EFEITO DO SOLVENTE NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE...

EFEITO DO SOLVENTE NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE

LIPASES COMERCIAIS IMOBILIZADAS

D. S. de QUEIROZ1, J. M. PARREIRA

1, C. M. B. BASTOS

1, F. M. T. MENDES

2 e M. A. P.

LANGONE1

1 Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Química, Departamento de Química

Analítica, Rua São Francisco Xavier, 524, PHLC, IQ, sl. 310; RJ, RJ, CEP: 20550-013 2 Instituto Nacional de Tecnologia, Avenida Venezuela, 82, Rio de Janeiro, Brasil, CEP 21081-312

E-mail para contato: [email protected]

RESUMO – Biodiesel é um biocombustível obtido a partir da reação de transesterificação

de óleos vegetais com alcoóis de cadeia curta, que pode ser catalisada por lipases

imobilizadas. Para diminuir o custo do processo, o biocatalisador pode ser recuperado,

lavado com solvente e reutilizado. Assim, foram avaliados os efeitos do solvente (etanol,

n-butanol e n-hexano) em três lipases comerciais imobilizadas (Novozym 435, Lipozyme

RM IM, Lipozyme TL IM). Os biocatalisadores foram incubados nos solventes por 2 h a

50 ºC. A suspensão foi centrifugada e com o sobrenadante foi realizada a análise do teor

de proteínas. A atividade de esterificação da preparação enzimática, bem como a análise

de Microscopia Eletrônica de Varredura, antes e após incubação no solvente foram

determinadas. A análise por MEV mostrou uma alteração significativa da estrutura da

Novozym 435 após incubação em n-hexano, enquanto que para a lipase Lipozyme TL IM,

esse efeito foi visualizado, principalmente, com etanol.

1. INTRODUÇÃO

Biodiesel, mistura de ésteres monoalquílicos de ácidos graxos de cadeia longa, é um

biocombustível obtido principalmente a partir da reação de transesterificação de gorduras e de óleos

com álcoois de cadeia curta, como metanol e etanol. O processo de produção de biodiesel pode

utilizar catalisadores ácidos, básicos ou enzimáticos e, neste caso, empregando lipases.

Lipases (triacilglicerol éster hidrolases, EC 3.1.1.3) pertencem ao grupo das hidrolases e

catalisam a hidrólise de triacilgliceróis a mono- ou diglicerídeos, ácidos graxos livres e glicerol. Em

meio aquo-restrito, as lipases podem catalisar uma variedade de reações de síntese, por exemplo,

esterificação, transesterificação, alcoólise, acidólise, aminólise, acilação e resolução de misturas

racêmicas. Podem ser obtidas de diferentes micro-organismos e são biocatalisadores eficazes devido

ao seu grande potencial catalítico, a sua elevada seletividade, ao uso de condições mais brandas de

reação e por serem biodegradáveis (Castro et al., 2004). Desta forma, as lipases tornaram-se

potencialmente importantes para diversas aplicações industriais.

O processo industrial para produção de biodiesel utiliza a catálise alcalina homogênea, no

Área temática: Processos Biotecnológicos 1

entanto, a matéria-prima utilizada deve ser essencialmente anidra e possuir um teor de ácidos graxos

livres menor que 0,5% em massa.

A síntese de biodiesel catalisada por lipase imobilizada elimina o problema de saponificação,

visto que as lipases também catalisam a reação de esterificação dos ácidos graxos livres, presentes na

matéria-prima, com álcool, convertendo-os em biodiesel. Além disso, o processo enzimático permite

que as reações sejam conduzidas em condições reacionais brandas de temperatura e de pressão

(quando comparadas às condições empregadas no processo químico), ocasiona a geração de um

menor volume de produtos secundários e de efluentes, visto que as lipases são catalisadores altamente

seletivos, utiliza quantidades estequiométricas de álcool em relação à quantidade de óleo,

proporcionando economia no reagente e nos custos de energia. O biocatalisador imobilizado também

pode ser facilmente recuperado do meio reacional e reutilizado.

Na reação de síntese de biodiesel empregando lipase imobilizada, o glicerol, formado na

transesterificação do triglicerídeo com o álcool, se deposita no biocatalisador e bloqueia fisicamente a

entrada de reagentes no suporte de imobilização da enzima, bem como, por ser uma substância polar,

pode inativar a enzima (Hernadez-Martins e Otero, 2008). Assim, a lavagem do biocatalisador com

solventes é um procedimento sugerido para minimizar esses efeitos, visando à reutilização dos

biocatalisadores.

Trabalhos anteriores do grupo (Couteiro et al., 2012; Ribeiro et al., 2012 e Aguieiras et al.,

2013), investigaram a reutilização de lipases comerciais imobilizadas na síntese de biodiesel. Visando

melhorar o rendimento em biodiesel nas bateladas consecutivas, foi avaliada a utilização direta do

biocatalisador, bem como a lavagem da lipase imobilizada com solvente (etanol, n-butanol, n-

hexano), antes de ser reutilizada. De acordo com os resultados obtidos, os solventes mais polares

(etanol e n-butanol) foram mais eficientes na remoção de glicerol gerado na reação de

transesterificação, permitindo menores perdas no rendimento. A escolha do solvente de lavagem deve

considerar alguns aspectos, como a capacidade de remoção do glicerol adsorvido sobre o suporte do

biocatalisador e de desnaturação da enzima.

A atividade enzimática em solventes orgânicos varia significativamente com o solvente

utilizado (Graber et al., 2007), e que está relacionada com vários fatores. O solvente pode alterar a

conformação nativa da proteína através do rompimento das interações hidrofóbicas e das ligações de

hidrogênio, o que reduz a atividade e a estabilidade da enzima. A influência do solvente orgânico na

atividade enzimática também pode ser explicada através da habilidade do solvente em afetar as

interações água–enzima e remover a camada essencial de água que estabiliza a conformação nativa da

enzima.

Os solventes mais prejudiciais às enzimas são aqueles altamente polares e mais hidrofílicos (que

têm afinidade pela água), pois são capazes de remover a camada de água essencial da superfície da

enzima e de competir pelas ligações de hidrogênio entre os átomos da proteína, causando

desnaturação do biocatalisador, com perda da atividade catalítica (Herbst et al., 2012). Geralmente, os

solventes apolares e os solventes hidrofóbicos causam menor desativação. Um dos mais importantes

indicadores da hidrofobicidade de um solvente é o coeficiente de partição octanol/água (P). Os


solventes com log P maior que 4 permitem expressar melhor a atividade catalítica da maioria das

enzimas, pois são mais hidrofóbicos (Illanes, 1994).

Este trabalho visou avaliar os efeitos do solvente (etanol, n-butanol e n-hexano) na atividade

enzimática de três lipases comerciais imobilizadas (Novozym 435, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL

IM), após a incubação no solvente. A atividade de esterificação da preparação enzimática, assim

como a análise de Microscopia Eletrônica de Varredura, antes e após incubação no solvente, foram

determinadas. Também foi avaliado o teor de proteínas no solvente, após a incubação do

biocatalisador.

2. EXPERIMENTAL

2.1. Materiais

As lipases comerciais imobilizadas utilizadas neste trabalho foram a Novozym 435 (lipase de

Candida antarctica, imobilizada em resina acrílica macroporosa), Lipozyme RM-IM (lipase de

Rhizomucor miehei, imobilizada em resina de troca iônica) e Lipozyme TL-IM (lipase de

Thermomyces lanuginosus, imobilizada em sílica), todas da Novozymes Latin America Ltda. (Paraná,

Brasil). n-hexano P.A., n -butanol P.A., etanol P.A., etanol (95%), acetona P.A., hidróxido de sódio

P.A. e ácido oléico (para síntese, 85%) foram obtidos da Vetec Química Fina Ltda. (Brasil).

2.2. Incubação da lipase imobilizada em solvente

Cerca de 0,3g da lipase comercial imobilizada (Novozym 435, Lipozyme RM IM e Lipozyme

TL IM), foi incubada em 3 mL do solvente (n -butanol P.A., etanol P.A. e n -hexano P.A.), durante

2h, a 50ºC, em reator batelada fechado de 15 mL, provido de agitação magnética. Os experimentos

foram realizados em triplicata. Após 2h, a suspensão foi centrifugada e o sobrenadante (solvente) foi

utilizado para análise do teor de proteínas, enquanto que o sólido (lipase imobilizada) foi empregado

para determinação da atividade de esterificação e para análise de Microscopia de Varredura

Eletrônica.

2.3. Determinação do teor de proteínas no solvente após incubação da lipase imobilizada

O teor de proteínas no solvente foi determinado pelo Método do Biureto (Neto, 2011),

utilizando como branco da análise o solvente puro, para verificar a dessorção da enzima do suporte de

imobilização após a incubação no solvente. Para obtenção da curva de calibração de proteína,

correlacionaram-se os valores de absorvância, a 550 nm, obtidos a partir da leitura de soluções de

caseína em concentrações entre 0 e 10 mg/mL.

2.4. Determinação da atividade de esterificação

A atividade de esterificação das lipases comerciais imobilizadas (Novozym 435, Lipozyme RM-

IM e Lipozyme TL-IM) foi determinada taxa inicial da reação de esterificação do ácido oleico com n-

butanol, empregando a razão molar ácido oleico:álcool estequiométrica (1:1), a 45ºC e concentração

de enzima de 3,0% (m/m), conforme o método descrito por Souza et al. (2009). Uma unidade de


atividade de esterificação foi definida como a quantidade de enzima que consome 1 µmol de ácido

oleico por minuto (U), nas condições citadas anteriormente.

2.5. Análise de Microscopia por Varredura Eletrônica (MEV)

A fim de investigar a morfologia da superfície das enzimas imobilizadas comerciais (Novozym

435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM), antes e após a incubação no solvente (n -butanol, etanol

e n-hexano), análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram realizadas. Os

experimentos foram realizados no Centro de Caracterização em Nanotecnologia (CENANO) do INT.

Antes da análise, as amostras seguiram um preparo de secagem e metalização com banho de ouro em

um metalizador (EMITECH K550X) por 2 minutos, a 20 mA. Após a metalização, as amostras foram

analisadas em microscópio eletrônico de varredura (INSPECT S50 FEI), com ampliações de 50x,

200x, 400x, 600x e 2000x.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O emprego de lipases imobilizadas oferece a facilidade de separação e de recuperação do

catalisador e de produtos do meio reacional através de operações simples como filtração ou

centrifugação, o que possibilita sua reutilização e redução dos custos operacionais. Visando a

reutilização de lipases comerciais na síntese de biodiesel, foram avaliados os efeitos dos solventes,

etanol, n-butanol e n-hexano nas enzimas Novozym 435, Lipozyme RM IM e Lipozyme TL IM, após

duas horas de incubação, sob agitação magnética, a 50°C.

Para a lipase comercial Novozym 435, os resultados de atividade enzimática relativa estão

ilustrados na Figura 1 e relacionam os valores de atividade antes e após a incubação nos solventes

estudados. Pode-se verificar que a maior diminuição na atividade de esterificação da Novozym 435

foi obtida após a incubação em etanol, por se tratar do solvente mais hidrofílico (log P =-0,30), em

relação ao n-butanol (logP=0,79) e ao n-henaxo (logP=3,5). José et al. (2011) observaram que a

estrutura secundária da lipase Novozym 435 foi alterada após contato com etanol, mesmo em

experimento em que água foi adicionada. Os resultados evidenciaram a formação de ligações entre o

etanol e resíduos dos aminoácidos (serina e histidina) da tríade catalítica da lipase.

Figura 1- Atividade relativa (%) da Novozym 435 antes e após incubação em etanol, n-butanol e n-

hexano.


No produto comercial Novozym 435, a lipase é adsorvida em uma resina macroporosa Lewatit

VP OC 1600 (José et al., 2011), que possui natureza hidrofóbica. Portanto, também é necessário

avaliar a interação do solvente com o suporte de imobilização da enzima. Quando a lipase Novozym

435 foi incubada em n-hexano, verificou-se, através da análise de MEV, que a conformação do

suporte foi totalmente alterada, o que não foi visualizado após incubação em etanol e n-butanol (vide

Figura 2), nas condições analisadas. Esse fato é justificado considerando o caráter hidrofóbico do n-

hexano, que poderia dissolver/desagregar a resina de imobilização No entanto, os resultados de

atividade enzimática e de determinação do teor de proteínas não mostram que a lipase tenha se

dessorvido do suporte quando incubada em n-hexano. A maior quantidade de proteína, após

incubação do biocatalisador Novozym 435, foi encontrada no solvente etanol. José et al. (2011)

verificaram que o etanol dissolve/desagrega a resina de poli(metilmetacrilato) (PMMA), que

compõem a partícula do biocatalisador Novozym 435. Além disso, os autores observaram que a

interação do etanol com a Novozym 435 não ocorre apenas na superfície, mas também ocorre dentro

da partícula, aumentando a estrutura de poro interna do suporte da enzima. O solvente também causa

a migração de substâncias usadas como aditivos no processo de imobilização da lipase. Toledo et al.

(2012) verificaram que a perda de suporte, de aditivos e de proteína da Novozym 435 ocorre em

maior extensão após incubação com etanol, comparado com a incubação em 2-propanol.

Comportamento semelhante em relação à atividade relativa foi verificado nos experimentos

conduzidos com as lipases Lipozyme RM IM e Lipozyme TL IM, conforme pode-se observar na

Figura 3. A maior perda da atividade enzimática também foi verificada após incubação da lipase em

etanol. A lipozyme RM IM é uma lipase Rhizomucor miehei produzida por fermentação submersa do

microorganismo Aspergillus oryzae, imobilizada em resina macroporosa de troca iônica com suporte

hidrofílico Duolite ES 562 (Rodrigues e Lafuente, 2010). As imagens de MEV, ilustradas na Figura 4,

mostram que não houve modificação significativa na estrutura da lipase após incubação nos solventes

testados. A determinação do teor de proteínas no solvente n-hexano, após incubação, revelou que a

quantidade de proteínas dispersas no meio reacional foi baixa, comparada com a quantidade de

proteína determinada em etanol. Hernández-Rodriguéz et al. (2009) observaram cerca de 60% da

atividade original (atividade relativa) da enzima Lipozyme RM IM após incubação durante 1 h em n-

hexano e etanol, a 25ºC.

Lipozyme TL IM é uma lipase de Thermomyces lanuginosus produzida por fermentação

submersa do micro-organismo Aspergillus oryzae. Essa lipase é imobilizada em suporte enzimático de

natureza hidrofílica (Wang et al., 2011), e o etanol, sendo um solvente hidrofílico,

dissolveu/desagregou o suporte de imobilização, conforme pode ser observado na Figura 5. A

quantificação de proteínas dispersas no meio alcançou valores altos em etanol, comprovando a

degradação do suporte com dessorção de enzima, quando comparada com os resultados em n-butanol

e n-hexano.


a) Pura b) Etanol c) n-butanol d) n-hexano

Figura 2 – Análise de Microscopia de Varredura Eletrônica da Novozym 435, com ampliação de 50x,

antes (a) e após incubação em etanol (b), n-butanol (c) e n-hexano (d).

a) Lipozyme RM IM b) Lipozyme TL IM

Figura 3- Atividade relativa (%) da Lipozyme RM IM (a) e da Lipozyme TL IM (b) antes e após

incubação em etanol, n-butanol e n-hexano.


Figura 4 – Análise de Microscopia de Varredura Eletrônica da Lipozyme RM IM, com ampliação de

50x, antes (a) e após incubação em etanol (b), n-butanol (c) e n-hexano (d).



Figura 5 – Análise de Microscopia de Varredura Eletrônica da Lipozyme TL IM, com ampliação de

50x, antes (a) e após incubação em etanol (b), n-butanol (c) e n-hexano (d).

4. CONCLUSÃO

Após a análise dos resultados, pode-se concluir que o etanol, como solvente de lavagem,

diminuiu a atividade enzimática de todas as enzimas testadas. O n-hexano, por ser mais hidrofóbico,

apresentou menor variação da capacidade catalítica (atividade relativa) dos biocatalisadores testados.

A escolha do solvente também deve considerar a sua interação com o suporte de imobilização da

enzima. A análise de MEV mostrou uma maior alteração na conformação da Novozym 435 em n-

hexano, enquanto que para a Lipozyme TL IM este efeito foi mais pronunciado com etanol.

5. AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Fernanda Cristina de S.C. Dos Santos pela obtenção das imagens de MEV

realizadas no Centro de Caracterização em Nanotecnologia (CENANO) do INT.

6. REFERÊNCIAS

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