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RENATA CONDURU RIBEIRO

EFEITO DO ARMAZENAMENTO NA QUALIDADE

FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE Gliricidia sepium (J acq.)

Steud. (LEGUMINOSAE ­ PAPILIONOIDEAE).

FEIRA DE SANTANA 2008

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RENATA CONDURU RIBEIRO

EFEITO DO ARMAZENAMENTO NA QUALIDADE

FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.

(LEGUMINOSAE ­ PAPILIONOIDEAE).

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós Graduação em Botânica, como parte

dos requisitos exigidos para obtenção do

título de MESTRE em BOTÂNICA, na

área de concentração de Fisiologia

Vegetal.

ORIENTADORA: DRA. CLAUDINÉIA REGINA PELACANI CO­ORIENTADOR: DR. RENATO DELMONDEZ DE CASTRO

3

“ Se não houver frutos, valeu a beleza das flores.

Se não houver flores, valeu a sombra das folhas.

Se não houver folhas, valeu a intenção da semente.”

Henfil

À minha mãe, Risete e o meu pai Manoel pelo apoio e amor incondicional,

dedico

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AGRADECIMENTOS

A força superior que nos protege “Deus”, pela conquista;

Aos meus pais pelo confiança, incentivo, apoio, amor incondicional que me deram toda

vida e que me fez tornar quem sou;

As minhas irmãs pela confiança e pela companhia mesmo estando distante;

A Claudinéia Regina Pelacani pela orientação, alegria, ensinamentos não somente

profissionais, mas também de vida, pode ter certeza que ainda estaremos juntas por um

bom tempo, “minha mãe postiça”;

A minha amiga Cimille que apesar de ter caído de pára­quedas em cima de mim, foi

uma aterrissagem muito bem feita. Obrigada pelo companheirismo, cumplicidade, apoio

em vários momentos difíceis que dividimos direitinho;

A meus companheiros, Jonaicon e Hugo podem ter certeza que vocês foram

fundamentais nessa caminhada e os fins de semana perdidos vão valer a pena na frente;

Ao seu José Juracy, seu apoio foi uma peça chave desse trabalho, sem as nossas várias

conversas pelo telefone, sem as coletas, sem a sua disposição o tempo todo nada teria

acontecido com sucesso;

Aos funcionários do Horto pela colaboração, em especial a Dona Zezé pela atenção e

carinho, seus chazinhos sempre me fortaleceram;

A Flavia que entrou como uma luz no meu caminho, uma amiga pra todas as horas, que

será inesquecível;

A Embrapa Semi­Árido pelo apoio, em especial a Dra. Bárbara pela colaboração. Com

certeza estarei presente quando precisar;

Aos amigos, Fabrício, Armando, Zizinho e Alberto que fizeram minhas análises ficarem

tão simples com a alegria contagiante deles o tempo todo;

5

Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida;

À FAPESB pelo financiamento do projeto;

A todos que, de alguma maneira contribuíram para que eu conseguisse chegar até aqui,

seja com um sorriso, um incentivo ou simplesmente com a força positiva do

pensamento em mim.

Agradeço a todos, com muito carinho.

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO........................................................................................................... 8 1.1 Impor tância e Caracter ização da Espécie ........................................................ 9 1.2 Caracter ização do Ambiente........................................................................... 12 1.3 Armazenamento de Sementes ......................................................................... 13 1.4 Aspectos fisiológicos da germinação de sementes........................................... 16

OBJETIVO ............................................................................................................... 20 CAPÍTULO I............................................................................................................. 21 Effects of storage on seed viability in Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae)............................................................................ 21 ABSTRACT .......................................................................................................... 22 RESUMO .............................................................................................................. 23 INTRODUCTION................................................................................................. 24 MATERIAL AND METHODS ............................................................................ 26 RESULTS.............................................................................................................. 28 DISCUSSION........................................................................................................ 32 ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................. 34 REFERENCES...................................................................................................... 35

CAPÍTULO II ........................................................................................................... 38 Reserve mobilization during imbibition of stored Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. seeds. ...................................................................................................................... 38 ABSTRACT .......................................................................................................... 39 RESUMO .............................................................................................................. 40 INTRODUCTION................................................................................................. 41 MATERIAL AND METHODS ............................................................................ 44 RESULTS.............................................................................................................. 47 DISCUSSION........................................................................................................ 53 ACKNOWLEDGMENTS..................................................................................... 56 REFERENCES...................................................................................................... 57

CAPÍTULO III.......................................................................................................... 61 Amylolitc activity and physiological quality of Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae) seeds dur ing storage. ........................................ 61 ABSTRACT .......................................................................................................... 62 RESUMO .............................................................................................................. 63 INTRODUCTION................................................................................................. 64 MATERIALS AND METHODS .......................................................................... 66 RESULTS.............................................................................................................. 69 DISCUSSION........................................................................................................ 74 ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................. 75 REFERENCES...................................................................................................... 76

CAPÍTULO IV.......................................................................................................... 79 Déficit hídr ico em sementes armazenadas de Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae)............................................................................ 79 ABSTRACT .......................................................................................................... 80 RESUMO .............................................................................................................. 81 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 82 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 84 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 86 AGRADECIMENTOS.......................................................................................... 94

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 95 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................... 99 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CITADAS NA INTRODUÇÃO GERAL 100 RESUMO GERAL .................................................................................................. 104 ABSTRACT OF DISSERTATION ........................................................................ 105

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INTRODUÇÃO

Nos últimos anos tem se intensificado o interesse na propagação de espécies

florestais, ressaltando­se a necessidade de recuperação de áreas degradadas e

recomposição da paisagem natural. Entretanto é restrito o conhecimento disponível para

o manejo e análise das sementes da maioria das espécies de modo a caracterizar seus

atributos físicos e fisiológicos. Há também a necessidade de se obter informações

básicas sobre a germinação, o cultivo e as potencialidades dessas espécies nativas ou

introduzidas, visando sua utilização para os mais diversos fins.

Comunidades vegetais como, a caatinga, predominante na região do nordeste

brasileiro, são submetidas à escassez de água por períodos prolongados e tendem a ser

dominadas por plantas nativas ou cultivadas que apresentam características de

tolerância a seca e que sobrevivem à seca através de sementes armazenadas nos bancos

de solos.

Considerando­se que os estudos com sementes são o ponto de partida para a

utilização e exploração, de forma racional, de algumas espécies potenciais, o

conhecimento sobre os processos fisiológicos de sementes armazenadas é de

fundamental importância, uma vez que, a longevidade destas é bastante influenciada

pelas condições do armazenamento. A manutenção da viabilidade das sementes durante

o armazenamento depende diretamente do teor de água encontrado nas unidades de

dispersão. Esta dependência está relacionada à intensidade das reações químicas e

metabólicas que caracterizam a atividade fisiológica das sementes, refletindo

diretamente no seu desempenho germinativo.

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1.1 Impor tância e Caracter ização da Espécie

Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. é uma planta nativa da América do Sul e

Central, com distribuição pelas regiões tropicais (SUMBERG, 1985). Segundo Duque

(1998), esta espécie ocorre naturalmente do México até a Colômbia, Venezuela e

Guianas. Desde os tempos pré­colombianos, G. sepium já era cultivada além das áreas

de ocorrência natural, tendo sido domesticada em Cuba, Jamaica, Havaí, África

Ocidental e Meridional, Índia, Siri Lanka, Tailândia, Filipinas, Indonésia e Austrália

(PARROTTA, 1992).

Vulgarmente conhecida no Brasil como gliricidia, no México e em países da

América Central como “madero negro”, “mata ratón”, “madre de cacao”, G. sepium, é

uma espécie pertencente à família Fabaceae sendo de grande interesse comercial e

econômico para regiões tropicais, devido às suas características de uso múltiplo. É uma

planta perene, que se reproduz sexuada (por semente) e assexuadamente (por estacas).

Apresenta porte arbóreo variando de 12 a 15 metros de altura, com diâmetros de até 30

cm (NATIONAL ACADEMY SCIENCES, 1980) e crescimento cespitoso (touceiras),

formando em média 4 a 5 fustes. Possui casca fina, lisa e esbranquiçada. Sua copa, em

geral, é ampla, entretanto, a forma da árvore é bastante variável, dependendo da

procedência e manejo. As raízes de gliricidia associam­se a bactérias do gênero

Rhizobium, com as quais entram em simbiose, originando um grande número de

nódulos, responsáveis pela fixação de nitrogênio (FRANCO, 1988).

As folhas são alternas imparipinadas, constituídas por 7 a 17 folíolos de 3 a 7 cm

de comprimento. As flores estão reunidas em inflorescências terminais, do tipo cacho

ou racemo e apresentam constituição típica das Papilionáceas. As pétalas são

predominantemente de cor lilás, com a porção central de estandarte em tom creme, que

funcionam como guias de néctar. O androceu é formado por onze estames diadelfos e o

10

gineceu apresenta ovário súpero, estilete único e estigma bífido. Os frutos são vagens

chatas, que geralmente apresentam cor verde pálido, podendo apresentar tonalidades

arroxeadas em função da exposição solar (Figura 1).

As vagens variam de 10 a 17 cm de comprimento e contêm três a oito sementes.

As sementes são lisas, com média de 0,9 cm de diâmetro, em geral, de cor marrom e

apresentam dormência tegumentar quando armazenadas por mais de um ano. A floração

e a frutificação desta espécie na região semi­árida, geralmente ocorrem no período seco,

nos meses de agosto a novembro, quando as árvores estão parcialmente sem folhas. As

plantas florescem a partir do terceiro ano de idade.

Há vários anos, esta espécie vem sendo cultivada na região sudoeste da Bahia

para o sombreamento do cacaueiro, tendo sido recentemente introduzida nos estados de

Pernambuco e Sergipe. Esta espécie se destaca por apresentar rápido crescimento, alta

capacidade de regeneração, e vem sendo explorada como forrageira pelo seu alto valor

nutritivo, como produtora de estacas vivas, medicinal e, ainda, como alternativa

energética. Entretanto, é necessário o estabelecimento de um programa de

melhoramento de gliricidia visando explorar a sua variabilidade genética, para

melhoraria da espécie, selecionando­se indivíduos capazes de suportar as adversidades

climáticas com boa produtividade, e estimular a sua utilização em programas de

recuperação de áreas degradadas na região Nordeste (DRUMOND & CARVALHO

FILHO, 1999).

11

Figura 1. Aspectos da espécie Gliricidia sepium – A­ Árvore, B­ Flores, C­ Frutos,

D­ Sementes.

A

D

B

C

12

1.2 Caracter ização do Ambiente

O Brasil possui 385 milhões de hectares de florestas nativas (IPEF, 2000), sendo

que a região de Caatinga tem cerca de 800 mil km 2 , totalizando 11% do território

nacional e 70% do território nordestino, abrangendo os estados do Ceará, Rio Grande do

Norte, Paraíba, Pernambuco, Sergipe, Alagoas, Bahia, sul e leste do Piauí e norte de

Minas Gerais (LIMA, 1996). O clima nessa região chamada “Polígono das Secas” é

semi­árido, quente com baixa pluviosidade, em torno de 250 a 800 mm anuais. A

quantidade de chuvas pode variar, alcançando em anos de muitas chuvas até 1.000

mm/ano e em anos de seca, apenas 200 mm/ano, em certas regiões. A temperatura

média se situa entre 24 e 26°C e varia pouco durante o ano (MAIA, 2004). Além dessas

condições climáticas rigorosas, a região está submetida a ventos fortes e secos, que

contribuem para a aridez da paisagem nos meses de seca (SAMPAIO & RODAL,

2000).

O bioma Caatinga é caracterizado por uma vegetação xerófila, de fitofisionomia

e florística variada. Esse tipo de formação vegetal tem características bem definidas

como árvores baixas e arbustos que, em geral perdem as folhas na estação das secas

(caducifólias), além da ocorrência de muitas cactáceas. O aspecto geral da vegetação, na

seca, é de uma mata espinhosa e agreste, apresentando três estratos: arbóreo, arbustivo e

o herbáceo (LIMA, 1996).

As espécies vegetais da caatinga possuem adaptações vegetativas ao ambiente

semi­árido, tais como folhas transformadas em espinhos, cutículas altamente

impermeáveis, caules suculentos, etc. Todas essas adaptações lhes conferem o aspecto

característico denominado xeromorfismo. Outras adaptações importantes à vida das

plantas na caatinga é a queda das folhas na estação seca, a rápida brotação destas na

estação das chuvas e a presença de um sistema radicular bem desenvolvido. A perda das

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folhas é uma adaptação para reduzir a perda de água por transpiração e as raízes bem

desenvolvidas aumentam a superfície de absorção de água no solo.

Segundo Drumond et al., (2000), não existe uma lista completa das espécies de

caatinga, no entanto, em trabalhos realizados sobre a flora e vegetação da caatinga,

foram registradas quase 600 espécies arbóreas e arbustivas, sendo 180 endêmicas. Cada

uma delas com características especiais e importantes para a composição deste bioma

(MAIA, 2004).

Nessa região existe uma grande demanda por recursos florestais em pequenas

propriedades, onde cada vez mais, as árvores assumem um importante papel na

economia rural. No entanto, o manejo inadequado da vegetação da caatinga, pela

retirada de madeira, exploração de pecuária e agricultura tem colocado em risco a

biodiversidade deste ecossistema (SAMPAIO, 1995). Desta forma, é importante a

utilização de espécies de uso múltiplo, isto é, cultivadas ou manejadas para mais de uma

finalidade, como a G. sepium.

É significativo o nível de conhecimento referente às características de adaptação

vegetativa das espécies submetidas às condições ambientais do semi­árido, entretanto,

pouco se sabe sobre os mecanismos de adaptação das sementes a tais condições, uma

vez que os bancos de sementes no solo constituem­se numa das principais estratégias de

sobrevivência dessas espécies (BASKIN & BASKIN, 1998).

1.3 Armazenamento de Sementes

A propagação de espécies florestais ocorre, principalmente, por meio de

sementes. Vários estudos têm sido realizados nos últimos anos sobre a tecnologia de

sementes de espécies florestais nativas ou introduzidas do Brasil, devido à crescente

necessidade de reabilitação de ecossistemas florestais e de conservação de

14

germoplasmas. No entanto, diante da grande diversidade de espécies dos nossos biomas,

as informações relativas ao comportamento fisiológico dessas sementes durante o

armazenamento ainda são deficientes.

O armazenamento das sementes deve ser iniciado na maturidade fisiológica e o

maior desafio é conseguir que as sementes, após certo período, ainda apresentem

elevada qualidade fisiológica (FERREIRA & BORGHETTI, 2004).

A longevidade das sementes é variável de acordo com o genótipo, mas, a

conservação do potencial fisiológico depende, em grande parte, da temperatura e das

condições do ambiente de armazenamento (FERREIRA & BORGHETTI, 2004;

MARCOS FILHO, 2005).

Roberts (1973) sugeriu a classificação fisiológica de armazenamento para

sementes em duas categorias: as que podem ser armazenadas por longos períodos com

baixos teores de água e em baixas temperaturas, denominadas de ortodoxas; e as que

não toleram o dessecamento e o armazenamento em baixas temperaturas, denominadas

de recalcitrantes, as quais nessas condições perdem sua viabilidade mesmo quando

armazenadas por curtos períodos.

As sementes ortodoxas sofrem redução do teor de água após a suspensão da

deposição de reservas, que pode variar conforme as condições climáticas prevalecentes.

Nessas sementes, isso leva a um estado de quiescência metabólica, garantindo a sua

sobrevivência até que as condições favoráveis à germinação sejam restabelecidas

(BEWLEY & BLACK, 1994). Durante esse período, o tipo de armazenamento

fornecido às sementes é de extrema importância para que ocorra a manutenção da

viabilidade destas, sendo o teor de água das sementes e a temperatura de

armazenamento os dois fatores de maior influência (WARD & POWELL, 1983).

15

Portanto, o potencial de conservação das sementes depende diretamente da qualidade

fisiológica das mesmas no início do período de armazenamento.

O alto teor de água das sementes é uma das principais causas da perda do poder

germinativo durante o armazenamento (DESAI et al., 1997). O alto teor de água causa

aumento da taxa respiratória e ação de microrganismos, sendo que umidade acima de

20% do peso inicial das sementes pode promover o aquecimento da massa a

temperatura letal (HARRINGTON, 1972).

A temperatura influencia todas as atividades biológicas. O aumento da

temperatura do ambiente de armazenamento provoca aumento da taxa respiratória da

semente, proliferação de fungos e de insetos que a acompanham (POPINIGIS, 1985).

A preservação da qualidade fisiológica de sementes sob determinadas condições

ambientais de temperatura e umidade relativa do ar é influenciada pelo tipo de

embalagem utilizada (FERREIRA & BORGHETTI, 2004). A escolha da embalagem

depende da espécie, do grau de umidade das sementes, das condições e do período de

armazenamento (MARCOS FILHO, 2005).

As embalagens, quanto à permeabilidade ao vapor de água, podem ser

classificadas em permeáveis, semipermeáveis e impermeáveis (CARNEIRO &

AGUIAR, 1993). As embalagens permeáveis permitem a troca de vapor entre as

sementes e o ambiente externo circundante permitindo que, o teor de água das sementes

sofre flutuações com as variações de umidade relativa do ar. Os principais materiais

empregados comercialmente na confecção de embalagens permeáveis de sementes são

papel, algodão, juta e polipropileno trançado (FERREIRA & BORGHETTI, 2004).

As embalagens semipermeáveis mostram­se resistentes à troca de vapor de água

entre as sementes e o ambiente externo circundante. Para a conservação de sementes em

embalagens semipermeáveis, o teor de água das sementes deve ser de 2 a 3 pontos

16

percentuais inferior ao empregado nas embalagens permeáveis. Os materiais utilizados

nesse tipo de embalagem são polietileno de baixa espessura e combinações de lâminas

de papel e outro material, como é o caso dos papéis alumizados, plastificados e com

película de asfalto (FERREIRA & BORGHETTI, 2004).

As embalagens impermeáveis impedem o intercâmbio de vapor de água entre as

sementes e o meio externo. Geralmente, são empregados sacos de polietileno espesso,

de média e alta densidade, envelopes de alumínio, embalagens metálicas de alumínio e

folhas de flandres com sistema de regravação e recipientes de vidro com sistema de

vedação na tampa.

A conservação de sementes de modo geral, é de grande importância, e o

armazenamento, uma vez aplicado de modo adequado, vai diminuir sua velocidade de

deterioração que se caracteriza por ser um processo irreversível (DELOUCHE et al.,

1973; MELO et al., 1998, citados por CABRAL et al., 2003).

A deterioração ocorre em níveis molecular, genético, celular, de tecido e de

população da semente (MATTHEWS, 1985). Esse é um evento que não pode ser

evitado, mas pode ser controlado, sendo esse o principal objetivo do armazenamento,

que está entre as estratégias de conservação ex situ mais utilizadas, por preservar as

características genéticas das sementes até que estas sejam semeadas (CARNEIRO,

1985, NODARI et al., 1998).

1.4 Aspectos fisiológicos da germinação de sementes

A propagação de um grande número de espécies florestais de importância social,

econômica e cultural encontra sérias limitações, em razão do pouco conhecimento que

se dispõe sobre as características fisiológicas, morfológicas e ecológicas de suas

sementes (MACHADO, 2002).

17

Os diversos métodos e procedimentos utilizados para a avaliação da qualidade

de sementes baseiam­se na análise dos componentes da qualidade de uma amostra

representativa que retrata o perfil de determinado lote. O teste mais tradicionalmente

utilizado para a avaliação da qualidade de lotes de sementes é o teste de germinação

(OLIVEIRA, 2004).

A germinação da semente ortodoxa é considerada como a retomada das

atividades metabólicas do eixo embrionário, o qual se encontrava paralisado nas fases

finais do processo de maturação; porém, quando estimulado por condições ambientais,

desenvolve­se, culminando com o rompimento do tegumento pela radícula. Essa é uma

etapa crítica do biociclo vegetal pelo fato do processo estar associado a vários fatores de

natureza extrínseca (fatores do ambiente físico) e intrínseca, ou seja, a processos fisio­

metabólicos (LABORIAU, 1983; POPINIGIS, 1985; ANDRADE & DAMIÃO­FILHO,

1989; BIANCHETTI, 1991; BORGES & RENA, 1993; BEWLEY & BLACK, 1994;

SANTOS, 1999).

Como resultado do déficit hídrico, há geralmente elevação de sais solúveis

(salinidade) que podem influenciar, significativamente, na resposta germinativa das

espécies. Dentre os diversos fatores ambientais capazes de influenciar o processo

germinativo de sementes, a indisponibilidade de água e a presença de sais em elevados

potenciais são os mais importantes. Esta condição é vista como um fator limitante à

iniciação da germinação de sementes e está envolvida, direta ou indiretamente em todas

as demais etapas do metabolismo subseqüente, seguindo a ativação do ciclo celular e

crescimento da plântula (ROCHA, 1996).

O processo germinativo se inicia com a absorção de água por embebição,

seguida da retomada das atividades metabólicas, sobretudo da síntese de novas enzimas

e do aumento de atividades das hidrolases pré­existentes, visando a mobilização dos

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compostos de reserva para a retomada de crescimento do eixo embrionário (SALES,

2002). Porém, há necessidade de que a semente alcance um nível adequado de

hidratação o qual permita a reativação dos seus processos metabólicos. Uma análise das

relações hídricas das taxas de germinação de sementes revelou que o início da

germinação está relacionado com a sensibilidade da iniciação do crescimento radicular

ao conteúdo de água no meio. A habilidade do embrião em absorver água do meio e

iniciar o seu crescimento é dependente do potencial osmótico de suas células

(MARCUS FILHO, 1986 apud, FONSECA & PEREZ, 2003).

Durante o processo germinativo as reservas das sementes têm basicamente duas

funções que se relacionam com a manutenção e o desenvolvimento do embrião até a

formação de uma plântula que apresente a capacidade de se manter de forma

autotrófica. Os compostos de carbono normalmente acumulados em sementes podem

ser utilizados tanto para produzir energia como para construir fisicamente as células

(FERREIRA & BORGHETTI, 2004).

Há enorme variação na composição de sementes, mas as substâncias

armazenadas em grande quantidade constituem os carboidratos, os lipídeos e as

proteínas. Os dois primeiros servem como fonte de energia e carbono para a germinação

das sementes e o desenvolvimento das plântulas. As proteínas têm como função

armazenar principalmente nitrogênio e enxofre, essenciais para a síntese de proteínas,

ácidos nucléicos e compostos secundários na plântula, sendo fundamental para o

crescimento inicial (FERREIRA & BORGHETTI, 2004).

Os principais carboidratos que atuam como reservas em sementes são a sacarose,

os oligossacarídeos da série rafinósica, o amido e os polissacarídeos de parede celular.

Enquanto a sacarose é praticamente universal, os oligossacarídeos da série rafinósica

ocorrem em um grande número de sementes de dicotiledôneas. O amido é um dos

19

compostos de reserva de mais larga ocorrência nos vegetais superiores e os

polissacarídeos de parede celular ocorrem em alguns grupos taxonômicos em que

geralmente atuam como reserva, mas preservando funções secundárias importantes

como o controle de absorção e de distribuição da água nos diferentes tecidos das

sementes. Os oligossacarídeos são degradados logo no início da germinação e, acredita­

se, assim, que sejam compostos de reserva. Porém, sua principal função tem sido

atribuída à propriedade das sementes ortodoxas de estabilizarem suas membranas e,

com isso, poderem permanecer secas por um longo período, após o qual germinam

normalmente, quando expostas ao meio líquido. Essa hipótese é suportada pelo fato de

haver uma tendência maior de acúmulo de oligossacarídeos da série rafinósica em

sementes ortodoxas em relação às recalcitrantes (FERREIRA & BORGHETTI, 2004).

Apesar do aumento considerável de conhecimentos relativos à análise de

sementes de espécies florestais, gerado pelas pesquisas nestas duas últimas décadas, a

maioria delas necessitam ainda de subsídios básicos referentes às exigências quanto às

condições ótimas de germinação (VARELA et al., 2005).

Assim, como as sementes constituem o principal veículo de multiplicação de

espécies, justifica­se a prioridade dirigida à concentração de esforços para elucidar ou

aprimorar os conhecimentos sobre o processo de germinação e os efeitos de fatores que

possam beneficiá­lo ou prejudicá­lo. Essas informações são fundamentais para o

estabelecimento de diagnósticos e o fornecimento de bases para a adoção de práticas

culturais adequadas, principalmente pelo sertanejo local, podendo ainda ser utilizada na

solução de problemas regionais.

20

OBJETIVO

Objetivou­se com esse trabalho avaliar a germinabilidade e longevidade de

sementes de Gliricidia sepium submetidas a diferentes períodos de armazenamento,

visando o ajuste de protocolos para conservação de sementes, da espécie, e sua

utilização pelo pequeno produtor da Caatinga. Para o alcance desse objetivo principal

teve­se como objetivos específicos:

ü Avaliar a qualidade fisiológica das sementes de G. sepium, submetidas a

diferentes condições e períodos de armazenamento, visando à escolha da melhor

estratégia de conservação;

ü Avaliar a mobilização de macromoléculas durante a germinação de sementes de

G. sepium verificando as possíveis modificações dessas reservas de

macromoléculas durante o armazenamento;

ü Avaliar as mudanças na qualidade fisiológica de sementes de G. sepium

submetidas ao armazenamento, considerando­se a viabilidade e vigor das

sementes pela atividade das enzimas de degradação do amido durante o processo

de germinação.

ü Avaliar o efeito do déficit hídrico sobre a germinação de sementes armazenadas

de G. sepium.

21

CAPÍTULO I

Effects of storage on seed germination in Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.

(Leguminosae ­ Papilionoideae)

22

ABSTRACT – (Effects of storage on seed germination in Gliricidia sepium

(Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae)). Studies of seed physiological

processes represent the starting point for the rational utilization of native or cultivated

plant species from the caatinga (dryland) region for which germination studies are still

scarce. In order to determine adequate methods for the conservation of Gliricidia

sepium seeds, the physiological quality of propagules exposed to different conditions

and times of storage were examined. Recently collected seeds of G. sepium were

analyzed immediately while other samples were stored for three, six, nine, or twelve

months in plastic or paper bags under refrigeration or at room temperature. The

germination rates of seeds from each storage regime were determined and these rates

compared to their water content. It was observed that germination capacity was directly

related to changes in seed humidity. Storing seeds in plastic bags yielded the best

conservation, principally when they were stored at low temperatures. However, even at

temperatures near 25°C it was possible to prolong seed viability when their water

content was controlled through the use of impermeable packing.

Key words: germination, water content, physiological quality, gliricidia

23

RESUMO – (Efeito do armazenamento sobre a germinação de sementes de

Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae)). Estudos dos

processos fisiológicos de sementes são efetivamente o ponto de partida para utilização e

exploração de forma racional de espécies nativas ou cultivadas da caatinga cujos

trabalhos sobre germinação ainda são escassos. Visando contribuir para o

estabelecimento de métodos de conservação de sementes de Gliricidia sepium, este

trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a qualidade fisiológica das sementes,

submetidas a diferentes condições e períodos de armazenamento. Sementes de gliricidia

recém coletadas foram analisadas e o restante armazenadas por três, seis, nove e doze

meses em sacos plásticos e de papel em geladeira e à temperatura ambiente. Para cada

ambiente e período de armazenamento testado foram analisados a taxa de germinação

relacionando­a com o teor de água das sementes. Observou­se que a capacidade

germinativa de sementes de gliricidia está totalmente relacionada à tolerância da espécie

ao ganho ou a perda de umidade das sementes. O armazenamento em saco plástico foi o

que proporcionou melhores condições de conservação das sementes, principalmente

quando acondicionadas em temperaturas baixas. No entanto, mesmo em temperaturas

em torno de 25°C é possível prolongar a viabilidade das sementes de gliricidia quando

se controla o teor de água inicial das mesmas através da utilização de embalagens

impermeáveis para o armazenamento.

Palavras­chave: germinação, teor de água, qualidade fisiológica, gliricidia

24

INTRODUCTION

“Gliricidia” [(Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.) ­ (Leguminosae –

Papilionoideae)] is a native species of Central and South America. It was introduced

into northeastern Brazil in the 1980’s and has since become the object of significant

commercial and economic interest for the region due to its multiple uses ­ which include

its use as a forage species with high nutritive value for grazing animals and bees, and as

a medicinal plant, among others. Drought resistance is one of the most important

characteristics of any plant to be cultivated in the caatinga region, and “gliricidia”

stands out in this respect because of its capacity to readily grow from seed and because

of its rapid growth, high capacity for regeneration, resistance to drought, among other

characteristics (Drumond & Carvalho Filho, 1999). Studies of seed physiological

processes represent the starting point for the rational use of native or cultivated plant

species from the caatinga region for which germination studies are still very scarce.

The seeds of a majority of cultivated species demonstrate orthodox

characteristics, in which an increase in their water content during storage will result in a

rapid loss of viability and a reduced germination percentage. The conservation potential

of any seed depends directly on the physiological quality of these propagules at the start

of the storage period.

Desiccation tolerance is acquired progressively during seed development.

Among orthodox seeds, desiccation tolerance occurs before the seeds experience any

severe reduction in water content ­ but it is not yet possible to determine if this capacity

is acquired beforehand, or if it is directly due to water loss (Bewley & Black, 1994).

Seed storage involves a series of procedures designed to preserve germination

quality; however, good results depend as much on the nature of the seeds themselves as

on the storage conditions (Santana, 2007). The packaging used in storing seeds exerts

25

an important role in the maintenance of their initial vigor. Additionally, environmental

humidity and storage temperature are other factors that can directly influence the

retention of viability (Ward & Powell, 1983).

Information about the water content of seeds allows one to choose the most

adequate procedures – from harvesting to storage ­ that will preserve their physical,

physiological and sanitary qualities, and will aid in the identification of procedural

problems that might arise and in the adoption of adequate responses (Marcos Filho et

al., 1987).

Seed conservation is very important, and adequate storage will diminish the rate

of their deterioration, which is an irreversible process (Delouche et al., 1973; Melo et

al., 1998, cited by Cabral et al., 2003).

Seed deterioration occurs at molecular, genetic, cellular, tissue, and population

levels (Matthews, 1985). It is a process that cannot be avoided, only controlled, and this

is the principal objective of all storage protocols. Seed storage represents one of the

most utilized strategies of ex situ species conservation, as it preserves the genetic

characteristics of the seeds until they are sewn (Carneiro, 1985, Nodari et al., 1998).

With the objective of contributing to the methodology of the conservation of

gliricidia seeds, the present work sought to evaluate the physiological quality of seeds

that were submitted to different storage conditions for different periods of time ­ for

identifying the best conditions for seed storage is of fundamental importance in

determining strategies for their conservation.

26

MATERIAL AND METHODS

Obtaining and storing seeds

Mature seeds were collected in 2006 from G. sepium trees –in Fazenda

Morrinhos, a farm located in the county of Queimadas, state of Bahia (W 39º 40 ׳ S 11º

which ,( ׳ 12 is considered ‘Private Reserve of Natural Patrimony’ under the Brazilian

law. Samples of these recently collected seeds were cleaned and analyzed for their water

content and germination rate, as an initial characterization of the lot.

The remainder of the seeds were placed into paper or plastic bags and stored at

room temperature (25°C ± 3) or in a refrigerator (8°C ± 2) during three, six, nine, or

twelve months in the Germination Laboratory of the Horto Florestal Experimental Unit­

UEFS – Feira de Santana, Bahia State, Brazil, for posterior evaluation.

Germination tests

After each experimental storage period, four sub­samples of 25 seeds were sown

onto Petri dishes containing two layers of germination paper that had been moistened

with a quantity of distilled water corresponding to 2.5 times the weight of the paper

substrate. The seeds were maintained in a germination chamber at 25°C with a

photoperiod of 14 h for a period of ten days. The germinating seeds were examined

daily and any propagules with its radicule protruding at least 2 mm from the seed coat

was considered to be germinating, and these individuals were counted and subsequently

discarded.

27

Water content

Seed water content was determined by drying them in an oven at 60°C until

obtaining a constant weight, which was then subtracted from the previously determined

fresh weight. Twenty­five seeds were used in each sub­sample.

Statistical analyses

Data related to water content and germination was expressed in percentages, and

the standard error calculated. The data of germination, average germination time,

average germination velocity, and germination velocity was transformed by the function

(x + 0.5) 0.5 and submitted to variance analysis using the Sisvar 4.3 software program

(Ferreira, 2000). Differences between the averages were compared using the Tukey test

at a 5% probability level.

28

RESULTS

While germination percentages changed in response to storage time and the

packaging used, the average germination time remained essentially constant (Table 1)

and independent of these two variables.

Storage in plastic bags provided the best conditions for seed storage under both

cold and room temperature storage conditions based on percentage germination.

However, seeds stored at room temperature in plastic bags did demonstrate a significant

decrease in germination potential starting at nine months (Table 2).

Changes in water content of Gliricidia sepium seeds over time during storage

depended on the type of packaging used. Initial seed water content was 6.5%, and this

percentage was maintained for the entire period in which the seeds were stored in the

refrigerator in plastic bags. High germination rates were observed (94%) even after 12

months of storage (Figure 1A).

Table 1. Variance analysis of the germination percentage (G), average germination time

(Tm), average germination velocity (Vm), and germination velocity (VG) of stored

Gliricidia sepium seeds.

Var iable G % Tm, days Vm, days ­1 VG

Storage time 74.01* 1.143 ns 41.336* 125.77*

Environments 132.97* 0.643 ns 75.075* 216.67*

Time* Environ. 52.46* 0.337 ns 4.569* 36.37*

CV% 7.85 24.26 3.12 5.67 ns = (not significant); * = significant to a 5% level

29

The germination capacity of any species is very dependent on its tolerance to

gaining or losing seed humidity. Figure 1B shows that when the water content of G.

sepium seeds attained lower than initial levels, germination dropped off. Seeds stored in

paper bags at room temperature demonstrated water gains after six months of storage

(Figure 1D) and a concomitant lose of viability. The results point to alterations in seed

carbohydrate reserves due to the increase in their water content.

Under low temperature conditions (refrigeration), gliricidia seeds stored in

impermeable (plastic) bags (Figure 1A) and permeable (paper) bags (Figure 1B)

demonstrated high germination rates and high average germination velocities up to one

year after initial storage (Table 2). Seeds stored at room temperature demonstrated a

decrease in average germination velocity during the year, independent of the packaging

used, as well as a decrease in percent germination (Table 2). Significant reductions in

all of these parameters were observed starting in the sixth month of storage.

Significant differences in the velocity of seed germination were observed when

the seeds were stored at room temperature in paper bags ­ but only after six months of

storage (Table 1). This reduction in germination speed can be attributed to a loss of

vigor in seeds kept under uncontrolled environmental conditions, in comparison to

storage in plastic bags at cold temperatures.

These results suggest that storing gliricidia seeds at low temperatures and in

impermeable packages is much more suitable than holding them at room temperature

and in permeable packaging, for seeds subjected to the latter conditions demonstrated a

much higher loss of viability.

30

Table 2. Germination percentage (G), average time (Tm), average velocity (Vm), and

germination velocity (VG) of recently collected Gliricidia sepium seeds (RC) stored in

a refrigerator [in plastic bags (RPB) or in paper bags (RPPB)]; or stored at room

temperature [in plastic bags (TRPB) or in paper bags (TRPPB)].

Months Environments 0 3 6 9 12 Average

G (% ) RC 100aA ­­­ ­­­ ­­­ ­­­ 100A RPB ­­­ 96.00aA 98.00aA 89.00aAB 94.00aA 94.25AB RPPB ­­­ 99.00aA 98.00aA 93.00aA 91.00aA 95.25AB TRPB ­­­ 98.00aA 96.00aA 78.00bB 87.00abA 89.75B TRPPB ­­­ 96.00aA 86.00aA 3.00bC 1.33bB 49.60C Average 100a 97.25ª 94.50a 65.75b 72.80b

Tm, (days) RC 1.490aA ­­­ ­­­ ­­­ ­­­ 1.490A RPB ­­­ 2.094aA 2.294aA 2.260aA 2.167aA 2.204A RPPB ­­­ 2.121aA 2.037aA 2.663aA 1.964aA 2.196A TRPB ­­­ 2.104aA 2.463aA 2.837aA 2.587aA 2.497A TRPPB ­­­ 2.127aA 3.570aA 4.500aA 2.000aA 3.112A Average 1.490a 2.112ª 2.590a 3.065a 2.191a

Vm, (days ­1 ) RC 0.672aA ­­­ ­­­ ­­­ ­­­ 0.672A RPB ­­­ 0.478aA 0.437aA 0.443aA 0.478aAB 0.459B RPPB ­­­ 0.472abA 0.508aA 0.378bA 0.513aA 0.467B TRPB ­­­ 0.477aA 0.408abA 0.361bA 0.390abB 0.409B TRPPB ­­­ 0.471aA 0.281bB 0.056cB 0.055cC 0.227C Average 0.672a 0.475b 0.409bc 0.309d 0.380c

VG RC 19.71aA ­­­ ­­­ ­­­ ­­­ 19.71A RPB ­­­ 11.84abA 13.120aA 10.48bA 12.62abA 12.01B RPPB ­­­ 12.09abA 12.910aA 10.09bA 14.47aA 12.39B TRPB ­­­ 12.13aA 11.02aAB 7.83bB 10.01abB 10.25C TRPPB ­­­ 11.90aA 8.80bB 0.087cC 0.055cC 5.554D Average 19.71a 11.99b 11.46b 9.904c 7.124d Averages followed by the same small case letter on the same line, or by the same upper case letter in the

same column, are not significantly different from each other by the Tukey test at a 5% probability level.

31

Figure 1. Water content and germination percentage of the seeds of G. sepium stored in

a refrigerator [in plastic bags (RPB) – A or in paper bags (RPPB) ­ B], or stored at room

temperature [in plastic bags (TRPB) – C or in paper bags (TRPPB) ­ D], during 0, 3, 6,

9, or 12 months. Average of four trials ± ASE.

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 3 6 9 12

Water content (%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

WC % G (RPB)

0

2

4

6

8

10

12

0 3 6 9 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

(%) G

ermination

WC % G (TRPPB)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0 3 6 9 12

Months Storage

Water content (%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

WC % G (TRPB)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

0 3 6 9 12

Months Storage

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

(%) G

ermination

WC % G (TRPPB)

32

DISCUSSION

Variations in water content are of fundamental importance in seed storage,

especially in terms of carbohydrate metabolism, as seed sugar levels are generally

affected by storage temperature. The quantity of sucrose found in seeds of the legume

Caesalpinia echinata Lam. is related to its desiccation tolerance, and high sucrose

levels were encountered in viable seeds stored for 18 months at 7°C (Barbedo et al.,

2002).

Ribeiro et al. (personal communication) observed that an increase in seed water

content in Gliricidia sepium initiated a series of reactions that contributed to their

deterioration by diminishing their sugar content. The accumulation of soluble

carbohydrates in seeds seems to be involved in the desiccation tolerance and longevity

observed in this species. 1

Permeable wrappings that permit water vapor exchange between the seeds and

the atmosphere are more adequate for use in dry environments during short storage

periods. Freitas et al. (1992) reported that seeds maintained in highly permeable

wrappers in humid environments are subject to relatively rapid deterioration.

Cisneiros et al. (2003) observed that seeds of Psidium guineense stored in paper

sacks demonstrated an increase in their water content even when stored in a freezer, and

their ability to germinate became greatly reduced over time.

Maluf & Pisciottano­Ereio (2005) reported that the best conditions for storing

and conserving seeds of Campomanesia phaea was in plastic bags under controlled cold

conditions. Plastic and glass wrappings (Cisneiros et al., 2003) function as barriers to

gas exchange between the seeds and their external environment, thus reducing their

1 Ribeiro et al. Reserve mobilization during imbibition of stored Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. seeds. 2008.

33

metabolism and retarding the processes involved in their deterioration; and these

beneficial effects become more accentuated at lower storage temperatures.

The present work established that the physiological quality of gliricidia seeds

was affected by the permeability of the wrapping material used during their storage. It

is interesting to note, however, that these results are different from those obtained for

other species in the semi­arid region, such as Anadenanthera macrocarpa,

Pseudobombax simpliciflolium, Myracrodruon urundeuva (Souza et al., 1980), and

Tabebuia impetiginosa (Cabral et al., 2003) when stored in a cold box in both cloth and

polyethylene bags under conditions of low relative humidity.

According to Carvalho and Nakagawa (2000), the type of packing used for seed

storage is very important in terms of their preservation, viability, and vigor, and the

choice of packing material will depend on the environmental conditions under which

the seeds will be stored. Cold and dry environments are more favorable for storing

orthodox seeds (Villela & Perez, 2004).

Germination velocity is one of the oldest measures of seed vigor (Vieira &

Carvalho, 1994). Seed lots with similar germination percentages frequently

demonstrate differences in germination velocity ­ indicating differences in physiological

vigor (Krzyzanowkski et al., 1999). The changes in germination velocity observed in

gliricidia seeds stored at room temperature thus indicate decreasing overall

physiological vigor.

According to Drumond & Carvalho Filho (1999), gliricidia seeds lose their

viability or enter into secondary dormancy after 12 months in storage. Successful

conservation of gliricidia seeds is intimately related to their initial water content, and

the permanence of that water content at that same level during storage. Maintenance of

34

high viability, and consequently a greater degree of tolerance to storage, was obtained

under low temperature conditions (refrigeration).

The results obtained in the present study are promising in terms of the

conservation of gliricidia seeds for they indicate that these propagules can be conserved

with high viability for reasonably long periods of time (up to 12 months), and even at

temperatures near 25°C, if the initial water content of the seeds is maintained through

the use of impermeable storage containers.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) and the Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da

Bahia (FAPESB) for financial support of this project, and José Juracy for his help with

plant material.

35

REFERENCES

BABEDO, C.J.; BILIA, D.A.C.; FIGUEIREDO­RIBEIRO, R.C.L. Tolerância à

dessecação e armazenamento de sementes de Caesalpinia echinata Lam. (pau­brasil).

Rev. Bras. de Bot. 25: 431­439, 2002.

BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: Physiology of Development and Germination.

2 th ed. Plenum Press, New York, 1994.

CABRAL, E.L.; BARBOSA, D.C.A.; SIMABUKURO, E.A. Armazenamento e

germinação de sementes de Tabebuia áurea (Manso) Benth. & Hook. F. Ex. S. Moore.

Acta. Bot. Bras. 17(4): 609­617, 2003.

CARNEIRO, J.G.A. Armazenamento de sementes florestais. curitiba: FUPEF, 35 p.

(Série Técnica, 14), 1985.

CARVALHO, N.M.; NAKAGAWA, A.J. Sementes: ciência, tecnologia e produção. 4

ed. Jaboticabal: FUNEP, 588p, 2000.

CISNEIROS, R.A.; MATOS, V.P.; LEMOS, M.A.; REIS, O.V. DOS; QUEIROZ, R.M.

de. Qualidade fisiológica de sementes de araçazeiro durante o armazenamento. Rev.

Bras. de Eng. Agr.e Amb., 7(3): 513­518, 2003.

DRUMOND, M.A.; CARVALHO FILHO, O.M. de. Introdução e avaliação de

Gliricidia sepium na região semi­árida do Nordeste Brasileiro. In: QUEIRÓZ, M.A. de;

GOEDERT, C.O.; RAMOS, S.R.R. (ed.) Recursos genéticos e melhoramento de

plantas para o Nordeste brasileiro. Versão 1.0, 1999. Petrolina­PE: Embrapa Semi­

Árido /Brasília­DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, nov.

http://www.cpatsa.embrapa.br.

36

FERREIRA, D.F. Análises Estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão

4.0. In. 45° Reunião Anual da Região Brasileira da Sociedade Internacional de

Biometria. UFS Car, São Carlos, SP, Julho, p. 255­258, 2000.

FREITAS, G.B.; SILVA, R.F.; ARAÚJO, E.F. Influência da condição de

armazenamento na qualidade de sementes de milho. Rev. Bras. de Armaz., Viçosa,

MG. 17(1): 21­26, 1992.

KRZYZANOWSKI, F.C.; VIEIRA, R.D.; FRANÇA NETO, J.B. Vigor de Sementes:

conceitos e testes. Londrina: ABRATES, 218 p, 1999.

MALUF, A.M.; PISCIOTTANO­EREIO, W.A. Secagem e armazenamento de sementes

de cambuci. Pesq. Agropec. Bras. 40(7): 707­714, 2005.

MARCUS FILHO, J.; CÍCERO, S.M.; SILVA, W.R. Avaliação da qualidade das

sementes. Piracicaba: FEALQ, 230p, 1987.

MATTHEWS, S. Physiology of seed ageing. Outlook on Agr iculture, 14(2): 19­23,

1985.

NODARI, R.O. et al. Conservação de frutos e sementes de palmiteiro (Euterpe edulis

Matius) sob diferentes condições de armazenamento. Rev. Árvore, 22(1): 1­10, 1998.

SANTANA, P.J.A. Maturação, secagem e armazenamento de sementes de espécies

de Eugenia (Myr taceae). Dissertação Mestrado, São Paulo­SP, 2007.

SOUZA, S.M.; PIRES, I.E.; LIMA, P.C.F. Influência da embalagem e condições de

armazenamento na longevidade de sementes florestais. p. 15­24. In: Pesquisa Florestal

37

no Nordeste Semi­árido: sementes e mudas. Boletim de pesquisa n.2, Embrapa –

CPATSA, Petrolina, 1980.

VIEIRA, R.D.; CARVALHO, N.M. Testes de vigor em sementes. Jaboticabal,

FUNEP, 164p, 1994.

VILLELA, F.A.; PERES, W.B. Coleta, beneficiamento e armazenamento. In:

FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. (eds), Germinação: do básico ao aplicado.

pp.265­281, Porto Alegre: Artmed, 2004.

WARD, F.H.; POWELL, A.A. Evidence for repair processes in onion seeds during

storage at high seed moisture contents. J . Exp. Bot. 34(140):277­282, 1983.

38

CAPÍTULO II

Reserve mobilization dur ing imbibition of stored Gliricidia sepium (Jacq.)

Steud. seeds.

39

ABSTRACT – (Reser ve mobilization during imbibition of stored Gliricidia sepium

(Jacq.) Steud. seeds). Gliricidia sepium (Leguminosae ­ Papilionoideae) is a species

which is tolerant to drought and can be easily propagated by seeds. Therefore, it has

been explored by farmers as a source of forage in the semi­arid region of the northeast

of Brazil. The present study has been developed to evaluate the effect of seed storage on

the mobilization of reserves during imbibition of Gliricidia seeds. Seeds were freshly

harvested, packed in paper bags and stored for three and six months at the laboratory

under environmental conditions (temperature and humidity). Cotyledons were isolated

from embibed seeds and macerated for the extraction and quantification of total soluble

sugars, reducing sugars, sucrose and starch, as well as of proteins and amino acids.

Storage under such conditions allowed an increase in seed water content, although

maintaining seed germinability at relatively high levels (86%). Seed macromolecule

levels showed significant variation in relation to the period of storage and of imbibition

being associated with the loss of seed viability due to inadequate conditions of storage.

Key words: Gliricidia sepium, seeds, storage, longevity, germination, reserve

mobilization.

40

RESUMO – (Mobilização de reservas durante a embebição de sementes de

Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae) armazenadas).

Gliricidia sepium é uma espécie que apresenta resistência à seca e facilidade em se

propagar por sementes, sendo intensamente explorada como forrageira no semi­árido

nordestino. O presente estudo foi desenvolvido para avaliar o efeito do armazenamento

na mobilização de açúcares e proteínas e as possíveis modificações dessas

macromoléculas de reserva durante a germinação de sementes de gliricidia. Sementes

recém coletadas foram armazenadas por três e seis meses em sacos de papel à

temperatura ambiente. Os cotilédones das sementes embebidas foram extraídos e

macerados para a quantificação dos açúcares solúveis totais, açúcares redutores,

sacarose, amido, proteínas e aminoácidos. O armazenamento em embalagem de papel

em temperatura ambiente propiciou o aumento no teor de água embora a capacidade

germinativa foi mantida em níveis altos (86%). O armazenamento e o tempo de

embebição influenciaram os níveis de macromoléculas nas sementes. A variação nos

teores de macromoléculas esta associada com a perda da viabilidade das sementes

proporcionada pela condição inadequada de armazenamento.

Palavras­chave: Gliricidia sepium, sementes, armazenamento, longevidade,

germinação, mobilização de reservas.

41

INTRODUCTION

Gliricidia (Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.) ­ (Leguminosae­ Papilionoideae) is

a native species from the South and Central Americas and it was introduced in the

Brazilian northeast region during the 80´s. It has commercial and economic interests for

the region due to its multi­purpose characteristics combined to drought tolerance,

among which a high nutritional value, therefore, an important alternative source of

forage in the composition of living fences and pastures. The rigorous climatic

conditions of the brazilian semi­arid is occurs mainly between May and October, due to

lack of rains, strong and dry winds that contribute to dryness and arid landscape

(Sampaio & Rodal, 2000; Teixeira, 2001). During this period, seeds may naturally also

be kept viable in the soil seed bank, e.g. orthodox seeds (Baskin & Baskin, 1998).

Therefore, drought resistance is one of the most important characteristics for

maintaining the viability of seeds during the dry periods and for cultivating this tree

species in the region. In this context, gliricidia stands out as it propagates easily by

seeds, has fast growth, high regeneration capacity, drought resistance, among other

referred characteristics (Drumond & Carvalho Filho, 1999). Although it does exist

significant knowledge relative to plant vegetative adaptation characteristics to semi­arid

environmental conditions, much is yet unknown about seed adaptation mechanisms

under such conditions, while soil seed banks consist in one of the main survival

strategies of wild plant species (Baskin & Baskin, 1998).

Maturation of orthodox seeds is characterized by intense deposition of reserves,

after which it undergoes an exclusive process of rapid water reduction, what seems to

vary according to the different species and prevalent climatic conditions. Dehydration

leads these seed species into a state of metabolic quiescence, allowing seed survival

until conditions favorable for germination are reestablished (Bewley & Black, 1985).

42

During this period, seed storage conditions are of extreme importance so that viability is

maintained to the most, e.g. longevity, whereas water uptake and storage temperature

are the most critical factors (Ward & Powell, 1983). Therefore, the potential for seed

conservation or longevity directly depends on the initial seed (physiological) quality

before the storage period.

Dissection tolerance is a common feature of orthodox seeds which is generally

attained during maturation and that allows seeds to be stored for different periods of

time, i.e. many years in some cases, without significant loss of viability (Maluf &

Pisciottano­Ereio, 2005). Such tolerance has been related to the capacity of an

organism, i.e. seeds, of facing the extreme stress condition of almost complete loss of

water during maturation and its rehydration during the germination process (Hoekstra et

al., 2003).

After maturation, seeds are subjected to a series of degenerative changes of

physiological, physical and biochemical origins which are associated with the reduction

of seed vigor (Alizaga et al., 1990). The occurrence in seeds of some processes such as

the Amadori and Maillard reactions can contribute for deterioration and the loss of seed

viability. These reactions apparently leads to metal complexation, therefore it can

reduce protein digestibility, inhibit the action of digestive enzymes, destroy amino acids

and ascorbic acid and intervene in mineral metabolism (Araújo, 1995). Once these

reactions are triggered by an increase in the water content of quiescent seeds, the

environmental conditions and the type of supplied reserves will significantly influence

the maintenance of physiological quality of the seeds.

The germination process initiates with seed imbibition as a result of water

uptake. This occurs due to a difference in osmotic potential between the dry seed and

the moist environment or substratum. However, it necessary that the seeds reaches an

43

adequate level of hydration, which allows the reactivation of seed metabolic processes

such as reserve mobilization, so that the resulting metabolites can be used by the

germinating embryo and on subsequent seedling growth (Bewley & Black, 1994).

In fact, much is still unknown about the mechanisms acting on the maintenance

of viability, longevity and conservation, and of the processes regarding reserve

mobilization during germination of seeds species that are common to or adapted to the

northeast semi­arid region of Brazil. Therefore, it has been carried in the present study

an ex situ evaluation of possible modifications on the composition of reserves as a result

of storage of G. sepium seeds under laboratory controlled conditions, as well as their

subsequent mobilization during germination. In this way, we sought to analyze possible

effects of storage over the initial seed physiological quality in search of comparative

parameters that could apply to the natural conditions in which gliricidia seeds are kept

as viable in soil seed banks of the northeastern semi­arid. Ultimately, analyze if those

parameters could contribute as evidences for outstanding rusticity and tolerance of this

species to the adverse draught stress conditions that are common to this region of Brazil.

44

MATERIAL AND METHODS

Seed origin and storage

Mature seeds were collected in 2006 from G. sepium trees –in Fazenda

Morrinhos, a farm located in the county of Queimadas, state of Bahia (W 39º 40 ׳ S 11º

which ,( ׳ 12 is considered ‘Private Reserve of Natural Patrimony’ under the Brazilian

law. Freshly collected seeds were processed and subsequently used for laboratory

analysis or packed in paper bags and submitted to storage for three and six months

under environmental conditions at the Germination Laboratory of the State University

of Feira de Santana (Laboratório de Germinação, Unidade Experimental Horto Florestal

– UEFS, Feira de Santana, Bahia), where water content and laboratory germination tests

were conducted at the end of each storage period.

Germination

Germination analysis was conducted on freshly collected seeds and on seeds

after each period of storage, using four replicates of 25 seeds placed over two layers of

germination paper (Germitest) in 9 mm Petri dishes soaked with an amount of water

equivalent to 2.5 times the weight of the substratum and incubated in germinator

chambers at 25°C and at photoperiod regime of 14 h for a period of 10 consecutive

days. Seeds were considered as germinated when their radicles had protruded at least 2

mm, after when they were scored and discarded.

Water content

Water content was determined on freshly collected seeds and on seeds after each

period of storage by the oven method (fresh weight basis), in which four replicates of 25

45

seeds were weighted before and after being submitted to 60°C, until weight

stabilization.

Extraction and analysis of macromolecules (carbohydrates and proteins)

Macromolecules analysis was performed at the Laboratory of Seed and Plant

Physiology, at the Embrapa Semi­Arid Research Center, in Petrolina, state of

Pernambuco, Brazil. Four replicates of 25 seeds were incubated in a germination

chamber at 25°C for a period of four days, as for the germination test. Germination was

scored and cotyledons isolated into reaction tubes at 24 h intervals until completing 96 h

and subsequently frozen and stored at ­20°C until the macromolecules extraction

procedures.

Macromolecules were extracted from samples of 1 g of fresh cotyledons that had

been homogenized in 5 mL ethanol 80% and centrifuged at 10,000 g during 20 min at

5°C. The procedure was repeated four times and the supernatants collected from each

constituted sample (Seiffert, 2003).

Soluble compounds were quantified spectrophotometrically in aliquots of the

ethanolic extracts. Total soluble sugars (TSS) were quantified by the method of

reactions with antrona (Morris, 1948; Yemm & Willis, 1954); reducing sugars (RS) by

the method of oxidation with 3,5­dinitrosalicilic acid (DNS) (Miller, 1959); sucrose­

(SUC) through antrona cold reaction, after addition of hot KOH (Passos, 1996); total

proteins (TP) according to Bradford method (1976) and amino acids (AA) according to

Rosen method (1957).

The pellets obtained after each centrifugation were dried in incubator at 60°C for

approximately 18 h (overnight). The dried materials were macerated and 0.1 g samples

put into microtubes for posterior starch digestion (S) with perchloric acid (Allen et al.,

46

1977). The sugars obtained from the starch digestion were quantified through TSS

concentration present in each sample (Morris, 1948; Yemm & Willis, 1954).

Statistical analysis

Germination and water content data were expressed as a percentage and

established the standard mean error. Macromolecule data were analyzed by means of

variance analysis using the Sisvar 4.3 software program (Ferreira, 2000). The averages

were compared by Tukey´s test at 5% probability. For the adjustment of regression

equations, it was selected the significative model which showed the highest

determination coefficient.

47

RESULTS

The contents of macromolecules in seed cotyledons were significantly affected

by variations in time of seed storage and imbibitions, except for the contents of starch

and proteins which was not influenced by the imbibitions time. In general, the contents

of all macromolecules varied when analyzed in relation to the combined effects of

storage and imbibition times (Table 1).

Germination percentage decreased from 100% in freshly collected gliricidia

seeds to 86% in seeds after storage, whereas the water content increased from 6,5% to

13,5% in seeds packed in paper bags after six months of storage under environmental

conditions at the laboratory (Figure1). It observed a decrease of 14% in total percentage

of germination in seeds with higher water content after storage.

Table 1. Values for variance analysis of macromolecule contents present in G. sepium

seeds during stored and imbibition. ST= starch; SUC= sucrose; TSS= total soluble

sugars; RS= reducing sugars; TP= total proteins; AA= amino acids.

ns; *= not significant, significant at 5% respectively

Source of var iation ST SUC TSS RS TP AA

Storage 72.324 * 331.401 * 178.859 * 106.247 * 7.147 * 33.644 *

Imbibition 1.424 ns 108.606 * 81.994 * 10.868 * 1.755 ns 3.233 *

Storage*Imbibition 18.658 * 15.264 * 7.337 * 3.680 * 3.311 * 5.950 *

CV % 25.34 21.02 14.96 18.18 18.71 11.30

48

Figure 1. Water content (%) and Total germination (%) of G. sepium seeds during

storage (m). Average of four replicates ± ASE.

The germinability of stored gliricidia seeds decreased in comparison to the

freashly harvested seeds, as it can be seen from the percentage of seeds that had

germinated during imbibition up to 96 h (Figure 2). Concomitant with this result TSS

content was significantly reduced in cotyledons (Figure 3a). It can be observed in Table

2 that the reduction was significant along storage mainly after six months where the

lowest mean values were observed.

The contents of ST and SUC apparently had a slight decrease after three months

of storage but increased significantly after six months of storage as it can be seen in

seeds imbibed for 24 h (Table 2). Despite that, the contents of SUC decreased during

imbibition of freshly harvested seeds as well as of stored seeds as an evidence of its

mobilization by the embryonic axis (Figure 3B). However, this seems not to be the case

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 3 6

Storage time (m)

Water content (%

)

50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

Germination (%

)

WC % G

49

for seeds stored for six months which showed reduction in germination percentages

during the same periods (Figure 2) and, therefore, indicating that SUC may have been

distributed to other metabolic pathways.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

24 48 72 96

Imbibition time (h)

Germination (%

)

0 M 3 M 6M

Figure 2. Germinability (%) during imbibition (h, hours) of G. sepium freshly harvested

seeds and after 3 and 6 months of storage (m). Average of four repetitions ± ASE.

Starch content kept about the same level until 72 h of imbibition in cotyledons of

freshly harvested and stored seeds (Figure 3C), after which the contents decreased in

freshly harvested seeds and in seeds stored for three months. This reduction seems also

to coincide with mobilization by the embryonic axis, possibly as a substrate for the

development of the seedling once seeds had initiated the germination process 48 h after

imbibition (Figure 2). On the other hand, a steep increase in ST content was observed in

seeds that were stored for six months, in which an apparent re­synthesis of ST occurred

after 96 h of imbibition (Table 2).

50

Figure 3. Macromolecule contentes (µmol/g.DW or µmol/g.FW) – A. Total soluble

sugars; B. Sucrose; C. Starch; D. Reducing sugar; E. Total proteins; F. Amino acids; in

cotyledons during imbibition of G. sepium freshly harvested seeds or after 3 and 6

months of storage (m). Average of six replicates.

0

1000

2000

3000

4000

5000

0 24 48 72 96

Total so

lube su

gars (µ

mol/gFW

)

0 m (y1) 3 m (y2) 6 m (y3) A

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000

0 24 48 72 96 Reducing sugars(µmol/gFW

)

D

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 24 48 72 96

Starch (µ

mol/gDW)

C

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

24 48 72 96

Imbibition time (h)

Total proteins (µm

ol/gFW

)

E

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 24 48 72 96

Sucrose (m

mol/gFW

)

B

y1= ­0.6947x 2 + 64.964x + 1866.4 R 2 = 0.9683

y2= ­32.125x + 5124.7 R 2 = 0.7733

y3= ­16.638x + 0.8201 R 2 = 0.8201

y1= ­10130x + 1E+06 R 2 = 0.9944

y2= ­5846.4x + 741504 R 2 = 0.9495

y3= ­24297x + 3E+06 R 2 = 0.8891

y1= ­11.573x + 2553.2 R 2 = 0.6239

y2= ­0.4401x 2 + 54.329x + 254.71 R 2 = 0.9929

y3= 1.191x 2 – 116.74x + 5110.2 R 2 = 0.9484

0

1000 2000

3000 4000

5000

6000

7000

8000

24 48 72 96

Imbibition time (h)

Amino acids (µm

ol/gFW

)

F

y1= 2.0434x 2 – 190.58x + 16143 R 2 = 0.9998

y2= 28.375x + 10928 R 2 = 0.1345

y3= 1.467x 2 – 188x + 10863 R 2 = 0.9293

y1= 25.666x + 3638.3 R 2 = 0.6547 y2= ­0.2986x 2 + 37.851x + 5409.6 R 2 = 0.846

y3= ­11.078x + 7401.6 R 2 = 0.6484

y1= 0.2459x 2 – 24.583x + 1658.3 R 2 = 0.9324

y2= ­3.7153x + 1554.2 R 2 = 0.7043

y3= ­0.25x + 1097.5 R 2 = 0.143

51

Table 2. Macromolecule contents (µmol/g.DW or µmol/g.FW) in cotyledons during

imbibition and germination of G. sepium freshly harvested seeds or after storage for 3

and 6 months (m). TSS= total soluble sugars; SUC= sucrose; ST= starch; RS= reducing

sugars; TP= total proteins; AA= amino acids.

Storage (m) Imbibition (h) 0 3 6 Average

TSS 24 2973.92 bB 3845.66 aA 1616.27 cAB 28.11.95 48 3538.41 bA 4217.22 aA 1752.76 cA 3169.46 72 2788.14 aB 3066.81 aB 1120.21 bB 2325.05 96 1752.05 aC 1659.16 aC 492.91 bC 1349.86

Average 2763.12 3197.21 1245.54 SUC

24 883.549 bA 561.580 cA 2191.017 aA 1212.049 48 687.121 bAB 512.337 bA 2126.082 aA 1108.514 72 434.415 bB 336.471 bAB 1441.558 aB 737.481 96 157.359 bC 152.489 bB 421.536 aC 244.480

Average 540.611 390.719 1545.048 ST

24 2083.79 bA 1314.80 cA 2892.13 aB 2096.91 48 2117.75 abA 1819.37 bA 2558.37 aB 2165.17 72 2054.68 aA 1913.98 aA 2571.99 aB 2180.21 96 1178.95 bB 1404.55 bA 5063.28 aA 2414.95

Average 1858.79 1613.17 3195.35 RS

24 12.757 aA 10.874 aB 7.084 bA 10.238 48 11.671 bA 14.750 aA 5.554 cA 10.658 72 13.047 aA 10.258 bB 4.597 cA 9.300 96 16.669 aB 14.640 aA 6.765 bA 12.947

Average 13.536 12.631 5.898 TP

24 1233.333abAB 1500.000 aA 1083.333 bA 1272.22 48 975.000 aB 1283.333 aA 1108.333 aA 1122.22 72 1233.333 aAB 1366.666 aA 1058.333 aA 1219.44 96 1541.666 aA 1175.000 bA 1141.666 bA 1276.47

Average 1245.833 1331.250 1082.609 AA

24 4461.18 cB 6111.57 bA 7306.21 aA 5959.65 48 4972.57 bB 6641.56 aA 6768.15 aA 6127.42 72 4661.09 bB 6483.49 aA 6295.71 aA 5813.43 96 6618.32 aA 6325.43 aA 6864.39 aA 6502.92

Average 5178.30 6390.52 6743.80 Averages followed by the same small letter in row and the same capital letter in a column do not differ between them for Tukey test at 5% of probability.

52

It was observed a significant increase in RS contents in freshly harvested three

months stored seeds after 96 h imbibition (Figure 3D), whereas the content was kept

low in seeds stored for six months throughout the imbibition period (Table 2).

In general, the TP levels of stored gliricidia seeds had little alteration throughout

the period of imbibition. The lowest levels of TP had been verified in seeds stored for

six months and those levels remained low during the period of imbibition (Figure 3E).

The behaviour of seeds stored for three months also showed a significant reduction,

reaching levels of TP similar to the ones of seeds stored for six months 96 h after

imbibition. A different protein profile was observed for freshly harvested gliricidia

seeds, whose levels had reduced in the first 48 h and later they had increased until

completing 96 h after imbibition (Figure 3E). The contents of AA had a significant

increase by the third month and continued to increase in the sixth month of storage

(Figure 3F). There were no significant differences between the hours of imbibition for

those two months (Table 2).

53

DISCUSSION

The longevity of seeds is greatly influenced by storage conditions, mainly by

environmental temperature and humidity which can influence the seed water content

and metabolism. In seeds of Myrtaceae, Campomanesia phaea (Maluf & Pisciottano­

Ereio, 2005), it was also verified that seeds stored in natural environment and packed in

paper bags lose total viability after 240 days of storage. Conservation of this seed

species was better provided when storage was done in plastic bags under controlled

conditions in cold chambers. The beneficial effect of this type of storage was observed

also for other species of the same family (Barbedo et al., 1998). Cold and dry

environmental conditions are more favorable for orthodox seed storage (Villela &

Peres, 2004). The association between low temperature and impermeable packing is

responsible for a reduction in cell metabolism and it reflects on seed longevity (Figliolia

et al., 1993; Ferreira & Borgehtti, 2004).

It has been reported that TSS had apparently been used in cell respiration or

released to the medium during the initial imbibition phases, as observed in embryos of

the leguminous plant Senna macranthera (Borges et al., 2001). This corroborates our

observations in which the TSS content decreased in cotyledons of imbibing gliricidia

seeds (Figure 3A). Apparently the mobilization of these reserves occurs following

radicle protrusion in Dalbergia miscolobium seedlings where it was clearly observed an

increase in TSS levels in root as in above­ground parts during the initial development of

seedlings (Sassaki & Felippe, 1992).

Part of RS produced during degradation of reserve carbohydrates is used in

cellular respiration of the storage tissue which is the main source of energy during the

beginning of seed germination. Another part of RS is employed for the SUC production

54

that will be carried to the embryonic axis or S synthesis, when there is RS excess in

storage tissues (Bewley & Black, 1994; Nelson & Coxswain, 2000). Synthesized ST is

stored as energy source for germination and subsequent growth of seedlings. According

to Stone & Gifford (1999), in seeds of Pinus taeda starch accumulation occurred in the

megagametofite tissue during radicle protrusion.

As stated by Zeleny (1954), increase in reducing sugars and posterior reduction

in seeds, as observed with gliricidia seeds in the third month of storage (Figure 3D),

seems to be associated with the loss of seed viability due to the fact that these sugars are

associated with reactions such as the Amadori and Maillard reactions which induce seed

deterioration by means of degradation of proteins and amino acids. As a result, SS

levels tend to diminish; however for the species in study an increase in sucrose content

occurred, possibly as a protection mechanism since the synthesis of this disaccharide

seems to be involved in seed protection systems against deterioration processes (Kigel

& Galili, 1995).

Decrease of reducing sucrose during seed imbibition occurred in rubber tree

seeds, as well as in gliricidia seeds (Figure 3D), partially explaining the process and use

of these sugars in seed metabolic processes. However De Paula et al. (1998), suggest the

participation of RS in Amadori and Maillard reactions.

On the other hand, the increase in hydration levels of gliricidia seeds as observed

in after the third month of storage (Figure 1) may have triggered the activation of

invertases and α­galactosidases. According to Wettlaufer & Leopold (1991), relatively

high levels of seed hydration are necessary so that there is activation of these same

enzymes and consequently promotion of increase in RS levels that will directly

participate in Amadori and Maillard reactions and cause deficiency of these compounds

in cells. As stated by Salisbury & Ross (1992), serious disturbances can occur in cells

55

due to loss of RS. This fact can be triggered since some of these sugars are important

intermediate compounds in photosynthetic metabolic pathways and cellular respiration.

They also constitute basic compounds for the synthesis of many other carbohydrates,

including starch and cellulose.

The increase in AA probably occurred due to activation of proteinases present

in seeds which has the role of degrading reserve proteins resulting in free amino acids.

According to Smith & Berjak (1995), these enzymes can increase their activity with the

seed aging process. Later, amino acid levels tend to diminish through their self­

destruction, due to Amadori and Maillard reactions, that according to Wettlaufer &

Leopold (1991), is characterized by non enzymatic attack to amine groups by RS. This

influence can be verified in rubber tree seeds (De Paula et al., 1998), as probably also in

G. sepium seeds (Figure 3F).

On most occasions, the lack of knowledge of ideal storage conditions, the

maintenance of physiological seed quality for long periods become more difficult,

therefore the aging of seeds is a natural process. In view of present results it was

verified that the environmental condition used for storage did not allow good

conservation of gliricidia seeds. The alteration in macromolecular composition in seed

cotyledons was apparently responsible for changes associated with seed deterioration

processes throughout the storage period.

It is not possible by means of the present study to conclude that similar

processes occur and what are the factors responsible for maintaining the viability of G.

sepium seeds while stored under the natural conditions of soil seed banks in the semi­

arid region. Therefore, further studies are needed in order to better characterize the

viability, longevity and storage tolerance of G. sepium seeds in order to better

56

understand its conservation and its capacity towards successful seedling establishment

and plant growth under adverse conditions.

ACKNOWLEDGMENTS

We would like to thank the following organizations for their valuable and

generous funding and technical support: Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia

(FAPESB), Embrapa Semi­Árido. And José Juracy Pereira for providing access to the

biological material at his property.

57

REFERENCES

ALLEN, S.E.; GRIMSHAW, H.M.; PARKINSON, J.A.; QUARMBY, C. Chemical

analysis of ecological mater iais. Oxford: Blackwell Scientific, 1974.

ALIZAGA, R.L.; MELLO, V.D.C.; SANTOS, D.S.B.; IRIGON, D.L. Avaliações de

testes de vigor em sementes de feijão e suas relações com a emergência em campo. Rev.

Bras. de Sement. Brasília, 12(2):44­58, 1990.

ARAÚJO, J.M.A. Química de alimentos: teoria e prática. Viçosa: UFV, Imprensa

Universitária, 335p, 1995.

BASKIN, C.C.; BASKIN, J.M. Seeds, ecology, biogeography, and evolution of

dormancy and germination. Academic Press, New York, 1998.

BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: Physiology of Development and Germination.

2 th ed. Plenum Press, New York, 1994.

BORGES, E.E.L., et al. Crescimento e mobilização de carboidrato em embrião de

sementes de fedegoso (Senna macranthera Irwis et Barneby) durante a germinação.

Rev. Cerne. 7(1), 2001.

DRUMOND, M.A.; CARVALHO FILHO, O.M. de. Introdução e avaliação de

Gliricidia sepium na região semi­árida do Nordeste Brasileiro. In: QUEIRÓZ MA de,

GOEDERT CO, RAMOS SRR, (ed.) Recursos genéticos e melhoramento de plantas

para o Nordeste brasileiro. Versão 1.0, 1999. Petrolina­PE: Embrapa Semi­Árido

/Brasília­DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, nov.

http://www.cpatsa.embrapa.br.

58

FERREIRA, D.F. Análises Estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão

4.0. In. 45° Reunião Anual da Região Brasileira da Sociedade Internacional de

Biometria. UFS Car, São Carlos, SP, Julho, p. 255­258, 2000.

HOEKSTRA, F.A.; GOLOVINA, E.A.; NIJSSE, J. What do we know about desiccation

tolerance mechanism? In: NICOLÁS G, BRADFORD KJ, CÔME D, PRITCHARD HD

(eds) The biology of seeds: resent research advances. pp. 259­270, Cambridge: CAB

International, 2003.

KIGEL, J.; GALILI, G. Seed development and germination. New York: Marcel

Dekker, 853p, 1995.

MALUF, A.M.; PISCIOTTANO­EREIO, W.A. Secagem e armazenamento de sementes

de cambuci. Pesq. Agropec. Bras. 40(7):707­714, 2005.

MILLER, G.L. Use of dinitrosalicilic acid reagent for determination of reducing

sugar . Analytical Chemistry, 31:426­428, 1959.

MORRIS, D.L. Quantitative determination of carbohydrates with Drywood’s anthrone

reagent. Science. Washington, 107:254­255, 1948.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger pr inciples of biochemistry. 3 th , Worth

Publishers, New York, NY, EUA, 2000.

PASSOS, L.P. Métodos analíticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel

Pacheco: Embrapa­CNPGL, 223p, 1996.

ROSEN, H. A modified ninhydrin calorimetric analysis for amino acids. Arch.

Biochem. Biophys, 67:10–15, 1957.

59

SAMPAIO RODAL, M.J. Fitofisionomias da caatinga. Avaliação e identificação de

ações prioritárias para a conservação, utilização sustentável e repartição de benefícios

da biodiversidade do bioma caatinga. In: Biodiver sidade da caatinga,

http//www.biodiversitas.org/caatinga, Petrolina, 2000.

SASSAKI, R.M.; FELIPPE, G.M. Remoção dos cotilédones e desenvolvimento inicial

de Dalbergia miscolobium. Rev. Bras. de Bot. 5:5­6, 1992.

SEIFFERT, M. Alguns aspectos fisiológicos e bioquímicos da germinação de

sementes e anatomia foliar de Protium widgrenii Engler . Universidade Federal de

Lavras, Dissertação Mestrado, 2003.

STONE, S.L.; GIFFORD, D.J. Structural and biochemical changes in Loblolly pine

(Pinus taeda) seeds during germination and early seedling growth. ll. Storage

triacylglicerols and carbohydrates. Int. J . Plant Science. 160(4):663­671, 1999.

TEIXEIRA, A.H.C. Informações Agrometeorológicas do Pólo Petrolina­

PE/J uazeiro ­ BA. Documentos. Embrapa Semi­Árido, Petrolina­PE, 2001.

VILLELA, F.A.; PERES, W.B. Coleta, beneficiamento e armazenamento. In:

FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. (eds), Germinação: do básico ao aplicado.

pp.265­281, Porto Alegre: Artmed, 2004.

WARD, F.H.; POWELL, A.A. Evidence for repair processes in onion seeds during

storage at high seed moisture contents. J . Exp. Bot. 34(140):277­282, 1983.

WETTLAUFER, S.H.; LEOPOLD, A.C. Relevance of Amadori and Maillard products

to seed deterioration. Plant Physiol. Rockville, 97(1):165­169, 1991.

60

YEMM, E.W.; WILLIS, A.J. The estimation of carbohydrates in plants extracts by

anthrone. Biochem. J . Colchester, 57:508­514, 1954.

ZELENY, L. Chemical, physical, and nutrive changes during storage. In: ANDERSON,

J.A.; ALCOCK, A.W. (eds.) Storage of cereal grains and their products. pp. 46­76.

Minnesota: American Association of Cereal Chemists, 1954.

61

CAPÍTULO III

Amylolitc activity and physiological quality of Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.

(Leguminosae ­ Papilionoideae) seeds during storage.

62

ABSTRACT – (Amylolitc activity and physiological quality of Gliricidia

sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae) seeds during storage). The

principal objective of seed storage is to maintain propagule quality. Storage is a very

critical procedure, as seeds are subject to a series of degenerative changes very soon

after being dispersed. The present work sought to evaluate the changes in the

physiological quality and in reserve mobilization of Gliricidia sepium seeds during

storage. Recently collected gliricidia seeds were analyzed immediately or stored for

three and six months in paper bags at room temperature. At the end of each storage

period the seeds were analyzed to determine their germination rate, water content, and

amylase activity during swelling. Seeds that had been stored for six months

demonstrated a reduction in vigor that was correlated with an increase in water content

and alterations in their enzymatic activity. The storage conditions tested were not found

to be ideal, for physiological alterations were detected that directly affected seed

germination quality.

Key words: water content, germination, vigor, amylases

63

RESUMO – (Atividade amilolítica e qualidade fisiológica de sementes de

Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae) submetidas ao

armazenamento). O objetivo principal do armazenamento é manter o nível de

qualidade das sementes. É um procedimento muito importante visto que as sementes

estão sujeitas a uma série de mudanças degenerativas depois de dispersas no ambiente.

Este trabalho visou avaliar as mudanças na qualidade fisiológica de sementes de

Gliricidia sepium submetidas ao armazenamento. Sementes de gliricidia recém

coletadas foram analisadas e o restante armazenadas por três e seis meses em sacos de

papel e em temperatura ambiente de laboratório. Ao final dos períodos de

armazenamento foram analisados a taxa de germinação, o teor de água das sementes e

atividade amilolítica durante a embebição. As sementes armazenadas por seis meses

mostraram redução no vigor que foi correlacionado com o aumento no teor de água e

com a alteração da atividade enzimática durante esse período. As condições de

armazenamento das sementes de gliricidia não foram ideais, uma vez que foram

detectadas alterações fisiológicas que refletiram diretamente na qualidade germinativa

das sementes.

Palavras­chave: teor de água, germinação, vigor, amilases

64

INTRODUCTION

Considerable research has been undertaken in recent years that examined the

physiological quality of seeds, and the series of degenerative changes that they suffer in

terms of their biochemistry and their physiology and physical integrity after maturation,

which are all associated with reduced vigor (Alizaga et al., 1990). These degenerative

changes may reflect deficiencies in basic procedures used in seed preservation, such as

storage conditions.

As the principal objective of storage is to maintain high levels of seed quality,

success in that endeavor will be closely associated with the initial quality of the seeds,

their degree of desiccation, and the storage conditions themselves (Carvalho &

Nakagawa, 2000).

In dryland vegetation communities such as the caatinga, which covers most of

northeastern Brazil, seeds are usually subject to prolonged periods of water deficit after

dispersal from the mother plant. As such, native or cultivated species that successfully

inhabit this region have a characteristically high tolerance to drought conditions, and

their seeds can generally survive through the dry season within the soil seed bank.

Gliricidia [Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Leguminosae­ Papilionoideae)] is

native to South and Central America, but was recently introduced into northeastern

Brazil. It is of significant commercial and economic interest there due to its multiple

uses ­ as a forage species with high nutritive value, as a source of living fence posts, as

a medicinal plant, and even as an alternative energy source. This species demonstrates

rapid growth, high capacity for regeneration, drought resistance, and is easily

propagated by seeds (Drumond & Carvalho Filho, 1999).

65

As the study of seeds is a common starting point for examining the rational use

of potentially useful plant species, an examination of the physiological processes

affected by storage is of fundamental importance. Seed longevity is greatly influenced

by their storage conditions, and can be measured directly by their germination capacity.

The maintenance of seed viability during storage depends directly on seed water

content, and is reflected by the intensity of the physiological activity of the seeds.

In addition to tissue re­hydration that occurs during the first phases of seed

swelling, germination is characterized by the mobilization of accumulated seed

reserves. These reserves are degraded and mobilized in order to promote embryo

development. Starch is one of the many types of seed reserves, and the principal

reserve polymer in legume seeds, and it is metabolized by hydrolytic enzymes, often α­

amylase (Buckeridge et al., 2004). This enzyme hydrolyzes the α ­ 1,4 bonds of the

starch molecule, producing various oligosaccharides (Bewley & Black, 1994).

Starch degradation is mediated by enzymes that may or may not be present in

quiescent seeds (Mayer & Poljakoff­Mayber, 1985). Many preexistent enzymes, such

as the α ­ amylase, can be detected only at low levels in quiescent seeds, and must be re­

synthesized during re­hydration.

Neves & Moraes (2005) observed that tests that examine the physiological

quality of seeds such as germination, and biochemical analyses such as solubilization,

starch degradation, and hydrolytic enzyme activity, can all serve as measures of the

vigor and viability of seeds that have been submitted to different storage periods.

The present work evaluates the changes in the physiological quality of stored

Gliricidia sepium seeds and evaluates their viability and vigor by analyzing amylase

enzyme activity during germination.

66

MATERIALS AND METHODS

Obtaining and storing seeds

Mature seeds were collected in 2006 from G. sepium trees –in Fazenda

Morrinhos, a farm located in the county of Queimadas, state of Bahia (W 39º 40 ׳ S 11º

which ,( ׳ 12 is considered ‘Private Reserve of Natural Patrimony’ under the Brazilian

law. The freshly collected seeds were cleaned and one sub­sample was immediately

evaluated ­ while the remaining seeds were placed in paper bags and stored at room

temperature (25°C ± 3) for periods of from three and six months, being newly evaluated

at the end of each of these time periods. All experiments were undertaken at the

Germination Laboratory of the Unidade Experimental Horto Florestal, UEFS, Feira de

Santana, Bahia, Brazil.

Water content

Seed water content was determined by drying them in an oven at 60°C until

obtaining a constant weight, which was then subtracted from the previously determined

fresh weight. Twenty­five seeds were used in each sub­sample.

Germination tests

After the passing of each experimental storage period, four sub­samples of 25

seeds were sewn onto Petri dishes containing two layers of germination paper that had

been moistened with a quantity of distilled water that corresponded to 2.5 times the

weight of the paper substrate. The seeds were maintained in a germination chamber at

25°C under a photoperiod of 14 h for a period of ten days. The germinating seeds were

examined daily and individuals with the radicule protruding at least 2 mm from the seed

67

coat were considered to be germinating, and these seeds were counted and subsequently

discarded.

Enzyme extraction and analysis of enzymatic activity

Enzyme extraction and the subsequent analysis of enzymatic activity were

undertaken at the Seed Analysis Laboratory of Embrapa Semi­Árido, in Petrolina,

Pernambuco State, Brazil. Alpha­amylase and total amylase activity were evaluated in

recently collected seeds and in seeds subjected to different storage periods. Seed lots

were divided into four sub­samples and one sub­sample was immediately frozen at ­

20ºC; the other three sub­samples were incubated in a seed germinator at 25ºC for 2, 4,

and 7 days. At the end of these time periods, the cotyledons of the germinating seeds

were removed, without touching the seeds, and stored at ­20ºC for later enzymatic

extraction.

Extraction and assay of the amylase enzymes were performed according to the

methods described by Gugelmineti et al. (1995). The cotyledons (1 g) were macerated

in 0.1 mol.L ­1 pH 7TRIS­HCl buffer containing 0.1 mol.L ­1 NaCl and 10 mmol.L ­1

CaCl2 using a mortal and pestle. The resulting slurry was centrifuged at 12,000 g for 10

minutes at 4 o C. All supernatants were collected and stored at ­20 o C until the enzyme

assays were performed. Total amylase and α­amylase activity were measured in a

reaction system composed of a reaction buffer (50 mmol.L ­1 sodium acetate pH 5.2 and

10 mmol.L ­1 CaCl2), with a substrate of soluble potato starch (2.5%). The reaction

system was divided into two parts, and the first portion was incubated at 35 o C for 15

minutes. To inactivate the other amylases (leaving only α­amylase), the second portion

of the crude extract was maintained at 70 o C for 15 minutes before initiating enzymatic

analysis. At the end of the reaction periods, free reducing sugars were quantified by the

68

dinitrosalicylic acid (DNS) method using a spectrophotometer (540nm). Total amylase

and α­amylase activities were expressed in mmol of reducing sugar produced by the

degradation of starch per g of fresh material per minute.

Statistical analyses

Data related to water content and germination was expressed in percentages, and

their standard errors were calculated. Data of enzymatic activity was submitted to

variance analysis using the Sisvar 4.3 software program (Ferreira, 2000). Differences

between the averages were compared using the Tukey test at a 5% probability level.

The significant model was selected to adjust the regression equations because it

presented the greatest coefficient of determination.

69

RESULTS

Increasing storage time significantly altered enzymatic activity (Table 1). No

significant differences were observed during the period of seed swelling, although a

significant interaction between the two parameters was observed.

The average results of the evaluation of the physiological quality of gliricidia

seeds stored in paper sacks at room temperature are shown in Figure 1.

Seed water content increased during storage, going from an initial value of 6.5%

to 13.5% by the sixth month of storage (Figure 1). These stored seeds demonstrated a

14% reduction in their germination rate over the same time period. This reduction in

seed vigor was significant after six months of storage, and coincided with the period in

which they demonstrated an increase in water content.

Table 1. Variance analysis of total amylase (AT) and α­amylase (α­A) activity in

Gliricidia sepium seeds during storage.

ns = not significant; * = significant at a 5% probability level

Source of Var iation AT α­A

Storage 25.492 * 3.994 *

Imbibition 0.592 ns 0.512 ns

Storage*Imbibition 3.316 * 6.483 *

CV % 9.68 14.10

70

Enzymatic activity during swelling and germination of the gliricidia seeds

followed the same pattern for total amylase activity. The α­amylase activity varied

according to the duration of seed storage (Figure 2A,B). In general, it was observed

that total amylase activity of the dry seeds was similar over the entire period of seed

storage (Figure 2B); α­amylase activity, however, increased in the third and sixth month

of storage (Figure 2A). This initial increase can be attributed to the effects of the

hydration of the seed tissues (Figure 1) that would cause alterations in seed metabolism

during storage.

Figure 1. Sugar content and percentage of total germination of G. sepium seeds stored

under environmental conditions is paper bags (SPB). Average of four trials ± SE

(Standard Error).

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 3 6

Storage time (m)

Water content (%

)

50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

Germination (%

)

WC % G

71

Figure 2. Amylase activity in the cotyledons of stored G. sepium seeds during

germination.

0

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

0 2 4 6 8

Activity of α

­mylase (µ

mol

RS/g.FW

/min)

0 m (y1) 3 m (y2) 6 m (y3) A

y1= 337.19x + 6312.4 R 2 = 0.6631 y2= 80.983x 2 ­ 560.56x + 7682.4 R 2 = 0.3924 y3= ­187.32x + 8656.5 R 2 = 0.7889

0

5.000

10.000

15.000

20.000

25.000

30.000

35.000

0 2 4 6 8 Imbibition time (Days)

Activity of total amylase (µ

mol

RS/g.FW

/min)

B

y1= ­127.88x + 24230 R 2 = 0.1644 y2= ­419.91x + 24948 R 2 = 0.7355 y3= ­261.28x 2 + 2114.3x + 25726 R 2 = 0.8185

72

During the swelling of recently colleted gliricidia seeds the levels of α­amylase

increased, demonstrating a peak of activity on the seventh day (Figure 2A). Total

amylase activity was little altered during swelling, remaining at high levels; and this

enzymatic activity is correlated with the high germination levels observed in these fresh

seeds (Figure 3).

During the swelling of gliricidia seeds stored for three months, an initial

reduction in α­amylase activity was observed (≅ 2,000 µmol RS/g. FW/min), and after

two days of swelling activity levels increased and then remained relatively constant

(Figure 2A). Although there was a reduction in enzymatic activity, germination levels

remained high among three­month old seeds (Figure 3). Germination levels remained

high even after the increase in enzymatic activity in the other periods of swelling.

0

20

40

60

80

100

120

2 4 7

Imbibition Time (Days)

Germination (%

)

0 M 3M 6M

Figure 3. Germination percentage of stored G. sepium seeds during swelling. Average

of four trials ± SE (Standard Error).

73

The differences seen in germination rates after six months can explain the

patterns of enzymatic activity observed for gliricidia seeds. Note that seeds required

longer swelling period after six months of storage in order to germinate (Figure 3).

Storage for six months altered α­amylase activity levels and these remained at a

constant level until the fourth day of swelling, when there was a further reduction,

which reflected the low observed germination levels (Figure 2A). Total amylase levels

during seed swelling were higher in seeds stored for six months than those observed in

the other storage treatment regimes (Figure 2B).

The observed tendency of increasing levels of overall amylase activity during

swelling over time may represent a mechanism for compensating for the loss of vigor

caused by longer periods of storage.

74

DISCUSSION

The preservation of seed physiological quality under any given conditions of

temperature and relative humidity is greatly influenced by the type of packaging

material utilized (Ferreira & Borghetti, 2004). The use of paper bags for storing

gliricidia seeds permitted an increase in their water content over time. Maluf &

Pisciottano­Ereio (2005) reported that Campomanesia phaea seeds stored under similar

conditions lost their viability and, as such, this storage technique would not be capable

of conserving seeds for long periods of time.

High water content is one of the principal causes of the loss of germination vigor

during storage (Villela & Perez, 2004). High seed humidity causes an increase in the

seed’s respiration rate, mobilizes energy reserves, and accelerates seed deterioration.

The energy liberated in these processes will detract from the stored reserves required to

initiate germination (Marcos Filho, 2005).

An increase in water content in rubber tree seeds likewise initiated seed

deterioration (De Paula et al., 1998). The principal alterations documented for seed

deterioration include the exhaustion of food reserves, alteration of the chemical

composition of seed components, such as the oxidation of lipidic components, the

partial degradation of proteins, the alteration of cell membranes, which results in the

reduction of their integrity and organization, with a concomitant increase in their

permeability, as well as enzymatic alterations, and modifications of the nucleotides

(Ferreira & Borghetti, 2004).

As enzymatic activity is required for germination, any alteration of seed

metabolism caused by an increase in its water content will be deleterious to seed

75

survival ­ as can be observed in the reduced vigor of gliricidia seeds over time (Figure

2).

Alpha­amylase demonstrates high activity levels at the start of the germination

process, but its enzymatic activity reduces over time. This behavior can be attributed to

the decrease in starch levels as germination proceeds (Bewley & Black, 1994). Aragão

et. al. (2003) observed this same pattern of amylase activity in sweet corn seeds. Many

studies have correlated a decrease in amylase activity with a loss of seed viability, and

decreasing amylase activity has been reported in cereal grains as a consequence of aging

(Muniz et al., 2007).

The present work verified that the decreasing vigor of gliricidia seeds was

mirrored by alterations in their enzymatic activity during storage (Figure 3). Desai et al.

(1997) observed that seed vigor was affected more rapidly than seed viability during

storage.

As the main objective of seed storage is to maintain seed quality, it can be

concluded that the storage conditions employed here were not ideal, as they resulted in

physiological alterations that directly influenced the quality of gliricidia seed

germination.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), the Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da

Bahia (FAPESB), and Embrapa Semi­Árido­ Petrolina (PE) for their support in

undertaken this work, as well as José Juracy.

76

REFERENCES

ARAGÃO, C.A.; DANTAS, B.F.; ALVES, E.; CATANEO, A.C.; CAVARIANI, C.;

NAKAGAWA, J. Atividade amilolítica e qualidade fisiológica de sementes

armazenadas de milho super doce tratadas com ácido giberélico. Rev. Bras. de Sem.

25(1): 43­48, 2003.

BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: Physiology of Development and Germination.

2 th , ed. Plenum Press, New York, 1994.

CARVALHO, N.M.; NAKAGAWA, A.J. Sementes: ciência, tecnologia e produção.

4 th , Jaboticabal: FUNEP, 588p, 2000.

BUCKERIDGE, M.S.; SANTOS, H.P.; TINÉ, M.A.S. et al. Mobilização de reservas.

In: FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. (Orgs.) Germinação do básico ao aplicado.

Porto Alegre: ARTMED. Cap. 11, p. 163­185, 2004.

DE PAULA, N.F.; BORGES, E.E.L. DE; BORGES, R.C.G. de, DE PAULA, R.C.

Avaliações bioquímicas e fisiológicas em sementes de seringueira (Hevea brasiliensis

Muell. Arg.). Rev. Bras. de Sem., 20(2): 1­10, 1998.

DESAI, B.B.; KOTHECA, P.M.; SALUNKE, D.K. Seeds handbook: biology,

production, processing and storage. New York: Marcel Dekker, 627p, 1997.

DRUMOND, M.A.; CARVALHO FILHO, O.M. de. Introdução e avaliação de

Gliricidia sepium na região semi­árida do Nordeste Brasileiro. In: QUEIRÓZ, M.A. de;

GOEDERT, C.O.; RAMOS, S.R.R. (ed.) Recursos genéticos e melhoramento de

plantas para o Nordeste brasileiro. Versão 1.0, 1999. Petrolina­PE: Embrapa Semi­

77

Árido /Brasília­DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, last consulted in

November, 2007. http://www.cpatsa.embrapa.br.

FERREIRA, D.F. Análises Estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão

4.0. In. 45° Reunião Anual da Região Brasileira da Sociedade Internacional de

Biometria. UFS Car, São Carlos, SP, last consulted in July, 2007, p. 255­258, 2000.

FERREIRA, A.; BORGHETTI, F.(Orgs.). Germinação­ Do básico ao aplicado. Porto

Alegre, Ed. Artmed, 2004.

GUGELMINETTI, L.; YAMAGUCHI, J.; PERATA, P.; ALPI, A. Amilolytic activities

in cereal seeds under aerobic and anaerobic conditions. Plant Physiology, Rockville,

109(1):1069­1076, 1995.

MALUF, A.M.; PISCIOTTANO­EREIO, W.A. Secagem e armazenamento de sementes

de cambuci. Pesq. Agropec. Bras. 40(7):707­714, 2005.

MARCOS FILHO, J. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba: Fealq,

495 p, 2005.

MAYER, A.M.; POLJAKOFF­MAYBER, A. The germination of plants. 4 th . Oxford:

Pergamon Press, 270p, 1978.

MUNIZ, F.R.; CARDOSO, M.G.; PINHO, E.V.R.V.; VILELA, M. Qualidade

fisiológica de sementes de milho, feijão, soja e alface na presença de extrato de tiririca.

Rev. Bras. de Sem. 29(2): 195­204, 2007.

78

NEVES, L.A.S. das; MORAES, D.M. de. Análise do vigor e da atividade da α­amilase

em sementes de cultivares de arroz submetidas a diferentes tratamentos com ácido

acético. Rev. de Ciênc. Agrovet. Lages. 4(1): 35­43, 2005.

VILLELA, F.A.; PERES, W.B. Coleta, beneficiamento e armazenamento. In:

FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. (eds), Germinação: do básico ao aplicado. pp.

265­281, Porto Alegre: Artmed, 2004.

79

CAPÍTULO IV

Déficit hídrico em sementes armazenadas de Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.

(Leguminosae ­ Papilionoideae).

80

ABSTRACT – (Water deficit of storage seeds Gliricidia sepium (Jacq.) Steud.

(Leguminosae ­ Papilionoideae)) Among the various environmental factors capable of

influencing the germinative process of seeds, the unavailability of water is one of the

most important. In view of the lack of physiological germination information

concerning the of seeds of many native or introduced species of the caatinga, this work

to verify the effect of water deficit on the germination of stored seeds of Gliricidia

sepium, multiple use species, which has been widely used in this region. The seeds used

were packed in paper bags and stored at room temperature for six, nine and twelve

months for further evaluation of the water deficit at the end of each period. For

simulation of the water deficit was used solution of polyethylene glycol (PEG6000) in

different potential osmotic (0.0; ­0.2; ­0.4; ­0.6; ­0.8; ­1.0; ­1.2; ­1.4; ­1.6; ­1.8; ­2.0

MPa). Seed germination was influenced by the osmotic conditioning during storage.

The tolerance of gliricidia seeds was between ­0.8 and ­1.0 MPa when not stored. The

limits of tolerance of stored seeds were influenced by the conditions of storage which

did not promote its conservation of these affecting its response water deficit.

Key Words: vigour, germination, water deficit, storage

81

RESUMO ­ (Déficit hídr ico em sementes armazenadas de Gliricidia sepium (Jacq.)

Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae)). Dentre os diversos fatores ambientais

capazes de influenciar o processo germinativo de sementes, a indisponibilidade de água

é um dos mais importantes. Tendo em vista a carência de informações fisiológicas

concernentes à germinação de sementes de grande parte das espécies nativas ou

introduzidas na caatinga, objetivou­se com este trabalho verificar o efeito do déficit

hídrico sobre a germinação de sementes armazenadas de Gliricidia sepium, uma espécie

de uso múltiplo e que vem sendo muito utilizada nessa região. As sementes utilizadas

foram acondicionadas em sacos de papel e armazenadas em temperatura ambiente

durante seis, nove e doze meses, para posterior avaliação do déficit hídrico ao final de

cada período. Para simulação do déficit hídrico foi utilizada solução de polietileno

glicol (PEG6000) em diferentes potenciais osmóticos (0,0; ­0,2; ­0,4; ­0,6; ­0,8; ­1,0; ­

1,2; ­1,4; ­1,6; ­1,8; ­2,0 MPa) durante a germinação. A porcentagem de germinação foi

influenciada pelo condicionamento osmótico durante o armazenamento. O limite de

tolerância das sementes de gliricidia encontrou­se em entre ­0,8 e ­1,0 MPa quando não

armazenadas. Os limites de tolerância das sementes armazenadas foram influenciados

pelas condições de armazenamento que neste caso não promoveu a conservação destas

afetando na sua resposta à indisponibilidade hídrica do meio.

Palavras­chave: vigor, germinação, déficit hídrico, armazenamento.

82

INTRODUÇÃO

O Brasil possui 385 milhões de hectares de florestas nativas (IPEF, 2000), sendo

que a região de Caatinga tem cerca de 800 mil km 2 , totalizando 11% do território

nacional e 70% do território nordestino. Essa comunidade vegetal predominante nessa

região é submetida à escassez de água por períodos prolongados e tendem a ser

dominadas por plantas nativas ou cultivadas que apresentam características de

tolerância à seca e suas sementes sobrevivem a essas condições, armazenadas nos

bancos de solos.

A germinação de sementes é um processo complexo, e seus mecanismos variam

entre espécies ou mesmo entre populações de uma mesma espécie (Khatri et al., 1991).

É considerada como a retomada das atividades metabólicas do eixo embrionário, o qual

se encontrava paralisado nas fases finais do processo de maturação; porém, quando

estimulado por condições ambientais, promove o rompimento do tegumento pela

radícula. Essa é uma etapa crítica do biociclo vegetal pelo fato do processo estar

associado a vários fatores de natureza extrínseca e intrínseca (fatores do ambiente

físico), ou seja, a processos fisio­metabólicos (Laboriau, 1983; Popinigis, 1985;

Andrade & Damião­Filho, 1989; Borges & Rena, 1993; Bewley & Black, 1994).

Dentre os diversos fatores ambientais capazes de influenciar o processo

germinativo de sementes, a indisponibilidade de água é um dos mais importantes. Este

fator abiótico pode ser considerado como limitante à iniciação da germinação de

sementes, assim como está envolvida, direta ou indiretamente em todas as demais

etapas do metabolismo subseqüente, seguindo a ativação do ciclo celular e

conseqüentemente crescimento da plântula.

83

Segundo Borges et al. (2002), a condição hídrica é um dos fatores que exerce

influência decisiva na manutenção do banco de sementes no solo. A indução de

estresses osmóticos vem sendo oportunamente utilizada nas ultimas décadas como

princípio benéfico em aplicações tecnológicas visando à melhoria da qualidade de

sementes e estabelecimento de plântulas referindo­se ao termo priming ou

envigoramento de muitas espécies cultivadas (Heydecker & Coolbear, 1977; Haigh,

1988; Roberts & Ellis, 1989).

A solução de polietileno glicol (PEG) tem sido usada como meio osmótico para

simular o estresse hídrico que ocorre em campo, segundo Baskin & Baskin (1998), pode

induzir à dormência secundária. Aparentemente, a imposição de estresse osmótico as

sementes pode induzir tolerância a outros tipos de estresses em espécies cultivadas,

incluindo tolerância à seca e a sais (Savino et al., 1979; Kretschmer, 1982; Burgass &

Powell, 1984; Bruggink et al., 1995; Cayuela et al., 1996; Cadman et al., 2006). Além

disso, esse parece ser um fenômeno evolutivo natural em espécies nativas, de adaptação

a condições adversas. Dentro desse enfoque, percebe­se a importância das pesquisas

relativas a estresses em sementes, como componente essencial e inicial de tolerância à

estresses abióticos que podem ocorrer ao longo do ciclo de vida natural da maioria das

espécies vegetais.

Tendo em vista a carência de informações fisiológicas relativas à germinação de

sementes de grande parte das espécies nativas ou introduzidas na caatinga, o presente

trabalho foi desenvolvido, com o objetivo de verificar o efeito do déficit hídrico sobre a

germinação de sementes armazenadas de Gliricidia sepium, uma espécie de uso

múltiplo e que vem sendo muito utilizada pelo pequeno produtor da caatinga.

84

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção e armazenamento de sementes

Foram utilizadas sementes de G. sepuim provenientes da Reserva do Patrimônio

Natural da Fazenda Morrinhos (Queimadas­BA, W 39º ׳ 40 S 11º ( ׳ 12 coletadas em

outubro de 2006. Uma parte das sementes recém coletadas logo após o beneficiamento

foram submetidas ao déficit hídrico. O restante das sementes foram acondicionadas em

sacos de papel e em seguida foram armazenadas em temperatura ambiente (25 °C ± 3),

durante seis, nove e doze meses no Laboratório de Germinação da Unidade

Experimental Horto Florestal (UEFS) – Feira de Santana –BA, para posterior avaliação

do déficit hídrico ao final de cada período.

Avaliação das sementes sobre déficit hídr ico

As condições de déficit hídrico foram testadas em diferentes potenciais

osmóticos na germinação das espécies. Os experimentos foram conduzidos em placas

de Petri, contendo as sementes umedecidas com a solução teste. As sementes

permaneceram em germinador ajustado a temperatura de 25 ºC e fotoperíodo de 14h por

um período de 10 dias.

Para simulação do déficit hídrico foi utilizada solução de polietileno glicol

(PEG6000) em diferentes potenciais osmóticos (0,0; ­0,2; ­0,4; ­0,6; ­0,8; ­1,0; ­1,2; ­

1,4; ­1,6; ­1,8; ­2,0 MPa), preparadas de acordo com Villela et al. (1991).

A unidade experimental foi composta de quatro repetições de 25 sementes para

cada potencial osmótico testado. Nas avaliações foram consideradas germinadas as

sementes que protrudiram radícula com pelo menos 2 mm de comprimento sendo estas

contadas e posteriormente descartadas.

85

Análise Estatística

Os dados de germinação foram expressos em porcentagem. Os dados de tempo

médio, velocidade média e velocidade de germinação foram transformados pela função

(x + 0,5) 0,5 e analisados mediante análise de variância utilizando o programa Sisvar 4.3

(Ferreira, 2000). As diferenças entre as médias obtidas foram comparadas pelo teste de

Tukey a 5% de probabilidade.

86

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de variância dos dados de germinação das sementes de gliricidia

mostrou interação significativa entre o tempo de armazenamento das sementes e o

déficit hídrico. Contudo, não ocorreu influência do armazenamento para o tempo médio

de germinação das sementes (Tabela 1). Os valores de velocidade média e de

germinação sofreram influência significativa para as duas variáveis incidentes

analisadas.

Tabela 1. Análise de variância do tempo médio de germinação (Tm), velocidade média

de germinação (Vm); velocidade de germinação (VG); de sementes armazenadas de

Gliricidia sepium, submetidas a déficit hídrico durante a germinação.

Fonte de var iação Tm, dias Vm, dias ­1 VG

Armazenamento 0.799 ns 44.765* 224.606*

Déficit 3.036* 32.739* 120.489*

Armaz.* Déficit 2.214* 8.689* 18.564*

CV% 18.06 3.82 11.16 F= ns; *= não significativo, significativo a 5% respectivamente.

A porcentagem de germinação foi influenciada pelo condicionamento osmótico

durante o armazenamento das sementes. Observou­se redução gradual da taxa de

germinação à medida que o potencial osmótico da solução tornava­se mais reduzido,

principalmente com o aumento do tempo de armazenamento, ficando evidente a

diferença do grau de sensibilidade das sementes de gliricidia à condição do meio. Na

87

Figura 1 observa­se que em potenciais inferiores a ­1,0 MPa, a geminação das sementes

de gliricidia foi significativamente reduzida, chegando a taxa nula a ­1,4 MPa.

Potenciais hídricos reduzidos, especialmente no começo da embebição das

sementes, inviabilizam a seqüência dos eventos germinativos durante a absorção de

água (Torres et al., 1999). O primeiro efeito mensurável do déficit hídrico na

germinação é o impedimento do crescimento, causado pela diminuição da expansão

celular. O processo de alongamento celular e a síntese de parede são altamente sensíveis

ao déficit hídrico (Kramer, 1974 apud Perez & Moraes, 1991).

De acordo com Jeller & Perez (2003), sob condições de déficit hídrico com

polietileno glicol, as sementes de Cassia excelsa apresentaram redução gradativa da

germinabilidade e da velocidade de germinação quando o potencial foi reduzido de ­0,2

a ­0,8 MPa.

Figura 1. Porcentagem de germinação de sementes recém coletadas e armazenadas de

G. sepium submetidas a déficit hídrico. Média de quatro repetições.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 ­0.2 ­0.4 ­0.6 ­0.8 ­1 ­1.2 ­1.4 ­1.6 ­1.8 ­2

MPa

0 m 6 m 9 m 12 m

(%) G

erminação

88

Durante o procedimento experimental, as sementes de gliricidia colocadas em

contato com as soluções osmóticas, iniciaram a embebição de água normalmente,

cessando o processo assim que entraram em equilíbrio com o potencial osmótico da

solução externa. Quando o potencial é reduzido, como em ­1,4 MPa, a expansão da

radícula de gliricidia foi impedida. As sementes túrgidas mesmo nesses potenciais

osmóticos reduzidos tornam­se fisiologicamente ativas, mobilizam reservas e iniciam

seu processo germinativo sem atingir a fase de alongamento celular, mesmo após

algumas semanas de contato com a solução osmótica. Os eventos do processo de

germinação sob condições de priming ou condicionamento osmótico são iniciados

mesmo em conteúdos limitados de água na semente. O processo de germinação não é

completado devido ao requerimento de absorção de água adicional para iniciar a fase III

do processo metabólico, que volta a ocorrer em condições favoráveis (Ferreira &

Borghetti, 2004).

Para as sementes armazenadas durante seis meses, as sementes apresentaram

germinação em potencial osmótico onde previamente não havia germinação (­1,2 MPa),

ampliando, portanto, o limite máximo de tolerância ao déficit hídrico simulado com o

PEG 6000. Essa resistência pode ter sido resultado de uma osmorregulação sofrida pelas

sementes durante o período de exposição à solução osmótica ou durante o tempo de

armazenamento.

O déficit hídrico altera a permeabilidade da membrana e as propriedades do

tonoplasto permitindo a interação entre proteínas citoplasmáticas e enzimas

degradativas, ou ainda, aumenta a degradação de proteínas por estimular a síntese de

enzimas proteolíticas (Perez & Moraes, 1991). O acúmulo de solutos no embrião antes

do crescimento radicular diminui o potencial osmótico, gerando pressão de turgescência

suficiente para permitir que o embrião cresça e rompa a barreira do tegumento.

89

Para as sementes armazenadas por doze meses, o armazenamento provocou a

perda do vigor (Figura 1). A taxa germinativa foi significativamente reduzida, mesmo

em condições favoráveis a germinação ou quando as sementes eram colocadas em

déficit hídrico. Considerando­se a interação significativa entre os dois fatores, verificou­

se que o déficit hídrico contribui muito para a perda de viabilidade das sementes.

A redução do vigor e da viabilidade das sementes de gliricidia pode ter sido

ocasionada também pela grande incidência de fungos observados visualmente

principalmente nas sementes armazenadas por nove e doze meses. A presença de fungos

foi bastante pronunciada quando as mesmas eram expostas aos diferentes potenciais

osmóticos das soluções.

Sabe­se que durante a hidratação da semente ocorre a liberação de solutos para o

meio circundante tais como, açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e vários íons, o

que pode estimular o crescimento de patógenos causando a deterioração das sementes

(Bewley & Black, 1994). Ao mesmo tempo, esse acúmulo de solutos nas sementes de

gliricidia ocasionados pelo condicionamento osmótico, pode ter permitido uma possível

osmorregulação das sementes armazenadas por seis meses, proporcionando um aumento

do grau de tolerância ao déficit.

As Tabelas 2 a 4 mostram a diferença entre os valores médios de tempo,

velocidade média e velocidade de germinação para as sementes armazenadas durante o

déficit hídrico.

Com relação aos valores do tempo médio observou­se que, com a redução do

potencial hídrico e aumento do período de armazenamento, as sementes de gliricidia

precisaram de um maior tempo para que o processo germinativo ocorresse (Tabela 2).

Sob condições adequadas as sementes requereram 1,490 dias para germinar, enquanto

90

que sob condições de déficit e em potenciais mais reduzidos necessitaram de

aproximadamente 5 dias para que ocorresse a germinação das sementes.

Tabela 2. Tempo médio (Tm) de sementes de Gliricidia sepium recém coletadas e

armazenadas submetidas a déficit hídrico durante a germinação.

Meses

MPa 0 6 9 Média

Tm, (dias)

0,0 1.490 bB 2.715 abA 3.637 aA 2.614 B

­0,2 1.562 aB 3.147 aA 3.167 aA 2.625 B

­0,4 2.422 aAB 2.792 aA 2.813 aA 2.676 B

­0,6 3.567 aAB 3.207 aA 4.950 aA 3.908 AB

­0,8 4.713 aA 3.830 aA 4.117 aA 4.220 AB

­1,0 4.750 aA 3.795 abA 3.000 bA 3.848 AB

Média 3.074 a 3.433 a 3.614 a Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e maiúscula na coluna não

diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

O tempo de armazenamento influenciou de forma significativa nos valores de

velocidade média de germinação das sementes. A velocidade média foi reduzida

principalmente em sementes com nove meses de armazenadas (Tabela 3). Entre os

potenciais osmóticos testados as sementes armazenadas por seis meses não foi

observada diferença significativa para a velocidade média de germinação.

A diminuição do vigor das sementes armazenadas provocou a redução também

da velocidade de germinação (VG) durante o déficit hídrico. Observou­se diferença

significativa durante o armazenamento das sementes para os potenciais testados,

principalmente entre 0,0 a ­0,4 MPa (Tabela 4). Verificou­se uma relação direta entre a

91

redução dos potenciais osmóticos e a germinação das sementes de gliricidia

promovendo um decréscimo acentuado na velocidade de germinação das sementes

armazenadas. O déficit hídrico normalmente diminui a velocidade de germinação e a

porcentagem de germinação, existindo grande variação entre as espécies, desde aquelas

muito sensíveis até as mais resistentes (Bewley & Black, 1994).

Tabela 3. Velocidade média (Vm) de sementes de Gliricidia sepium recém coletadas e

armazenadas submetidas a déficit hídrico durante a germinação.

Meses

MPa 0 6 9 Média

Vm, (dias ­1 )

0,0 0.673 aA 0.368 bA 0.280 bAB 0.440 A

­0,2 0.650 aA 0.318 bA 0.323 bAB 0.430 A

­0,4 0.422 aB 0.360 aA 0.367 aA 0.383 A

­0,6 0.283 abC 0.317 aA 0.207 bBC 0.269 B

­0,8 0.212 abC 0.260 aA 0.138 bCD 0.203 B

­1,0 0.215 aC 0.270 aA 0.095 bD 0.193 B

Média 0.409 a 0.305 b 0.235 c Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e maiúscula na coluna não

diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

A presença de diferentes compostos que altera os potenciais osmóticos do meio,

podem nos dar informações valiosas quanto aos limites de tolerância das sementes ao

déficit hídrico. O alto peso molecular do PEG 6000 impede a penetração da substância

através das membranas celulares, podendo reduzir a disponibilidade de oxigênio em

virtude de sua alta viscosidade, afetando o processo germinativo (Bradford, 1995). A

capacidade das sementes de algumas espécies em germinar sob condições de déficit

92

hídrico lhes confere vantagens ecológicas em relação a outras que são sensíveis à seca.

Um dos benefícios do condicionamento osmótico (priming) é a melhoria do

desempenho da semente por ocasionar o seu envigoramento (Ferreira & Borghetti,

2004).

Nas sementes de gliricidia o efeito do condicionamento osmótico não pode ser

verificado nas sementes não germinadas, devido à contaminação por fungos ter

diminuído o vigor das sementes nos potenciais mais negativos. Embora o tratamento do

priming imponha um estresse osmótico (moderado) às sementes, ele permite que

inúmeros processos metabólicos progridam, mas ao mesmo tempo prevenindo a

protrusão radicular. Acredita­se que dessa maneira, as sementes de um mesmo lote

possam sincronizar a germinação, resultando na uniformização do processo

germinativo.

Tabela 4. Velocidade de germinação (VG); de sementes de Gliricidia sepium recém

coletadas e armazenadas submetidas a déficit hídrico durante a germinação.

Meses

MPa 0 6 9 Média

VG

0,0 19.708 aA 8.007 bA 5.195 cA 10.970 A

­0,2 19.103 aA 6.265 bAB 3.520 AB 9.629 A

­0,4 11.768 aB 8.140 bA 1.153 cBC 7.020 B

­0,6 6.493 aC 5.207 aB 1.907 bBC 4.536 C

­0,8 3.215 aD 4.260 aB 0.563 bC 2.680 D

­1,0 0.920 aD 1.767 abC 0.125 bC 0.937 E

Média 10.201 a 4.866 b 2.077 c Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e maiúscula na coluna não

diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

93

O uso de sementes de baixa qualidade, aliado à ocorrência de condições

ambientais adversas, podem resultar em baixa porcentagem de germinação e menor

velocidade de germinação. As condições de armazenamento fornecidas às sementes de

gliricidia provocaram redução na qualidade fisiológica destas. Tratamentos como o

priming, tornam­se neste caso uma ferramenta de fundamental importância para

aumentar o vigor dessas sementes e obter melhores taxas de germinação, bem como

aumentar a tolerância das sementes às condições adversas durante o processo

germinativo.

Segundo Fanti & Perez (2004) em sementes de Chorisia speciosa (paineira),

houve uma redução da viabilidade das sementes com a redução do potencial osmótico,

sendo o limite máximo de tolerância ao PEG entre ­0,6 e ­0,7 MPa. Entre as espécies

que também não apresentaram limites elevados de tolerância ao déficit hídrico simulado

com PEG 6000, pode­se citar Adenanthera pavonina, Leucaena leucocephala (Fonseca

& Perez, 1999) e Senna occidentalis (Delachiave & Pinho, 2003). Nas sementes de

gliricidia esse limite encontrou­se em entre ­0,8 e ­1,0 MPa quando não armazenadas

(Figura 1).

Ribeiro & Pelacani (2006) estudando a influência do déficit hídrico imposto por

manitol verificaram um aumento do tempo médio de germinação apresentado por duas

espécies de leguminosas (Cenostigma gardnerianum e Anadenanthera colubrina),

corroborando com os resultados obtidos em G. sepium para o polietiolenoglicol. Em

condições naturais, esse aumento do tempo para que as sementes germinem poderia

atuar de forma positiva no estabelecimento das plântulas, pois desta forma a germinação

das sementes que permanecem viáveis pode ser distribuída no tempo e no espaço,

aumentando a probabilidade das plântulas encontrarem condições ambientais adequadas

para seu crescimento e desenvolvimento (Bewley & Black, 1994).

94

A longevidade das sementes pode variar de acordo com o genótipo, mas, a

conservação do potencial fisiológico depende, em grande parte, da temperatura, das

condições do ambiente de armazenamento e do grau de umidade das sementes (Ferreira

& Borghetti, 2004; Marcos Filho, 2005). De acordo com os resultados obtidos, os

potenciais em que a germinação parece ser afetada, denominada de limite de tolerância,

foram influenciados pelas condições de armazenamento das sementes de gliricidia.

Baseado na indisponibilidade hídrica do meio, neste estudo verificou­se que a

embalagem utilizada para o armazenamento das sementes promoveu a conservação

destas até seis meses de armazenadas.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e a pessoa de José

Juracy pelo suporte de material vegetal.

95

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDRADE, V. M. M.; DAMIÃO­FILHO, C. F.1989. Morfologia vegetal. Jaboticabal:

FUNEP/UNESP, 259 p.

BASKIN, C.C; BASKIN, J.M. 1998. Seeds, ecology, biogeography, and evolution of

dormancy and germination. Academic Press, New York.

BEWLEY, J. D., BLACK, M. 1994. Seeds: physiology of development and

germination 2.ed. New York. Plenum, 445 p.

BORGES, E. E. L.; RENA, A. B. 1993. Germinação de sementes. In: AGUIAR, I. B.;

PINíRODRIGUES, F. C. M.; FIGLIOLA, M. B. (Coord..). Sementes florestais

tropicais. Brasílica: ABRATES, 83 p.

BORGES, E.E.L de; PEREZ, S.C.J.G.A.; BORGES, R.C.G de; REZENDE, S.T de;

GARCIA, S.R. 2002. Comportamento fisiológico de sementes osmocondicionadas de

Platymiscium pubescens Micheli (Tamboril­da­Mata). Revista Árvore, Viçosa­MG,

26(5):603­613.

BRADFORD, K. J. 1995.Water relations in seed germination. In: KIGEL, J.; GALILI,

G. (Ed.). Seed devenlopment and germination. New York: Marcel Dekker Inc.,

p.351­396.

BRUGGINK, G.T. & VAN DER TOORN, P. 1995. Induction of desiccation tolerance

in germinated seeds. Seed Science Research. 5: 1­4.

BURGAS, R.W.& POWELL, A.A. 1984. Evidence for repair processes in the

invigoration of seeds by hydration. Annals of Botany. 53: 753­757.

96

CADMAN, C.S.C.; TOOROP, P.E.; HILHORST, H.W.M.; FINCH­SAVAGE, W.E.

2006. Gene expression profiles of Arabidopsis Cvi seeds during cycling through

dormant and non­dormant states indicate a common underlying dormancy control

mechanism. Plant Journal.46: 805­822.

CAYUELA, E.; PÉREZ­ALFOCEA, F.; CARO, M.; BOLARÍN, M.C. 1996. Priming

of seeds with NaCl induces physiological changes in tomato plants grown under salt

stress. Physiology Plant. 96: 231­236.

DELACHIAVE, M.E.A.; PINHO, S.Z.2003. Germination of Senna occidentalis Link:

seed at different osmotic potential levels. Br azilian Archives of Biology and

Technology, Botucatu, 46(2):163­166.

FANTI, S. C.; PEREZ, S. C. J. G. A. 2004. Processo germinativo de sementes de

paineira sob estresses hídrico e salino. Pesquisa Agropecuár ia Brasileira, Brasília,

39(9): 903­909, set.

FERREIRA, D.F. 2000. Análises Estatísticas por meio do Sisvar para Windows

ver são 4.0. In. 45° Reunião Anual da Região Brasileira da Sociedade Internacional de

Biometria. UFS Car, São Carlos, SP, Julho, p. 255­258.

FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F.(Orgs.). 2004. Germinação­ Do básico ao

aplicado. Porto Alegre, Ed. Artmed.

FONSECA, A.G.; PEREZ, S.C.J. G. A. 1999. Efeito do estresse hídrico e interferência

de diferentes profundidades de plantio na germinação de sementes de Leucaena

leucocephala (Lam) de wit. Revista Ceres, 46: 371­381.

97

FONSECA, S. C. L.; PEREZ, S. C. J. G. A. 2003. Ação do polietileno glicol na

germinação de sementes de Adenanthera pavonina L. e o uso de poliaminas na

atenuação do estresse hídrico sob diferentes temperaturas. Revista Brasileira de

Sementes, 25(1):1­6.

HAIGH, A.M. 1988. Why do tomato seed pr ime? PhD thesis. Macquarie University,

Sydney.

HEYDECKER, W. & COOLBEAR, P. 1977. Seed treatments for improved

performance­survey and attempted prognosis. Seed Science & Technology, 5: 353–

425.

IPEF. 2000. Reflorestamento. http.www.ipef.com.br. Acesso em: 12 de janeiro de 2007.

JELLER, H. & PEREZ, S. C. J. de A. 2003. Condicionamento osmótico na germinação

de sementes de cássia­ do­ nordeste sob estresse hídrico, térmico e salino. Pesquisa

Agropecuária Brasileira, Brasília, 38(9):1025­1034.

KHATRI, R.; SETHI, V.; KAUSHIK, A. 1991. Inter­population variations of Kochia

indica during germination under different stress. Annals of Botany, 67: 413­415.

KRETSCHMER, M. 1982. Extension of the temperature tolerance of Lactuca achenes

with PEG and red light. Gartenbauwissenschaft, 47: 152­157.

LABOURIAU, L. G. 1983. A germinação da semente. Washington: OEA, 173 p.

MARCOS FILHO, J. 2005. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba:

Fealq, 495 p.

98

PEREZ, S. C. J. G. de A. & MORAES, J. A. P. V. 1991. Influência do estresse hídrico e

do pH no processo germinativo da algarobeira. Pesquisa Agropecuár ia Brasileira,

Brasília, 26(7): 981­988.

POPINIGIS, F. 1985. Fisiologia da semente. Brasília: AGIPLAN, 289 p.

RIBEIRO, R.C.; PELACANI, C.R. 2006. Influência do manitol e NaCl na germinação

de sementes de duas espécies de leguminosas com importância no semi­árido baiano.

Revista Stientibus­Série Ciências Biológicas, 6(2): 105­109.

ROBERTS, E.H. & ELLIS, R.H. 1989. Water and seed survival. Annals of Botany. 63:

39–52.

SAVINO G. et al. 1979. Effects of pre­soaking upon seed vigor and viability during

storage. Seed Science & Technology. 7: 57­64.

TORRES, S.B.; VIERA, E.L.; MARCOS­FILHO, J. 1999. Efeitos do estresse hídrico

na germinação e no desenvolvimento de plântulas de pepino. Revista Brasileira de

Sementes. 21: 59­63.

VILLELA, F.A.; DONI FILHO, L.; SEQUEIRA, E.L. 1991. Tabela de potencial

osmótico em função da concentração de polietileno glicol 6000 e ta temperatura.

Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília, 26(11/12): 1957­1968, nov./dez.

99

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram concluir que:

• A manutenção da viabilidade das sementes de Gliricidia sepium durante o

armazenamento depende da manutenção do teor de água inicial que pode ser

alcançado através do tipo adequado de armazenamento das sementes;

• Embora ambientes com temperaturas mais baixas sejam mais adequados para a

conservação das sementes, em temperaturas em torno de 25°C é possível

prolongar a viabilidade das sementes de gliricidia quando se controla o teor de

água inicial das mesmas através da utilização de embalagens impermeáveis para

o armazenamento;

• A variação nos teores de macromoléculas está associada com a perda da

viabilidade das sementes, proporcionada pela condição inadequada de

armazenamento;

• A tolerância da espécie ao déficit hídrico durante a germinação foi influenciada

pelo tipo de armazenamento inadequado das sementes;

• As sementes armazenadas adequadamente apresentaram boa longevidade,

evidenciando seu uso potencial pelo pequeno agricultor da caatinga, ou em

programas de recomposição ambiental.

100

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CITADAS NA INTRODUÇÃO GERAL

ANDRADE, V. M. M.; DAMIÃO­FILHO, C. F. Morfologia vegetal. Jaboticabal:

FUNEP/UNESP, 259 p. 1989.

BASKIN, C.C.; BASKIN, J.M. Seeds, ecology, biogeography, and evolution of

dormancy and germination. Academic Press, New York, 1998.

BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: Physiology of Development and Germination.

Second Edition. Plenum Press, New York, 445p, 1994.

BIANCHETTI, A. Tratamentos pré­germinativo para sementes florestais. In:

SIMPÓSIO BRASILIERO SOBRE TECNOLOGIA DE SEMENTES FLORESTAIS, 2.

1989, Atibaia. Anais... São Paulo: Instituto Florestal, p. 237­246, 1991.

BORGES, E. E. L.; RENA, A. B. Germinação de sementes. In: AGUIAR, I. B.; PINí

RODRIGUES, F. C. M.; FIGLIOLA, M. B. (Coord..). Sementes florestais tropicais.

Brasílica: ABRATES, 83 p. 1993.

CABRAL, E.L.; BARBOSA, D.C.A.; SIMABUKURO, E.A. Armazenamento e

germinação de sementes de Tabebuia áurea (Manso) Benth. & Hook. F. Ex. S. Moore.

Acta. Bot. Bras. 17(4): 609­617, 2003.

CARNEIRO, J.G.A. Armazenamento de sementes florestais. curitiba: FUPEF, 35 p.

(Série Técnica, 14), 1985.

CARNEIRO, J.G.A. de; AGUIAR, I.B. de. Armazenamento de Sementes. In: AGUIAR,

I.B. de; PINíRODRIGUES, F.C.M.; FLIGLIOLIA, M.B. Sementes Florestais

tropicais. 350p. 1993.

DESAI, B.B.; KOTECHA, P.M.; SALUNKE, D.K. Seeds handbook: biology,

production, processing and storage. New York: Marcel Dekker, 627p. 1997.

DRUMOND, M.A., CARVALHO FILHO, O.M. de. Introdução e avaliação de Gliricidia sepium na região semi­árida do Nordeste Brasileiro. In: QUEIRÓZ, M.A. de,

GOEDERT, C.O., AMOS, S.R.R., (ed.) Recursos genéticos e melhoramento de

101

plantas para o Nordeste brasileiro. (on line). Versão 1.0. Petrolina­PE: Embrapa

Semi­Árido /Brasília­DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, nov. 1999.

Disponível via Word Wide Web http://www.cpatsa.embrapa.br. SBN 85­7405­001­6.

DRUMOND, M.A.; PIEDADE­KILL, L.H.; LIMA, P.C.F.; OLIVEIRA, M.C.;

OLIVEIRA, V.R.; ALBUQUERQUE, S.G.; NASCIMENTO, C.E.S.; CAVALCANTI,

J. Estratégias para o uso sustentável da biodiversidade da caatinga. Avaliação e

identificação de ações pr ioritár ias para a conser vação, utilização sustentável e

repar tição de benefícios da biodiver sidade do bioma caatinga. In: Biodiversidade da

caatinga, http//www.biodiversitas.org/caatinga, Petrolina, 2000.

DUQUE, J.A. Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. Disponível: site Hor ticulture Depar tment at Purdue web. URL: http://www.hort.parde.edu/newcrop/duke _

energy/Gliricidia_ sepium palavra­chave: Gliricidia sepium. Consultado em 7 de outubro de 2006.

FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. (Orgs.). Germinação­Do básico ao aplicado.

Porto Alegre, Ed. Artmed, 2004.

FONSECA, S. C. L.; PEREZ, S. C. J. G. A. Ação do polietileno glicol na germinação

de sementes de Adenanthera pavonina L. e o uso de poliaminas na atenuação do estresse

hídrico sob diferentes temperaturas. Revista Brasileira de Sementes, 25(1):1­6, 2003.

FRANCO, A.A. Uso de Gliricidia sepium como moirão vivo. Rio de Janeiro:

EMBRAPA­UAPNPBS, 5p. (EMBRAPA­UAPNPBS. Comunicado Técnico, 3), 1988.

HARRINGTON, J. F. Seed storage and longevity. In: KOZLOWSKI, T. T. Seed

biology. New York: Academic, 3:145­245, 1972.

IPEF. Reflorestamento. http.www.ipef.com.br. Acesso em: 12 de janeiro de 2000.

LABOURIAU, L. G. A germinação da semente. Washington: OEA, 173 p, 1983.

LIMA, J.L.S. Plantas for rageiras das caatingas: usos e potencialidades. Petrolina:

Embrapa Semi­Arido/ PNE/ RBG­KEW , 44p, 1996.

102

MAIA, G.N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. 1° ed. São Paulo. Editora

D & Z, 2004.

MACHADO, C.F. Metodologia para a condução do teste de germinação e utilização

de raios­X para a avaliação da qualidadde de sementes de aroreira­branca (Lithrae molleoides (Vell.) Engl.). Dissertação (Mestrado em Fitotecnia)­Escola Superior de

Agriculuta Luiz de Queiroz, Piracicaba, SP. 51p. 2002.

MARCOS FILHO, J. Germinação de sementes. In: Marcos Filho, J. (Ed.). Atualização

em produção de sementes. Campinas: Fundação Cargill, p.11­39, 1986.

MARCOS FILHO, J. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba: Fealq,

495 p., 2005.

MATTHEWS, S. Physiology of seed ageing. Outlook on Agr iculture, 14(2): 19­23,

1985.

NATIONAL ACADEMY SCIENCES (Washington). Firewood crops: shrub and tree

species for energy production. Washington, 237p. 1980.

NODARI, R.O. et al. Conservação de frutos e sementes de palmiteiro (Euterpe edulis Matius) sob diferentes condições de armazenamento. Rev. Árvore, 22(1): 1­10, 1998.

OLIVEIRA, L. M. Avaliação da qualidade de sementes de Tabebuia serratifolia Vahl. Nich. E Tabebuia impetiginosa (Martius Ex A. P. De Candolle Standley)

envelhecidas natural e ar tificialmente. Tese (Doutorado em Agronomia. Fitotecnia)­

Universidade Federal de Lavras, Lavras­ MG. 160 p. 2004.

PARROTTA, A.J. Gliricidia sepium (Jacq.) Walp. Glir icidia, mother of cocoa

Leguminosae (Papilionoideae) Legume family. Rio Piedras : Institute of Tropical

Forestry, 7p. (SO­ITF­SM­50), 1992.

POPINIGIS, F. Fisiologia da semente. Brasília: AGIPLAN, 289 p. 1985.

ROBERTS, E. H. P redicting the storage life of seeds Seed Science & Technology,

London, 1(1):499­514, Jan. 1973.

103

ROCHA, G. R. Efeito da temperatura e do potencial hídrico na germinação de

sementes de doze cultivares de Feijão­ Mungo­ Verde [Vigna radiata (L.) Wilczek].

Jaboticabal­SP. Trabalho apresentado à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias­

UNESP­ para graduação em Agronomia, 1996.

SALES, J. de F. Atividade da celulase sobre o processo germinativo de sementes de

cafeeiro (Coffea arabica L.). Dissertação (Mestrado em Agronomia. Fisiologia

Vegetal)­Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. 38 p. 2002.

SAMPAIO, & RODAL, M.J. Fitofisionomias da caatinga. Avaliação e identificação de

ações pr ioritár ias para a conservação, utilização sustentável e repartição de

benefícios da biodiversidade do bioma caatinga. In: Biodiversidade da caatinga,

http//www.biodiversitas.org/caatinga ,Petrolina, 2000.

SAMPAIO, E.V.S.B. Overview of Brazilian caatinga. In: MOONEY, H.A.;

BULLOCK, S.H.; MEDINA, E. (eds.) Dry Tropical forests. Cambridge University

Press, Cambridge. p. 35­63, 1995.

SANTOS, S. R. G. dos. Efeito da temperatura na germinação de sementes de Sebastiana commersoniana (Baill.) Smith e Downs (Branquilho). Dissertação (Mestrado em Agronomia. Produção e Tecnologia de Sementes)­ Univerisade Estadual

Paulista, Jaboticabal, SP. 76 p. 1999.

SUMBERG, J.E. Note on flowering and seed production in a yong Gliricidia sepium

seed orchard. Tropical Agriculture, Trinidad, 62(1):17­24, 1985.

VARELA, V. P.; COSTA, S. de S.; RAMOS, M. B. P. Influência da temperatura e do

substrato na germinação de sementes de itaubarana (Acosmium nitens (Vog.) Yakovlev)

­ Leguminosae, Caesalpinoideae. Acta Amazônica, 35(1):35 – 39. 2005.

WARD, F.H.; POWELL, A.A. Evidence for repair processes in onion seeds during

storage at high seed moisture contents. J Exp. Bot. 34(140):277­282, 1983.

104

RESUMO GERAL

Efeito do armazenamento na qualidade fisiológica de sementes de Gliricidia sepium

(Jacq.) Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae). Com a crescente demanda por

informações sobre espécies nativas ou introduzidas, visando sua utilização para os mais

diversos fins, torna­se fundamental o conhecimento fisiológico da germinação, levando

em consideração que os estudos com sementes são efetivamente o ponto de partida para

a utilização e exploração, de forma racional, dessas espécies potenciais. Objetivou­se,

com esta pesquisa, avaliar a germinabilidade e longevidade de sementes de Gliricidia

sepium submetidas a diferentes períodos de armazenamento, visando o ajuste de

protocolos para conservação de sementes, da espécie, e sua utilização pelo pequeno

produtor da Caatinga. A manutenção da viabilidade das sementes durante o

armazenamento dependeu, diretamente, do teor de água encontrado nas unidades de

dispersão. Esta dependência esteve relacionada à intensidade das reações químicas e

metabólicas que caracterizam a atividade fisiológica das sementes, refletindo

diretamente no seu desempenho germinativo e na sua capacidade de tolerância ao déficit

hídrico imposto durante o armazenamento. As melhores condições de conservação das

sementes foram obtidas com o armazenamento em saco plástico, principalmente quando

acondicionadas em temperaturas baixas. No entanto, mesmo em temperaturas em torno

de 25°C é possível prolongar a viabilidade das sementes de gliricidia quando se controla

o teor de água inicial das mesmas através da utilização de embalagens impermeáveis

para o armazenamento.

105

ABSTRACT OF DISSERTATION

Effect of storage on the physiological quality of seeds of Gliricidia sepium (Jacq.)

Steud. (Leguminosae ­ Papilionoideae). With the growing demand for information on

native or introduced species, targeting their use for many different purposes, it is

essential the physiological knowledge of germination, taking into account that studies

with seeds are actually the starting point for the use and exploitation , in a rational way,

of these species potential. The objective is, with this search, evaluate the germination of

seeds and longevity of Gliricidia sepium subjected to different periods of storage,

seeking to adjust protocols for conservation of seeds, the species, and its use by small

producer of the caatinga. Maintaining the viability of the seed during storage depended,

directly, the level of water found in the dispersion units. This dependence was related to

the intensity of the chemical reactions that characterize the metabolic and physiological

activity of seed, reflecting directly into their performance germination and its ability to

tolerance to water deficit imposed during storage. The best conditions for the

conservation of seeds were obtained with the storage in plastic bag, mainly when they

were stored at low temperatures. However, even at temperatures near 25° C it was

possible to prolong seed viability when their water content was controlled through the

use of impermeable packing.