o sono de ondas lentas, com predomínio de ondas de baixa

freqüência e alta amplitude, e uma fase de sono em que há ondas

dessincronizadas similares às da vigília, mas com atonia muscular e baixa

responsividade sensorial: o sono REM (rapid eye movement), descrito

primeiramente em humanos por Aserinsky e Kleitman (1953), também

chamado de sono dessincronizado (Timo-Iaria et al., 1970) e sono paradoxal

(Jouvet, 1969). Essa última denominação será usada no presente trabalho.

Vários autores sugerem que o sono representa um estado fisiológico

importante para o processamento eficiente das informações adquiridas durante

a vigília. As evidências experimentais e clínicas incluem a observação de

melhora de desempenho cognitivo após períodos de sono em humanos

(Mednick et al. 2002), aumento de sono paradoxal após tarefas de

aprendizagem em roedores (Smith e Lapp 1991; Smith e Rose 1997),

2

reverberação de atividade neuronal da vigília e aumento de oscilações lentas

durante o sono de ondas lentas (Ribeiro e Nicolelis 2004), e aumento de

expressão de genes de fatores neurotróficos durante o sono paradoxal (Ribeiro

et al. 1999; Ribeiro et al. 2002).

A perda de sono é um problema cada vez mais presente na sociedade

atual. Segundo levantamento realizado pela National Sleep Foundation (2002),

27% dos adultos americanos tem dificuldades para dormir e 16% apresentam

sonolência com consequências significativas em suas atividades diárias. Um

estudo recente de nosso laboratório levantou que, dentro de um conjunto de

mais de dois mil brasileiros distribuídos em 150 cidades pelo país, 63% destes

sofrem de algum distúrbio de sono (Bittencourt et al., 2009). Especificamente

na cidade de São Paulo, um segundo estudo de nosso laboratório, ao

comparar três levantamentos de queixas de sono obtidos nas últimas décadas,

demonstrou que a prevalência de sonolência diurna aumentou

consideravelmente (Santos-Silva et al., 2010). Sintomas clínicos comuns

associados à perda de sono incluem humor degradado, sonolência e prejuízos

cognitivos (Bonnet e Arand 2003). Esta última relação – perda de sono e

prejuízos cognitivos, especificamente, piora de memória – é o tema central da

presente tese.

A memória não é uma entidade única, podendo, em humanos, ser

classificada em dois tipos principais – memória declarativa e não declarativa –

conforme as áreas cerebrais envolvidas no processo mnemônico (Squire,

1992). A memória declarativa é descrita como a habilidade em reconhecer e

recordar fatos de forma consciente e está relacionada a estruturas do lobo

temporal medial, como a formação hipocampal (Squire & Zola-Morgan, 1991;

3

Eichenbaum, 2000). Por sua vez, a memória não declarativa refere-se à

capacidade de desenvolver habilidades percepto-motoras e cognitivas após

exposições repetidas e está associada a estruturas cortico-estriatais e

cerebelares (Squire & Zola-Morgan, 1991).

De forma similar à divisão de tipos de memória em humanos, é possível

obter modelos animais putativos de memórias declarativas e não declarativas,

com base no aprendizado de tarefas que requerem o envolvimento de

diferentes regiões do sistema nervoso central (Izquierdo e Medina, 1997). Por

exemplo, o hipocampo, uma estrutura essencial para a memória declarativa em

humanos, apresenta uma importante função no processamento de informações

espaciais e contextuais de animais, mas não está relacionado a tarefas que

não dependem deste tipo de informação (O’Keefe, 1990; Kim & Fanselow,

1992; Phillips & LeDoux e col., 1992).

Estudos sobre a influência da falta de sono na memória têm gerado

enfoques diversos, aos quais estão relacionados o momento do impedimento

do sono em relação à aprendizagem, o tipo e a complexidade da tarefa de

memória (Walker e Stickgold, 2006). Muitas evidências sugerem que a privação

de sono (PS) prévia à aprendizagem de novas informações prejudica a

memória do tipo declarativa. Em humanos, um dos primeiros trabalhos sobre o

tema foi realizado por Morris e colaboradores (1960), demonstrando que a

memória declarativa temporal (memória de eventos localizados no tempo)

estava prejudicada após uma noite de privação total de sono antes da

aprendizagem. Essas observações foram reavaliadas em um trabalho posterior

realizado por Harrison e Horne (2000), que observaram um prejuízo similar na

discriminação temporal de fotografias em voluntários privados de sono. Um

4

estudo de neuroimagem funcional avaliou os efeitos de 35 horas de PS na

atividade metabólica de várias áreas cerebrais enquanto os voluntários

aprendiam uma tarefa de memória declarativa verbal, no que se verificou

prejuízo significativo na retenção da tarefa associado a redução de atividade do

lobo temporal medial (Drummond et al. 2000). Em consonância a esse estudo,

Walker e Stickgold (2006) demonstraram que a PS antes da aprendizagem de

palavras neutras e emocionais prejudica o reconhecimento posterior, com

redução expressiva na retenção de palavras neutras e emocionalmente

positivas, ao passo que não há alteração na retenção de palavras negativas.

Em animais não humanos, há um volume considerável de trabalhos

relacionando os efeitos da perda de sono antes da aprendizagem (para

revisão: Pearlman 1979, Smith 1995, Walker e Stickgold 2006). Animais

privados de sono antes de aprenderem uma tarefa apresentam prejuízos de

memórias dependentes do hipocampo. Dessa forma, a privação de sono em

animais induz piora de desempenho em diversas tarefas que avaliam o

componente espacial ou contextual do processo de aprendizagem, como a

versão espacial do labirinto aquático de Morris (Youngblood et al. 1999,

Youngblood et al. 1997), a esquiva inibitória (Moreira et al., 2003, 2010; Dubiela

et al, 2005, 2010) e o condicionamento de medo ao contexto (Bueno et al.,

1994, McDermott et al., 2003; Ruskin et al. 2004). Tarefas que não dependem

do hipocampo, e classicamente não dependem de elementos espaciais ou

contextuais para sua execução, como o condicionamento de medo ao som

(O’Keefe, 1990), geralmente não são afetadas pela privação de sono (Bueno et

al. 1994, McDermott et al. 2003, Ruskin et al. 2004), embora Dametto et al.

(2002) tenham encontrado prejuízo no condicionamento de medo ao som em

5

ratos privados de sono. Nesses estudos, a privação de sono é realizada de 72

a 96 horas (3 a 4 dias), com o impedimento total da fase de sono paradoxal,

embora esta seja acompanhada por uma redução significativa do sono de

ondas lentas (Machado et al. 2004). Ainda, foi verificado que a privação de

sono por períodos mais curtos (por exemplo, 24 horas) não interfere

sobremaneira no desempenho da tarefa de esquiva inibitória (Bueno et al.,

1994), o que sugere uma relação análoga com os resultados obtidos em

humanos pelo estudo de Walker e Stickgold (2006) quanto a resistência de

traços de memórias aversivas aos efeitos da PS.

Especificamente em nosso laboratório, uma série de estudos

demonstrou que ratos privados de sono por 96 horas antes da realização da

tarefa de esquiva inibitória apresentam prejuízos de desempenho, verificados

tanto em intervalos de retenção curtos (30 minutos; Dubiela et al. 2005, 2010),

como em intervalos longos (24 horas; Bueno et al. 1994, Dametto et al. 2002,

Moreira et al. 2003, Dubiela et al., 2010) após o treino da tarefa. Ainda, ratos

submetidos a PS por 4 dias apresentam um aumento expressivo de sono

paradoxal nas primeiras horas de repouso (efeito rebote), que se normaliza

após 24 horas (Machado et al. 2004), e observamos que este mesmo período

de recuperação promove atenuação do prejuízo da PS sobre a tarefa de

esquiva inibitória (Dubiela et al. 2010, Fig 1). Dessa forma, é plausível supor

que os efeitos deletérios da privação de sono sobre os mecanismos neurais

relacionados com a formação de memórias estão vinculados à pressão

homeostática de sono, caracterizada pelo efeito rebote (Machado et al. 2004).

Por conseguinte, as modificações induzidas pela PS em tais mecanismos

6

mnemônicos estariam revertidas após a ocorrência oportunidade da

recuperação de sono.

Figura 1: Atenuação do prejuízo de esquiva inibitória de ratos privados de sono porde sono por

96 h após recuperação por 24 h, em intervalos de retenção de 30 minutos e 24 horas (média +

erro padrão em segundos). * p < 0,05 vs. controle (teste de Duncan após ANOVA de duas vias

com medidas repetidas). Adaptado de Dubiela et al. (2010).

2.2. A Privação de Sono e os Receptores AMPA

Em busca de mecanismos subjacentes aos prejuízos de memória

dependente do hipocampo em animais privados de sono, diversos

pesquisadores investigaram os efeitos da privação de sono sobre a

plasticidade hipocampal e, especialmente, sobre a potenciação sináptica de

longo prazo (LTP, do inglês long term potentiation, Bliss e Collingridge 1993,

Bear e Malenka 1994). A LTP é induzida geralmente por meio de breves

estimulações elétricas em alta frequência em fibras aferentes da região de

7

interesse, produzindo aumento da responsividade do neurônio pós sináptico

(Bliss e Collingridge 1993, Bear e Malenka 1994). Desde sua descoberta, a

LTP hipocampal é considerada um modelo eletrofisiológico putativo de

formação de memórias, embora grande parte das evidências que a suporte

sejam indiretas, tais como intervenções farmacológicas que prejudicam tanto a

aprendizagem de tarefas hipocampo dependentes como a indução de LTP

(Albensi et al. 2007). Por outro lado, uma evidência direta foi demonstrada no

estudo de Whitlock et al. (2006), no qual foi observado que a aprendizagem da

tarefa de esquiva inibitória induz mudanças sinápticas idênticas às geradas

pela LTP na região CA1, como aumento de potencial de resposta evocada e

ativação de receptores AMPA

Um dos primeiros trabalhos a avaliar os efeitos da PS sobre a

plasticidade hipocampal foi realizado por Campbell e colaboradores (2002), que

observou redução da LTP na região do CA1 de fatias hipocampais de ratos

privados de sono por 12 horas. McDermott et al. (2003) expandiram esses

dados, ao mostrar que, em preparações in vitro, tanto a LTP da região CA1

quanto do giro denteado estavam inibidas após PS de 72 horas de duração. À

semelhança de nossos dados na tarefa de esquiva inibitória (Fig 1), McDermott

et al. (2003) também demonstraram que a recuperação de sono por 24 horas

após PS reverteu a redução da LTP hipocampal.

Um fator comum entre a formação de memórias hipocampo

dependentes e a LTP hipocampal é a participação do sistema glutamatérgico,

responsável pela maior parte da transmissão excitatória do sistema nervoso

central e, por conseguinte, envolvido em diversos processos de plasticidade

cerebral (Izquierdo et al., 1993; Kandel et al., 2000). As evidências

8

neurofarmacológicas da participação desse sistema em processos

mnemônicos e eletrofisiológicos são obtidas por meio do estudo de seus dois

principais receptores ionotrópicos: os receptores de tipo NMDA e do tipo AMPA.

A privação de sono aumenta os níveis de glutamato extracelular no

córtex (Bettendorff et al., 1996; Mohammed et al., 2011) e no hipocampo

(Mohammed et al., 2011) de animais de laboratório, o que pode estar

associado a alterações em receptores do sistema glutamatérgico. Nesse

sentido, estudos dos efeitos da PS sobre os receptores do tipo NMDA, por

exemplo, demonstram redução na expressão de suas subunidades NR1

(McDermott et al., 2006, Ravassard et al., 2009) e NR2A (McDermott et al.,

2006) no hipocampo de ratos após 72 horas de privação de sono.

Complementarmente, dados de nosso laboratório mostram que ratos privados

de sono por 96 horas apresentam uma resposta farmacológica exacerbada aos

efeitos locomotores de MK-801, um antagonista não-competitivo de receptores

NMDA (Dubiela et al., 2011). Esses dados tomados em conjunto, reforçam a

concepção de que há uma redução da função desses receptores induzida pela

privação de sono.

Por outro lado, evidências sobre a influência da perda de sono sobre a

expressão e funcionalidade dos receptores do tipo AMPA são contraditórias. De

acordo com o estudo apresentado por Vyazovskiy et al. (2008), há aumento da

expressão da subunidade GluR1 no córtex e no hipocampo de ratos privados

totalmente de sono por 4 horas, enquanto que Hagewoud et al. (2009) não

encontraram modificações nos níveis de expressão da mesma subunidade em

camundongos submetidos a privação total de sono por 6 ou 12 horas. Por sua

vez, McDermott et al. (2006) indicam não haver alterações nas correntes

9

iônicas que fluem através do canal de receptores AMPA no hipocampo de ratos

privados de sono por 72 horas, ao passo que Ravassard et al. (2009)

revelaram níveis reduzidos da subunidade GluR1 no hipocampo de ratos

privados pelo mesmo período. Dentro deste contexto, é plausível que uma

análise abrangente em regiões cerebrais envolvidas com a formação de

memórias, por meio da autorradiografia de receptores, possa contribuir para

melhor elucidar essa questão.

A abordagem neuroquímica dos efeitos da privação de sono sobre os

receptores AMPA fornece uma interessante base de investigação, uma vez que

a marcação desses receptores encontra-se aumentada no hipocampo após a

indução de LTP (Maren et al. 1993). De forma similar, há aumento de

marcação de receptores AMPA hipocampais após aprendizagem de tarefas

hipocampo dependentes, como o condicionamento de medo ao contexto

(Tocco et al. 1992) e a esquiva inibitória (Cammarota et al. 1995, 1996; Sadad

et al., 2006). Ademais, a aplicação intra-hipocampal de CNQX, um antagonista

de receptores AMPA, prejudica a formação da memória na tarefa de esquiva

inibitória (Bonini et al. 2003), o que sugere um possível mecanismo que associe

a diminuição da função dos receptores AMPA e os prejuízos de memória

observados após a privação de sono.

Os receptores AMPA são estruturas multiméricas formadas pela

combinação de 4 a 5 subunidades proteicas, classificadas em quatro tipos:

GluR1, GluR2, GluR3 e GluR4 (Monaghan e Wenthold 1997). A identificação

dessa diversidade é crucial devido às características funcionais que cada

subunidade confere ao receptor: homômeros de GluR1 são recrutados do

citosol para o terminal pós sináptico quando há aumento de atividade neuronal

10

no hipocampo (Hayashi et al., 2000), e a presença da subunidade GluR2 inibe

a condutância de cálcio pelo canal iônico (Monaghan e Wenthold, 1997).

No hipocampo, a maior parte dos receptores AMPA são heterômeros

compostos pelas subunidades GluR1-GluR2 e GluR2-GluR3 (Shi et al., 2001).

A redução de receptores AMPA hipocampais é uma característica presente em

algumas patologias neurais associadas a prejuízos de memória, como o mal de

Alzheimer e a hipóxia isquêmica (Westerberg et al. 1987, Dewar et al. 1991,

Sommer et al. 2002, Montori et al., 2010). A diminuição do número de

receptores no mal de Alzheimer parece estar associada a uma redução da

transcrição da subunidade GluR1 (Pellegrini-Giampietro et al. 1994, Dickey et

al. 2003), enquanto que na isquemia cerebral observa-se uma diminuição nos

níveis de RNAm e de proteína das subunidades GluR1 e GluR2 na formação

hipocampal (Montori et al., 2010). Entretanto, um estudo recente demonstrou

que não há modificação da transcrição da subunidade GluR1 na formação

hipocampal de ratos privados de sono por 72 h (Ravassard et al., 2009). Dessa

forma, a caracterização da transcrição da subunidade GluR1 dos receptores

AMPA pode auxiliar a esclarecer mecanismos fisiológicos envolvidos na

modulação da plasticidade hipocampal após a privação e recuperação de sono.

11

2.3. Modulação Farmacológica De Receptores AMPA

Nas últimas décadas um grande esforço foi feito na busca por fármacos

que tenham a propriedade de melhorar a memória, tanto em situações

patológicas como normais. Muitos desses fármacos tem como mecanismo de

ação a facilitação da neurotransmissão glutamatérgica (O'Neill et al. 2004),

porém sem produzir efeitos indesejáveis decorrentes de estimulação intensa

e/ou sustentada, tais como convulsão e atividade paroxística (Yamashita et al.,

2004; Fan et al., 2011). Esta abordagem resultou no desenvolvimento de

potenciadores dos receptores AMPA, moduladores alostéricos positivos cujo

mecanismo de ação envolve o retardo da dessensibilização desses receptores

após sua ativação (Jin et al. 2005). Alguns exemplos incluem as pirrolidinonas

(piracetam, aniracetam) e, mais recentemente, as ampaquinas (CX614, CX717)

(O'Neill et al. 2004). A eficácia dessas drogas foi demonstrada com o uso de

modelos animais, onde os prejuízos de memória decorrentes de lesão cerebral,

envelhecimento, administração de fármacos amnésicos foram atenuados ou

mesmo prevenidos, seja com administração pré ou imediatamente após a

aprendizagem (Cumin et al., 1982; Gouliaev e Senning, 1994; Bartolini et al.,

1996).

Estudos recentes mostram que os potenciadores de receptores AMPA

podem contribuir para a prevenção de prejuízos cognitivos decorrentes da

perda de sono. Porrino et al. (2005) demonstraram que a ampaquina CX717

produz melhora de desempenho em primatas privados de sono e treinados

numa tarefa de memória dependente de hipocampo. Nesse trabalho, macacos-

12

rhesus foram treinados diariamente numa tarefa de reconhecimento espacial

com atraso (delayed match to sample task), na qual precisavam identificar,

numa tela de computador, uma imagem específica dentro de um conjunto, que

havia sido apresentada previamente à tentativa de identificação (1 a 30

segundos de intervalo). Em algumas sessões, os animais foram privados

totalmente de sono por 36 horas antes de começar a tarefa. Nesses casos, os

animais apresentaram prejuízos significativos de desempenho na tarefa, tais

como aumento da quantidade de erros e aumento na latência para resposta

(Porrino et al., 2005). Tais prejuízos foram atenuados quando os animais

receberam uma dose de CX717 (0,8 mg/kg) minutos antes do início da sessão

de teste. Um estudo similar, realizado em humanos privados de sono por 27

horas, mostrou que uma alta dose de CX717 (1000 mg) foi capaz de prevenir

os prejuízos de atenção induzidos pela privação de sono total por 24 horas

(Boyle et al., 2011).

Paralelamente, outra linha de evidências propõe que o bloqueio dos

receptores AMPA, em situações patológicas caracterizadas pelo aumento

excessivo de glutamato liberado, pode atenuar prejuízos de memória (Ruel et

al. 2002). Especificamente, antagonistas não competitivos seletivos de

receptores AMPA, como os 2,3-benzodiazepínicos (GYKI 52466, GYKI 53405) ,

foram avaliados em estudos de isquemia cerebral, nos quais se verificou

função neuroprotetora desses fármacos (Elger et al. 2005Block e Schwarz

1997, Gyertyan et al. 1999). Nesses dois últimos estudos, foi constatado que o

tratamento agudo com GYKI 52466, durante a intervenção isquêmica em

roedores, preveniu prejuízos de memória observados posteriormente, avaliados

13

na versão espacial do labirinto aquático de Morris (Block e Schwarz 1997) e na

tarefa de alternação espontânea (Gyertyan et al. 1999).

Consistente com mecanismos farmacológicos compensatórios entre

disponibilidade de ligante e receptor, a marcação cerebral de receptores AMPA

pode ser reduzida (downregulation) por meio de aumento excessivo de níveis

de glutamato (Montori et al., 2010) ou estimulação contínua desses receptores

por AMPA (Sinha et al., 2004). Por outro lado, o bloqueio crônico por meio de

antagonistas promove aumento da marcação dos receptores AMPA

(upregulation): Sinha et al. (1999) demonstraram que o tratamento crônico (6

dias) com o antagonista GYKI 52466 promove aumento no número de

receptores AMPA, tanto no córtex como no hipocampo de ratos. Tais

resultados sugerem um uso promissor como terapia em patologias associadas

a redução da atividade dos receptores AMPA.

Em suma, a pesquisa de fármacos que atuam sobre os receptores

AMPA sugere que tanto a administração de potenciadores quanto antagonistas

desses receptores possam atenuar os efeitos deletérios da PS em tarefas de

memória dependentes de hipocampo, seja por meio da modulação intrínseca

da função dos receptores, seja pela interferência sobre os níveis de receptores

nas estruturas cerebrais.

14

2.4. Receptores AMPA e o Ritmo Teta Hipocampal

As oscilações elétricas cerebrais foram descritas pela primeira vez por

Hans Berger (1929), ao descobrir sinais periódicos em registros de

eletroencefalograma (EEG) de humanos. Estas oscilações são produzidas

primariamente pela atividade síncrona de populações de neurônios, por meio

da soma resultante de potenciais pós-sinápticos inibitórios e excitatórios. Estes

últimos são gerados, em grande parte, por correntes iônicas dos receptores

AMPA, responsáveis pela despolarização rápida de terminais pós sinápticos

(Platt, 2007).

Os registros eletroencefalográficos podem ser convertidos do domínio do

tempo em que ocorrem ao domínio da frequência e, por meio de análise de

espectro de potência, é possível verificar a contribuição de cada componente

de frequência para o sinal obtido. Essa ferramenta é especialmente útil para

análise de sono, haja vista a ocorrência de faixas de frequências características

em diferentes estados do ciclo sono-vigília em roedores (Timo Iaria, 1970), tais

como o ritmo delta no sono de ondas lentas e o ritmo teta no sono paradoxal e

vigília.

O ritmo teta hipocampal é uma oscilação de grande amplitude, na faixa

de frequência de 4 a 12 Hz, observada na formação hipocampal de roedores

(Buzsaki, 2002). Esse ritmo pode ser verificado em outras espécies animais,

inclusive humanos (Bodizs et al., 2001), embora a compreensão de suas

características não esteja tão consolidada como em ratos (Lega et al., 2011). A

atividade de diferentes células hipocampais muda de acordo com a presença

15

do ritmo teta: a taxa de disparos de neurônios glutamatérgicos diminui, ao

passo que a maioria dos interneurônios GABAérgicos aumenta ou não altera

sua taxa de disparos (Buzsaki, 1983). Além disso, foi observado que a

atividade de neurônios glutamatérgicos e interneurônios pode estar em fase,

resultando em um padrão em que diferentes células disparam em sincronia

com outras durante fases específicas do ciclo (Csicsvari et al., 1999).

Classicamente, considera-se que o sítio da geração do marca passo do ritmo

teta é o núcleo septal medial da banda de Broca, ao passo que as camadas

stratum oriens de CA1 e a camada molecular do giro denteado compõem os

sítios geradores da corrente, embora não haja consenso conclusivo a respeito

(Buzsaki, 2002).

Vários autores buscam estabelecer uma relação entre comportamentos

e oscilações cerebrais. Devido a sua consistência, reproducibilidade e forte

relação com atividade exploratória, o ritmo teta hipocampal vem sendo utilizado

como modelo experimental de aprendizagem. Em ratos, verificou-se que a

potência do ritmo teta aumenta durante comportamentos preparatórios, como

movimentos voluntários, orientação espacial, exploração do ambiente, e

durante o sono paradoxal (Vanderwolf, 1969; Timo-Iaria, 1970). Por outro lado,

o ritmo teta está ausente quando o animal está imóvel, se alimentando ou

executando auto-limpeza (grooming), considerados como comportamentos

consumatórios (Vanderwolf, 1969).

O ritmo teta pode apresentar características diferentes de acordo com as

condições em que é registrado. Assim, dois tipos de ritmo teta foram descritos

com base na sensibilidade farmacológica ao antagonista colinérgico

muscarínico atropina (Kramis et al., 1975): o ritmo teta tipo 1, composto por

16

oscilações na faixa de 8 a 12 Hz, geralmente é observado durante atividade

motora em ratos conscientes, não é afetado pela atropina, mas pode ser

bloqueado pela ação de antagonistas de receptores NMDA (Buzsaki et al.,

2002); por sua vez, oscilações na faixa de 4 a 8 Hz, consideradas como

pertencentes ao ritmo teta tipo 2, são bloqueadas por antagonistas

muscarínicos, e podem ser melhor visualizadas em ratos anestesiados ou em

fatias hipocampais tratadas com carbacol. O ritmo teta tipo 2 tem sido

associado com a aprendizagem de tarefas de memória, ao passo que o ritmo

teta tipo 1 está mais relacionado a locomoção (Macrides et al., 1982; Berry e

Swain, 1989; Seidenbecher et al., 2003).

Além dos receptores muscarínicos e NMDA, os receptores AMPA

também representam um importante elemento na modulação do ritmo teta

hipocampal. A administração de antagonistas de receptores AMPA no núcleo

septal medial, proposto como o gerador de frequência do ritmo teta (Buzsaki,

2002), induz redução da amplitude e da frequência do ritmo teta tipo 2 em ratos

anestesiados (Puma e Bizot, 1999). Além disso, a aplicação de antagonistas

destes receptores diretamente na região hipocampal diminui a potência do

ritmo teta tipo 2 em ratos não anestesiados (Leung e Shen, 2004). Por outro

lado, a aplicação local de aniracetam no hipocampo de ratos preveniu a

redução do ritmo teta hipocampal induzido por um antagonista histaminérgico

(Masuoka et al., 2007). Nesse sentido, é plausível supor que alterações na

função dos receptores AMPA, sobretudo na região hipocampal, estejam

acompanhadas por modificações das oscilações teta.

O ritmo teta, e em especial o teta tipo 2, tem gerado grande interesse em

pesquisadores de memória, em função de muitos comportamentos associados

17

a este ritmo estarem envolvidos com processamento cognitivo. Por exemplo, foi

demonstrado que há aumento da intensidade de ritmo teta tipo 2 durante a

aprendizagem de tarefas de memória espacial (Yang et al., 2011) e

condicionamento de medo ao contexto e ao som (Pape et al., 2005). Ademais,

manipulações farmacológicas que bloqueiam ou facilitam o ritmo teta tipo 2

produzem piora ou melhora de desempenho em tarefas de memória hipocampo

dependentes, como a alternação espacial forçada (Givens e Olton, 1995) e a

versão espacial do labirinto aquático de Morris (Pan e McNaughton, 1997).

Consistente com a hipótese do envolvimento do ritmo teta tipo 2 na

formação de memórias, verificou-se que esta faixa de frequência está

associada com a plasticidade sináptica no hipocampo: a estímulação das vias

colaterais de Schaffer por meio de rajadas em pulsos de frequência de 5 Hz,

chamada estimulação de rajadas em teta (theta burst stimulation), promove

LTP hipocampal (Greenstein et al., 1988; Larson et al., 1986), resultando em

aumento da responsividade do neurônio pós sinápticos da região CA1. Por

outro lado, pulsos de rajadas realizadas em frequências mais altas, dentro da

faixa do teta tipo 1 (10 Hz), ou mais baixas, dentro da faixa do ritmo delta (2

Hz), não produzem o mesmo efeito de potenciação (Greenstein et al., 1988;

Larson et al., 1986).

Estudos de privação de sono em animais têm demonstrado efeitos

variados sobre o ritmo teta hipocampal observado durante a vigília. Vyazovskiy

e Tobler (2005) demonstraram que a potência do ritmo teta tipo 2 aumenta em

ratos privados totalmente de sono por 6 horas, ao passo que Mohammed et al.

(2011) encontraram uma diminuição dos ritmos teta tipo 1 e 2 após uma

privação de sono por 24 h, mas não por 72h. Utilizando o mesmo paradigma,

18

Corsi-Cabrera et al. (1994) encontraram um aumento da potência do ritmo teta

tipo 1, mas não do tipo 2, em ratos submetidos à privação de sono por 72

horas, ao qual atribuíram um aumento da excitabilidade locomotora do animal

privado de sono (Van Hulzen et al., 1984). Com relação à aprendizagem de

tarefas de memória, há apenas um estudo que investigou a combinação dos

efeitos da privação de sono sobre uma tarefa de memória e o ritmo teta

hipocampal (Yang et al, 2011). Neste trabalho, foi verificado que ratos privados

de sono paradoxal por sete dias e treinados, concomitantemente, numa tarefa

versão espacial do labirinto aquático de Morris, apresentam prejuízos de

desempenho a partir do terceiro dia (72 horas) de privação, juntamente com

prevenção de aumento da potência de ritmo teta tipo 2 induzida pela

aprendizagem da tarefa (Yang et al, 2011). Este conjunto de evidências sugere

a importância de avaliar os dois tipos de ritmo teta após a privação de sono,

sobretudo durante uma tarefa de memória, no intuito de verificar a relação

entre a atividade da formação hipocampal e o desempenho cognitivo de

animais privados de sono.

2.5. Justificativa

Atualmente, não é possível definir com clareza quais são os

mecanismos neurais relacionados aos prejuízos de memória induzidos pela

perda de sono, e quais representam uma reação compensatória a essa

exposição. Um possível candidato para estudo são os receptores

glutamatérgicos ionotrópicos do tipo AMPA, envolvidos com a formação de

19

memórias e plasticidade hipocampal. Dados da literatura demonstram

variabilidade de efeitos induzidos pela privação de sono sobre estes receptores

tanto em regiões corticais como hipocampais (Vyazovskiy et al., 2008,

Ravassard et al., 2009), ao passo que outro corpo de evidências indica

aumento de transmissão glutamatérgica generalizada em ratos privados de

sono (Bettendorff et al, 1996; Mohammed et al., 2011). Para melhor elucidar

esta questão, a avaliação autorradiográfica pode oferecer uma visão ampla da

distribuição, localização e quantificação de sítios do receptor AMPA em regiões

cerebrais envolvidas com processos mnemônicos em animais privados de

sono, ao passo que a análise de expressão gênica da subunidade GluR1 pode

incrementar a compreensão de mecanismos relacionados à alteração desses

receptores.

Em paralelo, estudos farmacológicos mostram que potenciadores de

receptores AMPA são capazes de atenuar prejuízos cognitivos em diversas

condições (Gouliaev & Senning, 1994), inclusive privação de sono total em

primatas humanos (Boyle et al., 2011) e não-humanos (Porrino et al. 2005).

Outras evidências demonstram que o tratamento crônico com o antagonista

seletivo GYKI 52466 induz aumento de receptores AMPA no hipocampo (Sinha

et al. 1999), e previne prejuízos de memória espacial, quando administrado de

forma aguda, num modelo animal de isquemia hipocampal (Block e Schwarz,

1997; Gyertyan et al. 1999), uma condição que está associada tanto a níveis

aumentados de glutamato como a redução de receptores AMPA hipocampais

(Montori et al., 2010). Portanto, a modulação farmacológica desses receptores

por potenciadores e/ou antagonistas poderia constituir uma estratégia eficaz

20

para a redução do prejuízo de desempenho de esquiva inibitória em ratos

privados de sono em nosso laboratório.

A alteração da função de receptores AMPA após a perda de sono pode

exercer influência sobre a atividade do hipocampo, e especialmente sobre o

ritmo teta hipocampal. O bloqueio de receptores AMPA por antagonistas reduz

a potência do ritmo teta tipo 2 (Leung e Shen, 2004), que está associado com a

aprendizagem de tarefas de memória (Givens e Olton, 1995). Por outro lado,

estudos de privação de sono apresentam resultados variados sobre o ritmo teta

hipocampal (Corsi-Cabrera et al., 1994; Vyazovskiy e Tobler, 2005;

Mohammed et al., 2011), e há poucos dados relativos à correlação dos efeitos

da perda de sono sobre uma tarefa de memória e o ritmo teta tipo 2 (Yang et al,

2011). Nesse sentido, ao considerar o envolvimento dos receptores AMPA

nesse fenômeno (Puma e Bizot, 1999; Leung e Shen, 2004), apresentamos a

hipótese de que o ritmo teta hipocampal tipo 2 está reduzido em ratos privados

de sono durante a aprendizagem de uma tarefa hipocampo dependente.

3. OBJETIVOS

O principal objetivo da presente tese é avaliar o papel dos receptores AMPA

na modulação dos prejuízos de memória dependente de hipocampo após a

privação de sono, bem como investigar possíveis efeitos decorrentes da

alteração da atividade dos receptores AMPA na formação hipocampal. Para

tanto, esta tese está dividida em duas etapas, com os seguintes objetivos

específicos:

21

PRIMEIRA ETAPA

Analisar a marcação de receptores AMPA e a expressão da subunidade

GluR1 no cérebro de ratos privados e recuperados de sono;

Verificar os efeitos da administração do potenciador aniracetam e do

antagonista GYKI 52466 sobre os prejuízos de memória decorrentes da

privação de sono.

SEGUNDA ETAPA

Caracterizar a atividade do ritmo teta hipocampal em ratos privados de

sono durante o desempenho de uma tarefa hipocampo dependente.

22

4. PRIMEIRA ETAPA: AVALIAÇÃO NEUROQUÍMICA E

FARMACOLÓGICA DOS RECEPTORES AMPA NA

FORMAÇÃO DE MEMÓRIAS EM RATOS

PRIVADOS DE SONO

4.1. Experimento 1: Efeitos da Privação e Recuperação de Sono na

Marcação De [3H]AMPA e Hibridização in situ de Glur1

O experimento teve como objetivo avaliar a distribuição, localização e

quantificação de sítios do receptor AMPA em regiões cerebrais envolvidas com

processos mnemônicos em animais privados de sono, bem como realizar a

análise de expressão gênica da subunidade GluR1 em regiões cuja marcação

de receptores AMPA está modificada

4.1.1. Experimento 1-1: Autorradiografia de Receptores AMPA após

Privação e Recuperação de Sono

Considerando os efeitos da privação de sono sobre a transmissão

glutamatérgica (Bettendorff et al., 1996; Mohammed et al., 2011), bem como a

23

modulação atividade-dependente de receptores AMPA (Sinha et al., 1999,

2004), é plausível supor que a perda de sono modifique a distribuição de

receptores AMPA. Dessa forma, o objetivo específico desse experimento foi

avaliar se há alterações sobre a marcação de [3H]AMPA em ratos submetidos à

privação e recuperação de sono, através da técnica de autorradiografia de

receptores, com ênfase em áreas cerebrais envolvidas na modulação da

memória.

Sujeitos

Foram utilizados ratos Wistar, machos, com três meses de idade,

provenientes do biotério do Departamento de Psicobiologia da Universidade

Federal de São Paulo. Os animais foram mantidos em condições controladas

de temperatura (23 2 ºC) e ciclo claro/escuro de 12:12 h, com início do

período claro às 7:00h. Água e comida foram fornecidas ad libitum. Cada

experimento foi realizado com diferentes conjuntos de animais.

Procedimento de Privação de Sono

Uma das primeiras técnicas amplamente utilizadas para indução de PS é

a técnica da plataforma invertida, proposta por Jouvet et al. (1964), utilizando

gatos, e adaptada para ratos por Cohen e Dement (1965). A técnica é

estruturada a partir de uma plataforma estreita circundada por água. Devido à

perda gradual da tonicidade muscular ao longo do sono até sua fase paradoxal,

em que ocorre a atonia muscular, o animal perde o equilíbrio postural e cai da

plataforma, acordando na água (Jouvet et al., 1964). Com a utilização desse

procedimento, além da perda completa do sono paradoxal, há uma perda

24

parcial do sono de ondas lentas (Grahnstedt e Ursin, 1985, Machado et al.,

2004).

A técnica de plataforma invertida tem sofrido críticas devido à presença

de variáveis intervenientes, como a imobilização do animal, embebição do pêlo

na água, isolamento social e outros fatores que podem ocultar os efeitos

específicos da perda de sono (Pearlman, 1979). Van Hulzen e Coenen (1981),

propuseram a técnica da plataforma múltipla como modelo de PS, na qual se

evita o efeito gerado pela imobilização. Nesse método utiliza-se um tanque de

água contendo várias plataformas para um mesmo animal experimental. Nunes

e Tufik (1994) propuseram um modelo similar ao da plataforma múltipla, mas

com um grupo de ratos ao invés de um único – o método da plataforma múltipla

modificada (MPMM, Figura 2). Com essa alteração, pretendia-se evitar o

estresse gerado pelo isolamento social e imobilização.

No entanto, Suchecki et al. (1998) verificaram que o MPMM induz

estresse maior do que o observado na plataforma invertida, através da análise

da ativação do eixo hipotalâmico-hipófise-adrenal (HPA). Em seqüência aos

seus estudos, Suchecki e Tufik (2000) avaliaram que um fator associado ao

estresse no MPMM se deve à instabilidade social dos ratos privados,

provenientes de várias gaiolas, e que essa instabilidade pode ser atenuada se

utilizado um grupo de ratos provenientes da mesma gaiola de moradia. Dados

posteriores demonstraram que o MPMM priva parcialmente (35%) a fase de

sono de ondas lentas, além de abolir por completo o sono paradoxal (Machado

et al., 2004).

Vinte e quatro animais foram separados em três grupos: privação de

sono (PS; n=8), recuperação de sono (RS; n=8) e controle-gaiola (CG; n=8). Os

25

animais dos grupos PS e RS foram habituados ao MPMM, por um período de

uma hora por dia, durante três dias. Após a habituação, foi iniciada a privação

de sono por 96 horas. Os animais tiveram acesso à água e ração ad libitum

durante todo período de privação de sono. Ao fim do período, os animais do

grupo RS foram devolvidos às suas gaiolas por um período de 24 horas, a fim

de recuperar-se da privação. Os animais do grupo CG permaneceram em suas

gaiolas, sob as mesmas condições ambientais dos outros grupos.

Figura 2: Privação de sono por meio do método da plataforma múltipla modificada.

Processamento Histológico

Ao fim de 96 horas de privação de sono para o grupo PS e 24 horas de

recuperação para o grupo RS, os animais dos três grupos foram sacrificados

por decapitação (Figura 3). Os cérebros foram rapidamente removidos,

congelados em gelo seco e mantidos a -80ºC. Para o processamento

histológico, os cérebros foram seccionados em criostato (-18ºC) da região do

26

bulbo olfatório até o bulbo caudal, em secções de 20 m de espessura, com

intervalos de 400 m. As secções cerebrais foram coletadas em lâminas

revestidas com gelatina, e guardadas em freezer (-80ºC) até o dia da marcação

autorradiográfica.

Figura 3: Desenho esquemático do experimento 1.

Marcação de [3H]AMPA

As lâminas contendo as secções cerebrais foram pré incubadas por 30

minutos em solução tampão Tris-acetato 50 mM contendo KSCN 100 mM (pH

7,2; 4ºC). Em seguida, as lâminas foram incubadas durante 45 minutos em

solução tampão contendo [3H]AMPA 10 nM (55,5 Ci/mmol, Perkin-Elmer, EUA).

A marcação de sítios inespecíficos foi obtida adicionando-se 10 uM de

quisqualato às lâminas preparadas para esse fim. Após o período de

incubação, as lâminas foram lavadas em tampão à 0-4ºC, seguido por um

rápido banho em solução de 100 ml de acetona contendo 2,5 ml de

glutaraldeído. Em seguida, as secções foram secas e expostas a filme sensível

ao trício (Kodak BioMax MR-1, Amersham Pharmacia Biotech) por 6 semanas

na presença de padrão calibrado. Para cada região cerebral, foi calculada a

média dos valores de densidade óptica delimitada dentro de cada seção. Em

27

seguida, a média dos valores dessa mesma região foi quantificada para todas

as secções dentro de cada encéfalo, e convertida em Ci/g de tecido por meio

do padrão calibrado. O valor final é a média da região cerebral de todos os

animais dentro de cada grupo. As regiões anatômicas foram definidas de

acordo com o atlas de Paxinos & Watson (1998).

Análise Estatística

Os dados para a marcação dos sítios dos receptores AMPA foram

analisados através de análise de variância de uma via (ANOVA), utilizando

grupo como fator para cada estrutura cerebral, com nível de significância de p <

0,05. Análises post hoc foram feitas através do Teste de Duncan, com nível de

significância de p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o

programa STATISTICA (StatSoft Inc., EUA).

4.1.2. Experimento 1-2: Hibridização in situ da Subunidade GluR1

após Privação e Recuperação de Sono

Estudos mostram que neuropatologias associadas com prejuízos de

memória e redução de receptores AMPA, como mal de Alzheimer (Pellegrini-

Giampietro et al. 1994) e isquemia cerebral (Montori et al., 2010), estão

acompanhadas por uma redução da transcrição da subunidade GluR1 na

formação hipocampal. Por outro lado, dados de Ravassard et al. (2009)

mostram que não há modificação de níveis de RNA mensageiro dessa

subunidade em ratos privados de sono por 72 h. O experimento teve como

28

objetivo especifico verificar os efeitos da privação e recuperação de sono sobre

a expressão da subunidade GluR1 em subáreas hipocampais onde houve

alteração de marcação de [3H]AMPA, de acordo com os dados obtidos no

Experimento 1-1.

Privação de Sono e Processamento Histológico

Um novo conjunto de ratos, subdivididos em três grupos (CG, PS, RS,

todos n=8), foi submetido ao procedimento de privação de sono conforme

descrito para o experimento 1-1. Em seguida, foram sacrificados por

decapitação e os cérebros, rapidamente removidos com instrumentos

cirúrgicos livres de RNases, congelados em gelo seco e mantidos a -80ºC.

Para o processamento histológico, os cérebros foram seccionados em criostato

(-18ºC), sendo selecionado o tecido contendo a formação hipocampal, em

seções de 20 m de espessura, com intervalos de 50 m. As secções

cerebrais foram coletadas em lâminas estéreis com aderência eletrostática

(Microscopic Plus, Fisher), e guardadas em freezer (-80ºC) até o momento do

início de ensaios de hibridização in situ.

Hibridização in situ

As lâminas foram gradualmente aquecidas à temperatura ambiente,

fixadas em formaldeído 4% (pH 7,4) e lavadas em solução PBS 10 mM (pH

7,4). Em seguida, foram tratadas por 30 minutos com proteinase K (0,5 ug/ml;

Life Technologies, EUA), EDTA (0.05 M, pH 8,0) e Tris–HCl (0.1 M, pH 8,0).

Depois, as lâminas foram acetiladas com trietanolamina-HCl (Avocado

Research, Reino Unido), lavadas em 2xSSC e desidratadas em uma série de

29

soluções de etanol. A hibridização foi realizada utilizando uma ribossonda

marcada com 35S-UTP complementar à sequência de interesse, produzida por

meio de transcrição in vitro (Promega, EUA). Durante a transcrição, uma

amostra de DNA complementar (DNAc) foi amplificada por meio de cadeia de

reação de polimerase (PCR) utilizando primers complementares à sequência

da subunidade GluR1 (Genbank # NM_031608, bases 108–405). Os primers

estão incorporados a sequências promotoras tanto da RNA polimerase SP6

(atttaggtgaacactatagaa) na extremidade 5’ do primer sense, como da RNA

polimerase T7 (taatacgactcactataggg) na extremidade 5’ do primer antisense.

Esta incorporação possibilita a produção de ribossondas alvo e controle de

RNA em fitas simples a partir do produto amplificado de DNAc. As ribossondas

foram diluídas (106 cpm/ml) em solução de hibridização, contendo formamida

50%, thiosulfato de sódio 1% e diothiothreitol (DTT) 5 M 2%. A solução de

hibridização foi aplicada nas secções de tecido, e as lâminas foram incubadas

a 57ºC durante 16 horas. Para o procedimento de pós hibridização, as secções

foram imersas em solução contendo RNAse A (20 μg/ml; USB, EUA) por 30

minutos e em seguida lavadas em tampão de RNase (NaCl 5 M 10%, Tris 1 M

4%, EDTA 0,2%, pH 8) por 30 minutos em temperatura ambiente. As lâminas

foram então lavadas em soluções contendo concentrações decrescentes de

SSC, desidratadas e expostas a filme sensível a emissão radioativa (Kodak

BMR-2, EUA) por quatro dias. A quantificação da hibridização foi obtida

mensurando a densidade ótica relativa das áreas cerebrais analisadas,

subtraindo-se o valor verificado no fórnix (região adjacente com menor

expressão de transcrição), usando um sistema de análise imagem (M2 MCID

system, Imaging Research, Canadá).

30


De forma similar ao Experimento 1-1, os dados para a hibridização in

situ da subunidade GluR1 foram analisados através de análise de variância de

uma via (ANOVA), utilizando grupo como fator para cada estrutura da formação

hipocampal, com nível de significância de p < 0,05. As análises post hoc foram

feitas através do Teste de Duncan, com nível de significância de p < 0,05.

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa STATISTICA

(StatSoft Inc., EUA).

4.2. Experimento 2 – Efeitos da Administração de Potenciador e

Antagonista de Receptores AMPA no Desempenho de Esquiva

Inibitória de Ratos Privados de Sono

O objetivo deste experimento foi verificar os efeitos da administração do

potenciador aniracetam e do antagonista GYKI 52466 sobre os prejuízos de

memória decorrentes da privação de sono. Cada fármaco e forma de

tratamento (agudo, crônico) foi avaliado em experimentos separados, que

compartilham o mesmo procedimento metodológico descrito a seguir.

Sujeitos

Foram utilizados ratos Wistar machos, com três meses de idade,

provenientes do biotério do departamento de Psicobiologia (UNIFESP). Os

animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22-24 °C) e

31

ciclo claro escuro de 12/12 hr (período claro iniciado às 7:00h), com livre

acesso ao alimento e água.


Os animais foram submetidos ao procedimento de privação de sono por

96 h em plataformas múltiplas modificada. Os animais do grupo PS foram

colocados em grupo em um tanque de água contendo nove plataformas

estreitas (6,2 cm de diâmetro) espaçadas 7-8 cm entre si. Água e ração foram

disponibilizadas ad libitum, e o tanque foi limpo diariamente. Os animais

controles (CG) foram mantidos na mesma sala onde ocorreu a privação de

sono.

Tarefa de Esquiva Inibitória

A tarefa de esquiva inibitória foi dividida em três sessões consecutivas:

treino, teste 1 e teste 2. Durante a sessão de treino, cada animal foi colocado

no compartimento claro de um aparato de esquiva inibitória (AVS Projetos

Especiais, Figura 4) e após 10 segundos, uma porta deslizante foi aberta.

Assim que o animal entrou no compartimento escuro, a porta deslizante foi

fechada e o animal recebeu um choque nas patas (0,8 mA/1 s). O animal foi

mantido no compartimento escuro por mais 15 segundos, e então retirado do

aparato e colocado em sua gaiola-moradia. Duas horas após a sessão de

treino, a primeira sessão de teste (teste 1) foi realizada, sob as mesmas

condições da sessão de treino, com exceção do choque, que foi desligado.

Uma segunda sessão de teste (teste 2) foi realizada 24 horas depois da sessão

32

de treino, seguindo o mesmo procedimento do teste 1. A latência máxima para

que o animal entrasse no compartimento escuro foi de 300 segundos.

Figura 4: Aparato de esquiva inibitória.

Fármacos

Foram utilizados dois ligantes de receptores AMPA:

1. o modulador alostérico positivo aniracetam (1-(4-metoxibenzoil)-2-

pirrolidinona, Sigma). O potenciador aniracetam foi suspenso em

uma solução de carboxi-metil-celulose 0,25%, contendo algumas

gotas de Tween 80.

2. o antagonista não competitivo GYKI 52466 (1-(4-aminofenil)-4-metil-

7,8-metilenedioxi-5H-2,3-benzodiazepina, Sigma). O fármaco foi

dissolvido em gotas de 0,1 M HCl e diluído em água destilada.

33

4.2.1. Experimento 2-1: Efeitos da Administração Aguda de

Aniracetam em Ratos Privados de Sono

O experimento foi realizado no intuito de avaliar se o tratamento agudo com

o potenciador aniracetam poderia prevenir prejuízos de desempenho na tarefa

de esquiva inibitória em animais privados de sono.

Tratamento farmacológico

Ao final do procedimento de privação de sono, o potenciador aniracetam

foi aplicado por via oral (volume de 2 ml/kg) nas doses de 25, 50, e 100 mg/kg.

Animais controles para tratamento receberam veículo (grupos n = 8-10). Dessa

forma, foram obtidos oito grupos: CG-vc, CG-ani25, CG-ani50, CG-ani100, PS-

vc, PS-ani25, PS-ani50, e PS-ani100. A administração foi realizada ao final do

período de privação de sono, cerca de 1 hora antes do início da tarefa de

esquiva inibitória (Figura 5).

Figura 5: Desenho esquemático do experimento 2-1. Ao final do procedimento de privação de

sono, animais recebem administração aguda de aniracetam ou veículo (via oral) e são

treinados na tarefa de esquiva inibitória (EI).

34

4.2.2. Experimento 2-2: Efeitos da Administração Aguda de GYKI

52466 em Ratos Privados de Sono

O objetivo do presente experimento foi verificar se o tratamento agudo de

GYKI 52466 em ratos submetidos à privação de sono é capaz de prevenir

prejuízos de desempenho na tarefa de esquiva inibitória, com base numa

possível modulação de receptores AMPA resultando na prevenção de prejuízos

de memória associados a aumento excessivo de glutamato, tal como verificado

em estudos de isquemia cerebral (Block e Schwarz, 1997; Gyertyan et al.

1999).

Tratamento Farmacológico

O antagonista GYKI 62466 foi aplicado por via intraperitoneal (i.p.)

(volume de 2 ml/kg) nas doses de 5 e 10 mg/kg ao final do procedimento de

PS. Animais controles para tratamento receberam veículo. Dessa forma, foram

obtidos seis grupos: CG-vc, CG-gyki5, CG-gyki10, PS-vc, PS-gyki5, e PS-

gyk10. A administração foi realizada ao final do período de PS, cerca de 1 hora

antes do início da tarefa de esquiva inibitória. (Figura 6).

35

Figura 6: Desenho esquemático do experimento 2-2. Ao final do procedimento de privação de

sono, animais receberam administração aguda de GYKI 52466 ou veículo (i.p.) e foram

treinados na tarefa de esquiva inibitória (EI).

4.2.3. Experimento 2-3: Efeitos da Administração Crônica de GYKI


O objetivo do presente experimento foi avaliar se o tratamento crônico com

GYKI 52466 em ratos privados de sono seria capaz de prevenir a

subsensibilidade de receptores AMPA hipocampais pela PS e,

consequentemente, impedir o prejuízo de desempenho na tarefa de esquiva

inibitória, de acordo com o estudo de Sinha et al. (1999).

Tratamento Farmacológico

O antagonista GYKI 62466 foi aplicado por via i.p. (volume de 2 ml/kg)

nas doses de 5 e 10 mg/kg. Animais controles para tratamento receberam

veículo (n = 8-14/grupo). As administrações ocorreram durante o período de

privação de sono, duas vezes ao dia (as 11:00 h e as 17:00 h,

respectivamente) ao longo de quatro dias, sendo descontinuadas cerca de 17 h

36

antes do início da tarefa de esquiva inibitória, a fim de evitar efeitos agudos do

fármaco (Figura 7). Dessa forma, foram obtidos seis grupos: CG-vc, CG-gyki5,

CG-gyki10, PS-vc, PS-gyki5, e PS-gyk10.

Figura 7: Desenho esquemático do experimento 2-3. Animais controles e privados de sono

foram tratados sistemicamente com GYKI 52466 ou veículo (duas injeções i.p. por dia) durante

o período de privação de sono, antes de serem treinados na tarefa de esquiva inibitória (EI).


Para cada experimento, foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de

duas via com medidas repetidas, utilizando grupos (CG e PS sob diferentes

tratamentos) e latência de passagem nas sessões (treino, teste 1, teste 2)

como fatores. Análises post hoc foram feitas através do Teste de Duncan, com

nível de significância de p < 0,05.

37

4.3. RESULTADOS

4.3.1. Experimento 1-1: Autorradiografia de Receptores AMPA após

Privação e Recuperação de Sono

As características da marcação de [3H]AMPA dos grupos controle gaiola

(CG), Privação de Sono (PS) e Recuperação de Sono (RS) estão contidas na

tabela 1. As análises de variância (ANOVA) de uma via das estruturas

estudadas indicam não haver diferença significativa da marcação entre os

grupos, com exceção das regiões CA1, CA3 e giro denteado da formação

hipocampal. As análises posteriores de pelo teste de Duncan revelaram uma

marcação reduzida nos animais privados de sono em comparação aos

controles (p < 0,05).

38

Tabela 1: Marcação de [3H]AMPA após 96 horas de privação de sono e recuperação

de 24 horas.

Grupo

Região CG PS RS P

(n=8) (n=8) (n=8)

Córtex

córtex frontal de associação 0,663 ± 0,04 0,569 ± 0,03 0,631 ± 0,03 0,243

córtex entorrinal 0,650 ± 0,03 0,606 ± 0,03 0,622 ± 0,02 0,744

Amigdala

núcleo basolateral 0,607 ± 0,05 0,571 ± 0,04 0,615 ± 0,02 0,683

núcleo central 0,274 ± 0,03 0,263 ± 0,03 0,275 ± 0,02 0,910

núcleo medial 0,411 ± 0,04 0,339 ± 0,03 0,370 ± 0,01 0,286

Formação hipocampal

CA1 1,115 ± 0,03 0,998 ± 0,03 * 1,076 ± 0,03 0,036

CA3 0,687 ± 0,04 0,538 ± 0,04 * 0,596 ± 0,02 0,018

giro denteado, porção dorsal 1,061 ± 0,05 0,895 ± 0,04 * 0,971 ± 0,03 0,039

giro denteado, porção ventral 1,114 ± 0,06 0,955 ± 0,03 * 1,055 ± 0,03 0,037

Valores em uCi/g (média ± erro padrão)

* p < 0,05 comparado ao grupo CG (teste de Duncan)

Figura 8: Imagens computadorizadas da marcação de [3H]AMPA em animais controle (CG),

privado de sono (PS) e recuperado de sono (RS).

CG PS RS

39

4.3.2. Experimento 1-2: Hibridização in Situ da Subunidade GluR1

após Privação e Recuperação de Sono

As características da hibridização in situ da subunidade GluR1 dos

grupos Controle (CG), Privação de Sono (PS) e Recuperação de Sono (RS)

estão contidas na tabela 2. As análises de variância (ANOVA) de uma via das

estruturas hipocampais estudadas indicam não haver diferença significativa da

transcrição da subunidade de GluR1 entre os grupos do experimento.

Tabela 2: Hibridização in Situ da Subunidade GluR1 após 96 horas de privação de

sono e recuperação de 24 horas.

Grupo

Região CG PS RS P

(n=8) (n=8) (n=8)

CA1 1,061 ± 0,25 0,929 ± 0,15 0,947 ± 0,27 0,937

CA3 0,885 ± 0,22 0,678 ± 0,16 0,719 ± 0,23 0,889

Giro denteado, porção dorsal 1,348 ± 0,27 1,355 ± 0,14 1,128 ± 0,25 0,677

Giro denteado, porção ventral 1,566 ± 0,22 1,288 ± 0,15 1,203 ± 0,24 0,641

Valores em densidade óptica relativa (média ± erro padrão)

40

Figura 9: Imagem computadorizada da hibridização in situ da subunidade GluR1 na formação

hipocampal de um animal controle.

4.3.3. Experimento 2-1: Efeitos da Administração Aguda de

Aniracetam em Ratos Privados de Sono

Os dados estão apresentados na Figura 10. Foram encontrada efeitos dos

fatores grupo (F(7, 70)=10.161, p < 0,05), sessão (F(2, 140)=187.19, p < 0,05),

e interação entre os fatores (F(14, 140)=6.1530, p < 0,05). A análise a

posteriori da interação dos fatores revelou que os grupos se comportaram de

forma similar na sessão de treino (p > 0,05), ao passo que nas sessões de

teste 1 e 2 os animais controles apresentaram latências de passagem maiores

do que os animais privados de sono (p < 0,05), com exceção daqueles

privados de sono tratados com 100 mg/kg de aniracetam (p > 0,24), que por

sua vez apresentaram latência de passagem maior do que dos animais

privados de sono tratados com veículo (p < 0,05).

41

Figura 10: Latência de passagem de ratos privados de sono tratados com aniracetam na tarefa

de esquiva inibitória (média ± erro padrão em segundos). CG = controle gaiola, PS = privação

de sono, vc = veículo, ani25 = 25 mg/kg aniracetam, ani50 = 50 mg/kg aniracetam, ani50 = 50

mg/kg, ani100 = 100 mg/kg aniracetam, * p < 0,05 vs. animais controles sob o mesmo

tratamento, na mesma sessão (teste de Duncan), # p < 0,05 vs. animais privados de sono

tratados com veículo, na mesma sessão (teste de Duncan).

0

50

100

150

200

250

300

350

Treino Teste 1 Teste 2

Latê

nci

a (s

egu

nd

os)

Sessão

CG vc (10)

CG ani25 (10)

CG ani50 (10)

CG ani100 (8)

PS vc (10)

PS ani25 (10)

PS ani50 (10)

PS ani100 (10)

* *

# #

42

4.3.4. Experimento 2-2: Efeitos da Administração Aguda de GYKI


Os dados estão apresentados na Figura 11. Foram encontrados efeitos

dos fatores grupo (F(5, 46)=17.046, p < 0,05), sessão (F(2, 92)=160.63, p <

0,05), e interação entre os fatores (F(10, 92)=8.3627, p < 0,05). A análise a

posteriori da interação dos fatores revelou que a latência de passagem dos

animais privados de sono foi menor do que a latência dos animais controles

(teste de Duncan, p < 0,05), independente do tratamento aplicado.

Figura 11: Latência de passagem de ratos privados tratados agudamente com GYKI 52466 na

tarefa de esquiva inibitória (média ± erro padrão em segundos). CG = controle gaiola, PS =

privação de sono, vc = veículo, gk5 = 5 mg/kg GYKI 52466, gk10 = 10 mg/kg GYKI 52466. * p <

0,05 vs. animais controles sob o mesmo tratamento, na mesma sessão (teste de Duncan).

0

50

100

150

200

250

300

350


Latê

nci

a (s

egu

nd

os)

Sessão

CG vc (8)

CG gyki 5 (8)

CG gyki10 (8)

PS vc (10)

PS gyki5 (8)

PS gyki10 (10)

* *

43

4.3.5. Experimento 2-3: Efeitos da Administração Crônica de GYKI


Os dados estão apresentados na Figura 12. Foram encontrados efeitos

dos fatores grupo (F(5, 54)=11,676, p < 0,01) e sessão (F(2, 108)=114,36, p <

0,01), bem como interação entre os fatores (F(10, 108)=6,4066, p < 0,01). A

análise a posteriori da interação dos fatores revelou que a latência de

passagem dos animais privados foi menor do que a latência dos animais

controles (teste de Duncan, p < 0,05), independente do tratamento aplicado.

Figura 12: Latência de passagem de ratos privados tratados cronicamente com GYKI 52466 na

tarefa de esquiva inibitória (média ± erro padrão em segundos). CG = controle gaiola, PS =

0

50

100

150

200

250

300

350


Latê

nci

a (s

egu

nd

os)

Sessão

CG vc (14)

CG gk5 (8)

CG gk10 (8)

PS vc (14)

PS gk5 (8)

PS gk10 (8)

* *

44

privação de sono, vc = veículo, gk5 = 5 mg/kg GYKI 52466, gk10 = 10 mg/kg GYKI 52466. * p <

0,05 vs. animais controles sob o mesmo tratamento, na mesma sessão (teste de Duncan).

4.4. DISCUSSÃO PARCIAL

Os dados de marcação autorradiográfica dos receptores AMPA

(Experimento 1-1) revelaram que houve uma redução seletiva em regiões da

formação hipocampal (giro denteado, CA1 e CA3, Figura 8) de ratos privados

de sono por 96 horas. As demais áreas cerebrais analisadas não mostraram

qualquer alteração significativa de marcação, apesar de estarem fortemente

associadas com a formação de memórias emocionais aversivas, tais como o

córtex entorrinal e a amígdala basolateral (McGaugh et al., 1990; Ueki et al.,

1994). Não foram encontradas diferenças na marcação de receptores AMPA

hipocampais entre os animais controles e os animais do grupo RS,

demonstrando uma normalização dos efeitos da privação de sono sobre esses

receptores mediante a oportunidade de dormir 24 horas após o procedimento

comportamental.

Com relação à hibridização in situ da subunidade GluR1 (Experimento 1-

2), não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos

experimentais em nenhuma região hipocampal. Esses achados encontram

consonância com o trabalho de Ravassard et al. (2009), no qual a expressão

da proteína GluR1 é reduzida no hipocampo de ratos privados de sono por 72

horas, ao passo que a expressão dos transcritos da subunidade GluR1 não

45

encontra-se alterada nessa condição. É plausível que, ao invés de

modificações na transcrição das subunidades que os compõem, a diminuição

da marcação de receptores AMPA seja decorrente de mecanismos pós

translacionais, tal como a internalização de receptores na membrana dos

terminais pós sinápticos, como verificado para as subunidades que compõe o

receptor NMDA em ratos privados de sono (McDermott et al., 2006). Nesse

sentido, apesar de empregar protocolos de privação de sono distintos (privação

de sono total por 12 horas e privação de sono paradoxal por 72 horas), os

trabalhos de Hagewoud et al. (2009) e Ravassard et al. (2009) coincidem

quanto aos efeitos da perda de sono induzindo redução da fosforilação do sítio

serina 845 da subunidade GluR1, que está associada à incorporação de

receptores AMPA na membrana (Esteban et al., 2003).

A redução e a normalização da marcação de receptores AMPA

hipocampais após a privação e recuperação de sono, respectivamente, abrem

interessantes vias de investigação quanto aos mecanismos subjacentes aos

efeitos deletérios da privação de sono no desempenho de tarefas de memória.

Como verificado em estudos anteriores, a recuperação de sono atenua os

prejuízos decorrentes da privação de sono em tarefas dependentes da

formação hipocampal. Dessa forma, McDermott et al. (2003) demonstraram

que ratos que puderam se recuperar depois de serem privados de sono por 72

horas não apresentam prejuízos de desempenho no condicionamento de medo

ao contexto. Resultados similares foram obtidos em nosso laboratório: ratos

privados de sono por 96 horas que puderam recuperar-se em suas gaiolas

durante 24 horas apresentam uma melhora dos efeitos deletérios da privação

de sono sobre a tarefa de esquiva inibitória (Dubiela et al., 2005, 2010).

46

Tomados em conjunto, esses dados sugerem que os receptores AMPA

hipocampais, participantes relevantes na formação de memórias aversivas

contextuais, parecem estar envolvidos tanto nos prejuízos mnésicos da

privação de sono como na reversão desses efeitos com sua recuperação.

Nossos dados farmacológicos demonstraram que os prejuízos de

desempenho na tarefa de esquiva inibitória, induzidos pela privação de sono,

são consistentes tanto na memória de curto prazo (avaliada 2 horas depois do

treino), como na memória de longo prazo (avaliada 24 horas depois do treino),

corroborando estudos anteriores (Dubiela et al. 2005, 2010). Além disso,

verificamos que o tratamento agudo com o potenciador aniracetam, na dose de

100 mg/kg, é capaz de prevenir tais prejuízos, em ambos os testes

consecutivos da tarefa (Experimento 2-1). Esses resultados encontram

consonância com aqueles de Porrino et al. (2005) e Boyle et al. (2011), que

observaram melhora dos prejuízos cognitivos induzidos pela privação de sono

em humanos e macacos-rhesus por meio de tratamento com o potenciador

CX717. De forma similar aos dados presentes em nosso estudo, o estudo de

Boyle e colaboradores (2011) avaliaram que a prevenção só foi obtida com a

aplicação de uma dose alta do fármaco.

A evidência de redução da função de receptores AMPA após a privação

de sono, obtida em nosso laboratório e em outros (Experimento 1-1, Ravassard

et al., 2009, Hagewoud et al., 2009), sugere uma forte relação com a ação do

aniracetam em ratos privados de sono. Apesar de doses baixas e

intermediárias do fármaco se mostrarem suficientes para promover melhora em

diversos modelos de prejuízo de memória (Cumin et al., 1982; Gouliaev e

Senning, 1994), as doses de 25 e 50 mg/kg não foram eficazes em prevenir os

47

prejuízos induzidos pela privação de sono em nosso experimento. Essa

ausência de melhora pode ser decorrente da baixa disponibilidade de

receptores AMPA após 96 horas de privação de sono, de forma similar à ação

de antagonistas bloqueando os efeitos antiamnésicos de potenciadores desses

receptores (Lu & Wehner, 1997). Por sua vez, a dose mais alta de aniracetam

(100 mg/kg) parece atuar no sentido de promover ativação suficiente sobre os

receptores remanescentes, sendo assim, capaz de anular os prejuízos de

memória induzidos pela privação de sono.

Com base em estudos que mostraram efeitos protetores e

antiamnésicos utilizando antagonistas de receptores AMPA num modelo de

isquemia cerebral (Block e Schwarz, 1997; Gyertyan et al., 1999), buscamos

verificar se um tratamento similar seria capaz de prevenir os prejuízos de

desempenho de esquiva inibitória induzida por PS. A nossa hipótese não foi

confirmada, haja vista que tanto a administração aguda como crônica de GYKI

52466 não produziram efeito sobre o desempenho dos ratos privados de sono.

Apesar das semelhanças encontradas entre os efeitos induzidos pela privação

de sono e a isquemia cerebral sobre o sistema glutamatérgico, tais como

aumento de níveis de glutamato e redução de receptores AMPA (Ravassard et

al., 2009; Montori et al., 2010; Mohammed et al., 2011; Kostandy, 2011), é

necessário reconhecer que a dinâmica dessas alterações ocorre de forma

distinta entre estes dois modelos. Por exemplo, enquanto que o aumento de

glutamato no modelo de isquemia cerebral ocorre de forma aguda e intensa

(Kostandy, 2011), o mesmo não ocorre durante a privação de sono, sendo

mantido em níveis elevados a partir de períodos curtos (12 h, Bettendorff et al.,

1996) a longos de PS (72 h, Mohammed et al., 2011).

48

Há algumas diferenças relevantes entre os trabalhos prévios que

empregaram o modelo de isquemia cerebral (Block e Schwarz, 1997; Gyertyan

et al., 1999) e o presente estudo em relação ao tratamento agudo com GYKI

52466, que podem ter contribuído para a ausência de efeitos do antagonista na

tarefa de esquiva inibitória. Enquanto Gyertyan et al. (1999) utilizaram gerbilos,

Block e Schwarz (1997) aplicaram o antagonista em ratos no momento da

intervenção isquêmica, de forma aguda, uma semana antes de avaliá-los na

versão espacial do labirinto aquático de Morris. Além disso, a alta dose utilizada

nesse estudo (30 mg/kg, Block e Schwarz, 1997) induz ataxia (Danysz et al.,

1994), o que dificultaria sua aplicação antes do treino no paradigma da tarefa

de esquiva inibitória em ratos privados de sono. Dessa forma, optamos por

administrar doses mais baixas do fármaco (5 e 10 mg/kg, Experimento 2-2), na

mesma faixa de doses aplicada no experimento crônico (Experimento 2-3).

É sabido que administração crônica de GYKI 52466 aumenta a

marcação de receptores AMPA (Sinha et al., 1999), e que a facilitação da

atividade desses receptores induz melhora de desempenho em tarefas de

memórias hipocampo dependentes (Gouliaev e Senning, 1994). Entretanto,

não verificamos melhora de desempenho de animais privados de sono ou

controles após 4 dias de tratamento com GYKI 52466 (Experimento 2-3). É

plausível supor que o tratamento crônico possa ter atenuado a redução de

receptores AMPA hipocampais após a privação de sono (Experimento 1-1), e

que não tenha sido suficiente para produzir um efeito sobre o prejuízo de

desempenho de ratos privados de sono. Uma possibilidade para testar esta

hipótese reside na combinação entre o tratamento crônico do antagonista GYKI

52466 com o tratamento agudo de doses subefetivas de aniracetam (por

49

exemplo, 25 e 50 mg/kg, conforme Experimento 2-1). Essa combinação poderia

produzir uma sinergia entre os dois fármacos e, assim, aumentar a eficácia da

reversão dos prejuízos de memória induzidos pela privação de sono com doses

sublimiares do potenciador de receptores AMPA.

A tarefa de esquiva inibitória, utilizada nos experimentos farmacológicos

descritos, é um paradigma que permite avaliar a memória de curto e longo

prazos de forma consecutiva (Izquierdo et al., 1998). Em sua constituição,

utiliza tanto mecanismos de aprendizagem instrumental quanto componentes

do condicionamento clássico de medo (Xavier, 1982). Dentro desse quadro,

para acessar, simultaneamente, efeitos específicos da privação de sono e da

administração do aniracetam sobre memórias hipocampo-dependentes, seria

necessário a utilização de um paradigma que permitisse dissociar memórias

dependentes e independentes do hipocampo, associado a um tratamento local

do fármaco na região de interesse.

O condicionamento clássico de medo é uma tarefa que pareia um

estímulo neutro com um estímulo aversivo e, após algum tempo, o estímulo

neutro assume as propriedades do estímulo aversivo, desencadeando as

mesmas respostas e sendo, então, denominado de estímulo condicionado

(Philips & LeDoux, 1992; Maren & Aharonov, 1996; Goosens & Maren, 2001).

Quando o pareamento é feito entre um estímulo complexo e espacial (como o

ambiente) e o estímulo aversivo (como um choque) a tarefa é denominada de

condicionamento de medo ao contexto e é dependente do hipocampo (Philips

& LeDoux, 1992). Por outro lado, quando o pareamento é feito entre um

estímulo discreto (como um som ou uma luz) e o mesmo tipo de estímulo

aversivo (choque), a tarefa é nomeada como condicionamento de medo ao

50

som. Para esse tipo de aprendizagem, a lesão do hipocampo não provoca

prejuízo no desempenho dos animais (Philips & LeDoux, 1992); por isso, diz-se

que a tarefa de condicionamento ao som é hipocampo-independente.

Baseados nesse panorama planejamos um novo experimento, com o

intuito de acessar os efeitos do potenciador aniracetam administrado

diretamente no hipocampo de ratos privados de sono, utilizando um paradigma

que pudesse dissociar, simultaneamente, memórias dependentes e

independentes do hipocampo: o condicionamento clássico de medo.

4.5. EXPERIMENTO COMPLEMENTAR: EFEITOS DA

ADMINISTRAÇÃO INTRA-HIPOCAMPAL DE ANIRACETAM EM

RATOS PRIVADOS DE SONO NO CONDICIONAMENTO DE

MEDO

Considerando os efeitos seletivos da privação de sono sobre a

marcação de receptores AMPA na região hipocampal (Experimento 1-1) e os

dados farmacológicos obtidos sob o paradigma da esquiva inibitória

(Experimento 2-1), planejamos um novo estudo com o intuito de acessar os

efeitos do potenciador aniracetam administrado diretamente no hipocampo de

ratos privados de sono. Para tanto, um conjunto de ratos foi operado para

implante de cânulas na região hipocampal. Estes animais foram submetidos

posteriormente ao procedimento de privação de sono, administração local de

soluções, e avaliação de desempenho na tarefa de condicionamento clássico

de medo, nessa ordem. Optamos por alterar a tarefa de memória para acessar,

51

simultaneamente, efeitos específicos da privação de sono e da administração

local do aniracetam sobre memórias dependentes do hipocampo (por meio do

condicionamento de medo ao contexto) em relação a memórias independentes

(por meio do condicionamento de medo ao som).

Sujeitos

Foram utilizados ratos Wistar machos, com três meses de idade,

provenientes do biotério do CEDEME (UNIFESP). Os animais foram mantidos

em condições controladas de temperatura (22-24 ºC) e ciclo claro escuro de

12/12 hr (período claro iniciado às 7:00 h), com livre acesso ao alimento e

água.

Cirurgia Estereotáxica

Cada animal foi anestesiado por via i.p. com uma solução associada de

quetamina e xilasina (Agener), na dose de 1 ml/kg para cada um dos fármacos.

Após atingir o plano anestésico, o pêlo da região craniana foi aparado e a

cabeça foi afixada num aparelho de estereotaxia (David Kopf Instruments). A

pele, tecido muscular subcutâneo e periósteo foram divulsionados com auxílio

de um bisturi lâmina 23 até exposição da tábua óssea. Após a ocorrência da

hemostasia, dois pequenos orifícios (cerca de 1 mm) foram realizados para

implantação de cânulas-guia bilaterais na região CA1 da formação hipocampal

(3,8 mm posterior e 2,4 mm lateral ao bregma, 1,6 mm de profundidade),

segundo o atlas de Paxinos & Watson (1998). Mais três orifícios foram

perfurados para implantação de parafusos para manutenção do capacete de

cimento de acrílico dental. Em cada cânula foi colocado um mandril para evitar

52

sua obstrução. Após o procedimento cirúrgico foi administrado pentabiótico (via

intramuscular) e diclofenaco de sódio (via i.p.), e os animais foram colocados

em gaiolas individuais aquecidas por 24 h, antes de retornar às suas gaiolas-

moradia. Os procedimentos comportamentais (privação de sono seguida por

avaliação de desempenho no condicionamento clássico de medo) foram

realizados após o período de recuperação pós-operatória (5-7 dias).


Após a recuperação de cirurgia, os animais foram submetidos ao

procedimento de privação de sono por 96 h em plataformas múltiplas. Os

animais do grupo PS foram colocados em duplas (a fim de prevenir isolamento

social) em um tanque de água contendo cinco plataformas estreitas (6,2 cm de

diâmetro) espaçadas 7-8 cm entre si. Água e ração foram disponibilzadas ad

libitum, e o tanque foi limpo diariamente. Os animais controles foram mantidos

em gaiolas individuais (mas com a oportunidade de interagir entre si entre as

grades), na mesma sala onde ocorreu a privação de sono.

Procedimento de Injeção Intra-Hipocampal

Após o procedimento de privação de sono, as soluções de infusão

(veículo ou aniracetam – doses de 0,1 μg e 1 μg, dissolvido em solução de

0,25% DMSO) foram injetadas bilateralmente no hipocampo através de agulhas

de microinjeção (Figura 13). Cada agulha de microinjeção é 1 mm mais longa

do que a cânula guia. Após cuidadosa imobilização do animal, o mandril foi

retirado e a agulha de microinjeção foi colocada dentro da cânula-guia. Cada

agulha foi fixada à extremidade de uma seringa Hamilton de 5 ml por meio de

53

um tubo de polietileno (PE-10). As infusões, em volume de 1 μl, foram

controladas por uma bomba de infusão (Insight), na qual foi acoplada a seringa

Hamilton. A velocidade de infusão foi de 0,5 μl/minuto. Terminada a injeção, a

agulha injetora permaneceu na cânula-guia por um tempo equivalente ao da

microinjeção, a fim de evitar refluxo da solução, e só então a agulha foi retirada

e o mandril recolocado na cânula-guia. O animal foi devolvido a sua gaiola

moradia e, 15 minutos depois, foi submetido à sessão de treino de

condicionamento clássico de medo. As doses escolhidas, bem como o intervalo

entre a administração e a tarefa, foram baseadas nos trabalhos de Lu e

Wehner (1997) e Masuoka et al. (2007).

Figura 13: Desenho experimental do experimento complementar. Ao final de 96 h de privação

de sono, os animais recebem administrações intrahipocampais de aniracetam e são treinados

na tarefa de condicionamento de medo (treino CM). No dia seguinte, os animais são testados

para o condicionamento de medo ao contexto e ao som (testes CMC e CMS).

Aparato de Condicionamento Clássico de Medo

Para a tarefa de condicionamento clássico de medo, utilizamos uma

caixa de condicionamento (21 x 15 cm de base, altura de 27,5 cm) que possui

paredes pretas com cinco quadrados brancos de 6 cm2. A tampa do aparelho

consiste em uma placa de acrílico transparente. A base é formada por grades

54

metálicas conectadas a uma fonte geradora de corrente alternada capaz de

administrar choques elétricos e sinais de som programáveis (AVS Projetos

Especiais). Cada grade da base do aparelho mede 0,4 cm de diâmetro. A

distância entre grades adjacentes é de 1,2 cm. Um recipiente cilíndrico (35 cm

de base e 60 cm de altura) de paredes brancas e piso marrom foi utilizado para

o teste do condicionamento de medo ao som.

Procedimento do Condicionamento Clássico de Medo

A tarefa de condicionamento clássico de medo foi realizada em dois dias

consecutivos. Durante a sessão de treino de condicionamento de medo (CM),

os animais foram colocados no aparato de condicionamento e, 2 minutos após,

receberam cinco pareamentos som-choque (som: 60 dB/5 s; choque: 0,6 mA/1

s), com 30 segundos de intervalo entre os pareamentos. Após o último

pareamento, os animais foram mantidos no aparato por um minuto adicional.

Os animais foram então retirados do aparato e colocados em suas gaiolas

moradias.

Duas sessões de teste foram realizadas após a sessão de treino, a fim

de acessar os efeitos da privação de sono e da administração local do

aniracetam em memórias dependentes e independentes do hipocampo (Phillips

& Ledoux, 1994, Figura 14). O primeiro teste – teste de condicionamento de

medo ao contexto (CMC) – foi realizado 24 horas após a sessão de treino. Os

animais foram colocados por 5 minutos no mesmo aparato de condicionamento

da sessão de treino, sem a presença de som ou choque, e o tempo de

congelamento médio por minuto foi registrado. Em seguida, os animais foram

retirados do aparato e colocados em suas gaiolas moradias. Duas horas

55

depois, foi realizado o segundo teste – teste de condicionamento de medo ao

som (CMS) – em uma nova câmara de teste (novo contexto), numa sala

distinta de onde foram realizadas as sessões anteriores. O animal permaneceu

na câmara por seis minutos. Após três minutos iniciais, os mesmos sons

apresentados na sessão de treino (60 dB/5 s) foram emitidos com intervalos

regulares de 30 segundos por cinco vezes, sem a aplicação de choques nas

patas. O tempo de congelamento médio por minuto foi registrado durante toda

a sessão de CMS, e subdividido em intervalos pré e pós apresentação de som.

Figura 14: Desenho experimental da tarefa de condicionamento clássico de medo. Animais são

treinados na tarefa de condicionamento de medo (treino CM) a contexto e sons específicos, e

consecutivamente testados para cada um desses fatores em separado (testes CMC e CMS).


Para o treino de CM foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de duas

via com medidas repetidas, utilizando grupos (CG e PS sob diferentes

tratamentos) e intervalos (pré e pós pareamento som-choque) como fatores.

Para o teste de CMC foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de uma

via, utilizando grupo como fator. Para o teste de CMS foi realizada uma análise

de variância (ANOVA) de duas via com medidas repetidas, utilizando grupos

X

X

X

56

(CG e PS sob diferentes tratamentos) e intervalos (pré e pós apresentação de

som) como fatores. Análises post hoc foram feitas através do Teste de Duncan,

com nível de significância de p < 0,05.

Histologia

Após os testes comportamentais, a fim de verificar se as cânulas foram

posicionadas corretamente, os animais receberam injeções bilaterais de

corante (azul de metileno 1%) com o mesmo procedimento realizado para a

infusão das soluções, descrito anteriormente. Em seqüência, os animais foram

sacrificados por meio de dose letal do anestésico hidrato de cloral. O encéfalo

foi retirado, armazenado em freezer (-80oC) e, posteriormente, a formação

hipocampal foi seccionada em fatias de 20 μm para confimar as coordenadas

descritas, de acordo com o atlas de Paxinos & Watson (1998, Figura 15).

Figura 15: Localização histológica de implante de cânula no hipocampo dorsal.

57

4.5.1. Resultados

Treino CM: os dados estão apresentados na Figura 16. ANOVA de duas vias

com medidas repetidas revelou efeitos dos fatores grupo (F(5,45)=3,7395, p <

0,05) e intervalo (pré e pós pareamento) (F(1,45)=458,36, p < 0,05), e uma

interação significativa entre eles (F(5,45)=3,0276, p < 0,05). A análise a

posteriori demonstrou que todos os grupos apresentaram mais resposta de

congelamento após os pareamentos som-choque (p < 0.05). Por outro lado, os

animais privados de sono apresentaram menos resposta de congelamento do

que os animais controles, independentemente do tratamento recebido, durante

o intervalo pós pareamento som-choque (p < 0.05).

Figura 16: Tempo médio por minuto de congelamento de animais privados de sono tratados

com injeção intrahipocampal de aniracetam durante o treino de condicionamento de medo

(média ± erro padrão em segundos). CG = controle gaiola, PS = privação de sono, vh = veículo,

ani 0,1 = 0,1 ug/ul aniracetam, ani 1,0 = 1,0 ug/ul aniracetam. * p < 0,05 vs. intervalo pré

pareamento som-choque. # p < 0,05 vs. grupo CG sob mesmo tratamento (teste de Duncan).

58

Teste CMC: os dados estão apresentados na Figura 17. Foi encontrado efeito

do fator grupo (F(5, 45)=11,206, p < 0,01). A análise a posteriori mostrou que o

tempo médio de congelamento dos animais privados de sono foi menor do que

o tempo de congelamento dos animais controles (teste de Duncan, p < 0,01),

independente do tratamento.


com injeção intrahipocampal de aniracetam durante o teste de condicionamento de medo ao

contexto (média ± erro padrão em segundos). CG = controle gaiola, PS = privação de sono, vh

= veículo, ani 0,1 = 0,1 ug/ul aniracetam, ani 1,0 = 1,0 ug/ul aniracetam. * p < 0,05 vs. animais

controles sob o mesmo tratamento, na mesma sessão (teste de Duncan).

Teste CMS: os dados estão apresentados na Figura 18. Não foi encontrado

efeito do fator grupo (F(5, 45)=1,9491, p=0,1049), foi encontrada efeito do fator

intervalo (antes e depois da apresentação do som) (F(1, 45)=177,63, p < 0,01)

e não foi encontrado efeito de interação dos fatores (F(5, 45)=0,4167,

p=0,8346). A análise a posteriori do fator período mostrou que o tempo médio

*

(10) (8) (8) (8) (7) (10)

59

de congelamento durante o intervalo pré som é menor do que o tempo de

congelamento durante o intervalo pós som (teste de Duncan, p < 0,01).


com injeção intrahipocampal de aniracetam durante o teste de condicionamento de medo ao

som (média ± erro padrão em segundos). CG = controle gaiola, PS = privação de sono, vh =

veículo, ani 0,1 = 0,1 ug/ul aniracetam, ani 1,0 = 1,0 ug/ul aniracetam. * p < 0,05 vs. intervalo

pré som (teste de Duncan).

4.5.2. Discussão do Experimento Complementar

O experimento demonstrou que, mesmo administrando aniracetam na

região hipocampal, o fármaco não afetou o desempenho dos animais na tarefa

de condicionamento clássico de medo. Paralelamente, nossos dados mostram

uma redução do tempo de congelamento dos animais privados de sono tanto

após o treino da tarefa como no teste de condicionamento de medo ao

contexto, ao passo que não foi encontrada diferença de desempenho entre os

grupos durante o teste de condicionamento de medo ao som.

* * *

* * *

(10) (10) (8) (8) (8) (7)

60

Estudos prévios mostram que ratos privados de sono podem exibir

respostas comportamentais distintas de animais controles a condições

aversivas, como choque e pressão nas patas (Onen et al., 2000; Dametto et al.,

2002), o que pode influenciar sobremaneira a evocação da tarefa de

condicionamento clássico de medo. Por outro lado, o desempenho dos animais

privados foram diferentes nas sessões de condicionamento de medo ao

contexto e ao som em comparação aos animais controles. Dessa forma,

confirmamos que os prejuízos de memória induzidos pela privação de sono são

específicos para memórias hipocampo dependentes, de acordo com estudos

prévios que utilizaram a tarefa de condicionamento clássico de medo

(McDermott et al., 2003; Ruskin et al. 2004).

Somados aos dados obtidos no Experimento 1-1, os resultados da

administração local de aniracetam indicam que a potenciação alostérica

induzida pelo fármaco, nas doses utilizadas (0,1 e 1 ug/ul), não é suficiente

para prevenir os prejuízos de memória hipocampo-dependentes em ratos

privados de sono. É possível que a redução da marcação de receptores AMPA

no hipocampo previna a ação antiamnéstica da infusão de aniracetam nessa

região, sendo necessária uma ativação mais consistente desses receptores

com doses mais elevadas do potenciador. Por outro lado, conforme observado

no Experimento 1-1, uma possibilidade alternativa reside na necessidade de

ativação de outras subáreas da formação hipocampal, além da região CA1,

para que seja produzida melhora de memórias emocionais aversivas

contextuais. Mais estudos serão necessários para investigar essa hipótese.

61

5. SEGUNDA ETAPA: AVALIAÇÃO DO RITMO TETA

HIPOCAMPAL DE RATOS PRIVADOS DE SONO

DURANTE A TAREFA DE RECONHECIMENTO DE

OBJETOS

O principal objetivo dessa etapa foi investigar o ritmo teta hipocampal de

ratos privados de sono durante a aprendizagem de uma tarefa. De maneira

secundária, também foram avaliados a influência da privação de sono na tarefa

de reconhecimento de objetos, bem como o efeito rebote entre as sessões da

tarefa. Todos os experimentos desta segunda etapa foram realizados durante

estágio de doutorado sanduíche, no laboratório CNRS UMR 5167 Physio-

pathologie des réseaux neuronaux responsables du cycle veille-sommeil (Lyon,

França), dirigido pelo Dr Pierre-Hervé Luppi e com supervisão do Dr Damien

Gervasoni. Dessa forma, algumas alterações metodológicas serão evidentes

ao longo da leitura dessa etapa em relação à anterior (e.g. procedimento de

privação de sono).

5.1. METODOLOGIA GERAL

Sujeitos

Foram utilizados seis ratos Long-Evans machos, com 2,5 meses de

idade, (Harlan Laboratories). Os animais foram mantidos em condições

62

controladas de temperatura (22-24 ºC) e ciclo claro escuro de 12/12 h (período

claro iniciado às 7:00 h), com livre acesso ao alimento e água.

Técnica para registros simultâneos com arranjos de multi-eletrodos

Para realizar esses registros, utilizamos arranjos de feixes de

microeletrodos (microfios de tugstênio, revestidos de teflon, manufaturados em

nosso laboratório), que permitiram amostragem contínua de atividade neuronal

em uma área de 2 mm2 de tecido cerebral por estrutura (Nicolelis et al. 1997;

Kralik et al., 2001). Usando essa abordagem, nós obtemos registros

simultâneos de populações de neurônios individuais localizados no córtex

somatossensorial S1 e nas regiões hipocampais de CA1 e giro denteado.

Os arranjos de microeletrodos implantáveis foram manufaturados em

laboratório. Os microfios foram implantados em arranjos de 16 microfios por

peça, espaçados em intervalos de 250 μm. Esses microfios são acoplados

juntamente com fios terra a conectores Omnetics (34 contatos cada). Os

conectores são cimentados em conjunto com os microfios formando o implante.

O implante foi subdividido para ser inserido em áreas corticais e subcorticais

(Figura 19), incluindo o córtex S1 (matriz de 8x2 eletrodos) e a formação

hipocampal (matriz de 4x4 eletrodos).

Implante cirúrgico dos Arranjos de Eletrodos

A acurácia da implantação dos eletrodos durante a cirurgia foi

assegurada pelo posicionamento estereotáxico de microfios e pelo registro

contínuo de atividade neural posterior à cirurgia. Especificamente para o

hipocampo, o posicionamento dos eletrodos foi guiado pelo perfil de

63

profundidade de atividade neuronal corrente, e pela presença de ritmo teta em

potenciais locais de campo registrados durante o experimento. Esses

procedimentos geralmente fornecem uma estimativa acurada do

posicionamento dos microfios em seus alvos. A reconstrução histológica para

determinar sítios específicos dos eletrodos foi realizada após todos os

experimentos de registro serem concluídos, por meio da inspeção de seções

coronais cerebrais coradas em vermelho neutro, com referência a planos

anatômicos definidos.

Identificação em tempo real de estados de sono e vigília

Um algoritmo de detecção de estado de sono-vigília foi utilizado,

baseado num algoritmo previamente desenvolvido (Gervasoni et al. 2004). Em

resumo, sinais de potenciais de campo locais foram pré amplificados (500X),

filtrados (0.3–400 Hz) e digitalizados a 500 Hz (Multi-Neuron Acquisition

Processor, Plexon, EUA). Em seguida, estes sinais foram recaptados do

computador de registro por meio do programa PlexNet (Plexon Inc, Dallas, TX).

Um computador cliente acessou os sinais de potenciais de campo por meio do

programa Matlab (MathWorks, Natick, MA). Uma variável tampão é gerada

para processar os potenciais de campo mais recentes registrados, enquanto os

dados recém-processados são armazenados. Após um segundo completo de

registro ser obtido, uma transformação de Fourier é aplicada para obter a

densidade espectral e os valores das faixas de amplitude espectral. Em

seguida, duas razões de amplitude de espectro foram calculadas integrando o

valor absoluto da amplitude espectral para cada faixa de freqüência

selecionada: 0.5-20/0.5-55 Hz para a razão 1, e 0.5-4.5/0.5-9 Hz para a razão

64

2. As medidas dessas razões são projetadas para produzir valores

normalizados entre 0 e 1, ou seja, a faixa de frequência do numerador era

incluída no denominador para gerar distribuições simétricas. Análises de

componentes principais foram aplicados em cada razão obtida para todos os

canais, e o primeiro componente principal foi utilizado como a medida da razão

em questão. As duas razões obtidas para cada segundo foram diagramadas

em um plano, de forma a produzir três agrupamentos principais de pontos,

refletindo os estados de vigília, sono de ondas lentas e sono paradoxal. O

agrupamento de sono de ondas lentas ocupa o quadrante superior direito

devido às oscilações lentas (0-20 Hz), que resultam num valor alto no eixo das

ordenadas, e às oscilações delta (1-4 Hz), que corresponde a um valor alto no

eixo das abscissas. Os agrupamentos da vigília e do sono paradoxal têm

valores menores no eixo das ordenadas comparados com o agrupamento do

sono de ondas lentas. O agrupamento da vigília é localizado à direita do sono

paradoxal em função desse último apresentar oscilações teta mais salientes (5-

9 Hz), resultando num valor baixo no eixo das abscissas (Gervasoni et al. 2004,

Figura 19D).

65

Figura 19: A e C: exemplos de arranjos de eletrodos implantados no córtex S1 (matriz de 8x2

eletrodos) e no hipocampo (matriz de 4x4 eletrodos); B: amostra da localização do

posicionamento dos eletrodos por reconstrução histológica na formação hipocampal; D:

diagrama contendo agrupamentos de estados do ciclo sono-vigília (QW: vigília quieta, AE:

vigília ativa, SWS: sono de ondas lentas, REM: sono paradoxal, IS: sono intermediário, WT:

movimento de vibrissas), baseados nas análises de componente das razão 1 (r1, 0.5-20/0.5-55

Hz) e razão 2 (r2, 0.5-4.5/0.5-9 Hz) dos valores obtidos do espectro de frequência de potenciais

de campo locais por segundo.

Habituação à Arena de Registro

Sete dias após a cirurgia de implante de arranjos de multi-eletrodos, os

animais foram habituados à arena de registro (50 cm x 50 cm x 35 cm), durante

quatro dias (4-6 h por sessão diária), e em seguida foram coletados registros

66

basais de disparos neuronais e potenciais de campo locais durante oito horas,

a partir das 10:00 h.


Reconhecimento de Objetos

O objetivo desse experimento foi avaliar o desempenho de ratos privados

de sono na tarefa de reconhecimento de objetos (TRO), em comparação a uma

condição prévia sem privação de sono dos mesmos animais. A escolha dessa

tarefa foi baseada na facilidade de executá-la na mesma arena de registro, e

por ser considerada dependente da formação hipocampal (Dere et al., 2007).

Além disso, verificamos os efeitos da privação de sono sobre os estados do

ciclo sono-vigília durante o intervalo entre sessões da tarefa.

Tarefa de Reconhecimento de Objetos

Duas horas após o início de uma sessão de registro basal, os animais

foram expostos a um par de objetos por duas sessões consecutivas de 10 min,

separadas em intervalos de 4 h (Figura 20). Na sessão 1, dois objetos idênticos

entre si foram apresentados, ao passo que na sessão 2 foram introduzidos dois

objetos diferentes, sendo um deles idêntico ao par de objetos da sessão 1

(Figura 20). Nesse paradigma, espera-se que os animais diferenciem o objeto

familiar do novo, por meio do aumento de exploração a este último durante a

sessão 2 (Dere et al 2007), definida pela aproximação do focinho do animal a

menos de 2 cm do objeto. Os objetos são constituídos por peças de plástico

67

similares a Lego (Fig 20), divididos em diferentes conjuntos de acordo com a

forma e textura das peças (lisa, perfurada, rugosa), afixados em plataformas

posicionadas em cantos diagonalmente opostos na arena de registro.

Figura 20: Acima, desenho experimental da tarefa de reconhecimento de objetos; abaixo,

exemplos de objetos utilizados na tarefa com diferentes formas e texturas.


Algumas semanas após a primeira exposição à tarefa de

reconhecimento de objetos, os animais foram individualmente submetidos a um

protocolo de privação de sono por 72 h em plataformas múltiplas, de acordo

com protocolo de Ravassard et al, (2009). Cada animal foi colocado em um

tanque de água contendo três plataformas estreitas espaçadas 7-8 cm entre si.

Água e ração foram disponibilizadas ad libitum. Ao final do procedimento cada

animal foi novamente exposto à TRO, sendo pré-habituado à arena por 30 min

antes do início da Sessão 1 (Figura 21). A fim de evitar a habituação dos

animais às características dos objetos, foi utilizada uma nova série de objetos,

2

68

com formatos e texturas diferentes da primeira apresentação à tarefa. Por meio

do acompanhamento dos registros de potenciais de campo locais e da

observação do comportamento do animal, foi possível acompanhar o rebote de

sono do animal especificamente durante o intervalo entre sessões.

Figura 21: A e B: amostras de registros de disparos neuronais e potenciais de campo locais

com visualização simultânea do comportamento do animal; C: desenho experimental do

estudo. Animais foram habituados á arena de registro 2 h antes da primeira sessão da tarefa de

reconhecimento de objetos.

Alterações de Estados do Ciclo Sono-Vigília após Privação de Sono

Os dados obtidos por meio da identificação em tempo de estados de

sono e vigília, especificamente durante o intervalo de 4 horas entre sessões da

tarefa de reconhecimento de objetos, foram analisados por meio do programa

NeuroExplorer e Excel. Os sinais foram classificados de acordo com Gervasoni

A B

C

69

et al. (2004), sendo determinados os estados de vigília, sono de ondas lentas e

sono paradoxal, bem como sua duração e número de episódios.


Os dados de reconhecimento de objetos para cada uma das duas

condições experimentais (controle e privação de sono) foram analisados

através de teste t de Student para uma amostra de 50%. Os dados de

exploração de objetos para cada uma das sessões da TRO foram comparados

entre as condições experimentais e analisados através de teste t de Student

pareado. Os estados de ciclo sono vigília foram analisados separadamente

para cada condição através de teste t de Student pareado. Todas as análises

foram realizadas com nível de significância de p < 0,05.

70

5.1.2. Experimento 2 – Análise da Potência de Ritmo Teta

Hipocampal durante uma Tarefa de Reconhecimento de

Objetos em Ratos Privados de Sono

Com a intenção de avaliar com maior detalhe a influência da privação de

sono sobre a aprendizagem da tarefa de reconhecimento de objetos,

procedemos à análise do rimo teta hipocampal durante o comportamento

exploratório nas duas sessões da tarefa.

Seleção de canais de registro

Foi escolhido um canal de registro hipocampal entre os 16 disponíveis,

para posterior realização da análise de potência espectral. Para tanto, para

cada um dos canais foi coletado um intervalo de registro de potenciais de

campo locais durante todo o período da sessão 1 da TRO na condição controle

(Figura 22). Dessa forma, foi obtido um espectrograma do período com a

presença de ritmo teta hipocampal proeminente. Em sequência, esses dados

foram normalizados em relação às demais frequências contidas para cada

amostra de cada animal, e posteriormente comparados por meio da razão do

pico pela média da faixa da frequência do ritmo teta hipocampal (4-12 Hz,

Figura 23). Os maiores valores obtidos determinam o canal de registro

hipocampal a ser utilizado para análises ulteriores. A localização histológica

dos canais selecionados foi confirmada ao final dos experimentos, sendo

verificado que a maioria está situada entre o giro denteado e a região CA1 (Fig

24). Esta observação corrobora achados que demonstram um aumento local do

71

ritmo teta nessas regiões, em comparação à região CA3 (Montgomery et al.,

2009).

Figura 22: Registro de potenciais de campo locais hipocampais durante uma sessão da tarefa

de reconhecimento de objetos. A: trecho de registro de um canal localizado na formação

hipocampal. B: espectrograma do canal ao longo da sessão (note a predominância de ritmo

teta hipocampal na faixa de 4 a 12 Hz). C: animal exposto aos objetos da tarefa de

reconhecimento.

B C

A

72

Figura 23: Razão entre pico e média de faixa de frequências do ritmo teta hipocampal (4-12

Hz). Os canais hipocampais (numerados de 16 a 32) de cada animal foram analisados para

seleção daquele com maior valor de pico (em vermelho) e menor valor de média (em azul).

73

Figura 24: Localização histológica do posicionamento dos canais selecionados para cada

animal. A seta indica a extremidade do eletrodo de registro.

74

Análise Espectral do Ritmo Teta Hipocampal

Para analisar os potenciais de campo locais, uma transformação rápida

de Fourier foi realizada de 0,1 a 50 Hz, com uma resolução de 0,12255 Hz para

cada segundo de atividade exploratória durante as duas sessões da TRO. A

potência da faixa de frequência de interesse foi dividida pela potência da faixa

de 0,1 a 50 Hz, de forma a obtermos a potência normalizada em porcentagem.

Analisamos especificamente a potência relativa do ritmo teta hipocampal na

faixa de 4 a 12 Hz, bem como o valor máximo (pico) dessa faixa. Além disso,

foram também analisadas as potências relativas do teta 1 (8-12 Hz) e do teta 2

(4-8 Hz).


Os dados de potência de ritmo teta (total, teta 1 e teta 2) e pico de

frequência obtidos para as duas condições experimentais (controle e privação

de sono), foram analisados através de teste t de Student pareado, com nível de

significância de p < 0,05.

75

5.2. RESULTADOS


Reconhecimento de Objetos

Efeitos da Privação de Sono na Tarefa de Reconhecimento de Objetos

Sessão 1: os dados estão apresentados nas Figuras 25 e 26. Não houve

preferência de exploração dos objetos familiares tanto na condição controle

(teste t de Student para uma amostra, p = 0,32) como após privação de sono

por 72 h (teste t de Student para uma amostra, p = 0,55) (Figura 25). Por outro

lado, a comparação do tempo total de exploração (Figura 26) mostrou que os

animais na condição controle apresentaram mais comportamento exploratório

do que após privação de sono (teste t de Student pareado, p < 0,05).

Sessão 2: os dados estão apresentados nas Figuras 27 e 28. Na condição

controle, os animais exploraram mais o objeto novo em relação ao acaso (teste

t de Student para uma amostra de 50%, p < 0,05). Após a privação de sono por

72 h, no entanto, não houve diferença de exploração do objeto novo em

relação ao objeto familiar (teste t de Student para uma amostra, p = 0,95). A

comparação do tempo total de exploração nas duas situações (Figura 28)

mostrou que os animais na condição controle apresentaram mais

comportamento exploratório do que na condição após privação de sono (teste t

de Student pareado, p < 0,05).

76

Figura 25: Tempo relativo de exploração de objetos idênticos durante a sessão 1 da tarefa de

reconhecimento de objetos, em condição controle (A) e após privação de sono por 72 h (B).

Figura 26: Tempo total de exploração dos objetos durante a sessão 1 da tarefa em condição

controle (CT) e após privação de sono por 72 h (PS). * p < 0,05 vs. condição controle (teste t de

Student pareado).

*

CT PS

77

Figura 27: Tempo relativo de exploração de objetos durante a sessão 2 da tarefa de

reconhecimento de objetos, em condição controle (A) e após privação de sono por 72 h (B). * p

< 0,05 vs. 50% (teste t de Student para uma amostra).

Figura 28: Tempo total de exploração dos objetos durante a sessão 2 da tarefa em condição

controle (CT) e após privação de sono por 72 horas (PS). * p < 0,05 vs. condição CT (teste t de

Student pareado).

*

*

CT PS

78

Alterações de Estados do Ciclo Sono-Vigília após Privação de Sono

Duração das fases do ciclo sono-vigília: os resultados estão apresentados na

figura 29. Foi encontrada uma diferença significativa na duração de sono

paradoxal entre as condições controle e privado de sono: a condição PS

demonstrou aumento de sono paradoxal em relação à condição CT (teste t de

Student pareado, p < 0,05). Com relação à duração de sono de ondas lentas,

foi encontrada uma redução significativa das condição PS em comparação à

condição CT (teste t de Student pareado, p < 0,05). Não foi encontrada

diferença significativa com relação à duração total da vigília (teste t de Student

pareado, p > 0,5).

Episódios de Sono Paradoxal: os resultados estão apresentados nas figuras

30A e 30B. Não foram encontradas diferenças significativas no número de

episódios e na duração média de episódio de sono paradoxal (teste t de

Student pareado, p > 0,05).

Episódios de Sono de Ondas Lentas: os resultados estão apresentados nas

figuras 30C e 30D. Não foram encontradas diferenças significativas no número

de episódios ou na duração média de episódio de sono de ondas lentas entre

as condições PS e CT (teste t de Student pareado, p > 0,05).

79

Figura 29: Efeitos da privação de sono no ciclo sono-vigília durante intervalo de 4 horas entre

sessões da tarefa de reconhecimento de objetos. CT = condição controle; PS = privação de

sono por 72 horas antes da tarefa. * p < 0,05 vs. condição CT (teste de Student pareado).

0

25

50

75

100

125

150

sono paradoxal sono de ondas lentas vigília

Du

raçã

o t

ota

l (m

in)

duração dos estados do ciclo sono-vigília

CT

PS

*

*

80

Figura 30: Efeitos da privação de sono em parâmetros específicos dos estados de sono. A:

número de episódios de sono paradoxal (SP); B: duração média de episódio de SP; C: número

de episódios de sono de ondas lentas (SOL); D: duração média de episódio de SOL. CT =

condição controle; PS = privação de sono por 72 horas antes da tarefa. Nenhuma diferença

significativa foi encontrada (teste t de Student pareado).

A B

C D

81

5.2.2. Experimento 2 – Análise Da Potência De Ritmo Teta

Hipocampal Durante Uma Tarefa De Reconhecimento De

Objetos Em Ratos Privados De Sono

Potência de Teta Total (4-12 Hz): os resultados estão apresentados na figura

32A. Na condição CT, foi encontrada redução significativa na potência de teta

na sessão 2 em relação à sessão 1 (teste t de Student pareado, p > 0,05). Foi

encontrada aumento na potência de teta na sessão 2 na condição PS em

relação à condição CT (teste t de Student pareado, p > 0,05).

Potência de Teta tipo 1 (8-12 Hz): os resultados estão apresentados na figura

32B. Foi encontrado aumento na potência de teta tipo 1 na sessão 2 na

condição PS em relação à condição CT (teste t de Student pareado, p > 0,05).

Potência de Teta tipo 2 (4-8 Hz): os resultados estão apresentados na figura

32C. Na condição PS, foi encontrado aumento significativo na potência de teta

tipo 2 na sessão 2 em relação à sessão 1 (teste t de Student pareado, p >

0,05). Foi encontrada diminuição na potência de teta tipo 2 na sessão 1 na

condição PS em relação à condição CT (teste t de Student pareado, p > 0,05).

Pico de frequência de teta: os resultados estão apresentados na figura 33. Não

foram encontradas diferenças significativas entre as condições ou entre as

sessões. (teste t de Student pareado, p > 0,05).

82

Figura 31: Espectro de potência normalizado do registro hipocampal durante as duas sessões

da tarefa de reconhecimento de objetos. CT = condição controle; PS = privação de sono por 72

horas. Valores em média ± erro padrão.

83

Figura 32: Efeitos da privação de sono sobre potência normalizada de teta total (4-12 Hz, A),

teta 1 (8-12 Hz, B), e teta 2 (4-8 Hz, C). CT = condição controle; PS = privação de sono por 72

horas. * p < 0,05 vs. condição CT na sessão 1; # p < 0,05 vs. condição CT na mesma sessão;

@ p < 0,05 vs. condição PS na sessão 1 (teste de Student pareado). Valores em média ± erro

padrão.

84

Figura 33: Pico de frequência de ritmo teta hipocampal nas condições controle (CT) e privação

de sono por 72 horas (PS) na tarefa de reconhecimento de objetos. Nenhuma diferença

significativa foi encontrada (teste t de Student pareado). Valores em média ± erro padrão.

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Sessão 1 Sessão 2

Pic

o d

e F

rqu

ên

cia

(Hz)

CT

PS

85

5.3. DISCUSSÃO PARCIAL

Os resultados obtidos no Experimento 1 mostram que, quando ratos são

privados de sono por 72 h, estes apresentam prejuízo significativo no

desempenho da tarefa de reconhecimento de objetos. Estudos prévios têm

demonstrado que a privação de sono entre as sessões da tarefa induz piora no

desempenho da mesma (Palchykova et. al, 2006; Rolls et al., 2011; Binder et

al., 2011), ao passo que nosso trabalho descreve pela primeira vez os efeitos

da privação de sono prévia à apresentação da TRO. Nossos dados mostram

ainda que, na condição de privação de sono, há redução da atividade

exploratória tanto durante a primeira quanto na segunda sessão da tarefa.

Com relação ao intervalo entre sessões da tarefa, nossos dados

demonstraram que a prévia privação de sono por 72 h induziu aumento de

sono paradoxal e redução de sono de ondas lentas, enquanto que a duração

da vigília não foi alterada. Esses dados estão de acordo com os obtidos por

Ravassard et al. (2009), que aplicaram o mesmo procedimento de privação de

sono e avaliaram seu rebote durante 150 minutos. Não foram encontradas

diferenças significativas no número de episódios ou duração média por

episódio, tanto do sono paradoxal como do sono de ondas lentas.

Provavelmente, o pequeno número amostral de nosso experimento não

permitiu analisar com precisão a qual fator se deveu o aumento e a diminuição

destas fases. Por outro lado, uma explicação alternativa seria a de que houve

uma combinação de aumentos graduais tanto no número de episódios quanto

na duração por episódio de sono paradoxal, ao passo que o mesmo ocorreu

com a diminuição do sono de ondas lentas.

86

Um aspecto interessante quanto ao rebote de sono paradoxal,

especialmente entre sessões de uma tarefa de memória, é que ele pode estar

promovendo, ou sustentando, uma redução de sono de ondas lentas. Moreira

(2011) apresentou um argumento interessante quanto aos efeitos deletérios da

privação de sono em tarefas de memória, relacionando o rebote de sono – e

sua consequente desorganização dos estados do ciclo sono-vigília – como um

fator a ser considerado na consolidação de uma versão da tarefa de esquiva

inibitória (esquiva inibitória por múltiplas tentativa). Em sua tese, Moreira (2011)

demonstrou que ratos apresentam aumento na duração média de episódio de

sono de ondas lentas nas primeiras horas após serem treinados na tarefa de

esquiva inibitória. Por outro lado, ratos privados de sono por 96 h, treinados ou

não nessa tarefa, apresentam redução de sono de ondas lentas e aumento de

sono paradoxal durante o rebote (Machado et al., 2004, Moreira, 2011). De

forma similar, Binder et al. (2011) encontraram aumento da atividade do ritmo

delta durante o sono de ondas lentas de ratos treinados numa versão espacial

da tarefa de reconhecimento de objetos, reforçando o envolvimento dessa fase

do sono na consolidação de tarefas hipocampo dependentes. Tomados em

conjunto, esses dados sugerem que a redução do sono de ondas lentas,

verificada entre as sessões da tarefa, pode estar relacionada ao prejuízo

subsequente dos animais na discriminação do objeto novo em relação ao

antigo.

Além das alterações observadas na quantidade de exploração dos

objetos entre as condições controle e privação de sono, buscamos analisar a

atividade hipocampal durante o comportamento exploratório, a fim de estimar

se o processamento de informações encontra-se reduzido após a privação de

87

sono. Assim, os resultados do Experimento 2 mostram que a potência do ritmo

teta hipocampal não difere na primeira sessão entre as condições, ao passo

que é verificada redução do ritmo na condição controle em relação a condição

de privação de sono. Por outro lado, uma análise mais detalhada mostra que,

durante a sessão 1, a condição de PS apresenta uma redução do ritmo teta

tipo 2 em relação à condição controle. Por outro lado, foi verificado aumento do

ritmo teta tipo 1 na condição de PS em relação ao controle na sessão 2. Com

relação a alterações entre sessões, foi verificado que o ritmo teta total é

reduzido na condição controle da sessão 1 para sessão 2, ao passo que foi

observado aumento do ritmo teta tipo 2 na condição de privação de sono.

A redução do ritmo teta tipo 2 durante a primeira sessão da TRO sugere

uma relação causal entre os efeitos da PS na atividade hipocampal, associada

com traços de memória. Nesse sentido, Yang et al. (2010) demonstraram que

ratos apresentam aumento do ritmo teta tipo 2 concomitantemente ao

treinamento da versão espacial do labirinto aquático de Morris, ao passo que

ambos os efeitos são abolidos com a privação de sono. Dessa forma, é

plausível que os prejuízos de aprendizagem decorrentes da PS, tais como os

baixos índices de exploração na sessão 1 da TRO (Experimento 1), estejam

associados com uma perturbação dos mecanismos eletrofisiológicos

relacionados à plasticidade na formação hipocampal, como a redução da LTP

(Ravassard et al., 2009). Por outro lado, a ausência de diferenças no ritmo teta

tipo 2 durante a segunda sessão da TRO sugere que a perturbação induzida

pela PS é transitória, e que pode ser revertida com a oportunidade de dormir

após a privação de sono. Novamente, esta observação está de acordo com

Ravassard et al., (2009), que demonstraram que a redução da LTP hipocampal

88

induzida pela PS pode ser revertida com uma recuperação breve de 150

minutos de sono.

Os efeitos da PS relacionados ao ritmo teta tipo 1 são menos evidentes,

uma vez que este ritmo está mais envolvido com movimentos voluntários e

exploração ativa (Buzsaki et al., 2002). Em razão das análises terem sido

realizadas com registros obtidos apenas durante atividade exploratória, é

curioso constatar que há uma diferença desse ritmo na segunda sessão da

tarefa entre as condições experimentais. Uma possível explicação reside num

estudo realizado por Nerad e Bilkey (2005), que demonstraram a presença de

uma faixa específica de oscilações (10-12 Hz), denominada flutter, que está

envolvida no reconhecimento de padrões contextuais familiares. O ritmo flutter

pode ocorrer simultaneamente ao ritmo teta hipocampal, de forma a confundir a

mensuração do ritmo teta tipo 1 (Nerad e Bilkey, 2005). Dessa forma, é

plausível que a diferença encontrada entre as condições na segunda sessão

seja devida a modificações do ritmo flutter. Assim, animais na condição

controle tenderiam a apresentar um flutter reduzido na segunda sessão de

TRO, em função deste ritmo diminuir na presença de pistas contextuais novas

(i.e. a presença do objeto novo, Nerad e Bilkey, 2005). Por outro lado, quando

os animais estavam privados de sono, não puderam se habituar de forma

eficiente às pistas contextuais disponíveis na primeira sessão de TRO, devido à

baixa atividade exploratória combinada com a potência reduzida do teta tipo 2.

Dessa forma, o ritmo flutter e, consequentemente, o ritmo teta tipo 1, não

estavam modificados na segunda sessão. Mais estudos serão necessários

para investigar o envolvimento deste ritmo nos efeitos induzidos pela privação

de sono.

89

6. DISCUSSÃO GERAL

Um dos objetivos do presente estudo foi avaliar o envolvimento dos

receptores AMPA no prejuízo de desempenho de tarefas dependentes do

hipocampo. Assim, na primeira etapa foram investigados os efeitos da privação

de sono sobre aspectos neuroquímicos e moleculares dos receptores AMPA,

bem como a ação de fármacos que atuam nestes receptores visando a

prevenção do prejuízo de desempenho em tarefas de memória emocional

aversiva. Por sua vez, a segunda etapa teve como objetivo analisar a atividade

eletrofisiológica da formação hipocampal no momento em que ratos privados

de sono são expostos a uma tarefa de reconhecimento de objetos, em busca

de elementos que auxiliem a compreensão dos efeitos da privação de sono em

tarefas hipocampo dependentes.

Na primeira etapa, foi revelada a redução seletiva da marcação do

receptor AMPA na formação hipocampal após a privação de sono por 96 h, e

que tal efeito desapareceu com a oportunidade de recuperação de sono por 24

h. Estes achados estão alinhados com dados obtidos por Ravassard et al.

(2009) e parcialmente com o estudo de Hagewoud et al. (2009). É sabido que

os receptores AMPA estão envolvidos com a formação de memórias, e que

neuropatologias ou intervenções farmacológicas que resultam numa redução

de sua função estão associados com prejuízos cognitivos, seja em humanos ou

em animais. Outrossim, a evidência de redução de receptores AMPA após a

privação de sono fornece uma explicação plausível para os prejuízos de

memória nessa condição.

90

Nossas análises de hibridização in situ não revelaram alteração da

transcrição da subunidade GluR1 nas subáreas hipocampais de ratos privados

de sono. Tal ausência de efeito distingue os efeitos da privação de sono sobre

os receptores AMPA em relação ao mal de Alzheimer e a isquemia cerebral,

patologias em que são identificadas redução da transcrição das subunidades

que compõe o receptor. Ravassard et al. (2009) e Hagewoud et al. (2009)

argumentam que a redução da função dos receptores após a privação de sono

é causada por processos pós transcricionais, tais como ancoramento de

receptores AMPA à membrana do terminal pós sináptico e a fosforilação de

aminoácidos que modulam a atividade do receptor.

A evidência da redução de receptores AMPA hipocampais após PS

direcionou a busca por estratégias farmacológicas que pudessem prevenir os

prejuízos induzidos por essa condição na tarefa de esquiva inibitória. Dessa

forma, duas abordagens principais foram propostas: aumento da função dos

receptores AMPA pelo tratamento com um potenciador (aniracetam), e a

prevenção da redução dos receptores por meio do tratamento crônico com um

antagonista (GYKI 52466). Dentre elas, apenas o tratamento sistêmico com

aniracetam surtiu o efeito esperado, e apenas na maior dose utilizada. Estes

resultados encontram consonância com um estudo realizado em humanos

privados de sono, cujos prejuízos cognitivos foram revertidos com uma dose

alta de potenciador de receptores AMPA (Boyle et al., 2011).

Os resultados obtidos pelo tratamento com aniracetam motivaram a

realização de um experimento complementar que conjugasse testes de

memória hipocampal vs. não hipocampal e um tratamento local no hipocampo

de ratos privados de sono. Ao injetar aniracetam diretamente no hipocampo de

91

ratos privados de sono, logo antes de serem treinados numa tarefa de

condicionamento de medo, esperávamos encontrar melhora de desempenho

no teste de condicionamento de medo ao contexto. Ao contrário de nossas

expectativas, não encontramos efeitos do fármaco, o que nos sugere que

talvez seja necessário o tratamento de todas as subáreas da formação

hipocampal para que ratos privados de sono possam desempenhar bem o

módulo contextual do condicionamento de medo, haja vista que a

administração da droga se restringiu à porção dorsal de CA1. Por sua vez, o

teste de condicionamento de medo ao som confirmou a especificidade do

prejuízo de memória dos ratos privados de sono, ao não ser encontradas

diferenças de desempenho dos animais controles e privados.

Os dados obtidos na primeira etapa fornecem as bases para uma

expansão da reversão de efeitos deletérios da PS sobre a atividade

hipocampal. Por exemplo, diversos estudos de potenciação sináptica de longo

prazo (LTP) mostram que esta encontra-se reduzida no hipocampo de ratos

privados de sono (Campbell et al., 2002; Mcdermott et al., 2003, 2006).

Considerando as evidências de que a aplicação de aniracetam facilita a

potenciação sináptica das subáreas hipocampais (Rao et al. 2001; Satoh et al.

1986; Arai e Lynch 1992), e de que a tarefa de esquiva inibitória compartilha

efeitos similares a uma LTP hipocampal (Whitlock et al., 2006), seria

interessante verificar se o mesmo tratamento com aniracetam, aplicado no

experimento 2-1 da primeira etapa, poderia ser replicado num modelo

eletrofisiológico putativo de formação de memória em ratos privados de sono.

Um aspecto importante da atividade hipocampal é seu ritmo teta,

geralmente associado com processamento de informações do ambiente e

92

desempenho cognitivo. O ritmo teta hipocampal está relacionado tanto a

tarefas de memórias como a potenciação sináptica de longo prazo, haja vista

que uma das formas de indução de LTP é a estimulação sob a mesma faixa do

ritmo teta tipo 2 (Greenstein et al., 1988; Larson et al., 1986). No entanto, há

poucos dados na literatura relacionando os prejuízos de memória decorrentes

da privação de sono com modificações do ritmo teta hipocampal (Yang et al.,

2011). Em vista disso, realizamos uma série de experimentos na segunda

etapa, no intuito de investigar o ritmo teta de animais privados de sono durante

a aprendizagem e evocação de uma tarefa de reconhecimento de objetos.

Como esperado, pudemos constatar que a privação de sono por 72 h induziu

prejuízo no desempenho da tarefa, tanto durante a sessão de treino como na

sessão de teste, sendo observada uma redução do comportamento

exploratório. Além disso, verificamos que o rebote de sono entre as sessões da

tarefa induziu aumento de sono paradoxal e redução do sono de ondas lentas.

Este último efeito pode estar implicado diretamente com o desempenho dos

animais na tarefa, uma vez que evidências recentes apontam o envolvimento

do sono de ondas lentas na consolidação de tarefas hipocampo dependentes,

como a esquiva inibitória (Moreira, 2011) e a versão espacial de

reconhecimento de objetos (Binder et al., 2011).

Com relação aos efeitos da privação de sono por 72 h sobre o ritmo teta

hipocampal na TRO, verificamos que a potência do teta tipo 2 está reduzida

durante a atividade exploratória da primeira sessão da tarefa. Uma vez que o

protocolo de privação de sono de nosso estudo foi idêntico ao de Ravassard et

al. (2009), e ao considerar os efeitos de antagonistas de receptores AMPA na

redução da potência do ritmo teta hipocampal, é plausível supor que haja uma

93

associação entre a redução da função de receptores AMPA após a privação de

sono e a diminuição da potência do ritmo teta tipo 2. Esta hipótese é fortalecida

com a evidência de que não foi encontrada redução do ritmo teta tipo 2 na

atividade exploratória durante a segunda sessão da tarefa em animais privados

de sono. Provavelmente, a oportunidade de rebote de sono entre as sessões

da tarefa promoveu a reversão dos efeitos da PS sobre os receptores AMPA,

de forma a normalizar o ritmo teta tipo 2 na segunda sessão.

Interessantemente, há evidências de que a injeção intrahipocampal de

aniracetam promove um aumento da potência do ritmo teta tipo 2, bem como

melhora de desempenho em uma tarefa de memória operacional espacial, em

ratos tratados com antagonista histaminérgico (Masuoka et al, 2007).

Os dados referentes ao ritmo teta tipo 1 mostram que a condição de PS

induz um aumento de potência desta faixa de frequência na segunda sessão

da tarefa. Em um primeiro momento, tais resultados eram inesperados, haja

vista que este ritmo está envolvido com atividade exploratória. Por outro lado,

nossos dados parecem estar mesclados a um outro tipo de ritmo, denominado

flutter (Nerad e Bilker, 2005). Este ritmo, ainda pouco estudado, diminui de

intensidade conforme o animal encontra elementos novos em seu ambiente. Ao

considerar que os animais privados de sono apresentam um prejuízo de

exploração na primeira sessão da tarefa, associado com uma redução tanto de

receptores AMPA como da potência do ritmo teta tipo 2, parece coerente supor

que não seja detectada uma modificação de elementos contextuais na

condição de PS. Animais na condição controle, por outro lado, estariam mais

habituados aos elementos familiares da primeira sessão, de forma a explorar

94

mais o objeto novo na segunda sessão e, por conseguinte, detectar o novo

elemento do ambiente.

Tomados em conjunto, os dados da primeira e segunda etapas mostram

que a privação de sono induz efeitos seletivos e transitórias em características

neuroquímicas e eletrofisiológicas da formação hipocampal. Tais efeitos estão

intrinsecamente associados com prejuízos em tarefas de memória hipocampo

dependentes, e sugerem uma possível terapia para reverter tais efeitos por

meio de potenciadores de receptores AMPA. Experimentos futuros serão

necessários para agregar estas evidências e aprofundar as implicações do

presente estudo.

95

7. CONCLUSÕES

1. A privação de sono por 96 h induz redução da marcação de receptores

AMPA em subáreas da formação hipocampal, mas não em outras áreas

relacionadas com a formação de memórias.

2. A recuperação de 24 h reverte os efeitos da privação de sono sobre os

receptores AMPA hipocampais.

3. A privação de sono por 96 h não modifica a transcrição da subunidade

GluR1.

4. O tratamento agudo e sistêmico com o potenciador de receptores AMPA

aniracetam promove reversão dos efeitos deletérios da privação de sono

sobre a tarefa de esquiva inibitória.

5. Os tratamentos agudo e crônico com o antagonista de receptores AMPA

GYKI 52466 não interferem com o prejuízo de desempenho na tarefa de

esquiva inibitória de ratos privados de sono.

6. A privação de sono por 72 h induz prejuízo de desempenho da tarefa de

reconhecimento de objetos, associado com alterações do ritmo teta

hipocampal e seus componentes (tipos 1 e 2).

96

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Albensi, B. C.; Oliver, D.R.; Toupin, J.; Odero, G.(2007). Electrical stimulation protocols for

hippocampal synaptic plasticity and neuronal hyper-excitability: Are they effective or relevant?

Exp Neurol, 204( 1), 1-13.

Arai, A.; Lynch, G. (1992). Factors regulating the magnitude of long-term potentiation induced

by theta pattern stimulation. Brain Res, 598( 1-2), 173-84.

Aserinsky, E.; Kleitman, N. (1953). Regularly occurring periods of eye motility, and concomitant

phenomena, during sleep. Science, 118 ( 3062), 273-4.

Bartolini, L.; Casamenti, F.; Pepeu, G. (1996). Aniracetam restores object recognition impaired

by age, scopolamine, and nucleus basalis lesions. Pharmacol Biochem Behav, 53(2), 277-83.

Bear, M. F.; Malenka, R. C. (1994). Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol, 4,

(3), 389-99.

Berger, H. (1929). Über das Elektrenkephalogramm des Menschen. Archiv für Psychiatrie und

Nervenkrankheiten, 87, 44.

Berry, S. D.; Swain, R. A. (1989). Water deprivation optimizes hippocampal activity and

facilitates nictitating membrane conditioning. Behav Neurosci, 103( 1), 71-6.

Bettendorff, L.; Sallanon-Moulin, M.; Touret, M.; Wins, P.; Margineanu I.; Schoffeniels, E.

(1996). Paradoxical sleep deprivation increases the content of glutamate and glutamine in rat

cerebral cortex. Sleep, 19( 1), 65-71.

Binder, S.; Baier, P.C.; Mölle, M.; Inostroza, M.; Born, J.;, Marshall, L. (2011). Sleep enhances

memory consolidation in the hippocampus-dependent object-place recognition task in rats.

Neurobiol Learn Mem.

Bittencourt, L.R.; Santos-Silva, R.; Taddei, J.A.; Andersen, M.L.; de Mello, M.T.; Tufik, S.

(2009). Sleep complaints in the adult Brazilian population: a national survey based on

screening questions. J Clin Sleep Med, 5(5), 459-63.

Bliss, T. V.; Collingridge, G. L. (1993).A synaptic model of memory: long-term potentiation in the

hippocampus. Nature, 361( 6407), 31-9.

Block, F.; Schwarz, M. (1997). Correlation between hippocampal neuronal damage and spatial

learning deficit due to global ischemia. Pharmacol Biochem Behav, 56(4), 755-61.

97

Bódizs, R.; Kántor, S.; Szabó, G.; Szûcs, A.; Erõss, L.; Halász, P. (2001). Rhythmic

hippocampal slow oscillation characterizes REM sleep in humans. Hippocampus, 11(6), 747-53.

Bonini, J.S.; Rodrigues, L.; Kerr, D.S.; Bevilaqua, L.R.; Cammarota, M.; Izquierdo, I. (2003).

AMPA/kainate and group-I metabotropic receptor antagonists infused into different brain areas

impair memory formation of inhibitory avoidance in rats. Behav Pharmacol, 14(2), 161-6.

Bonnet, M. H.; Arand, D. L. (2003). Clinical effects of sleep fragmentation versus sleep

deprivation. Sleep Med Rev, 7( 4), 297-310.

Boyle, J.; Stanley, N.; James, L.M.; Wright, N.; Johnsen, S.; Arbon, E.L.; Dijk, D.J.(2011).

Acute sleep deprivation: the effects of the AMPAKINE compound CX717 on human cognitive

performance, alertness and recovery sleep. J Psychopharmacol.

Bueno, O. F.; Lobo, L.L.; Oliveira, M.G.; Gugliano, E.B.; Pomarico, A.C.; Tufik, S. (1994).

Dissociated paradoxical sleep deprivation effects on inhibitory avoidance and conditioned fear.

Physiol Behav, 56(4), 775-9.

Buzsaki, G. (2002). Theta oscillations in the hippocampus. Neuron, 33(3), 325-40.

Buzsaki, G.; Leung, L. W.; Vanderwolf, C. H. (1983) Cellular bases of hippocampal EEG in the

behaving rat. Brain Res, 287(2), 139-71.

Cammarota, M.; Bernabeu, R.; Izquierdo, I.; Medina, J.H. (1996). Reversible changes in

hippocampal 3H-AMPA binding following inhibitory avoidance training in the rat. Neurobiol

Learn Mem, 66(1), 85-8.

Cammarota, M.; Izquierdo, I.; Wolfman, C.; Levi de Stein, M.; Bernabeu, R.; Jerusalinsky, D.;

Medina, J.H. (1995). Inhibitory avoidance training induces rapid and selective changes in

3[H]AMPA receptor binding in the rat hippocampal formation. Neurobiol Learn Mem, 64(3), 257-

64.

Campbell, I. G.; Guinan, M. J.; Horowitz, J. M. (2002). Sleep deprivation impairs long-term

potentiation in rat hippocampal slices. J Neurophysiol, 88(2), 1073-6.

Cohen, H. B.; Dement, W. C. (1965). Sleep: changes in threshold to electroconvulsive shock in

rats after deprivation of "paradoxical" phase. Science, 150(3701), 1318-9.

Corsi-Cabrera, M.; Ponce-De-Leon, M.; Juarez, J.; Ramos, J. (1994). Effects of paradoxical

sleep deprivation and stress on the waking EEG of the rat. Physiol Behav, 55(6), 1021-7.

98

Csicsvari, J.; Hirase, H.; Czurkó, A.; Mamiya, A.; Buzsáki, G. (1999). Fast network oscillations in

the hippocampal CA1 region of the behaving rat. J Neurosci, 19(16), RC20.

Cumin, R.; Bandle, E.F.; Gamzu, E.; Haefely, W.E. (1982). Effects of the novel compound

aniracetam (Ro 13-5057) upon impaired learning and memory in rodents. Psychopharmacology

(Berl), 78(2), 104-11.

Dametto, M.; Suchecki, D.; Bueno, O.F.; Moreira, K.M.; Tufik, S.; Oliveira, M.G. (2002). Social

stress does not interact with paradoxical sleep deprivation-induced memory impairment. Behav

Brain Res, 129( 1-2), 171-8.

Danysz, W.; Essmann, U.; Bresink, I.; Wilke, R. (1994). Glutamate antagonists have different

effects on spontaneous locomotor activity in rats. Pharmacol Biochem Behav, 48(1), 111-8.

Dere, E.; Huston, J. P.; De Souza Silva, M. A. (2007). The pharmacology, neuroanatomy and

neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci Biobehav Rev, 31(5), 673-704.

Dewar, D.; Chalmers, D.T.; Graham, D.I.; McCulloch, J. (1991). Glutamate metabotropic and

AMPA binding sites are reduced in Alzheimer's disease: an autoradiographic study of the

hippocampus. Brain Res, 553(1), 58-64.

Dickey, C. A.; Loring, J.F.; Montgomery, J.; Gordon, M.N.; Eastman, P.S.; Morgan, D.

Selectively reduced expression of synaptic plasticity-related genes in amyloid precursor protein

+ presenilin-1 transgenic mice. J Neurosci, 23(12), 5219-26.

Drummond, S.P.; Brown, G.G.; Gillin, J.C.; Stricker, J.L.; Wong, E.C.; Buxton, R.B. (2000).

Altered brain response to verbal learning following sleep deprivation. Nature, 403(6770), 655-7.

Dubiela, F.P.; Oliveira, M.G.; Moreira, K.M.; Nobrega, J.N.; Tufik, S.; Hipólide, D.C. (2005).

Learning deficits induced by sleep deprivation and recovery are not associated with altered

[(3)H]muscimol and [(3)H]flunitrazepam binding. Brain Res, 1037(1-2), 157-63.

Dubiela, F.P.; Messias, M.F.; Moreira, K.D.; Zanlorenci, L.H.; Grassl, C.; Filho, R.F.; Nobrega,

J.N.; Tufik, S.; Hipólide, D.C. Reciprocal interactions between MK-801, sleep deprivation and

recovery in modulating rat behaviour. Behav Brain Res, 216(1), 180-5.

Dubiela, F.P.; Oliveira, M.G.; Moreira, K.M.; Nobrega, J.N.; Tufik, S.; Hipólide, D.C.(2010)

.Inverse benzodiazepine agonist beta-CCM does not reverse learning deficit induced by sleep

deprivation. Neurosci Lett, 469(1), 169-73.

99

Eichenbaum, H. (2000). A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nat Rev

Neurosci, 1(1), 41-50.

Elger, B.; Huth, A.; Neuhaus, R.; Ottow, E.; Schneider, H.; Seilheimer, B.; Turski, L. (2005).

Novel alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate (AMPA) receptor antagonists of

2,3-benzodiazepine type: chemical synthesis, in vitro characterization, and in vivo prevention of

acute neurodegeneration. J Med Chem, 48(14), 4618-27.

Esteban, J.A.; Shi, S.H.; Wilson, C.; Nuriya, M.; Huganir, R.L.; Malinow, R. (2003). PKA

phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.

Nat Neurosci, 6(2), 136-43.

Gervasoni, D.; Lin, S.C.; Ribeiro, S.; Soares, E.S.; Pantoja, J.; Nicolelis, M.A. (2004). Global

forebrain dynamics predict rat behavioral states and their transitions. J Neurosci, 24(49), 11137-

47.

Givens, B.; Olton, D. S. (1995). Bidirectional modulation of scopolamine-induced working

memory impairments by muscarinic activation of the medial septal area. Neurobiol Learn Mem,

63(3), 269-76.

Goosens, K. A.; Maren, S. (2001). Contextual and auditory fear conditioning are mediated by

the lateral, basal, and central amygdaloid nuclei in rats. Learn Mem, 8(3), 148-55.

Gouliaev, A. H.; Senning, A. (1994). Piracetam and other structurally related nootropics. Brain

Res Brain Res Rev, 19(2), 180-222.

Grahnstedt, S.; Ursin, R. (1985). Platform sleep deprivation affects deep slow wave sleep in

addition to REM sleep. Behav Brain Res, 18(3), 233-9.

Greenstein, Y. J.; Pavlides, C.; Winson, J. (1988). Long-term potentiation in the dentate gyrus is

preferentially induced at theta rhythm periodicity. Brain Res, 438(1-2), 331-4.

Gyertyan, I.; Gigler, G.; Simo, A. (1999). The neu roprotective and hypothermic effect of

GYKI-52466, a non-competitive alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid-

antagonist on histological and behavioural variables in the gerbil global ischemia model. Brain

Res Bull, 50(3), 179-86.

Hagewoud, R.; Havekes, R.; Novati, A.; Keijser, J.N.; Van der Zee, E.A.; Meerlo, P. (2010).

Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces hippocampal AMPA receptor

phosphorylation. J Sleep Res, 19(2), 280-8.

100

Harrison, Y.; Horne, J. A. (2000). Sleep loss and temporal memory. Q J Exp Psychol A, 53(1),

271-9.

Hayashi, Y.; Shi, S.H.; Esteban, J.A.; Piccini, A.; Poncer, J.C.; Malinow, R. (2000).Driving

AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain

interaction. Science, 287(5461), 2262-7.

Izquierdo, I.; Medina, J. H. Memory formation: the sequence of biochemical events in the

hippocampus and its connection to activity in other brain structures. Neurobiol Learn Mem,

68(3), 285-316.

Izquierdo, I.; Medina, J.H.; Bianchin, M.; Walz, R.; Zanatta, M.S.; Da Silva, R.C.; Bueno e Silva,

M.; Ruschel, A.C.; Paczko, N. (1993). Memory processing by the limbic system: role of specific

neurotransmitter systems. Behav Brain Res, 58(1-2), 91-8.

Jin, R.; Clark, S.; Weeks, A.M.; Dudman, J.T.; Gouaux, E.; Partin, K.M. (2005). Mechanism of

positive allosteric modulators acting on AMPA receptors. J Neurosci, 25(39), 9027-36.

Jouvet, D.; Vimont, P.; Delorme, F. (1964). Study Of Selective Deprivation Of The Paradoxal

Phase Of Sleep In The Cat. J Physiol (Paris), 56(381).

Jouvet, M. (1969). Biogenic amines and the states of sleep. Science, 163(3862), 32-41.

Kandel, E. R. ; Schwartz, J. H. ; Jessell, T. M. Principles of Neural Science, quarta edição,

Editora McGraw-HillMichigan, Michigan, 2008, 1414 p.

Kim, J. J.; Fanselow, M. S. (1992). Modality-specific retrograde amnesia of fear. Science,

256(5057), 675-7.

Kostandy, B. B. (2011). The role of glutamate in neuronal ischemic injury: the role of spark in

fire. Neurol Sci.

Kralik, J.D.; Dimitrov, D.F.; Krupa, D.J.; Katz, D.B.; Cohen, D.; Nicolelis, M.A.

(2001).Techniques for long-term multisite neuronal ensemble recordings in behaving animals.

Methods, 25(2), 121-50.

Kramis, R.; Vanderwolf, C. H.; Bland, B. H. (1975). Two types of hippocampal rhythmical slow

activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether,

urethane, and pentobarbital. Exp Neurol, 49(1 Pt 1), 58-85.

Larson, J.; Wong, D.; Lynch, G. (1986). Patterned stimulation at the theta frequency is optimal

for the induction of hippocampal long-term potentiation. Brain Res, 368(2), 347-50.

101

Leung, L. S.; Shen, B. (2004). Glutamatergic synaptic transmission participates in generating

the hippocampal EEG. Hippocampus, 14(4), 510-25.

Lu, Y.; Wehner, J. M. (1997). Enhancement of contextual fear-conditioning by putative (+/-)-

alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid (AMPA) receptor modulators and N-

methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonists in DBA/2J mice. Brain Res, 768(1-2), 197-

207.

Machado, R.B.; Hipólide, D.C.; Benedito-Silva, A.A.; Tufik, S. (2004). Sleep deprivation induced

by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery. Brain

Res, 1004(1-2), 45-51.

Macrides, F.; Eichenbaum, H. B.; Forbes, W. B. Temporal relationship between sniffing and the

limbic theta rhythm during odor discrimination reversal learning. J Neurosci, 2(12), 1705-17.

Maren, S.; Tocco, G.; Standley, S.; Baudry, M.; Thompson, R.F. (1993). Postsynaptic factors in

the expression of long-term potentiation (LTP): increased glutamate receptor binding following

LTP induction in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 90(20), 9654-8.

Marques, N.; Menna-Barreto, L. Cronobiologia: princípios e aplicações, EDUSP/Fiocruz, São

Paulo/Rio de Janeiro , 1997, 320 p.

Masuoka, T.; Mikami, A.; Yasuda, M.; Shinomiya, K.; Kamei, C.(2007). Effects of histamine H(1)

receptor antagonists on hippocampal theta rhythm during spatial memory performance in rats.

Eur J Pharmacol, 576(1-3), 77-82.

McDermott, C.M.; Hardy, M.N.; Bazan, N.G.; Magee, J.C. (2006). Sleep deprivation-induced

alterations in excitatory synaptic transmission in the CA1 region of the rat hippocampus. J

Physiol, 570(Pt 3), 553-65.

McDermott, C.M.; LaHoste, G.J.; Chen, C.; Musto, A.; Bazan, N.G.; Magee, J.C. (2003).Sleep

deprivation causes behavioral, synaptic, and membrane excitability alterations in hippocampal

neurons. J Neurosci, 23(29), 9687-95.

McGaugh, J.L.; Introini-Collison, I.B.; Nagahara, A.H.; Cahill, L.; Brioni, J.D.; Castellano, C.

(1990). Involvement of the amygdaloid complex in neuromodulatory influences on memory

storage. Neurosci Biobehav Rev, 14(4), 425-31.

Mednick, S.C.; Nakayama, K.; Cantero, J.L.; Atienza, M.; Levin, A.A.; Pathak, N.; Stickgold, R.

(2002). The restorative effect of naps on perceptual deterioration. Nat Neurosci, 5(7), 677-81.

102

Mohammed, H.S.; Aboul Ezz, H.S.; Khadrawy, Y.A.; Noor, N.A. (2011).Neurochemical and

electrophysiological changes induced by paradoxical sleep deprivation in rats. Behav Brain Res,

225(1), 39-46.

Monaghan, D.T.; Wenthold, R.J. The Ionotropic Glutamate Receptors, Humana Press, Totowa,

1997, 378 p.

Montgomery, S. M.; Betancur, M. I.; Buzsaki, G. (2009). Behavior-dependent coordination of

multiple theta dipoles in the hippocampus. J Neurosci, 29(5), 1381-94.

Montori, S.; Dos Anjos, S.; Ríos-Granja, M.A.; Pérez-García, C.C.; Fernández-López, A.;

Martínez-Villayandre, B.(2010). AMPA receptor downregulation induced by

ischaemia/reperfusion is attenuated by age and blocked by meloxicam. Neuropathol Appl

Neurobiol, 36(5), 436-47.

Moreira, K.M.; Ferreira, T.L.; Hipolide, D.C.; Fornari, R.V.; Tufik, S.; Oliveira, M.G. (2010)

Modafinil prevents inhibitory avoidance memory deficit induced by sleep deprivation in rats.

Sleep, 33(7), 990-3.

Moreira KM; Hipólide DC; Nobrega JN; Bueno OF; Tufik S; Oliveira MG.(2003). Deficits in

avoidance responding after paradoxical sleep deprivation are not associated with altered

[3H]pirenzepine binding to M1 muscarinic receptors in rat brain. Brain Res, 977(1), 31-7.

Moreira KM. Relação do desempenho de ratos em uma tarefa de esquiva inibitória com o

padrão polissonográfico, [tese de doutorado] Universidade Federal de São Paulo, São Paulo:

2011.

Morris, G. O.; Williams, H. L.; Lubin, A.(1960). Misperception and Disorientation During Sleep-

Deprivation. Archives of General Psychiatry, 2(3), 247-254.

National Sleep Foundation. (2002). “Sleep in America” poll. 1–52. URL:

http://www.sleepfoundation.org.

Nerad, L.; Bilkey, D. K. (2005). Ten- to 12-Hz EEG oscillation in the rat hippocampus and rhinal

cortex that is modulated by environmental familiarity. J Neurophysiol, 93(3), 1246-54.

Nicolelis, M.A.; Ghazanfar, A.A.; Faggin, B.M.; Votaw, .S; Oliveira, L.M. (1997).Reconstructing

the engram: simultaneous, multisite, many single neuron recordings. Neuron, 18(4).

Nunes, J.R.; G.P.; TUFIK, S. (1994). Validation of the modified multiple platform method (MPM)

of paradoxical sleep deprivation in rats. Sleep Research, 22, 339.

http://www.sleepfoundation.org/

103

O'Keefe, J. (1990). A computational theory of the hippocampal cognitive map. Prog Brain Res,

83), 301-12.

O'Neill, M.J.; Bleakman, D.; Zimmerman, D.M.; Nisenbaum, E.S. (2004). AMPA receptor

potentiators for the treatment of CNS disorders. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 3(3),

181-94.

Onen, S.H.; Alloui, A.; Eschalier, A.; Dubray, C. (2000). Vocalization thresholds related to

noxious paw pressure are decreased by paradoxical sleep deprivation and increased after sleep

recovery in rat. Neurosci Lett. 291, 25-8.

Palchykova, S.; Winsky-Sommerer, R.; Meerlo, P.; Dürr, R.; Tobler, I. (2006). Sleep deprivation

impairs object recognition in mice. Neurobiol Learn Mem, 85(3), 263-71.

Pan, W. X.; Mcnaughton, N.(1997). The medial supramammillary nucleus, spatial learning and

the frequency of hippocampal theta activity. Brain Res, 764(1-2), 101-8.

Pape, H.C.; Narayanan, R.T.; Smid, J.; Stork, O.; Seidenbecher, T. (2005).Theta activity in

neurons and networks of the amygdala related to long-term fear memory. Hippocampus, 15(7),

874-80.

Paxinos, G.; Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, fourth edition, Academic

Press, New York, 1998, 256 p.

Pearlman, C. A. (1979). Rem-Sleep and Information-Processing - Evidence from Animal

Studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 3(2), 57-68.

Pellegrini-Giampietro, D. E.; Bennett, M. V.; Zukin, R. S. (1994). AMPA/kainate receptor gene

expression in normal and Alzheimer's disease hippocampus. Neuroscience, 61(1), 41-9.

Phillips, R. G.; Ledoux, J. E. (1992). Differential contribution of amygdala and hippocampus to

cued and contextual fear conditioning. Behav Neurosci, 106(2), 274-85.

Phillips, R. G.; Ledoux, J. E. (1994). Lesions of the dorsal hippocampal formation interfere with

background but not foreground contextual fear conditioning. Learn Mem, 1(1), 34-44.

Platt, S.R. (2007). The role of glutamate in central nervous system health and disease: A

review. The Veterinary Journal, 173, 278-286.

Porrino, L.J.; Daunais, J.B.; Rogers, G.A.; Hampson, R.E.; Deadwyler, S.A.(2005). Facilitation

of task performance and removal of the effects of sleep deprivation by an ampakine (CX717) in

nonhuman primates. PLoS Biol, 3(9), e299.

104

Puma, C.; Bizot, J. C. (1999). Hippocampal theta rhythm in anesthetized rats: role of AMPA

glutamate receptors. Neuroreport, 10(11), 2297-300.

Rao, Y.; Xiao, P.; Xu, S. (2001). Effects of intrahippocampal aniracetam treatment on Y-maze

avoidance learning performance and behavioral long-term potentiation in dentate gyrus in rat.

Neurosci Lett, 298(3), 183-6.

Ravassard, P.; Pachoud, B.; Comte, J.C.; Mejia-Perez, C.; Scoté-Blachon, C.; Gay, N.;

Claustrat, B.; Touret, M.; Luppi, P.H.; Salin, P.A. (2009). Paradoxical (REM) sleep deprivation

causes a large and rapidly reversible decrease in long-term potentiation, synaptic transmission,

glutamate receptor protein levels, and ERK/MAPK activation in the dorsal hippocampus. Sleep,

32(2), 227-40.

Ribeiro, S.; Goyal, V.; Mello, C.V.; Pavlides, C. (1999). Brain gene expression during REM

sleep depends on prior waking experience. Learning & Memory, 6(5), 500-508.

Ribeiro, S.; Mello, C.V.; Velho, T.; Gardner, T.J.; Jarvis; E.D.; Pavlides, C.(2002). Induction of

hippocampal long-term potentiation during waking leads to increased extrahippocampal zif-268

expression during ensuing rapid-eye-movement sleep. Journal of Neuroscience, 22(24), 10914-

10923.

Ribeiro, S.; Nicolelis, M. A. L. (2004). Reverberation, storage, and postsynaptic propagation of

memories during sleep. Learning & Memory, 11(6), 686-696.

Rolls, A.; Colas, D.; Adamantidis, A.; Carter, M.; Lanre-Amos, T.; Heller, H.C.; de Lecea, L.

(2011). Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad

Sci U S A, 108(32), 13305-10.

Ruel, J.; Guitton, M. J.; Puell, J. L. (2002). Negative allosteric modulation of AMPA-preferring

receptors by the selective isomer GYKI 53784 (LY303070), a specific non-competitive AMPA

antagonist. CNS Drug Rev, 8(3), 235-54.

Ruskin, D.N.; Liu, C.; Dunn, K.E.; Bazan, N.G.; LaHoste, G.J. (2004).Sleep deprivation impairs

hippocampus-mediated contextual learning but not amygdala-mediated cued learning in rats.

Eur J Neurosci, 19(11), 3121-4.

Santos-Silva, R.; Bittencourt, L.R.; Pires, M.L.; de Mello, M.T.; Taddei, J.A.; Benedito-Silva,

A.A.; Pompeia, C.; Tufik, S. (2010).Increasing trends of sleep complaints in the city of Sao

Paulo, Brazil. Sleep Med, 11(6), 520-4.

105

Satoh, M.; Ishihara, K.; Iwama, T.; Takagi, H. (1986). Aniracetam augments, and midazolam

inhibits, the long-term potentiation in guinea-pig hippocampal slices. Neurosci Lett, 68(2), 216-

20.

Seidenbecher, T.; Laxmi, T.R.; Stork, O.; Pape, H.C. (2003). Amygdalar and hippocampal theta

rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science, 301(5634), 846-50.

Shi, S.; Hayashi, Y.; Esteban, J.A.; Malinow, R. (2001). Subunit-specific rules governing AMPA

receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell, 105(3), 331-43.

Siegel, J. M. Do all animals sleep? Trends Neurosci, 31(4), 208-13.

Sinha, A.K.; Azevedo, R.; Chi, O.Z.; Weiss, H.R. (2004). Down-regulation of AMPA glutamate

receptors reduces cerebrocortical metabolic response to stimulation. Neurochem Res, 29(7),

1425-30.

Sinha, A.K.; Mirza, A.H.; Liu, X.; Chi, O.Z.; Weiss, H.R.(1999). Effect of upregulation of AMPA

glutamate receptors on cerebral O(2) consumption and blood flow in rat. Brain Res, 842(1), 230-

2.

Smith, C. (1995). Sleep states and memory processes. Behav Brain Res, 69(1-2), 137-45.

Smith, C.; Lapp, L. (1991). Increases in number of REMS and REM density in humans following

an intensive learning period. Sleep, 14(4), 325-30.

Smith, C.; Rose, G. M. (1997). Posttraining paradoxical sleep in rats is increased after spatial

learning in the Morris water maze. Behavioral Neuroscience, 111(6), 1197-1204.

Sommer, C.; Fahrner, A.; Kiessling, M. (2002). [3H]muscimol binding to gamma-aminobutyric

acid(A) receptors is upregulated in CA1 neurons of the gerbil hippocampus in the ischemia-

tolerant state. Stroke, 33(6), 1698-705.

Squire, L. R. (1992). Memory and the hippocampus: a synthesis from findings with rats,

monkeys, and humans. Psychol Rev, 99(2), 195-231.

Squire, L. R.; Zola-Morgan, S. (1991). The medial temporal lobe memory system. Science,

253(5026), 1380-6.

Suchecki, D.; Lobo, L.L.; Hipólide, D.C.; Tufik, S. (1998). Increased ACTH and corticosterone

secretion induced by different methods of paradoxical sleep deprivation. J Sleep Res, 7(4), 276-

81.

106

Suchecki, D.; Tufik, S. (2000) Social stability attenuates the stress in the modified multiple

platform method for paradoxical sleep deprivation in the rat. Physiol Behav, 68(3), 309-16.

Timo-Iaria, C.; Negrão, N.; Schmidek, W.R.; Hoshino, K.; Lobato de Menezes, C.E.; Leme da

Rocha, T. (1970). Phases and states of sleep in the rat. Physiol Behav, 5(9), 1057-62.

Tocco, G.; Annala, A.J.; Baudry, M.; Thompson, R.F.(1992). Learning of a hippocampal-

dependent conditioning task changes the binding properties of AMPA receptors in rabbit

hippocampus. Behav Neural Biol, 58(3), 222-31.

Ueki, A.; Miwa, C.; Miyoshi, K. (1994). Impairment in the acquisition of passive and active

avoidance learning tasks due to bilateral entorhinal cortex lesions. J Neurol Sci, 125(1), 14-21.

Van Hulzen, Z. J.; Coenen, A. M. (1981). Paradoxical sleep deprivation and locomotor activity in

rats. Physiol Behav, 27(4), 741-4.

Van Hulzen, Z. J.; Coenen, A. M. (1984).Photically evoked potentials in the visual cortex

following paradoxical sleep deprivation in rats. Physiol Behav, 32(4), 557-63.

Vanderwolf, C. H. (1969). Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat.

Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 26(4), 407-18.

Vyazovskiy, V.V.; Cirelli, C.; Pfister-Genskow, M.; Faraguna, U.; Tononi, G. (2008).Molecular

and electrophysiological evidence for net synaptic potentiation in wake and depression in sleep.

Nat Neurosci, 11(2), 200-8.

Vyazovskiy, V. V.; Tobler, I. (2005). Theta activity in the waking EEG is a marker of sleep

propensity in the rat. Brain Res, 1050(1-2), 64-71.

Walker, M. P.; Stickgold, R. (2006). Sleep, memory, and plasticity. Annu Rev Psychol, 57), 139-

66.

Westerberg, E.; Monaghan, D.T.; Cotman, C.W.; Wieloch, T.(1987). Excitatory amino acid

receptors and ischemic brain damage in the rat. Neurosci Lett, 73(2), 119-24.

Whitlock, J.R.; Heynen, A.J.; Shuler, M.G.; Bear, M.F. (2006). Learning induces long-term

potentiation in the hippocampus. Science, 313(5790), 1093-7.

Xavier GF. Alguns fatores relevantes na interpretação do teste de esquiva passiva. Implicações

para estudos de aprendizagem. [dissertação de mestrado] Universidade Federal de São Paulo:

São Paulo, 1981.

107

Yang, R.H.; Hou, X.H.; Xu, X.N.; Zhang, L.; Shi, J.N.; Wang, F.; Hu, S.J.; Chen, J.Y. (2011).

Sleep deprivation impairs spatial learning and modifies the hippocampal theta rhythm in rats.

Neuroscience, 173), 116-23.

Youngblood, B.D.; Smagin, G.N.; Elkins, P.D.; Ryan, D.H.; Harris, R.B. (1999). The effects of

paradoxical sleep deprivation and valine on spatial learning and brain 5-HT metabolism. Physiol

Behav, 67(5), 643-9.

Youngblood, B.D.; Zhou, J.; Smagin, G.N.; Ryan, D.H.; Harris, R.B. (1997). Sleep deprivation by

the "flower pot" technique and spatial reference memory. Physiol Behav, 61(2), 249-56.

108

9. ANEXO

Rua Botucatu, 572 - 1º andar – conj. 14 - CEP 04023-062 - São Paulo / Brasil Tel.: (011) 5571-1062 - 5539.7162

1

São Paulo, 11 de janeiro de 2008.

CEP 2075/07 IImo(a). Sr(a). Pesquisador(a) DÉBORA CRISTINA HIPÓLIDE Co-Investigadores: Francisco Paulino dubiela e Diva Maria Lima Disciplina/Departamento: Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo Patrocinador: AFIP, CNPq.

PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA INSTITUCIONAL Ref: Projeto de pesquisa intitulado: “Efeitos da privação de sono sobre a plasticidade hipocampal a importância

dos receptores AMPA”.

CARACTERÍSTICA PRINCIPAL DO ESTUDO: EXPERIMENTAL - CATEGORIA D - ESTUDO CRÕNICO.

RISCOS ADICIONAIS PARA O PACIENTE: NÃO SE APLICA.

OBJETIVOS: Avaliar o papel dos receptores AMPA na modulação dos prejuízos de memória dependente de

hipocampo após a privação de sono..

RESUMO: Serão utilizados ratos Wistar machos provenientes do CEDEME da UNIFESP. Os animais serão

mantidos em condições controladas de temperatura e ciclo de claro e escuro com livre acesso ao alimento e água.

Para o procedimento de privação de sono será utilizado o método da plataforma múltipla modificado que será

utilizado para produzir uma privação de sono em animais provenientes da mesma gaiola. Esse modelo tem a

vantagem de ser mais seletivo para os efeitos da privação de sono, por reduzir o envolvimento de variáveis como o

isolamento, a instabilidade social e a imobilização presentes no método da plataforma única..

FUNDAMENTOS E RACIONAL: Diversos estudos mostram que a falta de sono interfere com a formação de novas

memórias, especialmente as dependentes do hipocampo..

MATERIAL E MÉTODO: materiais e métodos adequadamente descritos.

CRONOGRAMA: Adequado.

OBJETIVO ACADÊMICO: Doutorado.

ENTREGA DE RELATÓRIOS PARCIAIS AO CEP PREVISTOS PARA: 10/1/2009 e 10/1/2010.

O Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo ANALISOU e APROVOU

o projeto de pesquisa referenciado.

1. Comunicar toda e qualquer alteração do projeto.

2. Comunicar imediatamente ao Comitê qualquer evento adverso ocorrido durante o desenvolvimento do estudo.

Rua Botucatu, 572 - 1º andar – conj. 14 - CEP 04023-062 - São Paulo / Brasil Tel.: (011) 5571-1062 - 5539.7162

2

3. Os dados individuais de todas as etapas da pesquisa devem ser mantidos em local seguro por 5 anos para

possível auditoria dos órgãos competentes.

Atenciosamente,

Prof. Dr. José Osmar Medina Pestana Coordenador do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/ Hospital São Paulo CEP 2075/07

EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO SOBRE A PLASTICIDADE ... · Por todos os desafios e sugestões que...

Documents

Transcript of EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO SOBRE A PLASTICIDADE ... · Por todos os desafios e sugestões que...