EFEITO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO trans-10, cis-12 …...A Deus por tudo e Nossa Senhora pelo...

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EFEITO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO trans-10, cis-12 NA REGULAÇÃO DA LIPOGÊNESE E EXPRESSÃO GÊNICA EM CULTURAS DE TECIDO ADIPOSO DE SUÍNOS EM CRESCIMENTO ANDREA A. F. BRASIL VIEIRA JOSÉ Tese apresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Agronomia, Área de Concentração: Ciência Animal e Pastagens. P I R A C I C A B A Estado de São Paulo - Brasil Fevereiro – 2005

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EFEITO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO trans-10, cis-12

NA REGULAÇÃO DA LIPOGÊNESE E EXPRESSÃO GÊNICA

EM CULTURAS DE TECIDO ADIPOSO DE SUÍNOS EM

CRESCIMENTO

ANDREA A. F. BRASIL VIEIRA JOSÉ

Tese apresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Agronomia, Área de Concentração: Ciência Animal e Pastagens.

P I R A C I C A B A

Estado de São Paulo - Brasil

Fevereiro – 2005

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EFEITO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO trans-10, cis-12

NA REGULAÇÃO DA LIPOGÊNESE E EXPRESSÃO GÊNICA

EM CULTURAS DE TECIDO ADIPOSO DE SUÍNOS EM

CRESCIMENTO

ANDREA A. F. BRASIL VIEIRA JOSÉ Engenheiro Agrônomo

Orientador: Prof. Dr. DANTE P. DUARTE LANNA

Tese apresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Agronomia, Área de Concentração: Ciência Animal e Pastagens.

P I R A C I C A B A

Estado de São Paulo - Brasil

Fevereiro - 2005

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP

José, Andrea Alessandra Filomena Brasil Vieira Efeito ao ácido linoléico conjugado trans-10, cis-12 na regulação da lipogênese e

expressão gênica em culturas de tecido adiposo de suínos em crescimento / Andrea Alessandra Filomena Brasil Vieira José. - - Piracicaba, 2005.

60 p. : il.

Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2005. Bibliografia.

1. Ácido graxos 2. Cultura de tecido animal 3. Expressão gênica 4. Metabolismo animal 5. Suíno 6. Tecido adiposo I. Título

CDD 636.4

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

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“FELIZ DE QUEM OLHA PELAS JANELAS DA SABEDORIA E AUSCULTA À SUA

PORTA; QUEM REPOUSA JUNTO À SUA CASA E, FIXANDO A ESTACA ÀS SUAS

PAREDES, INSTALA A CABANA AO SEU LADO E REPOUSA NA MORADIA DA

FELICIDADE PARA SEMPRE” (Eclo 14, 24-25)

DEDICO

Aos meus pais, Conceição e Jamil, a minha tia Clélia, minha sobrinha Carolina,

meus irmãos Alexandre e Júnior e minha cunhada Sílvia. Pela compreensão, força e carinho

que sempre me deram em todos os momentos da minha caminhada e, principalmente, pela

paciência em vários momentos desta fase...Obrigada.

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Meus agradecimentos,

A Deus por tudo e Nossa Senhora pelo colo de mãe.

Ao Prof. Dante por mais um período de orientação, ensinamentos, incentivos e um

ambiente de respeito, igualdade, amizade e companheirismo.

A FAPESP pela bolsa de estudos e subsídios para o desenvolvimento deste projeto.

A ESALQ, por todo suporte e aos seus funcionários e docentes que estiveram

juntos nesta fase.

A todos os funcionários do Departamento de Zootecnia.

Aos Drs. Dale Bauman e Lance Baumgard, por terem cedido o CLA para

realização do experimento.

A minha amada Carolina pelas noites de companhia no laboratório e por fazer da

minha vida uma constante alegria.

A Profa. Conceição W. B. V. José, minha amada mãe, por toda correção da tese.

Ao Prof. Irineu Umberto Packer pela super ajuda, disponibilidade e ensinamentos

estatísticos.

A todos os companheiros e ótimos profissionais do Laboratório de Nutrição e

Crescimento Animal - Marco Antônio, Liana, Rodrigo de Almeida, Dimas, Amanda,

Alexandre, Beatriz, Giovana, Amoracyr, Juliano, Eduardo Eifert, Rodrigo Goulart, Laudi,

Adriana, Ana Paula, Maria Antônia, Ana Júlia, Nice e Vilma pelo apoio, amizade e por

tornar esta fase tão suave e um ambiente de trabalho repleto de respeito, companheirismo e

risadas (nas horas vagas!!!). Cada um, com seu jeito especial de ser.

Ao Marco Antônio da Gama e a Liana Calegare, pelos ensinamentos,

companheirismo e ajuda nas coletas.

Ao Rodrigo de Almeida, por toda ajuda, calma e discernimento nos momentos

difíceis.

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A minha querida amiga, ótima estagiária e profissional Aline Urban.

A Dra. Lúcia Alvarez pela amizade e por ter me ensinado toda a arte laboratorial.

Aos Professores José Eurico Cyrino - Zico, Flávio Meirelles, José Fernando

Menten, Marília Oetterer, Antônio Figueira, Marisa d’Arce, Virgílio Nascimento, Luiz

Coutinho, Márcio de Castro, Francisco Monteiro, Albino Luchiari e Eduardo Delgado, por

toda ajuda pessoal e/ou profissional.

Aos superprofissionais Helena Alves, Vagner Benedito, Aline Raccanice, Aelson

Brum, Giovana Krempel, Raul Almeida e Othon Abrahão, pela ajuda nas diferentes fases

desta tese.

Aos Laboratórios de Biotecnologia Animal (ESALQ), de Biologia Molecular de

Plantas (ESALQ), de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento (FZEA), de

Melhoramento de Plantas (CENA) e de Experimentação Nuclear (CENA) por toda ajuda

e desprendimento.

Ao Seu Pires, Dona Maria, Seu Dito, Adão e Sokdô, pela super ajuda com os

animais e por fazer da simplicidade da vida sua essência mais profunda.

Aos meus compadres Carlos e Nirlei - Bruno Giaveno por um “presente” tão

abençoado, amado e especial: o Thomaz.

Aos meus queridos amigos que mesmo não participando diretamente, estiveram

comigo em todos os momentos da minha caminhada.

Ao meu querido Fred ...cão amigo e companheiro em todos os momentos.

v

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SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... vii

LISTA DE TABELAS......................................................................................... ix

LISTA DE SIGLAS............................................................................................. x

RESUMO............................................................................................................. xi

SUMMARY......................................................................................................... xiii

1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 1

2 REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 3

2.1 Descoberta dos ácidos graxos conjugados..................................................... 3

2.2 O ácido linoléico conjugado .......................................................................... 4

2.3 Efeitos fisiológicos dos isômeros de CLA..................................................... 5

2.4 Efeitos do CLA na saúde humana.................................................................. 6

2.5 CLA para animais em crescimento e lactação............................................... 8

2.6 Regulação da expressão gênica........................................................................ 12

3 VALIDAÇÃO DO USO DE PVA COMO CARREADOR DE ÁCIDOS

GRAXOS EM CULTURA DE EXPLANTES DE TECIDO

ADIPOSO........................................................................................................

16

Resumo................................................................................................................. 16

Summary.............................................................................................................. 17

3.1 Introdução....................................................................................................... 18

3.2 Material e Métodos......................................................................................... 19

3.2.1 Culturas de explantes de tecido adiposo de suínos..................................... 19

3.2.2 Ensaio de Lipogênese.................................................................................. 20

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3.2.3 Ensaio de lipólise........................................................................................ 21

3.2.4 Análise estatística........................................................................................ 21

3.3 Resultados e Discussão.................................................................................. 22

3.4 Conclusões..................................................................................................... 28

4 EFEITO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO EM CULTURAS DE

EXPLANTE DE TECIDO ADIPOSO DE SUÍNOS EM

CRESCIMENTO.............................................................................................

30

Resumo................................................................................................................. 30

Summary.............................................................................................................. 31

4.1 Introdução....................................................................................................... 32

4.2 Material e Métodos......................................................................................... 34

4.2.1 Culturas de explantes de tecido adiposo de suínos..................................... 34

4.2.2 Formação do complexo ácido graxo - poliivinil álcool............................... 35

4.2.3 Ensaio de Lipogênese.................................................................................. 35

4.2.4 Quantificação do RNA mensageiro da sintase de ácido graxo................... 36

4.2.4.1 Extração de RNA total e síntese de DNAc.............................................. 36

4.2.4.2 PCR em Tempo Real................................................................................ 36

4.2.5 Ensaio de lipólise........................................................................................ 37

4.2.6 Ensaios enzimáticos.................................................................................... 38

4.2.6.1 Homogeneização dos explantes de tecido adiposo.................................. 38

4.2.6.2 Teor de proteína....................................................................................... 38

4.2.6.3 Sintase de ácido graxo (EC 2.3.1.85)........................................................... 38

4.2.6.4 NADP-malato desidrogenase (EC 1.1.1.40)................................................ 39

4.2.6.5 Atividade da 6-fosfogluconato desidrogenase (EC 1.1.1.44) e glucose 6-

fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49)............................................................

39

4.2.7 Análise estatística........................................................................................ 39

4.3 Resultados e Discussão.................................................................................. 40

4.5 Conclusões..................................................................................................... 47

5 CONCLUSÕES GERAIS................................................................................. 48

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 49

vii

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LISTA DE FIGURAS

Página

1 Lipogênese em explantes de tecido adiposo após 24 h de cultura com I+D

(insulina e dexametasona) ou 200 µM BSA (insulina, dexametasona e

albumina sérica bovina). Resultados expressos em µmoles de 14C-glucose

incorporada por g de tecido após 2 h de incubação sem adições (Basal) ou

com 1000 ng/mL de insulina (INS)................................................................. 23

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LISTA DE TABELAS

Página

1. Taxas de lipogênese em explantes de tecido adiposo, após 4, 12, 24 e 48

horas de cultura com diferentes tratamentos...............................................

25

2 Taxas de lipólise (liberação de ácidos graxos em 2 h de incubação) em

explantes de tecido adiposo mantidos em cultura por 48 horas sob

diferentes tratamentos.................................................................................

27

3 Análise de perfil de ácidos graxos do ácido linoléico conjugado utilizado..

35

4 Taxas de lipogênese em explantes de tecido adiposo, após 4, 12, 24 e 48

horas de cultura com diferentes tratamentos...............................................

40

5 Atividades enzimáticas de explante de tecido adiposo, após 48 h de

cultura.........................................................................................................

42

6 Valores de transcritos do RNA mensageiro da FAS....................................

44

7 Taxas de lipólise em explantes de tecido adiposo mantidos em cultura por

48 horas sob diferentes tratamentos............................................................

46

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LISTA DE SIGLAS

6-PGDH: 6-fosfogluconato desidrogenase

AG: ácido graxo

AGNE: ácido graxo não esterificado

BSA: albumina sérica bovina

CLA: ácido linoléico conjugado

FAS: sintase de ácido graxo

G-6PDH: glucose 6- fosfato desidrogenase

LA: ácido linoléico

NADP-MD: NADP-malato desidrogenase

PCR: reação em cadeia da polimerase

pGH: hormônio do crescimento recombinante suíno

PUFA: ácidos graxos poliinsaturados

PVA: poliivinil álcool

RT: transcrição reversa

SCD: estearoil conezima A dessaturase

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1 INTRODUÇÃO

Aumentar a eficiência da produção animal, requer o conhecimento dos processos

biológicos envolvidos no metabolismo de nutrientes. Outros objetivos práticos da

pesquisa, na área de metabolismo animal, envolvem o desenvolvimento de soluções para

doenças metabólicas muito prevalentes na população humana e nos animais utilizados

para produção de alimentos.

Diversos nutrientes, hormônios e modificadores metabólicos, com importantes

efeitos sobre o metabolismo de lipídios, têm sido estudados. Recentemente, um objetivo

importante da pesquisa em nutrição tem sido a avaliação dos efeitos de lipídios

bioativos. Ou seja, lipídios capazes de ter efeitos além daqueles esperados pela sua

contribuição nutricional/energética.

Um componente alimentar funcional bastante estudado, nas últimas décadas, é o

ácido linoléico conjugado (CLA). Certos isômeros pertencentes a este grupo molecular

têm sido relacionados à redução da carcinogênese (Pariza et al., 1979), efeito anti-

obesidade, à alteração da composição corporal de camundongos e suínos (Bee, 2000;

Dugan et al., 1997; Dugan et al., 1999; Ostrowska et al., 1999; Park et al., 1997; Thiel-

Cooper et al., 2001), à alteração da composição do leite de vacas (Baumgard et al., 2000;

Chouinard et al., 1999; Giesy et al., 1999; Medeiros et al., 2000) e aos efeitos positivos

sobre doenças como diabetes mellitus, agregação de plaquetas e funcionamento do

sistema imunológico (Sebedio et al., 1999).

Estão particularmente bem definidos os efeitos de um isômero do CLA, o trans-

10, cis-12, na redução da síntese de gordura na glândula mamária. Este isômero reduz os

níveis de RNA mensageiro (RNAm) de enzimas lipogênicas (Baumgard et al., 2002;

Peterson et al., 2003), reduz a atividade da enzima lipoproteína lipase em culturas de

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adipócitos de camundongos 3T3-L1 (Park et al., 1999), inibe a atividade da estearoil

coenzima A dessaturase (SCD) (Baumgard et al., 2001; Park et al., 2000) e reduz a

abundância de RNAm da SCD (Choi et al., 2000; Lee et al., 1998), tem efeitos

antiadipogênicos em humanos (Brown & McIntosh, 2003) e altera a razão LDL:HDL em

humanos saudáveis (Tricon et al., 2004).

A partir destas constatações, o objetivo deste trabalho foi observar o efeito do

CLA trans-10, cis-12 no metabolismo lipídico, em culturas de explante de tecido

adiposo subcutâneo de suínos em crescimento. Culturas de explante permitem a

condução de um grande número de avaliações, e sendo uma cultura primária, apresenta

uma condição geralmente próxima à do tecido animal in vivo. Entretanto, no sistema in

vitro, há a necessidade de utilizar uma molécula carreadora do CLA trans-10, cis-12 no

meio de cultura. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho foi validar a utilização do

poliivinil álcool (PVA), como macromolécula carreadora de ácido graxo que não altere o

metabolismo das células em cultura, isto é, inerte no sistema de cultura. Posteriormente,

foram testados os efeitos do CLA sobre a lipogênese, a lipólise, a atividade das enzimas

lipogênicas e a expressão da sintase de ácidos graxos.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Descoberta dos ácidos linoléicos conjugados

A presença de ácidos graxos com duplas ligações conjugadas foi primeiramente

estabelecida por Booth et al. (1935), que observaram apreciável aumento na absorção de

luz ultravioleta a 230 nm em amostras de gordura do leite, obtidas de vacas retiradas do

pastejo após o inverno. Corroborando, Dan et al. (1935) administraram óleo à dieta de

vacas e verificaram, na manteiga do leite destas vacas, ácido graxo (AG) com alto

coeficiente de extinção, diferentemente dos originalmente presentes no óleo. Em

trabalho anterior, Dan & Moore (1933) concluíram que esse aumento na absorção de AG

poderia estar relacionado com a mudança isomérica nas ligações insaturadas destes

ácidos graxos.

Reiser (1951) foi o primeiro pesquisador a reportar a biohidrogenação de AG de

cadeia longa no rúmen. Posteriormente, outros experimentos foram desenvolvidos

observando esse processo, bem como os produtos originados. Assim, Smith et al. (1954)

observaram, em espectro infravermelho, que na concentração de ácidos graxos

poliinsaturados (PUFA), obtidos da gordura do leite, havia alta quantidade de ácido

dienóico conjugado cis, trans (trans, cis) com possibilidade de alguns serem trans,

trans. Estes dados foram confirmados posteriormente por Scott et al. (1959).

Na década seguinte, Kepler et al. (1966), em um ensaio de biohidrogenação in

vitro com Butyrivibrio fibrisolvens e ácidos graxos marcados com 14C, como o ácido

linoléico (LA), observaram que o primeiro intermediário produzido era o isômero

octadecadienóico conjugado cis, trans (ou trans, cis ou ambos).

Parodi (1977), utilizando amostras de gordura do leite obtidas de manteiga,

concluiu que o ácido graxo desta gordura do leite, o ácido octadecadienóico conjugado

cis, trans, (trans, cis), era essencialmente o ácido linoléico conjugado cis-9, trans-11.

Dois anos depois Pariza et al. (1979) observaram que, na carne bovina grelhada, havia

um componente que causava alteração nas células cancerígenas, e tentaram identificar

este componente. Pariza et al. (1983) notaram que extratos da carne grelhada possuíam

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4tanto componentes mutagênicos como antimutagênicos, e que estavam presentes

independentemente da cocção.

Já na década de 80, Ha et al. (1987) isolaram de extratos de carne bovina

grelhada, um componente anticarcinogênico, e estabeleceram que constituía uma série

de isômeros dienóicos conjugados do ácido linoléico. Posteriormente, Chin et al. (1992)

observaram que o cis-9, trans-11 foi o isômero mais encontrado em queijos e gorduras

da carne enquanto outros isômeros representavam frações menores. A partir destes

achados, muitas pesquisas surgiram com o intuito de esclarecer os mecanismos de

produção e ação deste ácido linoléico conjugado e, principalmente, de cada isômero que

o compõe.

2.2 O ácido linoléico conjugado

Com o desenvolvimento de pesquisas relacionadas, o processo de formação e

atuação deste ácido linoléico conjugado foi sendo esclarecido e, em 1987, o termo ácido

linoléico conjugado se tornou referido e conhecido como CLA. Este termo, embora

comumente utilizado no singular, denomina um conjunto de isômeros posicionais e

geométricos do ácido octadecadienóico com duplas ligações conjugadas (i.e. duas duplas

ligações separadas por uma ligação simples), que podem ser encontradas nas posições

dos carbonos 9 e 11, 10 e 12 ou 11 e 13, entre outras e podem ser em ambas

configurações, cis e trans. Estudos posteriores demonstraram que a posição da dupla

ligação e o seu tipo de isomeria geométrica determinam o papel do CLA no

metabolismo. Embora possam haver diversos isômeros possíveis, dois deles (CLA trans-

10, cis-12 e CLA cis-9, trans-11) têm mostrado pronunciados e, muitas vezes, distintos

efeitos biológicos (Pariza et al., 2001).

Segundo Bauman et al. (1999), o CLA cis-9, trans-11 encontrado na gordura do

leite e da carne de ruminantes é oriundo de duas fontes. Em uma, é formado como um

intermediário na via pela qual o ácido linoléico é biohidrogenado a ácido esteárico e este

processo ocorre pela ação de microorganismos presentes no rúmen. Na segunda, é

sintetizado nos tecidos animais a partir do ácido graxo trans-11 C18:1 pela ação da

enzima estearoil coenzima A dessaturase (∆9 dessaturase ou SCD). Griinari et al. (1998)

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5demonstraram que uma alteração no ambiente ruminal induzida por dietas com alto

concentrado, é associada a uma mudança no perfil de ácido octadecenóico trans na

gordura do leite. Nesta situação, o ácido graxo trans-11 octadecenóico é substituído pelo

trans-10 C18:1 como o isômero trans C18:1, predominante na gordura do leite. Uma

suposta via para produção ruminal do trans-10 octadecenóico tem sido proposta e

envolve a enzima isomerase cis-9, trans-10 específica, em bactérias ruminais, com a

formação de uma estrutura com dupla ligação conjugada trans-10, cis-12, como um

primeiro intermediário. Evidências posteriores suportaram que essa bactéria é favorecida

por dietas com baixa fibra, o que gera um aumento na proporção do isômero trans-10,

cis-12, na gordura do leite (Piperova et al., 2000).

Corl et al. (2001), em avaliações da síntese endógena de cis-9, trans-11 em vacas

lactantes, com diferentes tratamentos, contendo óleo vegetal parcialmente hidrogenado

como fonte de trans-11 C18:1 e ácido estercúlico como fonte de ácido graxo ciclopropeno

(i.e. inibidor específico da SCD), concluíram que a síntese endógena é a principal fonte

de cis-9, trans-11 na gordura do leite de vacas lactantes. Conclusivamente, a

concentração dos isômeros cis-9, trans-11 e trans-10, cis-12 em produtos lácteos varia

em função da dieta fornecida aos animais.

2.3 Efeitos fisiológicos dos isômeros de CLA

Park et al. (1999) indicaram que mudanças na composição corporal de

camundongos são resultantes, especificamente, da atuação do isômero trans-10, cis-12.

Neste experimento, os animais receberam um preparado enriquecido com cis-9, trans-11

ou trans-10, cis-12, e mudanças na composição corporal como redução na gordura,

elevação na água, proteína e cinzas foram associadas ao CLA trans-10, cis-12. Neste

mesmo experimento, em culturas de adipócitos de camundongos 3T3-L1, o isômero

trans-10, cis-12 reduziu a atividade da enzima lipoproteína lipase (LPL) e as

concentrações de triacilgliceróis e glicerol e elevou a liberação de glicerol no meio. Em

contraste, os isômeros cis-9, trans-11 e trans-9, trans-11 não afetaram estes parâmetros.

Corroborando estas constatações, o CLA trans-10, cis-12 inibiu a atividade da

SCD (Park et al., 2000) e a abundância do RNA mensageiro (RNAm) (Lee et al., 1998)

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6enquanto o cis-9, trans-11 e o trans-9, trans-11 não afetaram tais medidas. Park et al.

(2000) observaram que outros ácidos graxos como o trans-10 octadecenoato não foi

inibitório, enquanto o cis-12 octadecenato causou uma inibição, mas não tão intensa

quanto à ocasionada pelo trans-10, cis-12. Estes pesquisadores concluíram que a dupla

ligação na configuração cis-12 parece ser a estrutura chave característica na inibição da

atividade da SCD, especialmente quando acoplada a uma ligação trans-10, enquanto a

cis-11 é menos efetiva.

Baumgard et al. (2000) observaram que a infusão abomasal do CLA trans-10, cis-

12 reduziu a produção e porcentagem de gordura do leite. Os tratamentos tiveram um efeito

mínimo na concentração de glucose plasmática, ácidos graxos não esterificados, insulina e

fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I). A partir destas conclusões, a

multifuncionalidade aparente do CLA tem sido mais intrigante e menos confusa.

Diferentes isômeros parecem produzir diferentes efeitos. É também praticamente certo

que mais de um mecanismo bioquímico está envolvido em vários efeitos fisiológicos do

CLA (Pariza et al., 2000).

2.4 Efeitos do CLA na saúde humana

Muitos efeitos têm sido atribuídos ao CLA em relação à saúde humana e, sua

atividade biológica foi descoberta devido ao efeito inibitório na carcinogênese

epidermal, induzida quimicamente em camundongos (Ha et al., 1987). A dieta é o fator

que mais contribui para o início ou progresso de alguns tipos de câncer, assim como

estudos epidemiológicos indicam que a composição da dieta pode estar relacionada com

35% das mortes por câncer em humanos, e que produtos lácteos são eficientes em

retardar o desenvolvimento de tumores (Parodi, 1997).

O isômero cis-9, trans-11 tem se mostrado eficaz em reduzir a indução química

de neoplasia mamária em ratos (Ip et al., 1999). Neste experimento, foi observado que,

nos ratos que receberam diferentes fontes de CLA por 1 mês, pós-desmama, e

posteriormente, uma dose simples de um indutor de tumor, houve inibição tanto na

incidência quanto na produção do tumor. O tratamento com CLA decresceu os riscos de

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7câncer mamário em aproximadamente 50%, e houve uma significante incorporação de

CLA no fígado, gorduras mamária e peritoneal e no plasma destes animais.

Este efeito do CLA, na inibição da carcinogênese, pode incluir redução na

proliferação celular, alteração nos componentes do ciclo celular e indução da apoptose

(Evans et al., 2000). Além disso modula também marcadores de imunidade e formação

de eicosanóides em numerosas espécies (Belury, 2002). Ip et al. (1999) sugeriram que,

em modelo animal e células de câncer de mama animal, o CLA induziu a apoptose como

uma evidência na redução na expressão de um proto-oncogene antiapoptótico, o Bcl-2,

em tecido mamário de ratos. O CLA induziu a apoptose em pré-adipócitos 3T3-L1

(Evans et al., 2000) e também induziu a apoptose e aumentou a expressão de oncogenes

na via apoptótica dependente de p53 (i.e. p53, p21WAF1/CIP1), embora inibindo a

expressão do antiapoptótico Bcl-2 em MCF-7 (i.e. células oestrogene positivas) nesta via

(Wahle & Heys, 2002). Mas, segundo estes mesmos autores, em células de câncer

mamário oestrogene negativo, o CLA induziu apoptose através de uma via dependente

de p53 envolvendo o aumento na expressão de p21WAF1/CIP1, Bax e Bcl-Xs. Este

perfil pró-apoptótico ocorreu apesar de um acréscimo na expressão do antiapoptótico

Bcl-2.

Estudos recentes têm mostrado também a influência do CLA no diabetes

mellitus, agregação de plaquetas e no sistema imunológico (Sebedio et al., 1999). O

efeito do CLA na prevenção e tratamento de diabetes mellitus não dependente de

insulina foi primeiramente reportado por Houseknecht et al. (1998), em um experimento

em que ratos Zucker graxo fa/fa pré-diabéticos, mostraram uma diminuição da tolerância

à glucose e na hiperinsulinemia. Estes efeitos antidiabéticos parecem ser ligados a

ativação do receptor ativado proliferador de peroxissomo (PPARγ) em uma maneira

similar ao thiazolidone, potente sensibilizador de insulina (i.e. tem propriedades

antidiabéticas). Estes pesquisadores concluíram, portanto, que o efeito do CLA dietético

na homeostase e tolerância à glucose pode ser uma importante forma terapêutica na

prevenção e tratamento de diabetes mellitus não dependente de insulina.

Segundo Brown & McIntosh (2003), afirmações sobre efeito do CLA na saúde

humana ainda são inconsistentes, como, por exemplo, em relação ao consumo em que

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8adultos saudáveis receberam 3-3,4 g/d de CLA por 6 meses e não foi observado efeito na

porcentagem de gordura corporal e lipídios no sangue, contrastando com suplementação

por 7-13 semanas com 1,4-6,8 g/g, que reduziu a massa de gordura ou a porcentagem de

gordura em adultos que se exercitam, saudáveis e obesos. Esta discrepância é devido aos

mecanismos específicos de cada isômero, como o trans-10, cis-12, responsável por

efeitos antiadipogênicos.

O fornecimento de 3 g/d de CLA (50% cis-9, trans-11, 50% trans-10, cis-12),

para humanos com diabetes mellitus tipo 2, por 8 semanas, causou um efeito adverso no

metabolismo da glucose e insulina, reduzindo a sensibilidade à insulina e aumentando a

concentração de glucose em jejum. Enquanto foram observados efeitos positivos no

fibrinogênio e metabolismo da lipoproteína de alta densidade (HDL) (Moloney et al.,

2004). Contrariamente, Tricon et al. (2004) observam efeitos divergentes dos isômeros

cis-9, trans-11 (0,59; 1,19 e 2,38 g/d) e do trans-10, cis-12 (0,63; 1,26 e 2,52 g/d) no

perfil de lipídios do sangue de humanos saudáveis, onde o trans-10, cis-12 aumentou a

razão LDL (lipoproteína de baixa densidade):HDL e HDL, enquanto o cis-9, trans-11

decresceu ambos e, nenhum isômero causou alteração na concentração de insulina

plasmática. Mas cumpre sejam observadas as doses e os estádios fisiológicos de cada

indivíduo. Assim, há muito ainda a ser esclarecido sobre os mecanismos de ação do

CLA e seus efeitos na saúde humana.

2.5 CLA para animais em crescimento e lactação

Estudos do efeito do CLA, em animais em lactação, têm sido bastante

observados ante a importância da concentração de gordura (i.e. principal componente

energético) e proteína no leite, bem como na composição corporal de animais de

interesse econômico.

Kelly et al. (1998) observaram o efeito de diferentes óleos em dietas de vacas em

lactação. As dietas foram constituídas de 53 g/dia de óleo de amendoim (alta

concentração de ácido oléico), óleo de girassol (ácido linoléico) e óleo de linhaça (ácido

α-linolênico) e administradas por duas semanas. Não foram observadas diferenças na

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9produção de leite e teor de gordura do leite, mas a proteína do leite, durante o tratamento

com óleo de girassol, foi maior em comparação aos demais. Entretanto, a concentração

de CLA na gordura do leite, no tratamento com óleo de girassol, foi significativamente

maior em relação aos demais, e aproximadamente 500% maior que a tipicamente

observada em vacas recebendo dietas tradicionais. Estes pesquisadores concluíram que a

concentração de CLA no leite pode ser aumentada em dietas suplementadas com PUFA,

especialmente óleos ricos em ácido linoléico. Em outras pesquisas, dietas suplementadas

com CLA geraram um acréscimo no conteúdo de CLA na gordura do leite, alterando sua

composição de ácidos graxos e reduzindo o teor e a produção de gordura do leite

(Chouinard et al., 1999; Giesy et al., 1999; Medeiros et al., 2000).

Baumgard et al. (2000) observaram que o teor de gordura do leite diminuiu 44%

devido ao efeito da infusão abomasal do CLA trans-10, cis-12 em vacas lactantes.

Igualmente, um amplo decréscimo na secreção da gordura do leite (i.e. depressão da

gordura do leite - DGL) foi observado com dietas com 25% de forragem e 70% de

concentrado, suplementada com 5% de óleo de soja (Piperova et al., 2000). Entretanto,

Piperova et al. (2004) concluíram que a depressão de gordura no leite pode também

envolver o isômero C18:1 trans-10, embora seu efeito tenha se mostrado inferior ao do

CLA trans-10, cis-12. Neste experimento, as vacas receberam dietas contendo CLA-Ca

(CLA ligado a sais de cálcio, 35,83% de trans-10, cis-12) ou isômeros do ácido graxo

trans 18:1 ligado a sais de cálcio (28% de trans-10).

Muitos trabalhos vêm sendo conduzidos também com o intuito de avaliar os

efeitos do CLA na composição corporal de animais em crescimento, em suínos machos

castrados (Wiegand et al., 2002), suínos em crescimento-terminação (O’Quinn et al.,

2000), pós-desmama (Demaree et al., 2002) e em suínos magros geneticamente

modificados (Eggert et al., 2001).

Em suínos em crescimento, um importante tecido, responsável pelo

desenvolvimento do animal, é o tecido adiposo, que armazena as reservas energéticas

corporais, predominantemente na forma de triacilgliceróis. A deposição de reservas, no

adipócito, ocorre quando há um balanço positivo entre síntese e degradação de lipídios

(Bauman & Davis, 1975). Nesta espécie, 80% da síntese de lipídios é feita pela via de

novo, utilizando glucose como substrato, função de baixa proporção das calorias (~8%)

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10da dieta na forma de ácidos graxos pré-formados. Nesta situação, cerca de 40% da

utilização de glucose pelo corpo é destinada à deposição de lipídios (Etherton et al.,

1995), corroborando Dunshea et al. (1992) em estudos com cinética de isótopos. Tais

estudos mostraram que mais de 40% do turnover da glucose do corpo pode ser usado no

tecido adiposo, para a lipogênese de novo, em suínos com 80 kg de peso vivo. Por

conseguinte, o crescimento do tecido adiposo é altamente dependente das taxas

lipogênicas e a glucose é a primeira fonte de carbono.

Assim, o efeito do CLA tem sido observado no metabolismo do tecido adiposo e na

regulação da atividade das enzimas que estão presentes nos adipócitos, como a sintase de

ácido graxo (FAS) e a acetil coenzima A carboxilase (ACC), consideradas entre as mais

importantes. Desta forma, mudanças nas atividades destas enzimas são paralelas às

mudanças nas taxas de síntese de ácidos graxos (Sinnet-Smith et al., 1979). Por

conseguinte, a capacidade máxima de um tecido lipogênico carrear a síntese de novo de

ácidos graxos é determinada pela concentração de enzimas lipogênicas neste tecido e,

esta concentração, por sua vez, parece ser, em grande parte, determinada pela quantidade

de RNAm que codifica estas enzimas (Clarke, 1993).

Alguns nutrientes e hormônios podem inibir a síntese de novo de lipídios e,

conseqüentemente, alterar a composição da carcaça, diminuindo a espessura de gordura

subcutânea e aumentando a deposição de tecido magro. Destes nutrientes, são os PUFAs,

cuja inibição é conhecida há anos, que inibem a síntese de gordura a partir de mecanismos

de curto e longo prazo. Tais ácidos graxos são conhecidos inibidores alostéricos da

atividade da ACC (curto prazo) e em ratos, em crescimento, dietas ricas em PUFA reduzem

a expressão da FAS (longo prazo).

Segundo Clarke & Jump (1993), a supressão da transcrição dos genes que

codificam enzimas da via de síntese de ácidos graxos, é coerente com a menor necessidade

de síntese de gordura pela via de novo em animais que já apresentam altas taxas de síntese

de gordura a partir de ácidos graxos pré-formados. Além da atividade das enzimas

limitantes, outro sistema que pode ser alterado é o de transporte de glucose na membrana

celular, o qual é controlado por hormônios homeorréticos e homeostáticos (Bauman &

Vernon, 1993).

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11A partição de nutrientes e o decréscimo da síntese de gorduras são os efeitos

biológicos relacionados com o CLA e têm sido apresentados, por diversos autores, que

causam aumento na eficiência alimentar de suínos (Bee, 2000; Dugan et al., 1999; Dugan et

al., 1997; Ostrowska et al., 1999; Thiel-Cooper et al., 2001). Entretanto, os efeitos do CLA

na composição da carcaça e taxas de deposição nos tecidos em suínos, ainda não estão bem

reportados, pois o mecanismo exato pelo qual o CLA atua no metabolismo de lipídios

não está totalmente elucidado.

Dugan et al. (1997) testaram o efeito do CLA nas características da carcaça de

suínos de 61,5 a 106 kg de peso vivo, os quais receberam 2% de CLA ou 2% de óleo de

girassol. Estes autores observaram um aumento na deposição de tecido magro (+2,3%) e

redução na deposição de gordura subcutânea (-6,8%), além da incorporação de CLA no

tecido adiposo (3-4,7% do total de lipídios). Estes resultados foram corroborados pelo

mesmo grupo em 1999, mas acrescentaram que não houve alteração na qualidade e

palatabilidade da carne dos suínos que receberam dieta com CLA.

Dunshea et al. (1998), suplementando marrãs com níveis crescentes de 0; 0,125;

0,25; 0,5; 0,75 e 1% de CLA, observaram diminuição na espessura de toucinho de 21; 17,1;

16,1; 16,9; 15,4 e 14,6 mm, respectivamente, sem alterar o consumo e melhorando o ganho

de peso e conversão alimentar. Bee (2000) observou que a adição de 2% de um produto

contendo CLA (58,9% do total de ácidos graxos) na dieta de matrizes, aumentou o

ganho de peso e ingestão nos leitões pós-desmama, em relação às mães que receberam

somente 2% de LA, independentemente da dieta inicial que os leitões receberam.

Os efeitos de dietas suplementadas com CLA, na composição da carcaça de suínos

em crescimento, foram relacionados às taxas de acréscimo de gordura, proteína, água e

matéria mineral, e a inclusão de produto contendo CLA (55% do total de AG), na dieta,

também aumentou a deposição de tecido magro e decresceu a deposição de gordura em

aproximadamente 31% (Ostrowska et al., 1999). Posteriormente, Ostrowska et al. (2003b)

confirmaram estes efeitos do CLA em diminuir a deposição de gordura em suínos, medida

por absorção em raio-X de dupla energia e, também, aumentar o conteúdo de CLA no

tecido adiposo destes animais (Ostrowska et al., 2003a).

Thiel-Cooper et al. (2001) verificaram, em suínos suplementados com mistura de

ácidos graxos contendo CLA na dieta (60,5% do total de AG), um aumento linear no

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12ganho médio diário com as diferentes concentrações de CLA (0, 0,12, 0,25, 0,5 e 1%),

mas o consumo não foi afetado. Quando realizada a análise por ultra-som da área de

olho de lombo, na 10a costela, estes animais apresentaram menor espessura de gordura

em relação ao grupo controle. A dissecação do lombo demonstrou que o CLA produziu

um efeito quadrático em ambas, gordura intermuscular e subcutânea. Estes autores

concluíram que o CLA da dieta foi incorporado nos tecidos de suínos e teve efeito

positivo na performance e composição corporal.

2.6 Regulação da expressão gênica

Se o CLA altera o metabolismo lipídico de um modo geral, isto se deve ao seu

efeito direto ou não na regulação gênica, seja no RNAm ou na atividade de enzimas e

fatores de transcrição, seja na modificação do metabolismo como um todo. Assim,

pesquisas relacionadas têm buscado avaliar o efeito do CLA na regulação de genes

responsáveis pelo aumento e/ou diminuição da síntese, deposição e mobilização de

ácidos graxos e também genes relacionados ao metabolismo da glucose. Neste

metabolismo, o transportador de glucose-4 (Glut 4) tem papel relevante pois afeta a

entrada deste substrato para a célula. Por exemplo, Takahashi et al. (2002) observaram

uma redução no RNAm do Glut 4 no tecido adiposo marrom e branco de camundongos

que receberam CLA, durante 21 dias.

Satory & Smith (1999) observaram que o CLA promoveu o acúmulo de lipídios

pela via de novo em pré-adipócitos 3T3-L1, enquanto Park et al. (1997) utilizando a

mesma linhagem celular, verificaram redução de 66% na atividade da LPL e na

concentração intracelular de triacilgliceróis (-8%) e glicerol (-15%). Entretanto, houve

um aumento no glicerol livre no meio de cultura (+22%). Contudo, não observaram

redução na atividade da FAS. Neste mesmo experimento, em camundongos recebendo

dieta suplementada com CLA, obsevaram um aumento na atividade da carnitina

palmitoil transferase (CPT) no tecido muscular e adiposo. Este aumento sugere um

aumento de oxidação lipídica e que o CLA pode ter causado uma inibição na produção

do metabólito intermediário na síntese lipídica, o malonil CoA, que é um regulador

negativo da CPT. A quantidade de malonil CoA, por sua vez, é regulada pela ACC2

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13(isoforma 2) no músculo e ACC1 (isoforma 1) no fígado e no tecido adiposo (Abu-

Elheiga et al., 2001).

Park et al. (1999) observaram redução na atividade da LPL, em culturas de

adipócitos 3T3-L1. Efeito este notado somente pela ação do isômero trans-10, cis-12,

sem ter sido influenciado pelo CLA cis-9, trans-11. Entretanto, para se determinar se o

efeito na atividade da LPL foi direto ou por meio de um metabólito, Park et al. (1999) e

Park & Pariza (2001) prepararam um cognato, o ácido nonadecadienóico conjugado

(CNA), e observaram uma inibição na atividade da LPL e acúmulo de lipídio em 3T3-L1

similar ao CLA. Presumiram, que o CNA, por diferir em comprimento por um átomo de

carbono, é metabolizado diferentemente do CLA. Concluíram, portanto, que a inibição

da atividade da LPL, no sistema celular, é devido diretamente ao composto administrado

e não ao metabólito gerado por esse composto.

Posteriormente, trabalho conduzido por Xu et al. (2003) confirmou esses efeitos.

No tecido adiposo parametrial de camundongos, suplementados com 0,5 g de CLA/g de

peso vivo, houve uma significativa redução na atividade da lipoproteína lipase -

liberando heparina e da LPL intracelular, bem como uma redução na transformação de

glucose a CO2, ácido graxo e glicerol. Entretanto, o CLA não pareceu elevar a lipólise

no tecido adiposo desses animais.

Sakono et al. (1999) compararam o efeito de dietas contendo CLA e LA na

produção de corpos cetônicos e secreção de lipídios, em ratos, observando que somente a

dieta contendo CLA enriqueceu a oxidação hepática de ácidos graxos e estimulou a

produção de corpos cetônicos, em comparação com dietas contendo, também, LA. O CLA

aumentou igualmente a atividade mitocondrial da CPT, no tecido adiposo epididimal e no

músculo, sugerindo que o CLA influencia o metabolismo de ácidos graxos não só no

fígado mas em todos os tecidos extra-hepáticos.

Um dos efeitos do CLA na homeostase lipídica é via ativação do PPAR (Moya-

Camarena & Belury, 1999) e, segundo Mersmann (2001), os CLAs são ligantes para o

PPAR. Entretanto, Ding et al. (2000) não observaram alteração na concentração do

RNAm do PPARγ, na diferenciação in vitro de adipócitos de suínos tratados com CLA,

enquanto houve um acréscimo na atividade da LPL. Contrariamente, Meadus et al.

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(2002) verificaram um aumento nas taxas de RNAm do PPARγ e proteína ligante ao

ácido graxo do adipócito (AFABP) em suínos castrados alimentados com CLA por 45

dias, mas este aumento no RNAm não foi observado para o PPARα.

O efeito do CLA nas enzimas envolvidas no metabolismo lipídico, dentre elas as

responsáveis pela síntese de novo de ácidos graxos, reesterificação de ácidos graxos e do

ciclo das pentoses fosfato (i.e. produção de NADPH), vem sendo pesquisado. Peterson

et al. (2003), administrando dieta que induz a DGL em vacas, observaram uma redução

de 25 e 27% na porcentagem e produção de gordura do leite, respectivamente, e também

um aumento da concentração do isômero trans-10, cis-12 no leite. Estas observações

corroboraram alterações na abundância do RNAm de enzimas lipogênicas, como ACC,

FAS, acil-CoA ligase, glicerol fosfato acil-transferase (GPAT) e acilglicerol fosfato acil-

transferase (AGPAT). As reduções nos RNAs mensageiros também foram

correlacionadas ao aparecimento do CLA trans-10, cis-12 na gordura do leite para a

ACC, FAS, LPL e GPAT, concluindo, portanto, que dietas que induzem DGL envolvem

efeitos coordenados no RNAm para a via de síntese lipídica e dão suporte a alterações

nos mecanismos envolvidos na ativação transcricional desses genes.

O efeito do CLA, na atividade da ACC e da FAS, foi observado em vacas que

receberam dietas que causam DGL (Piperova et al., 2000). A administração desta dieta

causou um decréscimo de 43% na secreção da gordura do leite e de 61 e 44% na

atividade da ACC e FAS, respectivamente, consistente com a redução na abundância do

RNAm da ACC. Corroborando estes dados, Hayashi (2003) observou uma redução na

atividade da FAS, da G-6PDH e da 6-PGDH no fígado e na glândula mamária de ratas

que receberam ração contendo CLA-60 (35% trans-10, cis-12) de 13-15 dias pós-parto.

No tecido adiposo, somente a atividade da FAS foi reduzida. Contrariamente, Lin et al.

(2004) observaram uma redução na atividade e abundância do RNAm da ACC na

glândula mamária de ratas lactantes que receberam CLA de 4 a 15 dias pós-parto.

Entretanto, para a FAS, só foi observada redução na abundância do RNAm. Por outro

lado, no fígado destes mesmos animais, a atividade e a abundância RNAm da ACC e da

FAS não foram afetadas.

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15Choi et al. (2000), tratando pré-adipócitos 3T3-L1 em diferenciação com CLA

trans-10, cis-12, observaram redução dose-dependente na expressão (i.e. RNAm) da

SCD1. Entretanto, a expressão de outros genes dos adipócitos, como P2 adiposo (aP2),

FAS, SCD2 e PPARγ, permaneceu elevada. Baumgard et al. (2001) também mostraram

efeito do CLA trans-10, cis-12 na expressão da SCD, avaliada pela sua atividade

enzimática.

Trabalhos realizados com suínos demonstraram que houve um decréscimo na

atividade da SCD e no índice da ∆9 -dessaturase no tecido adiposo, após suplementação

in vivo com CLA (Gatlin et al., 2002; Smith et al., 2002). A presença de CLA, na dieta

inicial dos leitões, aumentou a atividade da glucose 6-fosfato desidrogenase (G-6PDH) e

da NADP-malato desidrogenase (NADP-MD) no tecido adiposo, mas não causou

mudanças na atividade da FAS. Bee (2000) observou, todavia, que a atividade da FAS

foi maior na gordura omental do que na subcutânea, o que pode ser explicado pela

diferença da proporção de gordura entre os dois tecidos. Entretanto, a composição de

ácidos graxos foi de alguma maneira contraditória à atividade da FAS.

Contraditoriamente, Corino et al. (2003), trabalhando com suínos suplementados com

CLA, não observaram diminuição na atividade da NADP-MD e G-6PDH no tecido

adiposo, mas houve uma queda na atividade da ACC. Em um trabalho anterior, este

mesmo grupo observou redução na atividade da ACC no fígado e no tecido adiposo de

coelhos que receberam dieta suplementada com CLA (Corino et al., 2002).

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3 VALIDAÇÃO DO USO DE PVA COMO CARREADOR DE ÁCIDOS GRAXOS

EM CULTURA DE EXPLANTES DE TECIDO ADIPOSO

Resumo

Culturas de explantes de tecido adiposo são uma ferramenta para estudo dos

mecanismos intracelulares de ação de hormônios e nutrientes. Entretanto, a avaliação

dos efeitos de lipídios, nestas culturas, necessita de uma molécula carreadora de ácidos

graxos. A albumina sérica bovina (BSA) tem sido usada com este propósito, mas estudos

sugerem que a presença de contaminantes afeta a resposta celular, particularmente a

lipogênese. O objetivo deste trabalho foi testar o uso da BSA e validar a utilização de

poliivinil álcool (PVA) como macromolécula carreadora de ácido graxo, testando seu

efeito no sistema de cultura. Explantes de tecido adiposo de nove suínos, em

crescimento, (78±3 kg) foram submetidos à cultura em meio 199 (com adição de 100

ng/mL de insulina, 10 nM de dexametasona e antibióticos) por 4, 12, 24 e 48 horas, com

os tratamentos: a) Controle - meio 199 ; b) PVA - meio 199 com 100 µM de PVA e c)

pGH - meio 199 com 100 ng/mL de pGH (hormônio do crescimento suíno) e 100 µM de

PVA. Após cada período de cultura, explantes foram coletados e submetidos ao ensaio

de lipogênese (taxa de incorporação de glucose marcada com 14C em 2 h de incubação

em tampão Krebs-Ringer na presença e ausência de insulina). Após 48 h, em meio 199

os explantes foram analisados para lipólise (taxa de liberação de ácidos graxos não

esterificados - AGNE - em 2 h de incubação em tampão Krebs-Ringer na presença e

ausência de isoproterenol). Nos ensaios preliminares, foram utilizadas diferentes fontes

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comerciais e lotes de BSA, que provocaram alterações nas taxas lipogênicas.

Diferentemente da BSA, o PVA não alterou a síntese de lipídios, sendo que o controle

positivo (pGH) diminuiu a incorporação de glucose em lipídios (P<0,01) em relação ao

Controle e também ao PVA (P<0,05). Para a lipólise, também, não houve diferença entre

Controle e PVA, entretanto houve efeito do pGH que aumentou a lipólise em relação ao

Controle (P<0,10) e ao PVA (P<0,05). Os resultados deste trabalho confirmam que

diferentes lotes de BSA alteram a taxa de síntese de lipídios em cultura, sugerindo que

não se deva utilizar a BSA, como carreador de ácidos graxos, para sistemas em cultura.

Já o PVA não alterou as taxas de lipólise, lipogênese, nem a resposta à insulina em

relação ao Controle. Portanto, a substituição da BSA pelo PVA nos parece indicada na

realização de estudos de ácidos graxos em cultura de tecido.

VALIDATION OF THE USE OF PVA AS FATTY ACID CARRIER IN

CULTURE OF ADIPOSE TISSUE EXPLANTS

Summary

Cultures of adipose tissue explants are a tool for study of the intracellular

mechanisms of hormones and nutrient action. However, evaluation of the effects of fatty

acids in these cultures require the use of a carrier molecule. Bovine serum albumin

(BSA) has been used with this purpose, but several studies suggest that the presence of

contaminants can alter cellular responses including the lipogenesis. The objective of this

study was evaluate the use of BSA and to validate the use of polyvinyl alcohol (PVA) as

a carrier. Adipose tissue explants from nine growing pigs (78±3 kg) were cultured in

medium 199 (with 100 ng/mL insulin, 10 nM dexamethasone and antibiotics) for 4, 12,

24 and 48 hours. Treatments were Control - medium 199; PVA - medium 199 plus 100

µM of PVA and pGH - medium 199, 100 ng/mL of pGH (porcine growth hormone) plus

100 µM of PVA. After each culture period explants were collected and assayed for

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lipogenesis (measured as rates of 14C labeled glucose incorporation over a subsequent 2

h incubation in Krebs-Ringer in presence or absence of insulin). After 48 h in medium

199 samples were also analyzed for lipolysis (non-esterified fatty acid release - NEFA-

over a subsequent 2 h incubation in Krebs-Ringer in presence or absence of

isoproterenol). Preliminary studies confirmed a significant effect of different

commercial sources and lots of BSA on lipogenesis. Conversely, there were no effects of

PVA on basal or insulin stimulated lipid synthesis. Glucose incorporation was

significantly decreased (P<0.01) in response to a positive control (pGH) compared to

both a Control and to PVA (P<0.05). For lipolysis, once again there were no effects of

PVA, but the system was responsive to the positive control of pGH. GH treatment was

different from Control (P<0.10) and PVA (P<0.05). Distinctly from BSA, the use of

PVA in adipose tissue cultures did not alter liplytic and lipogenic responses. Therefore,

the substitution of BSA for PVA is an alternative for studies with bioactive fatty acids

using adipose tissue culture systems.

3.1 Introdução

As culturas de explantes de tecido adiposo são uma ferramenta para estudo dos

mecanismos intracelulares de ação de hormônios e nutrientes, incluindo ácidos graxos.

Culturas de tecidos permitem a condução de diversos tratamentos simultâneos e,

conseqüentemente, de muitos estudos de forma rápida e de baixo custo. Entretanto, para

a avaliação dos efeitos dos ácidos graxos nestas culturas, há a necessidade de uma

molécula carreadora destas moléculas. A albumina sérica bovina (BSA) tem sido usada

com este propósito, mas há na literatura estudos sugerindo que a presença de

contaminantes afeta a resposta celular (Walton & Etherton, 1986) bem como mascara os

efeitos dos ácidos graxos (Tronstad et al., 2001).

Na literatura, existem, também, diferenças na metodologia recomendada para

formação do complexo ácido graxo (AG):BSA tanto na temperatura, proporção de

AG:BSA como no período em que o complexo permanece para ser formado (Brown et

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19

al., 2001; Evans et al., 2002; Mahoney et al., 1977; Matitashvili et al., 2001; Park et al.,

1997).

Existem diversas metodologias para cultura do tecido adiposo. Estas culturas

podem utilizar linhagens de células (e.g. linhagens de pré-adipócitos 3T3-L1) ou sistema

de culturas primárias (e.g. explantes ou células isoladas). Cada modelo de cultura

utilizado tem suas vantagens e desvantagens e, muitas vezes, estas diferenças dificultam

a comparação dos resultados obtidos. O uso de culturas primárias de suínos, na forma de

explantes, tem sido utilizado com grande sucesso na avaliação do efeito de diferentes

hormônios e nutrientes sobre a taxa de lipogênese (Dunshea et al., 1992; Etherton &

Bauman 1998; Etherton et al., 1995; Lanna et al., 1994). Nesta espécie a síntese de

gorduras ocorre no próprio tecido adiposo, sendo que cerca de 80% dela é feita pela via

de novo.

O objetivo deste trabalho foi validar a utilização de poliivinil álcool (PVA),

como macromolécula carreadora de ácido graxo, testando a hipótese de que este

composto não altera o metabolismo das células em cultura. Esta avaliação foi realizada

medindo-se a taxa de lipogênese e a taxa de lipólise.

3.2 Material e Métodos

3.2.1 Culturas de explantes de tecido adiposo de suínos

Nove suínos Landrace x Large White, do Departamento de Zootecnia

ESALQ/USP, com peso médio de 78 + ou - 3 kg, foram utilizados. Aproximadamente

20 g de tecido adiposo subcutâneo foram coletados da região dorsal posterior do pernil e,

imediatamente, colocados no tampão de transporte (25 mM de HEPES; 0,15 M de NaCl;

20 U/mL de penicilina; 20 µg/mL de estreptomicina; 5 µg/mL de neomicina e 2,5

µg/mL de anfotericina B - Sigma; 37oC, pH 7,4). Explantes de 50-100 mg foram

preparados a partir da camada intermediária do tecido subcutâneo, em condições

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20

assépticas, e incubados em meio 199 (25 mM de HEPES; 25 mM de bicarbonato; 20

U/mL de penicilina; 20 µg/mL de estreptomicina; 5 µg/mL de neomicina e 2,5 µg/mL de

anfotericina B - Sigma; 37ºC, pH 7,4) de acordo com metodologia descrita por Lanna et

al. (1995). Ao meio de cultura foram adicionados os tratamentos: a) Controle - 100

ng/mL de insulina e 10 nM de dexametasona; b) PVA - 100 ng/mL de insulina, 10 nM

de dexametasona e 100 µM de poliivinil álcool (PVA - Sigma) e c) pGH - 100 ng/mL de

insulina, 10 nM de dexametasona, 100 ng/mL de pGH (hormônio do crescimento

recombinante suíno - Reporcin®, Southern Cross Biotech) e 100 µM de PVA. As placas

foram mantidas em atmosfera contendo 95% Ar: 5% CO2 a 37oC por 4, 12, 24 e 48

horas.

Após esses períodos de incubação, parte dos explantes foi coletada e

imediatamente submetida às incubações de lipogênese. E, após 48 horas, parte dos

explantes foi imediatamente submetida ao ensaio de lipólise.

3.2.2 Ensaio de Lipogênese

Após cada período de cultura, os explantes foram coletados e transferidos para

frascos de cintilação contendo 2 mL de meio de lipogênese (KRB 1X - Krebs Ringer

buffer - 0,65 mM de CaCl2; 10 mM de HEPES; 10 mM de glucose e 0,5 µCi/mL de

glucose D-[14C (U)] - Amersham Biosciences; pH 7,4 a 37oC), sob atmosfera de 95%

O2:5% CO2, sob agitação, por 2 horas, a 37oC. Foram realizadas incubações em

triplicatas com: a) Lipogênese Basal - sem adições e b) Lipogênese INS - estimulada

com 1000 ng/mL de insulina.

Posteriormente, os explantes foram submetidos às extrações de lipídios, segundo

Folch et al. (1957), com modificações. Os explantes foram transferidos para frascos de

extração contendo 5 mL de metanol:clorofórmio 1:2. Após permanecerem em descanso

por 1 hora, adicionou-se 1 mL de NaCl 1% e a extração prosseguiu por 12 a 16 horas. À

fase inferior, foram adicionados 0,5 mL de hexano e 5 mL de líquido de cintilação

(Sigma). Os frascos de cintilação foram encaminhados para o Laboratório de

Experimentação Nuclear, CENA/USP, para leitura em cintilador automático (Beckman

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21

Instruments- LS 5000 TD - Liquid Scintillation System) e a lipogênese expressa em

nanomoles de glucose incorporada por grama de tecido por 2 horas.

3.2.3 Ensaio de lipólise

Após o período de cultura de 48 horas, os explantes foram coletados e incubados

em 2 mL de meio de lipólise (KRB 1X - 0,65 mM de CaCl2; 2,5 mM de HEPES; 5,6

mM de glucose e 3% de BSA; pH 7,4 a 37oC), sob atmosfera de 95% O2:5% CO2, sob

agitação, por 2 horas, a 37oC. Foram realizadas triplicatas das incubações com: a)

Lipólise Basal - sem adições e b) Lipólise ISO - lipólise estimulada com 10-5 M de

isoproterenol. Após este período, alíquotas dos meios foram coletadas para análise de

AGNE. A concentração de AGNE foi determinada por método enzimático

colorimétrico, a 540 nm, utilizando-se o kit NEFA C® (Wako Chemicals),. As leituras de

absorbância foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas,

ESALQ/USP, em Leitor de Elisa (Spectra Max Plus – Molecular Devices), utilizando-se

microplacas com poços de 200 µL onde foram adicionadas amostras, padrões e

reagentes. Os valores de absorbâncias foram convertidos em concentração (µmol de

ácido oléico/L) através da curva-padrão determinada e as concentrações de AGNE

obtidas foram corrigidas para o peso, em gramas, de cada explante e expressas em

µmoles de ácido oléico por g de tecido por 2 horas.

3.2.4 Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o Proc Mixed (SAS, 1999).

Para análise de variância do ensaio de lipogênese, com medidas repetidas no tempo, foi

utilizado um modelo envolvendo os efeitos fixos de tratamentos, estímulo, tempo e suas

interações e efeitos aleatórios de animal dentro do tratamento e animal dentro do

tratamento*estímulo que foram os erros para testar efeito de tratamento e de estímulo,

respectivamente. Tendo em vista que o tempo não foi igualmente espaçado, usou-se

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estrutura de covariância do tipo SP(POW) (tempo), conforme recomendado (Littel et al.,

1996).

No ensaio de lipólise, a análise de variância foi feita de acordo com o modelo de

experimento com parcela subdividida, tendo tratamentos aplicados nas parcelas e

estímulo às subparcelas. Todas as comparações de médias foram feitas pelo teste de

Tukey.

3.3 Resultados e Discussão

Em ensaios preliminares, utilizando albumina sérica bovina (BSA - fração V,

fatty acid free) em meio de cultura, foram observadas variações nas respostas

lipogênicas. Houve uma tendência de maior taxa de incorporação de glucose após 24

(Figura 1) e 48 h em meio de cultura contendo BSA, insulina e dexametasona,

comparado ao meio contendo apenas insulina e dexametasona. As diferenças

encontradas nos ensaios preliminares sugerem que a BSA não deve ser utilizada como

carreador de ácidos graxos em experimentos onde a taxa de lipogênese deva ser

estudada.

Foram testadas diferentes fontes comerciais, lotes e concentrações de BSA. Para

a maioria das fontes comerciais e lotes, houve algum nível de alteração das respostas

lipogênicas na presença de BSA. Também foi testada uma albumina previamente

submetida à purificação por diálise (Spector, 1986) o que também não resolveu a

questão de estimulação da síntese de lipídios. Como é impossível submeter a fonte de

BSA a estes testes antes de cada experimento, sugeriu-se a utilização do PVA.

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Figura 1 - Lipogênese em explantes de tecido adiposo após 24 h de cultura com I+D

(insulina e dexametasona) ou 200 µM BSA (insulina, dexametasona e

albumina sérica bovina). Resultados expressos em µmoles de 14C-glucose

incorporada por g de tecido após 2 h de incubação sem adições (Basal) ou

com 1000 ng/mL de insulina (INS)

Consistentes com os dados da Figura 1, Walton & Etherton (1986) afirmam que

a adição de BSA, em quantidades elevadas pode alterar o efeito da insulina em estimular

a lipogênese no tecido adiposo de suínos. Estes mesmos autores observaram diferenças

entre fontes comerciais de BSA nos seus efeitos sobre a lipogênese. Foram utilizadas

incubações de explantes de tecido adiposo de suínos, por 2 horas, semelhantes ao do

presente trabalho. Os autores sugerem ainda que contaminantes nos preparados

comerciais incluem o IGF (fatores de crescimento semelhantes à insulina) e esteróides

entre outros. Estes resultados levaram à tentativa de encontrar outra molécula

carreadora. A alternativa testada foi a troca da BSA pelo PVA.

Os resultados do efeito PVA, na incorporação de glucose marcada com 14C, estão

na Tabela 1. Não foi detectado efeito para as interações: tratamento*estímulo (P=0,77),

Lipogênese após 24 h de cultura

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

I + D 200 uM BSA

Tratamentos

umol

es d

e gl

ucos

e in

corp

orad

a/g.

2h

Basal

INS

23

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tratamento*tempo (P=0,28), tempo*estímulo (P=0,79) e tempo*tratamento*estímulo

(P=0,85). Entretanto, foram detectados efeitos para tratamento (P<0,001), tempo

(P<0,001) e para Basal: 4803,26 e Insulina 5950,20 nanomoles de glucose

incorporada/g.2h (P<0,05).

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Tabela 1. Taxas de lipogênese em explantes de tecido adiposo, após 4, 12, 24 e 48 horas de

cultura com diferentes tratamentos

TRATAMENTOS1

C PVA pGH

Tempo2 Estímulo3 nanomoles de glucose incorporada/g.2h

4 Basal 7726,7 8272,5 4992,5

INS 9373,1 1003 7163,2

12 Basal 5923,4 5017,3 5003,7

INS 7286,2 6352,8 6238,9

24 Basal 5496,4 5389,0 3225,7

INS 8698,8 6901,3 5753,6

48 Basal 3347,9 2231,8 1660,3

INS 4997,3 2911,4 1500,2

Lipogênese3 6409,6 (1090,7) 5914,4 (1090,7) 3804,6 (1112,8)

EFEITOS4 C x PVA C x pGH PVA x pGH

ns ** * 1 Tratamentos: C: controle (100 ng/mL de insulina e 10 nM de dexametasona); PVA: 100 µM de

PVA e pGH: 100 ng/mL de pGH. 2 Tempo: após 4, 12, 24 e 48 horas de cultura. 3 M: média do Basal: (sem adição) e INS: (1000 ng/ml de insulina). 4 Lipogênese: médias e seus respectivos erros-padrão, em nanomoles de glucose incorporada por

g de tecido após 2 h de incubação, das culturas de explante de tecido adiposo de 9 animais. 5 Probabilidade das diferenças entre tratamentos (*P<0,05;**P<0,01; ns: P>0,10).

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Na Tabela 1 observa-se que a taxa de incorporação da glucose-14C em lipídios

para o tratamento com pGH foi menor do que para os demais. Esta redução é consistente

com a observada em diversos estudos com hormônio do crescimento. Os resultados

deste controle positivo demonstram que o sistema de cultura utilizado estava

metabolicamente ativo e respondendo adequadamente aos estímulos hormonais.

Para os tratamentos C e PVA não houve diferença para a taxa de síntese lipídica

(P=0,73), consistente com a hipótese proposta de que o PVA não altera o metabolismo

lipídico em culturas primárias de explantes do tecido adiposo. Os valores de P para as

comparações entre C e pGH, bem como entre PVA e pGH, também são consistentes

com a hipótese deste trabalho. O efeito do pGH é observado mesmo com a adição de

PVA ao meio, demonstrando que este componente não afeta as respostas a este

hormônio, nem a atividade de síntese lipídica ao longo dos diferentes tempos de

incubação. Entretanto, não pode deixar de ser notar que houve uma elevada variação

nestes parâmetros.

Os valores de lipólise (i.e. liberação de ácidos graxos não esterificados, após 2 h

de incubação), observados na Tabela 2, demonstram que não houve diferença entre os

tratamentos C e PVA (P=0,92). Foram detectados efeitos para tratamento (P<0,01),

estímulo (P<0,001). Entretanto, não houve significância estatística para a interação

tratamento*estímulo (P=0,44).

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Tabela 2. Taxas de lipólise (liberação de ácidos graxos em 2 h de incubação) em

explantes de tecido adiposo mantidos em cultura por 48 horas sob diferentes

tratamentos

TRATAMENTOS1

C PVA pGH M2

µmoles de AGNE/g.2 h

Estímulo3 BASAL 1,75 (0,85) 1,85 (0,90) 3,65 (0,85) 2,41

ISO 7,29 (0,90) 4,73 (1,70) 9,05 (0,90) 7,02

EFEITOS4

C x PVA C x pGH PVA x pGH

ns † *

1 Tratamentos: C: controle (100 ng/mL de insulina e 10 nM de dexametasona); PVA: 100 µM de PVA e pGH: 100 ng/mL de pGH.

2 M: média da lipólise Basal: (sem adição) e ISO: (10-5 M de isoproterenol). 3 Valores médios e dos erros-padrão de lipólise em µmoles de AGNE por g de tecido por 2 h de

incubação com os estímulos, após 48 h de cultura nos diferentes para cada tratamento. 4 Probabilidade das diferenças entre tratamentos (*P<0,05; †P<0,10; ns: P>0,10).

A falta de interação tratamento*estímulo mostra que os explantes responderam

aos tratamentos independentemente do estímulo. O tratamento com pGH induziu a um

aumento da mobilização de AGNE, com e sem isoproterenol (β-adrenérgico), o que

corrobora seu efeito em estimular a lipólise. Este controle positivo confirma a

capacidade do sistema em responder a um estímulo lipolítico.

Os resultados para a lipólise são semelhantes aos resultados para lipogênese e,

novamente parecem demonstrar que a adição de PVA ao meio de cultura não altera o

metabolismo dos explantes. Isto está demonstrado mesmo para o período mais longo de

cultura utilizado (48 horas) e confirma que este composto pode ser adicionado sem

alterar as respostas celulares.

Além dos efeitos da albumina sobre a síntese de lipídios in vitro, há

inconsistência nas metodologias propostas, na literatura, para formação do complexo

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AG:BSA. A metodologia utilizada por Park et al. (1997) se diferencia da de Mahoney et

al. (1977), na temperatura e período nos quais o complexo permanece para ser formado.

Matitashvili et al. (2001) testaram a relação 3:1, de AG:BSA em tecido de glândula

mamária de vacas lactantes, enquanto Brown et al. (2001) e Evans et al. (2002) testaram

as relações 4:1 e 4:1 de AG:BSA em células de estroma vascular de humanos e pré-

adipócitos 3T3-L1, respectivamente. Foram realizados, também, testes preliminares com

estas relações de 3:1 e 4:1 de AG:BSA, bem como alterações nos períodos e

temperaturas de formação do complexo, em cultura de explantes de tecido adiposo, mas

as respostas para o sistema permaneceram alteradas. Estas variações, na metodologia,

podem ser responsáveis pelas respostas variáveis e até contraditórias encontradas nos

trabalhos in vitro.

A utilização de PVA vem sendo testada em comparação com a BSA, em modelos

de cultura de embrião de camundongos (Nowshari & Bren, 2000) e de bovinos (Bhuiyan

et al., 2004; Orsi & Leese, 2004). Segundo Nowshari & Bren (2000) produtos biológicos

como a BSA, que são rotineiramente usados em soluções de congelamento de embriões,

podem expor os embriões a agentes infecciosos, reforçando, a busca pelo PVA ou fontes

alternativas.

O PVA é um polímero com peso molecular semelhante ao da albumina, servindo

como uma importante alternativa para carrear ácidos graxos em meio de cultura. Este

trabalho demonstra que sua utilização gera maior segurança em relação ao uso da

albumina. Com o grande aumento do interesse na pesquisa com lipídios bioativos, estes

resultados vão permitir o uso desta molécula no teste de diferentes ácidos graxos em

cultura.

3.4 Conclusões

A utilização do PVA, em culturas de explante de tecido adiposo, não alterou o

padrão de resposta lipogênica e lipolítica, tanto para as culturas Controle quanto para as

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estimuladas com hormônio do crescimento. As culturas reproduziram os mesmos

padrões de respostas crônicas ao hormônio do crescimento e agudas à insulina,

observados em estudos onde este tratamento foi aplicado in vivo e in vitro.

Em contraste, a albumina sérica bovina estimula a lipogênese e diferentes fontes

de albumina geram efeitos inconsistentes no metabolismo de culturas de tecido adiposo.

Portanto, a substituição da BSA pelo PVA parece ser uma alternativa para a realização

de estudos onde se necessite de uma molécula carreadora de lipídios bioativos.

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4 EFEITO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO trans-10, cis-12 EM

CULTURAS DE EXPLANTE DE TECIDO ADIPOSO DE SUÍNOS EM

CRESCIMENTO

Resumo

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do CLA trans-10, cis-12 em

culturas de explantes de tecido adiposo de suínos, em crescimento, sobre a lipogênese

(taxa de incorporação de glucose-14C em 2 h de incubação na presença e ausência de

insulina), lipólise (liberação de ácido graxos não esterificados - AGNE - em 2 h de

incubação na presença e ausência de isoproterenol), atividades de enzimas lipogênicas e

abundância do RNA mensageiro (RNAm) do gene da sintase de ácido graxo (FAS).

Explantes de tecido adiposo de nove suínos, em crescimento, (78±3 kg) foram

submetidos à cultura em meio 199 com insulina, dexametasona e antibióticos por 4, 12,

24 e 48 horas. Tratamentos foram: Controle - 100 µM de PVA (poliivinil álcool);

CLA200: 200 µM de CLA trans-10, cis-12; CLA50: 50 µM de CLA trans-10, cis-12;

LA: 200 µM de ácido de linoléico e pGH: 100 ng/mL de pGH (hormônio do

crescimento suíno) e 100 µM de PVA. Os ácidos graxos foram complexados ao PVA

(2:1), por 24 horas. Depois de cada período de cultura, os explantes foram submetidos ao

ensaio de lipogênese. Após 24 h, transcritos de RNAm da FAS foram quantificados por

RT-PCR em Tempo Real. A lipólise e atividade das enzimas FAS, glucose 6-fosfato

desidrogenase, 6-fosfogluconato desidrogenase e NADP-malato desidrogenase, foram

avaliadas após 48 horas. A incorporação de glucose diminuiu (P<0,05) com o tratamento

controle positivo (pGH). O ácido linoléico não teve nenhum efeito nos parâmetros

avaliados. O tratamento com CLA trans-10, cis-12 causou diminuição na atividade da

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31FAS (P<0,05), mas as enzimas da síntese de NADPH não foram afetadas por nenhum

tratamento. Coerente com a diminuição na atividade da FAS, sob efeito do tratamento

crônico com CLA, a síntese lipídica e abundância de RNAm foram reduzidas. O

controle positivo pGH aumentou a lipólise basal e estimulada (P<0,05) após 48 h de

cultura, mas o tratamento com CLA não afetou a liberação de AGNE. Estes dados

sugerem que o CLA trans-10, cis-12 altera a lipogênese e, particularmente a FAS, mas

não afeta a lipólise em cultura de tecido adiposo de suínos

EFFECTS OF trans-10, cis-12 CONJUGATED LINOLEIC ACID ON CULTURES

OF ADIPOSE TISSUE EXPLANTS OF GROWING PIGS

Summary

The objective of this study was to evaluate the effects of trans-10, cis-12 CLA on

cultures of adipose tissue explants from growing pigs on lipogenesis (measured as rate

of 14C labeled glucose incorporation over a subsequent 2 h incubation in presence or

absence of insulin), lipolysis (release of non-esterified fatty acid - NEFA - over a 2 h

incubation in presence or absence of isoproterenol), activities of lipogenics enzymes and

mRNA abundance of fatty acid synthase (FAS) gene. Adipose tissue explants from nine

growing pigs (78±3 kg) were cultured in medium 199 with insulin, dexamethasone and

antibiotics for 4, 12, 24 and 48 hours. Treatments were Control: 100 µM of PVA

(polyvinyl alcohol); CLA200: 200 µM of trans-10, cis-12 CLA; CLA50: 50 µM of

trans-10, cis-12 CLA; LA: 200 µM of linoleic acid and pGH: 100 ng/mL (porcine

growth hormone) and 100 µM of PVA. The fatty acids were complexed to PVA (2:1),

for 24 hours. After each culture period explants were collected and assayed for

lipogenesis. After 24 h transcripts of FAS mRNA were quantified by Real Time RT-

PCR. Lipolysis and activities of enzymes FAS, glucose 6-phosphate dehydrogenase, 6-

phosphogluconate dehydrogenase and NADP-malate dehydrogenase were evaluated

after 48 hours Glucose incorporation was decreased (P<0.05) in response to pGH

treatment (positive control). Linoleic acid had no effect on any parameter evaluated.

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32Treatment with trans-10, cis-12 CLA decreased FAS activity (P<0.05), but NADPH

generating enzymes were not affected by any of the treatments. Consistent with the

reduction on FAS activity, under chronic treatment with CLA, lipid synthesis and FAS

mRNA abundance were reduced. The positive control pGH increased basal and

stimulated lipolysis (P<0.05) after 48 h of culture, but CLA treatment had not effect on

NEFA release. These data suggest trans-10, cis-12 CLA alters lipogenesis and

particularly FAS, but does not affect lipolysis on cultures of pig adipose tissue.

4.1 Introdução

Desde a descoberta de uma substância presente na carne bovina, capaz de reduzir

o número de tumores (Pariza et al., 1979), diversos trabalhos demonstraram que este

efeito é mediado por, um ácido linoléico conjugado. Este composto é encontrado no leite

e carne de ruminantes, sendo formado como um intermediário na via da biohidrogenação

do ácido linoléico a ácido esteárico, por microorganismos presentes no rúmen e em

menor grau no intestino grosso. Existem mais de 20 diferentes isômeros do ácido

linoléico conjugado, na natureza, que são coletivamente chamados de CLAs.

Estudos demonstraram que os efeitos dos diferentes isômeros de CLA são

relacionados à antiobesidade, alteração da composição corporal de camundongos (Park

et al., 1997) e suínos (Bee, 2000; Dugan et al., 1999; Dugan et al., 1997; Ostrowska et al.,

1999; Thiel-Cooper et al., 2001), alterações na gordura do leite de vacas (Baumgard et al.,

2000; Chouinard, et al., 1999; Giesy et al., 1999; Medeiros et al., 2000) e sobre a atividade

de enzimas lipogênicas (Hayashi, 2003; Piperova et al., 2000; Lin et al., 2004).

Dentre os diversos isômeros de CLA, o trans-10, cis-12 é considerado

responsável por reduzir a síntese de gordura na glândula mamária e as concentrações de

RNA mensageiro (RNAm) de enzimas lipogênicas neste tecido (Baumgard et al., 2002;

Peterson et al.; 2003). Este isômero também está envolvido em mudanças na

composição corporal de camundongos, com redução na deposição de gordura e redução

na atividade da enzima lipoproteína lipase, em culturas de adipócitos de camundongos

3T3-L1 (Park et al., 1999). Efeitos do trans-10, cis-12 incluem inibição da atividade da

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33estearoil coenzima A dessaturase (SCD) (Baungard et al. 2001; Park et al., 2000) e

redução da abundância do seu RNAm (Choi et al., 2000; Lee et al., 1998), efeitos

antiadipogênicos em humanos (Brown & McIntosh, 2003) e aumento na razão

LDL:HDL em humanos saudáveis (Tricon et al., 2004).

Entretanto, a maioria das observações dos efeitos dos diferentes CLAs e do

isômero trans-10, cis-12, foi conduzida em modelos animais distintos, usando mistura

com diversos isômeros, doses distintas, com administrações in vivo e avaliações in vitro,

ou mesmo com administração in vitro, mas com linhagens celulares (e.g. 3T3-L1). Não é

de se estranhar, portanto, que os resultados encontrados sejam bastante variáveis.

Uma ferramenta, para avaliação dos mecanismos de ação do CLA, é cultura de

explantes de tecidos, por permitir a condução simultânea de muitas avaliações. No caso

de culturas primárias, há vantagens em termos de semelhança das respostas em relação

às linhagens celulares que já sofreram diversas mutações.

Em suínos, em crescimento, o tecido adiposo é muito importante fisiológica e

economicamente. Este tecido armazena as reservas energéticas corporais,

predominantemente na forma de lipídios (Bauman & Davis, 1975). Em função das dietas

utilizadas para esta espécie, a síntese de lipídios ocorre principalmente pela via de novo,

utilizando glucose como substrato. Geralmente as mudanças nas taxas de síntese lipídica

são paralelas às mudanças nas atividades de enzimas (Sinnet-Smith et al.1979), como a

sintase de ácido graxo (FAS), considerada entre as mais importantes reguladoras desta

via bioquímica.

Assim, o objetivo deste trabalho foi observar o efeito do tratamento com um

isômero específico, trans-10, cis-12, do CLA no metabolismo lipídico de suínos em

crescimento, especificamente, em culturas de explante de tecido adiposo subcutâneo.

Portanto, esse efeito foi avaliado para taxa de síntese de lipídios, mobilização de lipídios,

abundância de RNAm para o gene da FAS e atividade enzimática da FAS, glucose 6-

fosfato desidrogenase (G6PDH), 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGDH) e NADP-

malato desidrogenase (NADP-MD).

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344.2 Material e Métodos

4.2.1 Culturas de explantes de tecido adiposo de suínos

Nove suínos Landrace x Large White do Departamento de Zootecnia

ESALQ/USP, com peso médio de 78 + ou 3kg, foram abatidos e, aproximadamente, 20

g de tecido adiposo subcutâneo coletados da região dorsal posterior do pernil.

Imediatamente, foram transportados em tampão (25 mM de HEPES; 0,15 M de NaCl; 20

U/mL de penicilina; 20 µg/mL de estreptomicina; 5 µg/mL de neomicina e 2,5 µg/mL de

anfotericina B - Sigma; 37oC, pH 7,4). Explantes de 50-100 mg foram preparados a

partir da camada intermediária do tecido subcutâneo, em condições assépticas, e

incubados em meio 199 (25 mM de HEPES; 25 mM de bicarbonato; 20 U/mL de

penicilina; 20 µg/mL de estreptomicina; 5 µg/mL de neomicina e 2,5 µg/mL de

anfotericina B - Sigma; 37ºC, pH 7,4) de acordo com metodologia descrita por Lanna et

al. (1995). Ao meio de cultura foram adicionados os tratamentos: a) Controle - 100

ng/mL de insulina, 10 nM de dexametasona e 100 µM de poliivinil álcool (PVA-

Sigma); b) pGH - 100 ng/mL de insulina, 10 nM de dexametasona, 100 ng/mL de pGH

(hormônio do crescimento recombinante suíno - Reporcin®, Southern Cross Biotech) e

100 µM de PVA; c) CLA200 - 100 ng/mL de insulina, 10 nM de dexametasona e 200

µM de ácido linoléico conjugado trans-10, cis-12; d) CLA50 - 100 ng/mL de insulina,

10 nM de dexametasona e 50 µM de ácido linoléico conjugado trans-10, cis-12; e) LA -

100 ng/mL de insulina, 10 nM de dexametasona e 200 µM de ácido linoléico (LA -

Sigma). As placas foram mantidas em atmosfera contendo 95% Ar: 5% CO2 a 37oC por

4, 12, 24 e 48 horas.

Após esses períodos de cultura, os explantes foram submetidos às incubações

para determinação da lipogênese ou lipólise. Outros explantes foram coletados após 24

ou 48 horas de cultura e, imediatamente, congelados em N2 líquido, para posterior

quantificação da abundância do RNAm para o gene da FAS ou análises enzimáticas.

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354.2.2 Formação do complexo ácido graxo - poliivinil álcool

Para apresentação do substrato à cultura, o ácido graxo testado foi complexado

com PVA. Foram diluídos o CLA ou LA em dimetilsulfoxido (DMSO - Sigma) e

adicionado em 2,5 mM de PVA em PBS (tampão salino fosfato, pH 7,4), em condições

assépticas, e o pH ajustado para 7,4 a 37oC, mantidos por 24 horas. O tratamento

controle, com PVA apenas, foi preparado da mesma forma, excetuando-se a adição de

ácido graxo. A relação ácido graxo - poliivinil álcool foi de 2:1 e as doses de CLA,

utilizadas nas culturas de explantes de tecido adiposo, foram obtidas em ensaios

preliminares. No tratamento CLA200, a concentração do suplemento contendo CLA foi

de 212 µM, para que a concentração final fosse de 200 µM do isômero trans-10, cis-12.

Este CLA foi gentilmente cedido por Baungard et al. (2000) e sua composição pode ser

observada na Tabela 3.

Tabela 3. Análise de perfil de ácidos graxos do ácido linoléico conjugado utilizado

Ácidos graxos g/100g

16:0 1

18:0 0,3

18:1 cis-9 0,4

18:2 cis-9, cis-12 0,4

18:2 cis-9, trans-11 2,2

18:2 trans-10, cis-12 94,5

não determinado 1,2

Fonte: Natural Lipids Hovdebygda, Norway Ltd.

4.2.3 Ensaio de Lipogênese

Após cada período de incubação, os explantes foram coletados e transferidos

para frascos de cintilação contendo 2 mL de meio de lipogênese (KRB 1X - Krebs

Ringer buffer - 0,65 mM de CaCl2; 10 mM de HEPES; 10 mM de glucose e 0,5 µCi/mL

de glucose D-[14C (U)] - Amersham Biosciences; pH 7,4 a 37oC), sob atmosfera de 95%

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36O2:5% CO2, sob agitação, por 2 horas, a 37oC. Foram realizadas triplicatas das

incubações: a) Lipogênese Basal - sem adições; b) Lipogênese INS - estimulada com

1000 ng/mL de insulina. Posteriormente, foram submetidos às extrações de lipídios,

segundo Folch et al. (1957), com algumas modificações. Os explantes foram transferidos

para frascos de extração contendo 5 mL de metanol:clorofórmio 1:2. Após

permanecerem em descanso por 1 hora, adicionou-se 1 mL de NaCl 1% e a extração

prosseguiu por 12 a 16 horas. À fase inferior, foram adicionados 0,5 mL de hexano e 5

mL de líquido de cintilação (Sigma). Os frascos de cintilação foram encaminhados para

o Laboratório de Experimentação Nuclear, CENA/USP, para leitura em cintilador

automático (Beckman Instruments- LS 5000 TD - Liquid Scintillation System) e a

lipogênese expressa em nanomoles de glucose incorporada por grama de tecido por 2

horas.

4.2.4 Quantificação do RNA mensageiro da sintase de ácido graxo

4.2.4.1 Extração de RNA total e síntese de DNAc

O RNA total foi isolado dos explantes, utilizando-se o reagente Trizol

(Invitrogen). Amostras foram dissolvidas em água livre de RNAases e quantificadas em

espectofotômetro a 260 nm (A260). A pureza do RNA total foi determinada pela relação

A260:A280 e a integridade, observada em eletroforese em gel de agarose 1%. Amostras

de DNAc (DNA complementar a população de RNAm) foram preparadas a partir de 3

µg de RNA total, usando como primer oligo (dT). A síntese de DNAcs foi feita com o

emprego do Kit SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen),

segundo protocolo do fabricante.

4.2.4.2 PCR em Tempo Real

A RT-PCR em Tempo Real é uma técnica rápida e acurada que permite a

quantificação dos produtos da PCR, em tempo real, sendo sensível para quantificar os

produtos na fase exponencial da reação.

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37 O método escolhido para a quantificação dos resultados foi o método de

quantificação relativa, uma vez que não é necessário saber o número absoluto de

transcritos de cada gene e sim a diferença de expressão em relação a um gene

constitutivo. Para tanto, utilizou-se, como gene controle, a β-actina (Giulietti et al. 2001)

e os resultados foram analisados segundo Pfaffl (2001).

As reações de PCR continham 2 µL de DNAc, 0,25 µM dos primers direto e

reverso, para cada gene, e 1X AbsoluteTM QPCR SYBR® Green Mix - ABgene, em um

volume final de 10 µL (50 ciclos de reação, denaturação a 95oC por 10 seg., anelamento

a 56oC, 15 seg. e extensão a 72oC, 20 segundos). Os primers foram desenhados para

amplificação de um produto de 126 pares de bases (pb) de DNAc do gene da FAS (5’

CGG CTC ACA CAC CTT CGT 3’- direto e 5’ TGC TCC ATG TCG GTG AAC T 3’-

reverso) e um fragmento de 150 pb para o gene da β-actina (5’ TGG TGG GTA TGG

GTC AGA A 3’ - direto e 5’ GCT CGT TGT AGA AGG TGT GG 3’- reverso, Dialab

Diagnóstico). As quantificações foram realizadas no Laboratório de Melhoramento de

Plantas, CENA/USP, no equipamento RotorGene 3000 (Corbett Research).

4.2.5 Ensaio de lipólise

Após os períodos de incubação de 48 horas, os explantes foram coletados e

incubados em 2 mL de meio de lipólise (KRB 1X - 0,65 mM de CaCl2; 2,5 mM de

HEPES; 5,6 mM de glucose e 3 % de BSA; pH 7,4 a 37oC), sob atmosfera de 95 % O2:5

% CO2, sob agitação, por 2 horas, a 37oC. Foram realizadas triplicatas das incubações: a)

Lipólise Basal - sem adições e b) Lipólise ISO - estimulada com 10-5 M de

isoproterenol. Após este período, alíquotas dos meios foram coletadas para análise de

ácidos graxos não esterificados (AGNE). A concentração de AGNE foi determinada por

método enzimático colorimétrico, a 540 nm, utilizando-se o kit NEFA C® (Wako

Chemicals). As leituras de absorbância foram realizadas no Laboratório Biologia

Molecular de Plantas, ESALQ/USP, em Leitor de Elisa (Spectra Max Plus – Molecular

Devices), utilizando-se microplacas com poços de 200 µL onde foram adicionadas

amostras, padrões e reagentes. Os valores de absorbâncias foram convertidos em

concentração (µmol de ácido oléico/L) através da curva-padrão determinada e as

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38concentrações de AGNE obtidas foram corrigidas para o peso, em gramas, de cada

explante e expressas em µmoles de ácido oléico por g de tecido por 2 horas.

4.2.6 Ensaios enzimáticos

4.2.6.1 Homogeneização dos explantes de tecido adiposo

As amostras da cultura de tecido adiposo subcutâneo foram, ainda congeladas,

adicionadas em tampão contendo 0,15 M KCl, 50 mM Tris, 1 mM Glutationa e 1 mM

EDTA (pH 7,4 a 4oC) e homogeneizadas rapidamente em homogeneizador (Polytron -

PT MR 21-00, Kinematica AG), seguindo-se centrifugação a 4oC, 2000 x g por 15 min.,

centrifugado, novamente, por 30 min., 4oC e 27000 x g. Parte do homogenato obtida foi

utilizada para determinação do teor de proteína e parte, nos ensaios enzimáticos.

4.2.6.2 Teor de proteína

O teor de proteína dos homogenatos foi determinado com reagente Biureto

segundo Gornall et al. (1949).

4.2.6.3 Sintase de ácido graxo (EC 2.3.1.85)

O ensaio da enzima FAS foi realizado de acordo com Ingle et al. (1973), com

algumas modificações. As concentrações dos reagentes foram: 40 mM de tampão

fosfato-potássio mais EDTA (pH 6,8), 0,1 mM malonil CoA, 0,1 mM acetil CoA, 0,3

mM NADPH e 0,4 mM ditiotreitol. A atividade foi determinada através do

acompanhamento da transformação de NADPH em NADP em incubações contendo

substratos, cofatores e o homogenato do tecido adiposo em cubetas sob

espectofotômetro a 340 nm e, expressa, em nmoles de NADPH incorporado/min. mg de

proteína.

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394.2.6.4 NADP-malato desidrogenase (EC 1.1.1.40)

O ensaio da enzima NADP-malato desidrogenase foi realizado segundo Bauman

et al. (1970). A atividade foi determinada monitorando-se a transformação de NADP em

NADPH em incubações, contendo substratos, cofatores e o homogenato em cubetas sob

espectofotômetro a 340 nm e, expressa, em nmoles de NADPH produzido/min. mg de

proteína.

4.2.6.5 Atividade da 6-fosfogluconato desidrogenase (EC 1.1.1.44) e glucose 6-fosfato

desidrogenase (EC 1.1.1.49)

Os ensaios foram realizados segundo Glock & McLean (1953). A atividade da 6-

fosfogluconato desidrogenase foi determinada através do monitorar da transformação de

NADP em NADPH, em incubações contendo substratos, cofatores e o homogenato em

cubetas sob espectofotômetro a 340 nm e, expressa, em nmoles de NADPH

produzido/min. mg de proteína. Para determinação da atividade da glucose 6-fosfato

desidrogenase, foram medidas as atividades de ambas as enzimas, conjuntamente, e, a

partir da atividade obtida, subtraída a atividade da 6 fosfogluconato desidrogenase.

4.2.7 Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o Proc Mixed (SAS, 1999).

Para análise de variância do ensaio de lipogênese, com medidas repetidas no tempo, foi

utilizado um modelo envolvendo os efeitos fixos de tratamentos, estímulo, tempo e suas

interações e efeitos aleatórios de animal dentro do tratamento e animal dentro do

tratamento*estímulo que foram os erros para testar efeito de tratamento e de estímulo,

respectivamente. Tendo em vista que o tempo não foi igualmente espaçado, foi usada a

estrutura de covariância do tipo SP(POW) (tempo), conforme recomendado (Littel et al.,

1996).

No ensaio de lipólise, a análise de variância foi feita de acordo com o modelo de

experimento com parcela subdividida, tendo tratamentos aplicados nas parcelas e

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40estímulo às subparcelas. Para os dados de atividade das enzimas e RNAm, a análise de

variância foi baseada no modelo inteiramente casualizado. Comparações de médias

foram feitas pelo teste de Tukey.

4.3 Resultados e Discussão

Na Tabela 4 observam-se os resultados obtidos do efeito dos tratamentos nas

culturas de explantes de tecido adiposo incubadas, por 4, 12, 24 e 48 horas, sobre a

incorporação de glucose marcada com 14C. Foram detectados efeitos para tratamento

(P=0,008) e tempo (P<0,001). Não foi detectado efeito para as interações:

tratamento*estímulo (P=0,41), tratamento*tempo (P=0,69), tempo*estímulo (P=0,41) e

tempo*tratamento*estímulo (P=0,99) e para Basal: 5019,80 e Insulina: 5764,14 em

nanomoles de glucose incorporada/g.2h (P=0,05).

Tabela 4. Taxas de lipogênese em explantes de tecido adiposo, após 4, 12, 24 e 48 horas

de cultura com diferentes tratamentos

TRATAMENTOS1

C pGH LA CLA50 CLA200

Lipogênese2 5913,1 (991,9)

3816,9 (1013,2)

5802,2 (985,6)

5861,2 (999,1)

5568,6 (1015,4)

EFEITOS3

C x

CLA200

CLA200 x

CLA50

CLA200 x

LA

CLA200 x

pGH

C x

CLA50

CLA50 x

LA

CLA50 x

pGH

C x

LA

LA x

pGH

C x

pGH

ns ns ns ns ns ns * ns * * 1 Tratamentos: C: controle (100 µM de PVA); pGH: 100 ng/mL de pGH; LA: 200 µM de LA;

CLA50: 50 µM de CLA trans-10, cis-12 e CLA200: 200 µM de CLA trans-10, cis-12. 2 Lipogênese: médias e seus respectivos erros-padrão, das culturas de explante de tecido adiposo

de 9 animais. 4Probabilidade das diferenças entre tratamentos (*P<0,05; ns: P>0,10).

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41Foi observada uma queda na taxa de incorporação de 14C ao longo dos períodos

de incubação. Embora esta queda tenha sido um pouco superior à observada em outros

trabalhos, as taxas finais são altas o suficiente para demonstrar que os explantes de

tecido adiposo estavam metabolicamente ativos. O fato de que as culturas responderam

ao efeito do pGH, nas últimas 24 horas, demonstra também que o tecido estava

respondendo ao controle positivo. Entretanto, o efeito de inibição da síntese de gordura

pelo pGH foi menor do que o observado em experimentos sob as mesmas condições de

cultura de tecido adiposo de suínos (Etherton et al., 1995; Lanna et al., 1994) e de vacas

em lactação in vivo e in vitro (Lanna & Bauman, 1999; Lanna et al., 1995). Este fato

pode ter ocorrido devido ao alto coeficiente de variação observado nas triplicatas de

incubação.

Uma hipótese deste trabalho era de que o CLA reduziria a taxa lipogênica.

Entretanto este efeito não foi demonstrado, apesar de haver uma diferença numérica

neste sentido. Alterações na lipogênese podem ser função de diferenças na quantidade de

enzimas chave na via bioquímica, na ativação destas enzimas e na quantidade de

substratos presentes. No caso da lipogênese, além da FAS, também, a atividade da

enzima acetil coenzima A carboxilase (ACC) é muito importante. Com relação à

quantidade de substrato, um possível efeito do CLA no transportador de glucose 4 (Glut

4) poderia afetar a entrada de substratos na célula. A redução no RNAm do Glut 4, no

tecido adiposo marrom e branco de camundongos tratados com uma mistura de isômeros

de CLA, foi observada após 21 dias de administração (Takahashi et al., 2002).

Os efeitos do CLA, bem como os mecanismos envolvidos na incorporação

lipogênica, ainda não são totalmente esclarecidos. Satory & Smith (1999) observaram

que uma mistura de isômeros de CLA (41% cis-9, trans-11 e 44 % trans-10, cis-12) na

dosagem de 6 µM promoveu o acúmulo de lipídios através da via de novo (i.e. que

utiliza a glucose como substrato) em pré-adipócitos 3T3-L1. De forma contraditória,

Park et al. (1997) observaram redução na atividade da lipoproteína lipase com um

aumento na liberação de AGNE, no meio de cultura, utilizando a mesma linhagem

celular, mas com uma dose maior (100 µM) de outra mistura de isômeros de CLA

(aproximadamente 50% cis-9, trans-11 e 50 % trans-10, cis-12). Certamente que as

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42diferentes misturas de isômeros e as diferentes doses empregadas podem explicar estes

efeitos contrastantes. Entretanto, a maior parte dos trabalhos é consistente em

demonstrar um efeito do isômero trans-10, cis-12 na lipogênese. Estes efeitos parecem

estar ligados à interação entre os CLAs e alguns fatores de transcrição, entre eles,

proteína de ligação ao elemento regulatório de esterol (SREBP; Takahashi et al., 2003).

De acordo com a hipótese deste trabalho, e também com a menor taxa numérica

de síntese de lipídios na presença de CLA, a atividade da FAS (Tabela 5) foi reduzida

pelo tratamento com CLA trans-10, cis-12 na dose mais elevada (200 µM). Além do

efeito observado para o tratamento CLA200, houve um efeito para o pGH, mais uma vez

acompanhando a diminuição da taxa de lipogênese. Em função da meia vida da proteína

ser superior a 48 h (Dice & Goldberg, 1975), mesmo no caso das incubações de longo

prazo (i.e. 48 horas), é possível que o período relativamente curto dificulte que se

demonstrem efeitos na concentração desta enzima. Entretanto, os efeitos do CLA foram

pronunciados e, mesmo no tratamento com o pGH, superiores aos observados em outros

trabalhos (Lanna et al., 1994).

Tabela 5. Atividades enzimáticas de explante de tecido adiposo, após 48 h de cultura

ENZIMAS2

TRATAMENTOS1

C pGH LA CLA50 CLA200

FAS 22 (5,10)a 6,7 (5,60)b 22,2 (4,30)a 17,1 (4,70)ab 8,6 (4,70)b

G-6PDH 46,1 (9,60)a 43,9 (14,0)a 64 (9,30)a 58,1 (10,7)a 64,6 (10,6)a

6-PGDH 41,3 (4,60)a 44,5 (5,70)a 39,7 (3,90)a 45,2 (5,70)a 54,5 (5,00)a

NADP-MD 131,8 (10,8)a 136,1 (11,8)a 139,3 (10,1)a 123,1 (10,1)a 144 (10,1)a 1 Tratamentos: C: controle (100 µM de PVA); pGH: 100 ng/mL de pGH; LA: 200 µM de LA;

CLA200: 200 µM de CLA trans-10, cis-12 e CLA50: 50 µM de CLA trans-10, cis-12. 2 Enzimas: FAS: sintase de ácido graxo; G-6PDH: glucose 6- fosfato desidrogenase; 6-PGDH,

6-fosfogluconato desidrogenase; NADP-MD, NADP-malato desidrogenase. Valores médios e seus respectivos erros-padrão em nanomoles de NADPH incorporado/g.2h, para FAS e em nanomoles de NADPH produzido/g.2h para G-6PD, 6-PGD e NADP-MD.

3Letras distintas na mesma linha, diferem estatisticamente (P<0,05), com exceção para FAS onde a interação entre os tratamentos C x pGH (P<0,10).

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43As reduções nas atividades da FAS não foram acompanhadas por reduções

semelhantes nas atividades das enzimas do ciclo das pentoses (i.e. produção de NADPH)

(Tabela 5). Isto é esperado uma vez que diversos tratamentos de efeito pronunciado

sobre a síntese de lipídios, inclusive o hormônio do crescimento, não têm demonstrado

efeitos paralelos nas atividades das enzimas que geram NADPH (Hayashi, 2003; Lanna,

1993). Isto sugere que a abundância destas enzimas é tal que elas não funcionam como

reguladoras destas vias bioquímicas.

Coerente com a menor atividade encontrada para a FAS, e também com a menor

a taxa numérica de lipogênese, a abundância de RNAm para a FAS, após 24 horas de

cultura foi reduzida em relação ao controle (Tabela 6). Este efeito do CLA trans-10, cis-

12 era esperado em função da literatura ter demonstrado tais reduções, principalmente,

em tecido da glândula mamária (Matitashvili et al., 2001).

A razão da transcrição do RNAm da FAS corrigida para a transcrição da β-actina

e as eficiências de amplificação, foi de 74 e 76% em relação ao controle (Tabela 6).

Estes valores são pequenos, mas semelhantes às diferenças observadas para as taxas

lipogênicas. São valores bastante distintos das mudanças na atividade da FAS, embora a

razão para esta discrepância não esteja clara. Não houve diferença na abundância

relativa do RNAm da FAS para o tratamento com CLA, na dose mais baixa (50 µM).

Entretanto, para o tratamento com LA a quantidade de RNAm foi maior do que para o

tratamento controle e para ambos os tratamentos com CLA.

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44Tabela 6. Valores de transcritos do RNA mensageiro da FAS

TRATAMENTOS1

C pGH LA CLA50 CLA200

RNAm2 - 0,74 1,45 1 0,76

1Tratamentos: C: controle; LA: 200 µM de LA; pGH: 100 ng/mL de pGH; CLA200: 200 µM de CLA trans-10, cis-12 e CLA50: 50 µM de CLA trans-10, cis-12.

2Valores dos transcritos do RNAm para o gene da FAS em relação à transcrição da β-actina, para cada tratamento, em relação ao tratamento controle.

Em experimentos onde foram observadas alterações na abundância de RNAm

das enzimas envolvidas no metabolismo lipídico, as dietas com CLA trans-10, cis-12

foram administradas por um período de tempo maior (3 semanas). Após 3 semanas

Peterson et al. (2003) observaram reduções na abundância do RNAm da FAS e ACC,

em biópsias de tecido da glândula mamária de vacas lactantes, condizentes com

alterações na secreção dos ácidos graxos na gordura do leite. Entretanto, Choi et al.

(2000) com linhagens de pré-adipócitos 3T3-L1, mantidas com CLA trans-10, cis-12,

durante a diferenciação, não observaram alterações na expressão da FAS, medida pelo

seu RNAm.

Em trabalho anterior, testando o efeito do pGH sob as mesmas condições de

cultura, José (2000) observou uma redução de 22% na atividade enzimática da FAS,

acompanhada de uma redução na abundância do RNAm de 70%, após 48 horas de

incubação. Neste trabalho os efeitos foram semelhantes em direção, mas de magnitudes

diferentes. A diferença entre a meia vida da proteína da FAS (i.e. em torno de 48 horas)

e do RNAm correspondente (i.e. 3 a 5 horas; Back et al., 1986) sugerem que se esperaria

uma diferença maior para a abundância de RNAm em relação à proteína.

Baumgard et al. (2002) observaram uma redução na abundância do RNAm da

FAS, ACC e SCD, em biópsias de glândula mamária de vacas que receberam infusão

abomasal de CLA trans-10, cis-12. Entretanto, o período de tratamento foi de 5 dias. Lin

et al. (2004), também, observaram uma redução na atividade da ACC e do seu RNAm,

na glândula mamária de ratas lactantes que receberam CLA trans-10, cis-12 de 4 a 15

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45dias pós-parto. Entretanto, para a FAS, só foi observada redução na abundância do

RNAm e não na atividade, apesar do longo período de tratamento. De forma distinta do

observado na glândula mamária, no fígado destes mesmos animais, as taxas de atividade

e o RNAm da ACC e da FAS não foram afetadas (Lin et al., 2004). Consistente com os

dados deste trabalho Hayashi (2003) observou uma redução na atividade da FAS e da G-

6PDH e 6-PGDH, no fígado e na glândula mamária de ratas que receberam dietas com

CLA60 (contendo 35% de CLA trans-10, cis-12) de 1 aos 15 dias pós-parto. No tecido

adiposo das ratas utilizadas por Hayashi (2003) somente a atividade da FAS foi

reduzida, semelhantemente aos dados deste trabalho e corroborando dados de redução na

atividade da FAS, na glândula mamária de vacas (Piperova et al., 2000). No estudo de

Hayashi (2003), como no presente trabalho, não houve diferenças nas atividades das

enzimas geradoras de NADPH.

Segundo Mersmann (2001), as respostas com CLA podem diferir entre espécies

devido ao padrão do metabolismo lipídico ser espécie-específico, tornando, assim, a

comparação dos resultados um pouco delicada. Um aspecto importante nestas

comparações é que, nos roedores, o tecido adiposo não é o sítio mais importante

quantitativamente na síntese de lipídios, ao contrário dos suínos em que a síntese de

novo de gorduras ocorre na grande maioria no próprio tecido adiposo, pela ação de

enzimas ali presentes.

Corino et al. (2003) não observaram diminuição na atividade da NADP-MD e G-

6PDH, no tecido adiposo de suínos que receberam uma mistura de isômeros de CLA.

Entretanto, houve uma queda na atividade da ACC. Contraditoriamente, Bee (2000)

avaliando o efeito de uma mistura de isômeros de CLA, na dieta inicial dos leitões,

observou um aumento da atividade da G-6PDH e NADP-MD no tecido adiposo. Estas

mudanças não foram acompanhadas de aumentos na atividade da FAS.

Os efeitos dos tratamentos sobre a lipólise, após 48 h de tratamento em cultura,

foram avaliados pela liberação de ácidos graxos não esterificados em período de 2 h de

incubação (Tabela 7) sem adições (basal) e na presença de isoproterenol (β-

adrenérgico). Houve efeito dos tratamentos (P<0,001), do estímulo com isoproterenol

(P<0,001), mas não houve efeito para a interação tratamento*estímulo (P=0,13).

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46

Tabela 7. Taxas de lipólise em explantes de tecido adiposo mantidos em cultura por 48

horas sob diferentes tratamentos

TRATAMENTOS1

C pGH LA CLA50 CLA200 M2

µmoles de AGNE/g.2 h

Estímulo3 BASAL 1,85 (0,73) 3,65 (0,69) 1,34 (0,69) 1,30 (0,69) 1,92 (0,69) 2,01

ISO 4,85 (1,4) 9,00 (0,73) 3,34 (0,69) 4,24 (0,69) 5,54 (0,69) 5,39

EFEITOS4

C x

CLA200

CLA200 x

CLA50

CLA200 x

LA

CLA200 x

pGH

C x

CLA50

CLA50 x

LA

CLA50 x

pGH

C x

LA

LA x

pGH

C x

pGH

ns ns ns * ns ns ** ns ** * 1Tratamentos: C: controle (100 µM de PVA); pGH: 100 ng/mL de pGH; LA: 200 µM de LA;

CLA200: 200 µM de CLA trans-10, cis-12 e CLA50: 50 µM de CLA trans-10, cis-12. 2 Valores médios em µmoles de AGNE por g de tecido por 2 horas, de cada estímulo. 3 Valores das médias e dos erros-padrão do Basal (sem adições) e ISO (10-5 M de isoproterenol),

para cada tratamento. 4 Probabilidade das diferenças entre tratamentos (*P<0,05; **P<0,01; ns: P>0,10).

O tratamento com pGH induziu a um aumento da mobilização de AGNE com e

sem isoproterenol, o que é consistente com seu efeito em estimular a lipólise. Estes

resultados sugerem que os mecanismos lipolíticos dos explantes, em cultura, eram

capazes de responder aos tratamentos. Para o tratamento CLA200, tanto na lipólise basal

quanto na estimulada, não se observaram diferenças na taxa de liberação de AGNE no

meio.

Em pré-adipócitos 3T3-L1 tratados com CLA trans-10, cis-12 por 6 dias

observou-se um aumento de 18% na lipólise basal, medida pela liberação de glicerol em

relação ao controle. Houve também um acréscimo de 300 vezes na liberação de glicerol,

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47na lipólise estimulada com isoproterenol e adenosina deaminase. Ao contrário, nesta

mesma condição de estímulo, o CLA cis-9, trans-11 causou uma queda de 11% na

liberação de glicerol no meio (Evans et al., 2002). Em contraste com estes resultados e

semelhantes aos dados obtidos neste estudo, em culturas primárias de células do estroma

vascular de tecido adiposo humano, tratadas com trans-10, cis-12 ou cis-9, trans-11, por

3 dias, nenhum isômero de CLA afetou a lipólise medida pela liberação de glicerol

(Brown et al., 2001).

A falta de efeito do CLA sobre a lipólise, conforme se observou neste trabalho,

por Brown et al. (2001), em tecido adiposo de camundongos (Xu et al., 2003) e em

trabalhos in vivo com vacas em lactação (Perfield et al., 2002), sugere que este isômero

tem um efeito mais pronunciado na inibição da síntese do que no estímulo à mobilização

de gorduras já depositadas. Isto é consistente com o pequeno sucesso deste isômero do

CLA, na redução da gordura corporal e no combate à obesidade em humanos.

4.4 Conclusões

O sistema in vitro respondeu ao controle positivo (hormônio do crescimento)

tanto para lipogênese (decréscimo), quanto para lipólise (aumento), como para a

atividade da FAS (decréscimo), sugerindo estar adequado para os testes com CLA.

O tratamento com CLA trans-10, cis-12, na maior concentração (200 µM),

reduziu a atividade da FAS, enzima chave na regulação da síntese de lipídios, em

relação ao ácido linoléico. Coerente com esta redução houve diminuições numéricas na

abundância de RNAm da FAS e na taxa de síntese de lipídios. A mobilização lipídica

não foi alterada sob efeito do CLA trans-10, cis-12.

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5 CONCLUSÕES GERAIS

Ensaios iniciais, consistentes com a literatura, demonstraram que a albumina

sérica bovina altera as taxas de lipogênese e lipólise, não sendo um veículo adequado

para apresentação de ácidos graxos bioativos ao tecido adiposo em cultura.

A utilização do PVA, em culturas de explante de tecido adiposo, não alterou o

padrão de resposta celular (lipogênese e lipólise) ao hormônio do crescimento utilizado

como controle positivo. Os resultados sugerem que esta é uma melhor opção de

molécula carreadora de ácidos graxos em cultura.

Os efeitos do CLA trans-10, cis-12 no metabolismo de gordura foram tênues.

Apenas o tratamento com a dosagem mais elevada (200 µM de CLA trans-10, cis-12)

resultou em redução significativa da atividade da FAS, e reduções numéricas de 24% na

abundância do seu RNAm e 6% na lipogênese.

O CLA trans-10, cis-12 parece ter um efeito inibitório sobre o mecanismo de

síntese de lipídios, mas não sobre a mobilização em culturas de tecido adiposo de suínos.

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