Efeito da exposição in vitro à bifenila policlorada nº126 em … · 2016. 2. 26. · Ficha...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas

Efeito da exposição in vitro à bifenila policlorada nº126

em células 3T3-L1

Wesley Soares Cruz

Dissertação para obtenção do Título de

Mestre

Orientador: Profa. Dra. Sandra Helena

Poliselli Farsky

São Paulo

2015


Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas


em células 3T3-L1

Wesley Soares Cruz

Versão corrigida da dissertação conforme resolução CoPGr 6018

Original encontra-se disponível no serviço de Pós Graduação da FCF-USP

Dissertação para obtenção do Título de

Mestre

Orientador: Profa. Dra Sandra Helena Poliselli

Farsky

São Paulo

2015

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Cruz , Wesle y Soares C957e Efei to da exposição in v i t ro à b i fenila pol ic lorada nº126 em células 3T3-L1 / Wesley Soares Cruz. - - São Paulo , 2015. 99p. Dissertação (mest rado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas . Orientador: Farsky, Sandra Helena Pol isel l i 1 . Poluente ambiental : Análise : Toxicologia I . T. II. Farsky, Sandra Helena Pol isel l i , or ientador . 615.907 CDD

Wesley Soares Cruz


Comissão Julgadora

da

Dissertação para obtenção do Título de Mestre

Prof. Dr.

orientador/presidente

_________________________________________________

1o. examinador

_________________________________________________

2o. examinador

__________________________________________________

3o. examinador

__________________________________________________

4o. examinador

São Paulo, ______ de _______________ de 2015

DEDICATÓRIA Aos meus pais que me colocaram no mundo com tanto amor e carinho. Aos meus

irmãos que tanto amo e aos meus amigos que fizeram esta jornada um pouco mais

suave, obrigado pelos encontros e pela amizade que tanto prezo. À Deus que me

conduziu e me deu forças mostrando sempre o certo à fazer.

AGRADECIMENTOS Agradeço à Deus por todos os objetivos alcançados, por estar sempre comigo

manifestando o que há de melhor em mim e por me conceder essa experiência

única. Ao meu Paizinho, que com paciência e admiração me acompanhou nesta

jornada. À minha querida Mama, por me ensinar a honestidade, a benevolência, a

paciência, a honra e acima de tudo o amor com o próximo, porque sem amor, eu

nada seria. Aos meus irmãos, Adriano, Valquíria, Vânia e Bruno, por me

incentivarem à seguir esse caminho que tanto amo. Aos meus melhores amigos

Bruno, Bruno II (são tantos que preciso numerá-los), Ariene, Bruna e Letícia por

estarem sempre ao meu lado. À minha querida amiga Viviane Ferraz por ser

parceira na pesquisa e na vida. Ao meu amado amigo Daniel, por sempre estar ao

meu lado, me erguendo quando houve momentos difíceis, sempre serei grato pela

sua amizade. Ao meu amigo Joninhas por me fornecer momentos de descontração

pela Web Cam, somos amigos de longas datas e nossa amizade perdurará através

das décadas. Agradeço também aos amigos do Lab, Natália, Éric, Rodrigo, José,

Isabel, Carine, Karina, Marina, Tatiana, Lorena e aos colegas de departamento. Um

agradecimento especial à Paula a nossa técnica, Samanta, Nancy, Camila e Dona

Luzia que sempre estarão no meu coração, obrigado por tudo.

Agradeço aos meus queridos Mestres que sempre me incentivaram nesta trajetória,

à Dra Dolores Helena, por me ensinar na faculdade o quanto a Toxicologia é

magnifica, obrigado por me ensinar a amar essa disciplina. Agradeço a Prof. Dra

Elizabeth Teodorov da Universidade Federal do ABC por sempre me incentivar, e

fazer com que eu sempre ultrapassasse os meus limites, ensinando-me a trabalhar

com ética e com amor, sempre deixando prevalecer a honestidade e a verdade,

obrigado por me apresentar a biologia molecular que tanto amo. Agradeço ao Prof.

Dr. Luciano Freitas Felício por abrir a porta do seu laboratório, obrigado pelas

referatas que tanto me ensinaram, quero lhe agradecer profundamente por todo o

carinho, toda a atenção, seu conhecimento como pesquisador me influenciou para

que eu pudesse seguir um bom exemplo de ética, profissionalismo e inteligência.

Agradeço a Professora Sandra Farsky que abriu a porta de seu laboratório e

compartilhou todo o seu conhecimento comigo. Quero lhe agradecer pelas

conversas sinceras, pelos momentos de descontração nas festas do Laboratório,

pela partilha de conhecimentos infindáveis. Sou grato por ter lhe conhecido e não

tenho palavras o quanto de momentos bons eu vivi fazendo o que eu mais amo, a

pesquisa.

Peço desculpas se esqueci de alguém, pois são muitas pessoas que adentraram

nessa história ao meu lado. Saibam que estou muito feliz por finalizar esse projeto

que tanto amor coloquei. Um grande abraço.

EPÍGRAFES

“Quanto mais me elevo, menor fico aos olhos daqueles que não sabem voar”.

Friedrich Nietzsche

“O pensamento lógico pode levar você de A a B, mas a imaginação te leva a

qualquer parte do Universo”.

Albert Einstein

RESUMO

CRUZ, W.C. Efeito da exposição in vitro à bifenila policlorada n° 126. 2015.

100f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade

de São Paulo, São Paulo, 2015.

A bifenila policlorada n° 126 (3,3',4,4',5-Penta-cloro-bifenil, PCB126) é um poluente

orgânico persistente (POP), tóxico para os seres vivos. Recentemente, a associação

entre a exposição aos POPs e doenças metabólicas têm sido descrita. No entanto,

os mecanismos desta toxicidade não estão esclarecidos. Desta forma, este trabalho

visou elucidar os efeitos da exposição ao PCB126 sobre pré-adipócitos da linhagem

3T3-L1, diferenciados ou não, focando nos mecanismos de morte celular,

proliferação, diferenciação e metabolismo. O PCB 126 foi diluído em DMSO (0,13%).

Células 3T3-L1 foram mantidas em meio Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM, 5%

de CO2 a 37ºC) e sua diferenciação foi realizada pela incubação com solução

contendo coquetel adipogênico durante 10 dias. As células foram incubadas com

diferentes concentrações de PCB126, DMSO (0,13%) ou DMEM. Células não

diferenciadas foram empregadas em ensaios de viabilidade, morte, proliferação,

ciclo celular, fragmentação do DNA (citometria de fluxo) e ensaios de produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS, espectrofotometria de fluorescência). Células

diferenciadas foram empregadas para quantificação dos mediadores inflamatórios

(ELISA), acúmulo de triglicérides intracelulares (Oil red, microscopia de luz),

produção de óxido nítrico (NO, reação de Greiss), expressão do receptor de aril

hidrocarboneto (AhR, WB) e do proliferador de peroxissoma (PPAR-γ, WB). Os

resultados obtidos mostraram que a exposição ao PCB126 (10, 30 ou 100µM; 24, 48

ou 72 h) não alterou a viabilidade e proliferação celular; reduziu a porcentagem de

células em apoptose (30, 100µM; 24 ou 72 h); não alterou o ciclo celular (10, 30 ou

100µM; 24 ou 72 h); induziu a fragmentação do DNA (10, 30 ou 100µM; 24h); não

induziu a geração de ROS (30, 100µM; 24 ou 72 h); induziu a produção de NO

(300µM; 24 ou 72h); não alterou a secreção do fator quimiotáxico para monócito

(MCP-1); aumentou a secreção do fator de necrose tumoral (TNF-α; 100 ou 300µM,

72 h) e da interleucina 12 (IL-12; 300µM, 72 h); reduziu a secreção de interleucina

1β (IL-1β, 300 µM, 72 h) e de interleucina 10 (IL-10; 300µM; 24h, 100 ou 300µM; 48

h; 100µM, 72 h); aumentou a expressão de PPARγ (100 ou 300µM, 24h; 300µM,

72h) e de AhR (300µM, 72h); aumentou a concentração de triglicérides intracelulares

(100 ou 300µM; 24, 48 ou 72h). Em conjunto, os resultados obtidos mostram as

ações diretas do PCB126 em células 3T3-L1 envolvidas na adipogênese, o que

reforça, embora que em ensaios in vitro, o papel desta classe de poluentes na

obesidade.

Palavras-chave: PCB 126. Obesidade. 3T3-L1. Poluentes.

ABSTRACT

CRUZ, W. C. In vitro exposure effect of polychlorinated biphenyl n° 126. 2015.

100f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade

de São Paulo, São Paulo, 2015.

The polychlorinated biphenyl (PCB) 126 is a persistent organic pollutant and toxic to

human being. The association between exposition to POPs and metabolic diseases

has been described. Nevertheless this toxicity mechanism is not yet elucidated. This

way this work aim to elucidate the exposure over pre adipocytes 3T3-L1 line to PCB

126, differentiated or not, focused on cellular death mechanisms, proliferation,

differentiation and metabolism. The PCB126 was diluted in DMSO (0,13%). 3T3-L1

cells were maintained in Dulbecco´s modified Eagle´s medium (DMEM, 5% CO2 at

37º) and the differentiation process was performed by incubation with adpogenic

cocktail solution by 10 days. The cells were incubated with different concentration of

PCB126, DMSO (0,13%) or DMEM. Cells not differentiated were used on viability

assays, death, proliferation, cell cycle and DNA fragmentation (flow cytometry) and

reactive oxygen species production assay (ROS, fluorescence spectrophotometry).

Differentiated cells were used to quantify inflammatory mediators (ELISA),

Intracellular triglycerides accumulation (Oil red staining, light microscopy), nitric oxide

production (NO, Greiss reaction), aril hydrocarbon receptor expression (AhR,

Western Blot) and Peroxisome proliferator receptor gamma (PPAR-y, Western Blot).

The obtained results showed that exposure to PCB126 (10, 30 or 100 µM; 24, 48 or

72 hours) did not interfere on cellular viability and proliferation; reduced the cells

percentage in apoptosis (30, 100 µM; 24 or 72h); did not interfere on cellular cycle

(10, 30 or 100 µM; 24 or 72h); induced DNA fragmentation (10, 30 or 100 µM; 24h);

did not induced ROS generation (30, 100 µM; 24 or 72h); induced the production of

NO (300 µM; 24 or 72h); did not alter the secretion of monocyte chemoattractant

protein (MCP-1); enhanced the secretion of tumoral necrosis factor (TNF-α; 100 or

300 µM; 72h) and interleukin 12 (IL12; 300 µM; 72h); reduced secretion of interleukin

1β (IL1β; 300 µM; 72h) and interleukin 10 (IL10; 300 µM; 24h; 100 or 300 µM; 48h;

100 µM; 72h); increased PPAR-y expression (100 or 300 µM; 24h; 300 µM; 72h) and

AhR (300 µM, 24h); increased intracellular triglycerides concentration (100 or 300

µM, 24, 48 or 72h). In summary the results show direct actions of PCB126 in 3T3-L1

cells evolved on adipogenesis, reinforcing, although in vitro, the role of this pollutant

class on obesity.

Keywords: PCB 126. Obesity. 3T3-L1. Pollutants.

LISTA DE ABREVIATURAS

ANXA V Anexina 5

2, 4, 5-T Ácido triclorofenoxiacético

2,4-D Ácido diclorofenoxiacético

AhR Receptor Aril hidrocarboneto

AMPc Adenosina monofosfato ciclico

CO2 Gás carbônico

CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente

CRP C reative protein

CS Soro de bezerro

DCFH 2´-7´-diclorodiidrofluoresceína

DM2 Diabetes Mellitus Tipo 2

DMEM Dulbecco's modified Eagle's médium

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido de Desoxirribonucléico

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

FITC Isocianato de Fluoresceína

GMP Guanosina monofosfato

H2O2 Peróxido de nitrogênio

HBSS Solução Fisiológica de Hanks Balanceada

IARC International Agency for Research on Cancer

IBMX Isobutilmetilxantina

IL Interleucina

Kda Kilo dalton

Kg Kilogramas

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MCP-1 Monocyte chemical protein

MeSO4-PCBs Bifenilas Policloradas metil-sulfonadas

Mg Miligramas

mM Milimolar

Ng Nanogramas

NO Óxido Nítrico

NO2- Nitrito

OH-PCBs Bifenilas Policloradas hidroxiladas

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS Tampão Salina Fosfatada

PCB Bifenila Policlorada

PCDD Dibenzo-p-dioxina

PCDF Dibenzofuranos

PER-ARNT-SIM (PAS) Period Circadian protein-Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein-Single-minded protein

Pg Picogramas

PI Iodeto de Propídeo

PMSF Phenylmethanesulfonylfluoride

POPs Poluentes Orgânicos Persistentes

PPAR-γ Peroxisome proliferator –activated receptor gamma

Ppm Parte por milhão

RIPA Radio-Immunoprecipitation Assay

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

RNAse-A Ribonuclease A

SDS Sodium dodecyl sulfate

SFB Soro Fetal Bovino

TBS Tris buffered saline

TBS-T Tris buffered saline-Tween 20

TCDD 2, 3, 7, 8 – tetraclorodibenzo-p-dioxina

TEF Toxic equivalency fator

TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine

TEQ Toxic equivalency

TNF Fator de necrose tumoral

VLDL Very low density lipoprotein

XRE Xenobiotcs responsible elements

Μm Microgramas

µM Micromolar

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura química do 3,3',4,4',5-Pentaclorobifenil (PCB 126). .................... 3

Figura 2 - Ativação do Receptor AhR. ......................................................................... 8

Figura 3 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a viabilidade e proliferação de

células 3T3-L1. .......................................................................................................... 26

Figura 4 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a apoptose e necrose de células

3T3-L1. ...................................................................................................................... 27

Figura 5 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre o ciclo celular e fragmentação do

DNA de células 3T3-L1. ............................................................................................ 28

Figura 6 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a geração de espécies reativas de

oxigênio por células 3T3-L1 ...................................................................................... 29

Figura 7 - Efeito da exposição ao PCB 126 sobre a produção de NO por células

3T3-L1 ....................................................................................................................... 30

Figura 8 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de MCP-1 por células

3T3-L1 diferenciadas em adipócitos. ......................................................................... 31

Figura 9 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de TNF-alfa por células


Figura 10 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de IL-12 por células


Figura 11 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de IL-1β por células


Figura 12 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de IL-10 por células


Figura 13 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a expressão protéica de PPAR-γ

por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos. ...................................................... 36

Figura 14 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a expressão protéica de AhR por

células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos. ............................................................ 37

Figura 15 - Efeito da exposição ao PCB126 sob o conteúdo de triglicérides em

adipócitos diferenciados. ........................................................................................... 38

SUMÁRIO

1. INTRODUÇĀO ...................................................................................................... 1

1.1.Fontes de exposição e características químicas das bifenilas policloradas (PCBs) ......................................................................................................................... 1

1.2.Exposição, biotransformação e excreção de PCBs .............................................. 5

1.3.Mecanismos da Toxicidade dos POPs: Receptor Aril Hidrocarboneto (AhR) ...... 8

1.4.POPs e doenças metabólicas ............................................................................... 9

1.5.Exposição dos PCBs em modelos in vivo de obesidade .................................... 12

1.6.Estudo da obesidade em modelos in vitro .......................................................... 13

2. OBJETIVO .......................................................................................................... 16

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 17

3.1 Cultura de células 3T3-L1 ................................................................................... 17

3.2 Ensaio para diferenciação das células 3T3-L1 ................................................... 17

3.3 Exposição in vitro ao PCB 126 ........................................................................... 17

3.4 Geração de espécies reativas de oxigênio ......................................................... 18

3.5 Determinação de NO2- ........................................................................................ 18

3.6 Ensaios de citometria de fluxo: viabilidade celular, proliferação celular, fragmentação de DNA e ciclo celular por citometria de fluxo. ................................... 19

3.7 Quantificação de mediadores inflamatórios ........................................................ 20

3.8 Quantificação de triglicérides intracelulares pelo corante Oil Red ...................... 20

3.9 Avaliação da expressão proteica de PPAR-γ e AhR por Western Blot .............. 21

3.9.1 Preparação e quantificação das amostras .......................................................... 21

3.9.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições denaturantes ........................... 22

3.9.3 Eletro-transferência das proteínas .............................................................................. 22

3.9.4 Imunodetecção da proteína de interesse .................................................................... 23

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 25

5. RESULTADOS .................................................................................................... 26

5.1 Efeito dos tratamentos com PCB126 sobre a viabilidade e proliferação celular 26

5.2 Efeito da exposição ao PCB126 sobre o ciclo celular e fragmentação do DNA . 28

5.3 Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) .......................................................................................................... 29

5.4 Efeitos do tratamento com PCB126 sobre a geração de NO2- ........................... 30

5.5 Efeitos do tratamento com PCB 126 sobre a secreção de mediadores inflamatórios .............................................................................................................. 30

5.5.1 Proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) ...................................................... 30 5.5.2 Fator de Necrose Tumoral (TNF) ................................................................................ 31

5.5.3 Interleucina 12 (IL-12) ................................................................................................. 32

5.5.4 Interleucina 1 beta (IL-1β) ........................................................................................... 33

5.5.5 Interleucina 10 (IL-10) ................................................................................................. 34

5.6 Efeito dos tratamentos com PCB126 sobre expressão do receptor proliferador de peroxisoma-gamma (PPAR-γ) e Aril hidrocarboneto (AhR). .................................................. 35

5.7 Efeito do tratamento com PCB126 sobre o acúmulo de triglicérides avaliado pelo corante Oil Red. ...................................................................................................................... 37

6 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 41

7 CONCLUSÕES ................................................................................................... 52

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 53

9 ANEXOS ............................................................................................................. 68

10 FICHA DO ALUNO ............................................................................................. 72

11 INSTRUÇŌES PARA OS MEMBROS DA BANCA JULGADORA ..................... 74

12 CURRÍCULO LATTES ........................................................................................ 75

1

1. INTRODUÇĀO

1.1. Fontes de exposição e características químicas das bifenilas policloradas (PCBs)

A bifenila policlorada n° 126 (3,3',4,4',5-Penta-cloro-bifenil, PCB126) foi um

dos 12 compostos incialmente inclusos na convenção de Estocolmo, realizada em

22 de maio de 2001. A Convenção de Estocolmo é um acordo assinado entre 164

países que visa o controle de poluentes orgânicos persistentes (POPs), que são

compostos altamente estáveis, e que persistem no ambiente durante anos devido a

suas características químicas. São resistentes à degradação química e biológica.

Devido a sua resistência, esses compostos podem ser levados a longas distâncias

pela cadeia trófica, e ocasionam efeitos nocivos ao meio ambiental e à saúde

animal, incluindo os seres humanos, atuando como interferentes dos sistemas

endócrino, imunológico e do metabolismo, e como carcinogênico. Sendo assim, se

estabeleceu um compromisso na convenção de Estocolmo, que visa o

monitoramento e controle de todas as etapas do ciclo dessas substâncias, tais

como, produção, importação, exportação, disposição e uso (EL- SHAHAWI et al.,

2011; IARC, 2009; MREMA et al., 2012; STOCKHOLM CONVENTION ON

PERSISTENT ORGANIC POLLUTANTS, 2001; VAN DER BERG et al., 2013).

A produção, o uso e o comércio de PCBs foram proibidos no Brasil por uma

ação conjunta dos Ministérios da Indústria e Comércio, Casa Civil, Minas e Energia.

A proibição foi realizada pelo ato da Portaria Interministerial (MIC/MI/MME) 0019, em

19 de janeiro de 1981 (MIC/MI/MME 0019 de 19/01/81). O ato exigia que a

produção, bem como a importação de equipamentos que continham PCBs

cessassem em 2 anos. Portanto, em 1983, a lei permitiu que os equipamentos

existentes permanecessem em uso até o fim de vida útil no país.

Devido a sua importância como contaminante ambiental em todo o mundo,

estudos científicos sobre a toxicidade dos POPs são expressivos e estes têm

mostrado a influência destes poluentes no desencadeamento de síndromes

metabólicas, que levam ao desenvolvimento de doenças que afetam grande parte da

população mundial, principalmente em grandes metrópoles (CETEWAYO et al.,

2

2013; LIND et al 2013; LI, WANG, 2005; ROOS et al., 2005; SHARMA et al., 2014).

Esses dados são relevantes devido a preocupação da contaminação ambiental

pelos POPs presentes em praguicidas, por produtos derivados da queima do

petróleo, pela emissão excessiva de gases no meio ambiente, contaminando, assim,

água, solo, ar e alimentos. A associação da exposição aos POPs e síndromes

metabólicas surgiu a partir de estudos epidemiológicos de indivíduos expostos aos

poluentes, principalmente ao TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina), PCDDs

(dibenzo-p-dioxinas), PCDFs (dibenzofuranos) e PCBs (bifenila policloradas) (LEE et

al., 2011).

A presença de átomos de cloro na estrutura química dos PCBs é

determinante para sua toxicidade, além de conferir estabilidade química e biológica,

sendo, assim, facilmente acumulado no meio ambiente e na cadeia alimentar (EL-

SHAHAWI et al., 2010; SCHELL et al., 2010; VAN DER BERG et al., 1998). Os

PCBs constituem uma classe de 209 congêneres, que são classificados de acordo

com a posição dos átomos de cloro no duplo anel benzênico (CHEN, 2010;

CASTRO-JIMÉNEZ; IARC, 2009; GONZALES, 2011; LAI et al., 2010; PENTEADO,

VAZ, 2001; HASSOUN; PERIANDRI-STEINBERG, 2010). Dentre estes, o PCB 126

(Figura 1) é considerado o mais tóxico das bifenilas, sendo classificado pela IARC

(International Agency for Research on Cancer) como grupo 1, com comprovada ação

carcinogênica para humanos. De acordo com sua estrutura química e quantidade

das moléculas de cloro no anel benzênico, o PCB126 é classificado como dioxina

coplanar, semelhante ao TCDD, a dioxina tóxica estudada cientificamente

(AMBOLET-CAMOIT et al., 2015; GHOTBADDINI, POWELL, 2015; HARRIS et al.,

1973). O PCB126, assim com o TCDD, possuem a capacidade de ligar-se a

receptores celulares, principalmente, o receptor de aril hidrocarbonetos (AhR), sendo

este um dos mecanismos responsáveis pela toxicidade em animais de

experimentação e humanos (CHEN, 2010; IARC, 2009; IARC, 2012). No entanto,

outros mecanismos de ação podem estar envolvidos na toxicidade do PCB126,

como a indução do estresse oxidativo, que em peixes (zebra fish), é responsável por

induzir má formações neonatais nesta espécie em diferentes estágios de

desenvolvimento (Liu et al., 2015). Adicionalmente, um estudo realizado por

TREMOEN e colaboradores (2014), onde uma linhagem de células de carcinoma

humano foram expostas a diferentes congêneres de PCBs, incluindo o PCB 126,

3

mostrou que esses compostos perturbam a esteroidogênese, mostrando assim a

sua capacidade como interferente endócrino (TREMOEN et al., 2014).

Figura 1 - Estrutura química do 3,3',4,4',5-Pentaclorobifenil (PCB 126).

Número CAS. 57465-28-8. Fórmula química C12H5CL5. Peso Molecular: 326,42. Adaptado de National Toxicology Program, 2006.

Os PCBs são liberados na atmosfera por fontes antropogênicas, como as

emissões provocadas pela queima de petróleo, fumaça de cigarro, capacitadores e

transformadores elétricos, bem como em fontes naturais, como na erupção vulcânica

e transformação química por conjugação atmosférica com outros compostos

(CASTRO-JIMÉNEZ; GONZALES, 2011; ERICKSON; KALEY, 2011). No anexo C da

convenção de Estocolmo aborda-se as fontes de liberação dos POPs não-

intencionais e intencionais, o que inclui os PCBs. As fontes intencionais são aquelas

que são produzidas pelo homem e as não intencionais são as oriundas de processos

químicos na atmosfera. Os PCBs não-intencionais são liberados a partir de

processos térmicos que envolvem material orgânico e cloro, como resultado da

combustão incompleta da matéria orgânica ou reações químicas como, cloração,

conjulgação química ou oxidação. As fontes de emissões industriais possuem alto

potencial de formação e liberação de PCBs no meio ambiente, os quais incluem os

incineradores de resíduos, co-incineradores urbanos, incineradores de lixo hospitalar

ou de lodo de esgoto, sendo que este último é formado pela precipitação desses

compostos. Outras fontes são citadas, tais como a queima de resíduos em fornos de

cimento; produção de celulose com utilização de cloro elementar, de substancias

químicas que gerem cloro elementar em processos de branqueamento, processos

térmicos na indústria metalúrgica que envolve a produção secundária de cobre,

4

planta de sinterização (processo de queima em altas temperaturas por aglutinação)

e na indústria siderúrgica com a produção secundária de alumino e zinco (MALISCH;

KOTZ, 2014; MREMA et al., 2013; ROSNER; MARKOWITZ, 2013; STOCKHOLM

CONVENTION ON PERSISTENT ORGANIC POLLUTANTS, 2001). Ainda, outras

fontes de PCBs contribuem para a contaminação do meio ambiente, tais como,

queima de lixo a céu aberto, incluindo queima em aterros sanitários; processos

térmicos na indústria metalúrgica; fontes residenciais de combustão; instalação

baseada na queima de combustível fóssil e caldeiras industriais; instalações para

queima de madeira e outros combustíveis de biomassa; processos específicos de

produção química que liberem PCBs formados de maneira não-intencional,

especificamente a produção de clorofenóis e cloranil;, crematórios; veículos

automotivos, particularmente aqueles que queimam gasolina com aditivos à base de

chumbo; destruição de carcaça de animais; tingimento (com cloranil) e acabamento

(com extração alcalina) de têxteis e de couro; planta de desmanche para tratamento

de veículos após vida útil; combustão lenta de cabo de cobre e refinarias para

processamento de óleo usado (IARC, 2009; STOCKHOLM CONVENTION ON

PERSISTENT ORGANIC POLLUTANTS, 2001).

Os PCBs foram amplamente comercializados na década de 1970 e 1980 nos

Estados Unidos como mistura sob o nome de Aroclor, que é um fluído dielétrico que

se encontra em capacitadores e transformadores elétricos. O Aroclor é composto de

uma série de misturas de PCBs e sua classificação se dá pelo nome seguido de

uma numeração, sendo que os dois primeiros dígitos identificam os átomos de

carbono, e os dois últimos dígitos indicam o percentual de cloro usado na mistura

(ANTONELLO et al., 2007). Dentre as misturas de Aroclor que contêm PCB 126,

estão o 1248 (98 ppm de PCB 126); 1254 (37,3 ppm de PCB 126); 1242 (33,6 ppm

de PCB 126) e o 1232 (21 ppm de PCB 126) (UNITED STATES DEPARTMENT OF

ENERGY, 2008).

No Brasil, o projeto de lei de número 1.075 do ano de 2011 dispõe a

obrigatoriedade da eliminação controlada dos PCBs e dos seus resíduos, a

descontaminação e a eliminação de capacitadores e transformadores e demais

equipamentos que contenham PCBs. Esta norma estabelece que os equipamentos

contaminados com PCBs não ultrapassem os limites de concentração superiores a

50 mg/Kg e que sua eliminação seja até 2025, sendo assim, este projeto de lei

5

preenche as lacunas observadas no projeto anterior do ano de 1981, que estipulava

que os equipamentos poderiam ainda ser utilizados até o fim de sua vida útil

(PROJETO DE LEI N. 1.075, 2011).

Diante do exposto, fica evidente que apesar das normatizações de uso de

POPs, entre os quais os PCBs, a exposição ambiental é ainda importante devido as

diferentes fontes de produção destes compostos.

1.2. Exposição, biotransformação e excreção de PCBs

Como salientado anteriormente, os PCBs podem ser encontrados no meio

ambiente, em solo, água e ar, decorrente de variadas fontes de produção. Excluindo

a exposição ocupacional ou acidental pelos PCBs, a exposição humana pode

ocorrer pela ingestão de alimentos contaminados, tais como, ovos, leite, carne, peixe

e produtos relacionados, principalmente em tecidos animais, acumulando-se na

gordura animal (IARC,1997).

Vale salientar que os POPs, entre os quais os PCBs, possuem meia vida

longa devido ao acúmulo em alguns tecidos e pela baixa biotransfromação no

organismo. Assim, mesmo em baixas exposições, os POPs podem atingir

concentrações tóxicas nos organismos vivos (U.S.EPA, 1991).

A exposição humana a esses compostos é calculada levando-se em

consideração a exposição global das substancias dioxin like PCBs ou das misturas

destas substancias (CONSONNI et al., 2012). Portanto, muitas vezes torna-se

complexo o processo de avaliação de risco, já que a contaminação com esses

compostos ocorrem pela exposição a misturas, e não somente a um congênere

isolado. Assim, para a determinação da toxicidade, calculamos o equivalente tóxico

(TEQ) total da exposição, onde se mensura a concentração de cada substancia.

Para tanto, necessita-se saber o valor do fator de equivalência tóxica (TEF), uma

vez que o TEQ é definido como a soma dos produtos da concentração de cada

composto do grupo em uma amostra multiplicado pelo seu TEF (CONSONNI et al.,

2012; NTP, 2006).

O TEF de uma susbtancia é considerado um cálculo de potencia relativa,

sendo o TCDD considerado a substancia padrão com um potencial tóxico mais

6

elevado dentro os POPs, sendo assim uma referencia apresentando o seu TEF igual

a 1,0 (NTP, 2006). O PCB 126 é normalizado com relação ao TCDD, apresentando

TEF igual a 0,1, sendo então considerado o congênere mais tóxico dentre os PCBs

(NTP, 2006). A determinação de uma dose limite de exposição para seres humanos

acaba sendo de difícil mensuração, uma vez que a exposição se dá pela mistura e

não pelo congênere isolado.

No Brasil, de acordo com a Instrução normativa n. 11, de 22 de maio de

2012, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os limites de

referencia para as misturas de PCBs segundo o Plano Nacional de Controle de

Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal, é de 200µg/kg de gordura em

carne, 100µg/kg no leite, 15µg/kg no peixe de cultivo e 10µg/kg em ovos. Para os

PCBs presentes no meio ambiente, o Conselho Nacional do Meio Ambiente

(CONAMA) prevê valores máximos permitidos de 0,5 µg/L para a soma dos PCBs

28, 52, 101, 118, 138, 153 e, 180 presente na água para consumo (CONAMA,

2008).

A exposição aos PCBs por via oral é responsável por 90% dos casos de

contaminação e as vias dérmica e inalatória são as principais vias de exposição

ocupacional a estes compostos (MREMA et al., 2012; RUZZIN et al., 2010; TIEMAN,

2008). Estudos realizados na cidade de São Paulo mostram altas concentrações de

PCBs no soro dos habitantes (NOGUEIRA et al., 1987; WASSERMANN et al., 1976),

e se diferem entre os gêneros, sendo maior em mulheres (1,0748 ppm) do que em

homens (0,7417 ppm). O motivo desta diferença não foi determinada, mas

hipotetizou-se que esta poderia estar relacionada a diferença alimentar entre os

gêneros (NOGUEIRA et al., 1987). Os dados encontrados na população brasileira

refletem os encontrados em demais regiões do Brasil, em especial nas

industrializadas e próximas a áreas de descarte de resíduos de equipamentos

contendo PCBs (CASCAES et al., 2014; CESAR et al., 2014; FERREIRA,

MOREIRA, 2015; KOWALSKI et al., 2013).

Os PCBs são lipossolúveis e após a exposição, são bem absorvidos pelo

trato gastrointestinal e, uma vez absorvidos, são transportados pelo sistema linfático

carreados pelos quilomicrons para todo o organismo (ATSDR, 2000; NTP, 2006;

WHO, 2000). Pela via sanguínea, a distribuição ocorre pelas lipoproteínas, lipídeos

7

e, uma menor fração, pela albumina e outros componentes celulares (ATSDR, 2000;

NTP, 2006; WHO, 2000). A distribuição também é determinada pela estrutura,

características fisico-quimicas dos congêneres e pela hidroxilação pelo citocromo

P450 (NTP, 2006). Em ratos Sprague Dawley, os sítios de distribuição iniciais que

ocorrem nos primeiros dias de exposição são o fígado, tecido adiposo, pele e

glândula tireoide (ATSDR, 2000; NTP, 2006; WHO, 2000).

A biotransfroamação dos PCBs ocorre no fígado pela hidroxilação pelas

enzimas do citocromo P450, onde se predomina a formação de metabólitos

hidroxilados (0H-PCBs), ocorrendo a hidroxilação por inserção direta em posição

meta ou, ainda, pode ocorrer formação de um óxido intermediário.

Subsequentemente, ocorre conjugação com ácido glicurônico e sulfatação, no

entanto, os OH-PCBs são mais persistentes no organismo por não serem bons

substratos para conjugação com ácido glicurónico ou pela sulfatação, o que diminui

a sua hidrossulubilidade e dificulta a excreção pela bile (ATSDR, 200; NTP, 2006;

WHO, 2000). Os óxidos intermediários, podem formar os PCBs metil-sulfonados

(MeSO2-PCBs), que tendem a se acumular no organismo. Tipicamente, os

congêneres menos clorados são rapidamente metabolizados e excretados, enquanto

os congêneres altamente clorados são metabolizados lentamente, o que faz com

que ocorra acumulação principalmente no tecido adiposo, em menor grau na pele,

fígado, rim, músculos e pulmão (ATSDR, 200; NTP, 2006; WHO, 2000).

A excreção dos PCBs é dependente da taxa de biotransformação a produtos

polares. A maioria dos PCBs apresentam um perfil de eliminação bifásico, ou seja,

um acentuado declínio inicial e um declínio subsequente, que ocorre lentamente e é

dependente da estrutura do congênere. Os metabólitos de todos os congêneres são

eliminados primeiramente pela bile e fezes. No entanto, uma pequena parte (<5%)

pode ser eliminada na urina, principalmente os congêneres pouco clorados e mais

hidrossolúveis (ATSDR, 200; NTP, 2006; WHO, 2000).

Além da contaminação ambiental elevada dos POPs, entre os quais dos

PCBs, e que contaminam solo, água e ar, suas características químicas os tornam

agentes facilmente absorvidos e dificilmente metabolizados no organismo. Em

conjunto, estes aspectos contribuem para a toxicidade dos PCBs, que será descrita

a seguir.

8

1.3. Mecanismos da Toxicidade dos POPs: Receptor Aril Hidrocarboneto (AhR)

Substancias organocloradas apresentam mecanismo de ação similar, pela

ligação ao receptor nuclear AhR, como mencionado anteriormente (CONSONNI et

al., 2012; GUYOT et al., 2012; NTP, 2006; SERDAR et al., 2014). Assim, o

mecanismo mais descrito para a toxicidade dos PCBs é sua interação ao AhR,

presente no citoplasma e, membro da família de super proteínas denominadas PER-

ARNT-SIM (PAS). A ligação ao agonista leva a ativação do receptor que funciona

como fator de transcrição, formando assim um complexo com ARNT (aryl

hidrocarbon translocator nuclear receptor; STOCKINGER et al., 2011). A sinalização

do AhR (Figura 2) pode ser regulada de diversas formas, como por exemplo pela

degradação proteossomal do complexo AhR/ARNT, pela indução do repressor de

AhR que compete por ligantes de ARNT e que contém o repressor transcricional e,

por auto regulação pela indução de enzimas metabólicas (STOCKINGER et al.,

2011).

Figura 2 - Ativação do Receptor AhR.

Adaptado de Tremayne Peart. Dísponivel em www.ualberta.ca/~osornio/cellular-pathways-and-pm.

A formação do complexo com ARNT permite a ligação de sequências

especificas presentes no XRE (xenobiotics reponsible elements), os quais estão

AhR$

TCDD,$PCBs$

Citoplasma$AhR$

AhR

ARNT

ARNT AhR

RNAm$Transcrição$Tradução$

Detoxificação

CYP450

Metabólitos$rea?vos$CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1…

Aduto$de$DNA$

Reparo do DNA

Mutações

Câncer

9

presentes em grande quantidade de genes, sendo os alvos mais estudados as

enzimas do citocromo P450, as CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 e CYP2S1 (este último

recentemente descrito), que são conhecidas como oxigenases metabolizadoras de

xenobióticos (STEVENS et al., 2009; DIETRICH; KAINA, 2010).

O TCDD é o ligante mais estável do AhR e não possui sensibilidade às

enzimas que metabolizam os xenobióticos que levam a desintoxicação, por

conseguinte, o receptor AhR em presença desse potente ligante, desencadeia uma

série de alterações celulares em tecidos com altas concentrações deste composto,

(POWERS et al., 2005; YAMAMOTO et al., 2005), sendo os que merecem

destaques são tecido pulmonar, hepático, adiposo e pele (MARLOWE; PUGA, 2010;

CHIBA et al., 2011). Assim, dentre as sintomatologias da intoxicação por POPs

organoclorados estão doenças respiratórias, alterações no sistema imunológico,

diabetes mellitus do tipo 2 (DM2) e carcinogênese (KURITA et al., 2009; CHOPRA

et al., 2010; CHIBA et al., 2011; STOCKINGER et al., 2011). Vale ressaltar que a

ativação de AhR em células do sistema imune, em especial em subtipos de

linfócitos, tem associado a exposição de POPs ao desenvolvimento de doenças

auto-imunes, como a esclerose múltipla. (KAJTA et al., 2009; FUJII-KURIYAMA;

KAWAJIRI, 2010; STOCKINGER et al., 2011).

Em conjunto, os dados da literatura mostram a importância do AhR na

toxicidade dos POPs, nos quais incluem os PCBs, e este mecanismo pode estar

associado a diferentes efeitos tóxicos dos PCBs, entre os quais à doenças

metabólicas, como será descrito a seguir.

1.4. POPs e doenças metabólicas

Um estudo epidemiológico realizado por Uemura (2012) mostrou que

veteranos de guerra americanos expostos ao agente laranja, uma mistura dos

herbicidas 2,4,5-T (ácido triclorofenoxiacético) e 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético)

usados como desfolhantes durante a guerra do Vietnã, foram contaminados com

TCDD. Como o TCDD é muito lipofílico e, assim, se acumula neste tecido, os

indivíduos ficaram expostos ao TCDD por longo período de tempo. Nesta população

foi encontrada desenvolvimento elevado de DM2, levando a uma correlação positiva

entre os níveis de TCDD e DM2 (UEMURA, 2012). Corroborando esta evidência,

10

outro estudo realizado em Helsink, Finlândia, confirmou a associação de DM2 em

adultos expostos a praguicidas organoclorados (AIRAKSINEN et al., 2011). Mais

recentemente, esta associação tem sido reforçada em diferentes populações do

mundo expostas a POPs (HONG et al., 2012; LEE el al., 2011; PESTANA et al.,

2014; REAVES et al., 2015).

Além do DM2, a associação da obesidade a poluentes vêm sendo

observada por pesquisadores ao redor do mundo (BAILLIE-HAMILTON, 2002; LEE

et al., 2007; GRÜN, BLUMBERG, 2007; NEEL, SARGIS, 2010). No entanto, é

importante salientar que mudanças nos hábitos rotineiros dos seres humanos

observadas nas últimas décadas, como o aumento do sedentarismo e maus hábitos

alimentares, contribuem efetivamente para o aumento da obesidade na população e,

consequentemente, com os distúrbios metabólicos, tais como a resistência insulínica

com predisposição para DM2, hiperlipidemia, esteatose hepática, aterosclerose,

disfunções renais e hipertensão (KRISTINA et al., 2012; JIN et al., 2013; ANDRADE

et al., 2013). Desta forma, a causa do aumento da obesidade e doenças é multi-

fatorial e a exposição a poluentes pode ser um fator adicional neste processo.

Atualmente, estima-se que 1,4 bilhões de adultos estão acima do peso e que

2,8 milhões irão a óbito por complicações do excesso de peso ou obesidade mórbida

a cada ano. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a prevalência da obesidade

aumentou nos últimos 30 anos, sendo que no ano de 2010, o número de crianças

que apresentavam sobrepeso chegou a 42 milhões em todo o mundo (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2013).

A obesidade é um processo complexo, caracterizado por acúmulo excessivo

de gordura corporal e por uma inflamação crônica, devido ao infiltrado de

macrófagos no tecido adiposo, apresentando aumento evidente de proteína C

reativa (PCR), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8),

interleucina-18 (IL-18), leptina e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) no tecido

adiposo e no sangue (KAWASAKI et al., 2012; CILDIR et al., 2013). Como em todo

processo endógeno, quando alterado, ocorre a contra-regulação do organismo para

o retorno da homeostasia. Assim, na obsedidade existe um controle endógeno do

processo inflamatório, representado, em especial, pela secreção de resistinas e

adiponectina pelas células adiposas. As resistinas são consideradas pró-

11

inflamatórias, e a adiponectina, um agente anti-inflamatório (MOKROWIECKA et al.,

2013). Estudos demonstram que a diminuição na produção de adiponectina reduz o

metabolismo de lipídeos e de glicose, proporcionando assim um ambiente propício

para o desenvolvimento de distúrbios metabólicos, sendo essencial que ocorra um

equilíbrio na secreção das mesmas (TOVI et al., 2009; KONTIO et al., 2010). Ainda,

a adiponectina diminui a gliconeogênese, o metabolismo de ácidos graxos e

carboidratos, inibe a adesão dos monócitos em células endoteliais, diminui o

acúmulo de lipídios dentro dos macrófagos residentes e induz a produção de NO

(óxido nítrico) levando, assim, a um processo de equilíbrio na inflamação local do

tecido adiposo. Em indivíduos obesos, a secreção de adiponectina encontra-se

diminuída, proporcionando assim um desequilíbrio na sensibilidade à insulina e

aumentando o risco de aterosclerose (JILKOVA et al., 2013; BÖRGESON,

SHARMA, 2013).

Ainda, neste contexto, o fator de transcrição PPAR-γ (peroxisome

proliferator–activated receptor gamma), que faz parte de um grupo de proteínas

nucleares que ativam genes específicos que regulam a diferenciação celular,

desenvolvimento e metabolismo de carboidratos, lipídeos, proteínas e processos

cancerígenos, tem sido considerado de suma importância na regulação da

adipogênese, ativando as adipocinas, o que contribui para a homeostase metabólica

(WANGA et al., 2012; KIM et al., 2013).

Adicionalmente, a expressão de PPAR- γ em fibroblastos direciona a

diferenciação das células em adipócito através da ativação de fatores de transcrição

denominados C/EBPs (CAAT enhancer binding proteins) que se ligam na região

promotora do DNA, atuando sinergicamente no controle da adipogênese e induzindo

na diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos (NOGUEIRA et al., 2004;

GREGOIRE et al., 1998; OSBORNE, 2000). Esses fatores de transcrição ativam

genes no tecido adiposo branco, tais como ap2 (activation protein 2) ligante de

ácidos graxos e a fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) que atuam em

conjunto na diferenciação dessas células (GREGOIRE et al., 1998).

As tiazolidinedionas, também conhecidas como glitazonas, pertencem a uma

classe de fármacos usados no tratamento de DM2. Esses compostos atuam

melhorando a sensibilidade do tecido adiposo à insulina por agirem como agonistas

12

seletivos de receptores de insulina localizados no núcleo celular. O mecanismo de

ação deste fármaco é atuando na ativação de PPARs, sendo mais especifico para o

receptor PPAR- γ, regulando assim o metabolismo glicídico e lipídico, e atividade

anti-inflamatória (NOGUEIRA et al., 2004; GREGOIRE et al., 1998).

Nesse contexto, a avaliação da ativação deste receptor como um regulador

da diferenciação de adipócitos, possui uma alta relevãncia, levando-se em conta o

seu papel na regulação da obesidade.

1.5. Exposição dos PCBs em modelos in vivo de obesidade

A obesidade, como já mencionado, é um co-fator importante no

desenvolvimento de doenças metabólicas, o que a torna uma problemática em

saúde pública. A exposição aos xenobióticos de amplo espectro de toxicidade, tem

sido mencionada na literatura, principalmente em estudos in vivo, como um

importante mediador do agravo da obesidade que contribuem no desenvolvimento

de doenças metabólicas. Nesse contexto, devido a complexidade da realização de

estudos clínicos, modelos in vivo vem sendo empregados e caracterizados para

melhor entender o comportamento e o efeito de xenobíóticos.

Em um estudo realizado por BAKER e colaboradores (2015), em que

camundongos foram expostos ao PCB77, demonstrou um aumento de peso,

alteração na homeostase da glicose, resistência à insulina e inflamação no tecido

adiposo. Adicionalmente, animais knockout para o receptor AhR foram expostos nas

mesmas condições e os efeitos encontrados nos animais, que não eram knockouts

para o receptor, foram revertidos, mostrando uma diminuição de TNF-α e perda de

peso. Os autores concluíram que, ligantes para o receptor AhR, como os PCBs,

regulam a hemeostase do tecido adiposo, corroborando com os dados da literatura

que mostram uma correlação entre exposição aos xenobióticos e potencial ganho de

peso em humanos (BRAWN, LAWTON, 1984; FUKANO, DOGUCHI, 1977, MC

FLARLAND, CLARKE; 1989).

RASHID e colaboradores (2013) mostraram que a exposição ao PCB126

em camundongos fêmeas tem efeito dose-dependente em suas proles. As proles do

sexo feminino, apresentaram um percentual baixo de massa magra, no entanto, um

13

aumento de tecido adiposo, comparado com os filhotes machos que não tiveram

alteração na composição destas variáveis. No entanto, a exposição ao PCB126 não

aumentou o peso dos animais, interferindo apenas na homeostase do tecido adiposo

(RASHID et al., 2015).

Neste contexto, o nosso grupo de pesquisa demonstrou que ratos Wistar

machos expostos via intranasal ao PCB126 por 15 dias, apresentaram um ganho de

peso, porém houve uma redução na massa do tecido adiposo, especificamente na

gordura retroperitoneal e periepididimal. Em conjunto, esses dados sugerem que

esse aumento pode ter ocorrido devido a um edema sistêmico, causado por um

processo inflamatório generalizado. Mostramos também, que houve um aumento na

expressão proteica do receptor AhR em diferentes tecidos, entre os quais o rim, de

animais expostos e também um aumento da creatinina sérica, sugerindo então, que

pode ter ocorrido uma retenção líquida por disfunção renal (Shimada et al., 2015).

Adicionamente outros estudos alertam para os efeitos decorrentes da

exposição aos PCBs e o seu efeito tóxico que podem predispor doenças

metabólicas. Dentre os efeitos podemos citar, doenças hepáticas que podem levar

ao desenvolvimento de esteatose e inflamação sistêmica (WAHLANG et al., 2014),

hiperinsulinemia e resistência à insulina (GRAY et al., 2013) e ainda, alteração na

secreção de adipocitocinas (WAHLANG et al., 2013).

A literatura se mostra controvérsa em estudos in vivo, mostrando que há

ainda muitas dúvidas que pairam no que se refere a exposição aos POPs. Nesse

sentido, é importante elucidar como esses compostos podem contribuir para

distúrbios epigenéticos, estruturais e funcionais de vias que regulam o metabolismo

e a adipogênese. Devido essa relação de exposição aos PCBs e obesidade serem

escassas, estudos adicionais, principalmente in vitro, devem ser realizados com o

intuito de aprofundar nos mecanismos celulares que são afetados pela exposição a

esses compostos.

1.6. Estudo da obesidade em modelos in vitro

Estudos in vitro empregando linhagens de adipócitos são eficientes para

avaliar os processos de diferenciação, proliferação, citoxicidade e expressão de

14

determinados genes responsivos na gênese da obesidade (SCOTT et al., 2011;

BRIONY et al., 2011).

As células 3T3-L1 são um modelo bem caracterizado, amplamente utilizado

e foram isoladas a partir de fibroblastos de embriões de camundongos Swiss 3T3

albinos por Green e Meuth em 1974. Os fibroblastos são células especializadas do

tecido conjuntivo, caracterizadas por extenso prolongamento citoplasmático,

contendo um núcleo claro, grande e de forma ovóide, há a presença de nucléolos

proeminentes, rico em organelas para biossíntese proteica, bem como uma alta

capacidade de diferenciação (POULOS et al., 2010).

Visto a alta capacidade de proliferação e diferenciação das células 3T3-L1,

Green e Meuth (1974) desenvolveram um coquetel de diferenciação capaz de

estimular as células a mudarem morfologicamente para um adipócito maduro.

Assim, essa linhagem vem sendo comumente empregada em projetos de pesquisa

que visam a investigação de parâmetros bioquímicos, imunológicos, moleculares,

genéticos, bem como o estudo da relação da obesidade com a intolerância à glicose

e insulina (KAWASAKI et al., 2012; ZHANG et al., 2013; ELTON et al., 2013).

Na literatura, o uso de células de adipócitos diferenciados a partir de

linhagens de fibroblastos de camundongos são bem descritos e usados de forma

ampla como um modelo de experimentação in vitro como já mencionado (SCOTT et

al., 2011; BRIONY et al., 2011; PRAMANIK et al., 2013, LACOURTABLAISE et al.,

2013).

Estudos relacionados com os PCBs na obesidade ainda são escassos,

sendo que poucos foram realizados com as células de linhagem 3T3-L1. Os estudos

existentes mostram os efeitos de outros congêneres de PCBs, tais como o PCB 28,

PCB 77, PCB 118, PCB 153 e o TCDD, os quais causaram inibição da proliferação

dos adipócitos (TCDD), diferença no acúmulo de PCBs (PCB 28, 118 e 163) no

tecido adiposo, devido a diferença na lipossolubilidade de cada congênere, bem

como o aumento na secreção de citocinas pró-inflamatórias (PCB 77) (OLSEN et al.,

1994; ARSENESCU et al., 2008; BOUREZ et al., 2012; KIM et al., 2012; ROOS et

al., 2012; CETEWAYO et al., 2013). Apesar dos estudos ainda serem escassos,

estes mostram que os PCBs afetam os mecanismos de proliferação, diferenciação e

citotoxicidade. Assim, associados aos dados recentes de que exposição a POPs,

15

entre os quais os PCBs, levam a obesidade e doenças metabólicas, justifica o

entendimento dos mecanismos dos PCBs na obesidade.

16

2. OBJETIVO

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da exposição ao PCB

126 em pré-adipócitos da linhagem 3T3-L1 focando nos mecanismos de morte

celular, proliferação, diferenciação e metabolismo.

17

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Cultura de células 3T3-L1

Os pré-adipócitos 3T3-L1 (CL-173, ATCC®) foram doados pela Profª Drª

Ana Campa, do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade

de São Paulo (FCF-USP). As células foram mantidas em atmosfera de 5% de CO2, a

37ºC em meio Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM; Gibco) contendo 1 g/l de

glicose, suplementado com 10% de soro de bezerro (calf serum – CS; Invitrogen).

3.2 Ensaio para diferenciação das células 3T3-L1

Na diferenciação das células 3T3-L1, os pré-adipócitos foram plaqueados na

densidade de 5 x 104/células por poço e mantidos em estufa de CO2, a 37° C, por 48

horas até que atingissem a confluência de 100%. Em seguida, foram mantidos em

meio de cultura DMEM contendo 4,5g/L de glicose suplementado com 10% de soro

fetal bovino. A este meio foram adicionados 0,5mM de isobutilmetilxantina (IBMX;

Sigma), 1µM de dexametasona (DEX; Sigma) e 1,67µM de insulina (Sigma),

necessários para a diferenciação. Após 72 horas, o meio de cultura foi substituído

novamente, e a cultura mantida por mais 72 horas, totalizando 6 dias.

Posteriormente, a cultura foi mantida em estufa (37°C, 5% CO2, e o meio cultura

(DMEM contendo 4,5g/L de glicose suplementado com 10% de SFB e 1,67µM de

insulina) foi trocado por 2 vezes, a cada 48 horas Todo o procedimento experimental

durou 10 dias (ZHANG et al., 2009).

3.3 Exposição in vitro ao PCB 126

O PCB126 foi inicialmente diluído em Dimetilsulfóxido (0,13%; DMSO) e

seguido de diluição seriada em solução salina estéril. As concentrações de 10, 30,

100 ou 300µM de PCB126 foram adicionados ao pré-adipócito 3T3-L1 ou a célula

adiposa diferenciada. Grupos controles consistiram de células tratadas com meio

DMEM ou Veículo do PCB126 (0,13%; DMS0). Após os períodos de incubação de

18

24, 48 ou 72 horas, as células foram utilizadas para os experimentos descritos a

seguir.

3.4 Geração de espécies reativas de oxigênio

As células 3T3-L1, não diferenciadas, foram incubadas com o PCB126, nas

concentrações de 10, 30 ou 100 µM de PCB126, segundo o trabalho de

ARSENESCU et al., 2008. As células foram incubadas por 24, 48 ou 72 horas em

placas de 24 poços. Após cada tempo de incubação, as células plaqueadas foram

levadas para o fluxo laminar e o sobrenadante foi coletado e armazenado para o uso

em ensaios futuros. Após a coleta do sobrenadante, as células foram lavadas 2x

com PBS (phosphate buffered saline) estéril. Em seguida, todas as células foram

incubadas com DCFH-DA (2, 7, Diacetato de Diclodihidrofluorosceína,

SigmaAldrich®), na concentração de 10µM. Como controle positivo da reação, foi

adicionado solução de peróxido de hidrogênio (H2O2; 10µM, SigmaAldrich®). Após o

período de incubação (1h, 37ºC em estufa de CO2 a 5%), as placas foram

analisadas em espectrofotômetro de fluorescência (Synergy®). A leitura foi realizada

em 490 nm e os resultados comparados em relação ao controle positivo (H2O2).

3.5 Determinação de NO2-

O sobrenadante da cultura de células 3T3-L1 descrita no experimento

anterior foi utilizado para mensurar a produção de NO, pelo ensaio de Greiss que

quantifica o nitrito (NO2-), metabólito estável do NO. Amostras de 100 µL foram

incubadas com 100 µL de reagente de Griess (1% de sulfanilamida, 0,1% de di-

hidrocloridato de nafitiletilenodiamida diluída em ácido fosfórico, SigmaAldrich®) e a

absorbância (550 nm) foi determinada utilizando espectrofotômetro. Os resultados

foram apresentados como µM de NO2- .

19

3.6 Ensaios de citometria de fluxo: viabilidade celular, proliferação celular, fragmentação de DNA e ciclo celular por citometria de fluxo.

Para determinação da curva de crescimento e viabilidade, as células 3T3-L1

foram plaqueadas na densidade de 0,5x104 em placas de 24 poços em meio DMEM

suplementado com 10% de SFB. e aguardou-se o tempo de adesão das mesmas (3

horas). Após este período, as células foram desprendidas da placa com solução de

Tripsina (Atená ®), adicionado meio de cultura DMEM contendo 1 g/L de glicose,

suplementado com 10% de CS (soro de bezerro, Gibco®) Após os tempos de

incubação com PCB126 ou veiculo, em diferentes concentrações, as células foram

coradas com azul de Trypan. As células foram evidenciadas por microscópio de luz

(objetiva de 100x) e a integridade da membrana plasmática foi mensurada pela

ausência de coloração intracelular. Sendo assim, células não coradas pelo azul de

Trypan, foram consideradas viáveis e empregadas para a realização dos ensaios.

Os pré-adipócitos 3T3-L1 não diferenciados foram plaqueados com meio

DMEM contendo 1g/L de glicose e 10% de CS para a realização de um segundo

teste de viabilidade celular por citometria de fluxo. Após atingirem 70% de

confluência, o meio foi retirado e substituído por DMEM 10% de CS. Após 24 ou 72

horas de incubação com PCB 126 ou veículo, as células foram incubadas com

100 µl de anticorpo anti-Anexina V-APC (BD Biosciences) por 20 minutos e,

imediatamente antes da leitura, foi acrescentado 10 µL de Iodeto

de Propídio (50µg/ml Sigma), para análise de citometria de fluxo.

Para avaliação da proliferação celular, os pré-adipócitos 3T3-L1 foram

incubados (15 minutos, 37°C) com solução PBS contendo diacetato de carboxi-

fluoresceína succinimidil éster (CFSE 1%; Invitrogen). Após este período, 1mL de

meio DMEM contendo 1 g/L de glicose, suplementado com 10% de CS foi

adicionado a cada poço, e a placa permaneceu por mais 30 minutos em estufa

(37°C, 5% CO2). Ao término deste período, as células foram lavadas e incubadas

com o meio de cultura acrescido ou não dos tratamentos. Imediatamente após as

incubações, as amostras foram centrifugadas e ressuspendidas em PBS para a

leitura. O monitoramento da proliferação celular foi realizado nos períodos de 24 e

72 horas por citometria de fluxo.

20

Para a análise concomitante de fragmentação do DNA e ciclo celular, os pré-

adipócitos 3T3-L1 não diferenciados foram plaqueados com meio DMEM contendo

1g/l de glicose e 10% de CS. As células foram tratadas com PCB 126 (10, 30 e 100

µM) ou veículo (0,13%) por 24 ou 72 horas, em estufa de CO2 (37°C, 5% CO2).

Após o término dos tratamentos, as células foram coletadas em DMEM contendo

10% de CS, homogeneizadas, transferidas para tubos de citometria e centrifugadas

(600g; 10min; 4°C). O sobrenadante foi desprezado e foram adicionados, a cada

tubo, 50 µL de uma solução contendo a enzima RNAse A (15 mg/mL,

SigmaAldrich®) e 150µL do tampão hipotônico fluorescente (PBS, 2% SFB, 0,05 %

Triton– X100, 0,1% de citrato de sódio, 25 µg/mL de iodeto de propídio). As

amostras foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente. Foi avaliada a

intensidade de fluorescência do iodeto de propídio ligado ao DNA de 10.000 eventos

por amostra por citometria de fluxo.

Todas as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo FACSCanto®

(Becton Dickinson®) e os sinais ópticos emitidos foram convertidos em sinais

eletrônicos, o que permitiu uma leitura computadorizada (Macintosh Apple, San

Jose, CA, USA) pelo software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, TN, USA).

3.7 Quantificação de mediadores inflamatórios

Células 3T3-L1 diferenciadas foram empregadas para quantificação de

citocinas secretadas nos sobrenadantes. Para tanto, as células foram plaqueadas na

densidade de 5x104 e tratadas com PCB 126 nas concentrações de 10, 30, 100, 300

µM ou veículo, por tempo. Adicionalmente, durante o processo de diferenciação a

mesma densidade de células foi plaqueada e as células foram tratadas com o

PCB126 ou veículo (0,13% de DMSO) nas mesmas concentrações, por tempo,

conforme o delineamento experimental descrito anteriormente. Os sobrenadantes

foram coletados para quantificação de mediadores inflamatórios, TNF, MCP-1, IL-1β,

IL-10 e IL-12 utilizando kits comerciais para reação imunoenzimática (ELISA; BD

Pharmigen).

3.8 Quantificação de triglicérides intracelulares pelo corante Oil Red

21

Para determinação de triglicérides, as células 3T3-L1 já diferenciadas em

placas de 12 poços em uma densidade aproximada de 5x104, incubadas com PCB

126 nas concentrações de 100 e 300 µM, veículo 0,13% de DMSO por 24 horas,

foram coradas com uma solução de Oil Red (SigmaAldrich®) à 0,5% (500 mg/100ml

de isopropanol, Biolab®). Para tanto, o meio foi aspirado e as células foram lavadas

com PBS, após, as células foram fixadas com formalina 10% por 15 minutos em

temperatura ambiente (1:10). As células foram lavadas 2x com água destilada por 5

minutos cada. Após o procedimento, as células foram coradas com a solução de Oil

Red descrita acima por 15 minutos. Novamente, as células foram lavadas com água

destilada por três vezes, lavadas com Isopropanol 50% em temperatura ambiente.

As células novamente lavadas com água destiladas uma única vez, fotografadas

com o auxilio de um microscópio invertido de luz com câmera fotográfica acoplada.

Em seguida, foi adicionado 500 µl de metanol e as células incubadas por 20 minutos

para leitura (490 nm) em espectrofotômetro para quantificação de triglicérides intra

celular.

3.9 Avaliação da expressão proteica de PPAR-γ e AhR por Western Blot

3.9.1 Preparação e quantificação das amostras

Imediatamente após os tratamentos dos adipócitos 3T3-L1 maduros com

PCB 126 nas concentrações de 100 e 300 µM, por 24, 48 ou 72 horas, as células

foram coletadas das placas de cultura com o auxilio de cell scraps, lavadas com

PBS 1x e centrifugadas a 600 g, 10 minutos a 4ºC. Após este procedimento, as

amostras foram ressupendidas em 200µL de working solution (Tampão RIPA, PMSF

1 mM e Inibidor de protease 10 µl/ml SigmaAldrich®), homogeneizadas com o

auxílio de um desintegrador ultrassônico e as amostras foram colocadas em tubos

de microcentrifuga, sendo armazenado posteriormente em freezer –80ºC até o

momento das análises. Para a quantificação de proteínas, foi utilizada uma curva

padrão em relação a concentrações conhecidas de albumina com o reagente

Bradford. As amostras foram acondicionadas em placas Elisa e quantificadas em

software específico (SoftMax PRO®).

22

3.9.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições denaturantes

As frações proteicas foram separadas por eletroforese em um gel de

poliacrilamida na presença de SDS, com o auxílio de mini cubas verticais (BioRad®).

Os lisados celulares foram solubilizados em um tampão de amostras (RIPA 60 mM,

glicerol 25%, SDS 2%, azul de bromofenol 0,1%, β-mercaptoetanol 14,4M,

SigmaAldrich®), de maneira a depositar a quantidade desejada de proteínas (50 µg)

em um volume final de 20 µL por poço do gel.

A migração foi iniciada em um gel de aproximadamente 1,5 cm de altura

(Tris-Base 1,5M, pH 8,8; SDS 10%; acrilamida 30%, persulfato de amônia 10% e

TEMED, SigmaAldrich®), sob potencial de 110 V. A eletroforese prosseguiu em um

gel de separação (Tris-Base 1M, pH 8,8; SDS 10%; acrilamida 30%, persulfato de

amônia 10% e TEMED), sob voltagem de 110 V, por 2 horas. A eletroforese foi

conduzida em Tampão de Migração (Tris-Base 250 mM e glicina 960 mM).

3.9.3 Eletro-transferência das proteínas

A eletroforese foi interrompida quando a fonte de migração, visualizada pelo

emprego do marcador de peso molecular (Kaleidoscopio Bio Rad®), atingiu a porção

correspondente a 95 Kda (AhR) e 54 Kda (PPAR-γ). As proteínas do gel foram

transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio Rad®). Para tanto, o gel foi

colocado em um tampão de transferência (Tris 25 mM; glicina 190 mM, metanol 10

%, SigmaAldrich® ), assim como a membrana e o blotting paper (Bio Rad®). Um

“sanduíche” foi produzido da seguinte maneira: uma folha de boltting paper, o gel de

poliacrilamida, a membrana de nitrocelulose, uma outra folha de blotting paper. A

transferência foi realizada a 110 V durante 1 horas a 4.C.

23

3.9.4 Imunodetecção da proteína de interesse

Após o tempo estabelecido para a transferência úmida, a membrana foi

lavada em TTBS (Tris 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,05%, SigmaAldrich®)

por 10 minutos. Em seguida, a membrana foi incubada durante 1 hora em solução

de TTBS acrescida de leite desnatado 5% (p/vol), temperatura ambiente e agitação

constante. Finalmente, a membrana foi incubada com anticorpo primário monoclonal

(Anti-AnR 1:1000 e/ou Anti PPAR-γ, Abcam®) diluídos em leite 3%, sob agitação

constante a 4.C e por um período aproximado de 17 horas.

No dia seguinte, a membrana foi lavada 4 vezes com TTBS por 10 minutos

cada, e o anticorpo secundário anti-mouse (Goat polyclonal secondary antibody to

mouse IgG – H&L ou Anti-Rabbit 1:3000, Abcam®) diluído na proporção de 1:10.000

foi adicionado e a membrana incubada durante 1 hora em temperatura ambiente. O

anticorpo secundário foi removido e a membrana lavada 4 vezes com TTBS durante

10 minutos e seguida de uma lavagem final com TBS por 10 minutos.

Em etapa subsequente, foi realizada a reação de quimioluminescência com

kit ECL (Perkin Elmer®) para detecção das proteínas para posterior quantificação. A

membrana então foi colocada em solução do kit por 1 minuto para reagir, e em

seguida rapidamente transferida para um cassete (Amersham®) para revelação. O

tempo de exposição no filme apropriado para ECL (Amersham®) foi de 2 minutos

para avaliação dos produtos proteicos de genes que codificam para os receptores

aril hidrocarboneto, de 25 segundos para a β- actina e de 2 minutos para PPAR-γ,

seguindo-se de revelação por 5 minutos, lavagem em água destilada por 30

segundos e fixação por 10 minutos. Em seguida, os filmes foram lavados em água

corrente por 10 minutos, aguardando-se o tempo para secagem.

As membranas foram lavadas com uma solução stripping de acido acético à

5% para retirada dos anticorpos que marcaram para o receptor anti-AhR. Para tanto,

as membranas foram lavadas em acido acético à 5% por 10 minutos, em

temperatura ambiente, sob agitação constante. Transcorrido este período, as

membranas foram novamente lavadas 2 vezes em TTBS, temperatura ambiente por

10 minutos, e bloqueadas com leite 5% TTBS por 1 hora em temperatura ambiente.

Foi realizada então a incubação com anticorpo conjugado da β-actina (anti- β-actina,

1:30.000, e ou/ PPAR-γ, Abcam®) diluído em TTBS, por 45 minutos ou overnight,

24

temperatura ambiente sob agitação constante. Finalmente, as membranas foram

lavadas 4 vezes em TTBS por 10 minutos. Em seguida foi feita a reação ECL e

fotografia das membranas como anteriormente descrito, porém o tempo de

exposição do filme no cassete foi de apenas 5 segundos.

Após a obtenção dos filmes, as bandas foram quantificadas por

densitometria em um software específico (Image J ®) e realizada a normalização em

relação à proteína constitutiva (β-actina).

25

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos estão representados como média ± erro padrão da

média (e.p.m) e foram analisados estatisticamente pela Análise de variância de 1 via

ou de 2 vias com comparações múltiplas (ANOVA), seguido do teste Newman-Keuls

ou Bonforroni quando necessário. Para tanto, foi utilizado o programa estatístico

Graph Pad Prism 5.0.

26

5. RESULTADOS

5.1 Efeito dos tratamentos com PCB126 sobre a viabilidade e proliferação celular

Os resultados obtidos mostram que a exposição ao PCB126, nas

concentrações de 10, 30 ou 100 µM, não alterou a viabilidade celular em todos os

tempos estudados (Figura 3A, B e C), nem a proliferação celular, como visualizada

na Figura 3D.

Figura 3 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a viabilidade e proliferação de células 3T3-L1.

Os gráficos representam a viabilidade (A, B e C) e curva de crescimento (D) de células 3T3-L1 não diferenciadas, tratadas com PCB 126, veículo (DMSO 0,13%) ou meio de cultura DMEM. O dados obtidos representam a média ± e.p.m. de 5 ensaios realizados em triplicata. Para a análise estatística da viabilidade celular utilizou-se o teste de ANOVA 1 via com o pós teste de Newman-Keuls e para a curva de crescimento celular foi empregado o teste de ANOVA de 2 vias com pós-teste de Bonferroni.

A)# B)#

C)# D)#

27

Para investigar se a exposição ao PCB126 poderia induzir morte por

apoptose ou necrose, foi realizado ensaio pela marcação com anti-anexina V e PI e

subsequente análise por citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostram que

exposição ao PCB126, em todas as concentrações empregadas, não alterou o

número de células em necrose ou apoptose tardia. Por outro lado, os tratamentos

com as concentrações de 30 e 100 µM de PCB 126 reduziram a porcentagem de

células em apoptose em relação ao grupo controle, mas não alterou a porcentagem

de células em necrose ou apoptose tardia (Figura 4 A e B).

Figura 4 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a apoptose e necrose de células 3T3-L1.

As análises foram realizadas pela marcação por anexina V ou PI, e mensuradas por citometria de fluxo. Os dados indicam a média ± e.p.m. de 3 ensaios em duplicata. Para análise estatística foram realizados os testes de ANOVA 2 vias seguido pelo pós teste de Bonferroni (*P< 0,05, **P< 0,01, vs células incubadas com DMEM ou veículo).

A)

**"**"*"

B) !

**!

28

5.2 Efeito da exposição ao PCB126 sobre o ciclo celular e fragmentação do DNA

Para a avaliação do ciclo celular, e concomitantemente análise da

fragmentação do DNA, as células 3T3-L1 foram cultivadas em placas de 24 poços

aproximadamente na densidade de 0,5x104 e incubadas com os tratamentos já

citados, pelos períodos de 24 ou 72 horas. A avaliação da fragmentação do ciclo

celular foi realizado pelo citômetro e analisadas no Software Flow Jow, onde

selecionou-se faixas diferentes para a obtenção dos resultados de fragmentação. Os

dados apresentados na Figura 5 A e B mostram que as exposições ao PCB 126 ou

veículo não causaram alterações no ciclo celular. No entanto, a Figura 5 C mostra

que as exposições ao veículo ou PCB 126 causaram fragmentação do DNA após

24h, mas não após 72 horas (Figura 5D). No entanto, a fragmentação causada pelas

diferentes concentrações de PCB126 foi maior que a causada pelo veículo.

Figura 5 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre o ciclo celular e fragmentação do DNA de células 3T3-L1.

As Figuras 5A e 5B representam o percentual de células no estágio G1/G0, S e G2 das fases do ciclo celular. As figuras 5C e 5D representam o percentual de células com DNA fragmentado. Os dados mostrados indicam a média ± e.p.m. de 3 ensaios em triplicata. Para

DMEM$ Veículo$$ 10$ 30$ 100!PCB$126$(μM)!

DMEM$ Veículo$$ 10$ 30$ 100!PCB$126$(μM)!

DMEM$Veículo$0,13%$10$30$100!

PCB$126$(μM)!

DMEM$Veículo$0,13%$10$30$100!

PCB$126$(μM)!

29

a análise estatística foi utilizado o teste de ANOVA 1 Via, seguido de pós teste de Newman-Keuls. (* P<0,05 ; **P<0,01 ***P<0,001 vs DMEM).

5.3 Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS)

Os resultados apresentados na Figura 6 mostram que as células expostas

ao PCB 126, nas concentrações de 10, 30 ou 100µM, não apresentatram alterações

na produção ROS em nenhum dos tempos de incubação estudados. A adição de

H202 aumentou a geração de espécies reativas e foi utilizada como controle positivo

da reação.

Figura 6 - Efeitos da exposição ao PCB126 sobre a geração de espécies reativas de oxigênio por células 3T3-L1

A intensidade de fluorescência emitida por células 3T3-L1 (densidade 0,5 x 104) pré-tratadas com PCB 126 foi analisada por espectrofotômetro de fluorescência. Os dados indicam a média ± e.p.m. de 2 ensaios realizados em triplicada. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 1 Via seguido de pós teste de Newman-Keuls ( **P<0,01 vs DMEM, Veículo, PCB 10, 30 ou 100 µM).

H2O2$ DMEM$ Veículo$ 10$ 100$30$PCB$126$(μM)$

1000$

2000$

3000$

0$

(Intensidad

e$de

$fluo

rescên

cia)$$

DCFH

$

H2O2$ DMEM$ Veículo$ 10$ 100$30$PCB$126$(μM)$

1000$

2000$

3000$

0$

(Intensidad

e$de

$fluo

rescên

cia)$$

DCFH

$

1000#

2000#

3000#

0#

(Intensidad

e#de

#fluo

rescên

cia)##

DCFH

#

H2O2# DMEM# Veículo# 10# 100#30#PCB#126#(μM)#

30

5.4 Efeitos do tratamento com PCB126 sobre a geração de NO2-

Os resultados obtidos mostram que a exposição a concentração de 100µM

de PCB126 não alterou a geração de NO2- no sobrenadante de células 3T3-L1. Por

outro lado, o tratamento com a concentração de 300µM aumentou a quantidade de

NO2- em 24 e 48h de incubação (Figura 7).

Figura 7 - Efeito da exposição ao PCB 126 sobre a produção de NO por células 3T3-L1

As células foram incubadas com PCB 126 por 24, 48 ou 72 horas. O NO2- foi mensurado no sobrenadante das células tratadas por reação de Griess. Os resultados indicam a média ± e.p.m. de 4 ensaios realizados em uniplicata. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 2 Vias seguido do pós teste de Bonferroni (*P<0,05 vs DMEM).

5.5 Efeitos do tratamento com PCB 126 sobre a secreção de mediadores inflamatórios

5.5.1 Proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1)

Os resultados mostram que não houve alteração na concentração de MCP-1

secretada pelos adipócitos (células diferenciadas) após exposição ao PCB 126 nas

concentrações de 100 ou 300 µM (Figura 8).

24h 48h 72h0

5

10

15

20DMEMVeículoPCB10 µMPCB30 µM

*P<0,05 vs. DMEM e Veículo One-way ANOVA

**

NO

2- (µ

M)

DMEM$Veículo$0,13%$100$300$

PCB$126$(μM)$

***"***"

24h 48h 72h0

5

10

15


*P<0,05 vs. DMEM e Veículo One-way ANOVA

**

NO

2- (µ

M)

DMEM$Veículo$0,13%$100$300$

PCB$126$(μM)$

A)#

B)#

31

Figura 8 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de MCP-1 por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

A mensuração de MCP-1 foi realizado no sobrenadante das células por ELISA. Os resultados indicam a média ± e.p.m. de 4 ensaios realizados em uniplicata. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 2 Vias seguido do pós teste de Bonferroni e/ou teste ANOVA de 1 Via com pós teste de Newman-Keuls

5.5.2 Fator de Necrose Tumoral (TNF)

Os resultados obtidos na Figura 9 A mostram que a exposição ao PCB126

não causou alteração na secreção de TNF-alfa em células 3T3-L1 após incubação

por 24 ou 48 horas após a diferenciação. No entanto, observou-se aumento da

concentração do mediador 72 horas após a incubação com 100 e 300µM de

PCB126 (Figura 9).

32

Figura 9 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de TNF-alfa por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

A mensuração do TNF-alfa foi realizada no sobrenadante das células por ELISA. Os resultados indicam a média ± e.p.m.de 4 ensaios realizados em uniplicata. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 2 Vias seguido do pós teste de Bonferroni e/ou teste ANOVA de 1 Via com pós teste de Newman-Keuls (*P<0,05 vs DMEM e Veículo).

5.5.3 Interleucina 12 (IL-12)

Os resultados apresentados abaixo mostram que não houve alteração na

secreção de IL-12 em células diferenciadas tratadas com PCB126 por 24 ou 48

horas. No entanto, o tratamento com PCB126 causou aumento deste mediador

inflamatório após 72 horas de exposição, na concentração de 300µM (Figura10). .

TNF$(pg/ml)$

33

Figura 10 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de IL-12 por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

A mensuração de IL-12 foi realizada no sobrenadante das células por ELISA. Os resultados indicam a média ± e.p.m. de 4 ensaios realizados em uniplicata. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 2 Vias seguido do pós teste de Bonferroni e/ou teste ANOVA de 1 Via com pós teste de Newman-Keuls (*P<0,05 vs DMEM).

5.5.4 Interleucina 1 beta (IL-1β)

Os resultados apresentados na Figura 11 revelam que não houve alteração

na secreção de IL-1β nas células diferenciadas e tratadas com PCB126 após 24 ou

48h de exposição. No entanto, houve diminuição na secreção deste mediador após

72 horas de tratamento com 300µM PCB126.

34

Figura 11 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de IL-1β por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

A mensuração de IL-1β foi realizada no sobrenadante das células por ELISA. Os resultados indicam a média de 3 ensaios realizados em uniplicata. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 2 Vias seguido do pós teste de Bonferroni e/ou teste ANOVA de 1 Via com pós teste de Newman-Keuls (*P < 0,05 vs os demais grupos).

5.5.5 Interleucina 10 (IL-10)

Os resultados apresentados na Figura 12 mostram diminuição na secreção de

IL-10 após exposição de 300 µM de PCB126 por 24h; de 100 µM ou 300 µM por

48h e de 100 µM por 72 h.

24h 48h 72h0

50

100

150

200


*

*P<0,05 vs. DMEM, Veículo e PCB10 One-way ANOVA

IL-1

beta

(pg/

ml)

DMEM$Veículo$100$300$ PCB$126$(μM)$

35

Figura 12 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a secreção de IL-10 por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

A mensuração de IL-10 foi realizada no sobrenadante das células por ELISA. Os resultados indicam a média de 3 ensaios realizados em uniplicata. Para a análise estatística foi realizado o teste de ANOVA 2 Vias seguido do pós teste de Bonferroni e/ou teste ANOVA de 1 Via seguido de pós teste de Newman-Keuls (*P<0,05 vs DMEM).

5.6 Efeito dos tratamentos com PCB126 sobre expressão do receptor proliferador de peroxisoma-gamma (PPAR-γ) e Aril hidrocarboneto (AhR).

Os resultados obtidos mostram que houve aumento na expressão proteica

do receptor PPAR-γ (Figura 13) em células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos,

quando estas foram incubadas com as concentrações de 100 ou 300 µM por 24 ou

72 h. Em relação ao receptor AhR, os resultados obtidos mostraram aumento na

expressão proteica apenas após incubação com 300 µM PCB126 por 72 horas

(Figura 14).

36

Figura 13 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a expressão protéica de PPAR-γ por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

Os gráficos em barras representam os valores de densidade óptica relativa para a expressão proteica de PPAR-gamma, padrão de bandas em gel, seguido de reação ECL e revelação, sendo os valores normalizados em relação à β-Actina (*P< 0.05 vs veículo e DMEM+SFB, n=4 (A), *P< 0.05 vs DMEM+SFB (C), n=8).

DMEM$ Veículo$ 100$ 300$

C)$ PPAR4γ$72$horas$

PCB$126$(μM)$

PPAR$%γ%24%HORAS%A)%

DMEM% Veículo% 100% 300%PCB%126%(μM)%

B)# PPAR'γ#48#horas#

DMEM# Veículo# 100# 300#PCB#126#(μM)#

37

Figura 14 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre a expressão protéica de AhR por células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos.

Os gráficos em barras representam os valores de densidade óptica relativa para a expressão proteica de AhR, padrão de bandas em gel, seguido de reação ECL e revelação, sendo os valores normalizados em relação à β-Actina (*P< 0.05 vs veículo e DMEM+SFB, n=4 (A), *P< 0.05 vs DMEM+SFB (C), n=8). (*P< 0.05 vs veículo e DMEM+SFB (C), n=4).

5.7 Efeito do tratamento com PCB126 sobre o acúmulo de triglicérides avaliado pelo corante Oil Red.

Os resultados obtidos mostram aumento no acúmulo de triglicérides pelas

células 3T3-L1 quando submetidas a exposição ao PCB 126 nas concentrações de

100 e 300 µM por período de 24, 48 ou 72 horas (Figuras 15 e 16).

DMEM$ Veículo$ 100$ 300$PCB$126$(μM)$



AhR$72$horas$

38

Figura 15 - Efeito da exposição ao PCB126 sobre o conteúdo de triglicérides em adipócitos diferenciados.

39

As figuras representam as micrografias das células coradas com o corante Oil Red, após exposição ao PCB126 ou Veículo 0,13% (DMSO), aumento de 40x. Na imagem A, B e C, mostra-se o aumento de triglicérides dos grupos tratados com PCB126 em relação ao grupo grupo controle (DMEM).

40

Figura 16 - Efeito da exposição ao PCB126 sob o conteúdo de triglicérides em adipócitos diferenciados.

O resultado representa o percentual através do espectro de 490 nm quantificado com o auxilio de um espectrofotômetro. Para a análise estatística foi utilizado o teste de ANOVA 1 Via, seguido de pós teste de Newman-Keuls (*** = p < 0,0001 vs DMEM (24 e 48 horas); # = p < 0,0001 Veículo (24 e 48 horas); + = p < 0,0001 vs PCB 100 µM; *** = p < 0,001 vs DMEM (72 horas); # = p < 0,001 vs DMEM (72 horas).

DMEM$ Veículo$$ 300$100$PCB$126$(μM)$



41

6 DISCUSSÃO

Como já mencionado, os PCBs compõem o grupo dos POPs e são

xenobióticos importantes para saúde pública. São compostos persistentes, de difícil

degradação e eliminação por terem características biomagnificantes e

bioacumulantes e causarem toxicidade (NOYES et al., 2009).

Entre os efeitos tóxicos dos POPs se destacam a carcinogenicidade e

imunotoxicidade (SHIN et al., 2004), porém, estudos recentes correlacionam

positivamente a exposição à poluentes a síndromes metabólicas, dentre as quais se

destaca a obesidade (MÜLLEROVÁ KOPECKÝ, 2007; RUSIECKI et al., 2008;

LANGER et al., 2014). Adicionalmente, estudos mostram a capacidade de acúmulo

de PCB126 no tecido adiposo (BOUREZ et al., 2012, KIM et al., 2012), bem como a

relação entre alterações dos parâmetros inflamatórios neste tecido e sua correlação

com a obesidade (PEREIRA-FERNANDES et al., 2014). No presente trabalho

reforçamos estas evidências, uma vez que a exposição in vitro do PCB126 com

células 3T3-L1 reduziu a porcentagem de células em apoptose, induziu parâmetros

inflamatórios e desencadeou mecanismos envolvidos na obesidade.

Células 3T3-L1 são fibroblastos, que ao receberem um coquetel adipogênico

se diferenciam em adipócitos, levando à síntese progressiva de lipídeos, atingindo

assim a forma de um adipócito maduro. O coquetel adipogênico é composto por

dexametasona, que irá ativar os receptores de glicocorticoides, a isobutil-metil-

xantina (IBMX) que é um inibidor não-específico de AMPc (Adenosina Monofosfato

Cíclico), GMP (Guanosina Monofosfato) e fosfodiesterases que leva à diminuição da

proliferação, aumento da diferenciação e a indução da apoptose. A presença da

insulina no coquetel adipogênico irá influenciar na síntese de lipídeos nos pré-

adipócitos e levará a formação das características morfológicas de um adipócito

maduro (BRIONY et al., 2011; LEFILS-LACOURTABLAISE et al., 2013). São células

amplamente utilizadas para o estudo dos mecanismos da obesidade e de doenças

metabólicas (ELSEN et al., 1994, HAUNER, LÖFFLER, 1986; KIM, NTAMBI, 1999;

MACDOUGALD et al., 1995; RUAN et al., 2002; WOLF, 1999).

42

As concentrações de PCB126 empregados neste trabalho foram escolhidas

a partir de dados preliminares do laboratório, uma vez que não há estudo in vitro

com PCB126 em células adipogências. Somente, ARSENESCU e colaboradores

(2008) mostraram que o tratamento com PCB77 em células 3T3-L1, na

concentração de 3 µM, é capaz de ativar o receptor AhR, estimulando a

diferenciação de adipócitos bem como aumentando a secreção de adipocinas pró-

inflamatórias. Já em alta concentração do mesmo congênere, 68µM, inibe a

diferenciação das células 3T3-L1 em adipócitos.

Nos ensaios prévios realizados com as células 3T3-L1, realizou-se uma

curva de crescimento para a determinação da densidade celular que seria usada em

futuros experimentos. A curva de crescimento é caracterizada por três fases, sendo

a primeira, a fase de Latência (LAG) que é definida por um crescimento lento das

células onde as mesmas normalmente são transferidas de criotubos para garrafas

ou placas de cultura, mantendo assim um meio nutritivo para as células, bem como

as condições necessárias para a proliferação celular em estufa controlada. Após a

fase LAG, ocorre o inicio da fase exponencial (EXP), as células apresentarão um

crescimento constante até chegar em sua última fase, conhecida como

desaceleração, ocorrendo um declínio na curva de crescimento em decorrência do

sombreamento celular pela justaposição das células, da carência de espaço e/ou de

nutrientes. Em conjunto, estes aspectos levam à apoptose (DULBECCO, VOGT,

1954; BUCHANAN et al., 1997). Nossos resultados iniciais mostraram que as

concentrações utilizadas, de fato, não alteraram o perfil de crescimento celular,

sendo as concentrações de escolha para dar seguimento ao estudo.

Uma vez concluída a curva de crescimento, investigou-se a viabilidade pela

técnica de citometria de fluxo, pela marcação com anti-anexina V e PI, e os

resultados obtidos mostraram a habilidade do PCB126 em inibir a apoptose das

células 3T3-L1. A Anexina V é um marcador de apoptose, que caracteriza a

expressão de fosfatitilserina na membrana celular pelas células que estão neste

processo, fazendo com que ocorra a ligação da Anexina V que é conjugada com um

fluoróforo. O iodeto de propídio se liga ao material genético da célula, que está com

a membrana rompida ou danificada, sendo assim, um marcador de células que

estão em necrose (VANDEN BERGHE et al., 2013).

43

A apoptose é um processo fisiológico ou não de morte programada e está

associada a embriogênese, morfogênese, diferenciação e reciclagem celular

(ELMORE, 2007). A apoptose também é conhecida como um mecanismo de defesa

contra agentes nocivos causadores de câncer, com o intuito de fazer com que a

célula lesionada não se divida, entrando assim, no processo de apoptose

(GEHMERT et al., 2014). As vias de ativação da mesma são altamente controladas

por mecanismos intracelulares, o que caracterizam as duas vias da apoptose, a via

intrínseca e extrínseca. A via intrínseca, se inicia na mitocôndria pela liberação de

segundos mensageiros pró-apoptóticos, devido ao contato da célula com agentes

químicos, alteração de pH, xenobióticos e fármacos que alteram a permeabilidade

da membrana mitocondrial, levando assim a ativação da via intrínseca (GEHMERT

et al., 2014). Os indutores do aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial

são as ROS, NO, concentrações elevadas de cálcio, ácidos graxos, ceramidas, luz

UV, toxinas, glicocorticoides, protoporfirina IX, clorodiazepam, ausência de fatores

de crescimento e danos ao DNA (NIKOLETOPOULOU et al., 2013).

O grupo de pesquisa liderado pelo Dr. GREGORASZCZUK tem mostrado o

papel de diferentes PCBs na esteroidogenese in vitro, e neste contexto mostraram

que o PCB126 acumula-se em folículos pre-ovulatórios (GREGORASZCZUK et al.,

2003a) e inibe a apoptose de células da teca e granulosa, que são células que

compõem o folículo ovariano, responsáveis por manter a homeostase hormonal dos

ovários, controlando a ovulação pela liberação de estrógeno, progesterona e

testosterona (GREGORASZCZUK et al., 2003b). Adicionalmente, este grupo

mostrou que a redução da produção hormonal e inibição da apoptose podem estar

relacionados a expressão de AhR em células da teca e granulosa (WOJTOWICZ et

al., 2005; GREGORASZCZUK et al., 2008). Nossos resultados corroboram a inibição

da apoptose em células 3T3-L1, mas se este está relacionado a expressão de AhR

não está determinada, uma vez que não realizamos ensaios para a expressão de

AhR em adipócitos não diferenciados expostos ao PCB126.

Na tentativa de elucidar este efeito, visamos investigar as fases do ciclo

celular e a fragmentação do DNA. O ciclo celular é composto por 2 fases, sendo elas

mitose e intérfase. A mitose é a fase que caracteriza dois eventos significativos que

correspondem a separação dos cromossomos e a divisão da célula em duas, o que

caracteriza a citocinese, sendo esse processo denominado de fase M (Mitose). A

44

fase M é onde ocorre uma progressiva condensação dos cromossomos que vão se

tornando menores e mais espessos ao longo do processo, impossibilitando o

emaranhamento. A intérfase é o período em que a célula passa de uma fase M para

a seguinte fase, que caracteriza um aumento significante no metabolismo da célula

que é dividido posteriormente em 3 fases do ciclo celular (NURSE et al., 2002). A

fase G1, que é a fase antecessora à fase M, que é caracterizada pela

descondensação dos cromossomos, sendo que nesta fase a célula está

metabolicamente ativa e crescendo, porém não ocorre a replicação do material

genético. Esta fase é de suma importância, caracterizada por síntese de proteínas e

RNA, o que deixará a célula preparada para entrar na próxima fase ou entrar em um

estado quiescente (G0) (MARTIN et al., 2009). Após a fase G1, a célula entra na

fase S, de síntese, fase pela qual possui uma alta replicação do DNA e,

subsequentemente, após a célula replicar o seu material genético, entrará na fase

G2. Na fase G2 são sintetizadas proteínas não-histônicas que se associam ao

cromossomo durante a condensação na mitose, acumulando o fator promotor de

maturação (MPF) e respectiva síntese de RNA (MARTIN et al., 2009).

Uma das formas de se avaliar o ciclo celular é por citometria de fluxo, onde

se utiliza o iodeto de propideo (PI) ligado a fluoróforo, juntamente com uma enzima

digestiva, a RNAse A (Ribonuclease A). A RNAse A é empregada para digerir o RNA

formado pela transcrição e expor somente o material genético para que ocorra a

ligação por PI e, assim ser analisado por citômetro de fluxo mensurando-se a

intensidade de florescência emitida pelas células, podendo se avaliar as fase de

G1/G0, S e G2/M (DEINLEIN et al., 1985). Nossos resultados mostram que a

exposição das células não diferenciadas 3T3-L1 com PCB126, não alterou o ciclo

celular. Entretanto, em estudo realizado por WEI e colaboradores em 2012, mostra

que a exposição ao PCB126 em diferentes concentrações in vitro em células de

hepatoma humano aumenta o número de células marcadas em G0/G1, mas diminui

o número de células marcadas na fase S. Porém, uma justificativa para a não

alteração do ciclo celular no presente estudo, é o fato de se utilizar uma outra

linhagem, bem como outras concentrações de PCB126.

A fragmentação do DNA é classificada como um indicativo de estímulos

provenientes de xenobióticos ou não, que levam a apoptose e/ou necrose (AITKEN,

KRAUSZ., 2001; EVENSON et al., 2005). Agentes nocivos capazes de alterar a

45

fragmentação do DNA, principalmente POPs, têm sido mostrados na literatura,

revelando assim, o seu potencial neoplásico (KIM et al., 2002; SHIM et al., 2004;

ROVEDA et al., 2006, NATIONAL TOXICOLOGY PROGRAM, 2006; COLLOTTA et

al., 2013). Nossos resultados mostram que o PCB 126 têm a capacidade de

fragmentar o DNA nas primeiras 24 horas de incubação, sendo que nas fases

posteriores pode ter ocorrido reparo, uma vez que não foi observada fragmentação

do DNA em 72 horas de incubação. Este pode ser um mecanismo responsável, pelo

menos em parte, pela ausência de morte celular por apoptose e necrose, observada

em nosso estudo.

Uma vez que verificamos alterações na apoptose, bem como na

fragmentação do DNA, fomos verificar a formação de EROs e de NO pelos

tratamentos com PCB126. As espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, dentre

outras espécies reativas, fazem parte do processo de metabolismo, sendo

observados em condições fisiológicas e patológicas. O estresse oxidativo é

consequência do desequilíbrio entre o sistema pró e anti oxidante, sendo que a

intensa liberação de EROs pode ocasionar lesão celular (HARTMAN et al., 2013).

O DCFH-DA (2,7– Dicloro-dihidro-fluoresceina) é utilizado como um

indicador da formação de peroxinitrito, dentre outras espécies reativas de oxigênio,

para a mensuração da ativação do burst oxidativo. Após a clivagem enzimática por

bases dos grupos diacetato em contato com EROs, ocorre a oxidação do DCFH em

diclorofluorosceína, um produto que é altamente fluorescente, sendo que esta

reação pode ser mensurada em um espectrofotômetro de florescência (RASTOGI et

al., 2013). Na avaliação da ativação do burst oxidativo não houve alteração na

geração de EROS nos pré-adipócitos tratados com PCB126 nas concentrações

utilizadas neste trabalho. Diferentemente, houve aumento na produção de NO

quando as células foram expostas a 300µM de PCB126, mas a elevação não foi de

grande magnitude. Esta diferença vale ser ressaltada porque o NO possui efeito

celular dual, ou seja, pode ser protetor ou citotóxico, dependente da fonte de

produção e concentrações no sítio de ação. Sabe-se que baixas concentrações, até

10µM são protetoras da toxicidade e inibidoras da apoptose (HAENDELER et al.,

1997), enquanto que concentrações altas (150 µM e 300 µM ) levam a morte celular

(LI et al., 2006). Assim, é possível que o NO secretado por células expostas ao

PCB126 possa contribuir para a inibição da apoptose aqui detectada.

46

Diferentemente, foi observado que concentrações mais elevadas de PCB126

causaram a morte celular por apoptose em condrócitos e em zebra fish via a

geração de EROS e de NO, sendo que este último foi produzido em altas

concentrações, via ativação da enzima óxido nítrico sintase induzível (Lee, Yang,

2012; Liu et al., 2015).

Em conjunto, os resultados obtidos em células 3T3-L1 não diferenciadas

mostram que a exposição ao PCB126 protegeu as células da apoptose,

possivelmente por mecanismos de reparo do DNA e induziu a produção de NO.

Estes resultados são mostrados pela primeira vez em células adipogênicas, e

podem indicar um mecanismo relacionado a obesidade, uma vez que pode favorecer

a manutenção destas células e a diferenciação das mesmas. Ainda, corrobora os

dados obtidos em células foliculares (GREGORASZCZUK, 2003a, b; WOJTOWICZ

et al., 2005; GREGORASZCZUK, et al., 2008) e da inibição da apoptose em células

cancerosas da linhagem MCF-17, observada após a exposição aos PCBs 118, 138,

153 ou 180. Neste último caso, o mecanismo parece estar relacionado à inibição de

caspase 9 (PTAK et al., 2011).

Como já mencionado, os pré-adipócitos 3T3-L1 são um bom modelo para a

investigação dos mecanismos que envolvem a obesidade in vitro (BOUREZ et al.,

2012). Na literatura existem poucos estudos que relacionam a exposição aos PCBs

usando as células 3T3-L1 diferenciadas em adipócitos ou não, porém sabe-se que

os PCBs acumulam-se no tecido adiposo e promovem uma série de alterações que

causam disfunções no metabolismo lipídico e, concomitantemente, podem levar a

doenças tais como DM2, aterosclerose, disfunções cardíacas, dentre outras

(ARSENESCU et al., 2008; KIM et al., 2012; TAXVIG et al., 2013; SALES et al.,

2013).

A obesidade é caracterizada como um acúmulo de gordura branca excessiva

nos adipócitos que excede ao gasto energético (OLSEN et al., 1998). As funções do

tecido adiposo incluem o armazenamento de lipídios e isolamento térmico, no

entanto, em 1994 foi descrito por ZHANG (1994), que o tecido adiposo é também um

órgão endócrino, capaz de secretar hormônios como a leptina, uma adipocina

(hormônio secretado também pelo tecido adiposo) que exibe um potente efeito na

prevenção da obesidade (ZHANG et al., 1994).

47

Nas últimas décadas, outras adipocinas têm sido descritas como

reguladoras sistêmicas críticas de lipídeos e na homeostase da glicose. As

adipocinas medeiam a resposta entre o tecido adiposo e outros órgãos chaves do

metabolismo, tais como o fígado, músculo e pâncreas, assim como o sistema

nervoso central (ROSEN, SPIEGELMAN, 2006). Além dessa característica

endócrina, o tecido adiposo medeia a resposta inflamatória, pela liberação de

citocinas, tais como, o TNF-α, IL-6, MCP-1, proteína C- reativa, dentre outros

(TILMIR et al., 2013; CAO, 2014).

Assim, neste trabalho investigamos se a exposição ao PCB126 poderia

alterar a secreção de mediadores inflamatórios que favorecem a adipogênese. A

MCP-1 é secretada em diferentes tecidos, entre os quais o adiposo, com papel no

recrutamento de monócitos para o tecido injuriado. Está aumentada em indivíduos

obesos, proporcionando um quadro de inflamação crônica, característico da

obesidade (CURTIS et al., 2014). Sabe-se que os PCBs são capazes de alterar a

secreção de MCP-1, uma vez que demonstrou-se que células da linhagem HUVEC

expostas ao PCB 104 (20µM) apresentaram um aumento na expressão do RNAm

para MCP-1 (CHOI et al., 2003). No entanto, no modelo empregado neste trabalho,

não houve alteração na secreção desta quimiocina pelas células 3T3-L1

diferenciadas.

O TNF-α também é um dos mediadores secretados pelo tecido adiposo

responsável por uma resposta pró-inflamatória, pois induz o recrutamento de

neutrófilos e monócitos para locais de infecção, além de induzir a secreção de

diferentes citocinas (ZHAO et al., 2008). Ainda, possui um papel fundamental na

resistência à insulina no tecido adiposo, também característico da obesidade

(HOTAMISLIGIL et al., 2006). Os dados aqui encontrados mostram o papel do

PCB126 sobre a secreção deste mediador pelos adipócitos 3T3-L1. De fato, em

estudo realizado com o PCB77 in vitro e in vivo mostra que ocorre um aumento na

concentração de TNFα em ratos obesos e em adipócitos 3T3-L1 expostos a esse

congênere, por aumentar o RNAm que codifica para o receptor de TNF-α, sendo que

esta ação é mediada via receptor AhR, o que contribui também para uma

intolerância à glicose e insulina (BAKER et al., 2013). KIM e colaboradores (2012)

realizaram um estudo, onde adipócitos 3T3-L1 foram submetidos a tratamento com

TCDD e PCB126, no qual observaram aumento na expressão de RNAm que codifica

48

para o receptor de diversos mediadores pró-inflamatórios, incluindo para o TNF.

Neste mesmo estudo, ainda realizou-se estudo in vivo, onde a dioxina foi

administrada em camundongos e observou-se aumento na expressão de TNF-α,

assim como encontrado nas células 3T3-L1 diferenciadas. Este efeito não foi

encontrado em camundongos knouckout para AhR, mostrando assim o importante

papel do receptor AhR na toxicidade mediada pelo PCB126 (KIM et al., 2012).

A IL-12 está relacionada a ativação de macrófagos após ter sido ativada

pelas células apresentadoras de antígeno (APC), sendo que a sua principal função é

aumentar a secreção de interferon-gama pelas células Natural Killers e pelos

linfócitos T auxiliares, sendo assim, a liberação de IL-12 promove ações para que

ocorra a erradicação de microrganismos pela ativação da resposta imune (SAGGINI

et al., 2011; VADACCA et al., 2011). Da mesma forma que o observado para o TNF-

α, a concentração de IL-12 foi aumentada no sobrenadante de células adiposas

3T3-L1 expostas ao PCB126, contribuindo para a hipótese de que o PCB126 ative

vias inflamatórias em células 3T3-L1.

A IL-1 β é uma citocina pró-inflamatória que está envolvida em diferentes

atividades celulares, incluindo a proliferação celular, diferenciação e apoptose

(GERY et al., 1972). Os dados aqui apresentados mostram que a exposição ao

PCB126 diminuiu a secreção deste mediador por células 3T3-L1. Este dado difere

dos encontrados anteriormente, e estudos adicionais deverão ser realizados para

melhor elucidação deste resultado.

A IL-10 é conhecida por inibir a ação do TNF-α, sendo que a mesma está

envolvida no controle das reações da imunidade natural e imunidade mediada por

células, principalmente as respostas que envolvem o macrófago (TATEYA et al.,

2011). Desta forma, a IL-10 é conhecida como uma citocina anti-inflamatória,

secretada por diferentes células no decorrer do processo, e atua para inibir o

desenvolvimento do mesmo. Assim, inibição da secreção desta citocina favorece o

desenvolvimento de respostas inflamatórias (BOGDA et al.,1991), e os dados aqui

encontrados, que mostram redução significante na concentração de IL-10 em células

3T3-L1 em células expostas ao PCB126, corroboram a hipótese do papel pró-

inflamatório do PCB126.

49

Em conjunto, os resultados obtidos, mostram que o PCB126 promove um

efeito pró-inflamatório em células de adipócitos 3T3-L1, o que corrobora dados da

literatura com demais congêneres de PCBs, mostrando, assim, o possível potencial

do desenvolvimento de doenças metabólicas.

Sabe-se que o receptor PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor

gamma) possui um papel importante na regulação do metabolismo de triglicérides

nos adipócitos e também controla a mobilização de lipídeos em adipócitos,

apresentando um papel essencial na manutenção do fenótipo dos adipócitos

(FERRE, 2004; GRUN, BLUMBERG, 2007). O receptor é pertencente a um grupo de

proteínas nucleares que atuam como fatores de transcrição regulando a

diferenciação e desenvolvimento celular, o metabolismo de carboidratos, lipídeos e

proteínas, além de regular a carcinogênese de organismos superiores (FERRE,

2004; SANTINI et al., 2004; SEMPLE, 2006). O isotipo gamma (γ) dos PPARs,

altamente expresso no tecido adiposo, músculo esquelético e coração, é

responsável por regular a expressão e as funções dos receptores de VLDL (Very

Low Density Lipoprotein) que é um membro dos receptores de lipoproteínas de baixa

densidade (GRUN, BLUMBERG, 2007, GRUN, BLUMBERG, 2009; FERRE, 2004).

No presente estudo, observamos um aumento na expressão proteica do PPAR-γ, o

que pode estar relacionado a uma resposta moduladora das células, no sentido de

controlar um possível efeito adipogênico exercido pelo PCB126. Diferentemente,

GADUPUDI e colaboradores (2014) mostraram recentemente que a exposição ao

PCB126 a uma nova linhagem de pré-adipócitos humanos (normal PreAdipocytes –

NPAD) inibiu a diferenciação em adipócitos, e especialmente quando a exposição

ocorreu durante a diferenciação. Este efeito foi relacionado a redução da expressão

gênica de PPAR-γ, o qual foi revertido pelo antagonista de receptor AhR.

Como já salientado anteriormente, o PCB126 é um agonista de AhR e

expressões elevadas do receptor tem sido evidenciada em intoxicações in vitro e in

vivo pelo PCB 126 (OLSEN et al., 1994; ARSENESCU et al., 2008; BOUREZ et al.,

2012; KIM et al., 2012; ROOS et al., 2012; SHIMADA et al., 2015; CETEWAYO et

al., 2013). Os nossos resultados não mostraram expressão de grande magnitude

quando as células 3T3-L1 foram expostas ao PCB126, sendo que a expressão

somente foi observada com a maior concentração do poluente, após 72 horas de

50

exposição. Este efeito pode estar relacionado ao aumento da expressão de PPAR-

γ, uma vez que tem sido descrito que a expressão de PPAR-γestá relacionada

com a inibição da expressão gênica do receptor AhR, sugerindo que a expressão do

receptor AhR é regulada por PPAR e somente acontecerá em tempos prolongados

de exposição, pelo AhR ser um receptor de ativação tardia (GAPUDI et al., 2014).

Desta forma, em nosso trabalho poderíamos observar um aumento na expressão de

AhR somente após 72 de exposição na maior concentração de PCB126. No

entanto, tanto a expressão de PPAR-γ como de AhR precisam de estudos

complementares para a elucidação de seus papéis na toxicidade induzida pelo

PCB126 em células 3T3-L1.

Uma vez observado aumento da expressão proteica nos receptores AhR e

PPAR-γ, fomos investigar se havia alteração no acúmulo de triglicérides nos

adipócitos 3T3-L1 submetidos a exposição ao PCB126. Os dados obtidos mostram

que houve um aumento no acúmulo de triglicérides em 24 horas de exposição nas

concentrações de 100 ou 300 µM de PCB126. Os resultados foram obtidos pela

marcação com o corante Oil Red que cora lipídeos, mostrando assim, que o PCB126

influencia no acúmulo de triglicérides em 24, 48 e 72 horas de exposição. Nossos

resultados corroboram os dados da literatura que mostram que, bifenilas

policloradas em diferentes concentrações, aumentam triglicérides em adipócitos de

linhagens, o que pode aumentar o risco de doenças metabólicas, cardiovasculares e

hepáticas (ARSENESCU et al., 2008, TAXVIG et al., 2012, WAHLANG et al., 2014,

GADUPUDI et al., 2014).

Arsenescu e colaboradores (2008) mostraram que o efeito do PCB 77 em

células 3T3-L1 está correlacionado a parâmetros moleculares pela avaliação dos

receptores que desencadeiam respostas fisiológicas importantes que podem

desenvolver quadros patológicos, tais como, obesidade, doenças cardiovasculares e

DM2. Estes receptores efetuam um papel importante no controle da toxicidade e da

homeostasia do adipócito e sugere-se que os mesmos podem se auto-regular

através da ativação do complexo das chaperonas, que apresenta uma classe de

proteínas denominadas Heat Shock Protein (HSP) que são ativadas no citoplasma e

translocadas através de vias que podem se interconectar e ativar diversos

51

receptores, tais como, PPAR, AhR, receptores de estrógeno, dentre outros (CHANG

et al., 2014). Porém, não se sabe quais são os mecanismos envolvidos.

Neste mesmo estudo, a autora mostrou que o PCB77 (dioxin like PCB),

promoveu o aumento na secreção de citocinas pró-inflamatórias, o aumento da

expressão gênica de PPAR-γ e o aumento do peso e da diferenciação em

adipócitos dos animais utilizados e em células 3T3-L1, havendo assim uma

contribuição para o quadro de obesidade. Por outro lado, quando animais knouckout

para o gene que codifica o receptor AhR ou animais que foram submetidos ao

tratamento com antagonista de AhR, os efeitos observados pela exposição ao

poluente eram revertidos. Em nosso trabalho, observamos um perfil similar, sendo

este, o aumento de triglicérides, aumento na expressão proteica de PPAR-γ e AhR

e, aumento na secreção de citocinas pró-inflamatórias, o que corrobora aos estudos

recentes na literatura que sugerem um fator risco à mais para organismos expostos

às bifenilas policloradas para o desencadeamento da obesidade e

consequentemente, de doenças cardiovasculares e doenças de origem metabólica,

como a Diabetes Melitus do tipo 2 (ARSENESCU et al., 2008).

Em conjunto, os resultados aqui obtidos mostram que a exposição do

poluente PCB126 induz parâmetros inflamatórios e de obesidade em células 3T3-L1,

o que pode contribuir para evidências epidemiológicas e experimentais da ação de

dioxin like PCBs sobre a indução da obesidade.

52

7 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, mostramos que a

exposição in vitro de PCB126 a células 3T3-L1:

- não alterou a viabilidade e proliferação celular (30,100µM; 24 ou 72 h);

- reduziu a porcentagem de células em apoptose (30,100µM; 24 ou 72 h);

- não alterou o ciclo celular (10, 30 ou 100µM; 24 ou 72 h);

- induziu a fragmentação do DNA (10, 30 ou 100µM; 24h);

- não induziu a geração de ROS (10, 30, 100µM; 24 ou 72 h);

- induziu a produção de NO (300µM, 24 ou 72 h);

- não alterou a secreção do fator quimiotáxico para monócito (MCP-1);

- aumentou a secreção do fator de necrose tumoral (TNF-α; 300µM, 72 h) e

da interleucina 12 (IL-12; 300µM, 72 h);

- reduziu a secreção de interleucina 1β (IL-1β, 300 µM, 72 h) e de

interleucina 10 (IL-10, 300µM 24h, 100 ou 300µM, 48 h, 100µM, 72 h);

- aumentou a expressão de PPARγ (100 ou 300µM, 24h, 300µM, 72h) e de

AhR (300µM, 72h);

- aumentou a concentração de triglicérides intarcelulares (100 ou 300µM;

24,48 ou 72h).

Em conjunto, os resultados obtidos mostram as ações diretas do PCB

126 em células 3T3-L1 envolvidas no adipogênese, o que reforça, embora

que em ensaios in vitro que se mostram mais vantajos para o

entendimento de mecanismos de ação, o papel desta classe de poluentes

na obesidade.

53

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68

9 ANEXOS

Testes realizados com concentrações mais baixas de PCB126 mostrando

uma tendência de um perfil pró-inflamatório. Os resultados não foram mostrados no

corpo do texto por ser apenas um teste e conter um número baixo de amostras.

Porém, achamos necessário para apreciação do leitor. Os resultados mostram as

células expostas durante o processo de diferenciação e após a diferenciação em

adipócitos, expostas ao PCB126 nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Os resultados

sócomeçaram a ter uma tendência em adipócitos já diferenciados.

A)#

B)#

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A)#

B)#

70

A)#

B)#

A)#

B)#

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A)#

B)#

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10 FICHA DO ALUNO

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11 INSTRUÇŌES PARA OS MEMBROS DA BANCA JULGADORA


Faculdade de Ciências Farmacêuticas Secretaria de Pós-Graduação

Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP Fone: (11) 3091 3621 - Fax (11) 3091 3141 – e-mail: [email protected]

Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado/Doutorado

1. O candidato fará uma apresentação oral do seu trabalho, com duração máxima de trinta minutos.

2. Os membros da banca farão a argüição oral. Cada examinador

disporá, no máximo, de trinta minutos para argüir o candidato, exclusivamente sobre o tema do trabalho apresentado, e o candidato disporá de trinta minutos para sua resposta.

2.1 Com a devida anuência das partes (examinador e candidato), é

facultada a argüição na forma de diálogo em até sessenta minutos por examinador. 3. A sessão de defesa será aberta ao público. 4. Terminada a argüição por todos os membros da banca, a mesma se

reunirá reservadamente e expressará na ata (relatório de defesa) a aprovação ou reprovação do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argüição.

4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a Comissão

Julgadora deverá emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado na ata.

4.2 Será considerado aprovado o aluno que obtiver aprovação por unanimidade ou pela maioria da banca.

5. Dúvidas poderão ser esclarecidas junto à Secretaria de Pós-

Graduação: [email protected], (11) 3091 3621.

São Paulo, 23 de maio de 2014.

Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior Presidente da CPG/FCF/USP

75

12 CURRÍCULO LATTES

21/07/15 16:13Currículo do Sistema de Currículos Lattes (Wesley Soares Cruz)

Página 1 de 5http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4444783J7

2013 Mestrado em andamento em Mestrado em Ciências.. Faculdade de Ciências Farmacêuticas-USP. Título: Efeito da exposição in vitro à bifenila policlorada n126 em células 3T3-L1.,Ano de Obtenção: 2015.

Orientador: Sandra Poliselli Farsky.Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. Palavras-chave: AhR; Obesidade; PCB 126; Poluição.Grande área: Ciências Biológicas / Área: Farmacologia / Subárea: Toxicologia. Setores de atividade: Atividades de atenção à saúde humana.

2008 - 2012 Graduação em Biomedicina. Universidade Paulista, UNIP, Brasil. Título: Exposição in vivo à bifenila policlorada n126 sob a expressão do receptoraril hidrocarboneto. Orientador: Sandra Helena Poliselli Farsky.

Vínculo institucional2012 - Atual Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Aluno de Mestrado, Regime:

Dedicação exclusiva.

Nome Wesley Soares Cruz

Nome em citações bibliográficas CRUZ, W. S.;CRUZ, WESLEY SOARES

Wesley Soares CruzEndereço para acessar este CV: http://lattes.cnpq.br/0425308709904380Última atualização do currículo em 17/07/2015

Biomédico formado pela Universidade Paulista-UNIP (2012). Atualmente é Mestrando em Ciênciascom ênfase em Toxicologia e Análises Toxicológicas pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas daUniversadade de São Paulo-USP. Têm experiência nos seguintes temas: Biologia molecular,neurofarmacologia, comportamento animal, drogas de abuso, toxicologia ambiental e farmacologia.(Texto informado pelo autor)

Identificação

Endereço

Formação acadêmica/titulação

Atuação Profissional

Faculdade de Ciências Farmacêuticas-USP, FCF-USP, Brasil.

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Vínculo institucional2010 - 2011 Vínculo: Iniciação Ciêntifica, Enquadramento Funcional: Aluno de Iniciação

Ciêntifica, Carga horária: 20

Vínculo institucional2009 - 2012 Vínculo: Iniciação Ciêntifica, Enquadramento Funcional: Aluno de Iniciação

Ciêntifica, Carga horária: 20

Vínculo institucional2009 - 2011 Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Bolsista FAPESP Iniciação Cientifica,

Regime: Dedicação exclusiva.

2013 - Atual Efeito da exposição in vitro à bifenila policlorada n 126 em células 373-L1

Descrição: Os poluentes orgânicos persistentes (POPs) são caracterizados porpossuírem resistência a degradação química e biológica. São lipossolúveis e sebiomagnificam na cadeia trófica, contaminando assim a fauna e flora. Dentre osPOPs, a bifenila policlorada (PCB) 126 é considerada como um dos mais tóxicos,sendo classificada pela IARC como nível 1, sendo potencialmente nociva parahumanos e animais. O PCB 126 foi largamente utilizado pela indústria emcapacitadores e transformadores elétricos devido às suas características químicas.Atualmente, apesar de ter sua fabricação proibida, o PCB 126 ainda pode serencontrado em lodo de rios, conjugado com compostos na atmosfera, alimentoscontaminados, queima de combustíveis fósseis, dentre outros. Dentre osdiferentes efeitos tóxicos que os POPs podem causar, existe uma correlaçãopositiva entre a exposição dos mesmos e incidências de doenças metabólicas,como obesidade, diabetes do tipo II e doenças cardiovasculares. Devido aimportância destas doenças para a saúde pública mundial, foi de interesse dopresente projeto investigar os efeitos da exposição ao PCB 126 in vitro emdiferentes concentrações em células 3T3-L1, não diferenciadas e diferenciadasem adipócitos.. Situação: Em andamento; Natureza: Pesquisa. Alunos envolvidos: Mestrado acadêmico: (1) .

Integrantes: Wesley Soares Cruz - Coordenador / Ana Lúcia Borges Shimada -Integrante / Sandra Helena Polisseli Farsky - Integrante.

2012 - Atual Caracterização da exposição in vivo a bifenila policlorada n126 em ratos sobre aexpressão do receptor aril hidrocarboneto

Descrição: Os PCBs são considerados poluentes ambientais importantes pelassuas características de exposição, cinética e mecanismos de ação tóxica. Sabendoda participação do receptor AhR em diversas respostas patológicas, este projetovisa investigar a expressão proteica do receptor aril hidrocarboneto em diferentesórgãos, tais como fígado, pulmão e pâncreas após uma exposição ao PCB126 invivo em ratos.. Situação: Em andamento; Natureza: Pesquisa. Alunos envolvidos: Graduação: (1) / Especialização: (0) / Mestrado acadêmico:(0) / Mestrado profissional: (0) / Doutorado: (1) .

Integrantes: Wesley Soares Cruz - Integrante / Ana Lúcia Borges Shimada -

Instituto de Ciências Biomédicas-USP, ICB-USP, Brasil.

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia-USP, FMVZ, Brasil.

Universidade Federal do ABC, UFABC, Brasil.

Projetos de pesquisa

77



Integrante / Sandra Helena Polisseli Farsky - Coordenador.

2011 - 2012 Papel dos hormônios esteróides na biologia molecular do receptor opióide tipomu em diferentes regiões do encéfalo de ratas virgens tratadas prolongadamentecom agonista opioidérgico

Descrição: De acordo com os princípios de cronobiologia, ritmos infradianos queduram mais de 24 horas são predominantes em mamíferos capazes de sereproduzirem. O ciclo estral é bem conhecido em roedores, sendo composto por4-5 dias e caracterizado pelas fases de proestro, estro, metaestro e diestro. Aregulação da secreção das gonadotrofinas hipofisárias é resultado de umainterrelação complexa entre efeitos de feedbacks dos esteróides gonadais e ainfluência exercida por neurotransmissores cerebrais no eixo hipotálamo-hipofise.Estudos mostram que o papel central neste fenômeno é desempenhado pelosopióides cerebrais, que particularmente exercem uma influência inibitória nasecreção de gonadotrofinas. É conhecido que diferentes classes de opióidescerebrais (como beta-encefalinas, encefalinas, dinorfinas) exercem suas açõespor meio da ligação específica a receptores de membrana, sendo os maisconhecidos denominados mu, kappa e delta. Os receptores do tipo kappa e deltaparecem estar associados ao controle da secreção de gonadotrofinas, porém sãopoucos estudos evidenciam a real participação dos receptores do tipo mu nessecontexto. Os experimentos conduzidos até o momento refletem o potencial deligação de agonistas opioidérgicos, como a morfina, que poderiam indicarmodulação no número de receptores do tipo opióide ativos pelapresença/ausência de hormônios esteróides e com conseqüências fisiológicas.Esse estudo utilizará técnicas atuais de biologia molecular para avaliar os padrõesde expressão do gene Oprm1 que codifica para o receptor opióide tipo mu, bemcomo os produtos protéicos MOR no hipotálamo, estriado e PAG de ratas virgense adultas, OVX ou não e tratadas com morfina, Estrógeno e Progesterona deacordo com o delineamento experimental. (AU). Situação: Concluído; Natureza: Pesquisa.

Integrantes: Wesley Soares Cruz - Coordenador / Cezar L.C - Integrante / PereiraL.A. - Integrante / Elizabeth Teodorov - Integrante.

1. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Farmacologia / Subárea: Toxicologia.

2. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Bioquímica / Subárea: BiologiaMolecular.

3. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Farmacologia / Subárea:Neurofarmacologia.

Espanhol Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem.

Inglês Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem.

Português Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem.

Italiano Compreende Pouco, Fala Pouco, Lê Pouco, Escreve Pouco.

2013 Menção Honrosa -21 SIICUSP, Universidade de São Paulo.

Áreas de atuação

Idiomas

Prêmios e títulos

Produções

78



2. FRAGOSO, Y. D. ; FINKELSZTEJN A. ; Giacomo M. C. B. ; Russo L. ; CRUZ, W. S. . The effect of multiplesclerosis on the professional life of a group of Brazilian patients. Arquivos de Neuro-Psiquiatria (Impresso) ,2010.

2. CRUZ, W. S. ; FARSKY, S. H. P. ; SHIMADA, A. L. B. . 16 Edição da Semana Farmacêutica da USP. 2013.(Apresentação de Trabalho/Congresso).

3. Araújo L.S. ; Carvalho S.H ; Cezar L.C ; CRUZ, W. S. ; Fernandes E. ; Garcia J.M. ; Rodrigues G.C.S. ; PereiraL.A. ; Pinheiro L.O. ; Silva ED C.S. . Aspectos Bioquímicos, Genéticos e Imunológicos de Animais GeneticamenteModificados. 2010. (Apresentação de Trabalho/Comunicação).

1. CRUZ, W. S. . Folhas de Outono. 2013. Composição (estréia).

1. CRUZ, WESLEY SOARES ; PEREIRA, LUCAS ASSIS ; CEZAR, LUANA CARVALHO ; CAMARINI,ROSANA ; FELICIO, LUCIANO FREITAS ; BERNARDI, MARIA MARTHA ; TEODOROV, ELIZABETH . Role of steroidhormones and morphine treatment in the modulation of opioid receptor gene expression in brain structures inthe female rat. SpringerPlus, 2015.

1. CRUZ, W. S. . Simpósio Internacional de Iniciação Cientifica da Universidade de São Paulo. 2013.(Apresentação de Trabalho/Simpósio).

2. XXVI Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental (FESBE). Maternal behavior andopioid gene expression of opioid receptors on periaquedutal grey of female rats treated chronically withmorphine.. 2011. (Congresso).

3. XXVI Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental (FESBE). Evaluation of OPRM1,OPRK1 and OPRD1 opioid gene expression in lateral periaquedutal grey of female rats treated acutely withmorphine DAMGO, DPLPE and U69593. 2011. (Congresso).

4. II Simpósio de Criminalistica e II Encontro Multiprofissional de Atividades Periciais. 2010. (Simpósio).

5. I Simpósio de Criminalistica e I Encontro Multiprofissional de Atividades Periciais. 2009. (Simpósio).

6. I Simpósio de Neurociências da Universidade Paulista-UNIP. 2009. (Simpósio).

1. Seminários da Comissão de Pesquisa FCF-USP-Insulina e inflamação. 2012. (Seminário).

1. CRUZ, W. S. . Simpósio Internacional de Iniciação Cientifica da Universidade de São Paulo. 2013.(Apresentação de Trabalho/Simpósio).

Produção bibliográfica

Artigos aceitos para publicação

Apresentações de Trabalho

Produção artística/cultural

Música

Eventos

Participação em eventos, congressos, exposições e feiras

Educação e Popularização de C & T

Apresentações de Trabalho

79



2. CRUZ, W. S. ; FARSKY, S. H. P. ; SHIMADA, A. L. B. . 16 Edição da Semana Farmacêutica da USP. 2013.(Apresentação de Trabalho/Congresso).

1. CRUZ, W. S. . Folhas de Outono. 2013. Composição (estréia).

Musica

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Efeito da exposição in vitro à bifenila policlorada nº126 em … · 2016. 2. 26. · Ficha...

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