UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

LUZIANA ADELLE SANTOS PIRES FERREIRA MARQUES

EFEITO DA HISTIDINA NO AUMENTO DA REATIVIDADE

DO FLUORETO COM O ESMALTE DENTAL

Piracicaba

2019

LUZIANA ADELLE SANTOS PIRES FERREIRA MARQUES

EFEITO DA HISTIDINA NO AUMENTO DA REATIVIDADE

DO FLUORETO COM O ESMALTE DENTAL

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para obtenção do título

de Mestra em Odontologia, na Área de

Cariologia.

Orientadora: Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado Tabchoury

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação

defendida por Luziana Adelle Santos Pires Ferreira Marques,

e orientada pela Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado

Tabchoury.

Piracicaba

2019

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2017/02133-9; CAPES

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7703-8088

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Marilene Girello - CRB 8/6159

Marques, Luziana Adelle Santos Pires Ferreira, 1988-

M348e Efeito da histidina no aumento da reatividade do fluoreto com o esmalte

dental / Luziana Adelle Santos Pires Ferreira Marques. – Piracicaba, SP : [s.n.],

2019.

Orientador: Cinthia Pereira Machado Tabchoury.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade

de Odontologia de Piracicaba.

1. Fluoretos. 2. Cárie dentária. 3. Reatividade. 4. Histidina. I. Tabchoury,

Cinthia Pereira Machado, 1969-. II. Universidade Estadual de Campinas.

Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Effect of histidine on the increase of fluoride reactivity with dental

enamel

Palavras-chave em inglês:

Fluorides

Dental caries

Reactivity

Histidine

Área de concentração: Cariologia

Titulação: Mestra em Odontologia

Banca examinadora:

Cinthia Pereira Machado Tabchoury [Orientador]

Carolina Patrícia Aires

Cecilia Pedroso Turssi

Data de defesa: 07-02-2019

Programa de Pós-Graduação: Odontologia

Identificação e informações acadêmicas e profissionais da aluna

- ORCID: 0000-0002-7703-8088

- Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/4022310403781940

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Odontologia de Piracicaba

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em sessão pública

realizada em 07 de Fevereiro de 2019, considerou a candidata LUZIANA ADELLE SANTOS

PIRES FERREIRA MARQUES aprovada.

PROFª. DRª. CINTHIA PEREIRA MACHADO TABCHOURY

PROFª. DRª. CAROLINA PATRÍCIA AIRES

PROFª. DRª. CECILIA PEDROSO TURSSI

A Ata da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

DEDICATÓRIA

A Deus, pois até aqui a sua graciosa bondade e seu incondicional amor me ajudou,

agradeço-lhe por mais uma conquista em minha vida.

Aos meus pais, Aloísio e Ana, meus maiores exemplos de superação, por todo esforço

e dedicação, por tudo que me ensinaram e proporcionaram ao longo da vida, o que foi

fundamental para que eu pudesse chegar até aqui. Hoje, mesmo à distância, agradeço por se

fazerem presentes em minha vida, por todo amor, apoio e incentivo, pelos valores ensinados e

por sempre acreditarem em mim.

Ao meu querido marido, Ayslan, por todo amor, paciência e ajuda. Durante todo esse

período sempre tive seu apoio, você foi meu ponto de equilíbrio em momentos que tanto

precisei. Agradeço por entender a necessidade da minha ausência em alguns momentos, sempre

me dando força e suporte para que eu pudesse me dedicar à pós-graduação. Essa conquista é

nossa, pois não teria chegado até aqui sem seu apoio e incentivo. Agradeço por sempre estar ao

meu lado e acreditar que é possível.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado Tabchoury, por todo ensinamento,

paciência, gentileza e compreensão, por ter enxergado minhas dificuldades e ensinado que com

esforço e dedicação podemos enfrentar os obstáculos. Agradeço por cada reunião semanal, onde

pude aprender por meio de discussões de artigos científicos, conteúdos inerentes à pós-

graduação e onde também pude ouvir conselhos e ser ouvida. Professora, a senhora é um

exemplo de pessoa, profissional e mestre que levarei para vida, que honra o cargo que lhe é

imposto com humildade e capacidade apreciável. Agradeço de coração por todo aprendizado e

crescimento durante esse tempo.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do Magnífico Reitor, Prof. Dr.

Marcelo Knobel e a Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu diretor, Prof.

Dr. Francisco Haiter Neto.

À Profa. Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz, coordenadora Geral da Pós-Graduação,

da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas.

À Profa. Dra Michelle Franz Montan Braga Leite, coordenadora do Programa de

Pós-graduação em Odontologia, da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade

Estadual de Campinas.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES)

- Código de Financiamento 001, pela concessão de bolsa de Mestrado nos períodos de

abril/2017 a junho/2017.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela

concessão de bolsa de Mestrado nos períodos de julho/2017 a agosto/2018, processo nº

2017/02133-9, e pelo auxílio financeiro da reserva técnica, primordiais para o desenvolvimento

desta pesquisa.

Ao Prof. Dr. Jaime Aparecido Cury, por quem tenho grande admiração, agradeço

pelos ensinamentos, discussões científicas geradas em sala de aula, por toda contribuição na

minha formação ao longo desse período.

À Profa. Dra. Altair Antoninha Del Bel Cury, pelos ensinamentos, experiência

transmitida e por toda dedicação à área da Cariologia, sempre dando apoio e estimulando a

todos.

Ao Prof. Dr. Antônio Pedro Ricomini Filho, por todo ensinamento, ajuda,

disponibilidade e atenção.

À Profa. Dra. Livia Maria Andaló Tenuta, pelos ensinamentos e contribuição durante

minha formação na pós-graduação.

Aos Profs. Drs. Jaime Aparecido Cury, Vanessa Cavalli Gobbo e Antônio Pedro

Ricomini Filho pelas valorosas considerações feitas durante o exame de qualificação.

Aos técnicos do laboratório de Bioquímica Oral da FOP-UNICAMP, Waldomiro

Vieira Filho e José Alfredo da Silva, por toda atenção, ajuda e amizade.

A todos os funcionários da Coordenadoria Geral de Pós-Graduação, pela

disponibilidade, ajuda e por todo suporte durante esse tempo.

Aos alunos de Iniciação Científica, Mônica e Gabriel, e aos alunos bolsista trabalho

SAE, Sameh e Tainá, por toda ajuda laboratorial.

A todos os amigos da pós-graduação, pelas experiências, alegrias e tristezas

compartilhadas. Agradeço pelo carinho, apoio e atenção.

Ao meu amigo Anderson Fernandes, que mesmo à distância se fez presente, agradeço

por todas as palavras de apoio e incentivo.

Às amigas Aline Laignier Soares, Bárbara E. Costa Oliveira e Carolina Veloso

Lima, por toda ajuda e amizade durante esse tempo. Agradeço por todo incentivo e apoio, por

estarem ao meu lado durante todo esse percurso.

A todos que direta, ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e

tornar essa conquista possível.

RESUMO

Conforme observado em estudos prévios, a histidina aumenta a reatividade do fluoreto (F) com

o substrato dental, tendo em vista a maior formação de fluoreto fracamente ligado (“CaF2”) e

firmemente ligado (FA). Para entender melhor o mecanismo de ação da histidina no aumento

da reatividade do F, foi objetivo da presente pesquisa avaliar se tal efeito seria influenciado

pelo volume de solução de tratamento e pela concentração de histidina. Foram realizados 2

estudos experimentais, in vitro, independentes, cegos quanto ao analista, com blocos de esmalte

dental bovino com lesão de cárie. Os blocos dentais (4x4x2 mm), pré-selecionados pela

microdureza de superfície, foram imersos em solução desmineralizante para indução de lesão

de cárie artificial e, em seguida, selecionados pela perda de dureza de superfície, aleatorizados

e distribuídos para os respectivos estudos e grupos de tratamento. No experimento I, os blocos

dentais foram tratados com soluções fluoretadas (F 0,1 M) contendo ou não histidina (0,1 M) e

foram avaliadas as seguintes proporções de volume da solução de tratamento por área de

esmalte dental exposto (n=12): 0,5 mL/mm2; 1 mL/mm2 e 2 mL/mm2. No experimento II, os

blocos dentais foram tratados com soluções (2 mL/mm2) contendo uma concentração fixa de

fluoreto e variável de histidina (n=12): água purificada (controle negativo); solução contendo

F 0,1 M (controle ativo); F 0,1 M e histidina 0,025 M; F 0,1 M e histidina 0,05 M e F 0,1 M e

histidina 0,1 M. Todas as soluções dos 2 experimentos, exceto água purificada, tiveram o pH

ajustado para 5,0. Os blocos de esmalte reagiram individualmente com as respectivas soluções

de tratamento por 10 min sob agitação (100 rpm) a temperatura ambiente. Em seguida, o pH

das soluções foi novamente determinado e as concentrações (µg F/cm2) de “CaF2” e FA nos

blocos dentais foram analisadas, utilizando um eletrodo íon específico. Os resultados foram

submetidos à análise de variância e teste de Tukey. O nível de significância foi fixado em 5%.

No experimento I, as soluções fluoretadas contendo histidina apresentaram menor variação de

pH após reação com os blocos dentais e maior concentração de “CaF2” e FA no esmalte cariado

quando comparado com soluções fluoretadas sem histidina (p<0,001), independente da

proporção de volume de solução por área de esmalte exposto (p>0,05). No experimento II, as

soluções fluoretadas com histidina também apresentaram menor variação de pH após reação

com blocos dentais e maior concentração de “CaF2” e FA no esmalte cariado quando comparado

com soluções fluoretadas sem adição da molécula de histidina (p<0,001). Dentre as diferentes

concentrações de histidina testadas, os blocos dentais do grupo F 0,1 M + histidina 0,1 M

apresentaram as maiores concentrações de “CaF2” e FA, diferindo significativamente dos

demais grupos (p<0,05), não sendo observada nenhuma diferença entre as duas soluções

fluoretadas com menores concentração de histidina (p>0,05). Análise de regressão também foi

realizada entre a concentração de histidina nas soluções fluoretadas e as concentrações de

“CaF2” e FA formados no esmalte com lesão de cárie, tendo sido verificado efeito dose-resposta

para as variáveis resposta (R2 = 0,5956; P <0,01 e R2 = 0,7511; P <0,01, respectivamente).

Diante dos resultados obtidos, conclui-se que o volume de solução de tratamento não

influenciou o aumento da reatividade do fluoreto pela histidina. Porém, a maior concentração

de histidina na solução de tratamento levou a maior reatividade do F com o esmalte com lesão

de cárie.

Palavras-chave: fluoreto, cárie dental, reatividade, histidina.

ABSTRACT

As observed in previous studies, histidine increases the reactivity of fluoride (F) with the dental

substrate, in view to higher formation of loosely ("CaF2") and firmly bound fluoride (FA). In

order to better understand the mechanism of action of histidine on the increase of F reactivity,

it was the objective of the present research to evaluate whether this effect would be influenced

by the volume of treatment solution and by the concentration of histidine. Two experimental,

in vitro, independent, analyst-blind experiments, using bovine dental enamel blocks with caries

lesion were conducted. The dental blocks (4x4x2 mm), pre-selected by surface microhardness,

were immersed in demineralizing solution for induction of artificial caries lesion and then

selected by surface hardness loss, randomized and distributed in the respective experiments and

treatment groups. In experiment I, the dental blocks were treated with fluoridated solutions (0.1

M F) containing or not histidine (0.1M) and the following proportions of volume of treatment

solution per exposed dental enamel area were assessed (n=12): 0.5 mL/mm2; 1 mL/mm2 and 2

mL/mm2. In experiment II, the dental blocks were treated with solutions (2 mL/mm2) containing

a fixed fluoride concentration and variable histidine (n=12): purified water (negative control);

solution containing 0.1 M F (active control); 0.1 M F and 0.025 M histidine; 0.1 M F and 0.05

M histidine and 0.1 M F and 0.1 M histidine. All solutions of the two experiments, except

purified water, had the pH adjusted to 5.0. The enamel blocks reacted individually with the

respective treatment solutions for 10 min under agitation (100 rpm) at room temperature. Then,

the pH of the solutions was determined again and the concentrations (μg F/cm2) of "CaF2" and

FA in the dental blocks were analyzed, using a specific ion electrode. The results were

submitted to analysis of variance and Tukey test. The level of significance was set at 5%. In

experiment I, the fluoridated solutions containing histidine presented lower pH variation after

reaction with the dental blocks and higher concentration of "CaF2" and FA in the carious enamel

when compared to fluoridated solutions without histidine (p <0.001), regardless of the

proportion of solution per exposed enamel area (p>0.05). In experiment II, the fluoridated

solutions with histidine also presented lower pH variation after reaction with dental blocks and

higher concentration of "CaF2" and FA in the carious enamel when compared to fluoridated

solutions without addition of histidine molecule (p<0.001). Among the different concentrations

of histidine tested, the dental blocks of group 0.1 M F + 0.1 M histidine presented the highest

concentrations of "CaF2" and FA, significantly differing from the other groups (p<0.05), with

no difference observed between the 2 fluoridated solutions with lower histidine concentrations

(p>0.05). Regression analysis was also performed between the concentration of histidine in

fluoride solutions and the concentrations of "CaF2" and FA formed in enamel with caries lesion,

and a dose-response effect was observed for the response variables (R2=0.5956; P<0.01;

R2=0.7511, P<0.01, respectively). Considering the results obtained, it was concluded that the

volume of the treatment solution did not influence the increase of fluoride reactivity by

histidine. However, the highest concentration of histidine in the treatment solution led to greater

reactivity of fluoride with enamel with caries lesion.

Key Words: fluoride, dental caries, reactivity, histidine.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

2 REVISÃO DA LITERATURA 16

3 PROPOSIÇÃO 25

4 MATERIAL E MÉTODOS 26

5 RESULTADOS 33

6 DISCUSSÃO 40

7 CONCLUSÃO 44

REFERÊNCIAS 45

ANEXO 1 – PRIMEIRA PÁGINA DO RELATÓRIO DO PROGRAMA ANTIPLÁGIO

TURNITIN PARA VERIFICAÇÃO DE ORIGINALIDADE 52

14

1 INTRODUÇÃO

O declínio da cárie dentária foi observado em diversos países a partir da década de

1970 (Bratthall et al., 1996; Lagerweij e van Loveren, 2015), sendo esta redução atribuída

principalmente ao uso difundido do fluoreto por diferentes meios, cujo efeito principal é local

(Fejerskov et al., 1981; Cury e Tenuta, 2008). Um dos mecanismos de ação do fluoreto no

controle da cárie a partir de dentifrícios, enxaguatórios e produtos de aplicação profissional é a

reatividade química com a superfície do esmalte e da dentina (ten Cate, 1997; Tenuta e Cury,

2013). Devido a esta reatividade, dois produtos fluoretados podem ser formados: um

firmemente ligado, como fluorapatita (FA), e outro fracamente ligado, denominado “tipo”

fluoreto de cálcio (“CaF2”) (Arends et al., 1983).

Dentre os produtos formados, considera-se que o fluoreto fracamente ligado

apresenta melhores propriedades no controle da cárie (ten Cate, 1997). O “CaF2” funciona como

reservatório de fluoreto de liberação lenta (Øgaard, 1990), reduzindo a desmineralização e

ativando a remineralização (Rølla e Saxegaard, 1990). Além disso, o fluoreto liberado deste

depósito durante quedas de pH pode adsorver-se aos cristalitos do esmalte e inibir a dissolução

dos mesmos (Arends e Christoffersen, 1990).

Estudos prévios (Tabchoury et al., 2005; Arthur et al., 2007a) mostraram que a

reatividade do fluoreto com o esmalte dental com lesão de cárie aumentou na presença do

conservante metilparabeno. Como o metilparabeno apresenta ação tamponante, tal efeito foi

melhor estudado por Vieira Júnior (2010), utilizando o aminoácido histidina, que pode atuar

como tampão na faixa de pH 5,0 a 7,0 em razão do seu grupamento R, cujo pKa é 6,05.

Verificou-se que a histidina também aumentou a reatividade do fluoreto com o esmalte dental

com lesão de cárie, diante da maior formação de “CaF2” e FA, sendo este efeito mais

significativo em pH 5,0. Nesta faixa de pH (5,0), a hidroxiapatita ([Ca10(PO4)6(OH)2]), principal

constituinte do esmalte, sofre dissolução e os íons fosfato (PO4-3) e hidroxila (OH-) liberados

combinam-se com prótons (H+) do meio, resultando assim em aumento do pH do meio durante

a reação química e, por conseguinte, na diminuição da reatividade do fluoreto (Arthur et al.,

2007a), que é dependente do pH. Logo, a ação de um tampão, diminuindo as variações do pH

da solução durante a reação com o esmalte dental, poderia aumentar a reatividade do fluoreto

(Vieira Júnior, 2010).

O efeito da histidina no aumento da reatividade do fluoreto foi também verificado

em dentina radicular com lesão de cárie (Dantas, 2016), aumentando tanto a formação de

“CaF2” quanto de FA. No entanto, avaliando-se o pH da solução de tratamento antes e após a

15

reação com a dentina, o tamponamento não pareceu ser o fator responsável pela maior

reatividade do fluoreto, pois as soluções sem histidina não apresentaram significativas

variações de pH após a reação com a dentina no modelo estudado. Assim, o tamponamento

poderia não estar relacionado ou explicar a maior reatividade do fluoreto com o substrato dental

com lesão de cárie, podendo este efeito ser atribuído à própria molécula de histidina.

Entre pH 5,0 e 6,5, valores das soluções fluoretadas de tratamento usadas nos

estudos de Vieira Júnior (2010) e Dantas (2016), o grupamento R da histidina, que apresenta

pKa de 6,05, pode atuar como tampão, na faixa de uma unidade de pH acima e abaixo deste

valor. Como o volume utilizado de solução de tratamento para reação com os blocos dentais

nestes estudos foi relativamente grande, isto é, 32 mL por bloco dental (2 mL/mm2 de área

exposta), testar volumes menores com a mesma área exposta de esmalte dental poderia ajudar

a entender se o tamponamento de fato tem um papel nesta maior reatividade do fluoreto na

presença de histidina. Assim, uma mesma quantidade de íons fosfato (PO4-3) e hidroxila (OH-)

serão dissolvidos do bloco dental, mas estarão em diferentes volumes de solução de tratamento.

Dessa forma, a hipótese é que um maior volume de solução de tratamento não seria

afetado de forma significativa pelos íons fosfato e hidroxila dissolvidos do bloco dental, não

apresentando alteração do pH da solução. Enquanto que um menor volume de solução de

tratamento poderia ter seu pH aumentado pela ligação dos íons fosfato e hidroxila com prótons

da solução, sendo que nesta situação o efeito tamponante da histidina seria mais pronunciado.

Outro fator importante a ser testado é a concentração de histidina nas soluções fluoretadas, pois

a força de um tampão é proporcional à sua concentração e o aumento da concentração de

histidina favoreceria a maior reatividade do fluoreto com o esmalte dental, podendo este efeito

ser resultado da manutenção do pH da solução, ou ainda ser proveniente de alguma outra ação

da própria molécula de histidina.

Diante do exposto, os objetivos foram avaliar se o efeito da histidina no aumento

da reatividade do fluoreto seria influenciado pelo volume de solução de tratamento e se o efeito

dose-resposta da histidina no aumento da reatividade do fluoreto é influenciado pela sua

concentração.

16

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Uso do fluoreto no controle da cárie dentária

Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) sugerem que, em muitos locais

do mundo, a prevalência da cárie diminuiu (Kassebaum et al., 2017). O declínio da cárie é

relatado principalmente nos países desenvolvidos, sendo menos explícito nos países em

desenvolvimento (Bratthall, 1996; Lagerweij e Loveren, 2015). No Brasil, o início do século

XXI é marcado pela redução da prevalência e da severidade da cárie em crianças e adolescentes

(Brasil, 2009), cujo avanço é atribuído principalmente ao uso difundido de fluoretos (Cury,

2001; Cury e Tenuta, 2008), maior acesso aos serviços de saúde bucal e melhores condições

socioeconômicas (Narvai, et al., 2006).

Apesar da significante redução da prevalência e severidade nas últimas décadas, a

doença cárie e suas consequências ainda apresentam problemas a nível mundial (Featherstone,

1999; Lagerweij e Loveren, 2015). Desse modo, medidas de saúde pública devem ser

direcionadas à educação do paciente em relação à dieta e higiene bucal (Pauleto et al., 2004),

bem como meios adicionais de uso de fluoreto devem ser indicados para pacientes que

apresentam maiores riscos de desenvolver a doença (Øgaard, 2008).

O uso do fluoreto é considerado a medida de maior impacto na redução da cárie

dental (Cury, 2001). Várias medidas foram preconizadas ao longo dos anos com o objetivo de

expandir o uso do fluoreto e, dentre estas, as principais foram a fluoretação das águas de

abastecimento e a adição de fluoreto aos dentifrícios (Cury e Tenuta, 2008; ten Cate, 2013),

cujo uso alcança grande parte da população.

Sabe-se que o efeito predominante do fluoreto é tópico (Featherstone, 1999). Para

exercer seu efeito na desmineralização, o fluoreto deve estar presente na saliva e fluido do

biofilme no momento da exposição a açúcares fermentáveis. Quando o pH do biofilme atinge

níveis abaixo de 5,5, a fase aquosa torna-se subsaturada em relação à hidroxiapatita (HA) do

esmalte, o que ocasiona a dissolução mineral. Se o fluoreto estiver presente e o pH não atingir

valores abaixo de 4,5, ele será capaz de reduzir a desmineralização, uma vez que ocorre a

precipitação de minerais na forma de fluorapatita (FA), ao mesmo tempo em que a estrutura

dental está sendo solubilizada pelo baixo pH gerado no biofilme dental exposto a carboidratos

fermentáveis (Featherstone, 1999; Cury e Tenuta, 2008).

Quando a exposição do biofilme a açúcares fermentáveis é interrompida, o pH

retorna aos valores fisiológicos e a fase aquosa torna-se supersaturada em relação à HA. Nessas

condições, ocorre a remineralização de cristais parcialmente desmineralizados (ten Cate, 1990),

17

que acontece na presença da saliva e é ativada pelo fluoreto, visto que este íon proporciona um

aumento na precipitação de cálcio e fosfato presentes nos fluidos bucais no esmalte

desmineralizado (Cury e Tenuta, 2009).

Sabendo que qualquer meio de utilização do fluoreto para ser considerado efetivo

deve ser capaz de manter sua concentração no meio bucal, variadas formas de utilização vêm

sendo aprimoradas, e seu uso tem aumentado nas últimas décadas, onde os dentifrícios

fluoretados, soluções para bochecho, géis e vernizes são considerados os métodos mais

utilizados (Marinho, 2009; ten Cate, 2013; Rugg-Gunn e Bánóczy, 2013; Twetman e Keller,

2016).

O dentifrício fluoretado é considerado o principal responsável pelo declínio da cárie

observado nas últimas décadas ao redor do mundo (Rølla et al., 1991). Seu uso frequente tem

demonstrado eficácia no controle da cárie (Marinho et al., 2003). Por associar a

desorganização/remoção do biofilme dental pela escovação e a disponibilização de F para a

cavidade bucal, o dentifrício fluoretado é considerado o meio mais racional de uso de fluoreto

(Cury e Tenuta, 2008). Dessa forma, ao mesmo tempo que ocorre a remoção mecânica do

biofilme por meio da escovação dentária, o íon F estará presente regularmente na cavidade

bucal, interferindo nos processos de des e remineralização na interface dente/placa (Tenuta et

al., 2009).

No Brasil, a maioria dos dentifrícios são disponibilizados na forma de dois

compostos fluoretados: fluoreto de sódio (NaF) ou monofluorfosfato de sódio (MFP, Na2PO3F)

(Ricomini Filho et al., 2012). Nos dentifrícios com NaF, o fluoreto está presente na forma

iônica; já no MFP, o fluoreto está ligado covalentemente ao fosfato, sendo hidrolisado por

fosfatases que estão presentes na cavidade bucal para a liberação do F iônico (Pearce e Dibdin,

1995). Independente da escolha do composto apresentado, o dentifrício deve ser utilizado

frequentemente e conter pelo menos 1.000 ppm F na forma solúvel para garantir eficácia

anticárie (Walsh et al., 2010). Embora exista consenso na literatura em relação à utilização dos

cremes dentais na concentração mínima de 1.000 ppm F e máxima de 1.500 ppm F, dependendo

do risco individual de cada paciente, maior concentração de fluoreto (5.000 ppm) pode ser

necessária para compensar maiores desafios cariogênicos (Nordström e Birkhed, 2010;

Noronha et al., 2016).

Ainda em relação aos meios de utilização de fluoreto, o uso de enxaguatórios bucais

fluoretados no controle da cárie dental é suportado por evidências científicas (Marinho et al.,

2004; Marinho et al., 2016). Para garantir seu efeito, essas soluções precisam ser usadas

regularmente, sendo recomendadas principalmente nas concentrações de 0,05% NaF (225 ppm

18

F) ou 0,2% NaF (900 ppm F), para uso diário e semanal, respectivamente (Marinho et al., 2004;

Rugg-Gunn e Bánóczy, 2013; Marinho et al., 2016; Twetman e Keller, 2016).

Alguns componentes presentes nos enxaguatórios bucais, como clorexidina, óleos

essenciais, triclosan e cloreto de cetilpiridínio, são eficazes na redução da placa e como agentes

antimicrobianos, porém, soluções contendo fluoreto possuem maior corpo de evidências

científicas que suportam seu efeito anticárie (FDI Commission, 2002; Duckworth et al., 2009;

Pitts et al., 2012). Um estudo realizado com adolescentes que apresentavam baixo e moderado

risco de cárie mostrou que o uso supervisionado de enxaguatórios fluoretados, como

complemento da escovação com dentifrícios fluoretados, resultou em menor incidência de cárie

em superfícies proximais (Mobebrg Sköld et al., 2005). Adicionalmente, Marinho et al. (2016)

verificaram que o uso regular supervisionado dessas soluções fluoretadas está associado a uma

redução de cerca de 27% da experiência de cárie em crianças e adolescentes.

Considerando a eficácia e relação custo-benefício, recomenda-se que os

enxaguatórios bucais sejam indicados para indivíduos que apresentem alto risco de cárie (Pitts

et al., 2012), como por exemplo pacientes idosos, que tenham fluxo salivar diminuído em

virtude da utilização de medicamentos, ou que apresentem perda da destreza manual (ten Cate,

2013).

Dentre os meios profissionais de uso de fluoreto, o gel, a espuma e o verniz são os

principais veículos aplicados topicamente e têm como objetivo aumentar a quantidade do íon F

na cavidade bucal e formar um reservatório de fluoreto na superfície do dente. Apresentam altas

concentrações de fluoreto (9.000 a 22.600 ppm F) e são indicados como meio complementar à

escovação com dentifrícios fluoretados para os pacientes que apresentam alto risco e atividade

de cárie. No entanto, o benefício dessa combinação é considerado modesto (Marinho et al.,

2004).

O conhecimento sobre os benefícios envolvidos nos meios de uso individual e

profissional do fluoreto é importante, pois fornece maior segurança aos profissionais de saúde

bucal quanto à sua indicação, frequência de utilização e concentração, proporcionando assim,

maior efetividade aos indivíduos que se apresentam sob elevado risco da doença cárie.

19

2.2 Reatividade do fluoreto com o substrato dental

Existe consenso na literatura de que o importante no controle da cárie dental é

manter o íon F disponível constantemente na cavidade bucal (Margolis e Moreno, 1990;

Ekstrand e Oliveby, 1999). Dependendo da concentração de fluoreto utilizada, haverá formação

de reservatórios de F na superfície do dente, os quais serão liberados lentamente para interferir

nos processos de des e remineralização (Saxegaard e Rølla, 1988).

Quando o fluoreto em altas concentrações (>100 ppm F) entra em contato com o

substrato dental, seja esmalte ou dentina, ocorre a formação de produtos de reação,

denominados fluoreto fracamente ligado (tipo “CaF2”) e fluoreto firmemente ligado (FA)

(Arends et al., 1983).

Como observado na figura 1, o fluoreto em alta concentração reage com o cálcio e

forma um produto do “tipo” fluoreto de cálcio. O “CaF2” pode atuar como um potencial

reservatório de fluoreto de liberação lenta (Øgaard et al., 1990), aumentando a remineralização

e retardando os processos de desmineralização (White e Nancollas, 1990). Esse efeito tem sido

confirmado, uma vez que, o fluoreto na solução, ao invés do F incorporado aos cristalitos do

esmalte, tem maior impacto frente aos desafios cariogênicos (Arends et al., 1983; Wong et al.,

1987).

Sugere-se que a lenta solubilização do “CaF2” na saliva ocorre em virtude da

adsorção de íons fosfato e moléculas de proteínas sobre a superfície desse fluoreto fracamente

ligado (Rölla e Øgaard, 1986; Christoffersen et al., 1988; Øgaard, 1990; Rölla e Saxegaard,

1990). Embora esse revestimento contribua para uma certa estabilidade do “CaF2”, quando o

pH do biofilme diminui, o “CaF2” é solubilizado, liberando dessa forma o fluoreto, que reduzirá

a desmineralização e ativará a remineralização (Øgaard, 2001).

Tem sido demonstrado que mais de 90% do produto formado a partir da reação do

F com o substrato dental é considerado do tipo “CaF2”, sendo este o responsável pelo efeito do

Sólido

Figura 1 - Relação de equilíbrio entre a hidroxiapatita e os íons dissolvidos na solução e a sua

reatividade na presença de fluoreto.

Interface líquido/sólido

Sólido

Sólido

20

fluoreto no controle da cárie (ten Cate, 1997). Dessa forma, é importante que o método de

determinação do fluoreto diferencie claramente esses produtos, pois é a incorporação de F como

fracamente ligado ao elemento dentário que está relacionada à eficácia anticárie das

formulações comerciais (Raven et al., 1991; Tenuta e Cury, 2013).

Por não ser estável no meio bucal, o “CaF2” é chamado de fracamente ligado, sendo

dissolvido pela saliva. Segundo Lagerlöf et al. (1988), os glóbulos são chamados do tipo

“CaF2”, porque a maioria do material é altamente contaminado por fosfato e talvez por outros

componentes, e não formando cristais de fluoreto de cálcio puros. Øgaard (2001) relata a

formação do fluoreto de cálcio e as melhores condições para sua formação no esmalte tratado

com solução de fluoreto de sódio. Apesar do “CaF2” ser formado principalmente sobre a

superfície do esmalte, observou-se através de microscopia confocal de varredura a laser do

esmalte tratado com fluoreto que, em cerca de 40 µm de profundidade, houve a presença de

precipitado de fluoreto de cálcio como um material granular. Verificou-se também que a maior

formação do “CaF2” pode ser resultado do aumento da concentração de fluoreto, maior tempo

de exposição e o menor pH da solução fluoretada.

O outro produto formado após a reação química do F com o substrato dental,

esmalte ou dentina, é o fluoreto firmemente ligado ou fluorapatita (FA) (Arends et al., 1983).

O fluoreto firmemente ligado está incorporado à estrutura mineral dos dentes, sendo conhecido

como F "permanentemente ligado", por não ser dissolvido em condições suaves, ou seja, é

insolúvel no meio bucal sob condição não cariogênica (Takagi et al., 2000).

No passado, acreditava-se que esse produto seria importante para deixar o dente

menos solúvel. Sendo assim, programas voltados para prevenção da cárie dental com o uso do

fluoreto tinham como objetivo incorporar esse mineral ao esmalte (Fejerskov et al., 1981).

Porém, foi verificado que, apesar da presença de alto conteúdo de fluoreto incorporado ao

esmalte hígido, a lesão de cárie se desenvolvia como resultado da dissolução dos tecidos duros

dentais pelos ácidos produzidos por bactérias presentes no biofilme (Arends e Cristorffersen,

1990).

Estudo realizado por Ogaard et al. (1988), utilizando dente de tubarão que consiste

de fluorapatita quase pura (30.000 ppm de F), também demonstrou que, apesar da grande

quantidade de fluoreto incorporado ao esmalte, este possui resistência limitada à cárie. Dessa

forma, o importante para reduzir a solubilidade do esmalte é a atividade do F na solução, não o

alto conteúdo de fluoreto incorporado ao esmalte (Fejerskov et al., 1981; Arends e

Christoffersen, 1986).

21

2.3 Papel da histidina na reatividade do fluoreto com o substrato dental

A reatividade do fluoreto com os tecidos dentários tem sido estudada e alguns

fatores podem influenciá-la, tais como: condição do substrato dental (hígido ou cariado),

composição das soluções fluoretadas e concentração de fluoreto (White, 1987; Saxegaard e

Rølla, 1988; Tanaka et al., 1992; White, 1995).

Uma importante questão a ser considerada é a condição do substrato dental

utilizado, uma vez que, quando comparado à superfície hígida, no esmalte dental

desmineralizado ocorre maior formação dos produtos de reação, especialmente se as lesões de

cárie artificiais forem formadas in vitro (Tenuta e Cury, 2013). Isso ocorre em virtude da maior

porosidade da superfície do esmalte cariado, aumentando a área de reação (White, 1995). Dessa

forma, dependendo da proposta do estudo a ser realizado, deve-se levar em consideração a

condição do substrato dental, seja esmalte ou dentina.

Também é conhecido que outras substâncias podem interferir de forma negativa na

reatividade do fluoreto com o substrato dental. A deposição do fluoreto no esmalte hígido

(Barkvoll et al., 1988) e cariado (Barkvoll, 1991) foi estudada in vitro a partir de aplicação

tópica com fluoreto de sódio (NaF) em combinação com lauril sulfato de sódio (LSS). Os

resultados em ambos os estudos mostraram que o LSS provocou uma significativa redução na

quantidade de fluoreto solúvel em álcali depositado no esmalte hígido ou cariado. Barkvoll

(1991) também examinou a incorporação de MFP no esmalte com lesão de cárie a partir de

soluções aquosas de MFP ou MFP associado ao lauril sulfato de sódio e foi verificado que esta

combinação levou a menor reatividade do MFP com o substrato dental. Zanatta et al. (2018)

avaliaram o efeito do lauril sulfato de sódio associado a soluções de fluoreto de sódio (NaF) na

prevenção da erosão do esmalte. Os autores observaram por meio de análise de microdureza e

quantificação de fluoreto solúvel em álcali que, na erosão inicial, a presença do LSS reduziu a

proteção e adsorção de fluoreto na superfície do esmalte. Uma possível explicação para o efeito

do lauril sulfato de sódio observado nestes estudos citados acima é que esse surfactante poderia

competir com o fluoreto pelos sítios de ligação ao cálcio e, assim, a interação do fluoreto com

a hidroxiapatita seria reduzida (Zanatta et al., 2018).

A fim de avaliar a qualidade dos enxaguatórios bucais contendo NaF 0,05%

adquiridos em farmácias de manipulação, Tabchoury et al. (2005) verificaram que a maioria

dos produtos apresentou fluoreto disponível para ser incorporado no esmalte com lesão de cárie.

Porém, em relação ao controle positivo (solução de NaF 0,05% preparada no laboratório sem

qualquer outro reagente), três enxaguatórios apresentaram reatividade significativamente maior

22

com o esmalte dental. Pela análise do rótulo e da absorbância das soluções, estes três produtos

continham o conservante metilparabeno em suas composições, o que poderia explicar a maior

reatividade.

Assim, um estudo subsequente (Arthur et al., 2007a) avaliou diretamente o efeito

do metilparabeno na reatividade do fluoreto com o esmalte dental hígido ou com lesões de cárie

artificial. Os blocos de esmalte dental foram tratados com soluções de NaF 0,05% contendo ou

não metilparabeno 0,2%, propilparabeno 0,02% ou benzoato 0,35%. O pH inicial das soluções

de tratamento variou de 5,60 a 6,18, aumentando após a reação com os blocos dentais. Os

resultados mostraram que nos blocos de esmalte com lesão de cárie, tratados com solução

contendo metilparabeno, cujo pH apresentou menor variação após a reação, houve maior

reatividade com o fluoreto. Porém, no esmalte hígido, a reatividade não foi afetada pelos

conservantes testados.

Subsequentemente, a reatividade do fluoreto com esmalte cariado foi avaliada na

presença ou ausência de histidina em diferentes valores de pHs (Vieira Junior, 2010). Blocos

de esmalte bovino com lesão cariosa foram submetidos aos seguintes tratamentos: soluções de

NaF 0,05% pH 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5 tamponadas com histidina 0,1 M ou com pH apenas ajustado.

Verificou-se que os tratamentos dos blocos de esmalte com as soluções contendo histidina

formaram concentrações de “CaF2” e FA maiores que os grupos sem esta substância, sugerindo

que o tamponamento da solução fluoretada pela histidina proporcionaria uma maior reatividade

do fluoreto com o esmalte cariado. No que se refere ao pH das soluções de tratamento, maior

concentração de “CaF2” foi formada na presença do tampão e no menor pH (5,0). Por outro

lado, observou-se que, nesse valor de pH, o pH das soluções se eleva após o teste de reatividade

e isso pode ocorrer em virtude da dissolução da hidroxiapatita (HA), com liberação de íons

fosfato (PO4-3) e hidroxila (OH-) que podem combinar-se com os prótons (H+) do meio,

elevando o pH e diminuindo a reatividade do fluoreto (Arthur et al., 2007a).

Posteriormente, o efeito da histidina na reatividade do fluoreto foi avaliado em

dentina com lesão de cárie induzida artificialmente (Dantas, 2016). Nesse estudo, dois

experimentos in vitro foram realizados. O primeiro avaliou o efeito da histidina em soluções

fluoretadas contendo 226 µg F/mL, com diferentes valores de pH (5,0; 5,5; 6,0 e 6,5), na

reatividade do fluoreto com a dentina com lesão de cárie. O segundo avaliou o efeito da histidina

na reatividade do fluoreto em diferentes concentrações (113, 226, 452 e 904 µg F/mL) com a

dentina com lesão de cárie. Verificou-se que a presença de histidina nas soluções favoreceu o

aumento da reatividade do fluoreto com dentina cariada, independente do pH, e o efeito dose-

23

resposta em relação à concentração de fluoreto e sua reatividade com a dentina cariada manteve-

se mesmo diante da presença da histidina nas soluções fluoretadas.

A histidina, semelhante a todos os aminoácidos, possui um grupo carboxila e um

grupo amina, todavia, o que diferencia esse aminoácido dos demais é a sua cadeia lateral, ou

grupamento R, cujo pKa é 6,05. Sabe-se que quando o pH do meio é igual ao pKa do tampão

tem-se a melhor condição de tamponamento, com metade das moléculas na forma de ácido

fraco (capaz de doar um próton) e metade de moléculas na forma de base conjugada (capaz de

receber um próton). Uma unidade de pH abaixo e acima do pKa, ainda se está numa faixa

adequada de tamponamento, o que é importante para a manutenção do pH do meio (Figura 2).

Ao observar os resultados dos estudos citados acima, talvez o pH não seja o único fator

responsável pela maior reatividade do fluoreto com o substrato dental, conferindo uma ação à

própria molécula de histidina. Nesse sentido, é importante ressaltar que Ramos Silva et al.

(2004) observaram, através de difração de raio X, uma ligação entre o fluoreto e a histidina. Os

autores descreveram que o fluoreto pode se ligar fortemente à histidina a um átomo de oxigênio

carboxílico por meio de uma ponte de hidrogênio.

Também é conhecido que algumas proteínas salivares secretadas pelas glândulas

parótidas e submandibulares apresentam alta afinidade pela hidroxiapatita e superfície do

esmalte dental, podendo se adsorver seletivamente a este mineral, sendo as principais

precursoras na formação da película adquirida do esmalte (Hay, 1973; Jensen et al., 1992;

Lamkin e Oppenheim, 1993; Schüpbach et al., 2001). Dentre estas proteínas, uma das principais

é a histatina, rica em histidina (Oppenheim et al., 1988), que além do seu papel na formação da

película, apresenta a capacidade de inibir o crescimento dos cristais de hidroxiapatita em

Grupamento lateral da histidina. Cadeia lateral aromática de nitrogênio heterocíclico, que consiste

em um carbono e um núcleo imidazole, destacada em azul, na faixa de uma unidade de pH abaixo

e acima do pKa 6,05.

Figura 2 - Estrutura química da histidina.

24

soluções supersaturadas de fosfato de cálcio, auxiliando na manutenção da integridade dos

dentes (Oppenheim et al., 1986).

Assim, em razão do conhecimento limitado sobre o mecanismo de ação da histidina,

justifica-se a realização do presente trabalho, considerando que o efeito da histidina no aumento

da reatividade do fluoreto poderia ser influenciado por diferentes proporções de volume de

solução de tratamento pela área do esmalte dental e pela sua concentração.

25

3 PROPOSIÇÃO

Com o propósito de elucidar o mecanismo de ação pelo qual a histidina aumenta a

reatividade do fluoreto com lesões de cárie em esmalte, o presente estudo teve os seguintes

objetivos específicos:

1. Avaliar se o efeito da histidina no aumento da reatividade do fluoreto seria influenciado pelo

volume de solução de tratamento;

2. Avaliar o efeito da concentração de histidina no aumento da reatividade do fluoreto.

26

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Delineamento Experimental

Dois estudos experimentais, in vitro, independentes, cegos quanto ao analista,

foram conduzidos, utilizando blocos de esmalte dental bovino com lesão de cárie (Figura 3).

No experimento I, os fatores em estudo foram histidina (presente e ausente) e o volume da

solução (0,5 mL/mm2; 1 mL/mm2 e 2 mL/mm2). Os blocos dentais alocados em 6 grupos de

tratamento foram tratados com soluções fluoretadas (0,1 M F) contendo ou não histidina (0,1

M), sendo avaliadas as seguintes proporções de volume da solução de tratamento por área de

esmalte dental exposto (n=12/grupo): 0,5 mL/mm2; 1 mL/mm2 e 2 mL/mm2. No experimento

II, o fator em estudo foi a concentração de histidina (0,025 M; 0,05 M e 0,1 M). Os blocos

dentais foram tratados com as seguintes soluções de tratamento (n=12/grupo): água purificada

(controle negativo); F 0,1 M (controle ativo); F 0,1 M e histidina 0,025 M; F 0,1 M e histidina

0,05 M; F 0,1 M e histidina 0,1 M, na proporção de 2 mL/mm2 de área de esmalte dental

exposto. Todas as soluções dos 2 experimentos, exceto água purificada, tiveram o pH ajustado

para 5,0. As variáveis de resposta em ambos experimentos foram concentração de fluoreto

fracamente ligado (“CaF2”), concentração de fluoreto firmemente ligado (FA) e pH da solução

após o tratamento. “CaF2” foi determinado após extração alcalina com KOH. Em seguida, duas

camadas consecutivas de esmalte foram removidas de todos os blocos dentais, utilizando HCl

sob agitação, por 15 s, para cada camada, para extração de FA. O pH das soluções foi novamente

determinado após os tratamentos.

27

Experimento I

Grupos de tratamento (n=12)

F 0,1 M (0,5 mL/mm2)

F 0,1 M (1 mL/mm2)

F 0,1 M (2 mL/mm2)

F 0,1 M + histidina 0,1 M (0,5 mL/mm2)

F 0,1 M + histidina 0,1 M (1 mL/mm2)

F 0,1 M + histidina 0,1 M (2 mL/mm2)

Figura 3 - Fluxograma do desenho do estudo.

Blocos de esmalte dental

bovino (4x4x2 mm)

Seleção inicial

por dureza de

superfície

Indução da lesão de cárie

Solução DES (2 mL/mm2)

37ºC por 16 h

Nova avaliação da dureza

de superfície

Cálculo da %PDS e

seleção dos blocos

Experimento II

Grupos de tratamento (n=12)

Água purificada (controle negativo)

F 0,1 M (controle ativo)

F 0,1 M + histidina 0,025 M

F 0,1 M + histidina 0,05 M

F 0,1 M + histidina 0,1 M

Variáveis resposta:

- pH da solução

- “CaF2”

- FA

FA

//

Variáveis resposta:

- pH da solução

- “CaF2”

- FA

FA

//

Reação dos blocos dentais com

as soluções de tratamento, sob

agitação (100 rpm), por 10 min,

a temperatura ambiente.

Reação dos blocos dentais com

as soluções de tratamento, sob

agitação (100 rpm), por 10 min,

a temperatura ambiente.

28

4.2 Obtenção dos blocos de esmalte

Os dois experimentos foram executados de maneira independente. Porém, em razão

da semelhança metodológica para sua realização, parte da metodologia para os experimentos I

e II será descrita conjuntamente.

Foram utilizados incisivos bovinos hígidos, previamente armazenados em solução

de formol a 2%, pH 7,0, para desinfecção, por pelo menos 30 dias (White, 1987). Dentes que

apresentavam trincas, fraturas, hipoplasias ou pigmentações foram excluídos. Blocos dentais

de esmalte foram obtidos, utilizando uma cortadeira elétrica Isomet (Buehler) e discos

diamantados de dupla face (Buehler Diamond Wafering Blade nº 11-4243 da série 15 HC).

Placas de acrílico foram utilizadas para fixar os dentes com auxílio de cera pegajosa, os quais

posteriormente foram seccionados na porção cervical, separando a porção coronária da

radicular na cortadeira elétrica. Os blocos dentais foram fixados em discos de acrílico,

planificados e polidos em politriz APL-4 Arotec®, com lixa de granulação de 400 a 1200,

seguida por discos de feltro e suspensão diamantada, deixando toda a região da superfície de

esmalte dental plana. Entre as mudanças de granulação das lixas 400 e 1200, os blocos foram

colocados em ultrassom (T7, Thornton®) para remoção de resíduos. Discos de feltro foram

utilizados para o ultra polimento, banhados com suspensão contendo partículas de diamante (1

µm), durante 2 min. Posteriormente, os blocos foram imersos em uma solução detergente

diluída em água purificada, por 2 min. Os blocos dentais foram lavados com água purificada e

armazenados em ambiente úmido e refrigerado.

4.3 Seleção dos blocos dentais

Para a seleção dos blocos dentais, foi realizada a determinação da microdureza de

superfície, utilizando microdurômetro Future Tech modelo FM–7, acoplado a um software FM–

ARS e penetrador tipo Knoop, com carga de 50 g por 5 s. Três endentações, com distância de

100 µm entre cada uma, foram feitas na região central dos blocos dentais. A seleção foi baseada

na média e desvio padrão da dureza de superfície de cada bloco. Foram excluídos os blocos que

apresentaram variabilidade entre as endentações maior ou menor que 10% (variabilidade intra-

blocos) e aqueles que apresentaram sua média individual de dureza maior ou menor do que 12%

da média de dureza calculada para todos os blocos inicialmente obtidos (variabilidade entre

blocos).

A obtenção e seleção dos blocos de esmalte foi realizada de acordo com a execução

de cada experimento. A média e o desvio padrão da dureza de superfície dos blocos,

29

inicialmente selecionados de acordo com os critérios citados acima, nos experimentos I e II foi

respectivamente, 330,7 ± 18,8 Kg/mm2 e 341,6 ± 15,7 Kg/mm2.

4.4 Indução das lesões de cárie artificial nos blocos de esmalte

O protocolo estabelecido por Queiroz et al. (2008) foi seguido para a indução das

lesões de cárie nos blocos dentais. Assim, os blocos dentais do experimento em execução foram

imersos em solução desmineralizante, na proporção de 2 mL de solução por mm2 de esmalte,

por 16 h a 37ºC, sem agitação. Esta solução é composta por tampão acetato 0,1 M pH 5,0

contendo Ca 1,28 mM, Pi 0,74 mM e 0,03 µg F/mL.

A análise da dureza de superfície dos blocos de esmalte foi novamente realizada

após indução das lesões de cárie, sendo feita uma nova linha de 3 endentações, 100 µm abaixo

daquelas iniciais, com carga de 50 g por 5 s. Em seguida, a porcentagem de perda de dureza de

superfície (PDS%) foi calculada para cada bloco. Foram então excluídos do experimento blocos

que apresentaram sua média individual de %PDS maior ou menor do que 5% da média de

%PDS calculada para todos os blocos inicialmente obtidos (variabilidade entre blocos). Dessa

forma, após exclusão dos blocos de esmalte pelo critério mencionado acima, a média e o desvio

padrão da %PDS dos blocos nos experimentos I e II foi 95,0% ± 1,20 e 92,7% ± 1,91,

respectivamente.

Os blocos selecionados tiveram a superfície vestibular do esmalte medida com

paquímetro digital. Posteriormente, com exceção da superfície do esmalte, as demais foram

isoladas com cera 7 e os blocos dentais, já devidamente identificados, foram armazenados em

ambiente úmido, sob refrigeração.

4.5 Preparo das soluções de tratamento

4.5.1 Experimento I

As soluções de tratamento foram preparadas com água purificada e apresentaram a

mesma concentração de fluoreto (0,1 M), variando quanto à presença ou não de histidina (0,1

M). Os reagentes utilizados foram Fluoreto de sódio (PM - 41,98 g/mol) P.A. Merck® (Lote:

1064497002) e L-Histidina cloridrato (209,63 g/mol) P.A. Dinâmica® (Lote: 40266). As

soluções de tratamento tiveram o valor do pH ajustado para 5,0. O ajuste do pH das soluções

foi realizado com soluções de HCl ou NaOH e o auxílio de eletrodo de pH e peagômetro

calibrado com soluções de pH 4,0 e 7,0. Foram avaliadas as seguintes proporções de volume da

30

solução de tratamento por área de esmalte dental exposto (n=12/grupo): 0,5 mL/mm2; 1

mL/mm2 e 2 mL/mm2.

4.5.2 Experimento II

As soluções de tratamento foram preparadas com a mesma concentração de fluoreto

(0,1 M) e diferentes concentrações de histidina (0,025 M, 0,05 M e 0,1 M), utilizando os

mesmos reagentes do experimento I. As soluções de tratamento tiveram o valor do pH ajustado

para 5,0. O ajuste do pH das soluções foi realizado com soluções de HCl ou NaOH e o auxílio

de eletrodo de pH e peagômetro calibrado com soluções de pH 4,0 e 7,0.

4.6 Dosagem de F das soluções de tratamento

Após o preparo de cada solução de tratamento, alíquotas das mesmas foram diluídas

e misturadas com TISAB II (tampão acetato 1 M, pH 5,0, contendo NaCl 1 M e CDTA 0,4%),

para determinação da concentração de fluoreto. Esta análise foi realizada em triplicata,

utilizando eletrodo íon específico (ORION 96-06, Thermo-Scientific) e analisador de íons (EA

940 Thermo-Scientific), previamente calibrado com padrões de 2 a 64 µg F/mL.

4.7 Reatividade das soluções de tratamento com os blocos dentais

Individualmente, os blocos de esmalte com lesão de cárie artificial foram imersos

nas soluções de tratamento e mantidos sob agitação em mesa agitadora (100 rpm) por 10 min,

em temperatura ambiente (Arthur et al., 2007b). No experimento I, as proporções de volume de

solução de tratamento por área de esmalte dental exposto utilizadas foram 0,5 mL/mm2; 1

mL/mm2 e 2 mL/mm2. No experimento II, para todos os grupos, a proporção utilizada foi 2

mL/mm2.

Em seguida, os blocos dentais foram retirados da solução, lavados com água

purificada, secos com papel absorvente e colocados em tubos de ensaio previamente

identificados para posterior extração do fluoreto fracamente ligado.

4.8 Determinação do pH das soluções de tratamento após reações com os blocos dentais

Após reação, o pH das soluções de tratamento foi determinado novamente,

utilizando eletrodo de pH e peagômetro calibrado com soluções padrões de pH 4,0 e 7,0.

31

4.9 Determinação do fluoreto fracamente ligado

Cada bloco de esmalte foi imerso individualmente em 0,50 mL de solução de KOH 1 M a

temperatura ambiente e mantido sob agitação (100 rpm) em mesa agitadora por 24 h (Caslavska

et al., 1975). Passado esse tempo, a solução foi neutralizada e tamponada com 0,50 mL de

TISAB II contendo HCl 1 M, o bloco foi retirado e lavado e a solução foi analisada em eletrodo

específico para íon flúor (ORION 96-06, Thermo-Scientific) acoplado a analisador de íons (EA

940 Thermo-Scientific), anteriormente calibrado com padrões de 1 a 64 µg F/mL (Experimento

I) e 0,125 a 64 µg F/mL (Experimento II). A análise foi realizada de forma cega, pois o analista

não sabia a qual grupo o tubo com a respectiva solução pertencia. O fluoreto fracamente ligado

formado e extraído dos blocos de esmalte foi calculado e expresso em µg F/cm2.

4.10 Determinação do fluoreto firmemente ligado

Consecutivamente, em cada bloco dental, duas camadas de esmalte foram

removidas por extração ácida. Os blocos foram imersos em 0,5 mL de HCl 0,5 M, por 15 s,

para cada camada, sob agitação, seguido por neutralização e tamponamento, usando o mesmo

volume de TISAB II, pH 5,0, modificado com adição de 20 g de NaOH/L (Koo e Cury, 1998).

Em seguida, cada bloco foi removido do seu respectivo tubo e nos extratos foi determinada a

concentração de fluoreto fortemente ligado, usando analisador de íon (ORION EA 940,

Thermo-Scientific) e eletrodo íon específico (96-09, Thermo-Scientific), previamente

calibrados com padrões de 1 a 64 µg F/mL (Experimento I) e 0,125 a 64 µg F/mL (Experimento

II). A análise de FA também foi feita de forma cega, conforme descrito anteriormente. A

concentração total de fluoreto firmemente ligado formado (FA total) foi calculada a partir do

somatório das médias das concentrações de fluoreto firmemente ligado obtidas em cada uma

das camadas extraídas, e expressa em µg F/cm2.

4.11 Análise estatística

Uma análise descritiva dos resultados foi realizada em cada experimento. Os

resultados obtidos foram inicialmente avaliados quanto à distribuição normal dos dados, sendo

utilizado análise de variância e teste de Tukey para os dados referentes ao pH e às concentrações

de fluoreto fracamente e firmemente ligado. A análise estatística foi realizada utilizando o

software SAS (SAS Institute Inc., versão 8.01) com o nível de significância fixado em 5%. As

pressuposições de normalidade e homogeneidade foram levadas em consideração. No

experimento I, para a análise de “CaF2”, a transformação dos dados em raiz quadrada foi

32

necessária. Em relação aos dados de pH e FA total, foi feita a transformação em log na base de

10. Para análise de “CaF2” e FA total, um outlier foi excluído. No experimento II, em todas as

análises, foi necessária a transformação dos dados em log na base de 10. Outliers foram

excluídos para análise de pH e FA total. Análise de regressão foi realizada para verificar o efeito

dose-resposta entre a concentração de histidina nas soluções fluoretadas e as concentrações de

“CaF2” e FA formados nos blocos de esmalte com lesão de cárie. Em ambos os experimentos,

Teste t de Student foi realizado para comparar o valor do pH inicial (5,0) e os valores de pH

das soluções de tratamento após reação com os blocos dentais.

33

5 RESULTADOS

5.1 Experimento I

A tabela 1 apresenta a média e o desvio padrão dos valores de pH das soluções de

tratamento após reação com blocos dentais e da concentração de fluoreto fracamente e

firmemente ligado presente nos blocos de esmalte tratados com as respectivas soluções. Os

resultados do Teste t de Student mostram que houve diferença significativa entre o valor do pH

inicial (5,0) e os valores de pH das soluções de tratamento após a reação com os blocos dentais

em todos os grupos (p<0,05). As soluções fluoretadas contendo histidina, independentemente

da proporção de volume de solução de tratamento por área de esmalte exposto (Tabela 1),

apresentaram valores de pH, após reação com os blocos dentais, mais próximos do pH inicial,

que não diferiram entre si e que foram estatisticamente menores do que aqueles das soluções

fluoretadas sem histidina (p<0,001). Os grupos de tratamento com soluções fluoretadas sem

histidina também não diferiram entre si quanto aos valores de pH em função da proporção de

volume de solução de tratamento por área de esmalte exposto.

Tabela 1: Média (±dp) dos valores de pH das soluções de tratamento e da concentração (µg

F/cm2) de “CaF2” e FA total presente nos blocos dentais após reação com as respectivas

soluções (n=12/grupo).

Grupos de Tratamento pH# “CaF2” (µg F/cm2) FA total (µg F/cm2)

F 0,1 M (0,5 mL/mm2) 5,33 ± 0,03 A 72,1 ± 18,8 A 4,3 ± 1,1 A

F 0,1 M (1 mL/mm2) 5,34 ± 0,03 A 57,5 ± 18,6 A 3,6 ± 1,0 A

F 0,1 M (2 mL/mm2) 5,31 ± 0,03 A 68,0 ± 12,1 A 4,2 ± 0,8 A

F 0,1 M + histidina 0,1 M

(0,5 mL/mm2) 5,05 ± 0,04 B 279,3 ± 42,0 B* 79,7 ± 20,8 B*

F 0,1 M + histidina 0,1 M

(1 mL/mm2) 5,08 ± 0,01 B 240,2 ± 28,4 B 70,3 ± 34,1 B

F 0,1 M + histidina 0,1 M

(2 mL/mm2) 5,03 ± 0,04 B 274,9 ± 27,9 B 80,6 ± 32,7 B

Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,001) e mostram as

diferenças nas colunas entre os grupos de tratamento. #O pH inicial de todas as soluções de tratamento foi ajustado para 5,0.

*n=11; um outlier foi removido.

Em relação à concentração de “CaF2”, a análise de variância dos dados mostrou que

há diferença significativa entre as soluções de tratamento utilizadas (p<0,001). A maior

formação de fluoreto fracamente ligado ocorreu nos blocos de esmalte tratados com soluções

fluoretadas contendo histidina (p<0,001). Porém, apesar da histidina aumentar a reatividade do

fluoreto com o substrato dental, a proporção do volume de solução em relação à área do esmalte

34

dental não influenciou a concentração de “CaF2”, quer seja na ausência ou presença de histidina

(p>0,05).

Figura 4 - Média (±dp) da concentração (µg F/cm2) de fluoreto fracamente ligado

(“CaF2”) presente no esmalte exposto a soluções fluoretadas, com ou sem histidina,

e em diferentes proporções de volume de solução por área de esmalte exposta

(n=12/grupo).

Letras maiúsculas distintas indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05)

entre os grupos.

F: soluções fluoretadas

*n=11; um outlier foi removido: 139,8 µg F/cm2.

Os resultados da concentração de fluoreto firmemente ligado formado na primeira

e segunda camada de esmalte removido estão representados na Figura 5. A soma das camadas

foi expressa como FA total. A análise dos dados mostrou maior concentração de FA nos blocos

dentais que reagiram com soluções fluoretadas contendo histidina (p<0,001). Contudo, a

proporção de volume de solução por área do esmalte dental não influenciou a reatividade do

fluoreto com o substrato dental, tanto na ausência quanto na presença de histidina.

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

0,5 mL/mm² 1 mL/mm² 2 mL/mm² 0,5 mL/mm² 1 mL/mm² 2 mL/mm²

F 0,1 M F 0,1 M + Histidina 0,1 M

Co

nce

ntr

açã

o d

e "

Ca

F2"

(µ

g F

/cm

2)

Tratamentos

A A A

B

B

B *

35

Figura 5 - Concentração (média±dp; µg F/cm2) de fluoreto firmemente ligado

(extrações consecutivas e soma das camadas) presente no esmalte exposto a soluções

fluoretadas, com ou sem histidina, e em diferentes proporções de volume de solução

por área de esmalte exposta (n=12/grupo).

Letras maiúsculas distintas indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05)

entre os grupos.

F: soluções fluoretadas

*n=11; **n=10; outliers foram removidos.

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

0,5 mL/mm² 1 mL/mm² 2 mL/mm² 0,5 mL/mm² 1 mL/mm² 2 mL/mm²

F 0,1 M F 0,1 M + histidina 0,1 M

Co

nce

ntr

açã

o d

e F

A (

µg

F/c

m2)

Tratamentos

1ª camada 2ª camada FA total

**

**

A

/

/

A A

B B B

36

5.2 Experimento II

De acordo com os dados da tabela 2, é possível observar que os valores de pH das

soluções de tratamento após reação com os blocos dentais aumentaram significativamente em

todos os grupos em relação aos valores iniciais (p<0,05). Entretanto, o menor aumento foi

observado no grupo de tratamento com a solução fluoretada contendo a maior concentração de

histidina (0,1 M), cujo pH final diferiu significativamente de todas as outras soluções de

tratamento (p<0,001).

Tabela 2: Média (±dp) dos valores de pH das soluções de tratamento e da concentração (µg

F/cm2) de “CaF2” e FA total presente nos blocos dentais após reação com as respectivas

soluções (n=12/grupo).

Grupos de Tratamento pH final# “CaF2” (µg F/cm2) FA total

(µg F/cm2)

Água purificada (controle negativo) 6,18 ± 0,04 A* 0,25 ± 0,04 A 0,83 ± 0,29 A

F 0,1 M (controle ativo) 5,12 ± 0,02 B 88,70 ± 12,18 B 5,88 ± 1,37 B

F 0,1 M + histidina 0,025 M 5,07 ± 0,01 C 160,77 ± 16,76 C 19,80 ± 13,17 C

F 0,1 M + histidina 0,05 M 5,08 ± 0,02 C 158,71 ± 32, 88 C 26,69 ± 14,69 C

F 0,1 M + histidina 0,1 M 5,02 ± 0,02 D** 199, 94 ± 20,90 D 73,71 ± 22,51 D**

Médias seguidas de letras maiúsculas distintas diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,001) e mostram

as diferenças nas colunas entre os grupos de tratamento. #O valor do pH inicial de todas as soluções fluoretadas foi ajustado para 5,0, exceto o pH inicial da água

(5,92), que não foi ajustado, apenas verificado. *n=5; **n=11; outliers foram removidos.

A partir da análise dos resultados, verificou-se que nas soluções de tratamento com

histidina, houve menor aumento do valor de pH (p<0,001) do que no grupo de solução

fluoretada sem histidina. Embora as soluções contendo histidina tenham apresentado menor

variação de pH, isto é, valores de pH menores após a reação com as soluções de tratamento,

nenhuma diferença significante entre os grupos F 0,1 M + histidina 0,025 M e F 0,1 M +

histidina 0,05 M foi encontrada (p=0,7736). O grupo F 0,1 M + histidina 0,1 M manteve o pH

mais próximo de 5,0, apresentando significativamente o menor valor após a reação com os

blocos dentre todos os grupos (p<0,001).

Analisando os resultados de “CaF2” da Figura 6, é possível verificar que a presença

de histidina aumentou a formação de fluoreto fracamente ligado no esmalte dental com lesão

cariosa (p<0,001).

37

Figura 6 - Média (±dp) da concentração (µg F/cm2) de fluoreto fracamente ligado

(“CaF2”) presente no esmalte exposto a soluções fluoretadas, sem ou com histidina

em diferentes concentrações (n=12/grupo).

Letras maiúsculas distintas indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05)

entre os grupos.

F: soluções fluoretadas; Hist: histidina

Os blocos dentais tratados com as soluções de tratamento contendo histidina

apresentaram concentrações significativamente maiores de “CaF2”, quando comparados com

aqueles do grupo água e do grupo F 0,1 M (p<0,001). Verificou-se também que, dentre as

diferentes concentrações de histidina, o grupo F 0,1 M + histidina 0,1 M apresentou uma maior

formação do fluoreto fracamente ligado (p<0,05).

A análise de regressão dos dados (Figura 7) mostrou significativo efeito dose-

resposta entre a concentração de histidina nas soluções fluoretadas e a formação de “CaF2” nos

blocos dentais (p<0,001).

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

Água

purificada

F 0,1 M F 0,1 M + Hist

0,025 M

F 0,1 M + Hist

0,05 M

F 0,1 M + Hist

0,1 M

Co

nce

ntr

açã

o d

e "

Ca

F2"

(µ

g F

/cm

2)

Tratamentos

A

B

C C

D

38

Figura 7 – Concentração (µg F/cm2) de fluoreto fracamente ligado (“CaF2”) presente

no esmalte dental em relação à concentração de histidina nas soluções fluoretadas

(n=12/grupo).

Figura 8 - Concentração (média±dp; µg F/cm2) de fluoreto firmemente ligado

(extrações consecutivas e soma das camadas) presente no esmalte exposto a soluções

fluoretadas, sem ou com histidina em diferentes concentrações (n=12/grupo).

Todos os grupos tratados com soluções contendo histidina apresentaram

significativamente maior concentração de fluoreto firmemente ligado (p<0,001), quando

comparado com os grupos água e F 0,1 M (Figura 8). Não houve diferença significativa entre

os grupos F 0,1 M + histidina 0,025 M e F 0,1 M + histidina 0,05 M (p=0,5442). Por outro lado,

o grupo F 0,1 M + histidina 0,1 M mostrou uma concentração de FA estatisticamente maior em

relação a todos os outros grupos (p<0,001).

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Água

purificada

F 0,1 M F 0,1 M + hist

0,025 M

F 0,1 M + hist

0,05 M

F 0,1 M + hist

0,1 M

Co

nce

ntr

açã

o d

e F

A (

µg

F/c

m2)

Tratamentos

1ª camada 2ª camada FA total

p<0,01

B

C C

D

*

* *

A

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00

Lo

g [

"C

aF

2"

]

0 0,025 M 0,05 M 0,075 M 0,1 M

Concentração de histidina

Letras maiúsculas distintas indicam diferença estatisticamente significativa

(p<0,05) entre os grupos. *n=11; outliers foram removidos.

39

De acordo com a Figura 9, verifica-se que a análise de regressão dos dados mostrou

significativo efeito dose-resposta entre a concentração de histidina nas soluções fluoretadas e a

formação de fluoreto firmemente ligado (p<0,001).

Figura 9 - Concentração (µg F/cm2) de fluoreto firmemente ligado (FA) presente no

esmalte dental em relação à concentração de histidina nas soluções fluoretadas

(n=12/grupo; exceto para o grupo F 0,1 M e histidina 0,1 M que foi 11).

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00

Lo

g [

FA

]

0 0,025 M 0,05 M 0,075 M 0,1 M

Concentração de histidina

p<0,01

40

6 DISCUSSÃO

No presente estudo, foram pesquisadas algumas condições que podem ser úteis na

elucidação do mecanismo de ação da histidina no aumento da reatividade do fluoreto com o

esmalte dental com lesão de cárie. Para tal, a proporção de volume de solução de tratamento

contendo fluoreto e histidina por área de esmalte dental exposto e a concentração de histidina

foram testadas.

No experimento I, o aumento nos valores de pH das soluções de tratamento observado

em todos os grupos após reação com os blocos dentais (Tabela 1), principalmente naqueles sem

histidina, está de acordo com o observado por Arthur et al. (2007a) e Vieira Júnior (2010). Este

aumento ocorreu em virtude da dissolução do esmalte durante reação com as soluções de

tratamento. No equilíbrio de solubilidade da hidroxiapatita com os íons da solução, o próton

(H+), que está circulado na Figura 1, é importante para aumentar a dissolução de cálcio, assim,

o F reagirá com o cálcio, formando “CaF2” ou FA. No entanto, os íons fosfato (PO4-3) e

hidroxila (OH-) também dissolvidos da hidroxiapatita (HA) podem combinar-se com os prótons

(H+) do meio, elevando o pH e, assim, diminuindo a disponibilidade de mais cálcio (Figura 1).

Consequentemente, o aumento resultante do pH da solução tenderia a diminuir a reatividade do

fluoreto com o substrato dental.

O menor aumento do pH das soluções fluoretadas contendo histidina, ou mesmo a não

alteração deste pH, pode ser explicado pelo seu efeito tampão e, no caso do pH testado no

presente estudo, 5,0, pode ser atribuído ao grupamento lateral da histidina, cujo pKa é 6,05

(Figura 2). Como o pH da solução é uma unidade abaixo do pKa da cadeia lateral da histidina,

praticamente toda a molécula se apresenta na forma de ácido fraco, sendo capaz de inibir

aumentos de pH. Assim, nas soluções fluoretadas contendo histidina um próton pode ser

liberado ou se ligar à histidina, possibilitando que variações bruscas de pH não ocorram.

Figura 1 - Relação de equilíbrio entre a hidroxiapatita e os íons dissolvidos na solução e a

sua reatividade na presença de fluoreto.

Sólido

Sólido

Sólido

Interface líquido/sólido

41

Também foi observado no experimento I que, apesar da presença da histidina ter

proporcionado valores de pH após reação com os blocos dentais mais próximos ao valor inicial

(5,0), a proporção de volume de solução fluoretada por área do esmalte dental exposto não

influenciou o pH das soluções de tratamento, quer na ausência ou presença de histidina. A

hipótese de que num volume menor de solução de tratamento por área de esmalte dental pudesse

haver uma maior alteração do pH não foi comprovada, pelo menos não nos volumes e tempo

de reação testados no presente estudo. O maior volume testado de solução de tratamento foi 32

mL, no qual foi imerso um bloco dental de 4 x 4 mm, que resulta numa área de 16 mm2 de

esmalte dental exposto. O menor volume foi 8 mL, no qual a mesma área de esmalte dental

estava imersa e exposta. Embora clinicamente possa se considerar que o tempo de reação dos

blocos de esmalte com as soluções de tratamento deva ser inferior, já foi demonstrado efeito

dose-resposta quanto à incorporação de fluoreto no esmalte cariado com 10 min (Arthur et al.,

2007b). Um tempo mais longo poderia resultar em maior reatividade, mas isso não seria prático

do ponto de vista operacional.

Da mesma maneira, no experimento II, foi observado que os valores de pH das soluções

de tratamento mostraram aumento significativo em relação aos valores iniciais após a reação

com os blocos dentais em todos os grupos. Semelhante ao experimento I e ao estudo de Vieira

Júnior (2010), as soluções contendo histidina apresentaram uma menor variação de pH. Porém,

dentre estas, a solução fluoretada contendo histidina 0,1 M, que foi a maior concentração

testada, conseguiu manter o pH mais próximo de 5,0. Uma possível explicação para esse

resultado seria que a maior concentração de histidina neste grupo mostraria uma maior

capacidade tamponante, diminuindo efetivamente a variação do pH.

Em relação aos resultados de “CaF2”, nos dois experimentos realizados, foi possível

verificar que a presença de histidina nas soluções fluoretadas promoveu maior formação de

Grupamento lateral da histidina. Cadeia lateral aromática de nitrogênio heterocíclico, que consiste

em um carbono e um núcleo imidazole, destacada em azul, na faixa de uma unidade de pH abaixo

e acima do pKa 6,05.

Figura 2 - Estrutura química da histidina na faixa de pH do presente estudo.

.

42

fluoreto fracamente ligado, apresentando aumento proporcional de 4 vezes em relação a

soluções contendo apenas fluoreto. Como em pH 5,0 a molécula de histidina se apresenta na

forma protonada, maior efeito tampão será exercido, o que proporciona a manutenção do pH da

solução, levando à maior reatividade do F com o esmalte dental. Estudos sugerem que o “CaF2”

funciona como reservatório de fluoreto para liberação durante desafios cariogênicos (Arends et

al., 1983; Ogaard, 1990, 2001; White e Nancollas, 1990). Assim, este efeito da histidina poderia

potencializar o efeito anticárie do F por aumentar a formação destes reservatórios. No entanto,

se este aumento da formação de reservatórios de “CaF2” de fato ampliaria o efeito anticárie do

F precisa ser testado em um modelo adequado para avaliar os processos de des e

remineralização.

Como a alteração do pH na ausência da histidina não é tão expressiva, isto é, em torno

de pH 5,3 para as soluções fluoretadas do experimento I, fica a questão se outro efeito, além do

tampão, poderia ser exercido pela histidina para aumentar a reatividade do fluoreto. Foi relatado

por Ramos Silva et al. (2004) que o fluoreto pode se ligar fortemente à histidina por meio de

uma ponte de hidrogênio. A estrutura relatada pelos autores contém o fluoreto ligado fortemente

por uma ligação de hidrogênio ao átomo de oxigênio do grupo carboxílico. A possibilidade de

formação desta estrutura viabiliza um outro mecanismo de ação para a histidina aumentar a

reatividade do fluoreto com o substrato dental. No entanto, outros estudos deverão ser propostos

para checar se esta estrutura química se forma nas condições aqui estudadas e se de fato teriam

algum efeito na maior reatividade do fluoreto.

Apesar da histidina favorecer o aumento da reatividade do fluoreto, a proporção de

volume de solução fluoretada de tratamento por área do esmalte dental exposto não apresentou

nenhuma diferença entre os diferentes grupos de tratamento, tanto na ausência, quanto na

presença desta molécula. Assim, a hipótese de que a redução do volume de solução de

tratamento demandaria um maior efeito tampão da histidina, uma vez que em volumes menores

os íons fosfato (PO4-3) e hidroxila (OH-) que fossem dissolvidos dos blocos de esmalte estariam

menos diluídos, não foi observada nos volumes testados no presente estudo. De fato, não houve

diferença no pH das soluções de tratamento após reação com os blocos dentais em função do

volume de solução. No entanto, volumes menores ainda poderiam ser avaliados, tal como 1 ou

2 mL da solução de tratamento para uma área de 16 mm2.

Semelhantemente, no experimento II, as soluções fluoretadas contendo histidina

resultaram na maior formação de “CaF2”. Comparando-se apenas os grupos com histidina, os

resultados mostram que todas as concentrações deste aminoácido foram significantes para o

aumento da concentração de fluoreto fracamente ligado. A maior concentração de “CaF2” foi

43

observada nos blocos dentais tratados com a solução fluoretada contendo histidina na maior

concentração testada neste estudo, 0,1 M. Dessa forma, poderia ser levantada a hipótese de que

a maior concentração de histidina nas soluções fluoretadas favoreceria a manutenção do pH das

soluções de tratamento e, consequentemente, maior reatividade do fluoreto com o substrato

dental, tendo em vista que, como observado em estudo prévio (Vieira Júnior, 2010), quanto

menor o pH, maior formação do mineral do “tipo” fluoreto de cálcio.

Com relação à formação de fluoreto firmemente ligado, nos dois experimentos, a

presença de histidina nas soluções fluoretadas levou ao aumento da concentração de FA no

esmalte dental com lesão cariosa, apresentando aumento proporcional de quase 20 vezes em

relação a soluções sem histidina. Esses resultados estão de acordo com os encontrados por

Vieira Júnior (2010), onde foi observada maior formação de FA nos grupos tratados com

soluções fluoretadas contendo histidina. No estudo realizado por Dantas (2016), apesar do

aumento da concentração de fluoreto ter apresentado efeito dose-resposta em relação à

formação de FA na dentina com lesão de cárie, nenhum efeito foi observado em relação aos

diferentes valores de pH utilizados.

Diante dos achados encontrados, mais estudos são necessários, avaliando se a histidina

é capaz de se ligar ao fluoreto e mesmo ao esmalte dental, além de verificar se este mesmo

efeito poderia ser observado também quanto ao biofilme dental, aumentando a quantidade de

fluoreto neste ambiente que pode atuar como um reservatório de “CaF2”.

44

7 CONCLUSÃO

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, o efeito da histidina no aumento da

reatividade do fluoreto com o esmalte com lesão cariosa foi confirmado, tanto em termos de

formação de “CaF2” quanto FA. Quanto maior a concentração de histidina, maior foi a

reatividade do fluoreto com o esmalte com lesão cariosa, apesar do volume de solução de

tratamento não ter influenciado o aumento da reatividade do fluoreto. No entanto, mais estudos

são necessários para avaliar se o tamponamento pela histidina seria de fato responsável pela

maior reatividade.

45

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ANEXO 1 – PRIMEIRA PÁGINA DO RELATÓRIO DO PROGRAMA ANTIPLÁGIO

TURNITIN PARA VERIFICAÇÃO DE ORIGINALIDADE