Licenciatura em Enfermagem - ESEC

Bioqumica e Biofsica

DNA & RNAAC Santos - 2008/2009

DNA Material Gentico? Griffith, 1928 - injectou ratinhos com a estirpe S de pneumococcus => morriam - ratinhos injectados com a estirpe R sobreviviam => extractos da estirpe S transformam a estirpe R na estirpe virulenta S = teste potencial para material gentico

Avery, MacLeod e McCarty, 1944 - usaram extractos purificados da estirpe S para caracterizar o princpio da transformao - o material era resistente a proteases; no continha lpidos nem acares - se o DNA no extracto for destrudo perde-se o princpio transformador - DNA puro isolado do extracto da estirpe S transforma a estirpe R => Avery sugeriu que o DNA era o material gentico

Confirmao por Hershey e Chase, 1952 - durante a infeco genes virusais entram na clula hospedeira levando produo de novos vrus - vrus marcados com istopos radioactivos => protenas marcadas com 35S e DNA marcado com 32P - o bacterifago T2 (vrus) foi misturado com bactrias e depois colocado num misturador para retirar os vrus da clula - as bactrias foram depois separadas dos vrus por centrifugao - s o DNA radioactivo entra nas bactrias

Martha Chase e Alfred Hershey, 1952

Concluso: o DNA o material gentico! Uma vez aceite esta ideia como verdade cientfica foi preciso explicar como podia uma simples molcula de DNA representar a nossa informao gentica

Estrutura do DNA - WH Bragg e WL Bragg (pai e filho), inventaram em 1912 a cristalografia. O Inglaterra era o centro desta tcnica no sc. XX e WL Bragg era o director da Medical Research Division dos Cavendish Laboratories de Cambridge em 1950.

- Rosalind Franklin (Kings College) => cristalografia de raios X do DNA

- Chargaff (1950) concluiu que em qualquer DNA as concentraes da adenina eram iguais s da timina e as de guanina eram iguais s de citosina = regras de Chargaff. Chargaff

Estrutura do DNA (cont.) Modelo de Watson and Crick (1953) baseado na informao de Franklin e Chargaff 2 conjuntos de pares de bases foram conjugados numa dupla hlice

Fosfatos e desoxiribose so dispostos como um esqueleto com o carbono 3' de um acar ligado atravs de uma ligao fosfodister ao carbono 5' do acar seguinte.

Estrutura do DNA As bases so como degraus de uma escada, com a Adenina ligada Timina e a Guanina Citosina. O espaamento do monmero de 0,34 nm; o passo de volta helicoidal 3,4 nm (10 pares de bases). As duas cadeias de DNA da dupla hlice so antiparalelas. A replicao do DNA e a transcrio do RNA s ocorrem na direco 5' => 3' .

Histones so as protenas principais da cromatina. Actuam como molas em torno do DNA e desempenham um papel na regulao dos genes.

Conhecem-se 6 classes de histonas : H1 (por vezes chamada histona conectora ou H5) H2A H2B H3 H4 Histonas primitivas As histonas H2A, H2B, H3 e H4 so designadas core histones, juntam-se para formar o nucleosoma (centro da partcula octamrica) envolvendo 146 pares de bases do DNA volta da mola proteica em 1,65 super-hlices de enrolamento levgiro. A histona espaadora H1 liga o nucleosoma aos locais de entrada e sada do DNA, bloqueando o DNA no seu lugar e permitindo a formao de estruturas + complexas. Durante a meiose, atravs da combinao de interaces do nucleosoma com outras protenas, o cromosoma montado. As histonas + o DNA designam-se cromatina.

Replicao do DNA Meselson e Stahl em 1957 obtiveram dados experimentais que evidenciavam que a cadeia de DNA servia como molde para uma nova sntese, processo designado por replicao semi-conservativa. Colocaram E. coli a crescer com 15N (istopo pesado). Mudaram para 14N (istopo leve) e aps 1, 2 e 3 geraes retiraram amostras de DNA Misturaram depois com cloreto de csio e separaram o DNA leve e o pesado.

O DNA de densidade leve, pesada e intermdia pode ser separado por centrifugao. Resultados da experincia

Concluses Os resultados mostram que aps 1 gerao a dupla hlice de DNA 1/2 pesada (da molcula me) e 1/2 leve (sintetizada de novo). Este resultado previsto pela replicao semiconservativa. Tal como o previsto por Watson e Crick as cadeias de DNA servem como molde pra a sua prpria replicao.

Replicao do DNAO molde de DNA com sntese da nova cadeia ocorre na direco 5 => 3'. O trifosfato 5' s pode ser adicionado a um 3' livre da desoxiribose. As duas cadeias antiparalelas so replicadas em simultneo. Usam-se primers de RNA para iniciar uma nova cadeia. A cadeia me, na extremidade 3', determina a cadeia filha ou cadeia codante na replicao contnua. A cadeia me, na extremidade 5, produz a cadeia no codante como pequenos pedaos de DNA (100-200 nucletidos nos eucariotas e um pouco + maiores nos procariotas). Estes pedaos foram descobertos por Reiji Okazaki, chamando-se fragmentos de Okazak. Os primers de RNA so removidos e os fragmentos juntam-se atravs da ligase do DNA.

Concluses A estrutura do DNA prediz que a sequncia de bases determina a replicao do DNA. Se a sequncia contm informao, ento as bases A,T,G, e C tm de algum modo de determinar a sequncia de aa nas protenas. Mutaes no DNA so devidas a alteraes na sequncia das bases. Ser que os genes especificam sequncias de aa nas protenas? As sequncias de bases no DNA so convertidas a RNA atravs da Transcrio. Os genes determinam o fentipo atravs da sntese das protenas. A teoria de Garrard da existncia de enzimas determinantes de genes foi continuada por Beadle e Tatum estudando mutantes em Neurospora crassa (bolor do po) (1940's). O tipo selvagem cresce em meio pobre. Usando raios X, que causam quebras do DNA e mutaes, produzem-se alguns mutantes sobreviventes (auxotr-ficos) que crescem em meios ricos mas no em meios pobres.

Concluses Nutrientes adicionados, tais como aa ou vit, podem fazer crescer os auxotrofos. Mutaes no DNA causam perca de enzimas que codificam genes. TEORIA - a funo de 1 gene controlar a produo de 1 enzima especfica. Dogma Central da Biologia Molecular DNA codifica a produo de DNA (replicao) e de RNA (transcrio). RNA codifica a produo de protenas (translao). A informao gentica armazenada sob forma de mensagem linear nos c. nucleicos. Notao para escrever uma sequncia de DNA: 5'-AGTCAATGCAAGTTCCATGCAT.... 1 gene determina a sequncia de aa nas protenas. Usam-se abreviaturas para escrever a sequncia de uma protena : NH2-Met-Gln-Cys-Lys-Phe-Met-His.... (ou 1 letra do cdigo: M Q C K F M H)

Vrus de RNA Alguns vrus usam RNA em vez de DNA como material gentico. 1 grupo de vrus de RNA, designados retrovrus, convertem RNA de novo em DNA. Vrus de RNA fazem muitos erros na replicao da informao gentica. Isto significa que alguns vrus como o HIV (SIDA) se alteram muito rapidamente, o que torna difcil a produo de uma vacina. Transcrio Sntese de RNA a partir de um molde de DNA. Requer 1 polimerase RNA dependente de DNA + os 4 nucletidos (ATP, GTP. CTP e UTP). A sntese comea num local de iniciao no DNA. A cadeia molde lida de 3' => 5' e o mRNA sintetizado de 5' => 3.

Tipos de RNA mRNA - RNA mensageiro. Molde para sntese de protenas. tRNA - RNA de transferncia. A molcula "adaptadora" que converte a sequncia de c. nucleico em sequncia proteica. rRNA - RNA ribosmico. Molcula estrutural e cataltica do ribosoma. A sntese proteica requer mRNA, tRNA e ribosomas, alm de 1 fonte de energia e factores proteicos.

O RNA pode existir ainda como: snRNA (small stable RNA) nas clulas eucariotas existem com ribonucleoprotenas e esto distribudos no ncleo, citoplasma ou ambos. hnRNA RNA nuclear heterogneo. Nas clulas dos mamferos os mRNA presentes no citoplasma no so imediatamente sintetizados a partir do molde de DNA mas sim formados por 1 precursor antes de entrar no citoplasma. snurps (small nuclear ribonucleoprotein particles) podero estar envolvidos na regulao de 1 gene, na produo das extremidades 3corretas das histonas do mRNA. RNA de transferncia A informao gentica do mRNA est na forma de sequncias de 3 letras chamadas codes. tRNA contm o anticodo, uma sequncia de bases que complementar para o seu codo. Existe pelo menos um tRNA para cada aa. tRNAs tm de ser carregados com aa especficos por aminoacil-tRNA sintetases. A reaco requer energia da hidrlise do ATP, crucial na correcta converso da sequncia do c. nucleico na sequncia do aa.

Traduo: processo com 3 etapas Iniciao Formao do complexo de iniciaao entre o mRNA, tRNA carregado e o ribosoma. A traduo comea com um codo especfico: o codo de iniciao (AUG).

Alongamento A cadeia polipeptdica crescente ligada a 1 aa no local P. O prximo codo a ser lido est presente sob o local A. O tRNA que tem o aa seguinte entra no local A. Forma-se 1 lig. peptdica entre o novo aa e a cadeia crescente, transferindo-a para o tRNA no local A. O ribosoma move-se 1 codo, levando o peptdeo-tRNA para o local P e o ciclo repete-se.

Mais de 1 ribosoma pode estar envolvido na traduo de uma dada molcula de mRNA. O complexo chama-se polisoma.

Retculo endoplasmtico - produz membranas celulares, protenas membranares e protenas para secreo. RER coberto por polisomas. O RE representa 1 srie de cisternas ou canais dentro da clula. Ribosomas citoplasmticos ligam-se ao mRNA e comeam a sntese de protenas. Estas protenas so destinadas secreo ou a localizao membranar; incluem 1 "sequncia de sinal" que liga a "docking sites" na superfcie do RE. Durate a sntese, a protena passa para dentro das cisternas no RE. A entrada no RER sequestra a protena do resto da clula e torna-a acessvel a 1 sistema que inclui vesculas de transporte e ao Ap. de Golgi para modificao e localizao em sites dentro deste sistema ou para secreo para fora da clula.

O cdigo gentico baseia-se em conjuntos de bases de DNA. Como pode 1 alfabeto s com 4 letras (A, T, C, G) ser traduzido para protenas com 20 aa? S existem 4 bases para os 20 aa. 1 cdigo de 2 nucletidos pode especificar apenas 16 aa diferentes (4 x 4 = 16 combinaes possveis). Grupos de 3 nucletidos seriam suficientes (4 x 4 x 4 = 64 combinaes possveis). Decifrando o cdigo gentico Nirenberg e Matthaei Desenvolveram 1 mt para sntese proteica in vitro com adio de mRNA. Lab Khorana e Nirenberg sintetizaram polmeros de RNA. Poly "U" ou UUUUUUUUUUU codifica para 1 protena contendo s fenilalanina. Poly "CA" codifica para polipeptdeos que alternam histidina-treonina. Poly "CAA" codifica para 3 polipeptdeos; poliglutamina, politreonina ou poliasparagina. A determinao completa do cdigo obteve-se quando se observou que 1 aatRNA s ligava a cdigo sinttico na presena de ribosomas.

O cdigo gentico Tripletos so como palavras de cdigo, no so sobreponveis. - Degenerado (+ do que 1 tripleto codifica para alguns aa) mas no ambguo (cada palavra de cdigo especifica s 1 aa). - Universal todos os organismos (excepto algumas mitocndrias). AUG - metionina e o cdigo comea UAA, UAG, UGA codes de stop